KR20010052431A

KR20010052431A - 당뇨병 치료제

Info

Publication number: KR20010052431A
Application number: KR1020007013430A
Authority: KR
Inventors: 테레사 아펠크비스트; 슈애드 에펜딕
Original assignee: 오테스코그 페르; 카로 바이오 아베
Priority date: 1998-06-08
Filing date: 1999-06-07
Publication date: 2001-06-25
Also published as: WO1999063976A2; EP1143948A2; EP1143948A3; JP2002527355A; WO1999063976A3; AU751569B2; CA2334116A1; IL139865A0; AU4160699A

Abstract

본 발명은 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제, 바람직하게는 하기 화학식(I)의 화합물의 당뇨병 치료를 위한 약제 조성물의 용도에 관한 것이다:

(I)

또한, 이러한 글루코코르티코이드 길항제를 함유하는 당뇨병 치료를 위한 조성물 및 이 조성물을 사용하여 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨병 치료제{TREATMENT OF DIABETES}

모든 당뇨병 환자의 약 90%는 비인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM 또는 제 2형 당뇨병)이 있으며, 외인성 인슐린에 의존성일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 유형의 제 1 형 진성 당뇨병의 고혈당증의 점진적인 치료는 시각, 신장 및 신경질환 합병증의 발병을 크게 감소시키는 것으로 나타났으며, 점진적인 치료는 또한 제 2형 당뇨병에도 유익한 것으로 입증되었다. 입수가능한 데이타는 또한 대부분의 환자가 현재 제 2형 또는 제 1형 당뇨병을 위한 이상적이고 최상의 치료를 받지 못하는 있음을 시사한다. 이러한 불충분한 점은, 제 2형 및 제 1형 당뇨병의 치료를 위한 인슐린 제제의 수개의 상이한 유형과, 인슐린 방출을 자극하는 시제, 예를 들어, 술포닐우레아, 간 글루코스 생성에 영향을 미치는 시제, 예를 들어, 메트포르민, 인슐린에 대해 민감성에 영향을 미치는 시제, 예를 들어, 트로글리타존 및 글루코스 흡수를 촉진시키는 시제, 예를 들어, α-글루코시다제 억제제를 포함하는 다수의 추가 양식을 입수할 수 있음에도 불구하고 존재한다. 혈중 글루코스 수준을 낮추는 수개의 상이한 경구 활성 시제를 입수할 수 있음에도 불구하고, 제 2형 당뇨병이 있는 많은 환자는 또한 혈당 수준의 조절을 위해 인슐린을 필요로 한다. 전체로서, 제 2형 당뇨병에서의 인슐린 사용은 제 1형 당뇨병의 사용량을 초과하며, 제 2형 당뇨병을 치료하기 위해 추가의 경구 활성 시제가 요구되는 것이 일반적으로 동의되고 있다.

제 2형 및 제 1형 당뇨병의 큰 문제점은 간에 의한 글루코스의 생성이 과다하고 부적당하는 것이다. 이러한 관찰은 매우 다양한 제 2형 당뇨병 집단을 연구한 많은 상이한 연구소에서 입증되었다. 이러한 정상 이상이 단식 과혈당증의 주요 원인이며, 이외에 인슐린 방출 조절 및 인슐린에 대한 말초 민감성에 결함을 일으킨다. 따라서, 간 글루코스 생성을 감소시키는 시제가 제 2형 당뇨병과 제 1형 당뇨병을 치료하는데 유익할 것이다.

비인슐린 의존성 진성 당뇨병(2형 당뇨병 또는 NIDDM)의 치료에는 현재 많은 치료 양상에도 불구하고 여전히 불충분하다. 증가된 글루코스 생성이 단식 및 식후 과혈당증을 병인에 주축이 되는 역할을 한다는 사실에도 불구하고, 제 2형 진성 당뇨병의 치료에 있어서 본 발명의 방법을 직접적으로 목적으로 하는 의학적 치료 방법은 없다.

진성 당뇨병을 치료하기 위해 현재 다양한 양식이 있음에도 불구하고, 어느 것도 이상적인 것은 없으며, 종래의 치료에 대한 문제점이 하기 표 1에 요약된다.

화합물의 분류	작용 메카니즘	효능(HbAlc)	효능	부작용	비고
인슐린	글루코스 생성의 억제글루코스 이용 자극	효능적으로 표준화		체중 증가저혈당증
술포닐우레아	인슐린 분비 증가	↓1.5-2.5%	2차 실패	체중 증가저혈당증	심장병?
비구아니드	글루코스 생성 억제	↓1.5-2.5%	2차 실패	설사,소화불량락트산 과다증
α-글루코시다제 억제제	느린 장 글루코스 흡수	↓0.5-1.0%	중간 효능	헛배, 설사변통
티아졸리딘디온	인슐린 민감도의 개선	↓0.5-1.0%	중간 효능	빈혈증,위장 증상	간 손상

글리부리드 및 글리피지드와 같은 술포닐우레아는 주로 췌장 인슐린 방출을 자극하므로써 작용한다. 이들 화합물은 비교적 저렴하며, 성공적으로 사용되었다. 이들 화합물은 저혈당증을 유발시킬 수 있다는 단점을 갖는다. 또한, 증가된 인슐린 방출은 보다 많은 지방 침착물을 유도하고, 체중 증가를 유발할 수 있다. 이들 화합물은 또한 많은 개인에게 단일 치료제로서 효과적이지 않다.

메트포르민 및 관련 생성물은 잘 이해되지 않은 메카니즘에 의해 간 글루코스 생성을 감소시킨다. 초기 연구에서는, 이러한 화합물의 작용에 대한 주요 메카니즘이 당신생(gluconeogenesis)에 대한 것임을 시사하였다. 이후, 연구에서는 상기 화합물이 글리코겐분해를 차단(저장된 글리코겐의 분해)하므로써 보다 잘 작용함을 시사하였다. 펜포르민과의 락트산 과다증을 갖는 이전 문제점은 메트포르민으로 상당히 축소되었다. 그럼에도 불구하고, 메트포르민은 식욕부진 효과를 유발한다. 이들 화합물이 제 1 주 치료로서 사용되지만, 그럼에도 불구하고 이들 화합물은 제한된 효능을 갖는다.

트로글리타존 및 그 밖의 티아졸라딘디온(인슐린 증감제) 작용의 주요 메카니즘은 근육 및 지방과 같은 말초 조직에서 인슐린 방출을 자극하지 않으면서 인슐린에 대한 민감성을 개선시키는 것이다. 이러한 작용은 또한 적은 정도로 간 글루코스 생성을 감소시킬 수 있다. 이러한 약제는 또한 혈압을 낮추며 지질 분포에 대한 유리한 효과를 산출시킬 수 있는 경향이 있다. 단점은 정상 수준으로의 혈중 글루코스 저장에 있어서 제한된 효능을 가져 많은 환자들이 추가의 치료를 요한다는 것이다. 최근, 트로글리타존과 관련된 간 손상의 대해 몇몇의 보고가 있었다.

탄수화물 흡수 억제제인 예를 들어, 아카르보스와 같은 α-글루코시다제 억제제는 위장관에서의 글루코스의 효소적 생성 및 흡수를 차단한다. 따라서, 이들 억제제는 식후 글루코스 수준을 감소시키는데 상당한 효과가 있다. 이들 억제제는 제한된 효능을 가지며 헛배부름, 약간의 변통 및 설사의 부작용이 일어날 수 있다.

코르티졸이 사람에게서 탁월한 글루코코르티코이드는 정상 생리 환경 하에서 부신에 의해 분비되는 스테로이드이다. 분비는 매우 다양한 상이한 스트레스 조건에 대한 반응에서 현저히 증가된다. 글루코코르티코이드의 효과는 당신생을 촉진시키므로써 간에서 글루코스 생성을 증대시켜 글리세롤, 알라닌 및 피루베이트를 포함하는 비글루코스 전구체로부터 글루코스를 생합성하는 것이며, 이는 글리코겐의 분해와는 상이하다. 따라서, 글루코코르티코이드가 불충분한 경우에는 간 글루코스 생성의 감소와 함께 저혈당증의 경향이 있다. 또한, 당뇨병 환자에게서 애디슨병의 발병이 일반적으로 글루코스 수준을 낮게 유도한다. 대조적으로, 글루코코르티코이드 과잉은 잠재성 진성 당뇨병이 있는 개인에서 명백한 당뇨병을 유발할 수 있으며, 일반적으로 발병된 당뇨병 환자에게서 글라이세민 조절을 악하시킨다. 유사한 영향이 여러 동물 모델에서 관찰되었다. 글루코코르티코이드 과잉 상태에서의 증가된 글루코스 생성은 잠재성 진성 당뇨병을 촉진시키거나, 진행중인 당뇨병을 악화시킬 수 있다. 대조적으로, 글루코코르티코이드 결핍 상태에서는 글루코스 생성이 감소되고 저혈당증의 경향이 있다. 당뇨병에서 글루코코르티코이드 작용을 차단하는 이전 효과는 사용된 어떠한 화합물이 일반적으로 모든 조직내의 글루코코르티코이드 작용을 차단하며, 저혈압과 같은 글루코코르티코이드의 문제 가능성을 유발하고, 발작 상태 동안에 쇼크를 일으키게 하고 극단적으로는 치사시킬 수 있다는 사실에 의해 제한되었다.

현재까지, 글루코코르티코이드 작용을 차단하는 모든 수단은 간에서 선택적이라기 보다는 몸 전체를 통해 일반화되었다. 따라서, 부신적출술이 명백한 부신 기능부전 애디슨병의 문제가 있는 환자에게 여지가 있다. 예를 들어, 메티라폰에 의한 부신 스테로이드 생성 또는 예를 들어, RU486과 함께 글루코코르티코이드 작용의 차단은, 증가된 코르티졸 방출이 있는 오랜 기간의 보상적 ACTH 과분비가 때로 이러한 차단을 무효화시킬 수 있기 때문에, 효능의 기간이 제한될 수 있다. 이러한 양식이 효과적인 경우에도, 이는 일반화된 부신 기능부전을 초래한다. 글루코코르티코이드에 반응하는 증가된 글루코스 생성은 많은 단백질에 영향을 미치는 것에 기인한다. 이들 중 중요한 것은 아미노산을 글루코스 전구체로 전환시키고, 글루코스-6-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트 카르복시-키나아제(PEPCK)를 유도하는, 티로신 아미노트랜스퍼라아제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제와 같은 다양한 트랜스아미나아제에 대한 영향이다. 유전자 전이 마우스에게 얻어지는 바와 같이 PEPCK가 크지 않게 증가된 경우에도, 과혈당증을 유발한다. 제 2형 당뇨병이 있으며 코르티코스테론(상기 종의 외인성 글루코코르티코이드) 수준이 증가된 마우스에서, PEPCK의 발현이 증가된 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 PEPCK의 과발현이 과혈당증에서의 동시 감소와 함께 GR 길항제 RU486으로의 치료에 의해 억제될 수 있음을 밝혀냈다.

진성 당뇨병(Diabetes mellitus)은 인구의 약 5 내지 6%가 앓고 있는 서방 세계에서 가장 심각한 의료 문제중 하나이다. 당뇨병은 서방 국가에서 일하는 성인의 시력을 잃게 하는 주요 원인이 되고, 신장병의 가장 중요한 원인이며, 심장마비, 발작 및 말초 혈관 질병을 포함하는 대혈관 질병의 위험 증가와 관련된다. 미국에서, 당뇨병은 16,000,000명 정도가 앓고 있으며, 당뇨병 치료 비용이 매년 1000억 달러를 넘고 있다.

도 1은 GRAF 세포에서의 본 발명에 따른 화합물의 GR 길항제 효과를 도시한 것이다.

도 2는 간 세포에서의 본 발명에 따른 화합물의 GR 길항제 효과를 도시한 것이다.

도 3은 마우스에서의 단식 글루코스 및 코르티코스테론 혈청 수준에 대한 본 발명에 따른 화합물의 효과를 도시한 것이다.

본 발명의 일면에 따르면, 간에서의 글루코스 생성을 억제하거나 감소시키는 작용하는 간-선택적 글루코코르티코이드 길항제로 대상을 치료하므로써 PEPCK, 글루코스 6 포스파타아제 또는 트랜스아미나아제로부터 선택된 효소의 발현을 낮추거나 억제시키는 것을 포함하여 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 문제점을 갖지 않는 간-특이적 GR 길항제 또는 비특이적 글루코코르티코이드는 진성 당뇨병에서의 증가된 간 글루코스 생성을 방해하며, 제 2형 당뇨병의 치료에 유용할 것이다.

본 발명의 간 선택적 GR 길항제는 많은 이점을 제공한다. 먼저, 간 글루코스 생성을 감소시킬 수 있다. 이 작용은 과혈당증 제 1형 당뇨병을 지속시키는 과다한 간 글루코스 생성에 중요한 역할을 한다는 점에서 글라이세민 조절에 상당한 효과를 갖는다. 둘째, 이러한 약제는 대사 환경에서 전반적인 개선과 인슐린 작용과 분비에서의 과혈당증 유도 결함의 개선으로 인해 인슐린 민감도를 증진시킨다. 혈당증에서의 감소 결과로서 감소된 β-세포 분비에 대한 요구는 제 2형 당뇨병의 점진적 β-세포 기능부전 특징을 지연시킬 수 있다. GR 길항제의 또 다른 이점은 이러한 약제가 저혈당증을 유발시키지 않는 것으로 기대되며, 단일 치료로서 또는 진행되고 있는 치료와 함께 사용될 수 있다는 점이다. 일반적으로, 통상적인 경구 시제는 심각하게 아프거나 심한 신장 또는 간 질병이 있는 환자에 대해서는 금기된다. 제거 메카니즘에 의존하여, 간 선택적 GR 길항제는 이러한 몇몇 상황(예를 들어, 스트레스 유도된 당뇨병)에 유용할 것이다.

제 2형 당뇨병 환자의 인슐린 사용은 질병의 중증도에 따라 예측된다. GR 길항제는 많은 환자에게서 인슐린 주입의 필요성을 감소시키거나 제거하는데 사용될 수 있다. 더우기, 특이적인 작용 메카니즘으로 인해, GR-길항제는 단독으로 또는 진행되는 경구 항당뇨병 치료제와 함께 효과적일 수 있다. 또한, 글루코스 불내성은 정상이상 비만, 고혈압 및 고지방혈증을 포함할 수 있는 대사 증후군의 일부이다. 경구적으로 투여된 GR 길항제는 글루코스 불내성을 감소시키는데 가치가 있을 수 있다. 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제의 구성은 몇몇 방법을 사용하여 기술자들에 의해 취해질 수 있다. 이들 방법은 간에서 불활성 유도체로 대사되는(제 1 패스 파괴) 화합물의 구성을 포함하며, 간에 의해 특이적으로 흡수되고/되거나 특이적 반응 요소에 대해 어떻게 작용하는 지에 대해 특이성을 갖는다.

글루코코르티코이드를 작용을 측정하기 위해, 사람 GR을 발현시키는 벡터와 알칼리 포스파타아제(ALP) 코딩 서열에 커플링된 글루코코르티코이드 반응 요소를 함유하는 글루코코르티코이드 유도성 리포터 유전자 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 CHO(중국산 햄스터 난소)와 같은 세포가 사용될 수 있다. 이러한 경우에, ALP 유전자 발현은 이들 세포내 글루코코르티코이드 의존성 형태로 전사적으로 활성화된다.

ALP 리포터 단백질은 배지로 분비되고, 통상적으로 사용되는 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT) 또는 루시페라아제 검정과 비교하여 이러한 리포터 검정을 매우 민감하게 하는 화학발광 검정에 의해 간접적으로 측정될 수 있다. 검정은 다양한 상이한 글루코코르티코이드 반응 요소와 프로코터 콘텍스트(promoter context)와의 GR 활성을 평가하기 위해 달성될 수 있다. 이들 검정은 수개의 상이한 유형의 글루코코르티코이드 반응 요소(GRE)와 글루코코르티코이드 반응을 매개하는 세포에 의해 사용되는 프로모터 콘텍스트의 사용을 포함할 수 있다. 이들 검정은 또한 전사 조절에 관여되는 단백질에 대해 GR을 속박하는데 흔히 사용되는 DNA보다는 활성 단백질-1(AP-1) 착물과 같은 다른 단백질과의 상호작용을 인지한다.

끝으로, 중요한 글루코코르티코이드 반응성 조직의 반영인 수개의 상이한 유형의 세포가 글루코코르티코이드 반응성을 측정하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이들 세포주는 생리적 수준에 근접한 GR 수준이 사용되도록 안정하게 트랜스펙션된다. 간 세포주는, 당뇨병과 관련하여 글루코코르티코이드 조절된 기능에 대한 글루코코르티코이드 길항제의 연구에 특히 유용하다. 이들 세포에서 당신생 및 글리코겐 침착과, 글리코겐 생성 및 분해, 및 당신생에 관여하는 특이적 효소가 측정될 수 있다.

신규 화합물의 생체내 시험을 위한 다양한 동물 모델, 예를 들어, ob/ob 마우스 (비만 당뇨병 모델) 및 GK-쥐(살이 안 찐 당뇨병 모델). 이들 동물에서, 연구는 인슐린 방출, 인슐린 민감성 및 글루코스 전환을 평가하는데 사용될 수 있다. 인슐린 민감성은 고인슐린혈증/정상혈당 클램프에 의해 평가될 수 있으며, 반면에 글루코스 전환은 6-H³글루코스를 사용하여 연구된다. 또한, 단리된 섬(islet), 단리 관류된 쥐 췌장 관류 섬, 패치 클램프 기법, 섬 이온 유출 및 단리 관류된 쥐의 간과 같은 많은 시험관내 모델이 입수될 수 있다.

간 선택적 글루코코르티코이드의 효과는 트레이서의 보조에 의한 글루코스 전화, 클램프를 사용하는 인슐린 민감성 및 인공 췌장의 사용에 의한 인슐린 요건에 대한 평가와 같이 사람의 글루코겐생성에 대해 길항적이다.

많은 시제가 현재 이용가능하지만, 이들중 어느 것도 간에서의 증가된 글루코스 생성에 의한 간에서의 글루코스 독성 문제를 적절하게 기술하고 있지 않음을 주목해야 한다. 간 선택적 GR 길항제는 주된 치료법으로서 또는 현재 입수할 수 있는 약제에 대한 보조 치료법으로서 사용하기 위한 치료적 축적물에 중요한 추가물이다.

본 발명자들은 상승된 혈중 글루코스 수준에 대한 다수의 합병증에 있어서의 가장 중요한 기여 인자가 간에서의 과다한 글루코스 생성임을 제시하고 있다. 간은 글루코스가 비당(non-sugar)으로부터 생성되는 인체의 주요 기관이다. 간은 단식 글루코스의 수준을 결정하고, 식후 글루코스 처리의 50%를 차지한다. 간장의 글루코스 생성에 영향을 미치는 현재 입수할 수 있는 단 하나의 약제는 메트포르민이다. 메트포르민의 작용 메카니즘은 공지되어 있지 않으며, 적당히 효과적이며, 시간이 경과함에 따라 효과가 약해진다. 간 선택적 GE 길항제는 간에 대해 보다 큰 효과를 가지며 세포 수준에서의 메카니즘이 잘 규정될 것이다.

임상적으로, 치료는 글루코스의 단식 수준을 표준화시키므로써 개시한다. 본 발명의 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제는 단식 과혈당증을 억제하려는 목표를 달성하기 위해 간에 특이적으로 작용하는 제 1 약제이다.

호르몬 및 기질에 의한 글루코스 생성의 조절이 제 2형 당뇨병에서 일어날 수 있으면서, 이러한 조절이 높은 "셋-포인트(set-point)"에서 효력이 있음을 알게 되었다. 따라서, 높은 수준의 순환 인슐린 및 글루코스가 정상에 가까운 수준으로 글루코스 생성을 유지시키는 데 필요하다. PEPCK 및 글루코스-6-포스파타아제와 같은 중요 효소의 작용과 유전자 발현 수준이 주로 이러한 셋 포인트에서의 개인간의 변수를 결정할 것이다.

본 발명의 방법에 의해 부여되는 또 다른 이점에는 손상된 글루코스 내성(IGT)을 갖는 환자 및 제 2형 당뇨병의 모든 중증도 수준의 당뇨병 환자 모두에, 즉 단일 치료, 조합하여 그리고, 인슐린을 제거하기 수단으로서, 정상 혈중 글루코스 수준을 회복 및 유지시키는 것으로 포함한다.

당뇨병의 대혈관계 및 미소혈관계 합병증의 발병을 적어도 지연시키는 것을 저지 및 실패하는 것이 개선된 치료에서 중요하다. 췌장에서의 정상 β-세포 기능의 보존과 혈중 글루코스 및 인슐린 수준에서의 정상 이상 회피가 이러한 목적을 달성하는데 도움을 준다. 개인 삶의 질에서의 악화를 방지하는 인슐린 민감도의 개선은 중요하나 단독으로 글루코스 독성 문제를 다루지는 못한다.

본 발명에 따른 치료 조성물 및 방법은 이제 첨부되는 도 1 내지 도 3의 도면을 참조로 실시예에 의해서 기술될 것이다.

하기 실시예에서, 화합물{3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸 -벤조일-페녹시]페닐}-아세트산은 본원에서 "KB285"로 언급하며 글루코코르티코이드 길항제이며, 시험관내 당신생을 감소시키는 것으로 나타났다. 생체내에서, 상기 화합물은 단식후보다 낮은 혈중 글루코스 수준을 나타냈다.

실시예 1

화합물 KB285를 하기와 같이 합성하였다:

{3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)-페녹시]페닐}-아세트산

(a) 비스(3-이소프로필-4-메톡시-페닐)요오도늄 테트라플루오로 보레이트.

발연성 질산(24.8ml, 530mmol)을 -20℃에서 62.8ml의 아세트산 무수물에 적가하였다. 요오드(22.6g, 88.8mmol)을 한번에 적가한 다음에 트리플루오로아세트산(41ml, 532mmol)을 적가하였다. 이 혼합물을 요오드가 모두 용해될 때까지 실온에서 교반하였다. 질소산화물을 질소로 퍼어징시키므로써 제거하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 252ml의 아세트산 무수물에 용해시키고, -20℃로 냉각시켰다. 상기 교반된 혼합물에 300ml의 아세트산 무수물과 45.2ml의 트리플루오로아세트산 중의 2-이소프로필아니솔(80g, 530mmol)을 적가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반한 후, 증발시켰다. 잔류물을 300ml의 메탄올에 용해시키고, 300ml의 10% 중아황산나트륨 수용액과 2리터의 2M 나트륨 보로테트라플루오라이드로처리하였다. 침전물이 응집한 후에, 석유 에테르를 첨가하고, 상청액을 따라냈다. 침전물을 석유 에테르로 분쇄하고, 여과하고, 석유 에테르로 세척하고, 진공하에서 실온에서 건조시켜 백색 고체로서 65g(71%)의 비스(3-이소프로필-4-메톡시페닐)요오도늄 테트라플루오로보레이트를 수득하였다[참조: Naokata Yokoyama, Gordon N. Walker, Alan J. Main, James L. Stanton, Michael M. Morrissey, Charles Boehm, Allan Engle, Alan D. Neubert, Jong M. Wasvary, Zouhair F. Stephan and Ronald E. Steele, J. Med. Chem., 38, 695(1995)].

(b) [4-(2-벤조일-5-이소프로필-4-메톡시-페녹시)-3,5-디브로모-페닐]-아세트산 메틸 에스테르.

0℃에서 CH₂Cl₂(7ml) 중의 비스(3-이소프로필-4-메톡시페닐)요오도늄 테트라플루오로보레이트(1g, 3.1mmol)과 청동구리(0.38g, 6.0mmol)의 교반된 혼합물에 CH₂Cl₂(5ml) 중의 (3,5-디브로모-4-히드록시-페닐)-아세트산 메틸 에스테르(1g, 3.1mmol)과 트리에틸아민(0.375g, 3.7mmol)의 혼합물을 첨가하였다. 이 혼합물을 5일 동안 암실에서 교반하고, 실라카 겔을 통해 여과하였다. 여액을 증발시키고, 잔류물을 크로마토토론(실리카, 9:1 n-헵탄/에틸 아세테이트) 상에서 정제하여 백색 고체로서 1.11g(76%)의 [4-(2-벤조일-5-이소프로필-4-메톡시-페녹시)-3,5-디브로모-페닐]-아세트산 메틸 에스테르를 수득하였다.

(c) {3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)-페녹시]페닐}-아세트산 메틸 에스테르.

CH₂Cl₂(1ml) 중의 4-(3-이소프로필-4-메톡시페녹시)-3,5-디브로모-벤조산 메틸 에스테르(50mg, 0.11mmol)과 3-메틸-벤조일클로라이드(82mg, 0.53mmol)의 교반된 혼합물에 티탄 테트라클로라이드(100mg, 0.53mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 이틀동안 교반하고, 얼음위에 부었다. 수성상을 EtOAc로 추출하고, 유기상을 MgSO₄상에서 건조시키고, 여과시키고 증발시켰다. 미정제 생성물을 크로마토토론(실리카, 8:2 n-헵탄/에틸 아세테이트) 상에서 정제하여 백색 고체로서 52mg(83%)의 {3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)-페녹시]페닐}-아세트산 메틸 에스테르를 수득하였다.

(d) {3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)-페녹시]페닐}-아세트산.

{3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)-페녹시]페닐-아세트산 메틸 에스테르(25mg, 0.04mmol)을 0.5ml의 메탄올에 용해시켰다. 0.3ml NaOH(1M, 수용액)을 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응을 0℃에서 1M HCl로 산성화시키고, 증발시키고, EtOAc로 추출하였다. 추출물을 MgSO₄상에서 건조시키고, 농축시키고, 진공하에 건조시켜 백색 고체로서 {3,5-디브로모-4-[5-이소프로필-4-메톡시-2-(3-메틸-벤조일)페녹시]페닐}- 아세트산 19mg(80%)을 수득하였다.¹H NMR(CDCl₃) δ7.80(m, 2H), δ7.42(s, 2H), δ7.33(m, 2H), δ6.98(s, 1H), δ6.24(s, 1H), δ3.80(s, 3H), δ3.57(s, 2H), δ3.22(m, 1H), δ2.37(s,3H), δ1.07(d, 6H).

실시예 2: 수용체 결합

본 결과는 KB285가 덱사메타손(이하 dex라도 함)과 같은 유사한 결합 친화성을 갖는 GR에 결합하는 글루코코르티코이드 수용체를 나타낸다. 덱사메타손에 대한 IC₅₀은 9.1nM이고, KB285에 대한 IC₅₀은 19mM이다(표 2참조). 프로게스테론, 미네랄코르티코이드 및 안드로겐 수용체에 대한 유사한 결합 경쟁 검정을 사용하여 본 발명자들은 KB285가 이들 수용체에 대해 매우 낮은 결합 친화성을 가짐을 보여주었다(표 2).

안드로겐 수용체(AR), 글루코코르티코이드 수용체(GR), 미네랄코르티코이드 수용체(MR) 또는 프로게스테론 수용체(PR)중 어느 하나를 발현시키는 Sf9 세포로부터의 사이토솔(cytosol)을 비표지 리간드의 농도를 증가시키면서[³H]-스테로이드로 4℃에서 16 내지 18시간 동안 인큐베이팅시켰다. 비표지 리간드를 DMSO로 희석시키고, 형성된 4.3%의 [³H]-알도스테론, [³H]-덱사메타손, [³H]-미볼레론 및 [³H]-R5020의 DMSO 최종 농도를 MR, GR, AR 및 PR 각각을 갖는 트레이서로서 사용하였다. 상응하는 비방사성 리간드는 대조군으로서 사용하였다. 수용체 결합 및 비결합 리간드를 세파덱스 G 25 칼럼(QS-2A)으로 분리시켰다. 수용체 결합 방사활성을 랙베타(RackBeta, Wallace OY)로 측정하였다.

표 2

수용체/표지 리간드	기준/화합물	IC₅₀(nM)	log IC₅₀
hGR/³H-dex	덱사메타손/KB285.2	9.119	-8.0416
	덱사메타손/KB285.2	9.119	-7.7136
hPR/³H-R5020	R5020/KR285.2	2.93800	-8.5329
	R5020/KR285.2	2.93800	-5.4175
rMR/³H-aldo	알도스테론/KR285.2	6.62400	-8.1785
	알도스테론/KR285.2	6.62400	-5.6272
hAR/³H-mib	미볼레론/KR285.2	3.85500	-8.4154
	미볼레론/KR285.2	3.85500	-5.2605

실시예 3: 세포 기재 검정

글루코코르티코이드 리포터 세포주 GRAF 세포에서, KR285는 길항 효과, 즉, IC₅₀= 0.4μM을 가지나, 작용제 효과는 갖지 않는 것으로 나타났다. 도 1의 투여 반응 곡선은 본 화합물이 IC₅₀= 0.4μM을 갖는 리포터 유전자인 알칼리 포스파타제(ALP)의 발현에 있어서 덱사메타손-자극된 증가를 억제할 수 있음을 보여준다.

특히, 화합물 KB283 및 RU486은 pMT-hGR 및 리보터 벡터 pMMTV-ALP로 안정하게 트랜스펙션된 CHO-K1 세포인 GRAF 세포에서 시험하였다[참조: Alksnis, M et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 10078-10085, Nilsson et al., (1994) Advances in Steroid Analysis '93, "Proceedings of the 5th Symposium on the Analysis of Steroids", Ed. G'r'g S. Published by AkadJmiai Kiad＼, Budapest, Hungary, p. 57-67]. 세포를 페놀 레드 부재하에 10% 태아 소혈청이 보강된 햄(Ham) F12 배지에서 통상적으로 배양하였다. 세포를 지시된 화합물의 농도로 opti-MEM에서 46시간 동안 유도하였다. 분비된 알칼리 포스파타아제 활성을 세포 배지에서 사실상 문헌(Tizard, R et al.(1990) Proc. Natl. Sci. U.S.A. 87: 4514-4518 and Nilsson et al(1994), 상기)에 기술된 바와 같이 화학발광 검정에 의해 분석하였다.

간 유도된 H4IIE 세포(Hepatoma cells, TAT assay); KR285 또한 길항 효과, 즉, IC₅₀= 0.4μM을 갖는 것으로 나타났으나, 이 화합물 또한 작용제 효과는 갖지 않는 것으로 나타났다.

특히, H4IIE 세포를 10% FCS, 1% 비필수 아미노산 및 2mM L-글루타민으로 보충된 MEM중에서 통상적으로 배양시켰다. 웰당 0.75 x 10⁶세포 처리를 위해, 96 웰 플레이트로 시이딩하였다. 24시간 후에, 배지를 1% DCCFCS(덱스트란-피복된 목탄으로 스트리핑된 FCS)로 보충된 MEM으로 대체하고, 화합물을 24시간 동안 첨가하였다. TAT 활성을 다이아몬드스톤(T.I. et al. (1996) Anal. Biochem 16, 395-401)으로부터 개질시켜 96웰 플레이트에서 측정하였다.

KB285는 헵파토마 H4IIE 세포 상에서 수행된 TAT(tyrosine aminotransferase) 검정에서 길항 작용성을 나타냈다. 도 2에 도시된 바와 같이, KB285는 투여 의존 방식으로 TAT 활성에서 덱사메타손-유도 증가에 대해 길항작용을 할 수 있으며, IC₅₀는 2.5μM였다. 상기 화합물을 작용제 효과는 나타나지 않았다(도 2).

실시예 4: db/db 마우스에서의 생체내 시험

수컷 C57BL/Ks J Rj-db/db 마우스를 입수하였다(Centre d'Ilevage R. Janvier, Le Genesr-St-Isle, France). 모든 동물을 표준 동물 우리에 가두고, 물로의 접근을 자유롭게 하고, 임의로 표준 실험실 음식을 공급하였다. 실험에 사용된 마우스는 7-8 주령이었고, 처리당 5마리의 동물을 사용하였다. 실험에서의 약제 투여량은 8, 25 및 75mg/kg이었고, 화합물을 1% 히드록실에틸셀룰로오스 및 1% 트윈 80으로 보충된 살균수중의 현탁액으로서 경구 투여용으로 제조하였다. 마우스에게 두가지 투여, 즉, 첫번째 투여는 4.30pm에, 두번째 투여는 8.00am에 제공하였다. 동물을 혈액 샘플링 전에 4시간 단식시켰다. 혈액 샘플을, 12.30pm에 이소플루란 마취 하에서 비히클 및 화합물 처리된 동물로부터 심장에서 수거하였다.

KB285는 db/db 마우스에서 단식 혈청 글루코스 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 글루코스 감소 효과는 25mg/kg 투여량에서 비히클 대조군에 비해 62%였다. 기준 물질인 RU486은 75mg/kg의 투여량에서 33%의 글루코스 감소 효과를 나타냈다(도 3). 코르티코스테론은 전신 글루코코르티코이드 효과에 대한 마아커로서 사용되었다. RU486은 비히클로 대조군(301ng/ml)과 비교하여 코르티코스테론 수준(584ng/ml)에서 증가를 나타냈다. 이는 RU486의 전신 효과에 기인한다. KB285의 효과는 360ng/ml의 코르티코스페론 수준에 대해 덜 두드러진다(도 3). 이는 KB285가 RU486에 비해 부작용/전신 효과를 감소시킴을 시사한다.

결과

화합물	투여량 mg/kg	글루코스 g/l	코르티코스테론 ng/ml
KB000285비히클	82575-	2.66±1.571.44±0.372.72±0.793.81±1.52	386±49.4364±42436±301±34.5

Claims

당뇨병 치료를 위한 약제 조성물의 제조에서의 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제의 용도.
예외적인 간 조직에서의 글루코코르티코이드 조절된 유전자 발현을 조절하기 위한 약제 조성물의 제조에서의 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제의 용도.
제 1 항에 있어서, 당뇨병이 제 2형 당뇨병이거나 장애된 글루코스 내성임을 특징으로 하는 글루코코르티코이드 길항제의 용도.
제 1 항에 있어서, 당뇨병이 제 1형 당뇨병임을 특징으로 하는 글루코코르티코이드 길항제의 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택적 글루코코르티코이드 길항제가

(I)

임을 특징으로 하는 용도.
하나 이상의 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제를 포함하는, 당뇨병을 치료하기 위한 조성물.
제 6 항에 있어서, 글루코코르티코이드 길항제가

(I)

임을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 글루코코르티코이드 길항제가 글루코코르티코이드 수용체에 대한 친화성이 10^-6M 미만임을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 인슐린, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다아제 억제제, 트리아졸리딘디온, PPAR γ 작용제로부터 선택된 하나 이상의 다른 화합물을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
PEPCK, 글루코스 6 포스파타아제, 및 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제로 처리된 트랜스아미나아제로부터 선택된 하나 이상의 간 효소의 발현을 낮추거나 감소시키는 것을 포함하여 당뇨병을 치료하는 방법.
제 10 항에 있어서, 간 선택적 글루코코르티코이드 길항제가

(I)

임을 특징으로 하는 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 트랜스아미나아제가 간에서 글루코코르티코이드 조절되고 발현됨을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 트랜스아미나아제가 티론신 아미노트랜스퍼라아제 또는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제임을 특징으로 하는 방법.