KR20010032491A - 생체 발광 생체 리포터 집적회로 - Google Patents

생체 발광 생체 리포터 집적회로 Download PDF

Info

Publication number
KR20010032491A
KR20010032491A KR1020007005733A KR20007005733A KR20010032491A KR 20010032491 A KR20010032491 A KR 20010032491A KR 1020007005733 A KR1020007005733 A KR 1020007005733A KR 20007005733 A KR20007005733 A KR 20007005733A KR 20010032491 A KR20010032491 A KR 20010032491A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bioreporter
light
dna
toluene
cells
Prior art date
Application number
KR1020007005733A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100591965B1 (ko
Inventor
심슨마이클엘
세일러개리에스
파울러스마이클제이
Original Assignee
유티-배텔, 엘엘씨
더 유니버시티 오브 테네시 리서치 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유티-배텔, 엘엘씨, 더 유니버시티 오브 테네시 리서치 코포레이션 filed Critical 유티-배텔, 엘엘씨
Publication of KR20010032491A publication Critical patent/KR20010032491A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100591965B1 publication Critical patent/KR100591965B1/ko

Links

Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01L—SEMICONDUCTOR DEVICES NOT COVERED BY CLASS H10
    • H01L27/00—Devices consisting of a plurality of semiconductor or other solid-state components formed in or on a common substrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0002—Remote monitoring of patients using telemetry, e.g. transmission of vital signals via a communication network
    • A61B5/0031—Implanted circuitry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/808—Optical sensing apparatus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/879—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/909—Vibrio
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Microelectronics & Electronic Packaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)

Abstract

본 발명은 생체 리포터와 OASIC 로 구비하는 모노리식 생체 전자 소자를 제공한다. 이러한 생체 발광 생체 리포터 직접 회로(BBIC)는 지하수, 산업 처리 장치 및 전쟁터와 같은 열악한 환경의 지역에 있는 오염 물질, 폭발물 및 중금속과 같은 물질을 검출하는데 이용된다. 또, 본 발명은 환경 오염 물질 검출, 오일 탐사, 약물 발견, 산업 처리 제어 및 위험한 화학 모니터링을 위한 장치 및 방법을 제공한다.

Description

생체 발광 생체 리포터 집적회로{BIOLUMINESCENT BIOREPORTER INTEGRATED CIRCUIT}
1.2 관련 기술의 설명
생체 센서는 생물적 구성 요소와 분석 측정 요소를 결합한 하이브리드 소자이다. 생물적 구성 요소는 통상, 관련된 피분석물과 반응 및/또는 상호 작용하여 전자, 광학 또는 기계 변환기에 의해 정량화가 가능한 응답을 한다. 가장 많이 사용하는 구성은 필요한 선택도를 제공하는 생물적 구성 요소로서 효소 또는 항체와 같은 운동성이 없는 생물 분자를 사용한다. 이 보다 덜 사용되는 또 다른 방법은 살아 있는 미생물 또는 기관이나 조직의 일부를 생물적 구성 요소로 사용한다. 때로는 전세포 생체 센서(whole-cell biosensor)[보우세(Bousse), 1996]라고도 불리우는 이들 바이오 센서는 처음부터 전기화학 변환기를 사용하여 성장하는 세포의 활성을 검출하였다[부에르크(Buerk), 1993]. 전세포 생체 센서는 피제어 환경에서 그 기능을 하였으나, 널리 적용되지는 못하고 있는데, 이는 주로 목적 피분석물을 제외한 기타 영양분의 증가에 의한 간섭 때문이다.
또는, 분자 생물학적인 기술을 사용하여 더 큰 선택도를 가지는 세포 또는 생체 리포터 스트레인을 생산하였다. 통상, 특정 프로모터 서열을 코딩하는 DNA 서열이 리포터 효소를 코딩하는 유전자와 융합되어 숙주 세포로 도입된다. 목적 분자가 존재하는 경우, 리포터 유전자는 발현되어서 피측정 신호를 생성하는 효소를 생산한다. 따라서 유전자 조절과 미생물 활성의 결과가 선택도를 제공한다.
통상 사용되는 리포터 효소로는 β-칼락토시다제(lacZ)와 카테콜 2,3-다이옥시지나제(xylE)가 있다. 이들 시스템은 신호를 생성하기 위하여 세포 파괴가 필요한 열량 검출 방법을 사용한다. 지난 십 년 동안, 생체 발광 리포터는 그 생체 발광 반응이 검출하기 쉽고, 세포를 파괴하는 분석이 아니므로 많이 사용되었다. 따라서 생체 리포터는 실시간으로 연속적으로 모니터링할 수 있다. 진핵 및 원핵 생체 발광 효소 모두를 사용하는 유전 공학적으로 처리된 생체 발광 생체 리포터가 개발되어서, 물과 토양의 독성 물질과 오염 물질을 검출하고 생체 이용률(bioavailability)과 오염 물질의 생물 분해에 대한 작용 프로세스를 측정하는 데 사용되었다.
생체 리포터의 생체 발광은 광전자 증배관, 광다이오드, 미소채널 플레이트, 포토그래픽 필름 및 전하가 결합된 소자를 포함한 수 많은 다른 형태의 광 변환기에 의해 검출되었다. 이들 많은 장치에서, 광은 집속되고, 이 광은 렌즈, 섬유 광 케이블 또는 액체 광 가이드를 사용하는 변환기로 전송된다. 그러나 적은 부피, 원격 탐지 또는 복수 병렬 감지를 필요로 하는 장치는 높은 선택도를 유지하면서도 작고 휴대용으로 된 새로운 형태의 기구를 필요로 한다.
생체 발광 리포터는 특정 물질이 대사 작용을 할 때에 빛을 생성하도록 유전공학적으로 처리된 유기체이다. 예를 들어서, 생체 발광(lux) 전사 유전자의 융합(fusion)을 사용하여 나프탈렌, 톨루엔 및 이소프로필벤젠과 같은 유기 화학적 오염 물질의 존재, 생체 이용률 및 생물 분해를 감지하는 데 사용될 수 있는 발광 리포터 박테리아 스트레인을 개발할 수 있다. 일반적으로, lux 리포터 유전자는 네이티브(native) 또는 벡터 플라스미드에서 유지되거나 또는 숙주 스트레인의 염색체 속으로 결합되어 있는 유도성 분해 오페론의 조정 제어 하에 놓일 수 있다.
석유 생산품의 광범위한 사용과 1998년 10월까지 지하 저장 탱크를 업그레이드, 교체 또는 폐쇄를 요구하는 현재 규제[브링클리(Brinkley), 1997] 때문에, 석유에 오염된 장소가 많아졌다. 특히, 더 수용성인 성분인 벤제, 톨루엔, 에틸벤젠 및 자일렌(BTEX)이 음용수 수질로서 관심이 되고 있다. 오염 물질의 생체 내 생물 분해에 달려 있는 자연 감소가 석유 오염 물질에 대해 특히 많은 관심을 받고 있다(국제 조사 위원회, 1993). BTEX를 생물 분해할 수 있는 미생물이 상기 장소에 존재한다면, 이들 장소의 조건들이 생물 분해가 일어나기에 좋은 조건인 지를 알아 볼 필요가 있다.
생체 발광 리포터가 유전자 발현을 실시간으로 비파괴 모니터링하는 데 널리 사용되었다. 헤이쪄(Heitzer)(1992) 등은 저급 나프탈렌 분해 오페론의 nahG에 lux 트랜스포손(Tn4431) 삽입을 포함하고 있는 킹(King)(1990) 등에 의해서 만들어진 nah-lux 리포터 스트레인 HK44을 사용하여 생체 이용률과 생물 분해에 대한 정량 분석법을 개발하였다. nah-lux 리포터는 지하수 모니터링에 적용하기 위한 온라인 광 생체 센서로의 사용으로 확장되었다(헤이쪄 등, 1994). 다른 lux 융합은 이소프로필벤젠의 분해[셀리포노바(Selifonova) 등, 1996]와 톨루엔의 분해[벌라지(Burlage) 등, 1994; 애플게이트(Applegate) 등, 1997]에 대한 것을 포함하여 이화 작용 유전자의 발현을 모니터링하도록 만들어졌다.
이화 작용 유전자 융합 외에도, lux 융합을 이용하는 다양한 유전자와 오페론이 연구되었다. lux 융합은 열 충격 유전자 발현[반디크(Van Dyk) 등, 1994; 1995], 산화 스트레스[벨킨(Belkin) 등, 1996], Hg(Ⅱ)의 존재(셀리포노바, 1993), 알긴산 생산(alginate production)[월레이스(Wallace) 등, 1994]을 모니터링하기 위하여 만들어졌다. 이들 모든 경우에 있어서, lux 융합은 플라스미드를 기반으로 하고, pUCD615에 포함된 Vibrio fischeri에서 나온 프로모터가 없는 lux 유전자의 앞부분에 관련되는 프로모터를 위치시켜서 제조되었다[로고우스키(Rogowsky) 등, 1987].
1.3 종래 기술의 문제점
생체 리포터와 OASIC을 모두 포함하면서 매우 작고, 튼튼하며, 저렴하고, 전력 소모가 적으며, 무선인 모놀리식 생체 전자 디바이스(monolithic bioelectronic device)에 대한 필요성이 대두되었다. 여기서, 모놀리식 생체 전자 디바이스란 생물적 구성 요소와 전기적 구성 요소를 포함하는, 단일 기판층에 제조되는 디바이스이다. 이러한 생체 발광 생체 리포터 집적회로(BBIC)는 지하수, 산업 처리 장치 및 전쟁터와 같은 혹독한 지역에 있는 오염 물질, 폭발물 및 중금속과 같은 물질을 검출할 수 있다. 상기 장치에 대한 애플리케이션으로는 환경 오염 물질 검출, 오일 탐사, 약물 발견, 산업 처리 제어 및 위험한 화학 모니터링을 포함한다. 상기 센서가 저렴하고, 광범위하며, 다양한 이용 방법이 나온다면, 많은 수의 센서가 매우 광범위한 영역에서 상당한 범위에 적용될 것이다.
1.0 발명의 배경
본 출원은 1997년 11월 25일 제출된 미국 특허 출원 제08/978,439호의 일부 계속 출원이다. 상기 출원의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조되어 본 발명의 일부를 이룬다. 미국 정부는 자원부의 허가 번호 FG05-94ER61870과 미공군의 허가 번호 FG9620-89-C-0023에 따라 본 발명에 있어서 권리를 가지고 있다.
1.1 발명의 분야
전자 회로는 발광 반응(luminescent response)을 검출하는 데 사용될 수 있는데, 특히 광학 응용 주문형 집적회로(OASIC)가 사용될 수 있다. 이 집적회로는 아날로그 신호 컨디셔닝, 디지털 신호 처리 및 무선 전송을 감광성 전자-광학 검출기와 결합시킨 것이다. 생체 리포터의 발광 반응에 대해 최대한의 감도를 얻기 위하여, OASIC는 가시 영역인 400 nm 내지 700 nm의 광에 민감하여야 하고, 누설 전류와 노이즈가 적어야 하며, 온도와 습도와 같은 주변 요인의 변화에 대해서 감도가 최소로 되어야 한다. 상기 소자는 단일 기판 상에서 표준 상보형 금속 산화막 반도체(CMOS) 공정을 통하여 제조될 수 있다.
3.0 도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 일실시예를 나타내는 사시도.
도 2는 본 발명의 예시적인 BBIC 의 검사 결과인 측정 신호를 나타내는 도면.
도 3a는 표준 n형 웰 CMOS 공정을 이용하여 만들어질 수 있는 고급의 광검출기를 나타낸 도면.
도 3b는 절연층상에 SOI(Silicon-On-Insulator) CMOS 공정에서 만들어진 2개의 광검출기 구조로서, 왼쪽에는 래터럴 PIN 검출기가 있고, 좌측에는 왼쪽에 있는 것과 유사한 소자지만 접합이 쇼트키 접합으로 형성되었다는 것만 상이한 광검출기 구조를 나타내는 도면.
도 4는 도 1의 광검출기와 단일 IC 상의 관련 신호 조절 및 처리 회로와 함께 나타낸 도면.
도 5는 본 발명의 신호 처리부의 일실시예를 나타낸 블록도.
도 6은 본 발명의 일실시예를 나타낸 측면도.
도 7a는 p형 확산층, n형 웰, p형 기판으로 구성된 간단한 광다이오드를 나타내는 도면.
도 7b는 광을 효율적으로 수집하는 대규모 광다이오드와, 광전류를 제거하는 순방향 바이어스 전류를 공급하는 피드백 루프의 소규모 다이오드를 이용한 회로를 나타낸 도면.
도 7c는 상관 이중 샘플링(CDS)를 이용하여 저주파수(플리커) 증폭기 노이즈의 영향을 최소화하고 증폭기 오프셋 전압의 시간 또는 온도 종속 편차를 최소화하는 회로를 나타낸 도면.
도 8은 물과 영양분이 공급된 생체 리포터를 나타낸 도면.
도 9a, 9b, 9c, 9d 는 다중의 생체 리포터를 이용하는 방법을 개념적으로 나타내는 도면으로서, 여기서 상이한 생체 리포터는 A, B, C 등으로 표시되었으며, 도 9a는 각각 상이한 생체 리포터를 포함하는 다수의 개별 섹션으로 구분된 생체막을 나타내며, 도 9b는 각각 상이한 생체 리포터를 갖는 다수의 생체막을 나타내고, 도 9c는 단일의 생체막 내에 다중의 생체 리포터가 조합된 것을 나타내고, 도 9d는 각각 상이한 생체 리포터를 포함하는 여러 개의 개별 층을 갖는 생체막을 나타내는 도면.
도 10은 mini-Tn5 및 클로닝 벡터, pIJS 를 발생시키는 부위 지향된 돌연변이 유발에 사용되는 프라이머 서열을 도시한 것이다. 별표(*)는 프라이머와 표적 서열간의 부정합을 나타낸다. *A* 는 우발적으로 합성되는 여분의 아데닌을 나타낸다.
도 11은 mini-Tn5Kmtid-lux 의 구성에 대한 다이아그램을 나타낸 것이다. A/X 및 Nh/X 는 각각 AvrII-Xhal 및 Nhel-Xbal 이종 클로닝 부위를 나타낸다. 약어: N, NotI; Sa, SalI;X, Xhal
도 12는 유일한 제한 부위를 갖는 pLJS 를 나타낸 것이다. 약어: A, AvrII; Ac, AccI; Ap,ApaI; B,BamHI; Bs, BstXI; C,ClaI;D, DraII; E, EcoRI; Ea, EagI; EV, EcoRV; H, HindIII; He HincII; K, KpnI; N, NotI; Nh, NheI; P, PstI;S, SpeI; Sa, SalI; Se, SacI; ScII, SacII, Sm, SmaI; X, XbaI, Xh, XhoI
도 13은 2시간 노출 후 증가하는 톨루엔의 농도에 대한 TVA8 의 생체 발광 반응을 나타낸 것이다. 값은 3회 반복한 평균값이고, 세포 밀도(OD546)로 표준화된다.
도 14는 톨루엔 증기를 사용하는 MSM 상에서 성장되는 TVA8(원) 및 FI(삼각형)의 배치 배양에 대한 성장 곡선을 나타낸 것이다. 값은 3회 반복한 평균값이고, 오착 막대는 하나의 표준 편차를 나타낸 도면.
도 15는 배치 조건하에 톨루엔 증기상에서 TVA8의 생체 발광성 및 성장을 나타낸 도면., △, A 는 많은 생체막의 개별 복제를 나타낸다. 사각형은 3개의 복제물의 546 nm(OD546)에서의 평균 광학 농도를 나타낸다.
도 16은 tod-lux 리포터 플라스미드, pUTK30의 구성을 도시한 도면으로서, pDTG514(Menn, 1991; Menn 등, 1991)으로부터의 2.75-kb EcoR1-Xbal 단편은 pUCD615 내의 프로모터 없는 lux 유전자 카세트의 앞에서 복제된다. 약어: B, BamHI; Gb, Bglll; E, EcoR1; II, HindII; K, Kpml; Ps, Pstl; Pv, PvuII; Sc, SacI; S, Sall;, Sm, Smal; X, Xhal.
도 17은 TCE의 코메타볼리즘(cometabolism)의 모니터에 이용되는 온라인 DVR 시스템의 블록도.
도 18은 1.5 시간 노출 후에 성장 세포 에세이(assay) 내에 mgL-1톨루엔()으로 표현되는, 톨루엔() 및 JP4 제트 연료의 농도 변화에 반응하는 생체 발광을 도시한 도면.
도 19는 배치 연구에서 P. putida B2 잔여 세포를 10 mgL-1톨루엔의 다중 혹은 단일 노출에 반응하는 생체 발광을 도시한 도면.
기호:다중 노출; △ 단일 노출.
도 20은 20시간 주기로 10 mgL-1톨루엔의 사각형파 섭동(perturbation)에 반응하여, P.putida B2에 의한 TCE의 생체 발광 및 코-메타볼리즘을 도시한 도면.
기호:생체 발광,유출 TEC,유출 톨루엔,피드 중 TEC, - - - 피드 중 톨루엔.
도 21은 리엑터의 확대되고 잘려진 도면. 피드는 작은 알긴산 비드로 리엑터 본체에 에치된 채널 및 부착된 금속 플릿에 의해 고정된 세포로 채워진 리엑터 구멍에 분포된다. 환형 삽입구는 0.2㎛의 상측 금속 플릿에 대향한 하이드로포빅 필터를 보유하여 흐름에 상당히 균일한 저항을 주고, HPLC로의 자동 주입용 청정 흐름을 제공한다. 필터에 의한 흐름의 저항은 청정 필터에 대하여 통상 50 psig이다.
도 22는 칼슘 알긴산상의 나프탈렌 및 살리실레이트염의 흡수 분리피(absorption isoterms)를 도시한 도면. 나프탈렌은 실험 조건에서 선형적으로 흡착되는 반면, 살리실레이트는 거의 분할되지 않는다.
도 23은 1a-c 및 4a-f의 연구의 실제의 예측된 농도를 도시한 도면. 에러 막대는 평균값으로 도시된다. 실선은 전체 데이터 세트에 대해 일정한 리스트-스퀘어 반응율(least-square reaction rate)을 이용한 모델 예측을 나타낸다. 모델은 전반적으로 2차이며, 생체량의 제1차 및 살리실레이트의 제1차는 일정한 비율인 2.23 x 10-2dm3/g mol을 갖는다. 실험 데이터는 표 8로부터 묘사된다.
도 24는 2a-c 및 3a-f의 연구의 실제의 예측된 농도를 도시한 도면. 에러 막대는 평균값으로 도시된다. 실선은 전체 데이터 세트에 대해 일정한 리스트-스퀘어 반응율을 이용한 모델 예측을 나타낸다. 모델은 전반적으로 2차이며, 생체량의 제1차 및 살리실레이트의 제1차는 일정한 비율인 2.23 x 10-2dm3/g mol을 갖는다. 실험 데이터는 표 8로부터 묘사된다.
도 25는 추가 단계에 의해 HK44의 청정 베드가 "쇼크된(shocked)" 때, 살리실레이트의 비일반적인 일시적인 반응을 도시한 도면. 일시적 반응은 세포로의 유발인자의 급격한 이동에 기인한 초기 비대칭과 느린 속도의 초기 분해율에 기인한다. 상기 초기의 일시적 양상 후에, 광세기는 유발자의 농도를 모사한다. 상기 일시적 양상은 연구의 초기에서만 관찰된다. 광세기는 후속의 유발자 농도 변화를 추종한다.
도 26은 알긴산-비운동상태의 P.fluorescens HK44에 의한, 광 탐침에서의 PBR 내부의 추정 농도의 함수로서 특정한 안정 상태의 광 방출을 도시한 도면. 표준 편차는 평균값이 도시된다. 선분은 각 데이터 세트에 대한 평균 선형 반응에 대한 응답이다.
도 27은 흐름 세포 내의 나프탈렌에 대한 HK44의 반응을 도시한 도면. 광세기는 흐름 세포 내의 살리실레이트 농도의 상승 및 하강을 모사한다. HK44는 광다이오드상의 알긴산 내에서 고정된다.
도 28은 흐름 세포 내의 나프탈렌에 대한 HK44의 응답을 도시한 도면. 광세기는 흐름 세포 내의 나프탈렌 농도의 상승 및 하강을 모사한다. HK44는 광다이오드상의 알긴산 내에서 고정된다. 도 27에서보다 큰 응답 래그(lag)가 관측된다. 상기 래그 시간은 나프탈렌 및 살리실레이트가 세포로 이송되고 소비되는 방법의 결과일 수 있다. 흡착과 같은 물리적 처리도 래그 시간에 영향을 준다.
도 29a 및 도 29b는 5시간의 유도 후에, 정규화한 대수적 광 레벨을 도시한 도면. 광 레벨은 nA cfu-1로 표현된다. 단순 용액, SS(도 29a) 및 혼합 용액, CS의 유도에 기인한 반응이 도시된다. 광이 생성되지 않을 때, pH 3-5의 지하수에 대한 데이터는 도시되지 않는다. YPEG는 이스트(yeast) 엑스프랙트(exfract)/펩톤/글루코스 배지를 표현한다.
도 30a 및 도 30b는 고정된 HK44에 의해 살리실레이트의 흡수력의 백분율을 도시한 도면. 도 30a는 SS의 유도 후의 흡수력을 도시하고, 도 30a는 SS의 유도 후의 흡수력을 도시한다.
도 31은 알긴산 비트 내의 HK44의 동작을 도시한 도면. 콜로니-형성 유닛(colony-forming units)/알긴산 대수(logarithm of number)가 도시된다.
도 32a 및 도 32b는 SS(도 32a) 및 CS(도 32b)에 대한 생체 발광 반응의 율을 도시한 도면. 규준화된 율은 5시간의 유도 기간 내에 수집된 광 데이터의 세트로부터 계산된다. 상기 데이터 세트는 회귀 공분산(regression covariance)의 계산이 이용된다.
도 33은 마이크로 송신기에 대한 오크 릿지 국립 연구소(Oak Ridge National Laboratory)의 연구의 일환으로서 보통 꿀벌에 장착된 집적회로(IC)의 개략도.
도 34는 분산 신경망에 함께 연결된 복수 개의 BBIC를 도시한 도면.
도 35는 도 34에 도시된 분산 신경망으로부터의 단일 BBIV를 도시한 도면.
도 36a, 도 36b, 도 36c는 BBIC를 도시한 도면. 도 36a는 40-핀 세라믹 캔터(canter) 및 세포 대한 봉합물에 장착되고 광학 응용 주문형 집적회로(OASIC)를 도시한다. 도 36b는 실험용 구성으로서, 칩에 장착된 인클로저를 도시한 도면이다. 도 36c는 아가 플러그(agar plug)상의 생체 리포터를 구비한 인클로저를 도시한다. O-링은 세라믹 칩 캐리어와 생채리포터 인클로저 사이의 광-결합 봉합(light-tight seal)을 형성하는 데 이용된다.
도 37은 BBIC의 실시예에 이용되는 OASIC를 도시한 도면. 상기 장치는 2.2 x 2.2 mm이고, 표준 상보형 금속 산화 반도체(CMOS) 공정으로 제조된다.
도 38은 생체 리포터 Pseudomanas putida TVA8을 채택한 BBIC에 대한 총시간의 함수로서의 톨루엔의 최소 검출 농도를 도시한 도면.
2.0 발명의 개요
본 발명은 생체 발광 검출 장치를 이용하여, 샘플 내의 특정 물질의 검출 및 정량하는 새로운 장치 및 방법을 제공함으로써 상기 요구와 기타 종래 기술의 문제점을 극복한다. 일반적인 특징으로서, 본 발명의 BBIC 소자는 기판과, 이 기판에 부착되어 생체 리포터를 유지할 수 있는 선택적 투과성 용기를 구비하는데, 여기서, 생체 리포터는 상기 선택적 투과성 용기 내에 포함된 특정의 목적 물질이 발광하도록 물질 대사시킬 수 있으며, 상기 기판상에 위치하고 방사된 광에 응답하여 전기 신호를 발생시키도록 동작하는 광변환기를 구비하는데, 상기 전기 신호의 세기는 목적 물질의 존재 또는 농도를 나타내게 된다.
본 발명의 장치는 실리콘 질화물층과 같은 용기와 기판 사이에 생체 내성/생체 적합성 재료층을 더 포함한다. 본 발명의 BBIC 는 CMOS IC 인 것이 바람직하며, 상기 광변환기는 광다이오드인 것이 바람직하다. 본 발명의 IC 는 전류-주파수 변환기 및/또는 디지털 카운터를 포함할 수 있으며, 또한 하나 이상의 송신기를 포함할 수 있다. 이 송신기는 무선으로 하거나 통상의 유선으로 하여도 된다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명의 장치는 송신기로부터의 전송 데이터를 수신할 수 있는 중앙 데이터 수집 스테이션을 포함한다.
본 발명의 장치는 기판상에 하나 이상의 유체 또는 영양분 저장부와 하나 이상의 미세유체 펌프를 포함함으로써 본 발명의 장치에 이용되는 생체 리포터 유기체를 위한 영양분 수단을 제공할 수 있다. 생체 리포터는, 예컨대 하나 이상의 유전공학적으로 처리된 박테리아, 이스트, 균류, 식물 도는 동물 세포와 같은 하나 이상의 진핵 세포 또는 원핵 세포를 포함할 수 있다. 예컨대, 박테리아 세포는 Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus 등의 장 유기체와, Pseudomonas 속의 호기성 박테리아를 포함하는 Proteobacteria 군을 포함한다. 실시예에 있어서, 발명자들은 톨루엔 등과 같은 목적 피분석물의 양을 검출하는데 Pseudomonas 종 내에 포함된 생체 리포터를 이용하는 설비를 나타내었다.
선택 투과성 용기는 중합체 매트릭스를 구비할 수 있는데, 이 중합체 매트릭스는 가스 또는 액체와 같은 유체가 유입되어 생체 리포터와 접촉할 수 있도록 할 수 있다. 이 중합체 매트릭스는 광학적으로 투명하거나 거의 투명하여, 매트릭스를 통해 광이 전송되어 검출기에 의해 검출될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 선택사항으로서, IC 는 글로벌 위치설정 시스템(GPS)을 포함할 수 있다. BBIC 는 하우징(예컨대, 사출 성형 합성주지) 내에 제공되어 가스 또는 유체의 출입은 자유롭고 주변 광(ambient light)은 차단하도록 제공될 수 있다. 이러한 하우징은 프랫-블랙 피니시(flat-black finish) 및 메이즈형 통로(maze-like passage-way)를 구비할 수 있다. 액체 또는 가스는 통로의 구부러진 곳을 통과하여 용이하게 흐를 수 있으며, 주변 광은 각각의 구부러진 곳에서 (플랫-블랙 피니시에 의해)크게 감쇠될 것이다.
본 발명의 다른 실시예는 유체와 같은 물질을 검출하는 장치에 관한 것으로서, 이 장치는 광에 반응하는 회로에 전기 신호를 입력하는데 적합한 광변환기와, 물질이 물질 대사하도록 하여 이러한 물질 대사에 의해 광을 방사하도록 하며, 물질과 접촉하도록 된 생체 리포터와, 광변환기와 생체 리포터 사이에 위치하여 생체 리포터로부터 방사된 광을 광변환기에 제공할 수 있는 투명하고 생체 적합성이 있으며 생체 내성이 있는 분리기를 포함한다. 이 생체 리포터는 박테리아, 균류, 이스트, 식물 세포, 동물 세포 또는 이와는 선택적으로 발광 리포터 분자를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열이 될 수 있다. 이 장치는 생체 리포터를 둘러싸서 물질과 생체 리포터가 접촉될 수 있도록 하는 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다. 이러한 중합체 매트릭스는 물질에 대해 투과성을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 특정 물질의 농도를 검출하는 장치를 제공하며, 여기서의 생체 리포터는 Pseudomonas 이다. 특히, 이 생체 리포터는 특정의 목적 물질이 물질 대사하도록 하는 Pseudomonas fluorescens HK44 세포로 구성되고, 이러한 목적 물질의 대사 작용에 의해, 세포는 광을 방사하고, 이것이 검출기에 의해 검출되는 것이다. 세포에서 방사되는 광의 세기는 정량화되고, 샘플에 존재하는 목적 물질의 정량의 결정된다. 이 장치는 기판과 용기 사이, 즉 기판상의 유체 및 영양분 저장부와 미세유체 펌프 사이에 적어도 하나의 실리콘 질화물층을 구비한다. 이 영양분 저장부가 필요한 것은 유기체가 성장 및 생존하여 물질 대사 활성이 유지되고 목적 물질이 흡수되어 유기체에 의해 물질 대사될 수 있도록 하기 위한 것이다. 펌프에 의해 특정 성장 배지의 보충이 가능하고, 미생물 집단 내에서 성장 배지의 순환이 가능하게 된다. 본래, 특정의 성장 배지, 영양분, 최적의 성장 온도, pH, 기타 배양 조건은 생체 리포터로서 이용되는 유기체에 따라 변경되지만, 당업자라면 각각의 특정 BBIC 에 이용되는 특정의 생체 리포터 유기체를 위헌 적절한 성장 배지, 적절한 성장 조건을 이용할 수 있을 것이다.
IC 는 상보형 금속 산화물 반도체(CMOS) IC 인 것이 바람직하고, 이 집적회로 소자는 방사된 광에 반응하여 전류를 발생시키는 적어도 하나의 광다이오드와, 전류-주파수 변환기, 디지털 카운터, 무선 송신기 및 이 무선 송신기로부터 제공되는 전송을 수신할 수 있는 중앙 데이터 수집 스테이션를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 특징은 샘플에서 물질을 검출하기 위한 모노리식 생체 전자 소자에 관한 것이다. 이 소자는 물질을 대사 작용시켜 광을 방사시키는 생체 리포터와, 방사된 광의 수신에 따라 전기 신호를 생성하는 센서를 구비한다. 이 소자는 생체 리포터와 센서 사이에 위치한 투과성 생체 내성 및 생체 적합성 분리기를 포함할 수 있다.
표준 IC 는 실리콘 이산화물 또는 실리콘 질화물과 같은 하나 이상의 절연 재료층으로 코팅될 수 있다. 이 공정은 패시베이션이라 불리며, 습기, 오염 물질 및 기계적 손상으로부터 칩의 표면을 보호하는 기능을 한다. 이러한 코팅이 범용 칩에 적합한다고 하더라도, BBIC 는 많은 열악한 환경에 사용되어 표준 패시베이션 공정이 적합하지 않게 되는데 이용될 수 있다. BBIC 는 생체 적합성이고 생체 내성이 있는 다른 코팅을 필요로 하며, 화학적 스트레스로부터 OASIC 를 보호하여야 하고, 테스트 중인 재료로부터 광을 효율적으로 투과시키도록 광학적으로 조절되어야 하며, 산화 코팅에 접착되어야 하고, 핀 구멍이 없어야 하며, 접착 패드 위에 개구를 형성하도록 패턴화될 수 있어야 하며, 어떤 구조이든 간에 생체 리포터를 유지하여야 하고 샘플을 수집할 수 있어야 한다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 각각의 구성 성분을 구입할 수 있고 개별적으로 조립할 수 있지만, 편의상 생체 센서의 구성 성문의 키트 형태로 패키지화될 수 있다. 이 키트는 적당한 용기 수단 내에, 하나 이상의 생체 리포터와 광변환기를 포함하는 IC 를 구비할 수 있다. 이 키트는 하나 이상의 생체 리포터를 포함하는 단일의 용기 수단과, 광 변환기를 포함하는 IC 를 구비할 수 있다. 또, 본 발명의 키트는 각각의 구성 성분을 위한 개별 용기 수단을 구비할 수 있다. 이 경우, 하나의 용기가 하나 이상의 생체 리포터를 포함하게 되면, 다른 용기는 본 명세서에서 개시된 적절한 배지에 미리 캡슐화되거나 그 때 캡슐화되고, 또 다른 용기는 IC 를 포함할 수 있다. 각각의 구성 성분을 위해 개별 용기 수단을 사용하게 되면, 키트의 다양한 구성 성분을 변형시킬 수 있을 것이다. 예컨대, 여러 개의 생체 리포터는 검출하길 원하는 하나의 물질에 따라 선택이 가능할 수 있다. 생체 리포터를 교체하면, 상이한 목적을 위해 키트의 나머지 구성 성분을 이용하여 구성 성분을 재사용하는 것이 가능하다.
용기는 작은 유리병, 검사 튜브, 패킷, 슬리브, 쉬링크랩(shrink wrap), 기타 다른 용기 수단과 같은 용기를 사용할 수 있으며, 이 용기 안에 키트의 구성 성분을 놓을 수 있다. 또, 생체 리포터는 더 작은 용기로 원하는 만큼 정제(aliquot)할 수 있다.
본 발명의 키트는 예컨대, 그 안에 작은 유리병이 있는 사출 성형 또는 블로우 성형 합성수지 용기와 같은 상업적 판매용으로 대단히 제한되어 있는 개별 용기를 포함하는 수단을 포함할 수 있다.
용기의 수에는 관계없이, 본 발명의 키트는 IC 상에 생체 리포터를 위치시키는 것을 지원하는 기구를 구비하거나 이 기구와 함께 패키지화될 수 있다. 이러한 기구는 시린지, 피펫, 겸자 또는 다른 유사한 장치가 될 수 있다.
사실상, 필요한 구성 성분을 실질적으로 적당히 패키지화하거나 운반하는 것은 생체 리포터가 그 기능을 유지하는 한 유용하다. 예컨대, 알긴산나트륨과 박테리아 서스펜션과 같은 매트릭스 상에 생체 리포터 칩을 장기간 보관하기 위해서는 냉동이 필요하고 유기체가 가시 상태를 유지하기 위해 건조되는 것을 방지하는 것이 필요하다.
본 발명의 키트는 하나 이상의 개별 생체 리포터와 단일의 광검출기를 구비할 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 나프탈렌과 톨루엔을 검출하기 위한 키트는 하나의 생체 리포터와, 나프탈렌을 검출하기 위한 생체막과, 톨루엔을 검출하기 위한 개별 및/또는 분리된 생체막을 구비할 것이다. 상기 2개의 생체막은 각각의 검사된 화합물을 개별적으로 센서에 순차적으로 적용할 수 있으며, 또한 어떤 환경하에서, 이들 생체막은 칩과 이와 동시에 검사되는 화합물에 대해 일렬로 적용될 수 있다. 다양한 실시예가 도 9a, 9b, 9c 및 9d 에 나타나 있다. 도 9a 에 도시된 바와 같이 여러 개의 생체막이 어레이식으로 배치되어, 여러 개의 상이한 생체 리포터들이 동시에 검사받을 수 있도록 할 수 있다. 단일의 개별 생체막에서 제공되는 신호가 광검출기에 의해 검출될 수만 있다는 개별 생체막의 수는 무한하게 할 수 있다고 생각한다. 또, 도 9b 에 도시된 바와 같이, 각각의 개별 생체막은 칩에 순차적으로 적용될 수 있다. 또, 도 9c 에 도시된 바와 같이, 여러 개의 생체 리포터들은 하나 이상의 생체막 내에서 혼합될 수 있다. 또, 이 생체막들은 도 9d에 도시된 것처럼 층을 이루어서 여러 개의 생체막이 동시에 측정될 수 있도록 한다.
4.0 실시예의 설명
도 1 내지 도 32에 도시된 본 발명의 바람직한 실시예에서, 다양한 도면내의 상응하는 부분은 동일한 참조 부호를 사용한다.
4.1 시스템 개관
광다이오드가 반도체 기판에 집적되는데, 신호 처리 전자회로와 데이터 저장 회로, 하드-와이어드 통신망을 통해 측정 데이터의 전송을 하는 회로 또는 데이터의 원격 판독용 무선 통신 회로를 따라 집적된다. 미세-발광 측정 시스템의 핵심 요소는 동반 회로의 제조에 채택되는 반도체 공정에 적합한 광다이오드, 전기적 잡음 속에서 저레벨 광신호의 검출을 위한 저잡음 전자회로 및 데이터 처리 및 저장 시스템으로 데이터를 전송하기 위한 통신회로(유선 또는 무선)이다.
도 1은 본 발명의 사시도이다. 검출된 물질(20)은 중합체 매트릭스(22)를 통해 BBIC(21)로 들어간다. 물질이 검출되면, BBIC는 물질의 농도를 나타내는 신호를 중심 위치로 전송한다.
도 6은 본 발명의 측면도이다. 생체 리포터는 중합체 매트릭스(103)에 봉입되는데, 상기 매트릭스는 보호 코팅(101)로 광검출기(102)와 분리된다. 단일 기판(100)은 신호 처리 및 전송을 위한 추가 회로(104)뿐 아니라 상기 소자를 수용한다.
도 3a는 표준 N-웰 CMOS 공정으로 제조된 고품질 광검출기를 도시한 도면이다. 광검출기는 평행한 두 개의 역바이어스 다이오드로 구성되어 있다. 상측 다이오드는 P+ 활성층(45) 및 N-웰(46) 사이에 형성되고, 하측 다이오드는 N-웰(46) 및 P-기판(47) 사이에 형성된다. 상측 다이오드는 양호한 단파장 감광도(400-550nm)를 갖는데, 하측 다이오드는 양호한 장파장 감광도(500-1100nm)를 갖는다. 따라서, 전체 다이오드는 400nm 내지 1100nm 범위의 감광도를 갖느다. 테스트용 발광 복합물(41)은 Si3N4층(40)과 SiO2층(42)에 의해 광검출기와 분리된다.
도 4는 집적회로(60)상의 신호 조절회로(65) 및 신호 처리회로(64)와 결합된, 도 1의 광검출기(66)를 도시한다. 아날로그 신호 조절회로의 목적은 증폭하고 상대적으로 적은 광검출기 신호를 필터하여 임계치와 비교하고, 디지털화하고, 또는 송신을 위해 변조하는 것이다. 광대역 잡음의효과가 신호의 통합에 의해 감소되지만, 상기 통합은 1/f 잡음에 대해 취약한 효과를 갖는다. 저주파 잡음에 대한 효과는 상호관련된 이중 샘플링(CDS)를 이용하여 감소시킬 수 있는데, 두 샘플이 짧은 시간 주기 내에 취해져서 한 샘플은 신호와 잡음으로 구성되고 다른 샘플은 잡음만으로 구성되도록 한다. 잡음의 저주파 성분은 상기 두 샘플의 차이로 현저하게 저감된다.
표적 물질이 생체 리포터에 도달하면, 이것은 메타볼라이즈되고, 생체 리포터는 약 400 내지 700nm(가시 영역)의 파장을 갖는 광을 방출한다. 생체 리포터는 자신을 광검출기상에 위치시키는 중합체 매트릭스를 수용하여, 가스 또는 유체가 샘플되어 생체 리포터에 도달하게 하고, 방출된 광이 광검출기에 도달하게 한다.
도 5에 도시된 블록도는 본 발명의 신호 처리부의 한 가능한 실시예를 나타낸다. 도 3a의 광검출기는 접지로 전류가 도전시킴으로써 광에 반응하는 광다이오드(81)이다. 전류-주파수 변환기(82)는 상기 전류를 디지털 계수기(83)으로 계수되는 일련의 펄스로 변환한다. 고정 시간동안 계수된 펄스의 수는 광다이오드에 수집된 광량과 정비례하며, 따라서 표적 물질의 농도에 정비례한다. 무선 송신기(84)는 상기 측정된 농도(85)를 중앙 데이터 수집국으로 중계한다.
도 8은 생체 리포터가 물 및 영양분을 공급받는 것을 나타낸다. 유체 및 영양분 저장기(141)는 미세유체 펌프(microfluidic pump)(142)에 연결되어 영양분 및 유체 생체 리포터를 감싸는 중합체 매트릭스(143)로 유동하도록 한다. 상기 각 요소는 단일 기판(140)에 구성된다.
본 발명의 실시예가 P.fluorescens HK44, 나프탈렌 생체 리포터의 OASIC로의 결합에 의해 구성된다. 결과가 되는 BBIC는 나프탈렌에 노출된다. 측정된 신호가 도 2에 도시된다. 배경 판독(background reading)은 0에서 10분 정도로 나타나지고, 유도된 생체 발광 중의 판독은 10 내지 20분으로 나타난다.
필요에 따라 추가의 회로가 BBIC에 포함될 수 있는데, 예컨대 BBIC는 전역 측위 위성 시스템(GPS 시스템)을 수용하여 센서의 위치를 결정할 수 있다.
4.2 광검출기
미세발광 신호 처리 체인(chain)의 제1 요소는 광검출기이다. 광검출기의 주요 요구조건은 아래와 같다.
1. 생체 발광 또는 테스트 대상인 복합물의 화학발광에 의해 방출된 광의 파장에 대한 감광도.
2. 기생 역바이어스 다이오드에 기인한 낮은 배경 신호(즉, 누설 전류).
3. 반도체 장치내의 재료가 연구중의 생체 발광 또는 화학발광 과정과 간섭되지 않게 하고, 연구 중의 상기 과정이 미세발광의 성능을 저하하는 것을 막는 적절한 코팅.
4. 미세발광 회로의 제조에 이용되는 제조 공정과의 호환성.
전술한 요구 조건을 만족시키는 두 개의 광검출기 구성을 아래에 설명한다. 그러나, 당업자라면, 본 청구범위에서 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 광검출기를 구성하는 대체 방법을 이용할 수 있다.
제1 실시예에서, 광검출기는 표준 N-웰 CMOS 공정으로 제조된다. 도 3a에 도시된 바대로, 상기 검출기는 PMOS 활성 영역과 N-웰 사이의 PN 접합의 연결에 의해, N-웰과 P-형 기판사이의 PN 접합과 평행하게 형성된다. 위와 같이 형성된 검출기는 약 400nm 내지 약 1000nm 사이의 광에 대한 감광성이 있으며, 450 내지 600nm의 방출 범위가 생체 발광 및 복합물 또는 조직의 화학발광에 가장 널리 사용된다. 상기 장치가 낮은 배경 신호를 갖는 조건을 충족하기 위하여, 상기 장치는 0 바이어스되어 동작되고, 다이오드의 동작 전압이 기판 전압과 같게 설정된다. 광다이오드 코팅은 적층된 실리콘 니트라이드(nitride)층 또는 반도체 공정 기술에 호환되는 다른 재료로 형성될 수 있다.
광검출기에 대한 제2 실시예에서, 검출기는 실리콘-온-인슐레이터(SOI) CMOS 공정으로 제조된다. SOI 공정에서 내부 누설 전류는 활성층과 기판 사이의 함침된(buried) 산화 절연층으로 인하여 표준 CMOS보다 낮은, 2 내지 3차(order)의 크기를 갖는다. 두 개의 광검출기 구조는 SOI 공정에서 계획된다. 도 3b의 좌측에 도시된 제1 구조는 측면의 PIN 검출기로 구성되는데, 이 때 P-층이 P+ 접촉층에 의해 형성되고, I(인트링식) 영역이 약하게 도핑된 활성층에 의해 형성되고, N 영역이 SOI CMOS 공정의 N+ 접촉층에 의해 형성된다. 상기 측면 검출기의 스펙트럴 감도는 활성층의 두께에 의해 설정되는데, 특정한 생체 발광 및 복합물의 화학발광에 대해 조정될 수 있다.
도 3b에 도시된 제2 구조는, 접합이 코발트 실리사이드(CoSi2)층 또는 다른 적절한 재료층과 약간 도핑된 활성층 사이에서 쇼트키 접합으로 형성되다는 것을 제외하고는 제1 구조와 유사한다.
본 발명의 발명자는 기타 광검출기 구성이 전술한 표준에 부합되면서 실리콘 또는 다른 반도체 공정에 가시화 될 수 있다고 생각한다.
4.3 저잡음 전자회로
저잡음 전자회로는 미세발광 신호 처리 체인의 제2 요소이다. 저잡음 회로의 요구조건은 아래와 같다.
1. 매우 낮은 신호 레벨에 대한 광검출기의 감광도.
2. 신호 처리 체인에 있어서의 전자 잡음 내성 또는 잡음에 대한 보상성.
3. 온도 변화에 대한 최소 민감도.
4. 전력 공급 전압(배터리 전원 장치용)의 변화에 대한 최소 민감도.
5. 전자회로의 어떤 적용에 대해서는 충분한 선형성 및 동적 구간이 있어 검출된 신호 레벨을 정확하게 기록할 것.
6. 전자회로의 다른 적용에서는 전기적 잡음 및 주변 잡음에도 불구하고 신호의 존재를 간단하게 검출할 것.
전술한 조건을 만족하는 제3 실시예를 아래에 설명한다. 그러나, 당업자라면, 본 청구범위에서 정의된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 광검출기를 구성하는 대체 방법을 이용할 수 있다.
도 7a는 극미한 신호를 검출한는 제1 방식을 도시한 개략도이다. 이 장치는 표준 CMOS IC 공정에 접합한 구조의 P-확산/N-웰 광다이오드를 이용하는데, 상기 광다이오드는 개방 회로 모드에서 판독 증폭기(광다이오드를 구비한 동일 IC에 제조됨)를 갖고 동작한다. 발광 신호는 P-확산 및 N-웰에 전자-홀 쌍을 생성한다. P-확산 내의 광-발생 전자는 N-웰에 주입되고, N-웰 내의 광-발생 홀은 P-확산으로 주입된다. N-웰은 접지 전위와 결합되어 이 영역에는 전하가 충전되지 않는다. 그러나, P-확산이 CMOS 증폭기의 입력 임피던스(저주파수에서는 0에 근접함)에만 밀착하여, 양전하가 이 영역에 수집된다. 따라서, P-확산 노드의 전압이 상승한다.
P-확산 전압이 상승하기 시작하면, P-확산/N-웰 광다이오드는 순방향 바이어스되고, 이에 따라 광-발생 전류와 반대 방향의 전류를 생성한다. P-확산 노드의 전압이 광-전류와 완전히 동일한 크기(그러나, 반대 극성임)의 순방향 바이어스 전류를 발생시킬 때, 시스템은 안정 상태에 진입한다. PN 접합이 이상적인 다이오드 방정식에 편차가 없다면, 출력 전압은 수학식 1과 같이 된다.
Vt는 열전압(실온에서 약 26mV임), Ip는 광-전류, A는 본 PN 접합의 단면적, 그리고 Is는 단위 단면적의 PN 접합의 역포화 전류이다. Ig값은 IC 공정 및 재료 파라미터에 크게 의존한다.
낮은 전류 밀도에서 PN 접합이 동작할 때, 두 개의 주 에레 전류가 존재한다. 극히 낮은 온도를 제외하고, 자유 캐리어가 PN 접합 공간 전하 영역 내에 랜덤하게 생성된다. 상기 영역이 고 필드를 갖으므로, 상기 열적 여기된 캐리어는 즉시 접합에 걸쳐 쓸려지고(sweep), 광-전류와 동일한 방향의 전류 성분(발생 전류)을 형성한다. 공간 전하 영역을 가로지르는 캐리어는 유한한 재결합 기회가 있다. 이로 인하여 광-전류와 반대 방향의 다른 전류 성분(재결합 전류)상 발생한다. 따라서, 이들 에러 전류를 고려하면 수학식 1은 아래의 수학식 2와 같이 된다.
이 출력 전압은 제어하기 어려운 파라미터의 함수이다. 그러나, 접합면(A)에 대한 제어를 할 수 있다. 불행하게도, 출력 신호를 더 크게 하려면, 더 작은 A가 필요하나, 높은 양자 효율(quantum efficiency; QE)을 위해서는 A가 커야된다.
도 7b는 상기 두 가지 요구를 충족하는 미세발광기의 제2 실시예를 도시한다. 이 회로는 효율적 광 수집을 위해 대면적 광다이오드를 이용하는데, 광-전류을 무효화 하는 순방향 바이어스 전류의 공급을 위해 피드백 루프에서 소면적의 다이오드를 이용한다. 다시 한번, 증폭기 및 피드백 다이오드는 포토다이드와 동일한 IC에 제조된다. 이 회로에 대하여 수학식 3이 적용된다.
여기서, Afb는 피드백 다이오드의 적은 단면적이다. 하나 이상의 다이오드가 피드백 경로상에 이용되어 여타의 후속 증폭단의 DC 오프셋에 비해 큰 출력 신호를 만들 수 있다. 이 기술은 피드백 경로상의 소면적 다이오드로 인한 큰 출력 전류를 발생하면서, 대면적 광다이오드로 광의 효율적 수집이 가능하게 한다.
도 7b의 피드백 회로는 광다이오드를 0 바이어스로 유지한다. 인가되는 전위가 없는 상태에서, 재결합 및 전류의 생성이 취소된다. 더 작은 피드백 다이오드 내의 더 작은 재결합 및 전류 생성이 무시되면, 수학식 3은 아래의 수학식 4와 같이 된다.
도 7b에 도시된 미세발광의 제2 실시예의 주요 이점은 다음과 같다.
1. SNR이 광다이오드전히 결정됨. 작은 다이오드 및 증폭기로부터의 잡음은 무시할 수 있음.
2. 증폭기의 출력단 신호 레벨이 후속단의 오프셋 전압(및 오프셋 전압 드리프트)에 비해 현저할 때까지, 피드백 경로상에 다이오드들이 부가될 수 있음.
3. 본 방법은 추가의 마스크, 재료 또는 공정 단계가 필요없이 완전히 표준 CMOS 공정에 적합함.
4. 본 검출 체계는 아날로그 및 디지털 신호 처리 회로와 RF 통신 회로오 ㅏ동일한 IC에 제조될 수 있음.
5. 회로에 전원을 인가하지 않아도 측정이 가능함. 측정을 판독하기 전에는 전원이 인가되야 하지만, 측정 중에는 전원이 불필요함.
도 7c에 도시된 미세발광의 제3 실시예는 콜리레이트된 이중 샘플링(CDS)를 이용하여 저주파수(플리커) 증폭기 잡음의 효과를 최소화할뿐 아니라 시간 또는 온도 의존적인 증폭기 오프셋 전압의 변화를 최소화 한다.
도 7C에 도시했듯이, 캐패시턴스(Cd) 및 잡음 전력 스펙트럼 밀도(Si)를 갖는 광 다이오드는 플립플롭 출력의 논리 레벨에 의해 제어되는 스위치 세트를 통해 집적 전치 증폭기에 연결되고, 그 집적 전치 증폭기는 피드백 캐패시턴스(Cf) 및 입력 잡음 전력 스펙트랄 밀도(Sv)를 갖는다. 플립플롭 출력이 낮을 때, 광전류가 전치 증폭기 외부로 흐르도록 상기 스위치들을 위치시켜서, 집적기의 출력 전압이 증가하게 된다. 저역 필터된 집적기 출력 전압이 임계값(VH1)을 초과할 때, 상부 비교기가 "파이어"하고, 플립플롭을 세팅하여 그 출력이 높아진다. 검출기가 변화 위치를 스위치하여, 전류가 집적 증폭기로 흐르게 하여, 증폭기 출력 전압을 감소시킨다. 집적기 출력이 제 2임계치(VL0) 이하로 될 때, 하부 비교기는 "파이어"하고, 플립플롭을 리세트하여 그 출력이 다시 낮아진다. 이 프로세스는 광전류가 존재하는 한 반복된다.
출력 펄스 △t의 평균 주기는
로 설정되고, 여기서 VHI및 VLO는 비교기의 임계 전압이고 IP는 다이오드 광전류이다. 2개의 잡음원은 측정값 △t에서의 에러에 기인한다. Si는 광 다이오드와 주로 관련된 입력 잡음 전압 전력 스펙트럴 밀도이다. 다이오드는
로 설정되고, 여기서 Is는 광 다이오드 역포화 전류이고 Ip는 광전류이다.
광전류가 제로로 접근할 때, 잡음 전력 스펙트랄 밀도는 4qIsA2/Hz인 유한값에 접근한다. 그 형태로 전치증폭기의 잡음 전압(Sv)이 결정되고 V2/Hz의 유닛을 갖는다.
다이오드 잡음을 집적기의 출력에 발생시키는 지점으로부터의 전달 함수는 대략
로 설정되고, 여기서 ω1은 집적 증폭기의 코너 주파수이고 s=jω이다.
스위치의 결과를 순간적으로 무시할 때, 증폭기 잡음을 집적기의 출력에 발생시키는 지점으로부터의 전달 함수가 대략
로 설정된다.
이 스위치들은 출력 펄스 스트링의 스위칭 주파수 아래로 나타나는 잡음을 감쇄하는 상관된 더블 샘플링 기능을 수행한다. 상관된 더블 샘플링 회로의 전달 함수는 제 1오더로
로 설정되고, △t는 출력 펄스 스트링의 평균 주기이다. 그러므로, 스위치들을 고려해서, 증폭기 잡음을 집적기의 출력에 발생시키는 지점으로부터의 전달 함수는 대략
로 설정된다.
이것은 중요한 결과인데 왜냐하면 잡음 전압 전달 함수에서 발생된 효율적인 제로가 증폭기의 플릭커 잡음을 감소시키기 때문이다.
그것은 플릭커 잡음이 도미넌트 효과를 가질 수 있는 마이크로-루미노미터의 CMOS 실행예에서 특히 유용하다.
집적기의 출력에서 평균 제곱된 출력 잡음은
및 RMS 잡음 전압이
측정된 주기의 RMS 에러는 집적기의 출력에서 집적된 신호의 기울기 및 잡음으로 결정되고, 그것은 다음의 관계식을 갖는다.
또는, 대략,
△t를 측정할 때의 에러는 많은 출력 펄스를 모으고 평균 주기를 얻음에 의해 감소될 수 있다. 그 측정된 평균 펄스 주기의 에러는 모아진 펄스수의 제곱근에 비례해서 개선되어, 그 식은 다음과 같다. 즉,
또는
여기서 tmeas가 총 측정 시간이다.
그러므로, 마이크로-루미노미터의 실행예는 다음의 장점을 갖는다.
· 증폭기의 저주파수 "플릭커" 잡음은 상관된 더블 샘플링 프로세스에 의해 감소된다.
· 이상적으로, 측정된 광전류의 정확도는 시간 주기를 증가시키는 데이터를 얻음에 의해 제한없이 개선될 수 있다.
물론, 시험중인 루미네슨트 컴파운드에 의해 발생된 신호의 수명 및 안정도에 의해 부과된 실질적인 제한이 궁극적으로 이 실행예의 정확도를 결정한다.
4.4 리드-아웃 일렉트로닉스
마이크로-루미노미터로부터 데이터를 판독하는 여러 방법이 사용될 수 있다. 그것들은
· 광전류에 비례하는 DC 전압 레벨의 발생;
· 광전류에 비례하는 DC 전류 레벨의 발생;
· 논리 펄스 스트링의 레이트를 광전류에 비례시키는 논리 펄스 스트링의 발생;
· 광전류에 비례하는 수치를 보고하는 아날로그 대 디지털 변환기의 온-칩 실행;
· 광전류에 비례하는 수를 보고하는 직렬 또는 병렬 통신 포트의 온-칩 실 행;
· 광전류값을 보고하는 온-칩 통신 시스템의 실행;
· 광전류가 미리 설정된 레벨을 초과할 때의 논리 플래그의 발생;
· 광전류가 미리 설정된 레벨을 초과할 때 무선-주파수 신호 또는 비콘의 발생.
4.5 영양물 전달 시스템
도 8은 BBICs상에서 영양물을 살아있는 바이오리포터로 제공하는 하나의 방법을 예시한다.
· 플루이드 및 영양물 저장소;
· 마이크로플루이딕 펌프; 및,
· BBIC.
BBIC와 다른 기판상에서 플루이드 및 영양물 저장소 및 마이크로플루이딕 펌프는 실행하기 쉬워진다. 그러나, 같은 모노리딕 기판상에 모든 3개의 성분을 위치시키는 실행예가 역시 사용될 수 있다.
상기 저장소는 용액에서 알맞은 영양물을 갖는 물을 넣어두는 간단하게는 컨테이너이다. 그것은 두꺼운 옥사이드를 칩의 플루이딕 영역을 통해 적층하고 저장소 공간을 포토리소그래픽 방식에 의해 형성함에 의해 온-칩을 실행할 수 있다. 그 실행예의 볼륨을 증가시키도록, 외부 컨테이너(예를 들어, 플라스틱 피펫 팁)는 온-칩 저장소에 알맞은 에폭시로써 부착된다.
마이크로플루이딕 펌프는 페리스탈틱(peristaltic) 펌프, 작동하는 폴리머 펌프, 및 전자-삼투성 펌프를 포함하는 수 많은 방법으로 실현될 수 있다. 온-칩 펌프에 대해, 전자-삼투성 펌프가 가장 양립할 수 있다. 상기 장치는 Si로 에치되고 열-성장된 옥사이드로써 코팅되는 모세관으로 구성된다. 알맞은 펌프 동작을 하는 데 상부판이 필요하다. 브랜드명 Sylgard 184(다우 코닝)로 판매된 폴리디메틸실록산(PDMS)은 상부판을 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 유리 또는 석영 슬라이드는 상부판을 형성하기 위해 사용한다. 모세관은 십미크론 넓이 및 십미크론 깊이일 수 있다. 그 길이는 수 센티미터이나, BBIC상에서 수 mm 정도이다. 펌프를 작동시키기 위해, 모세관을 통해 전압이 인가된다. 모세관 일렉트로포레지스 애플리케이션에서, 빠른 분리를 위해 1 kV의 전압이 필요로 한다. 그러나, 상기 애플리케이션에서, 우리는 수 볼트만에 동작을 기대한다.
중력 펌프는 모세관의 플로어가 기울어지는 곳에서 사용될 수 있었다. 플루이드를 바이오리포터에 공급하는 모세관의 말단은 플루이드의 흐름을 조절하도록 제한될 수 있었고 또는 액추에이터(예를 들어, 마이크로-캔틸레버)가 플루이드 흐름을 게이트할 수 있었다. 실제로, 적고, 저전력이고, 저전압으로부터 동작하는 펌프가 온-칩 또는 분리된 기판에서 사용될 수 있었다.
4.6 화학적 및 생물학적 작용제용 생체센서
"생체센서"는 인식 유생분자를 알맞은 변환기와 결합시키는 것을 토대로 하는 소형 휴대용 분석 장치이고, 화학적 생물학적 재료를 선택적으로 검출하고 높은 감도를 갖는다. 이와 같은 내용의 논문은 Paddle(1996)에 의해 발표되었고, 그것에서 발췌된 내용은 다음과 같다. 즉,
그들은 공기, 물 또는 토양 샘플 등의 각종 소스로부터 유독 물질을 검출하는 데 사용되거나 둘러싼 환경을 조절할 수 있다. 그들은 드럭 및 대사 산물 레벨을 조절하는 카테테르, 또는 피 및 오줌의 샘플에서 유독 물질, 드럭 또는 대사 산물의 분석용 프로브로서 포뮬레이트될 수 있다. 상기 포텐셜을 갖는 생체센서는 상업적으로 사용가능하거나 진행중인 상업적인 개발품이다(Scheller et al., 1989; Guilbault and Schmidt, 1991; Alvarez-Icaza and Bilitewski, 1993).
많은 수의 검토 논문(예를 들어, North, 1985; Frew and Hill, 1987; Schultz, 1987; Guilbault and Luong, 1988; Blum et al., 1989; Arnold, 1990; Bluestein and Chen, 1990; Danielsson, 1990; Henry et al., 1990; Karube, 1990; Kimura and Kuriyama, 1990, Rechnitz and Ho, 1990; Wingard, 1990; Tien et al., 1991; Kauffman and Guilbault, 1992; Grate et al., 1993) 및 다수의 책(예를 들어, Janta, 1989; Turner et al., 1989; Hall, 1991)에는 개별적인 생체 기술 및 그 개발의 이론적이고 실질적인 형태가 설명되어 있다.
4.6.1 생체센서
생체센서에서, 생체 소자를 기판과 반응시키는 것이 조절가능하다면 다른 생물학적 소자는 각종 종류의 변환기와 결합될 수 있다. 표 1은 생체센서를 제조하기위해 사용가능한 변환기 형태 및 그 변환기와 결합되었던 생물학적 소자를 목록으로 나타낸 것이다(Scheller et al., 1989; Guilbault and Schmid, 1991; Swain, 1992; Alvarez-Icaza and Bilitewski, 1993; Griffiths and Hall, 1993).
4.6.1.1 생체센서의 생물학적 성분
생체센서의 생물학적 성분은 분석제를 선택적으로 인식할 뿐만 아니라 변환기상에 조절된 물리-화학적인 신호를 발생시켜서, 결국에는 최종 장치의 감도를 측정한다(Lowe, et al., 1990). 그들은 2개의 구별된 카테고리로 분할될 수 있는 데, 그것은 촉매 작용 및 비-촉매 작용이다(Scheller et al., 1989; Griffiths and Hall, 1993). 촉매 그룹은 효소, 미세-조직 및 티슈를 포함한다. 상기 소자를 결합하는 장치는 밀리몰 내지 마이크로몰 범위로 대사 산물을 조절하는 데 알맞고 연속 조절용으로 사용될 수 있다. 비-촉매 또는 유사 클래스의 생물학적 성분은 마이크로몰 내지 피코몰의 농도에서 하몬스, 스테로이드, 드럭, 미생물 독소, 암 마커 및 바이러스를 측정하는 "단일 사용"의 처리 장치에 더 적용할 수 있는 항체(또는 항원), 렉틴, 리셉터 및 핵산을 구비한다. 최근에, 생체센서의 교배 구성은 항체 또는 DNA/RNA 프로브의 높은 유사(비가역성) 결합의 속성을 효소의 증폭 특성과 결합시키기위한 것이다. 상기 시스템은 피코몰 내지 펨토몰(10-12-10-15M) 농도 범위 아래에서 분석제를 조절할 수 있다(Lowe et al., 1990).
생체센서 결합
생체소자 변환기
형태 실시예
전자화학적
효소리셉터미세-유기체식물및 동물 조직 효소-라벨된 항체 포텐티오미트릭 산화 환원 반응 및 이온-선택 전극(예를 들어, pH 전극뿐만 아니라 그것을 토대로한 CO2, NH3,및 설파이드 전극(Kimura and Kuriyama, 1990; Kauffuman and Guibault, 1992; Owicki et al., 1994)
효소미세-유기체식물및 동물 조직 효소-라벨된 항체 암퍼로미트릭 클라크 산소 전극, 완화된 효소 전극(Henry et al., 1990; Kauffman and Guilbault, 1992)
효소이층 리피드 막＊ 컨덕티미트릭 이온 발생에 기인한 용액 전도 변화를 결정하는 Pt 또는 Au
리셉터항체 형광성 광학 (janta, 1989)옵트로드, 광다이오드, 광섬유, 버크 위상 검출(Arnold, 1990)
효소 루미네슨스 옵트로드, 광다이오드, 광섬유, 버크 위상 검출(Blum et al., 1989)
리셉터항체 에반네슨트 웨이브 코팅된 광섬유, 형광 검출(Bluestein and Chen, 1990)
항체항원효소핵산 표면 플라스몬 공진 BIAcore(유리 지지체상의 코팅된 금 또는실버층), 적은 합텐이 변위 에세이에 의해 간접적으로 측정되야함(Fagerstam and O'Shannessy, 1993)
항체항원효소핵산 음향 압전장치(Grate et al.,1993)
효소미세-구조세포 열량측정 서미스터,또는서모파일(Danielsson,1990)
4.6.1.2 효소
분석적인 견지에서, 효소중 가장 중요한 클래스는 옥시도리덕타세스이고, 그것은 산소 또는 NAD, 및 하이드로라세스를 사용해서 화합물의 산화를 촉매시키고 화합물의 하이드로리시스를 촉매시킨다(효소 목록 1978, 1979; Alvarez-Icaza and Bilitewski, 1993). 가장 성공한 생체선서는 그 촉매 메카니즘의 일부로서 교환될 수 있는 양자, 이온, 열, 광, 전자 및 매스(mass) 등의 변환 성분의 범위 때문에 생물학적 인식/응답 시스템으로서 효소를 이용한다(Lowe, 1989). 상기 촉매 활동은 pH, 이온 강도, 온도 및 상호-계수의 존재에 의해 제어된다. 효소 안정도는 효소를 토대로한 생체 센서의 수명을 결정할 때의 결정 요소이다(통상적으로 1일 및 1또는 2달간[Rechnitz and Ho, 1990]).
동물 또는 식물 소스에서의 세포 기관(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체)의 세포(예를 들어, 박테리아) 또는 티슈 부분이 임상 관계의 대사 산물의 넓은 범위로 생체센서에서 생체촉매 패키지로서 사용되어 왔다. 현존하는 수많은 효소와 함께 모든 기타의 필요한 성분은 발전되어 최적화되었던 환경에서 기판을 프로덕트로 변환하기에 필요로 된다(Scheller et al.,1989; Rechnitz and Ho, 1990). 그 시스템을 사용할 때의 중요한 결점은 다수의 효소의 동작인데, 기판 한정성을 감소시킨다. 그러나, 때때로 그 동작은 외부 실험 조건을 단지 변화시킴으로써 다른 기판이 같은 생체촉매 재료로써 측정될 수 있기 때문에 장점으로 작동할 수 있다. 반응 억제제 및 활성제가 알맞게 사용되어 티슈를 토대로한 생체센서의 선택도 및 수명을 향상시킨다(Rechnitz and Ho, 1990).
4.6.1.3 리셉터스
자연적으로 발생하는 리셉터는 세포막에 간격을 두게 하는 비-촉매 단백질이고, 세포외 및 세포내 공간으로 확장한다. 그들은 대사 산물 및 신경 생화학 요법에서 뿐만 아니라 후각 및 미각 등의 화학적 의미에 포함된다. 조직내에서 그들은 세포 활동을 초기화하거나 감소시키도록 목표 세포막을 통해 메시지를 전달할 목적으로 기타 세포로부터 유리시킨 특정한 신경-트랜스미터 및 하몬을 역결합으로써 세포-세포 전달의 링크로서 작용한다. 또한, 그들은 다수의 드럭 및 독소를 묶는 사이트이다. 트랜스미터 분자를 리셉터의 세포외측에 묶는 2가지의 방법이 있어왔고 그 방법은 세포내 프로세스를 변형되게 한다.
생체 센서에서 인식 소자로서 신경리셉터가 사용될 때, 전기 일(ell) 또는 광선의 전기 구조로부터 상대적으로 대량으로 격리될 수 있는 니코틴 아세틸콜린 리셉터(n-AChR)에 제한을 가한다. 생체 센서 사용시 기타 리셉터를 사용하지 못하는 것은 그들이 티슈에서 소량으로만 존재하고 그 자연적인 리피드막 환경에서 한번 제거되어 불안정하게 되는 사실을 반영하는 것임을 의심하지 않는 다. 그러나, 외부 세포선에서 리셉터 DNA 표현이 프로덕트는 생체 센서 애플리케이션에 사용되는 단백질을 사용하고, 원래의 개시 재료와 완전히 동일하지 않다(Wingard,1990). n-AchR 및 관련된 이온 채널 컴플렉스는 여럿의 자연적으로 발생하는 독소를 묶는 다.
4.6.1.4 항원 및 항체
항원은 외부에 있는 동물 조직에 의해 자체로 인식될 수 있고 그러므로 면역 응답으로 공지된 방어 메카니즘을 발생시키는 분자 종류이다. 상기 인식에 의해 ~10,000 Da의 낮은 분자량이 차단된다(Van Emon and Lopez-Avila, 1992). 자연적인 환경에서 그 항원은 바이러스, 박테리아 및 마이크로펀지의 표면에서 또는 세포 표면에서 및 기타 종류 또는 같은 종류의 다른 개체의 피 또는 티슈의 용액에서 단백질 또는 리포폴리사카라이드이다. 외부의 DNA 또는 RNA는 식물 기원의 재료로서 항원이다.
항체(Ab)는 항원에 응답해서 동물에 의해 생성된 분자이고 특정하게 나중에 묶인다. 구충제, 제초제, 미생물 독소 및 산업 화학제품 등의 적은 분자량의 환경 오염물질에 대한 항체는 보빈 세륨 알부민(BSA;bovine serum albumin) 또는 키홀 림페트(limpet) 헤모시아닌(KLH) 등의 캐리어 단백질에 후자를 공유결합해서 부착시킨 후 제조될 수 있다(Van Emon and Lopez-Avila, 1992). 항체 인식용으로 변형되었던 최종 공액근의 적은 분자 성분은 햅텐이다. 미생물, 식물 및 동물 기원의 기타 생체독소의 호스트는 항원이거나 햅텐-단백질 공액근의 형성에 의해 항원으로 되어질 수 있다.
포유 동물에서, 항원을 인식하는 데에는 개별적인 2가지 종류의 분자를 포함한다. 이러한 2가지 종류의 분자에는 세륨 및 티슈 플루이드에 있는 면역 글로불린으로 불리우는 단백질과, 특정화된 피 셀-T-림파구의 표면에 있는 항원 리셉터가 있다. 그것은 면역 글로불린 또는 항체이고, 항원에 대한 그것의 선택적 및 확고한 결합 특성은 분석적인 면역 감시 방법을 사용해서 생성된다. 고등 동물에서, 면역 글로불린 또는 항체는 5개의 개별적인 클래스, 즉 IgG,IgA,IgM,IgD 및 IgE로 된다. 그것들의 크기, 차지(charge), 아미노산 합성 및 탄수화물 함유량이 서로 다르다. 그들은 글리코프로테인로 되나 IgG에 대해서는 2-3% 및 나머지에 대해서는 12-14%의 탄수화물 함유량을 갖는다. 모든 면역 글로불린 분자의 기본 구조는 2개의 동일한 광 폴리펩티드 체인, 및 디설파이드 결합에 의해 함께 링크된 2개의 동일한 헤비(heavy) 폴리펩티드 체인으로 구성되는 Y형 유닛이다. Y의 "아암"의 아미노 터미널 단부는 시퀀스 변이성을 특징으로 하고 항원 결합 사이트이다. IgG는 항체의 배타적인 항독소 클래스이다. IgM은 5개의 Y자 유닛의 펜타머이고 그것의 역할이 복잡한 전염성 유기체로 나타나게 된다(Turner,1989).
변환기 표면에서 항체에 대한 항원의 결합은 직간접적으로 측정될 수 있다. 항원 또는 항체를 형광 라벨에 공액근으로 함으로써 결합이 검출된다(Anis et al.,1992; Ogert et al., 1992; Lee and Thompson).
4.6.1.5 핵산
DNA의 스트란드를 따른 염기의 특정 시퀀스 및 이중 나선 구조에서 염기쌍들(아데닌 및 티민 또는 치토신 및 구아닌)간에 쌍짓기의 특정한 상보형 특성이 생체다양성의 토대이다. 단일의 스트란드된 핵산 분자를 샘플의 그 상보형 파트너에 인식 및 결합(교배)하는 능력이 유전 분석에 사용되고 생체 센서에서 또한 사용된다.
샘플을 준비하는 데에는 하나 이상의 다음 단계를 포함한다. 즉 (a) 샘플의 세포로부터 DNA 인출; (b) 단일의 스트란드된 형태의 DNA 준비; 및 (c) 폴리메라아제 연쇄 반응(PCRTM)을 사용할 때 존재하는 DNA의 총량을 증가시키는 것이다(Saiki et al.,1985).
다른 가능성으로는 RNA 폴리메라아제, 프로모터, 리프레서 및 억제 효소 등의 DNA 결합 단백질을 사용한다는 것이고, 그러므로 그것은 생체 센서를 동작시키도록 특정한 DNA 시퀀스를 이중-스트란드된 형태로 결합시키는 능력을 나타낸다(Kung et al.,1990; Downs,1991). 단일의 스트란드된 형태의 DNA 준비 및 그 연속 교배가 필요로 하지 않고, 그 방법에서 샘플 준비 시간이 짧다.
4.6.2 바이러스, 박테리아 및 균
바이러스는 그 자체로 재생할 수 없는 소형 세포 기생균이다. 그들은 특정한 리셉터를 통해 세포에 부착하고 그것은 어떤 세포 형태가 감염되었는 지를 부분적으로 결정한다. 감염되는 특정한 세포는 바이러스의 세포내 복제를 수반하는 복잡한 생화학적 교란 때문에 결국 파괴된다. 바이러스는 하나 이상의 바이러스의 특정한 단백질 또는 글리코프로테인의 외부 쉘(shell)로 포위된 단일-스트란드되거나 이중-스트란드된 RNA 또는 DNA를 함유한다. 어떤 바이러스에는 주로 리피드로 구성될 뿐만 아니라 바이러스의 특정한 단백질을 함유하는 부가적인 외부 엔벨로프가 있다. 그것은 면역 응답 및 항체 발생을 하는 바이러스 항원인 표면 코트 단백질이다(Rook,1989; Darnell et al., 1990). 바이러스( 및 박테리아)는 그 표면에 대다수의 항원 결정소를 갖고 그러므로 각 유기체는 다수의 항체 유닛을 결합할 수 있다. 그것은 결과적으로 햅튼-항체 복합체를 통한 바이러스-항체 복합체의 안정도가 상당히 증가하게 된다(항체에 의존해서 폴드된 103-104까지)(Darnell et al.,1990).
병원 유기체
바이러스 박테리아 균
바리올라 바이러스 Rickettsia prowazecki Coccidioides immitis
치쿤군야 바이러스 Rickettsia rickettsi Histoplasma apsulatum
이스턴 엔세파리티스바이러스 Rickettsia tsutsugamushi Norcardia asteroides
베네주에란 엔세파리티스 바이러스 Bacillus anthracis
웨스턴 엔세파리티스 바이러스 Francisella(Pasteurellas tularensis)
덴규 바이러스 Pasteurella pestis
엘로우 피버 바이러스 Brucella melitensis. B.suis
저패니스 엔세파리티스 바이러스 Coxiella burnetti
러시안 스프링-서머 엔세파리티스 바이러스 Salmonella typhi
아르젠틴 해모르해직 피버 바이러스 Salmonella paratyphi
라사 피버 바이러스 Vibrio comma
림포사이트 코리오미닝이티스 바이러스 Corynebacterium diphtheria
볼리비안 해모르해직 피버 바이러스 Actinobacillus mallei
크리미안-콩고 해모르해직 피버 바이러스 Pseudomonas psuedomallei
하안탄(코리언 해모르해직 피버) 바이러스 Mycobacterium tuberculosis
리프트 밸리 피버 바이러스
마버그 바이러스
에볼라 바이러스
헵파티티스 A 바이러스
소정의 병원성 박테리아는 그들이 생산하는 질병에 관한 특정 증후가 기초가 되는 메카니즘의 일부로서 균체외 독소를 합성하여 분비한다. 민감한 포유 동물의 세포에 독을 주거나 죽이는 이들 단백질의 예들에는 Bacillus anthracis 및 Corynebacterium diphtheriae이 생산하는 독소는 물론, Shigella dysenteria 독소, Staph. aureus 장(腸)독소, 파상풍 독소 및 botulinum 신경 독소가 있다. 다른 병원성 박테리아(표 2의 Salmonella 및 Brucella 종)는 그들이 분해될 때 독소를 유리시킨다. 이들 독소는 박테리아 세포벽의 성분들이고 단백질, 지방질 및 탄수화물의 접합체들이며 균체내 독소라고 불러 왔다. 이 두 종류의 독소 모두는 항원성이다. 박테리아의 종류가 다르면 세포벽 구조도 다르다. 모든 종류[그람 양성(G+), 그람 음성(G-) 및 마이크로 박테리아)에는 세포 내막과 펩티도글라이칸 벽이 있다. 또, 그람 음성 박테리아에는 때때로 리포다당류가 발견되는 지방질의 외부 이중층이 있다. 또, 박테리아의 외부 표면에는 섬모나 편모가 포함되어 있을 수 있고, 또는 보호 피막으로 덮혀 있을 수 있다. 이들 구조에서의 단백질과 다당류는 항체를 위한 목표로서 작용할 수 있다.
일부 균류는 인간에게 병을 옮긴다. 그 이유는 그들 균류가 독소를 유리시키기 때문이라기 보다 오히려 체조직에 침투하여 그곳에서 증식하기 때문이다. 이들 중 세 가지가 표 2에 정리되어 있다. 다른 균류는 인체에 해롭다. 그 이유는 그들 균류가 만들어 내서 환경 속으로 유리되는 독소들 때문이다. 후자의 특정 예로서는 트라이코테신 진균독소를 생산하는 전술한 푸사륨 종이 있다.
균류는 생체 리포터로서 이용되기도 한다. 본 발명의 발명자는 본 발명의 방법에서 균류(예컨대, 효모균)의 이용을 고려하고 있다. 예컨대, 효모균의 균주는 그 효모균이 환경적인 신호 또는 스트레스에 응답하여 생체 발광 신호를 방출하는 본 명세서에 공개된 것과 유사한 방법에 의해서 박테리아 균주에 대해 구성될 수 있다.
4.6.3 항체에 기반을 둔 생체 센서
효소 기반의 전략과 수용체 기반의 전략이 생체 센서의 개발에 유용하지 않은 독소들도 폭 넓게 존재한다. 그러나, 적당한 항체를 얻을 수 있음을 가정하면, 항체 기반의 생체 센서들은 몇 가지 독성 화학 물질에 적용 가능하고 아마도 표 2에 정리된 모든 독소 및 병원성 마이크로 조직에 적용 가능하다.
면역 센서의 개발에 있어 계속되는 도전들 중 한 가지는 그들의 기능적 구조를 아직 유지하고 결합 중인 장소의 스테아린 장애를 방지하면서 항체를 고농도로 면역화할 수 있게 하는 것이다. 이것은 유리 또는 실리콘 및 금 표면에 자기 조립식 긴 사슬의 알킬 막(SAMSs: Self-assembling long chain Alkyl Membrane Systems)의 사용으로 이어져 왔다. 각 사슬의 종료 기능 그룹은 항원 연결 장소들의 균일한 기하학적 어레이를 형성하기 위해 항체 또는 항체의 일부 상에서 특정의 그룹들과 반응하도록 설계된다[바티아 등(1989년); 줄 등(1994년); 므르크시치 및 화이트사이즈(1995년)].
또, 면역화된 항체의 안정성은 향후 면역 센서의 연구에 매우 중요한 요소이기도 하다. 이에 관련된 문제는, 만일 포획 프로세스에 관한 시스템의 장소 배치 준비가 필요하다면 이것은 이를 고속화 개발에 몇 가지 장치 및 방법이 필요하다는 것이다. 피에조 전기 장치 상의 고정화에 보다 중요한 다른 필요 조건은 센서의 표면에 결합하는 불특정 단백질을 감소시킬 필요성이다[알루왈리아 등(1991년)]. 아마도 이 문제에 대한 한 가지 방법은 두 개의 긴 사슬의 알칸 타이올레이트의 혼합으로 형성된 SAM을 이용하는 것일 것이다. 하나는 예컨대 Fab-SH 그룹과 반응하기 위한 종료 기능 그룹을 갖고, 다른 하나는 막 표면에서 단백질의 불특정 흡착에 저항하기 위해 에틸 글리콜의 짧은 올리고머를 제공한다[줄 등(1994년); 므르크시치 및 화이트사이즈(1995년)]. 이 혼합에 의해, 공유 결합된 항체 일부의 스페이싱을 제어하고 특정 항원 결합을 최적화하는 가능성을 제공할 수 있다.
가장 면역학적인 반응은 기본적으로 그의 큰 관련 상수(105-109M-1s-1의 Kas) 때문에 불가역적이다. Kas는 각각 107에서 109M-1s-1및 102에서 10-4s-1에 이르는 큰 정방향[k1]과 작은 역방향[k-1] 속도 상수들로 구성된다[버나드 및 월트(1992년)]. 실시간으로 가역 측정을 가능케 할만큼 충분히 빠른 항원 해리 속도를 갖는 항체의 개발[노쓰(1985년); 로에(1992년)]은 카오트로픽 용액을 이용하여 항체를 대체하거나 결합을 역으로 할 필요 없이 항체의 연속 측정 또는 항체의 적어도 순차적 측정으로 이어질 수 있다[블랭커드 등(1990년); 위제수리야 등(1994b)]. 결국, 재조합 기술에 의해 새로운 결합 특성을 갖는 항체들을 만들어 낼 수 있게 될 것이다.
비가역성의 문제를 해결할 수도 있는 방법은 촉매 항체의 개발에 있다[레르너 등(1991년); 헤인즈 등(1994년)]. 전이 상태에 관한 스테레오 특성을 원용하여 설계된 합텐으로, 에스테르와 아미드의 간단한 가수 분해에서부터 생리학 상의 상대를 결하거나 통상 친하지 않은 반응에 이르기까지 광 범위한 화학적 변형에 촉매 반응을 미칠 수 있는 항체를 유도할 수 있다[레르너 등(1991년); 헤인즈(1994년)]. [분자 인식 요소로서 촉매 반응 항체를 이용하는 전위차계식 생체 센서에 대해서는 블랙번 등이 설명한 바 있다(1990년)]. 따라서, 만일 유독성 화학물질 및 독소에 대한 촉매 반응 항체를 얻을 수 있다면 계속해서 넣지 않고 수행할 수 있고 센서 물질을 신선하게 공급할 필요가 없는 이 물질들에 관한 생체 센서가 실현될 것임을 고찰할 수 있다.
대안으로서, 센서의 설계시 면역 반응을 효과적으로 이용하기 위해, 비가역성의 문제는 소정 장치의 감지 영역에 대해 면역 시약을 수동적으로 유리하는 보관소를 생성함으로써 포위되는 것도 가능하다. 이러한 목적으로, 제어된 릴리즈 폴리머가 사용되어 왔다[버나드 및 월트(1992년)].
근래 들어, 월레스와 그의 동료들[사딕 등(1994년)을 참조]은 Ag-Ab 반응이 (이격 거리에 의한 다양하고 상이한 분자 상호 반응을 포함함) 다단계 프로세스이기 때문에 초기 단계에서 특정화가 고정되고 나중 단계에서 비가역성이 발생하여 적합한 변경을 수반하는 것이 가능하다. 웰레스 등은 항체를 타우마틴에 수용하고 있는 폴리피롤의 필름에 코팅된 백금 전극을 이용하여 펄스화된 전류계식 측정으로부터 이러한 특성의 증거를 제시해왔다. 항원이 존재할 때 공급되는 포텐셜의 연속 펄스 동안에, 전류의 신속하고 가역적인 첨두치는 그의 높이가 항원의 농도에 직접 비례하였다고 관찰되었다. BSA와 다른 단백질의 주입은 반응을 크게 감소시켰지만, 이러한 감소의 얼마나 많은 부분이 챠지 구조의 차이에 기인하는지는 불분명하다.
4.6.4 핵산 기반의 생체 센서
유전자 탐침 분석 시험에서의 시간 소모적인 준비 단계들은 병원성 마이크로 조직의 장소 배치 검출을 위한 생체 센서의 기초로서 그들을 고려하게 하는 것을 어렵게 하고 있다. 주요한 시간 소모 단계들로는 DNA 분리 및 증폭(PCRTM) 절차와 잡종 교배 검출 단계가 있다. 최근 들어, 광 섬유의 표면에 ss-DNA를 성장시켜서, 바운드된 DNA의 이중 나선 영역 안에 갖혀 있는 에티듐 브로마이드의 형광을 이용함으로써 상보형 ss-DNA를 갖는 잡종 교배 프로세스를 표본으로 검출할 수 있게 되었다[피우노 등(1994년)]. 더욱이, 매우 민감하고 선택적인 그러한 핵산 기반의 생체 센서가 있을 가능성은 항체 기반의 생체 센서보다 몇 가지 이점을 갖는다. 우선, 병원성 박테리아와 균류에 관한 적절한 DNA 탐침의 개발[스미스 등(1994년)]과 센서 표면에 그들을 고정하기 위한 방법의 개선에 연구가 맞추어질 것이다. 잡종 교배의 검출은 ds-DNA 감응 형광 대를 유리 섬유 표면에 고정된 ss-DNA 위에 직접 공유 결합식으로 고정함으로써 더 개선되는 것도 가능하다[피우노 등(1994년)].
4.7 다중화된 생체 발광을 이용하는 미생물 생체 센서
전세포 생체 센서는 신호 변환 메카니즘과 불특정한 간섭으로 인해 감응성 및 신뢰성 면에서 제한받을 때가 종종 있다. 우드와 그루버씨(氏)는 미생물의 유전자 센싱 메카니즘을 쉽게 측정 가능한 신호로 정확하게 변환하는 것에 관한 개요를 제공하고 있다[우드 및 그루버(1996년): 본 명세서에 참고로 인용됨]. 살아 있는 세포는 수 백개의 상호 반응하는 생체 화학적 통로들로 이루어진 안정 상태의 조화체이기 때문에, 영향을 미치지 않고 하나의 경로에서 어느 정도 몇 개의 다른 경로들로 변경하기가 어렵다. 하나의 세포 안에서는 동시에 여러 개의 내부 조건과 외부 조건들이 감지되기 때문에, 어느 하나에서의 변경은 예측하기 어렵게 세포 생리학에 영향을 미칠 수 있다. 미생물 센서에 있어서, 이것은 환경 조건에 대해 신뢰할 수 없고 해석이 불가능하기까지 한 반응으로 이어질 수 있다.
미생물 센서를 보다 신뢰성 있게 만들기 위해서는, 불특정 자극의 영향들을 확실하게 하고 그 영향들을 센서의 반응으로부터 제거할 필요가 있을 수 있다. 불특정 자극의 누적된 영향은 제2 신호 변환 장치(특정의 유전자 센싱 시스템과 연결되지 않음)를 통해 판단되어 내부 제어 신호를 생성할 수 있다. 이 제어 신호는 목표 신호와 비교되는 동적 베이스 라인으로서 이용될 수 있다. 목표 변환 장치로부터의 신호는 목표로 한 자극과 불특정 자극 모두의 영향을 나타내기 때문에, 목표 신호를 제어 신호에 정규화함으로써 목표 자극의 영향을 분리할 수 있다.
이것은 살아 있는 세포의 복잡한 화학적 환경 안에서 기본적으로 동일하게 행동하는 두 개의 유전자 리포터를 이용함으로써 달성될 수 있지만, 쉽게 차별화된 신호들을 얻는다. 양호한 실시예들에 있어서, 두 개의 유전자 리포터는 생체 발광 단백질을 포함할 수 있고, 이 단백질은 서로 간에 미묘한 변형들을 가지며, 이러한 변형이 방출 파장에서 구별 가능한 변화를 제공한다. 이러한 변경예들은 많은 생체 발광 리포터에 대해서 상업적으로 이용 가능하고 당업자에게 공지되어 있다[예컨대, 우드(1990년)를 참조].
복수의 생체 발광 리포터는 두 개의 기능성 생체 리포터로 이루어진 하나의 폴리펩타이드로 변환되도록 구성될 수 있다. 만일 하나 이상의 리포터의 여기 스펙트럼이 그러한 구성에서 하나 이상의 다른 리포터의 방출 범위 이내에 있다면, 본 발명의 발명자는 이 "잡종" 구성이 단 하나의 리포터로 이루어진 것보다 신호 강도나 감지성 또는 그 두 가지 모두가 높을 것이라고 고찰한다. 대안으로서, 하나의 폴리펩타이드로 변환되는 것과 반대되는 바와 같이, 복수 개의 생체 발광 리포터는 그 리포터들이 상호 결합되거나 상호 근접되어 있을 수 있게 하는 영역들을 부호화하는 여러 개의 폴리펩타이드로 변환될 수 있다. "근접"이란 하나 이상의 리포터의 방출이 하나 이상의 다른 리포터들을 여기시킬 수 있는 배열 장소를 말한다.
4.8 생체 발광 유전자를 표현하는 재조합 벡터
본 발명의 한 가지 중요한 실시예에는 하나 이상의 생체 발광 폴리펩타이드를 부호화하는 하나 이상의 핵산 세그먼트를 포함하는 재조합 벡터가 있다. 이러한 벡터는 세포핵이 없는 또는 유카리오틱 숙주로 전달되어 복제될 수 있고, 여기에서 박테리아 세포는 특히 세포핵이 없는 숙주라고 하며 효모균 세포는 특히 유카리오틱 숙주하고 한다.
다른 실시예들에 있어서, 재조합 또는 이질성 프로모터의 제어 하에서 코딩 DNA 세그먼트의 위치를 지정하면 소정의 이점들을 얻을 것이라고 고찰한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 또는 이질성 프로모터는 자연 환경 안에서 크리스털 단백질 또는 펩타이드를 부호화하는 DNA 세그먼트와 통상 관련되어 있지 않은 프로모터라고 하고자 한다. 이러한 프로모터들은 어떤 박테리아, 바이러스, 유카리오틱 또는 식물 세포 또는 이들 모두로부터 분리된 다른 유전자 또는 프로모터들과 통상 관련된 프로모터들을 포함할 수 있다. 당연하게, 표현상 선택된 세포형, 유기체 또는 포유 동물에서의 DNA 세그먼트의 표현을 효과적으로 지시하는 프로모터를 이용하는 것이 중요할 것이다. 프로모터의 사용과 단백질 표현에 대한 세포형 조합들은 분자 생물학에 관한 당업자에게 공지되어 있다[예컨대, 샘브룩 등(1989년)을 참조]. 사용된 프로모터들은 구성적이거나 유도할 수 있고, 또는 도출된 DNA 세그먼트의 고 레벨 표현을 지시하도록 적절한 조건들 하에서 사용될 수 있다.
제1 실시예들에서, 재조합 벡터는 하나 이상의 생체 발광 폴리펩티드를 부호화하는 핵산 세그먼트를 포함한다. 매우 양호한 핵산 세그먼트들에는 Vibrio fischerii의 lux 유전자, 즉 luxCDABE가 있다. 다른 양호한 핵산 세그먼트들에는 개똥 벌레의 루시페라제, 다른 딱정 벌레의의 루시페라제 단백질, 와편모충류(Gorgula; Pyrocystis), 환형 동물(Dipocardia), 연체 동물(Lativa), 갑각류(Vargula; Cypridina), Aequorea victoria 또는 Renilla reniformis의 녹색 형광 단백질 또는 생체 발광 가능한 다른 유기체로부터 나오는 루시페라제를 부호화하는 것들이 있으나, 이에 한하지는 않는다.
본 발명의 제2 실시예에서, 발명자는 발광 생성물을 생성하는 반응 또는 발광 신호로 직접 전환될 수 있는 생성물을 만들어 낼 수 있는 하나 이상의 효소를 부호화하는 핵산 세그먼트로 이루어진 재조합 벡터를 고찰한다. 예컨대, 각 효소에 의해 전환될 때 형광을 발하는(화학적 발광을 하는), 공통으로 사용되는 β-갈락토시다제와 알칼린 포스파타제 효소로 된 기판은 상업적으로 이용 가능하다.
본 발명의 제3 실시예에서, 발명자는 색원체 생성물를 생성하는 반응 또는 색원체 신호로 직접 전환될 수 있는 생성물를 만들어 낼 수 있는 하나 이상의 효소를 부호화하는 핵산 세그먼트로 이루어진 재조합 벡터를 고찰한다. 예컨대, 각 효소에 의해 전환될 때 색원체인, 공통으로 사용되는 β-갈락토시다제와 알칼린 포스파타제 효소로 된 기판은 상업적으로 이용 가능하다. 여기 파장 및 방출 파장을 적절하게 선택함으로써 색원체 화합물의 검출 및 양자화를 가능케 할 수 있을 것이다. 마찬가지로, 표준 분석 시험이 분광 광도 측정 분석으로 가능한 어떤 색원체 기판이 본 발명의 방법에서 사용하는 데 용이하게 채용되어야 할 것이다.
본 발명의 제4 실시예에서, 발명자는 세포 표면에서 표현된 또는 세포로부터 분비된 하나 이상의 폴리펩타이드를 부호화하는 핵산 세그먼트로 이루어진 재조합 벡터를 고찰한다. 양호한 실시예에서, 핵산 세그먼트는 하나 이상의 TnPhoA 폴리펩타이드를 부호화한다. 다른 실시예에서, 폴리펩타이드는 생체 발광, 화학적 발광 또는 색원체의 생성물를 직접 또는 간접적으로 만들어 낼 수 있는 항체의 항원이다.
상기 실시예들 각각에서, 재조합 벡터는 환경적 요인에 반응하는 프로모터에 동작적으로 연계되는 해당 유전자를 포함할 수 있다. 양호한 실시예에서, Vibrio fischerii의 lux 유전자, 즉 luxCDABE는 미니-Tn5 트랜스포존 안에서 tod 오페론에 동작적으로 연계되어 있다. 그러나, 본 발명자는 해당 핵산 세그먼트가 환경적 요인에 반응하는 프로모터에 동작적으로 연계될 수 있는 가상적으로 어떤 재조합 벡터를 사용하는 것도 가능함을 고찰한다. 유용한 재조합 벡터들에는 유전자 융합, 오페론 융합 또는 단백질 융합에 의해 환경적 요인에 반응하는 프로모터에 동작적으로 연계되는 해당 유전자가 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 다른 중요한 실시예는 이들 재조합 벡터들 중 하나 이상의 벡터를 표현하는 전환된 숙주 세포이다. 숙주 세포는 세포핵이 없거나 유카리오틱할 수 있고, 그리고 특히 양호한 숙주 세포는 Vibrio fischerii의 lux 유전자, 즉 luxCDABE를 부호화하는 재조합 벡터로 이루어진 핵산 세그먼트(들)을 표현하는 것들이다. 박테리아 세포를 특히 세포핵이 없는 숙주라고 하고, 효모균 세포는 특히 유카리오틱 숙주라고 한다.
폴리펩타이드를 표현하는 핵산 세그먼트를 도출하는 데 이용할 수 있는 다양한 방법들은 유전자의 안정된 유지와 표현을 가능케 하는 조건 하에서 생체 발광 또는 화학적 발광을 미생물 숙주 안으로 제공할 수 있다. 한 가지 방법은 핵산 세그먼트, 조절 제어 하의 핵산 세그먼트 및 숙주 유기체의 서열과 일치하는 DNA 서열을 표현하기 위한 등사적 변환적 조절 신호들을 포함하는 DNA 구조를 제공하고, 그로써 집적화가 생성되고 또는 숙주 안에서 기능하는 복제 시스템, 집적 또는 안정적 유지 보수 또는 그 모두를 생성할 것이다.
등사적 초기 신호들은 프로모터와 등사적 초기 개시 사이트를 포함할 것이다. 양호한 예들에서, 생체 발광 또는 화학적 발광을 제공할 수 있는 핵산 세그먼트의 조절 표현을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 여기에서, 핵산 세그먼트의 표현은 적당한 환경으로 방출한 후에 생성될 뿐이다. 이로써, 미생물의 물리적 또는 화학적 환경의 변화시에 유도 가능한 연산자 또는 활성제나 강화제에 결합하는 영역을 얻을 수 있다. 변환적 개시에 있어서, 리보솜적 결합 사이트와 개시 코돈이 제공될 것이다.
특히 액티브 프로모터를 이용함으로써, 그리고 서열들을 이용함으로써 메신저 RNA의 표현을 강화하기 위한 몇 가지 조작이 사용되어, 메신저 RNA의 안정성을 강화할 수 있다. 등사적 변환적 종료 영역은 정지 코돈(들), 터미네이터 영역 및 선택적으로 (유카리오틱 시스템에서 사용될 때) 폴리아데닐레이션 신호를 포함할 것이다.
등사의 방향에서, 즉 코딩 혹은 감지 서열의 5' 내지 3' 방향에서, 등사적 조절 영역과 필요하다면 프로모터를 포함할 수 있고, 여기에서, 조절 영역은 프로모터, 리보솜 연결 사이트, 개시 코돈, 오픈 리딩 프레임이 개시 코돈과 동상인 구조적 유전자, 정지 코돈(들), 폴리아데닐레이션 신호 서열 및 필요하다면 터미네이터 영역의 5' 혹은 3'일 수 있다. 이중 나선으로서의 이 서열은 미생물 숙주의 변환을 위해 그 자체로서 사용될 수 있지만, 마커를 포함하는 DNA 서열이 대개 포함될 것이고, 제2 DNA 서열은 숙주 안으로의 DNA 유입시 표현 구성에 연합될 수 있다.
본 발명자는 변형되거나 변환된 숙주들의 선택을 제공하는 구조적 유전자를 "마커"라고 칭한다. 마커는 통상 예컨대 생물독 저항성(예컨대, 항생 물질 또는 중금속에 대한 저항성)을 제공하는 선택적 이점을 제공한다. 즉, 영양균 숙주 등에 프로토트로피를 제공하기 위해 보상을 제공한다. 숙주를 변형하기 위해서는 물론, 구성의 개발에 있어서는 하나 이상의 마커가 이용될 수 있다.
기능적 복제 시스템이 제공되지 않으면, 구성은 또한 적어도 50 베이스패어(bp), 양호하게는 적어도 약 100 bp, 더 양호하게는 적어도 1000 bp, 그리고 대개는 숙주에서의 서열과 일치하는 서열의 약 2000 bp 이하의 서열을 포함할 것이다. 이와 같이 하여, 타당한 재조합의 가능성이 강화되고, 따라서 유전자는 숙주 안으로 집적되고 숙주에 의해 안정하게 유지될 것이다. 바람직하게는, 생체 발광 또는 화학적 발광을 제공할 수 있는 핵산 세그먼트는 보상을 제공하는 유전자 및 경쟁적 우위를 제공하는 유전자에 근접할 것이다. 따라서, 생체 발광 또는 화학적 발광을 제공할 수 있는 핵산 세그먼트가 유실되는 경우에, 결과적인 유기체는 보상성 유전자 그리고 경쟁적 우위를 제공하는 유전자, 또는 그 둘 모두를 갖기 쉽다.
상당한 수의 등사적 조절 영역이 다양한 미생물 숙주, 예컨대 박테리아, 박테리오파제, 시아노박테리아, 조(藻)류, 균류 등으로부터 이용 가능하다. 다양한 등사적 조절 영역은 trp 유전자, lac 유전자, gal 유전자, λL및 λR프로모터, tac 프로모터와 관련된 영역을 포함하고 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 제4,332,898호, 미국 특허 번호 제4,342,832호 및 미국 특허 번호 제4,356,270호를 참조하시오. 등사적 개시 영역과 통상 관련된 종료 영역 또는 다른 등사적 개시 영역이 호환 가능하고 숙주 안에서 기능적인 한, 종료 영역은 이들 영역일 수 있다.
안정된 에피좀 유지 또는 집적이 요망된다면, 숙주 안에서 기능적인 복제 시스템을 갖는 플라즈미드가 이용될 것이다. 복제 시스템은 염색체, 그 숙주 또는 다른 숙주에서 통상 제공되는 에피좀 요소 또는 그 숙주에서 안정되어 있는 바이러스로부터의 복제 시스템으로부터 얻을 수 있다. 상당한 수의 프라즈미드, 예컨대 pBR322, pACYC184, RSF1010, pR01614 등이 이용 가능하다. 예컨대, 본 명세서에서 특히 참고로 인용되고 있는 올손 등(1982년), 바그다사리안 등(1981년) 및 미국 특허 번호 제4,356,270호, 제4,362,270호, 제4,371,625호 및 제5,441,884호를 참고하시오.
개시 영역의 조절 영역 하에 있도록 하기 위해, 소망스런 유전자는 등사적이고 변환적인 개시 영역과 등사적이고 변환적인 종료 영역 사이에서 유도될 수 있다. 이 구성은 플라즈미드 안에 포함될 것이고, 적어도 하나의 복제 시스템을 포함할 것이지만, 하나의 복제 시스템이 플라즈미드를 개발하는 동안에 클론하기 위해 이용되고 제2 복제 시스템이 최종의 숙주에서 기능하는 데 필요한 곳에서는 하나 이상을 포함하는 것도 가능하다. 더욱이, 전술되어 온 바의 하나 이상의 마커가 제공되는 것도 가능하다. 집적이 바람직하다면, 바람직하게는 플라즈미드는 숙주 게놈과 일치하는 서열을 포함할 것이다.
변형체는 대개는 선택 기술을 이용하여 종래의 방식에 의해 분리될 수 있어, 제공되는 경우에는 변형되지 않은 유기체 또는 전달 중인 유기체에 대한 것으로서 바람직한 유기체를 선택할 수 있다. 따라서, 변형체는 생체 발광 또는 화학적 발광의 활동에 대해 테스트될 수 있다. 원한다면, 원치않거나 보조적인 DNA 서열은 본 명세서에 특히 인용되고 있는 미국 특허 번호 제5,441,884호에서 설명된 바와 같은 사이트-특정의 재조합 시스템을 이용함으로써 재조합 박테리아로부터 선택적으로 제거되는 것도 가능하다.
4.9 항체 준비 방법
다른 형태에서, 본 발명은 폴리펩타이드에 면역 반응을 일으키는 항체를 고찰한다. 명세서 전반에 걸친 항체의 참고는 전체의 폴리클론 및 모노클론 항체(mAbs) 및 그들의 일부, 또는 단독으로 또는 다른 반과 공액하는 것들을 포함한다. 항체 부분은 Fab와 F(ab)2단편과 하나의 사슬 항체들을 포함한다. 항체는 적당한 실험실 포유 동물들의 생체 안에서 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 양호한 실시예에서, 항체는 폴리클론 항체이다.
요약하면, 폴리클론 항체는 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 면역원으로 포유 동물을 면역시켜 그 면역된 동물에서 항혈청을 수집함으로써 준비된다. 항혈청의 생산에는 광범위한 동물 종이 사용될 수 있다. 통상, 반(反)-항혈청의 생산에 사용되는 포유 동물에는 토끼, 새앙쥐, 쥐, 햄스터 또는 기니피그가 있다. 토끼는 혈액 량이 상대적으로 많기 때문에, 폴리클론 항체의 생산에는 토끼를 선택하는 것이 바람직하다.
소정의 폴리펩타이드에 폴리클론 및 모노클론 항체는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 종래의 면역 기술을 이용하여 준비될 수 있다. 특정 폴리펩타이드의 항원 요소를 수용하고 있는 합성은 토끼나 쥐와 같은 하나 이상의 실험용 포유 동물을 면역시키는 데 이용되어 폴리펩타이드에 대한 특정 항체를 생산하도록 진행할 수 있다. 폴리클론 항혈청은 항체 생식에 시간을 부여한 후 그 동물의 피를 뽑아 그 전체 혈액으로부터 혈청 샘플을 준비하기만 하면 얻을 수 있다.
폴리클론 항체의 생산에 사용되는 면역원 합성 량은 면역에 사용된 포유 동물과 마찬가지로 면역원의 성질에 따라 다르다. [피하, 근육내, 피내(皮內), 정맥내 및 복막내의] 면역원을 관리하는 것에는 여러 가지 루트를 이용할 수 있다. 폴리클론 항체의 생산은 면역화에 후속하는 다양한 관점에서 면역된 포유 동물의 혈액을 샘플링함으로써 모니터할 수 있다. 또한, 제2의 보조 주사도 이용될 수 있다. 부스팅 및 티터링 프로세스는 적정 농도에 이를 때까지 반복된다. 바람직한 면역 유전학적 레벨을 얻으면, 면역된 포유 동물의 피를 뽑을 수 있고 분리되어 저장된 혈청 또는 그 동물을 mAbs(이하)를 생식하는 데 이용할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 중요한 특징 중 하나는 폴리클론 혈청이고, 그 폴리클론 혈청은 그 안에서 항체의 특성에 대해 상대적으로 동종이다. 통상, 폴리클론 항혈청은 다양한 여러 가지의 "클론", 즉 상이한 혈통의 B-세포들로부터 얻는다. 이와는 대조적으로, mAbs는 공동의 B-세포 선조를 갖는, 즉 "모노" 클론성 항체 생산 세포들로부터 오는 것으로 정의된다.
폴리클론 혈청을 기르기 위해 항원으로서 펩타이드를 이용하면, 전체 항원을 이용했을 때보다 혈청의 클론적 성질상 상당히 적은 변형이 예견될 것이다. 불행하게도, 만일 항원 요소의 불완전한 단편들이 제공되면, 펩타이드는 복수의 (그리고 아마도 비토착적인) 구조들을 매우 잘 가정할 수 있을 것이다. 그 결과, 아무리 짧은 펩타이드라도 상대적으로 풍부한 특성을 갖는 폴리클론 항혈청과, 불행하게도 토착적인 분자와 전혀 반응하지 않거나 반응이 불량한 항혈청을 생산할 수 있다.
본 발명에 의한 폴리클론 항혈청은 전체의 손상되지 않은 항원 요소를 포함하도록 예견되는 펩타이드에 대해 생산된다. 따라서, 이들 항원 요소들은 면역학적인 면에서 보다 안정하여 면역 시스템에 대한 보다 응집력 있는 면역학적 목표를 표현하리라 믿는다. 이 모델에서, 이 펩타이드에 반응할 잠재적인 B-세포 클론의 수는 상당히 적고, 따라서 결과적인 혈청의 동질성은 더욱 높아질 것이다. 다양한 실시예에서, 본 발명은 클론성, 즉 동일한 분자 결정체와 반응하는 클론의 비율이 적어도 80%인 폴리클론 항혈청을 제공한다. 90% 또는 95%나 그 이상까지의 보다 높은 클론성도 고찰된다.
mAbs를 얻기 위해서, 폴리펩타이드를 함유하는 합성물로 실험용 포유 동물, 양호하게는 흔히 쥐를 초기에 면역시켜야 할 것이다. 항원 생식을 할 수 있는 충분한 기간 후에 그 동물로부터 비장 또는 임파 세포의 개체군을 얻을 것이다. 따라서, 비장 또는 임파 세포는 세포 라인, 예컨대 인간의 골수종 균주와 융합되어 항체를 분비하는 림프 잡종 세포 종을 생산할 수 있다. 이들 림프 잡종 세포 종은 소망하는 폴리펩타이드에 대한 항체의 생산을 위해 스크린될 수 있는 개개의 클론을 얻기 위해 분리될 수 있다.
면역화에 이어서, 비장 세포는 플라즈마시토마 세포를 갖는 표준 융합 프로토콜을 이용하여 제거되고 융화되어 해당 폴리펩타이드에 대해 mAbs를 분비하는 림프 잡종 세포 종를 생산한다. 선택된 항원에 대해 mAbs를 생산하는 림프 잡종 세포 종는 표준 기술, 예컨대 ELISA와 웨스턴 블롯(blot) 방법을 이용하여 식별된다. 따라서, 림프 잡종 세포 종 클론은 액상 매체 안에서 배양될 수 있고, 그 배양 부유물은 해당의 특정 mAbs의 폴리펩타이드를 제공하도록 정화된다.
본 발명의 특정 용도 중에는 형광 또는 효소성 분자로 꼬리표를 단 항체가 있다. 항체에 꼬리표를 다는 방법은 당업자에게 공지되어 있고 이러한 수많은 항체들이 상업적으로 이용 가능하다. 형광성 꼬리표에는 플루오레스세인, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 효소성 꼬리표에는 알칼린 포스파타제 및 서양고추냉이 페록시다제가 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
4.10 핵산 세그먼트
또한, 본 발명은 가상적으로 어떤 소스로부터 분리될 수 있고, 총 게놈 DNA로부터 자유로우며 본 명세서에 공개된 생체 발광 펩타이드를 부호화하는 핵산 세그먼트에 관한 것이다. 이들 펩타이드를 부호화하는 핵산 세그먼트는 lux관련 또는 다른 비관련 유전자 생성물s의 단백질, 폴리펩타이드, 서브유닛, 기능적 도메인 등을 부호화하도록 확인할 수 있다. 더욱이, 이들 핵산 세그먼트는 당업자에게 공지된 방법들을 이용하여 완전히 시험관 내에서 합성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 세그먼트"는 특정한 종의 총 게놈 핵산이 없이 분리된 핵산 분자를 말한다. 따라서, 생체 발광 폴리펩타이드를 부호화하는 핵산 세그먼트는 핵산 세그먼트가 얻어지는 종의 총 게놈 핵산으로부터 아직 분리되어 있거나 그로부터 자유롭도록 정화된 생체 발광 폴리펩타이드 코딩 서열을 수용하고 있는 핵산 세그먼트를 말한다. 용어 "핵산 세그먼트" 안에는 핵산 세그먼트와 그러한 세그먼트보다 작은 단편들, 및 예컨대 플라즈미드, 코즈미드, 파제미드, 파제, 바이러스 등을 포함하는 재조합 벡터들이 있다.
마찬가지로, 분리되거나 정화된 생체 발광 유전자를 포함하는 핵산 세그먼트는 펩타이드 부호화 서열에 더하여 자연 발생적인 유전자 또는 단백질 부호화 서열로부터 실질적으로 멀리 분리된 조절 서열과 같은 소정의 다른 요소들을 포함할 수 있는 핵산 세그먼트를 말한다. 이 점에서, 용어 "유전자"는 기능적인 단백질 부호화 유닛, 폴리펩타이드 부호화 유닛 또는 펩타이드 부호화 유닛을 지칭하기 위해 간단하게 사용되고 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 이 기능적 용어는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 표현하거나 표현하는 데 적합할 수 있는 보다 작게 처리된 유전자 세그먼트, cDNA 서열 및 게놈 서열 모두를 포함한다. 양호한 실시예에서, 핵산 세그먼트는 lux 유전자의 오페론을 포함한다.
"다른 코딩 서열로부터 실질적으로 분리되어 떨어졌다"는 것은 유전자 또는 해당 오페론, 이 경우에는 오페론 부호화 생체 발광 폴리펩타이드는 DNA 세그먼트의 코딩 영역의 상당 부분을 형성하고 DNA 세그먼트는 큰 염색체 단편 또는 다른 기능적 유전자 또는 cDNA 코딩 영역과 같은 자연 발생적인 코딩 DNA의 많은 부분은 차지하지 않음을 의미한다. 물론, 이는 원래 분리되어 있는 것과 같은 DNA 세그먼트를 지칭하지는 않으며, 인간의 손으로 나중에 그 세그먼트에 더해진 유전자 또는 코딩 영역을 제외하지 않는다.
또한, 아미노산 서열 및 핵산 서열은 부가적인 N-터미널 아미노산 또는 C-터미널 아미노산 또는 5' 서열, 또는 3' 서열과 같은 부가적인 잔류물을 포함하고, 서열이 전술된 기준을 충족하는 한 단백질 표현이 관련되어 있는 생물학적 단백질 활동의 유지를 포함하여 아직 여전히 본 명세서에 공개된 서열들 중 하나의 서열에 인용되는 바와 같이 기본적으로 존재한다. 종료 서열의 부가는 특히 코딩 영역의 5' 부분 또는 3' 부분 중 어느 하나의 측면에 접하는 다양한 코딩하지 않은 서열들을 포함할 수 있거나 다양한 내부 서열, 즉 유전자 안에서 발생하는 것으로 알려져 있는 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 공급된다.
본 발명의 핵산 세그먼트는, 코딩 서열 그 자체의 길이에 관계없이, 프로모터, 폴리아데닐레이션 신호, 부가적인 제한 위치, 복수의 클로닝 위치, 기타 코딩 세그먼트 등과 같은 다른 DNA 서열과 조합되어, 그들의 총 길이는 상당히 변화될 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편이 사용되고, 여기에서 총길이는 양호하게는 준비의 편이 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜의 사용에 의해 제한된다.
본 발명의 공개된 뉴클레오타이드 서열 주위에 설계된 다양한 탐침 및 프라이머는 소정의 길이를 구성할 수 있다. 서열에 수치값을 할당, 예컨대 제2 잔류물은 1, 제2 잔류물은 2 등으로 함으로써, 모든 프라이머를 정의하는 알고리즘은 다음 식과 같이 제안된다.
n 내지 n+y
여기에서, n은 1에서 최종 서열 번호까지의 정수이고, y는 프라이머에서 1을 뺀 길이이며, n+y는 최종 서열 번호를 초과하지 않는다. 따라서, 10메르인 경우, 탐침은 염기 1 내지 10, 2 내지 11, 3 내지 12, 등에 상응한다. 15메르인 경우, 탐침은 염기 1 내지 15, 2 내지 16, 3 내지 17 등에 상응한다. 20메르인 경우, 탐침은 염기 1 내지 20, 2 내지 21, 3 내지 22 등에 상응한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 부호화하는 특정 핵산 서열에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 재조합 벡터 및 분리된 DNA 세그먼트는 펩타이드 코딩 영역 자체, 선택된 변화를 유지하는 코딩 영역 또는 기본 코딩 영역에서의 변경을 다양하게 포함할 수 있고, 또는 그들은 그럼에도 불구하고 이들 펩타이드 영역을 포함하는 보다 큰 폴리펩타이드를 부호화하거나 변종 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 기능적인 등가의 단백질을 부호화할 수 있다.
본 발명의 DNA 세그먼트는 생물학적으로 기능적인 등가의 펩타이드를 포괄한다. 이러한 서열은 핵산 서열 및 따라서 부호화된 단백질 내에서 자연 발생한다고 알려져 있는 코돈 용장성 및 기능적 등가성의 결과로서 일어날 수 있다. 대안으로, 기능적으로 등가인 단백질 또는 펩타이드는, 아미노산의 성질이 바뀌어 있음을 고려함을 기반으로 하여, 단백질 구조의 변화가 처리될 수 있는 재조합 DNA 기술의 응용을 통해 생성될 수 있다. 인간에 의해 설계된 변화는 장소 지향적 변이 생성 기술의 응용을 통해 유도되어, 분자 레벨에서 활동을 검사하도록 하기 위해서 예컨대 단백질의 생체 발광 또는 시험용 돌연 변이체에 대한 개량을 유도할 수 있다.
또한, 바람직한 한가지는 정재용 또는 면역 검출용 "태그" 또는 색소체 약물 표적화 신호와 같이 바람직한 기능을 하는 팹티드 또는 다른 단백질과 동일한 유전인자내에 펩티드 코딩 영역을 정렬하는 팹티드 및 융해 단백질을 준비할 수 있다(예컨데, 친화력 색층 분석 및 효소 레벨 코딩 영역에 의해 정제될 수 있는 단백질).
재조합형 벡터는 본 발명의 또 다른 특징을 형성한다. 특히, 유용한 벡터는 상기 프로모터의 통제하에 전 길이 단백질 또는 작은 펩티드 중에 한 개를 인코딩하는 상기 DNA 세그먼트의 코딩 부분을 위치시키는 벡터가 되는 것을 관찰해야 한다. 이러한 프로모터는 본 발명의 유전자 인코딩 펩티드와 자연스럽게 결합되는 프로모터의 형태로 될 수 있으며, 이것은 코딩 세그먼트 또는 엑손의 5개의 비코딩 서열이 위치한 업스트림을 격리하여, 예컨데, 본원에 개시된 합성물과 결합하여 클로닝 또는 PCRTM기술을 이용하여 얻어질 수 있다.
다른 실시예에서, 재조합 또는 이종의 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 몇가지 장점을 얻을 수 있다. 본원에 이용된 바와 같이, 재조합 또는 이종의 프로모터는 자연 환경에서 한 개 이상의 생물 발광체 폴리펩티드 (bioluminescence polypeptide)를 인코딩하는 핵 세그먼트와 정상적으로 결합된다. 그러한 프로모터는 다른 유전체와 정상적으로 결합된 프로모터 또는 박테리아, 바이러스, 유칼리오틱 또는 식물 세포와 격리된 프로모터 또는 이러한 2개의 프로모터를 모두 포함할 수 있다. 자연적으로, 세포 타입, 유기체, 또는 동등한 동물에서 DNA 세그먼트의 표현을 효율적으로 지시하는 프로모터를 적용하는 것이 중요할 것이다. 프로모터의 이용 및 단백질 표현의 세포 타입 결합은 분자 생물학 [see Sambrook et al., 1989]의 당업자라면 알 수 있다. 상기 적용된 프로모터는 구성적으로 연역되거나, 적합한 조건아래 상기 소개한 DNA 세그먼트의 고급 표현을 지시하는데 이용될 수 있는데, 이것은 재조합 또는 펩티드를 대량 생산하는데 유리하다. 적절한 프로모터는 환경 요소 또는 스트레스로 인하여 유도되는 프로모터이다.
특별히 생물 발광체 폴리펩티드 인코딩 시퀀스로 잡종을 만드는 핵산 프로브의 능력은 소정의 샘플안에 보상 서열이 있다는 것을 검출할 때 이용될 수 있다. 그러나, 변종 프리머 또는 다른 유전 구조를 준비할 때 이용하는 프리머를 준비하는 서열 정보를 포함하여 다르게 이용할 수도 있다.
14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 등, 70,71,72,73 등, 80,81, 82,83 등, 90,91,92,93 등, 100,101,102,103 등, 150,151,152,153 등과 같이, 200-500, 500-1000 ,1000-2000, 2000-3000, 3000-5000, 5000-10000을 통한 모든 정수를 포함하고, 약 12,001, 12002, 13001, 13002의 서열을 갖는 접종 핵산염 균주및 동일한 종류의 핵산염, 또는, 본원에 개시된 핵산 서열로 보상하거나 동일한 핵산분자는 남북 얼룩에 이용하는 교배 프로브에서 관찰된다. 작은 단편들은 약 10 내지 14 및 약 100 또는 200 핵산염과 같이 접촉 보상 영역의 길이가 변하는 교배 실시에서 이용하는 것을 찾을 수 있지만, 보상 서열 가닥이 검출되는 길이에 따라 접촉 보상 가닥이 이용될 수 있다.
약 14,15,16,17,18 또는 19 핵산염의 교배 프로브를 사용하면 안정하고 선택적인 이중 분자를 세로로 형성할 수 있다. 세로로 14,15,16,17,18 또는 19 이상의 가닥에서 접촉성 보상 서열을 갖는 하이브리드 분자의 안정성 및 선택도를 증가시키기 위하여 일반적으로 적용되고, 그럼으로써, 특정 하이브리드 분자의 질 및 등급을 개선시킬 수 있지만, 15 내지 20 접촉성 핵산염 또는 그 이상의 유전 보상 능력을 갖는 핵산 분자를 설계하는데 적합할 것이다.
물론, 기계적인 쉐어링 또는 제한 효소 소화작용과 같은 다른 기술에 의해 단편들이 얻어질 수 있다. 작은 핵산 세그먼트 또는 단편들은 자동화 올리고 핵산염 신디사이저(automated oliginucleotide synthesizer)를 이용하여 일반적으로 실시되는 화학적 수단에 의해 직접 합성함으로서 쉽게 만들어진다. 또한, 재조합하기 위하여 재조합 벡터로 선택된 서열을 유도함으로써 본원에 인용 참증으로 포함된 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호의 PCRTM 기술과 같은 핵산 재생 기술 및 분자생물학의 당업자에게 널리 공지된 다른 재조합형 DNA 기술을 적용함으로써 단편이 얻어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 핵산염 서열은 DNA 단편의 보상 응력으로 2중 분자를 선택적으로 형성하는데 이용될 수 있다. 본원에 따르면, 다양한 조건의 교배를 통하여 타겟 서열쪽으로 프로브의 선택도를 변경하는 것이 바람직하다. 높은 선택도가 필요하면, 상대적으로 엄격한 조건을 적용하여 교배하고, 예컨데, 약 50℃ 내지 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 0.15M을 제공하는 것과 같이 상대적으로 낮은 소금 또는 고온 상태를 선택할 것이다. 어째든, 내성이 없는 그러한 선택적인 조건은 상기 프로브와 템플릿 또는 타겟 요소사이를 오정합하고, 생체 발광 폴리펩티드 인코딩 DNA 세그먼트를 분리하는데 특히 적합할 것이다. 교배를 통한 DNA 세그먼트의 검출은 당업자에게 널리 알려져 있고, 본원에 참조용으로 포함되는 미국특허 제4,965, 188호 및 제5,176,995호는 교배 분석 방법에 대한 일예이다. 원문[Maloy et al.,19 90;1994; Segal 1976;Prokop,1991; and Kudy,1994]속에서 찾을 수 있는내용과 특히 관련이 있다.
물론, 템플릿에 교배된 변종 프라이머 가닥을 적용하여 변종을 준비하는 것이 바람직한 장소 또는 생체 발광 폴리펩티드 인코딩 서열을 기능적으로 동일하거나 같은 관련 종으로부터 격리하는 장소에 적용하기 위하여, 덜 엄격한 교배 조건은 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성하는데 필요할 것이다. 이러한 환경속에 약 20℃ 내지 55℃의 온도에서 약 0.15M 내지 0.9M의 소금을 적용하는 것이 바람직하다. 크로스 교배종은 교배를 통제하는 교배 신호로 쉽게 식별될 수 있다. 어떠한 경우에, 일반적으로 그러한 조건은 포름아미드(FORMAMIDE) 양을 증가시킴으로써 더욱 엄격해지는데, 이것은 온도를 상승시키는 방법과 동일한 방법으로 2종 잡종을 불안정하게 한다. 따라서, 교배 조건은 쉽게 만들어짐에 따라, 소정의 결과에 따라 선택하는 방법이 될 수 있다.
임의 실시예의 장점은 라벨(label)과 같이 교배를 결정하는 적합한 수단과 결합하여 본 발명의 핵산 서열을 제공하는 것이다. 매우 다양한 지시기 수단은 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 형광성 및 효소를 포함하여 종래 기술에 공지되어 있다. 양호한 실시예에 있어서, 우레아제, 알카리성 포스파타아제 및 페록시다아제 (phosphatase or peroxidase)와 같은 형광 라벨 또는 효소 태그를 적용할 수 있다. 효소 태그의 경우에, 비색계(colorimetric) 지시기 기판은 육안으로 볼 수 있는 수단 또는 분광 광도계를 제공하여 보상 핵산을 함유한 샘플로 특정 교배를 식별하는데 적용하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 형광 태그의 경우에, 형광 지시기는 본 발명의 장치로 볼 수 있는 수단을 제공하는데 적용하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 교배 프로브는 용액 잡종 교배 및 고체 페이지를 적용한 실시예에서 시약으로 이용될 것이다. 고체 페이지를 적용한 실시예에서, 상기 시험 DNA(또는 RNA)는 흡수되거나 선택된 매트릭스 또는 표면에 고착된다. 이렇게 고착된 단일 가닥 핵산은 소정의 상태에서 선택된 프로브로 특정 잡종 교배에 들어간다. 그 선택된 조건은 필요한 특정 범주의 환경에 의존할 것이다(예컨데, G+C 내용, 타겟 핵산의 종류, 핵산의 소오스, 잡종 교배 프로브의 크기 등). 명확하지 않은 범주의 프로브 분자를 제거하기 위하여 잡종 교배된 표면을 세척한 후에, 특정 잡종 교배는 검출되고, 또한, 상기 라벨에 의해 정량적으로 분석된다. 프로브 라벨링 및 잡종 검출 수단은 본원에 참조용으로 포함된 참조문헌[sayler and layton (1990) and Hill et al(1991)]에서 실험된 바와 같이 당업자에게 널리 알려져 있다.
4.11 돌연변이된 DNA 세그먼트를 준비하는 방법
임의의 환경에서, 상기 프로모터 영역의 전사 활동 또는 다른 특성을 변경하기 위하여 본원에 개시된 한 개 이상의 프로모터 서열로 한 개 이상의 핵산염을 수정 또는 변경하는 것이 바람직하다. 일반적으로, DNA 세그먼트를 돌연변이시키는 수단 및 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 그러한 세그먼트로 수정은 랜덤하게 또는 특정 부위(site specific) 돌연변이 절차에 의해 수정될 수 있다. 그 프로모터 영역은 수정되지 않은 프로모터 영역을 인코드한 서열로부터 한 개 이상의 핵산염을 삭제 또는 부가하여 그 구조를 변경함으로써 수정될 수 있다.
돌연변이는 종래기술에 따라 실행되고, 특정 프로모터 영역의 서열내에서 한 번 이상 돌연변이한 올리고 핵산염을 합성할 수 있다. 특히, 특정 부위 돌연변이는 DNA의 특정 돌연변이를 통하여 프로모터 변이를 준비하는데 유용한 기술이다. 또한, 그 기술은 한 개 이상의 핵산염 서열 변화를 DNA에 유도함으로써 한번 이상 이전에 고려한 서열 변수를 준비하고 시험할 수 있다. 특정 부위 돌연 변이는 원하는 돌연변이의 DNA 서열을 인코딩하는 특정 올리고 핵산염 서열 및 충분한 갯수의 인접한 핵산염의 이용을 통하여 돌연변이 시켜, 충분한 크기 및 복잡한 서열의 프라이머 서열을 제공하여 횡단되는 공핍 접합의 양 측면에 안정한 듀플렉스를 형성한다. 통상적으로, 세로로 약 17 내지 75 핵산염의 프라이머는 변경될 서열의 결합 양측에 약 10 내지 25 개 이상이 체류하는 것이 적합하다.
일반적으로, 특정 부위 돌연 변이 기술은 다양하게 공개된 바와 같이 종래 기술에 널리 알려져 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 그 기술들은 통상적으로 단일 가닥 및 2중 가닥 형태의 페이지 벡터를 제공한다. 부위가 지시된 돌연변이에서 유용한 통상적인 벡터는 M13 페이지와 같은 벡터를 포함한다. 이러한 페이지는 상업적으로 손쉽게 이용할 수 있고 이러한 이용은 당업자에게 널리 알려져 있다. 또한 2개로 분기된 플라스미드는 플라스미드에서 페이지로 이득 있는 유전자를 전달하는 단계를 제거하는 부위 지정 돌연변이에 제공된다.
일반적으로, 본원에 따른 부위 지정 돌연변이는 처음에 단일 가닥기 벡터를 얻고 또한 원하는 프로모터 영역 또는 펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 그 서열내에 포함하는 2중 가닥 벡터의 2개 가닥을 용융시킴으로서 실행된다. 바람직하게 돌연변이된 서열을 갖고 있는 올리고 핵산염 프라이머는 일반적이고 종합적으로 준비된다. 다음, 이러한 프라이머는 단일 가닥 벡터로 어닐링되어 F, coli polyme rase I Klenow 단편과 같은 DNA 중합 효소에 제공되어, 돌연변이로 발생한 가닥의 합성을 종료한다. 따라서, 헤테로듀플렉스(heteroduplex)는 한 개의 가닥이 최초에 돌연변이 되지 않은 서열을 인코딩하고 제2의 가닥에 소정의 돌연변이가 일어남으로써 형성된다. 이러한 헤테로듀플렉스 벡터는 E.coli 세포와 같은 적합한 세포를 감염시키거나 변형시키는데 이용되고, 클론(clone)은 돌연변이 서열을 배치하는 재조합형 벡터를 포함하는 것이 선택된다. 유전자 선택 방법은 kunkel 등( 1987)에 의해 관찰되어 돌연 변이 유발력을 갖는 클론을 부양한다. 택일적으로, Taq 폴리머라제와 같은 상업적으로 유용한 열안정 효소를 갖는 PCRTM의 사용은 적합한 클로닝 벡터 또는 표현 벡터로 클로닝될 수 있는 확대된 DNA 단편으로 돌연변이 올리고 핵산염 프라이머를 포함하는데 이용된다. 상기 Tomic et al(1990) 및 Upender et al (1995)의 PCRTM중계 돌연변이 절차는 그러한 프로토콜의 2가지 예를 제공한다. 열안정 폴리머라제에 부가한 열안정 리가아제를 적용한 PCRTM은 적합한 클로닝 또는 포현 벡터에 클로닝되는 확대 DNA 단편에 인산화 돌연변이 올리고핵산염을 포함하는데 이용된다. Michael(1994)에 의해 설명된 돌연변이 절차는 상기 한 개의 프로토콜에 대한 일예이다.
부위 지정 돌연변이를 이용하는 선택된 프로모터 인코딩 DNA 세그먼트의 서열 변수의 준비는 잠재적으로 유용한 종(speies)을 생산하는 수단으로써 제공되는 것이지, DNA 서열의 서열 변수를 얻는 다른 방법과 같이 한정되는 것을 의미하는 것은 아니다. 예컨데, 상기 소정의 프로모터 서열을 인코딩하는 재조합 벡터는 하이드록시라민과 같은 돌연변이 시약으로 처리되어 서열 변수를 얻을 수 있다.
본원에 이용된 바와 같이, 용어 "올리고핵산염 지정 돌연변이 절차"는 특정 핵산 분자의 농도가 초기 농도에 비하여 커지고, 또한, 진폭과 같은 검출가능한 신호의 농도를 증가시키는 템플릿 공정 및 벡터 중계 전파로 언급한다. 본원에 이용된 바와 같이, 용어" 올리고핵산염 지정 돌연변이 절차"는 프라이머 분자의 템플릿 종속 확장을 포함하는 절차로 언급된다. 그 용어 "템플릿 종속 공정은 핵산의 새로운 합성 가닥이 널리 공지된 보상 베이스 쌍의 법칙(Wason, 1987)에 의해 받아들여지는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성으로 언급한다. 통상적으로, 벡터 중계 돌연변이는 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 벡터, 그 벡터의 클로닝 증폭 및 그 증폭된 핵산 단편을 회복시키는 것을 포함한다. 그러한 돌연변이에 대한 예들은 본원에 참조된 미국 특허 제4,237,224호에 제공된다.
복수의 템플릿 종속 공정은 증폭하는데 이용할 수 있다. 가장 많이 알려진 진폭 방법중 한 가지 방법은 본원에 참조된 미국특허 제4,683,195,호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세히 기술된 중합체 사슬 반응(polymerase chain reacti on)(PCRTM)이다. 간단히 말하면, PCRTM에서 2개의 프라이머 서열은 그 타겟 서열의 반대 보상 가닥 위에 영역을 보상되는 것이 준비된다. 디옥시 뉴클레오사이드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphates)의 액세스는 DNA 중합체(예, Taq 중합체)와 함께 반응 혼합에 부가된다. 한 개의 샘플에 타겟 서열이 있으면, 상기 프라이머는 타겟에 결합되고, 그 중합체는 핵산염을 부가함으로써 타겟 서열에 따라 프라이머가 연장될 것이다. 그러한 공정은 반복된다. 양호하게, 역전사제 PCRTM증폭 절차는 증폭되는 mRNA의 양을 정량화하기 위하여 실행될 수 있다. 중합체 사슬 반응 방법론은 종래기술에 널리 공지되어 있다.
증폭하는 다른 방법은 본원에 참조용으로 포함된 유럽 특허 출원 공개번호 제320,308호에 개시되어 있는 리가아제 사슬 반응(LCR로 언급). LCR에서, 2개의 보상 프로브의 쌍이 준비되고, 타겟 서열의 각 쌍은 타겟의 반대 보상가닥에 결합되어 인접하게 될 것이다. 리가아제의 출현으로, 2개의 프로브 쌍은 단일 유전인자를 형성하기 위하여 연결될 것이다. 온도 싸이클에 의해, PCRTM에서, 결찰된 유전인자는 타겟에서 분리된 다음, 액세스 프로브 쌍의 결찰에 " 타겟 서열"로 제공한다. 본원에 참조용으로 포함된 미국특허 제4,883,750호는 프로브 쌍을 타겟 서열에 결합하는 LCR과 비슷한 다른 증폭 방법을 설명한다.
본원에 참조용으로 포함된 PCT 공개번호 PCT/US87/00880에 기술된 레플리카아제는 본원 발명의 다른 증폭 재료로써 이용될 수 있다. 이러한 방법에서, 타겟의 영역에 보상 영역을 갖는 RNA의 복제 서열은 RNA 중합체의 출현시 샘플에 부가된다. 그 중합체는 검출될 복제 서열을 복사할 것이다. 제한 부위의 한 가닥에 핵산염5'-[-thio] 트리포스페이트를 포함하는 타겟 분자의 증폭을 실행하는데 제한 엔도뉴 클레아제(endonucleases) 및 리가아제를 이용하는 등온의 진폭 방법 (Walker et al,.1992, 본원에 참고용으로 포함됨)은 본원 발명의 핵산 증폭에 유용하게 이용할 수 있다.
가닥 변위 증폭(strand displacement amplification)(SDA)은 가닥 변위 및 합성의 복수의 횟수, 즉, 눈금 번역(nick translation)을 포함하는 핵산의 등열 증폭을 수행하는 다른 방법이다. 수복 사슬 반응(repair Chain Reaction)(RCR)이라 불리는 비슷한 방법은 본 발명에 유용한 다른 증폭 방법이고, 4개의 염기중 2개의 염기만이 나타나는 수복 반응 다음에, 증폭용으로 타겟된 영역을 통하여 수개의 프로브를 어닐링한다. 다른 2개의 염기는 검출하기 쉽게 바이오틴틸 도출(biotiny lated derivatives)로써 부가된다. 비슷한 방법은 SDA에 이용된다.
본원에 참조용으로 포함된 영국 특허출원 제2,202,328호 및 국제 공개 번호 PCT/US89/01025에 기술된 다른 증폭 방법은 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 이전의 출원에 있어서, 변경 프라이머는 PCRTM, 템플릿 및 효소 종속 합성에 이용된다. 상기 프라이머는 포획 성분(예,비오틴) 및/또는 검출기 성분(예, 효소)으로 레벨링함으로써 수정될 수 있다. 후자를 적용하면, 레벨된 프로브의 액세스는 샘플에 부가된다. 타겟 서열의 출현시, 그 프로브는 결합되고 촉매작용으로 분리된다. 분리후, 그 타겟 서열은 완전히 해체되어 액세스 프로브에 결합된다. 그 라벨된 프로브의 균열은 타겟 서열을 나타내는 신호이다.
다른 핵산 증폭 절차는 핵산 서열에 의한 증폭(nucleic-acid sequence based amplication)(NASBA) 및 3SR을 포함하는 전사 증폭 시스템(TAS)(본원에 참조용으로 포함된 국제 공개 번호 WO88/10315). NASBA에서, 핵산은 표준 페놀/클로로포름 추출에 의한 증폭, 샘플의 열 변성, 세포 용해 버퍼로 처리 및 DNA와 RNA의 격리를 위한 미니스핀 열 또는 RNA의 구아니듐 크롤라이드 추출을 위하여 준비된다. 이러한 증폭 기술은 결정 단백질-종 서열을 갖는 프라이머를 어닐링하는 것을 포함한다. 중합 반응에 따르면, DNA/RNA 하이브리드는 2 가닥의 DNA 분자가 다시 열로 변성하는 동안 RNase H로 소화된다. 2개중에 한 경우에 한 가닥 DNA는 2개의 결정 단백질- 종 프라이머를 부가함으로써 완전히 2 가닥으로 만들어 지고, 그 다음 중합 반응을 한다. 상기 2 가닥 DNA 분자는 T7 또는 SP6과 같은 중합체에 의해 전사되어 증식된다. 동등한 열 결정 반응에 있어서, RNAs는 2중 가닥 DNA로 역전사 되고, T7 또는 SP6과 같은 중합체로 다시 한번 전사된다. 절단되거나 완전한 그 결과의 부산물은 결정 단백질-종 서열을 지시한다.
본원에 참조용으로 포함된 유럽 특허 출원 공개 번호 제329,822호는 단일 가닥 RNA("ssRNA"), 단일 가닥 DNA(ssDNA) 및 2중 가닥 DNA(dsDNA)를 합성하는 핵산 증폭 공정을 개시하고 있는데, 이것은 본 발명에 따라 이용된다. 상기 ssRNA는 제1 프라이머 올리고핵산염에 대한 제1 템플릿인데, 이것은 역전사제(RNA 종속 DNA 중합체)에 의해 확대된다. 상기 RNA는 리보뉴클레아제 H의 작용에 의해 DNA : RNA 듀플렉스로부터 제거된다. 그 결과의 ssDNA는 제2 프라이머에 대한 제2 템플릿이고, 또한, 이것은 그것의 템플릿에 이종 관계로 RNA 중합체 프로모터(T7 RNA 중합체에 의해 예시)5'의 서열을 포함한다. 이러한 프라이머는 프라이머 사이의 최초 RNA의 RNA와 동일한 서열을 갖고, 일단에서, 프로모터 서열을 부가적으로 갖는 2 가닥 DNA("dsDNA")에 기인하는 DNA 중합체(E.coli DNA 중합제 I의 커다란"Klenow"에 의해 예시)에 의해 확장된다. 이러한 프로모터 서열은 적합한 RNA 중합체에 의하여 DNA의 많은 RNA 복사를 하는데 이용될 수 있다. 이러한 복사는 매우 빠른 증폭을 유도하는 싸이클을 다시 입력할 수 있다. 적합하게 효소를 선택함으로써, 이러한 증폭은 각 싸이클에서 효소를 부가하지 않고 등온으로 행할 수 있다. 이러한 공정의 순환성 때문에, 그 개시 서열은 DNA 또는 RNA 중에 한가지 형태로 선택될 수 있다.
PCT 국제 공개 번호 WO 89/06700은 본원에 참조용으로 포함되고, 상기 서열의 RNA 복제의 전사에 따라 타겟 ssDNA로 프로모터/프라이머의 잡종 교배에 의한 핵산 서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법은 주기적인 것이 아니다. 즉, 신규 템플릿은 그 RNA 전사로 발생되지 않는다. 다른 증폭 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있는 "RACE"(Forhman,1990) 및 일측 PCRTM(Ohara,1989)를 포함한다.
"디-올리고핵산염"의 서열을 갖고, 그 결과, 디-올리고 핵산염을 증폭하는(본원에 참조용으로 포함된 Wu and Dean, 1996) 핵산의 출현시 2개의 올리고핵산염의 결찰 방법은 본 발명의 DNA 서열의 증폭에 이용될 수 있다.
4.12 생물제제 기능 등식
본 발명의 펩티드 구조 및 바람직한 특성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 인코드하는 기능 분자를 얻고 인코드하는 DNA 세그먼트에서 수정 및 변경이 일어난다.동등하게 생성하는 단백질의 아미노산 또는 동일하게 개선한 제2 발생 분자의 변경에 대하여 다음과 같이 논의한다. 그 아미노산 변경은 표 3에 목록된 코돈에 따라 DNA 서열의 코돈을 변경함으로서 이루어질 수 있다.
코돈의 표
아미노산 코돈
Alanine Ala A GCA GCC GCG GCUCysteine Cys C UGC UGUAspartic acid Asp D GAC GAUGlutanic acid Glu E GAA GAGPhenylalanine Phe F UUC UUUGlycine Gly G GGA GGC GGG GGUHistidine His H CAC CAUIsoleucine He I AUA AUC AUULysine Lys K AAA AAGLeucine Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUUMethionine Met M AUGAsparagine Asn N AAC AAUProline Pro P CCA CCC CCG CCUGlutamine Gln Q CAA CAGArginine Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGUSerine Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCUThreonine Thr T ACA ACC ACG ACUValine Val V GUA GUC GUG GUUTryptophan Trp W UGGTyrosine Tyr Y UAC UAU
예컨데, 어떤 아미노산은 기판 분자상에 항체의 항원 결합 영역 또는 결합 부위와 같은 구조에 상호 작용하는 결합력의 손실없이 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 대체할 수 있다. 단백질의 생물학적 기능을 정의하는 단백질의 성질 및 상호 작용력 때문에, 임의의 아미노산 서열 치환은 단백질 서열 및 그 DNA 코딩 서열로 이루어지며, 그럼에도 불구하고, 동일한 특성을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 따라서, 발명가는 그 공개된 합성물의 팹티드 서열 또는 그들의 생물학적인 유용성 또는 활동도을 손상시키지 않고 상기 팹티드를 인코딩하는 DNA 서열로 다양하게 변경될 수 있다는 것을 고려해야 한다.
그러한 변화가 있을 때, 아미노산의 수치료법의 인덱스도 고려해야 한다. 단백질의 상호작용하는 생물학적 기능을 논의할 때 수치료법의 아미노산 인덱스의 중요성은 일반적으로 종래 기술에서 이해된다(본원에 참조된 Kyte 및 Doolittle, 1992). 상기 아미노산의 상대 수치료법의 문자는 다른 분자, 예컨데, 효모, 물질, 수용기, DNA, 항체, 항원을 갖는 단백질의 상호 작용을 정의하는 합성 단백질이 2차 구조에 기여하는 것이 수락된다.
각 아미노산은 그들의 소수성 및 전하 특성을 토대로 수치료법의 인덱스를 할당했는데(Kyte and Doolittle, 1982), 이것에는 이소레우신(isoleucine)(+4,5), 배린(valine)(+4,2), 레우신(leucine)(+3,8), 패닐랄라닌(+2,8), 시스테인/시스틴 (+2,5), 메티오닌(+1.9), 알라닌(+1.8), 글리신(-0.4), 트레오닌(-0.7), 세린(-0.8), 트립토판(-0.9), 티로신(-1.3), 프롤린(-1.6), 히스티딘(-3.2), 글루타메이트(-3.5), 클루타민(-3.5), 에스파테이트(-3.5), 에스페라진(-3.5), 리신(-3.9) 및 아르지닌(-4.5)이 있다.
임의의 아미노산이 비슷한 수치료법의 인덱스 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산에 의해 대체되고, 비슷한 생물학적인 활동을 하는 단백질에 기인하고, 즉, 생물학적 기능적으로 동일한 단백질을 얻을 수 있는 것은 종래 기술에 공지되어 있다. 이러한 변경을 함으로써, 수치료법의 인덱스가 ±0.5 이내에 있는 아미노산의 물질은 적합하며, ±1 이내에 있는 물질은 특히 적합하며, ±0.5 이내에 있는 물질이 가장 적합하다.
또한, 친수성을 토대로 동등한 아미노산 물질이 만들어지는 것을 이해할 수 있다. 본원에 참조되는 미국특허 제4,554,101호는 인접한 아미노산의 친수성에 의해 정복되는 단백질의 가장 큰 친수성이 그 단백질의 생물학적 특성과 상호 관계가 있다는 것을 언급하고 있다.
미국특허 제4,554,101호에 상술된 바와 같이, 다음과 같은 친수성 값은 아미노산 잔유물, 즉, 아르기닌(+3.0), 리신(+3.0), 에스퍼테이트(+3.0 ±1), 글루타메이트(+3.0 ±1), 새린(+0.3), 에스페러진(+0.2), 글리신(0), 트레오닌(-0.4), 프롤린(-0.5 ±1), 알라닌(-0.5), 히스티딘(-0.5), 시스테인(-1.0), 메티오닌(-1.3), 밸린(-1.5), 루신(-1.8), 이소루신(-1.8), 티로신(-2.3), 패닐라라닌(-2.5), 트립토판(-3.4)에 할당되어 있다.
아미노산은 비슷한 친수성 값을 갖게 대체되어, 생물학적으로 동등한 것을 얻을 수 있으며, 특히, 면역 감시에 동등한 단백질을 얻을 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 그러한 변경으로, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산의 물질이 적합하며, 특히, ±1 이내에 있는 물질이 적합하며, ±5 이내에 있는 물질이 더욱 적합하다.
상기 강조한 바와 같이, 아미노산 물질은 아미노산 측 사슬 물질이 상대적인 유사성, 예컨데, 그들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 앞선 다양한 특성을 고려한 물질은 당업자에게 널리 알려져 있으며, 아르기닌과 리신, 글루타메이트와 에스퍼테이트, 세린과 트레오닌, 글루타민과 에스페러진, 및 밸린, 루신과 이소루신을 포함한다.
4.13 본 발명의 부가적인 특징
본원에 상세히 기술된 실시예에 부가하여, 발명가는 본 발명의 BBIC를 오염물질, 폭팔성 물질, 중금속 또는 지하수, 하천, 강, 대양 또는 다른 환경에 잔류하는 화학적 생물학적 시료를 검출하는데 이용되는 것을 관찰할 수 있다. 또한, 본 발명의 BBIC는 생의학용 약 및 항암 검진의 조합형 화학, 오일 탐사용 센서, 산업공정 제어 및 생의학 기구에 이용된다. 본 발명의 BBIC는 시험용 화학물질, 예컨데, Fe+2또는 PO-2이 없는지 또는 덜 풍부한지에 응답하는데 이용된다. 화합물에 부가하여, 본 발명의 BBIC는 온도, 방사능 및 압력과 같은 환경 상태를 검출하는데 이용된다. 발명가는 BBIC의 유기체가 물질 또는 상태의 존부를 검출할 수 있는 경우에 이용되고, 리포터 유전체에 동작적으로 연결된 프로모터의 표현을 변경할 수 있다고 생각한다.
본원에 상세히 기술된 것 이외에, 발명가는 본 발명의 BBICs를 파워링하는 방법을 고려했다. 발명가는 RF, 광학 에너지(태양에너지 포함), 기계적인 에너지(진동, 수류, 기류등), 화학 에너지, 또는 열 에너지에 의해 원격적으로 전원이 인가될 수 있다. 본 발명의 몇가지 실시예에 있어서, 감지 유지체 또는 화합물에 의해 발생된 광은 BBIC에 전원을 공급하는데 이용될 수 있다.
발명가는 본 발명의 BBICs를 무선수단(예컨데, RF 또는 온 칩 광방출 장치) 또는 유선 수단(예컨데, 직접 아날로그, 디지털, 또는 저항, 커패시턴스 및 인덕턴스를 포함하는 수동수단)에 의해 판독될 수 있다. 또한, 본 발명의 BBICs는 바이폴라 실리콘, 실리콘 게르마늄, GaAs, InP 또는 다른 반도체 IC 프로세스로 실현될 수 있다.
본 발명의 광 방출제는 생물학적이거나 화학적이 될 수 있는데, 그 광을 방출하는 메커니즘은 루미네슨스, 플루오레슨스, 또는 포스포레슨스가 될 수 있다. 또한, 본 발명가는 그 광 방출제가 제조시간에 IC 상에 위치되고, 이용시간에 IC 상에 위치되는 것을 고려한다. 본 발명의 다른 실시예에 있어서, 광 방출제의 어레이를 포함하는 정합 어레이가 광 검출 소자의 정합 어레이를 포함하는 것을 고려한다. 신호처리(아날로그, 디지털, 신경망 등)를 부가하여, 이러한 어레이 소자는 개별적인 화학 약품 대신에 화학 약품의 군을 검출하는데 이용되고, 부가적으로, 다른 방출 파장을 갖는 광 방출 소자의 어레이를 포함하는 상기 BBIC는 집적 광 스펙트로미터를 포함한다. 예컨데, 방출광의 스펙트럼을 측정함으로써, 본 실시예는 단일 화학 약품을 검출하는 대신에 복수의 화학 약품을 검출하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 BBICs를 패키징하는 복수의 방법은 고려될 수 있다. 일반적으로, 선택된 패키징 타입은 BBIC가 제공되는 예측된 환경을 반영할 수 있다. 그러한 환경은 포함되지만, 액체, 기체 또는 고체 환경에 한정되지 않는다. 예컨데, 발명가는 부식을 검출하는 콘크리트 보강용 강철봉 근처의 콘크리트에 BBIC를 고려한다. 다른 실시예에 있어서, 발명가는 생의약 적용시(질병을 검출, 환자의 상태를 검사) 측정할 수 있는 방법으로 BBIC를 패키징하는 것이 고려된다. 일반적으로, BBIC는 검사될 특정 액체(예, 혈액)을 통과시키는 반투과막에서 패키지될 수 있는 반면, 상기 BBIC에 해를 입히고 간섭하는 물질(예, 포유동물 숙주 방어 메커니즘)은 블록으로 될 수 있다.
임의의 실시예에 있어서, 본 발명의 광 방출제는 다세포 유기체(예, 곤충)를 포함할 수 있다. 곤충과 같은 커다란 유기체가 타겟 물질의 출현시 생체 발광을 위하여 유전공학적으로 꾸며지는 것은 널리 공지되어 있다. 그러한 경우에, 상기 BBIC의 IC부는 칩이 생체 발광을 검출할 수 있게 하는 방법으로 곤충에 부착될 수 있다. 본원에 개시된 장치를 적용한 일예는 도 33에 도시된다. 또한, 발명가는 광 방출 인자가 다세포 유기체일 때, BBIC가 자체의 프로펠링(self propelling) 및/또는 자체가 파워될 수 있다고 생각한다.
발명가는 BBIC가 위치를 감지할 수 있을 뿐만 아니라 어떤 화합물 또는 생물학적 인자의 존부를 감지할 수 있는 클로벌 위치 감지기능을 갖는 BBIC를 생각한다.
발명가는 인위적인 지능 감지망을 형성하기 위하여 유무선 배전망에 접속된 BBICs의 배열을 고려한다. BBICs의 배열은 각 BBIC 상에 온 칩 처리 능력을 포함할 수 있다.
BBICs는 도 34에 도시된 바와 같이 광범위하게 무선으로 함께 접속되어 분배된다. 각 BBIC가 온칩 신호 처리 능력(예컨데,신경망 처리)을 가지면, 이러한 배전망은 인위적으로 지능 센터 시스템을 형성할 수 있다. 예컨데, 유독한 가스 누출이 발생하는 광범위한 영역에 걸쳐 BBICs의 대형망을 배치하는 것을 고려한다.
5.0 실시예
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태들을 입증하기 위한 것이다. 당업자라면 하기 실시예에 개시된 기법이 본 발명자들이 개발한 기법으로서 본 발명의 실시에 있어서 만족할 만한 기능을 나타냄을 알 수 있어야 하며, 따라서 실시의 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각할 수 있다. 그러나, 본 발명의 개시 내용의 견지에서, 당업자는 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 바와 같은 양태로 여러 변화예가 가능하며 이들 변화예로부터 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인지해야 한다.
5.1 실시예 1- 염색체 도입된 LUX 리포터에 대한 변형된 미니 TN-5 시스템
본 실시예는 삽입체를 미니-Tn5 트랜스포존 벡터내로 지향적 클론닝할 수 있는 클로닝 플라스미드에 관한 것이다. 이러한 벡터는 본 발명의 방법에 유용한 생체 리포터 작제물을 제조하는데 유용하다. 예시적 양태로서, tod-lux 융합체를 작제하고 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) F1으로 도입하여 BTEX 화합물 및 JP-4 제트 연료 성분의 수용액에 노출시 tod 오페론의 유도를 검사하였다. 이 시스템은 완전한 lux 카세트(luxCDABE)를 포함하기 때문에, 알데히드 기질을 첨가할 필요없이 전체 세포에서 박테리아 생체발광을 측정할 수 있다. 생성 균주를 야생형 균주 F1과 비교하여 생존성 및 적합성에 대해 평가하였다.
5.1.1 재료 및 방법
5.1.1.1 유기체 및 배양 조건
이들 연구에 사용된 균주는 표 4에 제시되어 있다. 모든 배양물은 28℃에서 증식시켰으나, 단 이.콜리 균주는 37℃에서 증식시켰다.
5.1.1.2 DNA 분리 및 조작
변형 알카리 세포용해 프로토콜(프로메가, 1992)을 이용하여 거대 규모의 플라스미드 DNA 분리를 수행하였다. 염색체 DNA는 Ausubel 등의 문헌(1989)에 개시된 프로토콜을 이용하여 제조하였다. 모든 DNA 제조물은 CsCl EtBr 초원심분리로 추가 정제하였다(Sambrook 등, 1989). DNA 변형 및 제한 엔도뉴클레아제 분해는 Sambrook 등의 문헌(1989)에 약술된 바와 같이 수행하였다.
5.1.1.3 클로닝 및 트랜스포존 작제
트랜스포존 미니-Tn5KmNX는 부위 지향적 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 작제하였다. pCRIITM(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)내 카나마이신 내성 유전자(KmR)에 대한 5' 및 3'의 2개의 58개 염기 올리고뉴클레오티드를 제조업자의 프로토콜에 따라 벡크만 올리고 1000 DNA 합성기(미국 캘리포니아주 팔로알토에 소재)를 사용하여 합성하였다. 염기 치환하여 I 및 O 삽입 서열 뿐 아니라 클로닝용 트랜스포존 내부의 고유 NotI 및 XbaI 부위를 형성하였다. EcoRI 부위 및 NheI 부위를 각 올리고뉴클레오티드 말단에 각각 첨가하여 전달 벡터 pUT내로 미니-Tn5KmNX를 클로닝하였다(Herrero 등, 1990). 서열 및 염기 변화는 도 10에서 확인할 수 있다. 프라이머는 다음과 같은 써모사이클러 조건으로 제조업자의 프로토콜에 따라 터치다운 PCRTM(Don 등, 1991)을 사용하여 pCRIITM로부터 카나마이신 내성 유전자를 증폭시키는데 사용하였다: 94℃ 초기 변성, 5분; 94℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장시키는 사이클 5회; 8 사이클을 42℃에서 수행할 때까지 매 5 사이클마다 어닐링 온도를 5℃로 낮추고, 최종적으로 72℃에서 15분 동안 연장시킨다. 1.3 kb 생성물은 제조업자의 프로토콜에 따라서 TA 클로닝 키트(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 인비트로겐)를 사용하여 pCRIITM내로 클로닝시켰다. 미니-Tn5KmNX를 함유하는 생성 플라스미드 pUTK210을 서열 결정하여 I 및 O 삽입 서열의 도입을 입증하였다. 확인 후에, pUTK210을 NheI 및 EcoRI로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다(Sambrook 등, 1989). 정제된 미니-Tn5KmNX 단편을 미니-Tn5 전달 벡터인 pUT의 XbaI-EcoRI 부위내로 클로닝하고 이.콜리 S17-1(λpir)내로 일렉트로포레이션하였다. 적절한 삽입체를 보유한 일렉트로포레이션의 결과물을 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 있는 LB 평판에서 선별하였다. DNA 미니프렙(Holmes 등, 1981)을 얻고, 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 삽입체를 확인하였다.
BssH II로 절단하고 재결찰시켜 다중 클로닝 부위(MCS)를 제거하여 pBluescript II(KS)(미국 캘리포니아 라졸라에 소재하는 스트라타젠)로부터 클로닝 벡터 pLJS를 작제하였다. 결찰된 DNA를 DH5α로 형질전환시키고 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 X-gal(40 ㎍/㎖)이 보충된 LB 평판에 도말하였다. MCS가 없는 형질전환체는 α-상보성이 없기 때문에 백색이었다. 생성 플라스미드를 pBSMCS(-)로 명명하였다. 염기 치환된 2개의 올리고뉴클레오티드(47량체 및 44량체)를 전술한 바와 같이 합성하여 다중 클로닝 부위를 재생시키고 다음 제한 부위 XbaI, NheI, SpeI 및 AvrII를 첨가하였다. 첨가 부위의 서열 및 방향은 도 10에서 확인할 수 있다. 신규 다중 클로닝 부위는 제조업자의 프로토콜에 따라 다음과 같은 써모사이클러 조건을 사용하여 pBluescript II(KS)로부터 증폭시켰다: 94℃ 초기 변성, 5분; 94℃에서 30초 동안 변성, 42℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 30초 동안 연장의 38 사이클; 72℃에서 15분 동안 최종 연장. 증폭된 단편은 BssHII로 절단하고, pBSMCS(-)내로 결찰시키고 DH5αTM내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 암피실린(50 ㎍/ℓ) 및 X-gal(50 ㎍/㎖)을 함유하는 LB 한천 배지에서 선별하였다. 청색 콜로니는 α-상보성이 복원되었음을 나타내기 때문에 청색 콜로니를 선별하였다. 작제물을 서열 결정하여 염기 치환 및 MCS 통합을 확인하였다. pKK233-3(미국 뉴저지주 피카타웨이에 소재하는 파마시아)에서 유래한 5S 리보좀 rrnB T1T2전사 종결인자를 함유하는 0.77 kb HindIII-HincII 단편을 HindIII 및 SmaI로 절단된 pLJS내로 지향적 클로닝시켜 pLJST2를 제조하였다. pLJST2로부터 유래한 NotI-AvrII 종결인자 단편을 미니-Tn5KmNX의 NotI-XbaI 부위내로 연속 클로닝하였다. 종결 인자의 미니-Tn5KmNX 하방에 있는 NotI 및 XbaI 고유 부위를 이종 결찰 및 재생시켜 XbaI 부위를 연속적으로 파괴시켰다(pUTK211). pUC18 Not tod-lux(표 4)에서 유래한 10.2 kb NotI-XbaI tod-lux 단편을 pUTK211의 NotI-XbaI 부위내로 지향적 클로닝시켜 미니-Tn5Kmtod-lux(pUTK214)를 제조하였다. 삽입체 및 벡터 DNA는 클로닝 전에 아가로스 겔 전기 영동 및 전기 용출법으로 정제하였다. 기타 모든 플라스미드 및 관련 작제물은 표 4에 제시되어 있다.
플라스미드 관련 유전자형/특성 참고 사항
pDTG514 tod 프로모터 Ptod를 함유하는 pDTG350에서 유래한 2.75 kb EcoRI-SmaI 단편, ApR을 보유한 pGem3Z Menn, 1991
pUCD615 프로모터가 없는 luxCDABE 카세트, ori pSa, ori pBR322, ApR, KmR Rogowsky, 1987
pKK223-3 5S 리보좀 종결인자 rrnB T1T2를 함유하는 발현 벡터 파마시아
pBSKS 다중 클로닝 부위(MCS) KpnI-SacI, ApR를 갖는 pBluescript IIKS+ 스트라타젠
pBSMCS(-) MCS(BssH II-BssH II 단편이 제거됨), APR이 없는 pBluescript
pLJS 첨가된 XbaI, NheI, AvrII 및 SpeI 부위, ApR이 있는 pBSMCS(-)
pLJS-tod pDTG514로부터 유래한 1.8 kb SmaI-XhoI tod 프로모터 단편, ApR를 함유하는 pLJS
pLJS-lux pUCD615에서 유래한 8.35 kb KpnI-PstI luxCDABE 카세트, ApR를 함유하는 pLJS
pLJST2 HindIII-SmaI 부위로 클로닝된 pKK223-3에서 유래한 0.77 kb HindIII-Hinc II 단편, ApR을 함유하는 pLJS
pUC18 Not NotI 부위에 인접한 다중 클로닝 부위, ApR를 함유하는 클로닝 벡터 Herrero, 1990
pUC18 Not-lux pLJS-rux에서 유래한 8.35 kb XbaI-PstI 단편, ApR함유
pUC18 Not-todlux pLJS-tod에서 유래한 1.8 kb SpeI-XhoI 단편, ApR함유
pUT mob RP4, ori R6K 및 Tn5 tnp 결핍 NotI 부위, ApR을 함유하는 5.2 kb 클로닝 벡터 Herrero, 1990
pCRTMII 3'돌출부, ApR, KmR을 보유한 PCRTM제품용 3.9 kb 클로닝 벡터 인비트로겐
pUTK209 고유 NotI 및 XhoI 부위를 갖는 미니-Tn5KmNX, ApR, KmR을 함유하는 pCRTMII
pUTK210 미니-Tn5KmNX, ApR, KmR을 함유하는 pUT
pUTK211 0.8 kb NotI-AvrII rrnB T1T2단편, ApR, KmR을 함유하는 pUT/미니-Tn5KmT2
pUTK214 pUC18 Not-todlux에서 유래한 10.2 kb NotI-XbaI 단편, ApR, KmR을 함유하는 pUT/미니-Tn5Kmtod-lux
5.1.1.4 일렉트로포레이션
일렉트로컴피턴트 세포는 제조자(BTX, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)가 개략한 방법에 따라 제조하였다. 일렉트로포레이션은 BTX Electroporator 600을 사용하여 다음과 같은 조건하에 수행하였다. 세포 40 ㎕, 결찰 혼합물 1 ㎕, 2 ㎜ 갭 큐벳을 이용한 약 4.7 ms 동안의 2.5 kV 펄스. 펄스를 가한 후, 세포를 즉시 LB(최종 1 ㎖) 배지에 재현탁하고, 선별용의 적당한 항생제를 첨가한 LB 평판 상에 평판 배양하기 전에 37 ℃(200 rpm)에서 1 시간 동안 회수하였다.
5.1.1.5 DNA 서열 분석
부위 지향성 돌연변이유발의 성공 여부를 확인하기 위하여 pCRII™에 대한 순방향 서열분석 프라이머와 역방향 서열분석 프라이머를 사용하여 pCRII™ 중의 미니-Tn5KmNX를 서열분석하였다. 서열분석은 Applied Biosystems Model 373A(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 실시하였다.
5.1.1.6 트랜스포존 돌연변이유발
pUTK214를 포함하는 이.콜리 S 17-1(λpir)을, 평판 교배를 통해 P.프티다 F1에 교배시켰다. 공여체 세포와 수용체 세포를 약 5:1의 비로 혼합하고, LB 평판에 점적하여 25 ℃에서 24 시간 동안 항온배양하였다. 돌연변이체는 카나마이신 50 ㎍/㎖를 보충한 슈도모나스(Pseudomonas) 분리 한천 상에서 선별하였다. 이어서, 콜로니를 격자 평판에 2차 배양하고 톨루엔 증기에 노출시켰다. 빛을 발하는 콜로니를 톨루엔 증기가 공급되는 무기염 배지(MSM)(Stanier et al., 1966)에서 증식시켜 트랜스포존이 그 세포의 필요 유전자에 삽입되었는지의 여부를 확인하였다. 또한, 이 균주를 액체 증식 세포 분석법에서 생체리포터로서의 성능에 대하여 평가하였다(Heitzer et al., 1992).
5.1.1.7 전위 확인
선별 균주를, pUT에 포함된 Tn5 트란스포스아제(tnp) 특이적32P 표지된 프로브를 사용한 재조합과 반대되는 전위를 입증하기 위하여, DNA:DNA 하이브리드화시켰다. 동등 표적량의 luxA, todC 및 tnp DNA를 제조자의 프로토콜에 따라바이오슬롯 블롯 장치(Biorad, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)를 사용하여 Biotrans™나일론 막(ICN, 미국 캘리포니아주 어빈 소재) 상에 장입하였다. 이 블롯은 F1, TVA8 및 전술한 대조군 유래의 염색체 DNA를 포함한다. 이 DNA를 3반복으로 장입하고 블롯을 분할한 뒤, 각 블롯을 luxA, todC 또는 tnp PCR™발생의32P 표지된 DNA 프로브와 하이브리드하였다. 블롯을 전술한 바와 같이 하이브리드하고 세척하였다(Applegate et al., 1997).
5.1.1.8 안정성 분석
증식 곡선에 대해 기재된 바와 같이 유일한 탄소원으로 톨루엔을 사용하는 250 ㎖ 어얼렌메이어 플라스크에, 카나마이신(Km50) 50 ㎍/㎖ 첨가된 LB 상에서 증식시킨 100 ㎖ 하룻밤 배양물 1 ㎖를 첨가하여 배취 안정성 분석을 실시하였다. 배양물 1 ㎖씩을 매일 5 일동안 톨루엔 증기가 공급되는 100 ㎖ MSM 함유 플라스크(Km 무첨가)에 첨가하였다. 분석은 3반복으로 실시하였다. 각각 첨가한 후, 세포를 선별 배지(LBKm50)와 비선별 배지(LB) 상에 평판배양하여, 트랜스포존의 결실이나 절단으로 나타나는 카나마이신 내성의 상실을 확인하였다. 콜로니를 295 bp luxA DNA 프로브를 사용하여 콜로니 하이브리드시켰다(Johnston, 1996).
또한, 28 ℃, 180 rpm 하에 작동되는 370 ㎖ 용기를 구비한 New Brunswick Bio Flow 발효기(미국 뉴저지주 에디슨 소재)를 사용하는 연속 배양으로 안정성을 분석하였다. 원료 공급은 1.0 ㎖/분의 유속으로 공급되는 약 100 ㎎/L의 톨루엔이 보충된 MSM으로 이루어졌다. 이것은 FMI 계량 펌프(미국 뉴욕주 오이스터 베이 소재)를 사용하여 톨루엔 포화 MSM을 분당 0.2 ㎖의 유속으로 첨가하고 MSM을 분당 0.8 ㎖의 유속으로 동시에 첨가하여 실시하였다. 항성분배양조를 저온 핑거와 냉각 순환 수조(Brinkman, 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)를 사용하여 28 ℃로 유지시켰다. 항성분배양조는 약 100회의 세대 분열이 일어나는 14 일동안 작동시켰다. 생체발광도와 광학 밀도에 대한 조사는 매일 실시하였다. 또한, 항성분배양조로부터 7일마다 세포를 취하여 평판배양하고 전술한 바와 같이 콜로니 하이브리드화를 실시하였다.
5.1.1.9 증식 곡선
250 ㎖ 어얼렌메이어 플라스크 중에 유일한 탄소원으로 톨루엔 증기가 공급되는 100 ㎖ MSM 중에서 세포를 증식시켜 TVA8 및 F1의 증식 곡선을 얻었다. 배양물은 처음, LB 100 ㎖ 중에서 ODS5461.0 까지 증식시키고 100 ㎖ MSM으로 2회 세척한 뒤 배지 100 ㎖에 재현탁시킨 새로운 하룻밤 배양물을 사용하였다. 이 현탁액 1 ㎖ 일정량을 톨루엔 플라스크에 첨가하였다. 이 배양물을 28 ℃에서 200 rpm으로 진탕하고 대략 매시간 마다 샘플링하였다. 각 배양물에 대한 OD546을 측정하고 광학 밀도의 증가 속도는 곡선의 직선부로부터 측정하였다.
5.1.1.10 생체발광도 검출
생체발광성 분석은 문헌[Heitzer et al.(1992)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. TVA8의 동결 저장물을 사용하여 얻은 하룻밤 배양물은 카나마이신 50 ㎍/㎖ 첨가된 LB 100 ㎖를 포함하는 250 ㎖ 어얼렌메이어 플라스크에서 제조하였다. 2차 배양물은 효모 추출물-펩톤-글루코스 배지(YEPG)에서 제조하여, OD5460.35 내지 0.45 까지 증식시키고 30분마다 분석하였다. 예비시험에서, 2시간의 항온 시간이 시그널 강도가 최대인 일정한 광반응을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 2 시간 후, 최종 OD546을 측정하고 그 값을 비생체발광도(namp/OD546)로 나타내었다.
5.1.1.11 시험 샘플 제조
제트 연료 대 물의 비가 1:10이 되게 멸균 탈이온수에 JP-4를 첨가하여 JP-4 제트 연료 성분의 수용액을 제조하였다. 이 용액을 24 시간 동안 회전식 진탕기에서 진탕하였다. 그 다음, 상을 분리하고, 수성상 일정량을 시험 바이엘에 첨가하였다. 톨루엔, 벤젠, 에틸벤젠, 페놀 및 크실렌 이성질체의 시험 용액도 전술한 바와 같이 제조하였다.
5.1.1.12 생체발광도 측정
샘플 바이엘을 광차단 박스에 놓고, 25 ㎖ 신틸레이션 바이엘을 사용하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이(Heitzer et al., 1992) 오리엘(Oriel) 광증폭기 및 디지털 디스플레이(Model 77340 및 모델 7070, 미국 코네티컷주 스트랫포드 소재)와 액체 광 파이프를 사용하여 측정하였다. 생육 곡선 및 항성분배양조에 대한 광측정은 OD 판독 후 광을 측정할 수 있게 큐벳을 수용하도록 광차단 박스를 변형시킨 것을 제외하는 전술한 바와 같이 측정하였다.
5.1.2 결과
5.1.2.1 균주 작제
생성된 미니-Tn5KmNX를 서열 분석한 결과, I 삽입 서열과 O 삽입 서열 모두는 트랜스포존을 생성하기 위해 사용되었던 프라이머와 동일하였다(도 10 참조). 잘못 첨가된 여분의 아데닌은 상기 작제물에 영향을 끼치지 않았다. 플라스미드 pLJS(도 12)를 서열 결정하여 첨가된 부위가 혼입되었는 지를 확인하고, 또한 다중 클로닝 부위(MCS)의 통합을 결정하였다. 서열 데이터는 MCS와 모든 첨가된 부위가 그대로 유지되었음을 보여주었다. 생성된 클로닝 벡터는 α-상보성 능력을 또한 유지하였다. 미니-Tn5KmNX 작제물에 대한 개략도와 최종 작제물 미니-Tn5Kmtod-lux는 도 11에 나타나 있다.
미니-5Kmtod-lux를 지닌 E. coli의 S17-1(λpir)균주를 F1과 교배한 후 톨루엔 접촉시 생체발광을 산출하는 생성된 변이주의 능력을 검색하였다. 14개의 균주를 대상으로 톨루엔 MSM 상에서 증식하는 이들의 역량을 평가한 후 숫자 8을 선택하여 TVA8로 지칭하였다. 균주를 검사한 결과 이것이 역위로 인한 현상이며 재조합으로 인한 현상이 아님을 확인하였다. DNA:DNA 하이브리드화 결과 TVA8은 lux 유전자를 함유하지만 tnp와 하이브리드화하지는 않음을 확인하였다. tnp와 하이브리드화된 블롯을 todC를 사용하여 탐색하여 DNA가 존재함을 확인하였다. 음성 트랜스포자제로부터 역위가 일어났음을 확인하였다.
5.1.2.2 TVA8의 안정성
회분식 배양법 및 연속 배양법으로 안정성을 연구한 결과, F1내 트랜스포존 삽입체는 안정한 것으로 보인다. 선별 배지(LBKm50)와 비선별 배지(LB)의 평판을 계수 비교하여 카나마이신 마커가 소실되었는 지 여부를 측정하고, 콜로니 블롯을 luxA 프로브와 하이브리드화시켜 모든 콜로니가 lux 트랜스포존 삽입체(오염물 없음)를 함유하는 지를 확인하였다. 항생제 선택이 없는 숙시네이트 항성분배양조의 경우, 10일 후에 선별 평판 수는 비선별 평판 수에 비하여 약 5% 낮았지만, 상기 두가지 유형의 평판으로 부터 얻은 콜로니 100%가 lux-양성이었다. 유일한 탄소 공급원으로서 톨루엔 증기를 사용하는 회분식 배양법에서의 안정성 연구결과, TVA8은 동일한 평가를 하였을 때 불안정성을 나타내지 않았다. 선별 평판 수 : 비선별 평판 수의 비율은 매일 5회의 전달 후에 1.12±0.13 이었고, 모든 콜로니는 luxA 프로브와 하이브리드화하였다. 약 100mg/L로 공급된 톨루엔을 사용한 연속 배양 조건하에서의 TVA8의 안정성 실험에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 14일 후(약 100 세대시간), 선별 평판 수: 비선별 평판 수의 비는 1.05±0.13 이었고, 선별 평판과 비선별 평판에서 얻은 모든 콜로니는 lux-양성이었다.
5.1.2.2 톨루엔, BTEX 화합물 및 JP-4 제트 연료에 대한 TOD-LUX 리포터 균주의 정량 반응
톨루엔 농도를 증가시키면 생체발광 반응의 증가가 관찰되었다(도 13 참조). 5 mg/L 내지 20 mg/L의 범위에서 톨루엔 농도에 대한 생체발광 반응은 133 namp/OD546내지 228 namp/OD546의 특이적 생체발광 값과 1차 관계가 있었다. 20 mg/L보다 높은 농도에서 광 반응의 배수 증가는 다소 작은 것으로 나타났는 데, 예컨대 50 mg/L의 경우 290 namp/OD546의 값을 나타냈다. 전체 생체발광 반응 곡선은 Michaelis-Menten(효소 역학) 형태를 나타내는데, 이는 높은 인듀서 농도에서 포화가 일어났음을 의미하는 것이다. 톨루엔 검출한계는 50 ㎍/ℓ 미만으로 측정되었다.
BTEX 화합물 뿐 아니라 페놀 및 수용성 JP-4 제트 연료 성분에 대한 생체발광 반응에 대해 TVA8를 조사하였다. 벤젠, m-크실렌 및 p-크실렌, 페놀 및 JP-4(표 5)뿐 아니라 톨루엔에 대한 유의적인 광반응이 있었다. 톨루엔과 벤젠(50 mg/ℓ)은 동일한 농도에서 서로 유사한 광 반응을 산출하였다. o-크실렌에 노출시 생체발광이 증가되지 않았다. JP-4로 인한 광 반응은 추정된 농도로 존재하는 JP-4 성분(즉, BTEX 성분)에 대한 추가 반응보다 상당히 크게 나타났다(Smith 등, 1981). 증가된 반응은 테스트 되지 않은 JP-4의 기타 성분으로 인한 유도 결과일 수 있다. 4시간 후 유의적인 광 반응이 에틸 벤젠에 대해 관찰하였다. 2 시간 동안 항온배양한 후, 에틸벤젠으로 처리한 경우의 세포 밀도는 다른 시료보다 상당히 작았는 데, 이는 여기에 독성 효과가 있었음을 의미하는 것일 수도 있다. 다른 연구 결과, 세포를 에틸벤젠상에서 미리 증식시킨 후 증식중인 세포를 분석하면 50 mg/L의 에틸벤젠은 유도기 없이 생체발광 반응을 유발함을 확인하였다.
TVA8의 생체발광 반응에 대한 BTEX, 페놀 및 JP-4 성분의 효과
처리a 노출 시간(시) 특정 생체발광(namp/OD)b
완충액(대조군) 2 0.2±0.1
톨루엔 2 291±6
벤젠 2 242±9
처리a노출 시간 고유 생체발광 (시간) (namp/OD)b
버퍼(제어) 2 0.2 ±0.1 톨루엔 2 291 ±6 벤젠 2 242 ±9 에틸벤젠 2 1.0 ±0.2 4 47 ±6co-크실렌 2 0.5 ±0.1 m-크실렌 2 38 ±3 p-크실렌 2 24 ±2 페놀 2 70 ±2 JP-4 2 93 ±4
aBTEX 및 페놀 처리를 위한 최종 농도는 대략 50 mg/L이고, 탄화수소 포화 MSM 용액이 부가되어 있다. 수용성 JP-4 성분의 최종 퍼센트는 대략 2%이다.
b값은 3개의 복제 샘플의 평균치 ±표준 편차로서, 이 값은 최종 세포 밀도(OD546)로 규격화된다.
c4시간 판독을 위한 값은 유사하지만 독립된 연구에 의해 측정되는 값이다.
5.1.2.2 F1을 갖는 생체발광 리포터의 톨루엔 성장 비교
도 14에는 톨루엔 증기에 따라 TVA8 및 모균주(parent strain)(F1)에 대한 성장 곡선이 도시되어 있다. 이 곡선은 다소 상이한 접종물(inoculum) 농도에 기여될 수 있는 TVA8 및 F1에 대해 서로 상이한 지연 시간을 갖는 유사한 형상을 나타내고 있다. 비율은 양쪽의 균주에 대한 성장 곡선의 선형 부분의 기울기로부터 계산된다. F1 및 TVA8에 대한 각각의 광학 밀도, 즉 2.14 ±2.2 및 2.2 ±0.3 min-1×10-3의 평균 증가 비율은 통계적으로 서로 상이하지 않다(α= 0.05). 이 결과는 생체발광 반응이 세포의 성장에 영향을 주고 있지 않음을 증명하고 있다.
TVA8의 생체발광은 톨루엔 성장 중에 측정되며, 도 1에의 세포 밀도 데이타에 따라 도시되어 있다. 이 생체발광도는 보다 이른 시간 지점으로 이동되더라도 TVA8 성장 곡선과 유사하게 도시되어 있다. 이 그래프는 생물량(biomass)의 증가와 광 생성의 증가 사이에서 명확한 상관성이 있음을 보여주고 있다. 보다 높은 세포 밀도에서, 산소용으로 제한될 가능성이 있는 세포들은 감소된 생체발광 값으로 나타난다.
5.1.3 염색체적으로 삽입된 TOD-LUX 시스템의 이점
최근의 주요 생체발광 리포터는 프로모터가 없는(promoterless) LuxCDABE 유전자 카세트의 정면에 프로모터(promoter)를 pUCD615 내에 클로닝하고 플라스미드 (plasmid) 구조를 특정 프로모터를 포함하는 균주(strain)의 내부로 전달하는 결과로서 이용되고 있다. 플라스미드계 시스템은 1995년 Rice 씨 등에 의해 관찰된 바와 같이 플라스미드 유지를 위해 일정한 선택적인 압력에 대한 필요성 등의 명백한 결점을 가지고 있다. 또 다른 중요한 대상으로는 플라스미드 복제 수에 있다. 이 시스템이 적극적으로 규정되면, 복제 수는 유전자 표시를 소극적으로 실행할 수 있다. 오페론(operon)을 표시하지 않는 염색체(chromosome)상의 결합 부위와 필적하는 플라스미드상의 단백질(protein)을 조절하는 프로모터 결합제 영역의 다중 복제가 1994년 라우(Lau)씨 등에 의해 연구되고 있다. 박테리아 공정의 온라인 모니터링을 위해 lux 접합(lux fusion)을 사용하는 경우에 이 소극적인 효과는 중요하다.
생체발광 리포터의 구성에 사용되는 또 다른 방법은 lux 트랜스포손(lux transposon) Tn4431(Shaw et al., 1994)의 사용이다. 소망의 리포터 균주는 트랜스포손-돌연변이를 일으키게 하고(transposon-mutagenized), 이 구성은 nah-lux 리포터 HK44(King et al., 1990)의 경우에서와 같이 고유 유발물질(specific inducer)의 부가에 따라 생체발광을 위해 선택된다. 그러나, 트랜스포손 삽입에 의한 lux 접합을 생성하는 문제는 삽입이 발생되는 경로가 통상적으로 분열되는 것이다. 예컨대, HK44에서 lux 삽입 분열된 nahG(살리실산염 히드로게나아제) 및 그에 따른 균주는 nah 및 sal 경로(King et al., 1990; Menu et al., 1993)를 통해 나프탈렌의 완전한 분해를 더이상 중재할 수 없게 된다. 나프탈렌 분해를 모니터링하는데 사용하는 균주를 생성하기 위해서, 리포터 플라스미드는 나프탈렌의 메타볼리즘(metabolism)을 완성할 수 있는 또 다른 균주와 결합되어 있다. 이러한 관심사로 인하여, 연구원들은 트랜스포손 전송 시스템을 사용하기 위해 이동되고 있다.
Herrero et al.(1990)에 의해서 고유의 NotI 및 SfiI 제한 부위와 다중 클로링 부위에 접하는 이들 2개의 제한 부위 중 어느 하나를 포함하는 pUC 유도체 (derivative)를 갖는 mini-Tn5 트랜스포손으로 이루어진 mini-Tn5 전송 시스템을 구성하였다. 이 트랜스포손은 최종 구성에서 안정성을 제공하기 위해 트랜스내에 제공된다. 이 방법은 특정 pUC 유도체 내에 적절한 삽입물을 서브클로닝하는 단계, 이것을 mini-Tn5 벡터dml 내부로 클로닝하는 단계 및 관심을 갖는 균주의 염색체 내부로 전이하는 단계를 포함한다. 이 시스템은 NotI 및 SfiI 부위로 한정되며, 이들 2개의 효소(enzyme) 중 하나가 삽입 DNA 내에서 차단되면 또 다른 방법이 수행되어야만 하는 결점이 있다. 더욱이, 12kbp 이상의 큰 DNA 단편을 비지향적으로 클로닝하는데 어려움이 있다.
본원 명세서에 개시된 시스템은 종래의 시스템의 변형예이다. 본 발명에서 구성된 mini-Tn5 시스템은 2개가 서로 대향하도록 5개의 효소, 즉 AvrII, NheI, SpeI, XbaI 및 NotI의 이용을 기초로 하고 있다. Mini-Tn5KmNX 는 벡터 DNA의 삽입된 부정적인 탈인(dephosphorylation)의 방향성 클로닝을 허가하는 유일한 NotI 및 XbaI 부위를 포함하고 있다. mini-Tn5 유도체의 최종 버젼인 pUTK211은 트랜스포손이 삽입된 유전체로부터 통독 전사(read-through transcription)가 존재하지 않도록 유일한 클로닝 부위에 대해 강한 전사 종료기(transcription terminator)(5')를 포함한다. mini-Tn5KmNX와 결합하여 사용된 클로닝 벡터 pLJS는 한쪽에 AvrII, NheI, SpeI, XbaI 및 NotI와, 다른쪽에 AvrII, NheI, SpeI 및 XbaI에 의해 플랭크된 다중 클로닝 부위의 큰 영역의 이용이 가능하다. 클로닝될 단편에 NotI 부위가 존재하면, XbaI 부위는 비지향성 클로닝용으로 이용될 수 있다. 이들 효소에 대한 제한적인 인식 서열은 거의 없다(8-베이스 서열을 인식하는 NotI을 제외하고는 6-베이스 서열임). XbaI 부위의 장점은 이들 모든 효소가 동일한 5' 돌출부인 CTAG를 갖기 때문에 AvrII, NheI 및 SpeI의 이종 구조 (heterologous)의 클로닝을 가능하게 하는 점이다. 또한, 이 시스템은 AvrII를 이용하는 이종 구조의 클로닝에 의해 XbaI 부위를 파괴하는 전사 종료기의 클로닝에 의해 나타낸 바와 같이 보다 큰 관심을 갖는 어셈블리를 가능하게 한다. 이 합성 클로닝 단계는 유일한 XbaI 부위를 다시 생성한다. 유일한 XbaI 부위의 파괴 및 재생성의 이와 같은 이종 구조의 클로닝 방법을 사용하면, 원하는 구성에 대해 서로 상이한 DNA 단편을 조립할 수 있다. 이 시스템, 즉 P putida TVA8을 사용하면, 염색체적으로 엔코드된 tod-lux 생체발광 리포터가 구성된다.
TVA8은 트랜스포손 삽입이 성장을 위해 필요한 유전체를 분열시키지 않는 것을 증명하는 톨루엔 또는 숙신산염(succinate)을 갖는 미네럴 염 배지에서 성장될 수 있다. 이것은 추가의 평가 이전에 균주의 모든 적합성을 확인하기 위해 실행되어야만 하는 중요한 점검이다. 더욱이, TVA8은 연속 배양내의 100개의 생식 또는 배취 배양(batch culture)내의 5개의 연속하는 전달 이후에 트랜스포손 삽입의 손실 또는 생체발광의 손실을 보여주고 있지 않는다. 이들 결과는 선택 압력이 균주의 보전을 위해 필요하지 않음을 암시한다. 이 안정도는 원위치에 이 생체리포터의 사용을 배제하는 것이 필요한 경우에 항생제(antibiotic) 선택의 필요성을 제거하기 때문에 중요하다. 균주는 생체발광 리포터가 세포상의 중요한 메타볼릭 드레인인지의 여부와, 전위 부위가 세포에 장해가 있는지를 확인하기 위해서 야생형 균주(wild type strain)(F1)와 비교된다. 2개의 균주 사이의 성장 차이가 없음을 나타내는 톨루엔 증기상의 TVA8 및 F1의 성장은 어느 삽입이나 리포터도 세포에 대해 중요한 핸디캡이 아님을 암시하고 있다.
tod-lux 리포터는 50 ㎍ 톨루엔/L 이하의 검출 한계에 아주 민감하다. 이 농도의 생체발광 값은 생체발광의 배경 레벨보다 큰 80 배이다. 이 생체리포터는 생체발광의 매우 낮은 배경 레벨(1 namp/OD546이하)을 보여주고 있다. TVA8은 낮은 농도의 수용액에서 제공되는 톨루엔의 양을 정하는데 유용하도록 나타내고 있다. 도 15에는 중요한 광 레벨이 매우 낮은 광학 밀도로 관찰되고 있다.
TVA8은 벤젠, 에틸벤젠 및 m-크실란 및 p-크실란에 반응하기 때문에 단지 톨루엔 생체리포터에서 보다 일반화된 BTEX 생체리포터로서 설명되고 있다. 이들 모든 화합물이 생체발광 반응을 유도하기 때문에, TVA8은 BTEX 화합물을 포함하는 임의의 연료의 JP-4 분사 연료 오염 또는 존재에 대해 생체리포터로서 사용되고 있다. 균주는 lux 및 tod 오페론이 동일한 조정하에 있고 톨루엔 디옥시게나아제가 TCE를 분해 대사하고 있기 때문에 TCE 코메타볼리즘(cometabolism)의 온라인 모니터링을 위해 사용된다. 생체발광 리포터는 유전자 표시의 온라인 및 비분열성 분석과 화학적 오염의 검출을 제공할 수 있는 용도의 분야에 있어서 큰 잠재성을 가지고 있다. 주위의 분리로 리포터 유전자의 안정된 트랜스포손 삽입의 발전에 의해 원위치에서 유전자 표시를 감지하는 생체리포터 균주의 실용성을 확장시킨다.
5.2 실시예 2 - P. PUTIDA B2: 톨루엔 및 트리클로로에틸렌 코-메타볼리즘용 Tod-Lux 생체발광 리포터
트리클로로에틸렌(TCE)의 환경 파멸 및 생체교정 가능성은 독성 및 발암성 관심사(Geiger and Molner-Kubica, 1977; Petura, 1981; Shahin and Von Borstel, 1977; Van Duren and Banerfee, 1976; Westrick et al., 1984)의 지하수 우선 오염물질로서 그 광범위한 생성, 사용(Storck, 1987) 및 출현으로 인해 수용되는 상당한 주의를 갖는다. TCE의 세균성 메타볼리즘은 광범위하게 검토되고 있다(Ensley, 1991). TCE 분해는 TCE가 탄소원으로서 사용되지는 않지만 예기치 않게 분해되는 코-메타볼릭이다. 소기성 분해(Maltoni and Lefemine, 1974)중에 발암성 염화비닐의 가능한 생성으로 인하여, TCE 생체분해에 따른 최근의 다수의 초점은 호기성 옥시게나아제 매개 TCE 코-메타볼리즘(Nelson et al., 1988; Oldenhuis et al., 1989)에 의해서이다. 실질적인 정보는 메탄 모노옥시게나아제 및 다양한 톨루엔 모노옥시게나아제의 특정 강조를 갖는 TCE(Oldenhuis et al., 1989; Wackett et al., 1989)의 모노옥시게나아제 매개 코-메타볼리즘에 따라서 발전된다.
톨루엔 분해는 TCE를 산화시키는 능력을 갖는 모노옥시게나아제 및 디옥시게나아제의 양자를 포함하는 분해 경로를 통해 발생된다(Ensley, 1991; Shields and Reagin, 1992; Wackett and Gibson, 1988). Pseudomonas Putida(F1)에 포함되는 톨루엔 디옥시게나아제(todC1C2BA)는 TCE(Zylstra et al., 1989)를 전달할 수 있다.
호기성 코-메타볼릭 TCE 생체교정(bioremediation)의 이용 및 추가의 발전의 요점은 상기 생체분해 처리를 모니터링, 제어 및 최적화하기 위한 능력이다. 이러한 방법 중 하나는 온라인 리포터 기술에 사용하느 생체발광 lux 유전자 결합의 진화에 있다(Burlage et al., 1990; King et al., 1990). 나프탈렌 분해의 온라인 모니터링의 연구에 있어서 lux 리포터 시스템의 사용은 잘 문서화되어 있다(Heitzer et al., 1995; King et al., 1990). 이들 리포터 시스템은 분해 유기체에 대해 오염물질의 생체 이용도를 평가하기 위해 사용된다(Heitzer et al., 1992; King et al., 1990).
이 실시예는 TCE 등의 오염물질의 코-메타볼릭 산화를 모니터링 및 최적화하는 lux 생체리포터의 구성을 설명하고 있다. 이러한 목적으로, P. putida(F1)에 포함된 tod 시스템은 톨루엔 디옥시게나아제의 표시를 모니터링하기 위해 tod-lux 유전자 결합을 진화시키는데 선택되고 있다.
5.2.1 재료 및 방법
5.2.1.1 균주 구조
이 실시예에 사용되는 균주 및 플라스미드를 표 6에 도시한다. 대장균은 Luria-Bertani(LB) 육즙(broth)내에서 성장되고, LB 아가(agar; 세균 배양기)상에서 37℃ 로 배양된다. Pseudomonas Putida(F1)은 28℃인 1 리터(L)의 증류수 내에 0.2g의 이스트 추출물, 2.0g의 폴리펩톤, 1.0g의 디글루코오스 및 0.2g의 질산 암모늄(pH 7.0)을 함유한 이스트 추출물-펩톤-글루코오스(YEPG)상에서 성장된다.
균주 및 플라스미드
균주 플라스미드 관련 특성(들) 참조
대장균 JM109 pDTG514 2.75 kb를 갖는 pGem3Z tod 프로모터, AmpR를 함유한 pDTG350으로부터의EcoR1-SmaI 단편 Menn, 1991; Mennet al., 1991
대장균 HB101 pUCD615 프로모터가 없는 luxCDABE 카세트, mobR,AmpR, KmR Rogowsky et al.,1987
P.putida F1 없음 톨루엔 분해용의 염색체적으로 엔코드된 tod 오페론을 함유 Wackett andGibson, 1988
P.putida B2 pUTK30 프로모터가 없는 luxCDABE 카세트, AmpR, KmR의 tod 프로모터 단편 삽입 상류부문을 함유한 tod-lux 리포터
대장균 DF1020 pRK2013 헬퍼 플라스미드, AmpR, KmR, Tra+ Figurski andHelsinki, 1979
적절한 플라스미드를 갖는 대장균(E. coli) JM109 및 HB101의 1 리터 배양은 변형된 알칼리 용해 절차(Promega, 1992)를 이용해서 분리된다. 플라스미드 DNA는 부탄올 추출물 및 에탄올 석출(Sambrook et al., 1989)에 의해 수행되는 CsCl 밀도 비차 정제에 노출된다. 플라스미드 DNA는 TE 버퍼(10mM Tris-base, 1mM EDTA, pII 8.0)내에서 다시 일시 정지되고, 사용할 때까지 4℃ 에서 저장된다. 제한 엔도누클라아제 및 T4 DNA 리가아제는 Gibeo BRL(Gaithersburg, MD)로부터 입수되어, 제조업자의 프로토콜에 따라서 사용된다. 클로닝 기술은 Sambrook et al(1989)에 의해 개설된 바와 같이 실행된다. 리포터 플라스미드 pUTK30은 pUCD615(Rogowsky et al., 1987)의 lux 유전자 카세트 정면의 pDTG514(Menn, 199; Menn et al., 1991)로부터 tod 프로모터(Lau at al., 1994; Wang et al., 1995)를 클로닝함으로써 생성되었다. 이것은 2.75 kb EcorR1-XbaI 단편을 pDTG514로부터 pUCD615(도 16)의 EcoR1-XbaI 소화물 내부로 방향적으로 클로닝하는 것에 의해 실현된다. 형질변환은 제조업자의 프로토콜에 따라 서브클로닝 유효 성분 세포(Gibeo BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 실행되고 있다. 이 형질변환은 50 ㎍ ml-1카나마이신을 함유한 LB 판상에서 선택된다. 형질변환의 플라스미드 미니프레프는 1981년 홀름스 및 퀴그레이에 의해 개시된 방법에 의해 실행되며, tod 단편의 삽입을 확인하기 위해 BamHI에 의해 분해된다. 합성 대장균 균주인 JBF-7은 리포터 플라스미드 pUTK30을 제공한다.
삼중모 교배(triparental mating)는 필터 기술의 변형된 버젼을 이용해서 실행된다. 도우너(JBF-7, pUTK30), 헬퍼(DF1020, pRK2013; Figurski 및 IIelsinki, 1979) 및 수혈자(F1)의 순수 배양은 적절한 항생제로 LB 육즙내에 대략 1.0의 546 nm(OD546)인 광학 밀도로 성장된다. 세포(들)는 10분 동안 9800 ×g 의 원심분리에 의해 수확된다. 펠릿은 일시 정지되고, 100 ml 50 mM KH2PO4(pH7.0) 분위기에서 3배 세척되며, 50 ml 50 mM KH2PO4분위기에서 일시 정지된다.
이 3개의 균주는 2:1:1(도우너/헬퍼/수혈자)의 비율로 혼합해서 사용된다. 테프론 막(47 mM, 022 ㎛ 구멍 크기) 및 필터를 통해 여과됨에 따를 세포 현탁액은 LB 판상에 배치된다. 28℃에서의 오버나이트 잠입 이후에, 필터는 제거되고, 1.5 ml 50 mM KH2PO4내에서 세정된다. 직렬 희석이 수행되고, 희석은 pseudomonas 격리 아가(Difeo, Detroit, MI)상에서 배양된다. 48시간 잠입 이후에, 톨루엔 증기가 유입되고, 광이 생성된 군체는 추가의 특성을 위해 선택된다. 톨루엔 증기인 P. putida B2 에 반응해서 광이 방출되는 5개의 카나마이신 방염제 균주들 중의 하나는 나머지 연구에 이용하기 위해 선택되고 있다.
5.2.1.2 생체발광 분석
배치 및 반응 용기의 연구에 있어서는, 생체발광은 광을 전류로 변환하는 광전 증폭관을 이용해서 측정하였다. 정지 세포 평가분석 및 반응 용기 시스템내에서 광전 증폭관은 컴퓨터에 접속되어, 생체발광 냄프 전류가 기록된다.
5.2.1.3 배치 연구
성장 세포의 평가분석은 Heitzer et al(1992)에 의해 개시된 방법에 의해 수행된다. P. putida B2의 고정된 원료로부터의 오버나이트 배양은 100 ml LB 및 50 ㎍ ml-1카나마이신을 함유한 250 ml의 삼각 플라스크 내에서 제조된다. 부배양은 준비되고, 세포는 중간 로그 상(0.45∼0.48의 OD546)에서 이용된다. 2.5 ml의 약수는 0∼50 mg ml-1의 톨루엔 또는 10∼100 μl 의 JP4 분사 연료 포화 MSM을 함유한 2.5 ml 미네럴 염 배지(MSM)에 부가된다. JP4 분사로 포화된 물 내에 톨루엔의 농도는 대략 8 ㎎ L-1이다(Smith et al., 1981). 생체발광은 매 30분마다 측정된다(Heitzer et al, 1992).
정지 세포 평가분석을 위한 세포는 2.7 gL-1dml 숙신산염으로 부가된 MSM상에서 성장된다. P. putida B2의 배양은 대략 0.8의 OD546상에 제공된다. 이 세포는 10분 동안 15000 ×g 로 원심 분리되고, 0.6 의 4 밀리리터의 배양의 OD546으로 MSM 내에서 일시 정지되며, 스터 바(stir bar)가 있는 미니너트 밸브(Dynatech, Chantilly, VA)를 갖는 6개의 26 ml 유리병의 각각에 부가된다. 하나의 유리병이 다중 톨루엔 노광을 위해 사용되고, 나머지는 단일 노광을 위해 사용된다. 이 유리병은 광이 통하지 않는 샘플링 세포내에 자기적으로 혼합된다. 톨루엔 포화 MSM 및 MSM 단독에 의해 0.47의 OD546을 산출하기 위해 부가되고, 10 mg L-1의 톨루엔은 다중 노광 유리병의 130 h 기간 동안 6배 주입된다. 동일한 시점에, 단일 노광 유리병은 10 mg L-1의 톨루엔이 주입된다. 이 광 반응은 데이타 획득 컴퓨터(King et al., 1990)에 접속된 광전 증폭관으로 매 3분 마다 기록된다.
5.2.1.4 고정된 세포 반응 용기 시스템
P. putida B2는 고정된 세포 반응 용기 시스템용의 정열 비드 내에 캡슐화되어 있다. 1 L LB내에 1.2의 OD546으로 성장되는 세포는 10분 동안 5500 ×g 으로 원심 분리되고, 0.9%의 NaCl 분위기에서 3배 세정되며, 40 ml 0.9% NaCl 분위기에서 일시 정지된다. 이 세포 현탁액은 80 ml의 알긴산 용액(28 g L-1의 저점성도 알긴염, 0.9% NaCl)(Webb, 1992a;b)에 첨가된다. 이 세포 알긴염 현탁액은 60 ml 주사기 내에 주입되어, 25 게이지 바늘을 통해 밀어내며, 0.5 M CaCl2용액으로 강하하게 된다. 알긴염은 Ca2+이온에 의해 교차 결합되어, 세포를 캡슐화한다. 이 세포는 0.1 M CaCl2의 신선한 용액내에 연속해서 배치되고, 사용하기 전에 30분 동안 방치된다.
시차 부피 반응기(DVR)는 이상적인 플러그 흐름 반응기의 섹션을 모의 시험하기위해 사용된다. 반응기로의 유입은 플랫 속도 프로파일을 베드로 제공하기 위해 다공성 금속 프릿을 통해 분산된다. 반응기는 5.0 cm i.d. ×50 cm 길이로 측정된다. 이 반응기에 대한 완전한 설명은 Webb et al.(1991)에 의해 개시된 내용을 참고할 수 있다. 이 문헌에 있어서, 시스템은 도 17에 예시된 바와 같이 상기 DVR을 통합하여 설계되어 있다. 이 시스템은 690 kPa에 관련된 3개의 Millipore(Bedford, MA) 스테인레스강 기질이 설비되어 있다. 기질 도관으로부터 반응기 입구로의 이송은 2개의 Filson(Middleton, WI) 301 HPLC 펌프에 의해 제어된다. 0.4 ml min-1의 유량이 유지되고 있다. 기질 도관은 전자 억셉터을 갖는 시스템을 제공하기 위해 산소로 압력이 가해진다. 모든 배지 도관은 3 ㎎ L-1의 피루브산 및 Tris-base(pH 7.0)의 0.1 M 용액이 부가된 트레이스 미네랄 배지(Luckey et al., 1993)를 수용하고 있다. 인산염 버퍼는 인산염 이온이 Ca2+이온을 합성하여 알긴염 교차 결합으로 분리되기 때문에 사용되지 않는다. 이 배지에 부가하여, 상기 도관의 2개는 TCE 또는 톨루엔 중 어느 하나를 포함한다. 톨루엔의 입구 농도는 타이머에 의해 제어된 HPLC 펌프를 사용하여 20 h 사이클(톨루엔으로 10 h, 톨루엔이 없이 10 h)의 정사각형파 섭동을 이용함으로써 변경된다. 이 사이클의 이송 부분 동안 10 ㎎ L-1의 톨루엔은 반응기의 입구로 유입되고 있다. 입구 TCE 농도는 20 ㎎ L-1에서 일정하다.
5.2.1.5 TCE 및 톨루엔 분석
반응 장치의 유출물(effluent)의 TCE 분석은 TCE 분리를 위해 적당한 표면 영역을 제공하는 3mm 글래스 비드로 패킹(packed)한 스트립핑 컬럼(stripping column)(길이 12.5cm, 내경 0.4cm)을 사용하여 온라인상에서 수행되었다. TCE는 GC 케리어 가스인 헬륨 가스에 의해 스트립핑(stripped)되었다. 스트립핑 컬럼의 출구는 전자 포획 검출기(electron capture detector)를 갖는 가스 크로마토그래프(GC;gas chromatograph, Hewlett Packard(Wilmington, DE)(HP) 5890 시리즈 Ⅱ)에 75℃로 유지되는 가열된 샘플 라인에 의해 장착되어 있다. 자동 주입(25㎕)이 컴퓨터화된 제어 프로세스(HP Chem 스테이션 소프트웨어)에 의해 처리된다. 오븐이 60℃로 등온으로 동작하는 동안, GC에는 (길이 30m, i.d. 0.2mm, 막 두께 0.33㎛인) 교차-연결형(cross-linked) 메틸 실리콘 모세관 컬럼이 장착된다. 그 외의 동작 파라미터로는 150℃의 주입 온도, 200℃의 검출기 온도 및 10:1의 분할비를 구비한다. 이 시스템은 스트립핑 컬럼을 보정하기 위해 반응기 주위에 바이패스 라인을 장착하고 있다.
톨루엔 샘플은 유출물 샘플링 포트로부터 정제되어 0.5ml씩 제거되고(도 17 참조), 샘플 바이얼(vial)내로 주입된다. 헤드스페이스(headspace) 분석이 직경 2.44m, 3.2mm의 포로팩(Poropak) N 패킹용 컬럼 및 플래임 이온화 검출기를 장착한 시마즈(Shimadzu)(Columbia, MD) GC-9A 가스 크로마토그래프를 이용하여 수행된다. 오븐은 210℃의 등온으로 유지하고, 검출기와 주입 온도 모두 220℃로 유지한다.
5.2.2 결과
5.2.2.1 일괄 검토
90분 노출후, 톨루엔의 농도를 최대 10mgJ-1톨루엔까지 증가시킴에 따라 증가한 생체발광 반응을 보이는 셀의 성장을 실험하였다(도 18 참조). 이 범위에서는 선형으로 비례한 관계를 보였다. 생체발광 반응은 0.1mg/l 톨루엔에 대해 2.4namp에서부터 10, 20 및 50mg/l에 대해 대략 90namp까지 변화하였다. 0 및 0.01mg/l 톨루엔에 대해서는 확실한 생체발광 반응을 보이지 않았다. 마찬가지로, 광의 반응은 수용성 제트 연료 성분의 농도가 증가함에 따라 증가한다(도 18 참조). 10㎕ 제트 연료-포화형 MSM 첨가시(대략 0.02mg/l 톨루엔), 광의 반응은 16namp인 반면에, 100㎕ 제트 연료-포화형 MSM 첨가시(대략 0.2mg/l 톨루엔), 광의 반응은 31namp로 증가한다. 제트 연료와 등량의 0.1mg/l에 대한 생체발광 반응은 0.1mg/l 톨루엔에 대한 생체발광 반응보다 약 10배이었다. 그래서, 톨루엔 이외의 다른 성분은 생체발광에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
셀의 휴면(resting)시의 실험에 있어서, 톨루엔의 단회 노출에 대한 생체발광 반응은 신속하고 재현성이 있다(도 19 참조). 다수회 노출 바이얼(vial)에 대한 초기 주입에서는 각각의 단회 노출 바이얼과 동일한 특징적인 광 반응을 보였지만, 톨루엔에 이전에 노출한 셀의 반응에 비해 톨루엔에 대한 초기 노출시에 더욱 느린 반응(생체발광 증가율, H-1)을 보였다. 게다가, 반응율은 톨루엔에 대한 각각의 노출에 의해 증가한다(도 7 참조). 그러나, 단회 노출 및 다수회 노출 양쪽 모두에 대한 최대 생체발광 반응은 573±127namp로 동일하다.
10mg/l 톨루엔a에 다수회 노출 및 단회 노출한 생체발광 반응율(namp/hr)
시간 포인트 다수회 노출 바이얼b 단회 노출 바이얼c
1 95 ND
2 321 137
3 642 67
4 768 60
5 737 60
6 973 49
a 반응율은 시간에 따라 증가하는 생체발광율로 정의한다.
b 다중 첨가된 톨루엔을 갖는 단일 바이얼
c 이전에 톨루엔에 노출된 적이 없고, 각각의 시간 포인트시에 톨루엔에
의해 주입되는 새로운 바이얼
ND 처리되지 않음
5.2.2.2 비유동성 셀 반응기 시스템
알긴산-엔캡슐레이트형 P.putida B2를 탑재한 DVR 시스템은 광 반응과 P. putida B2의 TCE 상호-물질대사(co-metabolism)를 결정하는데 이용된다. 실험 결과에서는 톨루엔 도입하에서 빠른 생체발광 반응을 보였다. 도 20은 주입 톨루엔 농도와 TCE 제거량의 변화에 대한 반응기에서의 생체리포터 균주의 광 반응을 도시한다. 도 20은 톨루엔 농도에 대한 생체발광의 반응 관계를 도시한다. 사이클기간동안, 광 방출은 16.3±1.2 namp/hr만큼 증가한다. 톨루엔의 공급이 정지한 후 톨루엔의 유출물 농도가 0로 되어 가며, 반응기의 광 반응은 3.4±0.8namp/hr의 비율로 감소한다. 생체발광과 TCE 분해 사이의 관련성이 관찰되었다. 최대 광 반응은 43.4±6.8namp이다.
톨루엔이 시스템내로 도입되었을 때 정상 상태(steady-state) TCE의 유출물 농도는 16.5±0.2mg/l(20% 제거)인 반면에, 유출물의 톨루엔 농도는 5.8±0.1mg/l(50% 제거)이다. 분해율은 μmol TCE 분해당 1.7μmol 톨루엔 분해이다. 상이한 실험 유형으로부터의 결과가 톨루엔에 대해 유사한 반응을 보이는 반면에, 생체발광의 크기는 실험 조건들 사이의 몇가지 상이점(즉, 샘플 동요, 셀의 생리 현상, 광 모니터링)들 때문에 비교하기가 어렵다.
5.2.3 논의
셀 성장 실험에 따르면, 톨루엔에 대한 정성적인 생체발광 반응뿐만 아니라 정량적인 반응을 증명한다. 셀의 성장 실험에 있어서, 생체발광도 및 톨루엔 농도 사이, 즉 0∼10mg/l 사이에는 선형의 관계가 있다. 또한, 생체발광 반응은 화합물의 결합으로 구성된 환경성 오염 물질, 즉 제트 연료의 희석에 비례하다. 그러나, 생체발광 반응이 제트 연료내의 톨루엔만에 기인한 것이라면, 제트 연료에 대한 생체발광 반응의 크기는 기대한 것보다 크다. 최근에 또 다른 생체발광 균주에 의한 작용이 용매에 대해 확실한 생체발광 반응이 있음을 개시하고 있다(하이저(Heitzer) 등, 1996). 셀이 루시페라제(luciferase) 반응의 알데히드(aldehyde) 물질에 대해 제한됨을 증명한다. 용매가 지방산의 셀룰러내 농도를 증가시키는 셀룰러막을 교란한다고 가정하였다. 지방산이 대응하는 알데히드에 대해 lux 효소(enzyme)에 의해 감소하기 때문에, 지방산의 셀룰러내 농도의 증가량이 고 생체발광을 야기하는 알데히드 한정을 무효로 한다. 이 용매의 효과는 순수한 톨루엔과 셀의 성장 실험에서의 용매 모체(matrix)내의 톨루엔 사이의 생체발광의 크기에서의 관찰된 상이점을 설명할 수 있다.
전형적으로, 자연환경에 있어서, 셀은 성장의 중간기록상(midlog phase)으로 존재하지 않는다. 그러므로, 본 발명의 발명자들은 셀의 휴면시의 조건하에서 생체발광 성질을 설명하였다. 간헐적인 단일 카본 소스로서 톨루엔을 갖는 셀에 있어서, 생체발광 반응은 적어도 5일동안 재현성이 있다. 보다 빠른 생체발광 반응이 이전에 톨루엔에 노출한 셀에 대해 관찰되었지만, 최대 생체발광이 일정하게 유지한다.
비유동성 P.putida B2 시스템은 DVR내의 톨루엔 및 TCE측의 분해 활성도(degradative activity)을 온-라인 모니터링할 수 있다. 이 P.putida B2 시스템은 톨루엔 분해와 생체발광 사이의 관계를 직접 보여준다. lux 및 tod 오페론(operon)은 동일한 프로모터(promoter) 제어하에 있기 때문에, 생체발광도는 tod 오페론으로 표시되고, TCE가 상호-물질대사임을 지시한다. 그러므로, 생체발광과 TCE 상호-물질대사 사이에는 기계적인 상호관계가 있다. 이 연구에 있어서, TCE는 또 다른 P.putida 균주에 대해 보고한 바와 같이, P.putida B2 시스템에서의 tod 오페론을 유도하도록 나타내지 않는다(헬드(Heald) 및 젠킨스(Jenkins), 1994). 도 20은 톨루엔이 없는 경우 TCE의 유입물 농도와 유출물 농도는 등량이며, 생체발광은 증가하지 않음을 나타낸다.
TCE에 대한 노출 및/또는 그것의 물질대사는 유독할 수 있고, 분해적인 효소 활성도에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 생체발광도의 강도는 톨루엔의 연속적인 동요시에, TCE가 없는 경우에 조차도 재현성이 있다(도 20 참조). 이러한 데이터는 tod 유전자 표시의 온-라인 측정법을 제공하고, 또한,연속적인 TCE 노출에 기인하는 잠재적인 유독성 효과의 지시를 제공하기도 하는 tod-lux reporter를 나타낸다. 20mg/l TCE시에, 소정의 유독성 효과가 나타나지 않는다. 이 예는 다양한 생리학적인 조건(이동가능한 셀의 성장과 휴면 및 비이동성 셀의 성장과 휴면)하에서 식별가능한 반응 및 재현성있는 반응이 있다는 것을 증명한다.
5.3 실시예 3 ― P.FLUORESCENS 생체센서의 운동력학 및 반응
PAH(Polycyclic aromatic hydrocarbon)는 유독성이고 발암성의 분해되기 어려운 환경성 오염 물질이다(해리슨(Harrison) 등, 1975). 토양내의 kg당 수g의 PAH보다 높은 농도로 높게 오염된 곳이 전국 수백곳에 존재한다. 이런 오염된 곳은 1 acre에서 100 acre를 초과하는 곳까지 다양하다. 토착성 토양 유기물이 이러한 복합물을 분해시키는 능력을 가지고 있다는 것을 증명되어 있다.
킹(king) 등(1990)은 luxCDAB 카세트와 원형의 NAH 플라스미드 pKAI내의 nahG 유전 물질의 전사성 융해물에 의해 구성된 물질인 pUTK21을 보고하였다(킹 등, 1990). 또한, 벌라게(Burlage) 등(1990)은 유사한 구성 물질을 보고하였다. 유전공학적으로 처리된 pUTK21로부터의 이화작용성 플라스미드 pKAI는 2개의 오페론, 즉 나프탈렌 및 살리친산 오페론으로 조직되고, 나프탈렌, 살리친산 및 많은 다른 오염물질의 분해를 중재한다(새일러(Sayler) 등, 1990). pUTK21은 두개의 경로, 살리친산에 대한 나프탈렌의 분해에 대해 코딩(나프탈렌 오페론)하는 상부 경로와, lux 경로에 대해 코딩하는 유전공학적으로 처리된 하부 경로를 포함한다. 하부 경로는 nahG 유전 물질이 luxCDABE 카세트의 삽입에 의해 분열되는 바와 같이 살리친산 분해에 대해 더 이상 코딩하지 않는다. pUTK21의 양쪽 모든 경로는 살리친산에 의해 유도된 프로모터에 의해 제어된다(쉘(Schell), 1990). 상기 보고자들은 박테리아, 즉 Pseudomonus fluorescens HK44(HK44)가 pUTK21를 포함한다고 보고하고 있다. HK44는 nah와는 독립된 경로로 살리친산을 자연 분해시킴으로써 허용되지 않는 살리친산 오페론을 보완한다(디그라지아(DiGrazia), 1991; 하이저 등, 1992; 킹 등, 1990). 생체발광과 유도 효소(inducer)의 농도(다프탈렌 및 살리친산)뿐만 아니라 이들의 복합물의 분해 사이의 포지티브한 정량적인 관계가 증명되었다(디그라지아, 1991). 생체발광 활성도은 산소, NADPH, ATP, FMNH2, 및 알데히드 물질을 필요로 한다(하스팅스(Hastings) 등, 1985; 마이근(Meighen), 1988, 1991). luxCDABE 유전 물질은 헤테로다이메릭 루시페라제(heterodimeric luciferase), 리덕타제(reductase), 트랜스페라제(transferase), 및 신데타제(synthetase)를 코딩한다. 광 반응은 광 반응동안 지방산을 변환하는 장범위-체인형 알데히드 물질을 필요로 한다. 지방산 리덕타제 복합체(리덕타제, 트랜스페라제, 및 신데타제)는 지방산 생성물로부터의 장범위-체인형 알데히드 물질을 재생성하는 기본 물질이다.
이전의 연구에서는 이동이 자유로운 살리친산과 나프탈렌의 농도에 대해 선형 광 반응성을 지시하는 HK44를 채택하였다(하이저 등, 1992; 하이저 등, 1994). 이 예에서는 비유동성 HK44에 의한 살리친산의 형성 및 파라미터를 기술한다. 이동이 자유로운 상태와 이동이 어려운 상태 사이의 박테리아 생리 현상내에 잠재적인 상이점이 존재한다. 그들이 "비침투적이고, 비파괴적이며, 빠르고, 개체군이 특정"하기 때문에(디그라지아, 1991), 생체발광 리포트 균주는 생체가능성, 분해 활성도, 및 최적한 분해 조건 등을 신속하게 지시하는 잠재성을 지닌다(벌라게 등, 1990; 하이저 등, 1992; 킹 등, 1990; 세일러 등, 1990). 본 발명의 명세서에 기재된 HK44 생체센서는 광-컬미네이팅(light-culminating) 장치상의 비유동성 HK44에 의해 생성될 수 있다(예컨대, 광 화이버). 그후 HK44 센서는 토양의 상태와 분해를 연속적으로 모니터링하기 위해 채택될 수 있다. 이러한 센서를 사용하면, (1) 플름(plume)(예컨대, 살리친산은 나프탈렌 및 몇가지 다른 PAH의 생물학적인 분해에 의해 생성되는 유동적인 소산 화합물임)을 검출하거나 또는 (2) PAH 농도가 감소하는 바와 같은 나중의 재중재 단계동안 재중재를 모니터링할 수 있다. 수학적으로 표현된 비유동성의 HK44에 의한 살리친산 분해를 제공한다. 예시적인 시스템은 알긴산-비유동성 HK44를 갖는 PBR(packed-bed reactor)을 갖는다.
5.3.1 수학적인 모델
이 예에서는 비유동성 HK44의 베드(bed)를 갖는 PFR(plug-flow reactor)을 기술한다. 축 방향으로만 확실한 유속이 발생한다고 가정하면, 벌크 액상의 비정상-상태의 쉘 질량는 시간 t에서부터 시간 t+Δt까지 및 위치 z에서부터 z+Δz까지 균형을 이룬다.
수학식 17을 정수 계산의 평균값 이론(mean value theorem)을 인가하는, 즉 Δt 및 Δz로 나누고, Δt 및 Δz가 0으로 수렴하도록 한정하며, 질량 전송률, 원형 비드의 표면 영역, 및 외관상의 비율로 치환하면 수학식 18로 된다.
수학식 18은 이하의 치환에 의해 차원이 구성될 수 있다.
수학식 20은 치환의 결과이다.
초기 조건으로 청결한 베드(bed)를 가정한다. 수학식 21이 차원 형성의 경계 조건이다.
고상에 대해 균형을 이루는 비정상-상태의 질량의 수율은 수학식 22에 의해 구한다.
수학식 22에 있어서, 액체의 확산율이 지배적이라고 가정하고, 포어(pore)내가 평형이라고 가정한다. 항목은 앞서 전개한 항목에 항목을 부가함으로써 흡수된 고상 플럭스에 대해 전개될 수 있다. Δz 및 Δt로 나누는, 정수 계산의 평균값 이론을 인가하고, Δt 및 Δz를 0으로 수렴하도록 하며, 수학식 19에서 치환을 실시하고, 선형 흡수를 가정하면, 수학식 23으로 된다.
Ri의 정확한 형태는 이 시스템에서 알려져 있지 않다. MMRM(Michaelis-Menten reaction model)은 분해율 및 물질 농도의 비율 및 물질 농도 사이의 비선형적인 관계를 전반적으로 반영한다. 이 비선형적인 관계는 생물학적인 시스템의 한정적인 분해 능력으로부터 발생한다. 낮은 농도시에, MMRM은 물질 농도의 제1 차수인 반응율에 접근한다. 이 시스템의 분해 능력이 접근하거나 또는 초과하면, MMRM은 농도의 제0 차수로 된다. 따라서, 다수개의 조건이 MMRM의 속도 상수를 적절하게 측정하는데 필요한 반응 기구에 공헌한다. 반응율 형태와 반응율 상수는 HK44의 정상-상태의 거동을 MMRM의 한정하는 경우와 우선 비교함으로써 설명된다. 이러한 한정의 경우, 즉 제1 차수의 살리친산과 제1 차수의 생체질량와 같은 경우 수학식 24와 같이 표현된다.
그리고, 제0 차수의 농도와 제1 차수의 생체질량의 경우 수학식 25와 같이 표현된다.
수학식 24와 수학식 25는 MMRM에서 요구하는 바와 같은 두개의 파라미터 대신에 단일률 상수를 각각 요구한다. 실제적으로, 선형 비율 모델, 수학식 24 및 수학식 25는 두개의 파라미터, 비선형 MMRM보다 더욱 설득력있는 거동의 설명을 제공한다.
초기 조건 및 경계 조건으로 청결한 베드(bed), 비드내의 대칭성 및 고체 계면의 축적이 없다고 가정한다.
수학식 20 및 수학식 23은 이하의 조건을 만족하는 물질의 분배 및 변환에 영향을 미치는 프로세스를 나타낸다. 이하 조건으로는 (1) 벌크상내의 분산 및 대류적인 전달, (2) 벌크 및 초기 고상 질량 전달 저항, (3) 비드의 포어내의 알긴산으로의 흡수, 및 (4) 비즈내에서만의 박테리아에 의한 화학적 변환이 있다. 성장하지 않는 생체질량의 일정한 공헌을 가정한다. 성장하게 되면, 생체질량의 공헌이 비드 지름의 함수로 될 수 있다(쿤(Kuhn) 등, 1991). 이 모델은 무시가능한 질량 전달 저항을 가정하여 베드 정상-상태 거동을 분석하기 위해 단순화된다. 단순화된 이 모델은 반응율 수학식 24와 결합할 때, 해결할 수 있다(다넥워트(Danekwerts), 1953).
여기서,
이다.
이 단순화된 모델은 반응율 수학식 26과 결합할 때 해결할 수 있다.
여기서,
그후 비정상-상태 거동 및 전체 모델 예측은 임계적인 가정의 평가를 위해 비교된다. 이용불가능한 분석적인 해결에 대한 수학적인 문제는 PDECOL 소프트웨어 패키지(마드슨(Madsen) 및 신코벡(Sincovec), 1979)를 이용하여 해결하였다. 이용가능한 분석적인 해결 및 수학적인 결과는 확산, 전송 및 반응 프로세스와 비교되었다(크랭크(Crank), 1975). 또한, 다른 조사자들은 PBR 프로세스를 시뮬레이션하기 위한 PDECOL(코스타(Costa) 및 로드리거스(Rodrigues), 1985)를 사용하였다.
5.3.2 재료 및 방법
종래에 개발된 온-라인 장치를 구비한 PBR 시스템(웹(Webb), 1992a;b; 웹 등, 1991)은 이러한 물질을 모방하는 조건하에서 박테리아 분해 및 생체발광 활성도을 측정하기 위해 사용된다. 도 21은 상세한 반응기 설계를 도시한다. PBR은 온도 제어형이고, 비이동성 배양기를 유지하고 비이동성 배양기에 공급하기 위한 주입구 및 배출구에 용접된 금속 플릿(frit)을 구비한 고정형이다. 부가적인 내부-공동을 삽입하면, 패킹된 베드와 HPLC(high-performance liquid chromatography)내로 자동 주입하기 위한 유출물을 필터링하고, 반응기에 대한 전반적인 공헌을 개선하는 흐름에 균일한 저항을 생성하는 출력구 플릿(outlet frit) 필터(예컨대, 0.2mm 무기질 및 폴리머)를 설치할 수 있다(웹, 1992a,b). 반응기는 내부 직경이 1.34cm인 반면에, 베드의 길이는 0.8∼11.0cm까지 허용가능하다. HPLC 펌프는 가압형 공급 저장소로부터 각각의 반응기로 매개체(media)를 공급한다. 산소를 포함하는 모든 영양물(nutrient)은 액상으로 분해되어 반응기에 들어간다. 나프탈렌 및 살리친산은 FL-4 듀얼-모노크로메터 형광 검출기(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 구비한 비닥(Vydac) TP20154 컬럼(Sep/A/Ra/Tions Group, Hesperia, CA)을 이용하는 온-라인 HPLC에 의해 검출된다. 각각의 살리친산 검출용 여기 파장 및 방출 파장은 290nm 및 360nm이다. 반응기는 반응기 입구로부터 대략 2.5cm에 이격된 접착형 화이버 번들(bundle)(Ensign Bickford Optics, Simsbury, CT)로 이루어지는, 생체발광 활성도을 모니터링하기 위해 온-라인 광 검출기(던바(Dunbar), 1992)에 의해 고정된다. 모델 77448 광전자 증배관 튜브(500nm 파장 근방에서 방사선 민감도가 80 MA/W)를 이용하는 오리엘(Oriel)사(Stratford, CT)의 7070 광전자 증배관 검출 시스템가 채택되었다.
두번째 장치는 알긴산 생체센서를 통과하는 플로우를 시뮬레이션한다. 이 장치는 플로우 셀 및 알긴산에서 비유동성인 HK44 층을 부착한 하마마츠(Hamamatsu) 광 다이오드(브리지워터(Bridgewater), NJ)로 구성된다. 플로우 셀의 양은 5ml인 반면에, 플로우 속도는 1.5ml/min으로 유지된다. 살리친산의 농도는 변화하는 반면에, 광은 광 다이오드에 의해 모니터링된다. 미네랄염(mineral salt) 매개체는 유도 효소의 농도를 변환시키는 이러한 실험에 사용된다.
MgSO47H2)(0.1g/l), NH4NO3(0.2g/l), trizma(상표명) 베이스 (3.03g/l), MgO(1.0×10-3), CaCl2(2.9×10-4g/l), FeCl36H2O(5.4×10-4g/l), ZnSO47H2O(1.4×10-4g/l), CuSO4(2.5×10-5g/l), H3BO4(6.2×10-6g/l), 및 Na2MoO4H2O(4.9×10-5g/l)로 구성된 미네랄염 매개체(pH 7.2)는 분해 및 생체발광 연구를 위한 적절한 카본(carbon) 소스를 갖는 반응기에 공급된다. 운동력학적인 박테리아의 연구 대상은 공급의 가압 및 반응기를 제어함으로써 제한되게 유지된 호기성(好氣性)의 인산염(phosphate)이다.
HK44는 글로코스(glucose)(1.0g/l), 폴리펩톤(polypeptone)(2.0g/l), 이스트 익스트렉트(yeast extract)(14 mg/l), NH4NO3(0.2g/l) 및 테트라사이크린(tetracycline)을 포함하는 YEPG 매개체 100ml에 청결하게 녹인 접종물(사용하기 전까지 -70℃에서 얼림)을 첨가하여 고정화(immobilization)하기 위해 준비되었다. 25℃에서 15시간 교반하여 배양한 후, 8000rpm으로 10분동안 원심분리하였다. 그후 고정화하기 전 펠릿(pellet)을 0.9% NaCl 용액으로 3번 세척하였다. HK44의 농도는 546nm 파장대의 광학 밀도 측정법에 의해 측정되었다. HK44는 0.9% NaCl 용액내의 박테리아를 부유시키고, 저점성의 알긴산(28g/l)과 NaCl(9g/l) 용액을 1:2의 체적비를 갖도록 혼합함으로써 고정화되었다. 비드는 0.1 M CaCl2용액에 정밀한 레귤레이터(Porter Instrument Co., Hatfield, PA)와 0.003인치(i.d.) 튜빙에 의해 제어된 에어 제트(클라인(Klein) 등, 1983)내에 장착된 스포이드 바늘로 제어하면서 드롭와이즈(dropwise) 첨가하여 형성되었다. 비드의 직경은 부드러운 습식 시빙(sieving)법을 이용하여 측정하였다. 알긴산 비드는 50ml 나트륨 헥사메타포스포타내에서 용해하였다.
칼슘 알긴산상의 나프탈렌 및 나트륨 살리친산 흡착 등온선은 배치 이퀴리블리움법(batch equilibrium)과 브레이크스루 커브법(breakthrough curve method)으로 측정하였다(루드엔(Ruthyen), 1984). 분산에 대한 체류 시간 기여 측정법 및 액상 질량 전달 측정법은 반응기의 6-포트 HPLC 밸브 업-스트림을 통해 도입한 살리친산(0.1 M), 포타슘(potassium), 및/또는 브로마이드(bromide)(1.0 M)를 이용하여 측정한다. 트레이서(tracer)는 시리즈 510 HPLC 펌프, IC-PAK 음이온 교환 컬럼(anion exchange column) 및 431 컨덕턴스 검출기(Waters, Cam-bridge, MA)를 구비한 워터 이온-크로마토그래피 시스템(water ion-chromatography system)을 이용해서, 형광 발광을 연속적으로 이용하여 모니터링하여 측정한다.
5.3.3. 비생물적 성질
전형적으로, 거의 모든 비드의 직경은 3.9×10-2및 7.5×10-2cm이었다. 예를 들어, 4, 65, 및 31wt%는 7.5×10-2, 4.5×10-2, 및 3.9×10-2cm 스크린을 각각 유지한다. 살리친산은 알긴산에 측정가능한 정도가 흡착되어 있지 않은 반면에, 나프탈렌 등온선은 8.4의 무차원 비율의 선형이다(도 22 참조). 최종 평형 액상 농도의 범위는 0.0 내지 1.5×10-4M인 반면에, 고상 농도의 범위는 알긴산 1리터당 1.1×10-3mole의 나프탈렌까지이다. 분산은 루드벤(Ruthven)에 의해 제안(1984)된 바와 같이, 하이네스(Haynes) 및 사마(Sarma)에 의해 유도된 분석적인 관계(1973)를 선형화하여 측정하였다. 그 측정 곡선의 기울기의 범위는 1×10-2및 2×10-2m2/min로서, 10-2cm2/min 차수의 분산을 지시한다. 반응기 체적과 평균 체류 시간의 비교는 확실치 않은 채널링을 증명하였다. 다른 연구(웹, 1992a, b)에서 언급한 바와 같이, 소수성(hydrophobic) 필터는 반응기의 유출구를 넘는 플로우에 균일한 저항을 미치고, 플로우 특성을 크게 개선한다. 블롯(blot)수의 범위는 대략 100정도이고, 확실치 않는 질량 전달을 나타낸다(머천트(Merchant) 등, 1987).
나프탈렌 및 살리친산 리토터 박테리아에 대한 양호한 고정화 매개체로서는 양호한 질량 전달 및 흡착 성질에 기인하여 알긴산이 선택되었다. 또한, 알긴산은 센서 어플리케이션(예컨대, 광 프로브에 직접 부착된 박막으로서)에 유용한 형태로 형성할 수 있다(하이저 등, 1994). 나트탈렌은 풍부한 환경성 오염 물질이고 일반적으로 다른 PAH 오염 물질을 갖고 있는 반면에, 살리친산은 나프탈렌과 다른 다른 PAH의 물질대사산물(metabolite)이기 때문에 살리친산 및 나프탈렌이 바람직한 테스트 복합물이다. 이런 용해성 및 흡착성 특성에 있어서 큰 PAH가 이러한 모델 복합물로부터 확실하게 유도될 수 있기 때문에, 다른 PAH를 검출하기 위한 고정화 모체를 선택하는데 주의를 기울여야 한다.
5.3.4 P.FLUORESCENS HK44의 운동력학인 평가
18개의 실험에 있어서 표 8의 제2행 내지 제4항에 기록된 공급 농도, 생물량 및 플로우 속도의 상이한 결합이 분해율 수학식과 관련 상수의 형태를 결정하기 위해 변화시킨다. 이들 연구에 사용된 비유동성 셀의 5개의 차지(charge)는 제1행의 지정수에 의해 나타내어진다. 액상 질량 전달은 가타오카(Kataoka) 등의 보정을 사용하여 평가되었다(1973). 정상-상태 거동은 측정된 파라미터를 사용하여 수학식 20 및 수학식 23에 의한 예측과 일치하는 퍼투베이션(pertubation)후 몇가지 베드 체적내에서 성취된다. 몇몇 연구에서 (높은 표준 편차로 나타내어진) 소량의 편류(drift)가 보고되긴 하였지만, 그후 박테리아 분해 활성도은 일정한다. 생물량, 살리친산 농도, 및 체류 시간에 대한 범위로는, 각각 1.9×109∼3.5×109cells/ml, 2.25∼4.5mg/l 및 14∼150min이다. 4.5 mg/l 이하의 살리친산이 반응기에 공급된다. 화학량론적인 레벨의 용해된 산소는 높은 살리친산 농도에서 HK44에 대한 유독성을 증명한다. 상기의 범위를 초과하는 농도는 1mg/l 농도로 용해가능한 매우 적은 PAH와 같이 대체적으로 현실적이지 못하다(리(Lee) 등, 1979). 제5행에 기록된 살리친산 변환은 9%∼92%의 범위이고, 1.08%∼2.96%의 표준 편차 범위를 갖는 유출량 농도를 정규화하였다. 제5행에서의 표준 편차와 평균 변환은 각각의 경우에 대해 100개의 데이터 포인트의 평균을 내서 계산하였다.
5개의 독립된 연구를 반복해서, 물질 변환, 생물량, 공급 농도 및 반응기내 잔류 시간 사이의 재현성있는 관계를 증명하였다. 이하 5개의 독립된 연구를 기술한다. (1) 연구 4b 및 연구 3c는 0.62의 변환, (2) 연구 4f 및 연구 4c는 0.50의 변환, (3) 연구 3e 및 연구 4d는 0.41 및 0.39의 각각의 변환, (4) 연구 1a 및 연구 1c는 0.64 및 0.73의 각각의 변환, 및 (5) 연구 3c 및 연구 3f는 0.77 및 0.70의 각각의 변환이다.
적응가능한 단일 파라미터로서 분해율 상수를 이용하는 수학식 27은 양호한 실험 데이터에 대한 설명을 제공한다. 도 23 및 도 24에서 기술한 바와 같이, 반응율은 물질 농도가 감소함에 따라 감소한다. 실험 1a∼1c, 3a∼3f 및 4a∼4f로부터의 퇴행한 분해율 상수가 치밀하게 그룹화되었다. 전체적인 데이터 세트 및 서브세트를 이용하여 얻어진 분해율 상수는 (1) 완전한 세트에 적합하게 한 2.23×10-2dm3g-1; (2) 서브세트 1a∼1c에 적합하게 한 1.88×10-2; (3) 서브세트 2a∼2c에 적합하게 한 2.85×10-2; (4) 서브세트 3a∼3f에 적합하게 한 2.06×10-2; 및 (5) 서브세트 4a∼4f에 적합하게 한 2.28×10-2이다.
도 23 및 도 24는 전체적인 데이터 세트와 분해율 상수 2.23×10-2을 이용한 수학식 27 사이의 양호한 관계를 증명한다. 연구 2a∼2c는 모든 18개의 연구에 대한 나머지 전체에 가장 크게 기여한다. 디그라지아(DiGrazia)(1991)의 보고에 따르면, HK44에 의한 나프탈렌의 분해는 나프탈렌에서의 제1 차수와 생물질에서의 제1 차수인 분해율 항목에 의해 나타내어질 수 있다.
수학식 28은 HK44의 운동력학을 나타내기에 수학식 27보다 조금 부적절하다. 나머지는 전반적으로 수학식 27을 이용하는 크기의 차수보다 크다. 또한, 수학식 28에 의해 제안된 기초적인 관계는 그 데이터에 의해 실증되지 않는다. 수학식 28을 이용하여 얻어진 분해율 상수는 크기 차수의 범위의 거의 절반인 4.33×10-5내지 1.35×10-4min-1이다.
생물량, 공급 농도 및 잔류 시간의 함수로서 P. FLUORESCENS HK44에 의해 생산된 정상 상태의 분해 및 광 생산량
연구 생물량(cells/mL) 살리친산 나트륨량(ml/L) (min) 살리친산 유출량±σ(mg/L) 생체발광±σ(nA)
1a 3.3×109 2.25 14 1.43±2.85×10-2 유효하지 않음
1b 3.3×109 2.25 58 0.46±0.84×10-2 유효하지 않음
1c 3.3×109 2.25 14 1.65±4.77×10-2 유효하지 않음
2a 3.5×109 2.47 24 1.03±2.83×10-2 2.71±4.0×10-2
2b 3.5×109 2.47 26 0.86±0.93×10-2 1.81±2.0×10-2
2c 3.5×109 2.47 94 0.20±0.28×10-2 0.16±2.0×10-2
3a 1.9×109 4.45 15 4.06±8.85×10-2 유효하지 않음
3b 1.9×109 4.45 18 3.84±6.99×10-2 유효하지 않음
3c 1.9×109 4.45 24 3.42±8.55×10-2 3.07±1.0×10-2
3d 1.9×109 4.45 36 2.77±4.24×10-2 2.26±1.0×10-2
3e 1.9×109 4.45 72 1.81±5.36×10-2 0.95±5.0×10-2
3f 1.9×109 4.45 24 3.12±4.09×10-2 유효하지 않음
4a 1.9×109 4.45 29 3.07±6.45×10-2 유효하지 않음
4b 1.9×109 4.45 36 2.76±3.95×10-2 유효하지 않음
4c 1.9×109 4.45 48 2.25±3.47×10-2 2.17±8.0×10-2
4d 1.9×109 4.45 72 1.75±2.03×10-2 1.61±6.0×10-2
4e 1.9×109 4.45 150 0.89±1.54×10-2 0.83±6.0×10-2
4f 1.9×109 4.45 48 2.24±3.49×10-2 2.53±4.7×10-1
5a 1.9×109 2.5 15 유효하지 않음 1.60±1.90×10-2
5b 1.9×109 2.5(나프탈렌의 경우 8.0) 15 유효하지 않음 4.79±3.18×10-2
모델 예측 및 데이터는 모두 살리실레이트 변환이 질량 전달율에 의해 한정되지 않고 반응율에 의하여 한정된다는 것을 나타낸다. 유량비(flow rates), 유효 인자, 딜레 계수(Thiele modulus), 레이놀즈(Reynolds) 수 및 비오(biot) 수가 표 9에 기재되어 있다. 비오 수는 대략 100이었다. 가장 적합한 제 1차 반응율 상수를 사용한 유효 인자에 대한 계산은 비즈가 내부 질량 전달 내성에 의해서가 아니라, 반응율에 의해서 제한되었다는 것을 나타낸다. 분석 용액을 사용하여 얻어진 적합한 결과물은 질량 전달율도 최소화 되었다는 결론을 지지하게 되며, 여기서, 외부 및 내부 질량 전달은 무시할만하다고 가정하였다. 이 모델에 의해 살리실레이트 분포가 (마지막은 99%인) 알기네이트 비즈 내에서 대략 7분 이내에 안정 상태에 도달한다는 것을 예측할 수 있다. 확산 계수가 알기네이트 매트릭스의 크기의 순서에 따라 감소되었다고 가정하더라도, 15분 이내에 안정 상태에 도달하였다. 오이아스(Oyass)(1995) 등은 칼슘 알기네이트 내에서의 확산이 아홉개의 용질(단당류, 이당류 및 유기산)를 사용한 물에서 대략 85%라는 것을 알아냈다. 1% 미만으로 추정되는 세포의 부피는 대략적으로 확산에 거의 영향을 끼치지 않는다[웨스트린 및 알렉슨(Westrin 및 Axelsson), 1991]. 또한, 이 모델은 액체 질량 전달 내성이 안정 상태에 도달하는 데에는 거의 영향을 미치지 않았을 것이라는 것을 나타내고 있다. 나프탈렌과 같은 흡수성 물질의 경우에, 이 모델은 흡수가 반드시 고려되어야 함을 나타낸다. 측정된 흡수율에서의 염기성의 50% 오류는 궁극적으로 안정 상태에 도달하는 데에 필요한 시간을 배가시킬 것이다. 이 모델은 나프탈렌에 대한 안정 상태가 청정 알기네이트 베드에서 시작하여 대략 1 시간 이내에 획득되었다는 것을 예측하였다. 모델 파라미터가 측정되었고(액체 질량 전송율, 필레 공극 부피 및 흡수율), 발표되었으며(액체 확산율)[던바(Dunbar), 1992], 다시 추정되었다(고체 확산율)[트레이발(Treybal), 1980]. 나프탈렌에서의 상대적인 확산율은 액체 확산, 고체 확산 및 랑그미르(Langmuir) 평형 상수가 각각 9.0x10-6cm2s-1, 9.0x10-8cm2s-1이며, 8.4cm2s mol-1이었다. 동반하는 유리 세포 연구는 유리 운동역학과 고정 운동역학 및 반응에 대한 더 이상의 평가가 필요하다.
유동율, 레이놀즈 수, 딜레 계수, 유효 인자 및 비오수
실험 유동율(cm/s) 레이놀즈 수 비오 수 딜레 계수 유효 인자
1A 1.17 x 10-2 2.65 x 10-1 1.53 x 102 9.25 x 10-1 9.47 x 10-1
1B 2.92 x 10-3 6.62 x 10-2 9.66 x 101 9.25 x 10-1 9.47 x 10-1
1C 1.17 x 10-2 2.65 x 10-1 1.53 x 102 9.25 x 10-1 9.47 x 10-1
2A 1.17 x 10-2 2.65 x 10-1 1.53 x 102 9.07 x 10-1 9.49 x 10-1
2B 1.05 x 10-2 2.38 x 10-1 1.48 x 102 9.07 x 10-1 9.49 x 10-1
2C 2.92 x 10-3 6.62 x 10-2 9.66 x 101 9.07 x 10-1 9.49 x 10-1
3A 1.17 x 10-2 2.65 x 10-1 1.53 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
3B 9.36 x 10-3 2.12 x 10-1 1.42 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
3C 7.02 x 10-3 1.59 x 10-1 1.29 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
3D 7.02 x 10-3 1.59 x 10-1 1.29 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
3E 4.68 x 10-3 1.06 x 10-1 1.13 x 102 6.77 x 10-1 8.71 x 10-1
3F 2.34 x 10-3 5.30 x 10-2 8.97 x 101 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
4A 1.17 x 10-2 2.65 x 10-1 1.53 x 102 6.77 x 10-1 8.71 x 10-1
4B 9.36 x 10-3 2.12 x 10-1 1.42 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
4C 7.02 x 10-3 1.59 x 10-1 1.29 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
4D 7.02 x 10-3 1.59 x 10-1 1.29 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
4E 4.68 x 10-3 1.06 x 10-1 1.13 x 102 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
4F 2.34 x 10-3 5.30 x 10-2 8.97 x 101 6.77 x 10-1 9.71 x 10-1
유동율은 거의 번동이 없는 것에 가까웠다. 비오 수는 대략 100의 범주에 있으며, 이는 유동 상태 질량 전달은 중요하지 않았다는 것을 나타낸다. 유효 인자는 1.0에 접근하며, 이 반응율이 모든 반응율을 거의 지배하였다는 것을 나타낸다.
5.3.5 생체 발광
글루코스(glucose) 및 HK44의 광 발산시에 (카본이 없는) 미네랄 염 배지의 영향을 판정하기 위한 조정 연구가 이루어졌다. 측정된 유출 산소 레벨은 항상 (〉10ppm)을 크게 초과한다. HK44가 현저하게 성장한다는 것은 인산염이 리엑터 내로 공급되지 않았다는 것과 같이 있을 수 없는 일이다. 생체 발광 활동은 지속적이며 극소량의 미네랄 염 배지만을 사용한다. 또한, 미네랄 염 배지 내의 글루코스는 5mg/L, 그리고, 1.0mL/min의 유량으로 HK44에 공급된다. 글루코스가 광에 노출되면, 광 방사는 살리실레이트 반응보다는 작은 정도의 크기 이었지만 26시간 동안 기준선 잡음 이상으로 완만하게 상승한다. 발광은 글루코스가 피드로부터 제거될 때까지 12시간 동안 지속되었다. 글루코스는 훌륭한 탄소 및 에너지 원이므로, 하나 이상의 광 재료의 풀(pool)을 증가시킬 수 있을 것이다. 쉘(Schell)(1990)은 낮은 레벨의 nah mRNA가 유도되지 않은 세포에서 나타났다는 것을 발견하였다. 미네랄 염 피드에서의 트리즈마(TRIZMA:상표명) 기반 버퍼는 이 실험에서의 긴 채류 시간에도 불구하고 pH를 7.2로 유지하였다. 따라서, pH는 광 반응에서는 인자가 될 수 없는 것으로 보인다. 이들 데이터는 광 발산에서의 작은 증가가 반응 물질의 증가된 풀(pool) 및 lux 효소의 낮은 구성 레벨에 의하여 생긴 결과였다는 것을 의미한다.
분해 연구하는 동안, 글루코스 용액은 본 실험 내내 계속적인 관심을 보인 리엑터에 첨가된다. 유도 효소는 실험을 시작한 이후로 15시간 동안을 첨가하였다. 거의 모든 경우에 있어서, 광 밀도는 살리실레이트 농도에서의 변화와 유사하였다. 유도 효소가 증가하면, 광밀도도 증가하였다. 반대로, 유도 효소 농도가 감소하면, 광 밀도는 감소하였다. 이 작용에 대한 하나의 예외는 HK44의 하나의 깨끗한 베드가 유도 효소의 농도의 상태 변화에 따라 초기의 충격 때인 실험의 맨 앞상태에서 관찰되었다. 이 충격된 상태에서 광 생산은 크기의 등급을 초기에 증가시켜 대략 1 주기의 잔류 시간 후에 최고치에 도달하였다(도 25). 4 내지 6 주기의 시간 내에 광 밀도는 안정 상태에 도달한다. 반대로, 유출 농도는 2 주기의 잔류 시간 내에 일정하게 된다. 따라서 불안정 상태 광 방출은 살리실레이트 벌크 상태 농도에서의 빠른 변화 및 세포막 및 이의 분해에 의해 전달 간의 불균형에 의한 세포 내에서의 살리실레이트의 초기 생성에서 기인한다. 또한 유도 효소의 첨가 이전에 15 시간 동안의 글루코스의 첨가는 가벼운 물질의 풀을 증가시켜 궁극적으로 lux 보조 요인을 과잉 공급할 것이다. 따라서, 더 이상의 실험은 이 전사 현상을 조사하는 데에 사용될 것이다. 예컨대, 보조 요인 농도는 공급된 물질의 함수로서 직접 측정될 것이다.
도 26은 광 프로브에서 상술한 살리실레이트 농도의 함수로서의 평균 특이 광 반응(단위 생체 질량 당 빛)을 도시한다. 분해 실험하는 동안 얻어진 도 26의 데이터는 평균과 표준 편차로서 나타내었다. 모든 실험에서, 산소는 화학량 요구를 초과하는 레벨에서 유지되었다. 산소 유출 농도는 리터당 수 밀리그램 보다 항상 컸다. 도 26에 도시된 광 밀도는 유출 농도 보다는 광 프로브에서의 국지 유도 효소 농도의 함수로 표현되었다. 국지 살리실레이트 농도는 상술한 모델 및 파라미터를 사용하여 계산되었다. 도 26의 목적은 유출과 유도 효소 농도 사이의 관계를 정성(定性)적으로 비교하는 것이다. 광 방출과 유도 효소 농도 사이에는 양성 관계가 있다. 가장 적합한 라인은 각 2a-c, 3c-e 및 4c-f의 실험에 의하여 각각 1.4, 2.3 및 1.5의 기울기를 갖고 있다. 광 값은 실험들(예컨대, 변화하는 알기네이트 불투명도) 사이에 측정자로서의 표준 광원이 없는 실험에서는 상대적이기 때문에, 본 분석은 정성적으로 다루어져야만 한다. 따라서, 만곡에 대한 일정한 방해는 알려져 있지 않다. 그러나, 이 기울기는 서로 유사해서 광 발산이 유도 효소 농도의 양성적인 함수를 나타내었다.
이 실험은 나프탈렌(실시시레이트의 근원 화합물)에 대한 반응을 조사하기 위하여 수행되었다. 살리실레이트는 16 시간의 제어하에 PBR에 가해진다(실험 5a). 살리실레이트에 대한 반응은 이전 실험에서와 동일하다. 광 발산은 나프탈렌이 가해지기 이전에 안정된다.
알기네이트 고정된 HK44의 광 반응은 45시간에 나프탈렌에 가해져 농도가 짙어진다. 나프탈렌에 대한 HK44의 안정 상태 반응은 동일한 상태하의 살리실레이트에 대한 반응의 반응보다 대략 2 배의 크기로 커지게 된다. 이들 결과는 실험이 반복됨에 따라 증명된다.
이 분해 연구에 대하여 독립적으로 행한 실험의 제 2 부분에서, 광 밀도는 유도 효소 농도의 함수로 측정되었다. 이 분해 연구는 광 반응을 실험하는 데에는 적합하지 않다. 상기 실험에서, HK44는 포토다이오드에 부착된 아기네이트 박막층에 고정되었다. 유출 세포 내에서 매우 짧은 잔류 시간(3분)이 유지되었다. 또한, 상기 실험은 세포가 유도 효소 농도에서의 단계 변화에 의하여 충격받지 않았던 상기 분해 실험과는 상이하다. 또한, 살리실레이트 농도는 점차적으로 증가한다. 도 27 및 도 28은 광 반응 및 유도 효소 농도를 도시한다. 지연 시간이 있지만, 광 밀도는 유도 효소 농도를 모방하였다. 나프탈렌 실험에서는 살리실레이트 실험에서보다 길어진 지연 시간이 관찰되었다. 지연 시간은 최소한 부분적으로라도, 벌크 용액으로부터 고정된 세포로 질량 전달에 의하여 그리고 나프탈렌의 경우에 있어서는 알기네이트를 흡수함으로써, 발생된 것으로 여겨진다. 지연시간에 있어서의 차이는 나프탈렌과 살리실레이트가 세포 내로 전달되어 소모되는 등의 상이한 방법의 결과일 수도 있다. 이 실험의 부분에 있어서 그리고, 그 이전의 실험[하이쳐(Heitzer)등]의 부분에 있어서, 불안정 상태 반응은 유도 농도를 모방하였다.
HK44는 나프탈렌과 살리실레이트 양측에서 100만분의 수개의 농도에서도 강한 반응을 나타내었다. 토양에서의 PAH 농도는 전형적으로 1000분에 수개의 농도로 관찰되었다. HK44의 적량을 사용하면 PAH 및 분해 산물 농도가 다수 감소된 플럼 프론트(plume front)를 검출하게 될 것이다. HK44는 살리실레이트보다 나프탈렌에 더 민감하다. 상승 메카니즘, 유도자의 에너지 레벨 및 세포막 유동성에서의 유도 효과는 HK44의 이들 혼합물에 대한 반응의 차이에 기여할 수 있다. 나프탈렌은 바람직하게는 지질(脂質)을 흡수하며, 잠재적으로 막 유동성에 영향을 미쳐 궁극적으로는 지질 합성으로부터 알데히드 물질을 증가시킨다. 또한, 나프탈렌 상승은 수동적인 것으로 여겨진다[베이트맨(Bateman)등, 1986]. 살리실레이트는 대전된 이온이기 때문에 상승은 활성 전달에 의하여 발생될 수 있다. 나프탈렌은 살리실레이트보다 탄소 및 에너지 원이 크기 때문에 나프탈렌은 lux 물질을 증가시켜 궁극적으로 광밀도를 상승시킨다.
5.3.6 명명 목록
Cbiomess생체 질량 농도
CDii 성분의 벌크 상태 점 농도
CDli미립자 구멍 내의 i 성분의 액체 상태 점 농도
CDsii 성분의 점 흡수 고체 상태 점 농도
Cii 성분의 벌크 피드 농도(mol/dm3)
CiOi 성분의 피드 농도(mol/dm3)
CPii 성분의 구멍 농도(mol/dm3)
CSii 성분의 흡수 고체 상태 농도(mol/dm3)
Csalicylate농도(mol/dm3)
Dii 성분의 확산율(dm2/s)
DPii 성분의 구멍 확산율(dm2/s)
K1비율 상수(mol/s g cells)
K2비율 상수(dm3/s g cells)
K1비율 상수(dm3/s g cells)
K1액체 상태 질량 전달율(dm/s)
L 베드 길이
NPi질량 전달율(mol/s dm3)
Pe 특성 길이로서의 베드 길이를 갖는 펙렛 수
r 미립자의 위치(dm)
r0미립자의 반경(dm)
Ri 반응율(mol/dm3s)
RSalicylate살리실레이트 반응율(mol/dm3)
S 표면 면적(dm2)
t 시간(s)
tr 베드에서의 평균 잔류 시간(s)
V 틈새 속도(dm/s)
z 컬럼에서의 위치(dm)
컬럼에서의 점 위치
미립자에서의 점 위치
베드 공극 부피
P미립자 공극 부피
l 점 시간
Sii 성분의 최대 피드 농도와 동일한 평형 상태에서의 흡수점 농
도율
5.4 실시예 4 ㅡ 영양 결핍 상태에서의 캡슐화된 생체 발광 박테리아의 배치
P.fluorescens HK44는 나프탈렌 또는 살리실레이트에 노출되면 청색-녹색 광을 발생시킨다. 생체 발광에 사용되는 유전자는 플라스미드(plasmid) 내에 위치하여 살리실레이트 하이드록시라아제 유전자의 증진물(promoter), 나프탈렌 분해 경로의 nahG 및 증진자가 없는 Vibrio fisheri의 luxCDABE 유전자 카세트[킹(King)등, 1990] 간의 전사적인 융합을 발생시킨다. 증진자 없는 lux 오페론 및 활성도는 다른 곳에서 설명하기로 한다[샤우(Shaw)등, 1988].
이전의 실험에서, HK44 세포에 의해 생산된 유도된 광의 양은 노출된 나프탈렌 또는 살리실레이트의 양에 비례함을 나타냈었다[하이쳐(Heitzer)등, 1992, 1994]. 액체 분석에서, 이 세포는 3.25㎎/l의 나프탈렌에 대하여 0.72㎍/l의 비율로, 그리고, 20㎎/l의 살리실레이트에 대하여 0.4㎎/l의 비율로 선형적인 발광 반응을 나타내었음을 보여주었다. 또한, 이 세포는 환경오염에서 나프탈렌을 검출하기 위한 생체분석에 유용하게 사용될 수 있음을 보여주었다. HK44를 갖는 광학 온라인 생체 센서의 실시예에서, 고정된 세포가 토양 슬러리(slurry) 내의 나프탈렌에 노출된 경우에도 이들 세포가 특이 발광 반응을 방출한다는 유용성을 입증하였다[하이쳐(Heitzer)등, 1992, 1994]. 이들 실험으로부터, 생체 발광 기술이 말단점 및 규제 표준을 결정하는 생체 이용율 분석 및 중대한 환경 오염 물질의 분해에 사용될 수 있다는 정보를 알 수 있었다[깁슨(Gibson) 및 세일러(Sayler), 1992 ; 하이쳐(Heitzer) 및 세일러(Sayler), 1992, 1994].
생체 발광은 O2분자를 소모하고, 감소된 플라빈 모노뉴클리오타이드 및 알데히드 물질의 합성물을 필요로 하는 복잡한 신진대사의 함수이다[하스팅(Hasting)등, 1985]. 이 알데히드 물질은 빛이 발산을 확장하는 동안 ATP 및 NADPH 배지된 주기 반응에 의해 재발생된다[유리쳐(Ulitzur)등, 1981]. 영양이 필요한 환경의 유도하에서의 생리적인 부담은 안정 및 특이 생체 발광를 만들어 내기 위하여 HK44의 본질적인 능력 및 Pseudomonas putida B2와 같이 유전공학적으로 유사하게 처리된 스트레인[에플리게이트(Applegate)등, 1993]에 기반하여 기초적인 의문을 제기하고 있다.
5.4.1 재료 및 방법
5.4.1.1 박테리얼 스트레인
Pseudomonas fluorescens HK44(독일의 미생물 제품)인 생체 발광 생체 리포터가 이 실험[킹(King)등, 1990]에서 사용되었다. HK44는 탄화 플라즈미드인 pUTK21(nah+, sal-, tet+)를 전달하되, 이 탄화 플라즈미드는 나프탈렌 및 실시리레이트 효용성 및 분해를 모니터링하도록 하는 nah-iux 전이 융합을 포함한다. luxCDABE인 이 lux 유전자 카세트는 플라즈미드 코드화된 경로를 통해 sal 오페론의 nahG 유전자의해 주입되어 살리실레이트의 이화 작용에 서식한다. 그러나, 살리실레이트는 염색체 유전자에 의해 코드화된 효소에 의해 변쇠된다.
5.4.1.2 배양 환경
스트레인 HK44는 14 mg/l의 테트라사이클린과 함께 100ml의 이스트(yeast)/추출물/펩톤/글루코스(YEPG) 성장 배지를 포함하는 500ml의 원추형 플라스크에서 배양하였다.
YEPG의 조성은 다른 곳[하이쳐(Heitzer)등, 1992, 1994]에 나타내었다. 이 배양은 27℃의 쉐이커에서 성장되었다.
이 유기물은 실험적인 상태에 따라 알기네이트/SrCl2매트릭스에 고정되어 지하수에서 배양된 YEPG 배지(A5460.8)에서 배양하였다. 가정된 지하수는 테네시주의 오크리지에 있는 오크리지 국립 연구원에 도급한 원래 위치의 지하수에 의하여 제공되는 방법에 의하여 실험실에 구비하였다. 이 방법은 지하수의 농도에 대하여 실험한 이 팀에 의하여 분석된 다수의 지하수 샘플의 조성물에 기초한다. 가정된 지하수는 (증류된 물에 mg/리터의 단위로) 다음의 요소들을 포함한다. 즉, 상술한 요소들은 CaCl2166, MgCl2 6H2O 85, BaCl2 2H2O 1.8, SrCl2 6H2O 0.6, FeSO4 7H2O 25 및 KNO317등이다. 2배 농도의 지하수가 준비되고 각각의 버퍼 용액과 함께 희석되어 3, 4, 5, 6 및 7의 pH 레벨을 갖는 1배 농도의 지하수가 만들어진다. 다음의 버퍼 용액을 축적하는 것은 지하수를 원하는 pH로 조정하는 데에 사용된다. 0.2M의 수산화칼륨 파탈레이드 대 0.2M HCl의 용액은 지하수를 pH 3 내지 4에서 조정하는 데에 사용하되, 0.2M의 수산화칼륨 파탈레이드 대 0.2M HCL의 용액은 pH 7에 대한 비율이다. 지하수는 완전히 섞여지고, 홧맨(Whatman) 여과지를 통과하여 고압 용기에 의해서 살균된다.
5.4.1.3 배양 및 추출
캡슐화된 HK44는 지하수와 0.1 x YEPG 매질에서 배양된다. 캡슐화에 대하여서는 다른 곳[하이쳐(Heitzer)등, 1994]에서 기술된 대로 수행된다. 캡슐화된 HK44인 500mg의 알기네이트 샘플은 3ml의 배양 배지, 즉, (영양분이 결핍된)지하수와 (영양분이 초과된)0.1 x YEPG를 포함하는 무균의 25ml 유리병[파이어스(Pierce) Ⅲ]에 투입된다. 모든 각 유형의 배양 배지에 대하여 충분한 유리병이 3벌을 한세으로하는 유리병이 유도와 분석에 사용될 것이다. 6일의 유도 기간, 즉, 이 유도 기간은 1, 7, 14, 21, 28, 35일 등이다. 모든 유리병들은 27℃에서 배양된다.
세포의 유도는 유리병에 1ml의 유도 용액을 첨가하면서 시작된다. 광 출력은 0시간에서 5시까지 매 30분 마다 측정된다. 유도되지 않은 광 반응을 나타내는 것을 제어하기 위하여 1ml의 증류된 물과 YEP 용액이 각 유형의 배양 배지로부터 3 개의 유리병에 첨가된다. 존재하는 광값은 각각의 처리로부터 얻어진 빛으로부터 배경 빛에 따라 조정된다.
5.4.1.4 추출 용액
단순한(SS) 및 복잡한(CS) 추출 용액이 본 실험에 사용된다. 단순한 추출 용액은 증류수에 용해된 소듐 살리실레이트로 이루어지며, 복잡한 추출 용액은 YEP 용액 내의 소듐 살리실레이트로 이루어진다. 이 두 용액은 대략 100mg/l의 소듐 살리실레이트의 최종 농도에 제공된다. CS 내의 YEP은 각각 0.2g/l 및 2g/l의 증류수에서 이스트 추출물 및 폴리펩톤을 나타낸다.
5.4.1.5 광측정
생체 발광은 상술한 바와 같이 광 증식자 튜브를 사용하여 검출되었으며, 수 암페어로 측정되었다[하이쳐(Heitzer)등, 1992, 1994]. 광 출력은 nA/cfu로 나타낸다.
5.4.1.6 개체군 카운트
HK44의 생균 콜로니 형성 단위[viable-cell-colony-forming unit(cfu)]의 수는 캡슐화된 비드에 대하여 결정된다. 캡슐화된 HK44는 0.5M의 소듐 헥사메타인산염과함께 알기네이트 매트릭스에 용해됨에 의하여 자유롭게 되며, 이어서, 인산 완충된 염류에 희석되어 14mg/l의 테트라사이클린을 포함하는 YEPG 플레이트 상에 분포된다. 이 플레이트는 27℃에서 36 내지 60시간 동안 배양되며, 세균성 콜로니들이 카운트된다.
5.4.1.7 HPLC 분석
살리실레이트의 농도는 유도 반응 이전과 이후에 고 성능 액상 크로마토그래피(HPLC)에 의해서 결정된다. 상청액(supernatent)의 2ml 샘플은 HPLC 분석 이전에 알기네이트 비즈의 세포와 잔해를 제거하기 위하여 각 가공 유형에 따라 한 세트의 각 유리병으로부터 제거되어 0.2㎛의 구멍 크기를 갖는 테플론(Teflon) 막 필터를 통하여 필터링된다. HPLC 장치는 LC 250의 이진 펌프[퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 그로톤(Groton), CT], 슈펠코실(Supelcosil) LC-18 칼럼[슈펠코(Supelco), 벨레폰테(Bellefonte), PA] 및 LS-235 광다이오우드 배열 검출기[퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)]로 구성된다. 크로마토그래피 조건은 0.5분에서 8분 사이에 0% 에서 60%의 수성 아세토니트릴로 계속적으로 변화하고, 9분에서 14분 사이에는 60% 에서 100%의 아세토니트릴로 계속적으로 변화한다. 이 프로그램은 100%의 물을 갖는 2분 동안의 컬럼 균형 상태로 종료된다. HPLC 그레이드의 아세토니트릴 및 물이 분석에 사용되었다. 살리실레이트에 대한 자외선(UV) 흡수는 진행 중인 20㎕ 부피의 샘플에 의하여 결정한 후, 255nm의 파장에서 정상값을 검출하였다. 이 농도는 양질의 물에 용해된 소듐 살리실레이트의 주지하는 양으로 작성된 표준 만곡으로부터 계산된다.
5.4.2 결과
데이터는 이 실시예의 3가지 개별적인 반복 중 하나로부터 나온 결과를 나타낸다. 캡슐화된 P.fluorescens HK44는 지하수와 0.1×YEPG에서 배양한 후에 SS 및 CS를 사용하는 유도에 반응하였다. 반응 시간, 생체 발광 크기 및 생존 가능성은 pH와 유도 인자 용액의 합성물에 따라 변화하였다. 6일 동안 5시간 유도시켜 측정하였다. 실험에 따르면, 배양 매질의 pH는 ±0.25 단위 내에서 변동하였다.
5.4.2.1 SS 및 CS를 사용한 유도
유도 인자 용액 내의 나트륨 살리실산염은 lux 유전자를 유도하며 계속해서 광 방사량을 증가시켰다(도 29a 및 도 29b). 유도 인자 중 하나에 대해 6 이하의 pH를 갖는 지하수 내의 세포로부터는 어떤 생체 발광도 측정되지 않았다. 도 29a 및 도 29b에 도시된 다른 배양 조건에서, 대수의 광 레벨은 유도 기간 후 5 시간 내에 특정한 최대 응답을 나타낸다. 광 레벨은 알긴산염/SrCl2비드(bead) 내의 살아있는 세포(cfu)의 수를 기준으로 정규화된다. 광 레벨은 CS 및 SS에서보다 높은 크기의 등급이다.
도 29a에 도시된 SS에 의한 유도에 나타난 바와 같이, 로그 생체 발광은 하루를 제외하고는 pH6의 지하수에 계속 남아있었으며, 광 크기는 2e-6에서 9e-6nA cfu-1사이의 범위이었다. pH7의 지하수 및 0.1×YEPG에서, 최대 광의 크기에서 주기적 패턴이 측정되었다. 예를 들면, 실험의 처음 전반부 동안은 반응이 점차적으로 감소되고 그 이후의 유도시에는 반응이 점진적으로 증가되었다(28일 및 35일).
CS를 사용하여 유도될 때, 별개의 반응이 지하수와 0.1×YEPG에서 측정되었다. 도 29b에 도시된 바와 같이, pH6의 지하수 내의 세포로부터의 광 레벨과 pH7의 지하수 내의 세포로부터의 광 레벨은 전체 유도 일에 걸쳐 대략적으로 안정적이였다. pH6 및 pH7의 지하수에서 측정되는 반응은 0.1×YEPG에서의 반응과 비교하여 패턴이 비교적 거의 유사하였고 계속해서 감소되었다. 그럼에도 불구하고, SS 또는 CS를 사용함으로써, 캡슐화된 HK44는 적어도 35일동안 주기적인 유도를 행하는 능력을 나타낸다.
반응을 위한 지연 시간은 캡슐화된 세포의 생리적 상태의 필수적인 유도 인자로 간주될 수 있다. 이것은 광 레벨이 시간-0 레벨 이상으로 증가되는 시간 간격으로 측정되었다. pH6 및 pH7의 지하수에서, 지연 시간은 처음 3일의 유도동안 동일하게 유지되었고 그 후에 pH7에서 SS를 사용하여 약 1시간 만큼 연장되었다. 그러나, 0.1×YEPG에서는, 지연 시간은 유도 일 전체에 걸쳐 동일하게 유지되었다. 흥미있는 것은 지연 시간이 CS를 사용한 배양 매질과는 무관하게 유도 일 전체에서 동일하였다는 것이다.
5.4.2.2 고정화된 HK44에 의한 살리실산염 흡수
유도 이전과 유도 이후에 살리실산염의 농도는 살리실산염 흡수의 퍼센트를 계산하는 데에 사용되었다. 퍼센트 특성 흡수는 살아있는 세포(cfu)의 수로부터 결정되었다. 이 데이터는 살리실산염이 초기 농도의 50%~60% 만이 사용될 때, 5시간동안 충분히 과도하게 존재한다는 것을 나타낸다(도 30a 및 도 30b). SS의 존재시, pH7의 퍼센트 흡수는 pH6의 지하수와 0.1×YEPG에서와 비교하여 높게 유지되며, 이것은 pH의 병용 효과와 캡슐화된 세포상의 기아(starvation)를 나타낸다. 한편, CS에서는, 1일과 35일을 제외하고 모든 유도에 대해 흡수는 pH6으로 거의 일정하게(거의 20%) 유지되며, 이것은 캡슐화된 세포에 의한 안정된 반응을 표시한다. pH7의 지하수와 0.1×YEPG에서, 순환 패턴은 21일까지는 점차적인 감소로 측정되었고 28일과 35일에는 안정적인 증가로 측정되었다.
5.4.2.3 고정화된 HK44의 생존 가능성
세포 생존 가능성은 YEPG/아가 매질을 포함하는 테트라사이클린(4mg/l)상에 용해된 비드 현탁액의 분취량을 도금하여 결정되었다. 집단 형성 단위의 수는 도 31에 도시되어 있다. 이들 값은 35일 기간동안 0.1×YEPG 및 pH6 및 pH7의 지하수에서 안정적이었다. 이들 값은 6이하의 pH를 갖는 지하수에서는 크게 영향을 미치며 21일의 검출 레벨이하에서는 영향력이 감소되었다. 이들 값은 알려진 바와 같이 28일과 35일에 검출가능하게 되었다.
5.4.4 생체 발광 반응 비율
광 생성물은 30분마다 모니터링되었고 반응 비율은 유도 기간 후 5 시간 내에 전체 분석 시간동안 nA min-1cfu-1로서 계산되었다. 표준화된 광 레벨의 세트는 pH6 및 pH7의 지하수 및 0.1×YEPG에 대해 도 32a 및 도 32b에 표시되어 있다. 광 레벨은 살리실산염의 포화 농도의 존재시 시간 경과에 따라 발광의 선형적 증가를 나타낸다. 그러나, 이 비율의 경향과 크기는 유도 일과 용액에 따라서 다르게 증가한다. 2가지 유도 인자 용액에 대해, 이 비율은 pH6의 지하수에서 유도 일 전체에 걸쳐 증가하고 CS를 사용하는 것다ㄷ보다 SS를 사용하면 더 낮아진다. 1일에는, 세포의 비적응성 때문에 지연된 반응이 발생할 것이다. pH7의 지하수와 0.1×YEPG의 경우에, 반응 경향과 크기는 비교적 유사하다.
광 응답에 대한 후퇴 곡선의 경사도는 각 유도 이벤트에 대해 표 10에 나타나 있다. SS를 사용하여, 1일을 제외하면, pH6의 지하수의 경사도는 동일한 차수의 크기내에서 안정적이었다. 그러나, CS를 사용하면, 경사도의 절대값은 배양시에 증가하는 일수에 따라 증가하였다. SS를 사용하면, pH7의 지하수와 0.1×YEPG에서 경사도 값은 크기가 변동하였다. 유도 인자와는 무관하게, 증가된 경사도 값은 이후의 실험 단계 동안 pH6 및 pH7의 지하수에서 측정되었다.
생체 발광 반응의 변화 비율
시간 배양 매질
유도 인자 (일) pH6 GW pH7 GW 0.1×YEPG
SS 1 1.48e-9(〉0.99) 1.31e-6(0.96) 5.78e-8(0.88)
7 3.94e-7(0.98) 5.84e-8(0.93) 1.24e-7(0.95)
14 8.78e-7(0.98) 1.64e-8(0.90) 4.58e-9(0.84)
21 3.2e-7(0.97) 9e-10(0.93) 1.56e-8(0.1)
28 5.56e-7(0.97) 5.68e-9(0.90) 1.91e-7(0.96)
35 1.01e-6(0.98) 1.87e-7(0.86) 8.84e-8(0.70)
CS 1 1.49e-6(0.96) 5.38e-6(0.93) 8.82e-6(0.01)
7 9.9e-7(0.96) 2.48e-7(0.98) 1.75e-7(0.80)
14 1.55e-6(0.95) 3.44e-7(0.96) 6.51e-8(0.88)
21 1.56e-6(0.91) 7.74e-8(0.98) 1.7e-8(0.37)
28 3.04e-6(0.95) 1.87e-7(0.94) 1.45e-7(0.05)
35 4.52e-6(0.92) 6.98e-7(0.95) 9.33e-8(0.09)
이 값들은 유도 기간후 5 시간 내에 즉정된 광 응답에 대한 선형 곡선의 경사도를 나타낸다. 선형적 적합성 r2는 괄호안에 표시되어 있다. GW 지하수; YEPG 효모 추출/펩톤/포도당 매질 유도 인자 용액; SS 단일 성분 용액, CS 복합 용액.
5.4.3 설명
이 실시예에서는 영양물 제한 조건하에서 캡슐화된 P. fluorescens IIK44의 유도, 측정가능한 광 방사 및 생존에 대한 빠른 반응에 대해 보조적인 증거를 참조하여 측정을 행하였다. 부가적으로, 캡슐화 공정은 그 자체로 장기간의 생물학적 활동에 견뎌낼수 있는 것으로 판명되었다. 이러한 특성은 P.fluorescens HK44를 사용하는 필드 바이오센서의 설계와 적용에 있어서 중요하다.
이러한 연구에서 테스트되는 시뮬레이션된 외부 조건하에서, 세포에는 효과적인 유도와 생존 가능성을 위해 pH6 및 pH7의 지하수를 사용하는 것이 바람직하다는 것은 명백하다. 이것은 세포가 pH6 이하의 지하수에서는, 생체 발광 또는 세포의 생존 가능성 중 하나가 억제되거나 그 둘다가 억제되기 때문에 pH6 이하의 지하수에서는 반응할 수 없으므로, HK44를 직접 사용하는 것에는 잠재적인 제한이 있다는 것을 의미한다. 흥미있는 것은, 실제로 많은 생체 발광 박테리아에서, 루시페라제 활동을 위한 최적 pH는 연구 결과(1989년, Danilov and Iamailov)에 따르면 약산성이다.
이 연구는 장기간의 바이오센서 적용시에 박테리아의 연속적인 유효성과 관련하여 신중하게 언급하고 있다. 측정되는 바와 같이, 생체 발광 반응 비율은 35일간의 기간동안 pH6 및 pH7의 지하수에서 크기와 경향이 상이했다. "차단(cut-off)" 동작 기간이 각 지하수 샘플에 대해 얻어질 수 있으면, 박테리아의 동작 효능은 일정한 시간 프레임에 대해 설정될 수 있고, 이전에 캡슐화된 세포는 시간 프레임의 끝에서 새로운 캡슐화된 세포로 교체될 수 있으며 바이오센서를 연속적으로 동작할 수 있게 한다. 예를 들면, 최근 연구에서, 28일과 14일의 보존 차단 기간은 반응에 기초하여 각각 pH6 및 pH7 GW에 대해 설정된다(표 10, 도 29a 및 29b).
캡슐화는 이러한 형태의 장기간 적용을 돕는 것으로 판명되었으며, 이것은 토양에서 박테리아의 유도 제어를 연구한 Trevors 등(1993년)에 의해 측정되어 있다. 그러나, 여기에는 자유 세포(free cell)를 이용하여 수행된 연구에 기초하여 재료 섭취 또는 생체 발광 반응에 영향을 준다는 것에 대한 언급이 없다. Pseudomonas sp.의 다른 유사한 비교 연구는 생리적 활동에 일반적인 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다(1993년 Shreve와 Vogel).
5.5 실시예 5 -- IC상의 미생물 세포의 고정화 및 캡슐화
IC상에 미생물 유기체를 증착시키는 것은 하기에 설명된 여러가지 프로토콜에 의해 성취될 수 있다. 이러한 캡슐화 방법의 최종적 목표는 다른 환경으로부터의 스트레스를 제한시키는 안정된 미세환경을 제공하는 것이다. ㅋ캐ㅋㅋ캡슐화된 세포는 선택된 방법에 따라서 소정의 두께와 직경을 갖는 시트 또는 비드로 형성될 수 있다. IC상에 세포 증착을 위해 사용되는 작은 영역은 얇은 두께(0.1~2mm) 또는 작은 직경의 비드(〈50㎛)로 제조될 필요가 있다. 그러나, 더 작은 세포 부피를 얻기 위해서 고감도의 IC를 사용할 수도 있다. 약 1×106내지 약 1×108cfu/ml를 포함하는 세포 배양 절차가 통상적으로 진행되고 이들 세포의 약 1 내지 5 g 습식 중량이 캡슐화 프로토콜에 사용될 수 있다.
5.5.1 아가/아가로오스
세포에는 용융된 아가 또는 아가로오스(약 1% 내지 약 5%)가 첨가될 수 있다. 아가 또는 아가로오스가 실내 온도까지 냉각될 때 겔화가 일어난다(1989년 Kanasawud 등).
5.5.2 카라게닌
카라게닌의 2% 용액은 약 70℃에서 약 80℃까지 데워져서 용해되기 시작하여 약 25℃ 에서 약 50℃의 온도로 유지된다. 세포 배양액도 또한 데워져서 카라게닌 용액에 첨가된다. 겔 형성은 차가운 0.1M의 칼륨 클로라이드를 첨가하여 이루어진다(1996년 Cassidy 등).
5.5.3 폴리아크릴아미드
세포는 아크릴아미드(35g)와 BIS(2.4g)의 용액과 혼합된다. 암모늄 퍼슐페이트(Ammonium persulfate)(0.40g/ml 용액 40㎕)와 TEMED(100㎕)가 그후에 중합을 시작하기 위해 첨가된다. 20분 이내에 소정의 두께의 캡슐화된 세포의 시트는 절단될 수 있다. 세포의 작은 비드가 또한 캡슐화된 세포(직경이 약 1mm 내지 약 3mm)의 비드들을 형성하기 위해 아크릴아미드 용액에 주사기로 첨가될 수 있다(1989년 Kanasawud 등; 1992년 Stormo와 Crawford 등).
5.5.4 알긴산
세포에 알긴산의 약 1% 내지 약 8% 용액이 첨가된다. 0.5M 칼슘 클로라이드 또는 0.1M 스트론튬 클로라이드를 첨가하여 중합을 시작한다. 시트, 비드 또는 마이크로비드가 형성될 수 있다(1996년 Cassidy 등).
5.5.5 폴리우레탄/폴리카르보밀, 술폰산염(PCS)
30~50%의 폴리머 함유량의 폴리우레탄 또는 PCS는 1% 칼슘 클로라이드 용액과 혼합된다. pH는 거의 6.5로 조정되고 세포 중량이 부가된다. 이러한 혼합물은 0.75% 칼슘 알긴산에 분사되어 비드가 형성된다.
1시간후에 비드가 제거되고, 세척되어, 세포를 둘러싸는 폴리우레탄/PCS의 층만을 남기고 알긴산 층을 용해시키는 2% 나트륨 트리폴리포스페이트 버퍼에 넣어진다(1992년 Vorlop 등).
5.5.6 폴리비닐 알코올(PVA)
세포 현탁액은 13% PVA, 0.02% 나트륨 알긴산 혼합물과 혼합된다. 포화된 붕산 및 2% 칼슘 클로라이드의 용액과 접촉한 후에, 겔화가 일어난다(1991년 Wu와 Wisecarver)
5.5.7 졸/겔
졸-겔 프로세스는 실내 온도 조건하에서 실리콘 유리를 형성시킨다. 세포는 0.1M Tris-Cl 및 테트라메틸오소실리케이트 (TMOS), 테트라에틸오소실리케이트 (TEOS), 메틸트리메속시실란 (PTMS) 또는, 폴리디메틸실록산(PDMS)과 결합된다. 고형화 시간은 사용되는 농도에 따라 변화한다(약 0.02%에서 약 0.5%까지). 시트, 비드 또는 마이크로비드가 생성될 수 있다(1996년 Armon 등).
5.5.8 생성물의 결합
상기 방법들의 대부분은 결합될 수 있다. 예를 들면, 세포들은 먼저 알긴산, 카라게닌, 아가 또는 아가로오스로 캡슐화될 수 있고, 그 후에 PCS, PVA 또는 졸-겔로 된 더 강한 층으로 다시 캡슐화될 수 있다. 캡슐화층이 또한 생성될 수 있으며; 알긴산 마이크로비드가 졸-겔로 된 층 사이에 "끼워"질 수 있다. 이것은 단일층 단독으로 사용하는 것보다 세포를 더 높은 수준으로 보호할 수 있으며 내부층은 세포에 더욱 적합하도록 유지하면서 외부층을 IC에 더욱 적합하도록 한다.
5.5.9 보정
세포 생존을 돕기 위해 캡슐화 공정 중에 여러가지 보정이 추가될 수 있다. 이러한 보정은 폴리디메틸실록산과 같은 산소 캐리어(1985년 Leonhart 등); 가루로 된 우유 부유물과 같은 영양물 소오스(1996년 Cassidy 등); 점토 입자와 같은 수분 저장기(1996년 Cassidy 등) 및; 빈 껌(bean gum)과 같은 강도와 유연성을 개선시키는 합성물(1996년 Cassidy 등)을 포함한다.
5.6 실시예 6 -- 생체 발광의 유독성 적용
합성물 또는 생체 발광 박테리아상의 합성물의 영향에 기초하여 합성물 또는 주어진 합성물의 유독성을 측정할 수 있는 많은 실험이 개발되었다. 기본적으로, 테스트 박테리아의 생체 발광 신호에서의 감소에 의해 유독성이 나타내어 진다. 상업적으로 이용가능한 실험은 마이크로톡스 및 루미톡스 시스템을 포함한다. 이러한 실험 시스템은 실제로 생체 발광하는 박테리아를 사용한다. 생체 발광하는 박테리아를 사용하는 유독성 실험의 적용예는 표 11에 나타나 있으며, 이 표 11은 사용되는 유기체의 형태와 상업적으로 이용가능하다면, 그 실험의 이름을 포함하고 있다.
5.7 실시예 7 -- 생체 발광 유전자 유독성 실험
합성물이 돌연변이 유발 요인인지 또는 돌연변이 유발성 합성물이 박테리아와 접촉했는지를 판정하기 위해 생체 발광 박테리아를 사용하는 많은 실험이 개발되었다. 이러한 실험은 돌연변이 유발 요인에 의해 발생된 손상된 DNA에 대한 세포의 반응 또는 생체 발광을 가능하게 하는 박테리아성 DNA내의 뚜렷한 변화를 초래하는 예측되는 돌연변이 유발 인자의 특성에 기초한다. 생체 발광 유전자 유독성의 적용 실시예는 표 12에 나타나 있으며, 이 표 12는 유기체의 형태와 사용되는 생체 발광 유전자를 포함하고 있다.
5.8 실시예 8 -- 항균제 스크리닝 방법
본래 생체 발광성이며 생체 발광성이 되도록 처리된 유기체가 유기체의 생존 가능성에 영향을 주는 특성을 가진 합성물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 기본적으로, 이러한 실험에서, 생체 발광은 살균성 활동에 역비례할 것이다. 생체 발광성 항균 스크리닝 실험의 적용 실시예는 표 13에 나타나 있으며, 이 표 13은 사용되는 유기체의 형태와 생체 발광 유전자(사용가능하다면)를 포함하고 있다.
생체발광의 독성 적용
테스트 유기체 Lux 유전자 분석물 적용 참조
P,phosphoreum 적용 불가능 마이크로톡스(Microtox) 시스템은 방오 작용제로서 트리뷰테닐틴(tributenyltin) 화합물이 티리뷰틸틴(tributyltin) 화합물보다 독성이 덜 약한지를 구분하기 위해 사용될 수 있다. 둘리(Dooly)와 테스터(Testa), 1989
P,phosphoreum 마이크로톡스 시스템은 토양에서 살충제가 그들의 분해 산물보다 독성이 더 강한지 약한지를 결정하는데 사용될 수 있다. 소마수다람(Somasudaram) et al.,1990
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 디트로이트 강의 퇴적물 틈간의 수질 오염의 파괴 정도를 측정하는데 사용될 수 있다. 기에시(Giesy) et al., 1988
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 페놀 화합물이 오염된 수질 처리제로 사용될 때 파괴 산물의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 헥(Heck) et al., 1992
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 트리니트로톨륨, 다이미노톨륨 및 다이니트로메탈리늄 혼합물의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 한켄슨(Hankenson) 및 샤퍼(Shaeffer), 1991
P,phosphoreum 루미톡스(Lumitox) 분석물은 스페인의 살만카에 토메스 강으로의 유출량을 검사하고 그 강에서 생체발광이 충돌로 감소되는 것을 바로잡기 위해 사용될 수 있다. 퍼난데즈(Fernandez) et al., 1995
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 사이노박테리아의 개화(bloom)를 검출하는데 생체발광의 유용성 및 연관된 헥파토톡신(마이크로시스틴)을 검사하는데 사용될 수 있다. 로슨(Lawton) et al., 1990
V.harveyi 적용 불가능 분석물은 토양과 산(酸)이 있는 것과 없는 것으로 추출물을 나누어 생체에 해로운 화학 물질을 검출하는데 사용될 수 있다. 토물카(Thomulka) 및 란지(Lange), 1995
V.harveyi 마이크로톡스 분석물은 두 개의 유기 화합물 및 니트로벤젠과 트리니트로벤젠의 조합 또는 혼합 독성을 평가하는데 사용될 수 있다. 토물카(Thomulka) 및 란지(Lange), 1997
V.fischeri 마이크로톡스 분석물은 두 곳의 케사스픽 베이 지류의 순수한 물에서 포인트 및 넌포인트 오염의 충돌을 측정하는데 사용될 수 있다. 카루피아(Karuppiah) 및 란지(Lange), 1997
V.fischeri 마이크로톡스 분석물은 메탈알코올 독성으로 인한 강 및 늪지대의 퇴적물의 영향을 측정하는데 사용될 수 있다. 카루피아(Karuppiah) et al., 1997
p,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 페트로늄 하이드로카본의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 에이스맨(Eisman) et al., 1991
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 지하수에 유기체를 파괴하는 울트라필트라션(ultrafitration)의 영향을 측정하는데 사용될 수 있다. 미도우(Middaugh) et al., 1991
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 해양의 계면활성제의 독성을 테스트하는데 사용될 수 있다. 포렘바(Poremba) et al., 1991
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 Euphorbia splendens 유액의 독성을 테스트하는데 사용될 수 있다. 샬(Schall) et al., 1991
P,phosphoreum 마이크로톡스 시스템은 Gonyaulax polyedra의 "적조" 현상에서 뉴로톡신과 같은 마비성 갑각류의 독성이 존재하는지 테스트하는데 사용될 수 있다. 브루노(Bruno) et al., 1990
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 위콘신 강 상류에서 물고기의 맛을 부패시키는 티오-및 알키페놀(alkyphenols)의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 헤일(Heil) 및 린드세이(Lindsay) et al., 1989
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 음료수에 오존분해 부산물의 독성을 테스트하는데 사용될 수 있다. 클로우(Chou) 및 큐 히(Que Hee) et al., 1992
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 나무 방건제에서 발견되는 유기 화합물 및 소정의 금속에 대한 생체학적 영향을 측정하는데 사용될 수 있다. 웬트(Wendt) et al., 1996
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 4-클로로-2-메틸페녹시아세틱산(methylphenoxyacetic acid)의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 비마라(Vimara) et al., 1996
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 소라강 부근에서 추출한 수질 표본의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 필리픽(Filipic) et al., 1995
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 오타호수(남이탈리아) 퇴적물의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 구젤라(Guzzella) et al., 1996
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 아줄렌(azulene) 및 롱기폴린(longifolene)의 치명적인 영향을 측정하는데 사용 될 수 있다 스위트(Sweet) 및 메이어(Meier), 1997
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 석탄 가스화 수질에 처리된 과립형의 활성화된 탄소의 독성을 측정하는데 사용될 수 있다. 마키노(Makino) et al., 1986
P,phosphoreum 마이크로톡스 분석물은 구리 복합체를 유기 화합물로 할당하는데 사용될 수 있다. 모렐(Morel) et al., 1988
제노톡식서티(GENOTOXICITY) 분석물
테스트 유기체 Lux 유전제 적용 참조
Photobacterium phosphoreum(알수 없는 변형) 적용 불가능 P,phosphoreum의 알수 없는 변형은 무타톡스(Mutatox)라는 이름으로 마이크로빅 코포레이션에서 마케팅된다. 이 시스템은박테리아를 의심스런 무타겐에 노출시킴으로써 제오톡시서티(genotoxicity)를 모니터하고 만약 생체발광에 환원유전이 일어난다면 그 화합물은 가능한 무타겐이라 제시한다. 선(Sun)과 스타(Stahr),1992
E.coli 프로파지 형태에서 발광효소를 발현하기 위해 박테리오파지 λ로 주입된 개똥벌레 발광효소 박테리오파지 λ는 용원성(溶原性)인 균주를 형성하는 E.coli의 염색체로 통합된다. 생체발광은 의심되는 무타겐의 출현을 지시하는데, 무타겐이 프로파지 λ에 감응(感應)하는 특징을 가지고 있기 때문이다. 또한 이 분석물이 발공소를 오직 외인성으로 추가시켜야만 하는 발광효소를 사용하기 때문이다. 리(Lee) et al.,1992
E.coli 프로파지 형태에서 발광효소를 발현하기 위해 박테리오파지 λ로 주입되는 V.fischerii의 luxAB 분석물은 발광효소용 기질(基質)이 n-디케널(decanal)이라는 것을 제외하고 이상과 같다. 밀라드(Millard) et al., 1996
향균성 작용제 구분
테스트 유기체 Lux 유전자 적용 참조
Mycobacteriumluberculosis 셔틀 벡터 pMV261상에 열 충격 프로모터 앞에서 복제된 개똥벌레 발광효소 균주는 다양한 향균성 작용제의 영향을 조사하는데 사용된다. 분석물은 세포가 용해되었을 때 in vitro를 수행하며 발광소 기질이 첨가된다. 그러나, 발광소는 전세포에 첨가될 수 있다. 쿡세이(Cooksey) et al., 1993
Mycobacteriumsmegmatis 셔틀 벡터 pMV261상에 열 충격 프로모터 앞에서 복제된 V.harveyi의 luxAB 균주는 향균성 작용제의 효과를 구분하는 신속한 방법으로 사용된다. 분석물은 전세포에 사용되지만 추가적로 알데히드 기질을 필요로 한다. 앤드류(Andrew) 및 로버트(Roberts), 1993
Listeriamonocytogenes 발현 플라시미드에서 복제된 V.fischerii의 luxAB 분석물은 세포내에서 소화하는 병원체 L.monocytogenes에 대한 생체 파괴제로 페로신젠(peroxygen)의 살균성 효과를 평가하는데 사용된다. 워커(Walker) et al., 1993
Listeriamonocytogenes 발현 플라시미드에서 복제된 V.fischerii의 luxAB 분석불은 세포내에서 소화하는 병원체 L.monocytogenes 상에서 페놀 및 클로로헥시딘의 생명 파괴성 영향을 검사하는데 사용된다. 워커(Walker) et al., 1992
Photobacteriumphoshoreum 적용 불가능 분석불은 음압의 정도와 기간을 변화시키면서 생체발광을 검사함으로써 박테리아의 청각 에너지 및 케비테이션 이용 효과를 조사하는데 사용된다. 다른 예로 충치를 막는데 이용되기도 한다. 맥인너스(McInnes) et al., 1990
E.coli 및 B.subtilis pyrophorus plagtophthalamus의 발광효소 유전자 분석물은 혈청 보완제의멤브라놀리틱(membranolytic) 활동도를 측정하는 데 사용된다. 비타(Virta) et al., 1997
5.9 실례 9 - 생체발광 분석물을 이용한 오염 물질 검출
미생물 대사 작용의 공통된 특징은 환경에서 화합물을 인지하는 특성과, 대사 산물을 이용하기 위해 필요로 하는 유전자의 발현을 자극하는 특성 및 이어서 대사 산물이 더이상 존재하지 않으면 이들 유전자를 억제하는 특성을 포함한다. 그 대표적 예가 lac 오페론이다. lac 오페론 프로모터는 당 원소의 존재 또는 락토우스의 부재로 억제된다. 그러나, 당 원소가 이용되지 않을 때 락토우스가 존재한다면, lac 오페론은 크게 발현한다. 당 원소의 레벨이 충분하던지 락토우스가 없을 때에는, lac 오페론은 다시 억제된다.
미생물은 다양한 화합물을 물질 대사로 변화시키는 특징을 가지고 있다. 소정의 박테리아는 인간에게 해롭고 오염 물질이라고 간주되는 화합물을 물질 대사로 변화시키는 특성을 가지고 있다. 오염 물질 대사 작용이 가능한 유전자의 발현은 lac 오페론의 발현과 유사하다. 어떤 박테리아는 환경에서 오염 물질이 존재하는 것을 인지할 수 있고, 오염 물질 대사 작용에 필요한 유전자를 자극하고, 오염 물질이 더이상 존재하지 않으면 상기 유전자를 억제할 수 있다. 단일 유전자 및 복수의 유전자를 효과적으로 결합함으로써 오염 물질 대사 작용 유전자 및 오페론의 프로모터에 생체발광을 제공한다. 그러한 이용에 대한 여러가지 예가 유기체, lux 유전자, 효과적으로 결합된 lux 유전자의 프로모터를 포함하는 표 14에 제시된다.
5.10 실례 - 생체발광 산소 센서
산소 분자에 반응하여 발광하는 Photobacterium의 특성은 낮게 분해되는 산소 농도를 모니터하는데 사용된다(로이드(Lloyd) et al, 1981). 기타 예는 표 15에 제시된다.
오염 물질 검출 : 방향족 화합물 및 압력 지표종
테스트 유기체 Lux 유전자 적용 참조
P.fluorescens HK44 nah-luxCDABC(V,fischerii) 어느정도 정량적으로 나플탈렌 농도를 결정할 수 있는 균주는 또한 온라인 광학 생체센서에 사용되어 센서를 지나 흐르는 물에서 나플탈렌의 출현을 측정하기한다. 킹(King) et al., 1990헤이저(Heizer) et al., 1992;1994
P.putida B2 pUCD615의 프로모터가없는 생체발광 유전자 앞에서 복제된 tod 프로모터 균주는 JP4 젯트 연료의 수질에 용해 가능한 구성요소 뿐만 아니라 수질 표본에서 톨루엔을 검출한다. 균주는 상이한 부피 생체리엑터에서 TCE 분해를 온라인으로 모니터하는데 사용된다. 애플리게이트(Applegate) et al., 1997
E.coli V,fischerii의 luxCDABE pUCD615으로 결합된 두 개의 열 충격 프로모터 dnaK 및 grpE 갖가지 에타놀 및 펜타클로로페놀을 포함한 환경적 상해를 치료하는 균주는 열 충격 반응의 감응 작용과 서로 관련된 생체발광에서 증가분을 나타낸다. 반다이크(VanDyk) et al, 1994
E.coli V,fischerii의 luxCDABE pUCD615으로 결합된 두 개의 열 충격 프로모터 dnaK 및 grpE E.coli 균주는 오염된 수질 생체가공 식물의 영향종에서 오염 물질의 독성 레벨을 검출하는 어얼리 워닝 시스템(early warning system)으로 역할하기 위해 소형의 생체리액터로 이용되는 분석된 grp E-lux 결합에 잠복한다. 구(Gu) er al, 1996
E.coli 프로모터가 없는 V,fischeri luxCDABE에 결합된 수은 레지스턴스 오페론 생체센서는 오염된 수질에서 생체 이용률 무기성 수은을 어느 정도 정량적으로 검출하는데 사용된다. 셀리포노바(Selifonova) et al,1993
E.coli 질산염 환원 효소 (narG) 프로모터에 결합된 Photorhabdus luminescens의 생체발광 오페론 분석물은 질산염의 존재를 검출하는데 사용된다. 프레스트(Prest) et al,1997
5.11 실례 - 유카로틱(EUKARYOTIC) 리포터 내에서 생체발광
발광효소 및 녹색 형광성의 단백질은 유카로틱 시스템에서 리포터로서 광범위하게 사용된다. 포유류 세포 라인에서 발광효소 유전자의 사용 실례는 사용된 세포 라인의 이름, 사용되는 프로모터 및 생체발광, 적용에 대한 상세한 설명을 포함하는 표 16에 나타난다.
5.12 실례 - OASIC으로써 생체발광 신호를 측정
Pseudomonas fluorescens HK44는 나플탈렌 또는 살리실레이트(salicylate)에 노출되었을 때 청녹색의 빛을 발생한다. 생체발광용 유전자는 살리실레이트 하이드로엑스와이레이저(hydroxylase) 유전자의 프로모터, nahG 사이 및 나플탈렌-분해 경로와 Vibrio fisheri의 프로모토가 없는 luxCDABC 유전자 카세트 사이에서 전사 결합을 수행하는 플라시미드에 위치한다(킹(King) et al,1990). 프로모터가 없는 lux 오페론 및 활동은 다른 문헌에 설명되었다(쇼(Shaw) et al,1988).
Pseudomonas fluorescens HK44의 배양균으로 된 현미경 슬라이드는 OASIC 위에 장착된다. 결과 장치는 나플탈렌에 노출되었고 출력 전압은 시간을 지나 측정되었다(도 2).
산소 센서
테스트 세포 Lux 유전자 적용 참조
P,phosphoreum 적용 불가능 P,phosphoreum은 생체학적 산소 요구량(BOD)에 관한 센서로 이 분석물에 사용된다. BOD는 생체발광의 증가로 의해 측정된다. 테스트용 물에서 유기적 분자가 물질 대사를 수행함으로 감소된 산물은 생체발광을 증가시키는 생체발광 반작용으로 전환된다. 휸(Hyun) et al., 1993
P,phosphoreum 적용 불가능 P,phosphoreum은 산소 농도의 온라인 제어기로써 이 분석물에 사용된다. 박테리아의 산소 센서는 적절하게 분해된 산소 농도를 제어하는데 사용되어 Klebsiella penumoniae 내에 최대의 C2H2감소 활동을 산출한다. 카바냐(Kavanagh) 및 힐(Hill), 1990
유카로틱 리포터
테스트 세포 Lux 유전자 적용 참조
인간의 간암 세포 라인 CYP1A1-luc(개똥벌레) 유전자 결합 구성은 P450 반응을 추출할 독성 화합물이 개똥벌레 발광효소를 대신해 발현하는 것과 같이 유전공학적으로 처리된다. 본 방법은 전세포 분석물이 발달될 수 있음에도 불구하고 활동성을 측정하기 위해 추가의 외인성(外因性) 발광소 뿐만 아니라 세포의 용해도 수반한다. 앤더슨(Anderson) et al., 1995
인간의 간암 세포 라인 Hep3B luc와 결합된 epo 프로모터 서열 생체발광은 에이리트로포테인(erythropoitein) 유전자의 감응을 모니터하는데 사용된다. 굽타(Gupta) 및 골드와세(Goldwasser), 1996
힐러(HeLa)세포 티미딘 키나아제와 결합된 발광효소 힐러 세포는 발현 벡테 HEG0 및 Vit.A2 ERE에 잠복하는 발광효소 리포터 프라시미드와 함께 분리된 핵산을 체포로 감염시킨다. 앤티에스트로겐은 전사 활동을 막기 위해 설계되고 테스트되어 발견된다. 비버거(Biberger). 폰앵거러(Von-Angerer), 1996
쥐의 파이브로블래스트(fibroblast)3T3 세포 발광효소로 결합된 두 개의 서브유닛 R1, R2에 대한 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide) 환원효소 리포터 구성체는 쥐의 파이브로블래스 세포로 형성되는 R1 및 R2 프로모터 발광효소 구성체를 사용한다. R1 luc는 3-겹의 감응을 보여주고 R2 luc 10-겹의 감응은 1 회 분량에 좌우되는 방식으로 UV 빛에 노출됨에 따라 증가한다. 필라토브(Filatov) et al., 1996
에스트로겐 양성 리포터 유방암 세포 라인 개똥벌레 발광효소와 결합된 티미딘 키나아제를 함유하는 리포터 플라시미드 발광효소 리포터는 에스트로겐 및 앤티에스트로겐의 성질을 구분하는데 사용된다. 폰즈(Pons)et al., 1990
힐러 세포 Gal-4 프로모터로써 조절되는 개똥벌레 발광효소 Ga14 효모 단백질의 범위를 구속하는 DNA 및 다양한 스테로이드 수용기의 범위를구속하는 호르몬을 포함하는 가상의 단백질은 스테로이드 호르몬의 생체학적 활동을 테스트하기 위해 Gal-4-발광효소 구성체를 포함하는 세포 라인에 위치한다. 요슨-로프레다(Jausons-Loffreda) et al., 1994
5.13 실례13 - 새로운 종류의 전세포 생체센서, BBICs 형성
BBIC는 전세포 생체센서의 발달 과정에서 IC와 인터페이스하는 유전적으로 강화된 생체리포트 조직으로 구성된 새로운 혁신을 나타낸다. 생체리포터는 목표 물질과 마주쳤을 때 발광하도록 유전공학적으로 처리되고, 이 발광을 검출하도록 설계된 회로를 구비하여 신호를 처리하며 결과를 통신한다. 그러므로 회로 설계자는 살아있는 개체임에도 불구하고 생체리포터를, 트랜지스터 또는 레지스터에 아날로그적인 또다른 구성 요소로서 사용할 수 있다.
생체센서는 분석적으로 측정하는 요소를 갖춘 생체학적 센서 구성요소를 조합하는 하이브리드 장치이다. 생체학적 구성요소는 통상적으로 전자, 광학 또는 기계적 변환기로써 정량화될 수 있는 반응을 생산하기 위해 흥미적인 분석물로 반응 및/또는 상호작용한다. 가장 평이한 구성은 효소 또는 생체학적 구성요소와 같은 앤티바이오딕과 같은 고정시킨 거대 분자를 사용하며, 덜 평이한 다른 접근 방식은 생체학적 성분으로 살아있는 거대기관 또는 기관의 섹터 또는 조직을 사용한다. 원래, 이러한 생체센서들은 때때로 성장하는 세포들(부엑(Buerk), 1993)의 활동을 검출하는 전기화학적 변환기로 이용되는 단세포 생체센서(보우세(Bousse), 1996)를 의미한다. 단세포 센서는 제어된 환경에서 목표 분석물과 다른 영양물에서 성장으로 인한 인터페이스 때문에 폭넓지는 않지만 크게 적용된다.
대안적으로, 분자-생체학적 기술은 휠씬 넓은 선택도를 지닌 세포 또는 생체리포터 균주를 생산하기 위해 이용된다. 통상적으로, 특정한 프로모터 서열에 대한 코드인 DNA 서열은 리포터 효소에 대한 유전자 코드로 결합되어 숙주 세포에 적용된다. 그러므로, 유전자 조절(오히려 미생물 성장의 결과로 인해)로 선택도가 제공된다.
주로 사용되는 리포터 효소에는 유전자 lacZ에 의해 인코드되는 β갈락토시다아제 및 유전자 xylE에 의해 인코드되는 카테콜-2 및 3-다이옥제나아제를 포함된다. 이 시스템은 모두 신호를 생산하기 위해 세포 파괴를 요구하는 열량 측정 검출 방법을 이용한다. 지난 10여년 동안, 생체발광의 생체리포터는 생체발광적 반응이 쉽게 검출되고 분석물이 세포를 파과하지 않으므로 좋은 인상을 주고 있다.
따라서, 생체리포터는 실시간 연속적으로 모니터될 수 있다. 생체이용률 및 오염 물질 생체분해의 기능적 과정을 평가하기 위해서, 진핵 세포 및 원핵 세포의 생체발광 효소를 이용하여 유전공학적으로 처리된 생체발광 생체리포터는 물 및 토양에 있는 독소 및 오염 물질을 검출하기 위해서 개발되어 왔다.
생체리포터 생체발광은 광전자 증배관, 광다이오드, 마이크로채널 플레이트, 사진 필름 및 전하 결합 디바이스를 포함하는 다수의 상이한 형태의 광변환기에 의해서 검출되어 왔다. 이들 여러 애플리케이션에서, 빛은 집광되고, 렌즈, 광섬유 케이블 또는 액체 광유도관(liquid light guide)을 이용하여 광변환기로 전달된다. 그러나, 작은 체적과 원격 검출 또는 복수의 평행 감지를 요구하는 애플리케이션은 작고 이식 가능한, 그러나 여전히 고감도를 유지할 수 있는 새로운 형태의 수단을 요구한다.
본 발명에서 설명되는 생체발광 생체리포터 IC(bioluminescent-bioreporter IC : BBIC) 바이오센서는 전송 소자의 필요성과, 큰 규모의 검출 장치가 낮은 레벨의 생체발광을 검출, 처리 및 보고하기 위해서 특별히 설계된 IC에 생체발광 생체리포터를 직접적으로 결합해야 하는 필요성을 제거할 수 있는 신규의 방법을 제시한다. 바이오센서는 환경, 의학, 약학 및 산업에 관한 정보를 제공하기 위해서 저렴하게 비싸지 않게 생산될 수 있다.
5.13.1 BBIC
특정한 물질하에서 생체발광하는 유전공학적으로 처리된 전세포의 생체리포터는 빛을 검출하고 이의 신호를 처리하여 결과를 보고하기 위해서 설계된 IC상에 배치된다. 이러한 경우에서, 생체리포터는 상기 IC 설계자가 이용할 수 있는 (트랜지스터, 레지스터 또는 캐패시터와 유사한) 또 하나의 구성 요소로서 간주될 수 있다. 이러한 방법의 주된 이점은 모든 신호 처리 및 통신 기능을 포함하는 완전한 센서가 값비싸지 않고 튼튼한 단일 칩의 저전력 디바이스로서 생산될 수 있다는 것이다. 다른 변환기는 단지 빛을 검출하므로 완전한 시스템을 만들기 위해서 다른 구성 요소를 필요로 하지만, 상기 IC는 완전한 독립 센서를 만들기 위해서 필요로 되는 아날로그, 디지털 및 무선 주파수(RF) 회로 기능을 제공한다. 또한, 비싸지 않고 IC 제작이 용이함으로써, 특정 애플리케이션에 맞게 개별적으로 제작될 수 있다. 따라서, 전체적 위치 감지(global-position sensing : GPS)과 같은 특정 기능은 배포된 감지 애플리케이션용으로 설계된 BBIC에 포함될 수 있다.
BBIC의 성공적인 개발을 위해서는 목표된 물질에 반응하는 유전공학적으로 처리된 생체리포터와, 그 생체리포터를 상기 IC에 부착하기 위한 고정화 및/또는 캡슐화(encapsulation) 절차와, 생체내성(bioresistant) 및 생체적합성(biocompatible) IC 코팅과, 원하는 기능을 수행하도록 설계된 IC를 필요로 한다.
5.13.2 생체발광 생체리포터
미생물은 깊은 바다의 열수 분출구(hydrothermal vent), 영하의 북극 해수, 고염분을 함유한 용액(hypersaline solution), 유기 용매(organic solvent)로 포화된 물, 오염된 토양 및 산업 폐기물 등의 다양한 환경에 존재한다. 그러한 열악한 환경에서도 생존할 수 있는 유기체의 능력은 변화하는 환경 조건을 감지하고 조절할 수 있는 능력과 관련된다. 따라서, 생체리포터 균주의 성공적인 발생을 위해서는, 첫째로, 실험적 환경에서 쉽게 잔존할 수 있는 유기체를 선택해야 한다. 둘째로, 그 유기체는 적합한 유전자 조절 시스템 가져야 하거나, 유전공학적 기술을 통해 그러한 시스템을 받아들일 수 있는 능력이 있어야 한다. 셋째로, 생체발광 유전자는 본질적인 세포 기능에 역효과 없이 유기체의 유전자 시스템으로 통합되어야 한다. 미생물은 거의 모든 형태의 환경에서 존재하고, 유전공학적 조작이 매우 용이하며, 다양한 유전자 조절 시스템 세트를 가지기 때문에 매우 훌륭한 후보자이다.
많은 종류의 곤충, 물고기, 오징어, 젤라틴 해수(gelatinous sea animal),진균류, 디노플라젤레이트(dinoflagellate), 원생 동물 및 박테리아는 빛을 생산하는 능력을 갖는다. 생체발광에 관한 분자 생물학은 다수의 상이한 경로를 따라 전개되어 왔으며, 대분분의 공통적인 생체발광 시스템은 루시페라제(luciferase) 효소를 이용하여 루시페린(luciferin)이란 기질을 산화시킨다. 이러한 반응은 보통 산소 분자를 필요로 한다.
원핵 생물에서, lux로 불리는 유전자 시스템은 두개의 상이한 서브유닛으로 이루어지고 유전자 luxA 및 luxB에 의해 엔코드된 루시페라제를 포함하는데, 이 루시페라제는 긴 사슬의 지방 알데히드를 대응하는 지방산으로 산화시키며, 그 결과 490nm 대의 청록광을 방출한다(Tu와 Mager, 1995; Meighen, 1991; O'Kane와 Prasher, 1992). 또한, 유전자 시스템은 3개의 단백질[luxC에 의해 엔코드된 리덕타아제, luxD에 의해 엔코드된 트란스페라제(transferase), luxE에 의해 엔코드된 신세타제(synthetase)]로 이루어진 멀티효소 지방산 리덕타아제(reductase)를 포함하는데, 이는 지방산을 알데히드 기질로 전환하여 재순환시킨다. 유전자는 luxCDABE로 표시되는 단일 오페론(operon)에 포함된다. 이러한 유전자 구성은 완전한 lux-유전자 카세트(cassette)가 생체발광을 이용한 유전자 발현의 모니터를 가능하게 하는 리포터 유전자로서 다른 프로모터(promoter)의 하류에 삽입되도록 한다. luxAB 유전자를 포함하는 생체리포터는 다만 유전자 발현을 모니터하기 위해서 사용되어 왔으나(Chatterjee와 Meighen, 1995; Hill와 Stewart, 1994), 멀티효소 지방산 리덕타아제가 존재하지 않기 때문에 알데히드 기질[통상 n-데캐널(decanal)]은 생체발광(예컨데, 효소 활성)을 판정하기 위해서 외인적으로(exogenously) 첨가되어야만 한다.
진핵 세포의 루시페라제 유전자는 클론되어져 왔고, 리포터 유전자로서 박테리아에서 이용되어 왔는데, 주로 개똥벌래 루시페라제(lux)는 560nm대의 빛을 생산하며, 방아벌레무리 루시페라제(luxOR)는 595nm대의 빛을 생산한다(Cebolla 외, 1995; Hastings, 1996). 단일 세포내에서 방아벌레무리 시스템과 개똥벌레 시스템을 이용한 다중 시스템이 제안되어 왔다(Wood와 Gruber, 1996): 이론적으로, 한가지 색의 빛을 생산하는 하나의 효소가 프로모터의 제어하에 놓일 것이고, 다른 효소는 조절되지 않거나, 즉 구성적으로 전환되고, 일반적인 생리적 변화, 생체발광 세포의 농도 변동 및 환경 파라미터의 변화에 대해서 보정하기 위한 제어 신호로서 이용될 것이다.
발생된 생체발광 신호가 선택적 및 양적 방식에 있어서 가장 바람직하게 목표 물질의 농도에 직접적으로 관련된다는 가정이 BBIC의 생체리포터 균주의 사용에 있어서 내재되어 있다. 일반적으로, lux 리포터 유전자는 원시 플라스미드, 브로드-호스트-레인지 플라스미드에 보존되거나 염색체적으로 호스트 균주에 통합된 유도될 수 있는 오페론의 조절 제어하에 놓인다. 이러한 유전자 시스템에서, 목표 분석 또는 그의 분해 산물은 생체발광 유전자의 유도 인자로서 활동하며, 선택성 및 결과로서 생기는 반응을 책임진다. 예를 들면, Pseudomonas Fouorescens HK44는 나프탈린의 존재하에서 빛을 생산하는 생체리포터이다. 이러한 균주는 NahR, LysR형 단백질에 의해서 조절되는 두개의 유전자 오페론을 갖는다. 두개의 오페론 중에 하나는 lux 생체발광 유전자를 포함하고, 다른 하나는 나프탈렌의 살리실산, 즉 나프탈렌 분해의 대사 중간물로의 분해를 책임지는 유전자를 포함한다. 상기 두개의 오페론은 살리실산이 조절 단백질 NahR과 상호 작용할 때 유도된다. 그러므로, 나프탈렌이나 살리실산 중에 어느 한쪽에 HK44가 노출되면 유전자 발현이 증가되고 생체발광은 감소된다. P. Fouorescens HK44의 연속적인 배양에 대한 연구는 생체발광 반응의 크기가 펄스형 섭동 조건하에서 나프탈렌의 수상(aqueous-phase) 농도와 상호 관계를 갖고 있음을 증명한다(King 외, 1990). 생체발광의 분석 평가는 나프탈렌(또는 존재한면,살리실산) 생체이용률에 대한 평가를 위해 발전되어 왔다(Heitzer 외, 1992). 성장 세포 배양을 이용하여, 2개 종류의 크기의 농도 범위에 걸쳐 나프탈렌과 살리실산에 대한 생체발광과의 선형 관계를 알 수 있었다[나프탈렌에 대해서 0.990 및 살리실산에 대해서 0.991의 상관 계수(r2)]. 재생 가능한 생체발광은 수성 나프탈렌 샘플에서 뿐만아니라 나프탈렌과 스파이크된 토양 현탁액(soil-slurry) 샘플, 복합 토양 삼출액 및 제트 연료의 물 용해(water-soluble) 성분에서도 관찰될 수 있었다. P. Fouorescens HK44는 오염 물질의 존재에 대한 양적인 분석이나 생체이용률 측정을 위한 환경적 이용에 적용될 수 있다. 그러나, 그러한 적용에 대해서, 자연 환경의 화학적 복잡성과 유기체의 생리적 조건은 생체발광 반응을 해석함에 있어서 고려되어야만 한다. 톨루엔(toluene) (Applegate 외, 1997)과 이소프로필벤젠(isopropylbenzene) (Selifonova와 Eaton, 1996)을 포함하는 다른 오염 물질의 존재, 생체이용률 및 생체분해를 감지하는 빛 방출 생체리포터 박테리아 균주를 개발하기 위해서 여러 형태의 생체발광 (lux) 전사 유전자 융합이 이용되어 왔다. 유도될 수 있는 중금속 해독 및 내성 시스템[수은을 포함(Selifonova 외, 1993)]과 열충격(heat-shock)(Van Dyk 외, 1994) 및 산화 스트레스(oxidative stress)에의 반응에 대한 유사한 유전적 방법이 보고되었다. 또한, 항균성 약품(antimicrobial agent)의 효능(감소된 빛은 더 큰 효능과 같음)을 검사하기 위해서 유전공학적으로 처리된 그램-포지티브(Gram-positive) 생체리포터가 이용되어 왔다(Andrew와 Roverts, 1993; Cooksey 외, 1993). 또한, 독성 화합물(Anderson 외, 1995; Gupta와 Goldwasser, 1996), 산소(Filatov 외, 1996), 및 발정성(oestrogenic) 및 항발정성(antiestrogenic) 화합물(Pons 외, 1990)을 검출하기 위해서 진핵 세포 생체리포터가 생성되었다. 생체발광 측정을 포함하는 환경적 적용은 재고되었다(Steinberg와 Poziomek, 1995).
5.13.3 생체리포터 포착(entrapment)
IC의 광감지 부분이나 그 근처에 미생물 세포를 포착하기 위한 다양한 방법이 있다. 예를 들면, 삼투막(porous membrane) 뒤에나 천연 또는 합성 폴리머(polymer)에 세포를 쉽게 포착할 수 있다(cassidy 외, 1996). 중합 매트릭스(polymeric matrix)는 활동 및 성장에 필요한 영양물 및 보조인자(cofactor)를 포함하는 수산화된(hydrated) 환경을 제공할 수 있다. 또한, 캡슐화된 세포는 그 환경에서 독성 물질로부터 보호되며, 증가된 플라스미드 안정성을 유지한다(Cassidy 외, 1996). IC상에서 이용할 수 있게 작은 표면 영역에 적합하도록 세포를 박막 또는 작은 직경의 비드(bead)에 캡슐화할 수 있다. 액체 폴리머의 세포를 혼합하여 박막을 형성하여, 얇은 층으로 IC상에 마이크로핏펫화되고, 중합된다; 가상적으로 어떤 원하는 두께로 필름을 슬라이스하여 IC에 부착함으로써 더 큰 블록의 세포가 생성될 수 있다. 마이크로비드는 액체 폴리머 세포 혼합물을 네불리저(nebulizer)를 통해 중합 에이젼트(polymerzing agent)로 뿌리므로써 생성된다. 다음의 캡슐화 프로토콜은 IC 적용에 있어서 유용함을 보여준다.
아가/아가로제(agar/agarose): 세포를 용해된 아가 또는 아가로제(1-5%)에 첨가할 수 있다. 아가 또는 아가로제가 룸 온도로 식어감으로써 겔화(gelation)된다(Kanasawud 외, 1989).
카라게닌(carrageenan): 2%의 카라게닌 용액이 70-80C로 되면 용해되기 시작하여 35-50C를 유지한다. 세포 배양은 또한 따뜻해지고 카라게닌 용액에 첨가된다. 차가운 0.1M 염화칼륨(potassium chloride)을 첨가함으로써 켈이 형성된다(Cassidy 외, 1996).
알기네이트(alginate): 세포를 1-8% 알기네이트 용액에 첨가한다; 0.5M 염화칼슘(calcium chloride) 또는 0.1M 염화스트론튬(stontium chloride)의 첨가는 중합화를 유발한다(Cassidy 외, 1996). 이러한 방법을 이용하여 액체 광유도관의 종단에 생체발광 생체리포터 P. Fouorescens HK44를 고정해 왔다(Heitzer 외, 1994).
폴리우래탄-폴리카르보닐 술포네이트(polyurethane-polycarbomyl sulfonate:PCS): 30-50%의 폴리머 내용물의 폴리우래탄 또는 PCS를 1% 염화칼슘 용액과 혼합하여, pH가 대략 6.5가 되도록 조절하고, 세포 덩어리를 첨가한다. 이 혼합물을 0.75% 칼슘 알기네이트에 뿌리므로써 비드가 형성된다. 한 시간 후에, 비드를 이전하여 세척한 후 소듐-트리폴리포스페이트(sodium-tripolyphosphate) 버퍼에 넣으면, 알기네이트층은 용해되고 단지 세포를 둘러싼 폴리우레탄-PCS층만 남는다(Kanasawud 외, 1989).
폴리아크릴아미드(polyacrylamide): 세포를 아크릴아미드와 비스아크릴아미드 용액에 혼합한다. 과황산암모늄(ammomium per-sulfate) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-에틸렌디아민(TEMED)을 첨가하면 중합이 시작된다(Vorlop 외, 1992).
폴리비닐 알코올: 세포 현탁액(suspension)을 13% 폴리비닐 알코올, 0.02% 소듐-알기네이트 혼합물과 혼합한다. 포화된 붕소산(boric acid)과 2% 염화칼슘 용액과 접촉될 때 겔화된다(Wu와 Wisecarver, 1991).
졸-겔(sol-gel): 세포는 0.1M 삼염화물(Tris-Cl)과 테트라메틸오소실리케이트(tetramethylorthosilicate), 테트라에스옥시실랜(tetraethoxysilane), 메틸트리메스옥시실랜(methyltrimethoxysilane), 에틸트리메스옥시실랜(ethyltrimethoxysilane), 프로필트리메스-옥시실랜(propyltrimeth-oxysilane) 또는 폴리디메틸-실옥산(polydimethyl-siloxane)과 화합한다(Rietti-Shati 외, 1996).
5.13.4 집적 회로
상기 IC는 (1) 광신호를 검출; (2) 잡음으로부터 상기 신호를 구별; (3) 아날로그 또는 디지털 신호 처리 수행[예를 들면, 알람 스레스홀(alarm threshold)과 비교]; (4) 결과를 전달; (5) 보조 기능을 수행(예를 들면, 위치 감지, 온도 측정)하는 디바이스 및 회로를 포함한다. 다행히도, 이러한 기능은 보수성 금속 산화막 반도체(CMOS) IC 공정으로 수행될 수 있다. 반도체 산업에 매우 유용한 CMOS는 BBIC에게 매우 큰 유연성 및 유용성을 준다. 처음에 CMOS는 디지털 전자에서 사용되었지만, 고품질의 아날로그 회로는 오늘날 CMOS 공정을 이용하여 생산된다. 또한, CMOS는 전-광(electro-optical) 검출 부분에서 매우 큰 잠재력을 가지고 있음이 최근에 증명되고 있다(Simpson 외, 1997). 결국, 소형의 SOI CMOS 공정은 아날로그, 디지털 및 전-광 검출 회로와 같은 IC상에 RF 통신 및 위치 감지 회로를 통합할 수 있도록 해준다. BBIC와 결합하여, 이러한 기능은 진정한 "단일 칩상의 실험 도구" 디바이스 개발에 있어서 중대한 도약을 의미한다.
기본 형태로서, BBIC는 생체리포터에서 방출된 빛의 양을 측정하여 이 값을 디지털화한 후 그 결과를 데이터 수신기에 전송한다. 최소 검출 가능 신호는 양자 효율(η)와, 누설 전류와, 광검출기의 잡음과, 신호 조절 회로의 잡음 및 필터링 특성의 함수이다. 광전자 증배관과 달리, 실리콘 광검출기는 단일 광자를 계산할 수 없다. 그러나, 생체발광은 통상적으로 오랜 시간 동안 지속되는 현상이기 때문에, 낮은 레벨의 빛을 검출하기 위해서는 오랜 통합 시간이 필요할 수 있다. 상기 제한으로 인해서, 양자에서 측정되는 최소 검출 가능 신호(MDS)는 다음 수학식과 같이 상기 제한에 접근한다:
여기서 q는 전하, APD는 광다이오드의 면적, Tint는 통합 시간, IS는 광다이오드 포화 전류이고, 매우 종속적인 과정이다. 이 수학식은 단지 광다이오드의 암전류가 영(즉, 광다이오드상의 바이어스가 영)인지를, 다음의 신호 처리 회로가 광다이오드의 잡음과 비교하여 무시될 수 있는지를 의미한다.
이 수학식에서, MDS는 η및 Tint가 최대로 되고 IS및 APD가 최소로 될 때 최소화된다. 그러나, Tint는 사용될 수 있는 측정 시간에 의해서 억제될 수 있고, 작은 APD는 생체리포터가 작은 면적의 IC에 걸쳐 집중될 수 없다면 적은 집광 효율을 초래한다. 그러나, IS는 표면 특성에 부분적으로 의존하므로, IC 보호 코팅 증착 및 어닐닝 공정은 IS를 최소화하는데 최대한 활용될 수 있다. 또한, 박막 IC 보호 코팅이 화학적 및 생물학적으로 충분히 거칠다면, 광검출기를 위한 반사방지 코팅을 형성할 수 있어 η을 최대화하는 데 도움을 줄 수 있다.
CMOS의 완전한 효용은 빛이 검출된 후에 실현된다. CMOS 아날로그 신호 조절 회로는 전압 증폭기, 트랜스임피던스 증폭기, 차지 센서티브(charge-sensitive) 컨버터를 포함하고, 신호 처리 선택은 아날로그 필터링, 디지털 필터링, 신경-네트워크 프로세싱 및 알람 식별을 포함한다. BBIC는 중앙 데이터 수집 센터에 연결되거나, 심지어 무선 네트워크를 통해 서로서로 연결될 수 있다. 다른 환경 감지(예를 들면, 온도 측정), 시간 스탬핑 또는 위치 감지를 포함하는 보조 기능의 숙주는 적용에 의한 요구로서 IC상에서 충족될 수 있다.
5.13.5 보호 코팅
비결정질의 이산화규소(SiO2)은 보통 IC용 유전체로서 사용된다. 불행히도, SiO2는 다양한 화학적 및 생물학적 물질에 의한 공격에 민감하기 때문에, 생체센서 적용에서 보호 코팅 물질로서 부적합하다. 그러나, 비결정질의 질화규소(SiN)막은 일반적으로 불순물 확산에 대해 더 내성이 강하며, 어떠한 형태의 SiN은 화학적 및 생물학적 물질에 의한 공격에 더 내성이 강하다. 이러한 특징으로 인해서 BBIC 적용을 위한 유망한 물질을 만들 수 있다. 또한, SiN의 광학적 특성은 가시 영역에서 동작하는 감광성 디바이스에 대해 매우 유용하다: 증착 조건에 의존하여, 633nm에서 비결정질의 SiN의 굴절률은 2.0과 3.5 사이에서 변화하며, 실리콘 광검출기용 단일층 반사방지 코팅으로서 이상적이다. 실리콘 광검출기용 반사방지 코팅으로서 수소화된 SiN막을 이용함으로써 더한 이점을 갖는데, 이는 상기 막을 어닐링하여 약간의 수소를 방출한 후 실리콘 표면의 '댄글링(dangling)' 본드(bond)를 결합하기 위해서 계면에 확산시킴으로써 청색 빛에서 광검출기의 반응을 향상시킬 수 있다.
대부분의 SiN은 향상된 플라즈마 화학증기증착(PE-CVD)을 이용해서 만들어지며, 막이 성장하기 전에 하나 또는 그 이상의 RF 에너지원의 기체를 이온화하기 위해서 RF 에너지원이 사용된다. 이러한 성장 기법은 고품질의 광학적 막을 얻기 위해서 상대적으로 낮은 기판 온도(대략 300°C)를 요구하나, 상기 막의 특성은 상기 에너지원의 기체 압력 및 성장 챔버(chamber)의 크기에 매우 의존한다. PE-CVD를 이용하여 증착된 비결정질 SiN의 두꺼운 층(대략 500nm)은 IC에 적합하고 생체내성 및 생체적합한 코팅을 형성할 수 있다. PE-CVD로 성장된 SiN은 많은 유리한 특성을 갖지만, 10-20%의 막 파라미터에서의 런-투-런(run-to-run) 차이가 보통이고, 심지어 다른 막 성장 파라미터는 근소한 차이를 갖는다.
최근, SiN 박막은 실온에서 새로운 연속 제트 증착 기법(JVD)을 사용하여 실리콘에 성공적으로 증착되었다[왕(Wang)등, 1995; 말리크(Malik)등, 1996]. 그러나 이 방법은 IC 생산 라인에 사용되는 복잡한 진공 시스템과는 양립할 수 없는 매우 높은 가스 부하를 발생시킨다.
분자 제트 CVD(MJ-CVD)로 알려진 소정의 박막 성장 기법이 발전되어 왔다[레스와 론드(Res and Lowndes), 1992]. 이 기법은 작은 개구을 통하여 통과 시키고, 이에 의하여 박막 성장 표면에서의 속도를 향상시키는 것을 포함한다. 이 개구는 빠르게 열리고 닫혀 매우 짧은 주기의 시간동안 표면 및 성장 환경의 잔류물들을 노광시킬 수 있도록 만든다. 펄스형 제트 기법은 초음파가 없는 제트 박막 성장의 매우 본질적인 이점을 가지며, 가스 부하를 줄이는 동시에 층층 마다의 방식에 따라 박막을 성장시킬 수 있다.
5.13.6 결과
BBIC는 톨루엔 감지 생체 리포터인 Pseudomonas putida TVA8을 OASIC에 위치시킴으로서 구성된다. 도 36A, 도 36B 및 도 36C는 예시적인 센서 및 이의 내부를 도시하며, 도 37은 일반적으로 광 다이오우드를 만들기 위하여 트랜지스터 접합을 형성하는 다이오우드를 사용하는 OASIC의 실시예를 도시한다. 전면 말단 신호 상태 회로는 주파수가 광다이오우드의 전류에 정비례하는 출력 펄스 열을 생성시킨다. 누설 및 광 전류의 합에 비례하는 디지털 신호는 특성 시간에 대한 펄스들을 카운트함으로써 발생된다.
종래의 전위계 회로와 비교할 때, 이 BBIC 프론트-엔드(front-end) 신호 조절 회로는 낮은 잡음(피드백 경로에 레지스터는 없음), 과부하로부터 더 빠른 회복(시간 상수가 높지 않음), 더 넓은 다이나믹 레인지를 제공하였다. 전반적인 OASIC는 2.2×2.2 mm로 측정하였고, 표준 1.2 ㎛ n-웰 CMOS IC 공정에서 원할하게 되었다.
세포에서 발생되는 발광은 없었고, 복수 회 측정이 1 min의 통합 시간으로 이루어졌다. 누설 전류는 대략 1분당 6 회(cpm)의 신호를 산출하였다[0.22 cpm의 표준 편차가 있음]; 기대한 바와 같이, 표준 편차는 통합 시간의 2 제곱근으로 감소하였다. 더 긴 통합 시간은 1 min 동안의 측정을 합함으로써 라인에서 이탈되어 산출되었다.
생체발광은 톨루엔 증기에 노출함으로써 BBIC 세포 및 제어 샘플에서 유도되었다. 제어 샘플 측정에 있어서, 본 발명자는 톨루엔 농도를 1 ppm 미만으로 계산하였다[12 cpm의 신호(백그라운드 이상에서 6 cpm )가 측정되었다]. 이전의 측정에 있어서, P.putida TVA8은 포화상태까지 톨루엔 농도에 선형 반응을 지닌 것으로 알려졌고, 그 농도는 약 10 ppm의 레벨까지 이른다(Selifonova와 Eaton, 1996). 최소 검출가능 신호는 백그라운드 이상에서 2 σ이고, 이어서 이 BBIC에 대한 톨루엔의 최소 검출가능 농도(MDC)는 다음의 수학식으로 추측할 수 있다.
여기에서 Ssat는 10 ppm의 농도에서 cpm으로 표시한 신호이고 Tint은 분으로 표시하는 집적 타임이다. 집적 타임의 함수로서 BBIC에 대한 최소의 검출가능한 톨루엔 농도는 도 38에 도시된다.
6.0 참조문헌
다음 참조문헌들은 예시적인 과정과 본 명세서에 개시된 다른 상세한 보충으로 확장되며, 본 명세서에서 참조한다.
본 명세서에서 개시되고 청구된 모든 장치, 하합물 및 방법은 현재 개시된 것에서 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 장치, 하합물 및 방법이 바람직한 실시예로서 개시되었지만, 당업자는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 방법의 과정 또는 단계에 따라 그리고 하합물 및 방법에 적용될 수 있는 변형이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 특히, 화학적 물리학적으로 관련된 임의의 물질이라도 본 명세서에 개시된 물질로 대체가 가능하며, 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 당업자에 대해 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형물은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 본 발명의 범위 내에 포함될 것이다. 따라서, 청구범위에 개시된 것으로 배타적 권리가 특허될 것이다.

Claims (34)

  1. a) 기판,
    b) 선택된 물질을 물질 대사시키거나 인식하여 발광할 수 있는 생체 리포터,
    c) 상기 기판에 부착되어 상기 생체 리포터를 유지할 수 있는 선택적 투과성 용기 및
    d) 상기 광에 응답하여 신호 생성 기능을 하는 광변환기를 포함하는, 상기 기판 상의 집적회로
    를 포함하는 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 d)의 집적회로의 신호는 상기 물질의 존재를 나타내는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기판과 상기 용기 사이에 생체 내성 및 생체 적합성 재료로 된 층을 더 포함하는 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  4. 제2항에 있어서, 상기 생체 내성/생체 적합성 재료는 실리콘 질화물을 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 집적회로는 상보형 금속 산화막 반도체(CMOS) 집적회로인 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 광변환기는 광다이오드를 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 집적회로는 전류-주파수 변환기와 디지털 카운터를 더 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 집적회로는 광다이오드와 전류-주파수 변환기를 더 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 집적회로는 송신기를 더 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 송신기는 무선인 것인선택된 물질의 농도 검출 장치.
  11. 제9항에 있어서, 상기 송신기로부터의 전송을 수신할 수 있는 수신기를 더 포함하는 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 전송은 디지털 데이터를 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  13. 제1항에 있어서, 상기 기판 상에 유체와 영양분 저장부와 미시유체 펌프를 더 포함하는 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  14. 제1항에 있어서, 상기 생체 리포터는 유전공학적으로 처리된 이스트, 박테리아, 균류, 동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  15. 제1항에 있어서, 상기 선택 투과성 용기는 중합체 매트릭스를 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 가스나 유체에 의해 상기 생체 리포터에 도달할 수 있는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  17. 제15항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 광학적으로 투명한 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  18. 제1항에 있어서, 상기 집적회로는 글로벌 위치 결정 시스템(지피에스)을 더 포함하는 것인 선택된 물질의 농도 검출 장치.
  19. a) 물질을 물질 대사시키고, 이 대사 작용의 결과로서 발광할 수 있는 생체 리포터 및
    b) 상기 방사된 광에 응답하여 전기 신호를 생성할 수 있는 센서
    를 포함하는 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  20. 제19항에 있어서, 상기 생체 리포터는 생체 발광 표지를 인코딩하는 핵산 세그먼트를 포함하는 것인 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  21. 제19항에 있어서, 상기 생체 리포터와 상기 센서 사이에 위치한 투명하고, 생체 내성이 있으며, 생체 적합성이 있는 분리기를 더 포함하는 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  22. 제19항에 있어서, 생체 리포터를 넣을 수 있고, 상기 물질과 상기 생체 리포터 사이의 접촉을 가능하게 하는 중합체 매트릭스를 더 포함하는 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중합체 매트릭스는 상기 물질에 대해 투과성인 것인 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  24. 제20항에 있어서, 상기 핵산 세그먼트의 서열
  25. 제19항에 있어서, 상기 생체 리포터를 유지하기에 적합한 물과 영양분의 소스를 더 포함하는 물질 검출용 모놀리식 생체 전자 장치.
  26. a) 광에 응답하여 신호를 생성하기에 적합한 광변환기를 포함하는 집적회로,
    b) 물질을 물질 대사시키고, 이 대사 작용의 결과로서 발광할 수 있으며, 상기 물질과 접촉하기에 적합한 생체 리포터 및
    c) 상기 광변환기와 상기 생체 리포터 사이에 위치하는 투명하고, 생체 적합성이 있으며, 생체 내성이 있는 분리기
    를 포함하는 물질 검출 장치.
  27. 제26항에 있어서, 상기 생체 리포터는 lux 유전자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 물질 검출 장치.
  28. 제26항에 있어서, 상기 생체 리포터를 넣을 수 있고, 상기 물질과 상기 생체 리포터 사이에 접촉을 가능하게 하는 플라스틱 매트릭스를 더 포함하는 물질 검출 장치.
  29. 제28항에 있어서, 상기 플라스틱 매트릭스는 상기 물질에 대해 투과성인 것인 물질 검출 장치.
  30. 제29항에 있어서, 상기 물질은 유체를 포함하는 것인 물질 검출 장치.
  31. 제26항에 있어서, 상기 생체 리포터는 박테리아를 포함하는 것인 물질 검출 장치.
  32. a) 기판,
    b) 특정 물질을 물질 대사시키고, 이 대사 산물에 응답하여 발광할 수 있는 Pseudomonas fluorescens HK44,
    c) 상기 Pseudomonas fluorescens HK44를 수용할 수 있고 상기 기판 상에 부착되며, 가스 또는 유체에 의해 상기 생체 리포터에 도달할 수 있고, 주변광이 상기 생체 리포터에 도달하지 못하도록 하는 선택 투과성 용기,
    d) 상기 기판과 상기 용기 사이에 있는 반도체성 재료로 된 층,
    e) 상기 기판 상에 있는 유체와 영양분 저장부 및 미소 유체 펌프,
    f) 상기 광에 응답하여 전류 발생 기능을 하는 광다이오드, 전류-주파수 변환기, 디지털 계수기 및 무선 송신기를 포함하는, 상기 기판 상의 상보형 금속 산화막 및
    g) 상기 송신기로부터 전송을 수신할 수 있는 중앙 데이터 수집 스테이션
    을 포함하는 물질 농도 검출 장치.
  33. 제32항에 있어서, 상기 f)의 상보형 금속 산화막은 상보형 금속 산화막 집적회로인 것인 물질 농도 검출 장치.
  34. 제32항에 있어서, 상기 d)의 반도체성 재료로 된 층은 실리콘 질화물 또는 실리콘 산화물인 것인 물질 농도 검출 장치.
KR1020007005733A 1997-11-25 1998-11-25 생체 발광 생체 리포터 집적회로 KR100591965B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/978,439 1997-11-25
US08/978,439 US6117643A (en) 1997-11-25 1997-11-25 Bioluminescent bioreporter integrated circuit
US8/978,439 1997-11-25
PCT/US1998/025295 WO1999027351A1 (en) 1997-11-25 1998-11-25 Bioluminescent bioreporter integrated circuit

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010032491A true KR20010032491A (ko) 2001-04-25
KR100591965B1 KR100591965B1 (ko) 2006-06-21

Family

ID=25526097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007005733A KR100591965B1 (ko) 1997-11-25 1998-11-25 생체 발광 생체 리포터 집적회로

Country Status (7)

Country Link
US (6) US6117643A (ko)
EP (1) EP1034424A1 (ko)
JP (1) JP2001524667A (ko)
KR (1) KR100591965B1 (ko)
AU (1) AU751563B2 (ko)
CA (1) CA2311502C (ko)
WO (1) WO1999027351A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101506041B1 (ko) * 2009-07-13 2015-03-26 삼성전자주식회사 Ｗｂａｎ에서 통신 방법 및 장치
WO2017022887A1 (ko) * 2015-08-06 2017-02-09 한국생명공학연구원 난분해성 유해 방향족 화합물 감지용 리포터 식물 시스템 및 이의 용도
WO2021262454A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 J. Brasch Co., Llc Calibrating a sensing device for improved analog-to-digital converter resolution utilization

Families Citing this family (292)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7657297B2 (en) * 2004-05-03 2010-02-02 Dexcom, Inc. Implantable analyte sensor
US6117643A (en) 1997-11-25 2000-09-12 Ut Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit
CA2309841C (en) * 1997-12-04 2003-12-02 Roche Diagnostics Corporation Method of configuring a hand-held instrument
US20060015058A1 (en) * 1998-01-08 2006-01-19 Kellogg Scott C Agents and methods for enhancement of transdermal transport
US6175752B1 (en) 1998-04-30 2001-01-16 Therasense, Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US6949816B2 (en) 2003-04-21 2005-09-27 Motorola, Inc. Semiconductor component having first surface area for electrically coupling to a semiconductor chip and second surface area for electrically coupling to a substrate, and method of manufacturing same
US8465425B2 (en) 1998-04-30 2013-06-18 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US8974386B2 (en) 1998-04-30 2015-03-10 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US8346337B2 (en) 1998-04-30 2013-01-01 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US8480580B2 (en) 1998-04-30 2013-07-09 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US8688188B2 (en) 1998-04-30 2014-04-01 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US9066695B2 (en) 1998-04-30 2015-06-30 Abbott Diabetes Care Inc. Analyte monitoring device and methods of use
US6391549B1 (en) * 1999-04-01 2002-05-21 Ramont University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. Monitoring gene expression
DE19915310A1 (de) * 1999-04-03 2000-10-05 Bayer Ag Diffusionskontrollierende Sensorschicht
GB9925788D0 (en) * 1999-11-01 1999-12-29 Univ Napier Immobilised bacteria
AU2001252890B2 (en) * 2000-03-02 2005-06-02 Microchips, Inc. Microfabricated devices for the storage and selective exposure of chemicals and devices
US6436055B1 (en) * 2000-03-02 2002-08-20 The Procter & Gamble Company Device having diarrhea diagnostic panel
US7485454B1 (en) 2000-03-10 2009-02-03 Bioprocessors Corp. Microreactor
EP1266214B1 (en) * 2000-03-20 2009-09-23 The Charles Stark Draper Laboratory, INC. Flexural plate wave sensor
WO2001082784A2 (en) * 2000-05-03 2001-11-08 Cornell Research Foundation, Inc. Enhanced biologically based chronotropic biosensing
US6706474B1 (en) 2000-06-27 2004-03-16 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid enzyme biosensors for ions
ATE443154T1 (de) 2000-07-11 2009-10-15 Chesapeake Techlabs Inc Vorrichtung und verfahren zur bestimmung und klassifizierung von chemikalien, partikeln, viren und bakterien in fluiden mittels aptamer
BR0003066A (pt) * 2000-07-21 2002-04-30 Fundacao Oswaldo Cruz Método e dispositivo para detecção microrganismos à fibra óptica
US6889153B2 (en) * 2001-08-09 2005-05-03 Thomas Dietiker System and method for a self-calibrating non-invasive sensor
US20030108980A1 (en) * 2000-08-14 2003-06-12 Sayler Gary S. Bioluminescent methods for direct visual detection of environmental compounds
WO2002023168A2 (en) * 2000-09-12 2002-03-21 Ut-Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit detection methods
DE60116520T2 (de) * 2000-10-10 2006-08-31 Microchips, Inc., Bedford Microchip-reservoir-vorrichtungen mit drahtloser übertragung von energie und daten
US6905816B2 (en) 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
WO2002059625A2 (en) * 2000-12-26 2002-08-01 Weigl Bernhard H Microfluidic cartridge with integrated electronics
US6560471B1 (en) 2001-01-02 2003-05-06 Therasense, Inc. Analyte monitoring device and methods of use
EP1372602B1 (en) 2001-01-09 2007-04-18 Microchips, Inc. Flexible microchip devices for ophthalmic and other applications
US20020160520A1 (en) * 2001-03-16 2002-10-31 Phoenix Bioscience Silicon nano-collection analytic device
EP1397068A2 (en) 2001-04-02 2004-03-17 Therasense, Inc. Blood glucose tracking apparatus and methods
WO2002083852A2 (en) * 2001-04-10 2002-10-24 Bioprocessors Corporation Microfermentor device and cell based screening method
US7572642B2 (en) * 2001-04-18 2009-08-11 Ambrigen, Llc Assay based on particles, which specifically bind with targets in spatially distributed characteristic patterns
US6844563B2 (en) * 2001-05-22 2005-01-18 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Fluorescence detecting device with integrated circuit and photodiode, and detection method
US6544729B2 (en) * 2001-07-20 2003-04-08 University Of Tennessee Bioluminescent biosensor device
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
JP2003079365A (ja) * 2001-09-07 2003-03-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 環境有害化学物質の高感度検出法
DE10151020A1 (de) * 2001-10-16 2003-04-30 Infineon Technologies Ag Schaltkreis-Anordnung, Sensor-Array und Biosensor-Array
US9247901B2 (en) 2003-08-22 2016-02-02 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream
US8010174B2 (en) * 2003-08-22 2011-08-30 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream
US9282925B2 (en) * 2002-02-12 2016-03-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream
US8364229B2 (en) 2003-07-25 2013-01-29 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US7613491B2 (en) 2002-05-22 2009-11-03 Dexcom, Inc. Silicone based membranes for use in implantable glucose sensors
US8260393B2 (en) * 2003-07-25 2012-09-04 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal data artifacts in a glucose sensor data stream
US7863038B2 (en) * 2002-03-29 2011-01-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Implantable biosensor from stratified nanostructured membranes
US20060008837A1 (en) * 2002-04-04 2006-01-12 University Of Tennessee Research Foundation Compositions and methods for detecting estrogenic agents in a sample
US7534560B2 (en) 2002-05-10 2009-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Simple catalytic DNA biosensors for ions based on color changes
US6890719B2 (en) 2002-05-10 2005-05-10 The Board Of Trustess Of The University Of Illinois Fluorescence based biosensor
US6952651B2 (en) * 2002-06-17 2005-10-04 Intel Corporation Methods and apparatus for nucleic acid sequencing by signal stretching and data integration
WO2004008142A1 (ja) * 2002-07-12 2004-01-22 Mitsubishi Chemical Corporation 分析用チップ、分析用チップユニット、分析装置及びそれを用いた分析方法並びに分析用チップの作製方法
US7171312B2 (en) * 2002-07-19 2007-01-30 Smiths Detection, Inc. Chemical and biological agent sensor array detectors
US7810380B2 (en) * 2003-03-25 2010-10-12 Tearlab Research, Inc. Systems and methods for collecting tear film and measuring tear film osmolarity
BR0313618A (pt) * 2002-08-21 2005-06-21 Shell Int Research Método para análise quìmica de fluidos de poço
JP4092990B2 (ja) * 2002-09-06 2008-05-28 株式会社日立製作所 生体および化学試料検査装置
US6806543B2 (en) * 2002-09-12 2004-10-19 Intel Corporation Microfluidic apparatus with integrated porous-substrate/sensor for real-time (bio)chemical molecule detection
US7141414B2 (en) * 2002-09-16 2006-11-28 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Biosensor
KR100698956B1 (ko) 2002-12-12 2007-03-26 이상문 생체 표피 조직의 특성 및 기능과 생체의 표피조직을 이용한 전자기 시그널 감응용(感應用) 고형생체소재 및 그 제조방법
GB2434165B (en) * 2002-12-14 2007-09-19 Schlumberger Holdings System and method for wellbore communication
US7534207B2 (en) * 2003-02-07 2009-05-19 Alfred E. Mann Institute For Biomedical Engineering At The University Of Southern California Implantable device with sensors for differential monitoring of internal condition
US7612185B2 (en) 2003-03-07 2009-11-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid biosensors
US6925398B2 (en) * 2003-07-07 2005-08-02 Colorado Vnet, Llc Water measurement apparatus and methods
US7467003B2 (en) * 2003-12-05 2008-12-16 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US7366556B2 (en) 2003-12-05 2008-04-29 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US7460898B2 (en) * 2003-12-05 2008-12-02 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US9763609B2 (en) 2003-07-25 2017-09-19 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US7761130B2 (en) * 2003-07-25 2010-07-20 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US8423113B2 (en) * 2003-07-25 2013-04-16 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7424318B2 (en) 2003-12-05 2008-09-09 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US8160669B2 (en) 2003-08-01 2012-04-17 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US8622905B2 (en) * 2003-08-01 2014-01-07 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US9135402B2 (en) 2007-12-17 2015-09-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US20190357827A1 (en) 2003-08-01 2019-11-28 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US7519408B2 (en) 2003-11-19 2009-04-14 Dexcom, Inc. Integrated receiver for continuous analyte sensor
US7774145B2 (en) * 2003-08-01 2010-08-10 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US8886273B2 (en) * 2003-08-01 2014-11-11 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7933639B2 (en) * 2003-08-01 2011-04-26 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US8275437B2 (en) * 2003-08-01 2012-09-25 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US7494465B2 (en) * 2004-07-13 2009-02-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US20080119703A1 (en) 2006-10-04 2008-05-22 Mark Brister Analyte sensor
US8369919B2 (en) * 2003-08-01 2013-02-05 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8761856B2 (en) 2003-08-01 2014-06-24 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US6931327B2 (en) 2003-08-01 2005-08-16 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US20140121989A1 (en) 2003-08-22 2014-05-01 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing analyte sensor data
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005022136A1 (en) * 2003-08-26 2005-03-10 University Of Cincinnati Selectively permeable film supported membrane
US6898529B2 (en) * 2003-09-05 2005-05-24 Halliburton Energy Services, Inc. Method and system for determining parameters inside a subterranean formation using data sensors and a wireless ad hoc network
AU2004272062B2 (en) * 2003-09-11 2010-08-19 Labrador Diagnostics Llc Medical device for analyte monitoring and drug delivery
US20050074784A1 (en) * 2003-10-07 2005-04-07 Tuan Vo-Dinh Integrated biochip with continuous sampling and processing (CSP) system
WO2005046445A2 (en) * 2003-11-07 2005-05-26 University Of Connecticut Artificial tissue systems and uses thereof
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8615282B2 (en) * 2004-07-13 2013-12-24 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7787923B2 (en) * 2003-11-26 2010-08-31 Becton, Dickinson And Company Fiber optic device for sensing analytes and method of making same
US11633133B2 (en) 2003-12-05 2023-04-25 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US8423114B2 (en) 2006-10-04 2013-04-16 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
ATE480761T1 (de) 2003-12-05 2010-09-15 Dexcom Inc Kalibrationsmethoden für einen kontinuierlich arbeitenden analytsensor
US8364231B2 (en) 2006-10-04 2013-01-29 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8287453B2 (en) 2003-12-05 2012-10-16 Dexcom, Inc. Analyte sensor
EP2301428B1 (en) * 2003-12-09 2016-11-30 Dexcom, Inc. Signal processing for continuous analyte sensor
US20050153309A1 (en) * 2003-12-22 2005-07-14 David Hoon Method and apparatus for in vivo surveillance of circulating biological components
US7553625B2 (en) * 2003-12-22 2009-06-30 John Wayne Cancer Institute Method and apparatus for in vivo collection of circulating biological components
US7637868B2 (en) * 2004-01-12 2009-12-29 Dexcom, Inc. Composite material for implantable device
US20050182451A1 (en) * 2004-01-12 2005-08-18 Adam Griffin Implantable device with improved radio frequency capabilities
US7485419B2 (en) 2004-01-13 2009-02-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Biosensors based on directed assembly of particles
JP4065855B2 (ja) * 2004-01-21 2008-03-26 株式会社日立製作所 生体および化学試料検査装置
JP2005230521A (ja) * 2004-01-21 2005-09-02 Denso Corp 体液成分検出デバイス及び体液成分検出システム
US8808228B2 (en) 2004-02-26 2014-08-19 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
JP3905094B2 (ja) * 2004-04-07 2007-04-18 株式会社アイディエス 自走式検体ホルダの搬送システム
AU2005236081B2 (en) * 2004-04-21 2010-06-17 Ausbiochip Pty Ltd Optoelectronic biochip
WO2005103652A1 (en) * 2004-04-21 2005-11-03 Ausbiochip Pty Ltd Optoelectronic biochip
US8792955B2 (en) 2004-05-03 2014-07-29 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
EP1744809A4 (en) * 2004-05-04 2008-05-07 Univ Rochester WIRELESS IMPLANTABLE INTRAVASCULAR ELECTROPHYSIOLOGICAL DEVICE FOR NEUROLOGICAL / CARDIOVASCULAR MEASUREMENT AND STIMULATION
WO2005107864A1 (en) * 2004-05-04 2005-11-17 University Of Rochester Leadless implantable cardioverter defibrillator
CA2565624A1 (en) * 2004-05-04 2005-11-17 University Of Rochester Implantable bio-electro-physiologic interface matrix
US20050261561A1 (en) * 2004-05-24 2005-11-24 Christopher W. Jones Blood testing and therapeutic compound delivery system
US7783333B2 (en) * 2004-07-13 2010-08-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous medical device with variable stiffness
US20070045902A1 (en) 2004-07-13 2007-03-01 Brauker James H Analyte sensor
US8170803B2 (en) 2004-07-13 2012-05-01 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
CA2475240A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-20 Biophys, Inc. Method and device to measure dynamic internal calibration true dose response curves
CA2475456A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-20 Biophys, Inc. Method and device to optimize analyte and antibody substrate binding by least energy adsorption
US8097431B2 (en) 2004-08-04 2012-01-17 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions for detecting steroids
US8224414B2 (en) * 2004-10-28 2012-07-17 Echo Therapeutics, Inc. System and method for analyte sampling and analysis with hydrogel
WO2006050031A2 (en) * 2004-10-28 2006-05-11 Sontra Medical Corporation System and method for analyte sampling and analysis with error correction
US8075540B2 (en) * 2004-11-09 2011-12-13 Hollister Incorporated Bowel management system with physiologic sensors
EP1659379B1 (en) * 2004-11-11 2009-08-26 STMicroelectronics (Research & Development) Limited Light monitor
US20080076975A1 (en) * 2005-01-25 2008-03-27 Microchips, Inc. Method and implantable device with reservoir array for pre-clinical in vivo testing
US7875426B2 (en) * 2005-02-04 2011-01-25 University Of South Florida DNA biochip and methods of use
US7155343B2 (en) * 2005-02-18 2006-12-26 Grant Charles A Nanocircuitry for sensing, recording and outputting data
US8133178B2 (en) 2006-02-22 2012-03-13 Dexcom, Inc. Analyte sensor
KR100690455B1 (ko) 2005-03-25 2007-03-09 주식회사 엠엔비그린어스 미세 채널을 구비한 바이오칩과 이를 이용한 미생물 농도 검출 장치
US20060234369A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable biosensor
US7738086B2 (en) * 2005-05-09 2010-06-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
US20070097364A1 (en) * 2005-05-09 2007-05-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Active CMOS biosensor chip for fluorescent-based detection
WO2006135632A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Nanologix, Inc. System for sustained microbial production of hydrogen gas in a bioreactor
US8309057B2 (en) * 2005-06-10 2012-11-13 The Invention Science Fund I, Llc Methods for elevating neurotrophic agents
WO2007008864A2 (en) * 2005-07-12 2007-01-18 Whitehead Institute Wireless cmos biosensor
US20080168953A1 (en) * 2005-08-01 2008-07-17 Koninklijke Philips Electronics, N.V. Device to be Attached to or to be Worn by an Animal for Indicating the Physiological Status of the Animal
US7892734B2 (en) 2005-08-11 2011-02-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer based colorimetric sensor systems
US7298488B2 (en) * 2005-09-20 2007-11-20 National Taipei University Of Technology Surface-plasmon-resonance sensing technique using electro-optic modulation
US20070099820A1 (en) * 2005-10-19 2007-05-03 Smartcells, Inc. Polymer-drug conjugates
WO2007065095A2 (en) * 2005-11-29 2007-06-07 Spencer Rosero System and method for supporting a biological chip device
EP1963538A2 (en) 2005-11-30 2008-09-03 Guild Associates, Inc. Differentially fluorescent yeast biosensors for the detection and biodegradation of chemical agents
US7432069B2 (en) * 2005-12-05 2008-10-07 Sontra Medical Corporation Biocompatible chemically crosslinked hydrogels for glucose sensing
WO2007102842A2 (en) * 2006-03-09 2007-09-13 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing analyte sensor data
WO2007109500A1 (en) 2006-03-16 2007-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Lateral flow devices
EP2004241B1 (en) * 2006-03-28 2013-08-07 Glusense Ltd. Implantable sensor
WO2007124448A2 (en) * 2006-04-20 2007-11-01 Rosero Spencer Z Method and apparatus for the management of diabetes
US7476840B2 (en) * 2006-05-08 2009-01-13 Slicex, Inc. Sensing light and sensing the state of a memory cell an aid of a switch controlled by a schmidt trigger
US7809441B2 (en) * 2006-05-17 2010-10-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable medical device with chemical sensor and related methods
US20080071157A1 (en) * 2006-06-07 2008-03-20 Abbott Diabetes Care, Inc. Analyte monitoring system and method
EP2043522A4 (en) * 2006-06-16 2010-01-06 Medtor Llc SYSTEM AND METHOD FOR NON-INVASIVE MEDICAL SENSOR
US7777287B2 (en) * 2006-07-12 2010-08-17 Micron Technology, Inc. System and apparatus providing analytical device based on solid state image sensor
KR100770440B1 (ko) * 2006-08-29 2007-10-26 삼성전기주식회사 질화물 반도체 발광소자
EP1901058A3 (en) * 2006-09-13 2010-02-17 Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. Examination element and examination container for testing liquid samples
JP4974816B2 (ja) * 2006-09-13 2012-07-11 株式会社半導体エネルギー研究所 検査素子及び検査容器
US20080293086A1 (en) * 2006-09-18 2008-11-27 Cobalt Technologies, Inc. A Delaware Corporation Real time monitoring of microbial enzymatic pathways
JP5048070B2 (ja) 2006-09-28 2012-10-17 メドトロニック，インコーポレイテッド 低電力センサシステム用の容量性インタフェース回路
US7831287B2 (en) * 2006-10-04 2010-11-09 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US7704731B2 (en) * 2006-10-10 2010-04-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy System and method for quantifying toxicity in water, soil, and sediments
US8579853B2 (en) * 2006-10-31 2013-11-12 Abbott Diabetes Care Inc. Infusion devices and methods
US20090007947A1 (en) * 2006-12-22 2009-01-08 Angela Spangenberg Portable weather shielding canopy
US7676953B2 (en) * 2006-12-29 2010-03-16 Signature Control Systems, Inc. Calibration and metering methods for wood kiln moisture measurement
US7798090B2 (en) * 2007-01-05 2010-09-21 Thomas Angell Hatfield Rescue and locational determination equipment
WO2008089248A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Amphiphilic substances and triggered liberation from lipid vesicles
AU2008222757B2 (en) * 2007-03-07 2011-06-09 Echo Therapeutics, Inc. Transdermal analyte monitoring systems and methods for analyte detection
US7799656B2 (en) 2007-03-15 2010-09-21 Dalsa Semiconductor Inc. Microchannels for BioMEMS devices
CN101678169A (zh) * 2007-03-19 2010-03-24 茵苏莱恩医药有限公司 药物输送设备
US9220837B2 (en) * 2007-03-19 2015-12-29 Insuline Medical Ltd. Method and device for drug delivery
US20100286467A1 (en) * 2007-03-19 2010-11-11 Benny Pesach Device for drug delivery and associated connections thereto
US8622991B2 (en) * 2007-03-19 2014-01-07 Insuline Medical Ltd. Method and device for drug delivery
US8058415B2 (en) 2007-04-24 2011-11-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Aptamer- and nucleic acid enzyme-based systems for simultaneous detection of multiple analytes
US20100221817A1 (en) * 2007-04-25 2010-09-02 Technische Universitaet Dresden Whole-Cell Sensor
US20200037875A1 (en) 2007-05-18 2020-02-06 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US8649840B2 (en) * 2007-06-07 2014-02-11 Microchips, Inc. Electrochemical biosensors and arrays
US8562558B2 (en) 2007-06-08 2013-10-22 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
WO2009012309A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for divalent copper ion detection
DE102007034042A1 (de) * 2007-07-20 2009-01-22 Biotronik Crm Patent Ag Implantierbares medizinisches Gerät
US8568690B2 (en) 2007-07-31 2013-10-29 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MRI contrast agents and high-throughput screening by MRI
US8367416B2 (en) 2007-08-10 2013-02-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleic acid based fluorescent sensor for mercury detection
US20090081715A1 (en) * 2007-09-07 2009-03-26 Cobalt Technologies, Inc., A Delaware Corporation Engineered Light-Emitting Reporter Genes
WO2009036070A1 (en) * 2007-09-10 2009-03-19 University Of Kentucky Research Foundation Spores for the stabilization and on-site application of bacterial whole-cell biosensing systems
CN101868286A (zh) 2007-09-20 2010-10-20 马格雷股份有限公司 采用磁性传感器进行的分析物检测
US20090087912A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Shlumberger Technology Corporation Tagged particles for downhole application
US20090088726A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Microsoft Corporation Symbiotic biological systems as platforms for sensing, production, and intervention
US20090087911A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-02 Schlumberger Technology Corporation Coded optical emission particles for subsurface use
EP2195427A2 (en) 2007-10-01 2010-06-16 Guild Associates, Inc. Differentially fluorescent yeast biosensors for the detection and biodegradation of chemical agents
US9474461B2 (en) * 2007-10-03 2016-10-25 University Of Utah Research Foundation Miniature wireless biomedical telemetry device
US9452258B2 (en) 2007-10-09 2016-09-27 Dexcom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
US8417312B2 (en) 2007-10-25 2013-04-09 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7890357B2 (en) * 2007-11-20 2011-02-15 Hartford Fire Insurance Company System and method for identifying and evaluating nanomaterial-related risk
TWI407939B (zh) * 2007-11-27 2013-09-11 財團法人國家實驗研究院 無線生理訊號整合系統及其方法
US8384803B2 (en) * 2007-12-13 2013-02-26 Keigo Iizuka Camera system and method for amalgamating images to create an omni-focused image
US9839395B2 (en) 2007-12-17 2017-12-12 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8409133B2 (en) 2007-12-18 2013-04-02 Insuline Medical Ltd. Drug delivery device with sensor for closed-loop operation
US20090198458A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Mcdermid John Water measurement auto-networks
EP2244761A2 (en) * 2008-02-20 2010-11-03 Dexcom, Inc. Continous medicament sensor system for in vivo use
US20090242399A1 (en) * 2008-03-25 2009-10-01 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8583204B2 (en) 2008-03-28 2013-11-12 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
US8682408B2 (en) 2008-03-28 2014-03-25 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
US11730407B2 (en) 2008-03-28 2023-08-22 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
EP2268825A4 (en) 2008-04-09 2012-05-02 Cobalt Technologies Inc IMMOBILIZED MICROORGANISMS, TOLERANT TO A PRODUCT
US10271778B2 (en) * 2008-06-03 2019-04-30 Nonin Medical, Inc. LED control utilizing ambient light or signal quality
US8092761B2 (en) * 2008-06-20 2012-01-10 Silverbrook Research Pty Ltd Mechanically-actuated microfluidic diaphragm valve
US7981386B2 (en) * 2008-06-20 2011-07-19 Silverbrook Research Pty Ltd Mechanically-actuated microfluidic valve
US20090315126A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 Silverbrook Research Pty Ltd Bonded Microfluidic System Comprising Thermal Bend Actuated Valve
US20090317302A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 Silverbrook Research Pty Ltd Microfluidic System Comprising MEMS Integrated Circuit
US8080220B2 (en) * 2008-06-20 2011-12-20 Silverbrook Research Pty Ltd Thermal bend actuated microfluidic peristaltic pump
US8062612B2 (en) * 2008-06-20 2011-11-22 Silverbrook Research Pty Ltd MEMS integrated circuit comprising microfluidic diaphragm valve
US8075855B2 (en) * 2008-06-20 2011-12-13 Silverbrook Research Pty Ltd MEMS integrated circuit comprising peristaltic microfluidic pump
US7892496B2 (en) * 2008-06-20 2011-02-22 Silverbrook Research Pty Ltd Mechanically-actuated microfluidic pinch valve
US20090317301A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 Silverbrook Research Pty Ltd Bonded Microfluidics System Comprising MEMS-Actuated Microfluidic Devices
US7842248B2 (en) * 2008-06-20 2010-11-30 Silverbrook Research Pty Ltd Microfluidic system comprising microfluidic pump, mixer or valve
US7887756B2 (en) * 2008-06-20 2011-02-15 Silverbrook Research Pty Ltd Microfluidic system comprising mechanically-actuated microfluidic pinch valve
KR20100124827A (ko) * 2008-06-20 2010-11-29 실버브룩 리서치 피티와이 리미티드 Ｃｍｏｓ-제어 가능한 미세유체 장치를 포함하는 결합형 미세유체 시스템
US20090314367A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 Silverbrook Research Pty Ltd Bonded Microfluidics System Comprising CMOS-Controllable Microfluidic Devices
US20090314368A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-24 Silverbrook Research Pty Ltd Microfluidic System Comprising Pinch Valve and On-Chip MEMS Pump
US20090325212A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-31 Microsoft Corporation Data standard for biomaterials
US20100061976A1 (en) * 2008-07-24 2010-03-11 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Method for treating or preventing osteoporosis by reducing follicle stimulating hormone to cyclic physiological levels in a mammalian subject
US8062893B2 (en) 2008-10-10 2011-11-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fluorescent sensor for mercury
RU2532893C2 (ru) 2008-11-07 2014-11-10 Инсьюлин Медикал Лтд. Устройство и способ доставки лекарственных средств
US20100160749A1 (en) * 2008-12-24 2010-06-24 Glusense Ltd. Implantable optical glucose sensing
US7927904B2 (en) 2009-01-05 2011-04-19 Dalsa Semiconductor Inc. Method of making BIOMEMS devices
US8721618B2 (en) 2009-02-25 2014-05-13 The Invention Science Fund I, Llc Device for actively removing a target cell from blood or lymph of a vertebrate subject
US8317737B2 (en) * 2009-02-25 2012-11-27 The Invention Science Fund I, Llc Device for actively removing a target component from blood or lymph of a vertebrate subject
US8454547B2 (en) * 2009-02-25 2013-06-04 The Invention Science Fund I, Llc Device, system, and method for controllably reducing inflammatory mediators in a subject
US8167871B2 (en) 2009-02-25 2012-05-01 The Invention Science Fund I, Llc Device for actively removing a target cell from blood or lymph of a vertebrate subject
BRPI1006527A2 (pt) * 2009-03-26 2020-04-07 Koninl Philips Electronics Nv detector de imagens e método
CN102413765B (zh) * 2009-03-26 2016-09-21 皇家飞利浦电子股份有限公司 频谱成像
WO2010111660A1 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Dexcom, Inc. Methods and systems for promoting glucose management
WO2010151706A1 (en) * 2009-06-26 2010-12-29 Cobalt Technologies, Inc. Integrated system and process for bioproduct production
US8207651B2 (en) 2009-09-16 2012-06-26 Tyco Healthcare Group Lp Low energy or minimum disturbance method for measuring frequency response functions of ultrasonic surgical devices in determining optimum operating point
DE102009043527B4 (de) * 2009-09-30 2021-06-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Anordnung und Verfahren unter Verwendung von Mikrosensoren zum Messen von Zell-Vitalitäten
US9631219B2 (en) * 2010-02-24 2017-04-25 Nalco Company Metabolic rate indicator for cellular populations
DE102010002990A1 (de) * 2010-03-18 2011-09-22 Robert Bosch Gmbh Mikrofluidisches System für Analyse- und Diagnosezwecke sowie entsprechendes Verfahren zur Herstellung eines mikrofluidischen Systems
ES2340134B1 (es) * 2010-04-09 2011-01-28 Centro De Estudios E Investigaciones Tecnicas De Guipuzcoa (Ceitg) Reactor para el estudio y cultivo de biocapas.
CN102812771B (zh) * 2010-10-19 2017-04-12 华为技术有限公司 用于处理移动终端的通信的服务网关
DK2675902T3 (da) 2011-02-17 2019-06-03 Univ Pennsylvania Sammensætninger og fremgangsmåder til at ændre vævsspecificitet og forbedre aav9-medieret genoverførsel
JP6101215B2 (ja) 2011-03-09 2017-03-22 マグアレイ，インコーポレイテッド サンプル中の分析対象物に対するハイスループット検出を行うシステム及び方法
ES2964546T3 (es) 2011-04-15 2024-04-08 Dexcom Inc Calibración avanzada de sensor de analito y detección de errores
US9238133B2 (en) 2011-05-09 2016-01-19 The Invention Science Fund I, Llc Method, device and system for modulating an activity of brown adipose tissue in a vertebrate subject
US9011510B2 (en) 2011-05-09 2015-04-21 The Invention Science Fund I, Llc Method, device and system for modulating an activity of brown adipose tissue in a vertebrate subject
US9037205B2 (en) 2011-06-30 2015-05-19 Glusense, Ltd Implantable optical glucose sensing
US9968258B2 (en) * 2011-09-12 2018-05-15 Tufts University Imaging fluorescence or luminescence lifetime
CN103959900B (zh) * 2011-09-29 2016-08-24 沃特洛电气制造公司 高动态温度控制系统
US9023640B2 (en) * 2011-12-13 2015-05-05 Fundamental Solutions Corporation Device for rapid detection of infectious agents
US8772764B2 (en) * 2011-12-27 2014-07-08 The Johns Hopkins University Electro-chemical sensors, sensor arrays and circuits
US8906320B1 (en) 2012-04-16 2014-12-09 Illumina, Inc. Biosensors for biological or chemical analysis and systems and methods for same
IN2014DN09550A (ko) 2012-05-17 2015-07-17 Shell Int Research
US20130330761A1 (en) 2012-06-12 2013-12-12 Celcuity, LLC Whole cell assays and methods
JP2014062838A (ja) * 2012-09-21 2014-04-10 Hamamatsu Photonics Kk 蛍光検出装置
BR112015007186A2 (pt) * 2012-10-16 2017-07-04 California Inst Of Techn sistemas e métodos para transdutores sem uso de fios através de antena integrada no chip
US10130288B2 (en) 2013-03-14 2018-11-20 Cell and Molecular Tissue Engineering, LLC Coated sensors, and corresponding systems and methods
US10405961B2 (en) 2013-03-14 2019-09-10 Cell and Molecular Tissue Engineering, LLC Coated surgical mesh, and corresponding systems and methods
JP6422935B2 (ja) 2013-03-15 2018-11-14 マグアレイ，インコーポレイテッド 磁気トンネル接合センサ及びその使用方法
WO2014186874A1 (en) * 2013-05-23 2014-11-27 Yyz Pharmatech, Inc. Methods and compositions for enzyme linked immuno and hybridization mass spectrometric assay
US9403198B1 (en) * 2013-08-09 2016-08-02 Todd Franssen Compositions and methods for cleaning contaminated solids and liquids
US10906075B2 (en) 2013-08-09 2021-02-02 Todd Franssen Compositions and methods for cleaning contaminated solids and liquids
KR101644623B1 (ko) 2013-10-29 2016-08-01 서울대학교산학협력단 포지티브 피드백을 이용한 수질 센서
WO2015065023A1 (ko) * 2013-10-29 2015-05-07 서울대학교 산학협력단 포지티브 피드백을 이용한 수질 센서
CN110411998B (zh) 2013-12-10 2022-06-07 伊鲁米那股份有限公司 用于生物或化学分析的生物传感器及其制造方法
WO2015089380A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 Celcuity Llc Assays and methods for determining the responsiveness of an individual subject to a therapeutic agent
US9662392B2 (en) 2014-06-03 2017-05-30 Pop Test Abuse Deterrent Technology Llc Drug device configured for wireless communication
ES2828278T3 (es) 2014-09-23 2021-05-25 Tearlab Res Inc Sistema de integración de recolección de lágrimas microfluídicas y análisis de flujo lateral de analitos de interés
WO2016057042A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Medtor Llc System and method for a non-invasive medical sensor
US10575765B2 (en) 2014-10-13 2020-03-03 Glusense Ltd. Analyte-sensing device
US10716500B2 (en) 2015-06-29 2020-07-21 Cardiac Pacemakers, Inc. Systems and methods for normalization of chemical sensor data based on fluid state changes
WO2017002080A1 (en) * 2015-06-30 2017-01-05 Kaitek Labs Spa System for the detection of paralytic shellfish poisoning related toxins based on genetically modified microorganisms
DE102015115706B4 (de) * 2015-09-17 2021-09-16 OSRAM Opto Semiconductors Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Herstellung eines optoelektronischen Bauelements
US10871487B2 (en) 2016-04-20 2020-12-22 Glusense Ltd. FRET-based glucose-detection molecules
US11160542B2 (en) 2016-06-09 2021-11-02 Haimachek, Inc. Collector for detection and reversible capturing of cells from body fluids in vivo
KR101663289B1 (ko) * 2016-07-20 2016-10-07 서울바이오시스 주식회사 포지티브 피드백을 이용한 수질 센서
US9659249B1 (en) * 2016-09-27 2017-05-23 International Business Machines Corporation Pre-programmed resistive cross-point array for neural network
KR102603196B1 (ko) * 2016-11-03 2023-11-15 엠쥐아이 테크 컴퍼니 엘티디. 생물학적 또는 화학적 분석을 위한 바이오센서들 및 이를 제조하는 방법
CN110446926A (zh) 2017-03-20 2019-11-12 凯尔科迪股份有限公司 测量用于选择治疗剂的信号传导途径活性的方法
MX359868B (es) * 2017-05-08 2018-09-25 Monroy Sampieri Carlos Sistema para captacion y monitoreo de agentes contaminantes atmosfericos.
CN108968976B (zh) 2017-05-31 2022-09-13 心脏起搏器股份公司 具有化学传感器的植入式医疗设备
CN109381195B (zh) 2017-08-10 2023-01-10 心脏起搏器股份公司 包括电解质传感器融合的系统和方法
CN109419515B (zh) 2017-08-23 2023-03-24 心脏起搏器股份公司 具有分级激活的可植入化学传感器
US20190117131A1 (en) 2017-10-24 2019-04-25 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
US11331022B2 (en) 2017-10-24 2022-05-17 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
US10426424B2 (en) 2017-11-21 2019-10-01 General Electric Company System and method for generating and performing imaging protocol simulations
CN109864746B (zh) 2017-12-01 2023-09-29 心脏起搏器股份公司 用于医学装置的多模式分析物传感器
CN109864747B (zh) 2017-12-05 2023-08-25 心脏起搏器股份公司 多模式分析物传感器光电子接口
US10861829B2 (en) 2017-12-26 2020-12-08 Illumina, Inc. Sensor system
GB2585152A (en) * 2018-02-27 2020-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior Univ Engineered immune cells as diagnostic probes of disease
US20210302318A1 (en) * 2018-07-16 2021-09-30 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agrucultural Research Organization Means and method for the real-time analysis of harvested crops
CN109897317B (zh) * 2019-03-06 2021-08-17 南京林业大学 一种纤维素纳米晶-稀土配合物-聚乙烯醇复合水凝胶荧光探针及其制备方法和应用
JP2023500014A (ja) * 2019-08-12 2023-01-04 エファレント ラブス，インコーポレイテッド 生理的変化を監視するためのウェアラブルデバイスおよび使用方法
WO2022099082A1 (en) * 2020-11-05 2022-05-12 President And Fellows Of Harvard College Fiber-optic integrated textiles with embedded freeze-dried cell-free reactions for wearable sensors
CN113121352B (zh) * 2021-04-25 2024-03-08 浙江樱玫莉雅化妆品有限公司 一种复合印迹聚合物分离纯化绿原酸的方法

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4356270A (en) 1977-11-08 1982-10-26 Genentech, Inc. Recombinant DNA cloning vehicle
US4157560A (en) * 1977-12-30 1979-06-05 International Business Machines Corporation Photo detector cell
FR2440957A1 (fr) 1978-11-13 1980-06-06 Pasteur Institut Vecteurs appropries a l'insertion dans leurs genomes de fragments d'adn etrangers, selon l'une quelconque des phases de traduction possibles, et moyens pour leur fabrication
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4444879A (en) * 1981-01-29 1984-04-24 Science Research Center, Inc. Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte
US5387247A (en) 1983-10-25 1995-02-07 Sorin Biomedia S.P.A. Prosthetic device having a biocompatible carbon film thereon and a method of and apparatus for forming such device
US4800415A (en) * 1984-09-21 1989-01-24 American Telephone And Telegraph Company, At&T Bell Laboratories Bipolar inversion channel device
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
IT1196836B (it) 1986-12-12 1988-11-25 Sorin Biomedica Spa Protesi in materiale polimerico con rivestimento di carbonio biocompatibile
GB8701731D0 (en) * 1987-01-27 1987-03-04 Patcentre Benelux Nv Sa Pumps
US5282856A (en) 1987-12-22 1994-02-01 Ledergerber Walter J Implantable prosthetic device
WO1989006700A1 (en) 1988-01-21 1989-07-27 Genentech, Inc. Amplification and detection of nucleic acid sequences
US6143508A (en) * 1989-06-29 2000-11-07 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Device and process for cell capture and recovery
US5294541A (en) 1989-09-21 1994-03-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Real-time monitoring of oxidative products from in vitro cell-biomaterial interaction using chemiluminescence
US5109850A (en) 1990-02-09 1992-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Automatic blood monitoring for medication delivery method and apparatus
JPH11508121A (ja) * 1990-03-22 1999-07-21 ザ ソーク インスティテュート フォア バイオロジカル スタディーズ 昆虫レチノイドレセプター組成物および方法
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US5846708A (en) * 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
CA2134087C (en) 1992-04-24 2007-07-17 Robert S. Ward Copolymers and non-porous, semi-permeable membrane thereof and its use for permeating molecules of predetermined molecular weight range
US5421816A (en) * 1992-10-14 1995-06-06 Endodermic Medical Technologies Company Ultrasonic transdermal drug delivery system
US5441884A (en) * 1993-07-08 1995-08-15 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis transposon TN5401
CA2149900C (en) 1993-09-24 2003-06-24 Yasuo Shikinami Implant material
US5770389A (en) * 1993-09-27 1998-06-23 Abbott Laboratories Apparatus and method for determining the quanity of an analyte in a biological sample by means of transmission photometry
US5935927A (en) * 1994-02-03 1999-08-10 The Picower Institute For Medical Research Compositions and methods for stimulating amyloid removal in amyloidogenic diseases using advanced glycosylation endproducts
WO1995024929A2 (en) * 1994-03-15 1995-09-21 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
GB9501170D0 (en) * 1994-03-23 1995-03-08 Secr Defence Luciferases
US5620883A (en) 1994-04-01 1997-04-15 The Johns Hopkins University Living cells microencapsulated in a polymeric membrane having two layers
US5569186A (en) 1994-04-25 1996-10-29 Minimed Inc. Closed loop infusion pump system with removable glucose sensor
US6001647A (en) * 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5474552A (en) * 1994-06-27 1995-12-12 Cb-Carmel Biotechnology Ltd. Implantable drug delivery pump
US5605152A (en) * 1994-07-18 1997-02-25 Minimed Inc. Optical glucose sensor
US5833979A (en) 1994-07-20 1998-11-10 Cytotherapeutics, Inc. Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
IE72524B1 (en) * 1994-11-04 1997-04-23 Elan Med Tech Analyte-controlled liquid delivery device and analyte monitor
DE69529572T2 (de) * 1994-11-10 2003-06-18 Univ Kentucky Res Foundation L Implantierbare wiederauffüllbare vorrichtung mit gesteuerter freisetzung zur verabreichung von arzneistoffen unmittelbar an einen inneren teil des körpers
FR2730812B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-14 Thomson Csf Capteur biochimique
US5961923A (en) * 1995-04-25 1999-10-05 Irori Matrices with memories and uses thereof
CA2190628C (en) * 1995-06-07 2000-05-30 Mark D. Butler An implantable containment apparatus for a therapeutical device and method for loading and reloading the device therein
GB9611437D0 (en) * 1995-08-03 1996-08-07 Secr Defence Biomaterial
US5702444A (en) * 1995-09-11 1997-12-30 Struthers, Mehta And Maxwell Implantable artificial endocrine pancreas
US5711861A (en) 1995-11-22 1998-01-27 Ward; W. Kenneth Device for monitoring changes in analyte concentration
SE9504233D0 (sv) * 1995-11-27 1995-11-27 Pacesetter Ab Implantable medical device
SE9601155D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Pacesetter Ab Anordning vid aktivt implantat
JPH10108697A (ja) 1996-10-08 1998-04-28 Kurita Water Ind Ltd アンモニア酸化細菌の硝化活性阻害の測定方法
US5795726A (en) * 1996-11-12 1998-08-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying compounds useful in treating type II diabetes
WO1998022820A1 (en) 1996-11-21 1998-05-28 Lawrence Livermore National Laboratory Detection of biological molecules using boronate-based chemical amplification and optical sensors
JP3795533B2 (ja) * 1996-12-12 2006-07-12 プロルーム・リミテツド 感染性物質を検出及び同定するための方法及び装置
US5756351A (en) 1997-01-13 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Biomolecular optical sensors
US6074859A (en) * 1997-07-08 2000-06-13 Kikkoman Corporation Mutant-type bioluminescent protein, and process for producing the mutant-type bioluminescent protein
US5902598A (en) * 1997-08-28 1999-05-11 Control Delivery Systems, Inc. Sustained release drug delivery devices
US6117643A (en) 1997-11-25 2000-09-12 Ut Battelle, Llc Bioluminescent bioreporter integrated circuit

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101506041B1 (ko) * 2009-07-13 2015-03-26 삼성전자주식회사 Ｗｂａｎ에서 통신 방법 및 장치
US9338659B2 (en) 2009-07-13 2016-05-10 Samsung Electronics Co., Ltd Communication method and apparatus in wireless body area network
WO2017022887A1 (ko) * 2015-08-06 2017-02-09 한국생명공학연구원 난분해성 유해 방향족 화합물 감지용 리포터 식물 시스템 및 이의 용도
WO2021262454A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 J. Brasch Co., Llc Calibrating a sensing device for improved analog-to-digital converter resolution utilization
US11478166B2 (en) 2020-06-26 2022-10-25 J. Brasch Co., Llc Calibrating a sensing device for improved analog-to-digital converter resolution utilization
US11730401B2 (en) 2020-06-26 2023-08-22 J. Brasch Co., Llc Calibrating a sensing device for improved analog-to-digital converter resolution utilization

Also Published As

Publication number Publication date
US20060014228A1 (en) 2006-01-19
US7208286B2 (en) 2007-04-24
JP2001524667A (ja) 2001-12-04
US7090992B2 (en) 2006-08-15
AU1705199A (en) 1999-06-15
US6905834B1 (en) 2005-06-14
EP1034424A1 (en) 2000-09-13
US7371538B2 (en) 2008-05-13
WO1999027351A1 (en) 1999-06-03
US6117643A (en) 2000-09-12
US20060281067A1 (en) 2006-12-14
KR100591965B1 (ko) 2006-06-21
AU751563B2 (en) 2002-08-22
CA2311502A1 (en) 1999-06-03
US6673596B1 (en) 2004-01-06
CA2311502C (en) 2007-10-23
US20070003994A1 (en) 2007-01-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100591965B1 (ko) 생체 발광 생체 리포터 집적회로
Nivens et al. Bioluminescent bioreporter integrated circuits: potentially small, rugged and inexpensive whole‐cell biosensors for remote environmental monitoring
Shin Genetically engineered microbial biosensors for in situ monitoring of environmental pollution
Mehrvar et al. Fiber-optic biosensors-trends and advances
Narsaiah et al. Optical biosensors for food quality and safety assurance—a review
Rainina et al. The development of a new biosensor based on recombinant E. coli for the direct detection of organophosphorus neurotoxins
Yagi Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science
Gu et al. Whole-cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application
Rupani et al. Characterization of the stress response of a bioluminescent biological sensor in batch and continuous cultures
Tescione et al. Construction and evaluation of a metal ion biosensor
US9493805B2 (en) Enzymatic biosensors with enhanced activity retention for detection of organic compounds
Gu et al. A miniature bioreactor for sensing toxicity using recombinant bioluminescent Escherichia coli cells
JPH06509712A (ja) 水の不純物を検出するための装置
US20160024552A1 (en) Biosensing system with extended lifetime via cofactor recycling
EP1317666B1 (en) Bioluminescent bioreporter integrated circuit detection methods
Lopreside et al. Bioluminescence goes portable: recent advances in whole‐cell and cell‐free bioluminescence biosensors
Eltzov et al. Fiber-optic based cell sensors
Webb et al. Kinetics and response of a Pseudomonas fuorescens HK44 biosensor
AU2001292620A1 (en) Bioluminescent bioreporter integrated circuit detection methods
Strovas et al. Measurement of respiration rates of Methylobacterium extorquens AM1 cultures by use of a phosphorescence-based sensor
DUBUC Patent 2421748 Summary
Li et al. Recent advances in the development and applications of luminescent bacteria–based biosensors
Shin Applications of microbial whole-cell biosensors in detection of specific environmental pollutants
WO2007083137A1 (en) Whole cell biosensor using the release of a volatile substance as reporter
Bidmanova et al. Online monitoring of biodegradation processes using enzymatic biosensors

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee