JP2001524667A - 生物発光バイオレポーター集積回路 - Google Patents

生物発光バイオレポーター集積回路

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ギャリー エス． セイラー，
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Abstract

(57)【要約】 バイオレポーターおよびＯＡＳＩＣを含むモノリシック生体電子工学デバイスが開示される。これらの生物発光バイオレポーター集積回路は、地下水、生産加工容器、および戦場のような荒れ果てた区域において存在する、汚染物質、爆発物、および重金属のような物質を検出する際に有用である。また、環境汚染物質検出、石油探査、薬物発見、生産加工制御、および危険化学薬品のモニタリングのための方法ならびに装置が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （１．０ 発明の背景） 本願は、１９９７年１１月２５日に出願された、米国特許出願連続番号第０８
／９７８，４３９号の一部継続出願であり、この全体の内容が、特に、その全体
が本明細書中に参考として援用される。米国政府は、エネルギー庁から認可番号
第ＤＥＦＧ０５−９４ＥＲ６１８７０号、そして米国空軍から認可番号第Ｆ４９
６２０−８９−Ｃ００２３号に準拠して、本発明における権利を有する。
【０００２】 （１．１ 発明の分野） 電子回路が、発光応答を検出するために使用され得る。特に、光学的特定用途
向け集積回路（ＯＡＳＩＣ）を使用し得、これは、アナログシグナルコンディシ
ョニング、デジタルシグナル処理、および無線送信を、電気光学的感受性検出器
と合わせたものである。バイオレポーターの発光応答に対する最大感度を達成す
るために、ＯＡＳＩＣは、４００ｎｍ〜７００ｎｍ（可視）範囲において光に感
受的であるべきであり、低い漏出電流および低ノイズであるべきであり、そして
温度および湿度のような環境因子の変化に対して最小の感度を有するべきである
。このようなデバイスは、単一の基板上で、標準的な相補型金属酸化膜半導体（
ＣＭＯＳ）プロセスによって製造され得る。
【０００３】 （１．２ 関連技術の説明） バイオセンサーは、分析的な測定エレメントと生物学的構成要素を組み合わせ
る混成デバイスである。この生物学的構成要素は、代表的に、電子的、光学的、
または機械的トランスデューサーによって定量化され得る応答を生じる目的の分
析物と、反応および／または相互作用する。最も一般的な配置は、必要な選択性
を提供する生物学的構成要素として、酵素または抗体のような固定化された生体
分子を使用する。別のそれほど使用されないアプローチは、生物学的エレメント
として、生存微生物または器官もしくは組織の切片を使用する。本来、これらの
バイオセンサー（時に、全細胞バイオセンサーと呼ばれる（Ｂｏｕｓｓｅ、１９
９６））は、増殖中の細胞の活性を検出するために電気化学的トランスデューサ
ーを使用した（Ｂｕｅｒｋ、１９９３）。全細胞バイオセンサーは、制御された
環境において機能したが、しかし大きくは標的検体以外の栄養における増殖によ
って生じる障害の理由から、広範に利用可能ではない。
【０００４】 あるいは、分子生物学的技術が、よりずっと大きな選択性を有する細胞または
バイオレポーター菌株を作製するために使用されてきた。代表的には、特異的な
プロモーター配列をコードするＤＮＡ配列が、レポーター酵素（単数または複数
）をコードする遺伝子（単数または複数）と融合され、そして宿主細胞に導入さ
れる。標的分子が存在する場合、このレポーター遺伝子は、測定されるシグナル
の生産の原因である酵素（単数または複数）を産生するように発現される。従っ
て、微生物活性の遺伝子調節（しかし、結果ではない）が、選択性を提供する。
【０００５】 いくつかの一般に使用されるレポーター酵素は、β−ガラクトシダーゼ（ｌａ
ｃＺ）およびカテコール ２，３−ジオキシゲナーゼ（ｘｙｌＥ）である。これ
らの系の両方は、熱量検出方法を使用し、シグナルを生産するために細胞破壊を
必要とする。過去１０年において、生物発光応答は容易に検出され、かつこのア
ッセイは細胞に対して破壊的である必要がないので、生物発光バイオレポーター
が一般的になってきた。従って、このバイオレポーターは、実時間において連続
的にモニターされ得る。真核生物の生物発光酵素および原核生物の生物発光酵素
の両方を使用する、遺伝子操作された生物発光バイオレポーターは、水および土
壌中の毒素および汚染物質の検出のために、ならびに汚染物質の生物分解の生物
学的利用能および機能的過程を評価するために開発されてきた。
【０００６】 バイオレポーターの生物発光は、多くの異なる型の光学的トランスデューサー
（光倍増管、フォトダイオード、ミクロチャネルプレート、写真フィルム、およ
び電荷結合素子を含む）によって検出されてきた。これらの適用の多くにおいて
、レンズ、光ファイバーケーブル、または液体光導体を使用して、光が収集され
、そしてトランスデューサーに移動される。しかし、小体積、遠隔検出、または
多重並行検出を必要とする適用は、小さくそして携帯可能であるが高感度を維持
する、新規の型の計測器を必要とする。
【０００７】 生物発光バイオレポーターは、特定の物質が代謝される場合に光を生成するよ
うに遺伝子操作された生物である。例えば、生物発光（ｌｕｘ）転写遺伝子融合
が、有機化学汚染物質（例えば、ナフタレン、トルエン、およびイソプロピルベ
ンゼン）の存在、生物学的利用能、および生物分解を検出し得る発光レポーター
細菌性菌株を発生させるために使用され得る。一般に、このｌｕｘレポーター遺
伝子は、天然もしくはベクタープラスミド中に維持された、または宿主菌株の染
色体内に組み込まれた誘導性の分解オペロンの調節制御下に配置される。
【０００８】 石油製品の広範囲な使用、および地下保存タンクが１９９８年１２月までに引
き上げられ、置き換えられ、または閉鎖されることを必要とする現行の法規のた
めに、石油汚染場所の数が多い。飲料水の質について特に関心のあることは、よ
り水溶性である成分、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼンおよびキシレン（Ｂ
ＴＥＸ）である。汚染物質のインサイチュでの生物分解に依存する天然の弱毒化
は、特に石油汚染物質について多大な注目を受けてきた（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、１９９３）。ＢＴＥＸ化合物の生物分解を可
能にする微生物は、通常これらの場所に存在するが、生物分解が生じるために条
件が好都合か否かを知る必要がある。
【０００９】 生物発光レポーターは、遺伝子発現の実時間における非破壊的なモニタリング
のために広範に使用されてきた。Ｈｅｉｔｚｅｒら（１９９２）は、より低いナ
フタレン分解オペロンのｎａｈＧ中のｌｕｘトランスポゾン（Ｔｎ４４３１）挿
入を含む、Ｋｉｎｇら（１９９０）によって構築されたｎａｈ−ｌｕｘレポータ
ー菌株ＨＫ４４を使用する、ナフタレン生物学的利用能および生物分解について
の定量的アッセイを開発した。このｎａｈ−ｌｕｘレポーターは、地下水のモニ
タリングにおける適用のための、オンライン光学バイオセンサーとしての使用に
ついて展開された（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９４）。他のｌｕｘ融合は、イソプ
ロピルベンゼン（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａら、１９９６）およびトルエン（Ｂｕｒ
ｌａｇｅら、１９９４；Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、１９９７）の分解の遺伝子を含
む、異化遺伝子の発現をモニタリングするために構築されてきた。
【００１０】 異化遺伝子融合に加えて、広範な種々の遺伝子およびオペロンが、ｌｕｘ融合
を使用して研究されている。Ｌｕｘ融合は、熱ショック遺伝子発現（Ｖａｎ Ｄ
ｙｋら、１９９４；１９９５）、酸化ストレス、（Ｂｅｌｋｉｎら、１９９６）
、Ｈｇ（ＩＩ）の存在（Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖａ、１９９３）およびアルギン酸生
成（Ｗａｌｌａｃｅら、１９９４）をモニタリングするために構築された。これ
らの全ての場合において、このｌｕｘ融合は、プラスミドに基づき、そしてｐＵ
ＣＤ６１５に含まれるＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来のプロモーターのな
いｌｕｘ遺伝子に先立って目的のプロモーターを配置することによって構築され
た（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８７）。
【００１１】 （１．３ 従来の技術の欠陥） バイオレポーターおよびＯＡＳＩＣの両方を含み、なお非常に小さく、頑丈で
あり、安価であり、低電力であり、そして無線である、モノリッシクなデバイス
について、必要性が生じている。（モノリッシクな生体電気デバイスとは、生物
学的構成要素および電気的構成要素を含み、そして単一基板層上に構築されたデ
バイスをいう。）このような生物発光バイオレポーター集積回路（ＢＢＩＣ）は
、荒廃領域（例えば、地下水、工業的プロセスの容器、および戦場）に存在する
汚染物質、廃棄物、および重金属のような物質を検出し得た。このようなデバイ
スの用途には、環境汚染物質の検出、石油の探査、薬物の発見、工業的プロセス
の制御、および有害な化学物質のモニタリングが挙げられる。低コストのこのよ
うなセンサーおよび広範な種々の配備方法は、それらの多くが非常に包括的な適
用範囲のために広範囲にわたって分布されることを可能にする。
【００１２】 （２．０ 発明の要旨） 本発明は、生物発光検出装置を使用する、サンプル中の特定の物質の検出およ
び定量のための新規のデバイスおよび方法を提供することによって、従来の技術
におけるこれらおよび他の欠陥を克服する。全体的かつ一般的な面において、本
発明のＢＢＩＣデバイスは、一般的に、基板、バイオレポーターを保有し得る基
板に対して添付された選択的透過性容器、選択的透過性容器内に含有される、特
定の標的物質を代謝して発光し得るバイオレポーター、および発光に応答して電
気的シグナルを生成するように作動する光トランスデューサーを備える基板上の
電子回路、を備える。ここで、電気的シグナルの強度は、標的物質の存在を示し
、そしてまた、標的物質の濃度をも示す。
【００１３】 この装置はさらに、窒化ケイ素の層のような、基板と容器との間に生体抵抗性
／生体適合性材料の層を備える。ＩＣは、好ましくはＣＭＯＳ ＩＣであり、そ
して光トランスデューサーは、好ましくはフォトダイオードである。ＩＣはまた
、電流−周波数変換器および／またはデジタルカウンターを備え得る。さらに、
ＩＣはまた、１以上の送信器を備え得る。このような送信器は、無線であり得る
か、または慣習的に有線であり得る。好ましい実施態様において、この装置はま
た、送信器から送信を受信し得る中央データ収集ステーションを備える。
【００１４】 この装置はまた、基板上に１つ以上の流体または栄養リザーバおよび１つ以上
の微小流体ポンプを備え、この装置とともに利用されるバイオレポーター生物体
の栄養手段を提供し得る。例示的なバイオレポーターは、１つ以上の原核生物細
胞または真核細胞（例えば、１つ以上の遺伝的に操作された細菌細胞、酵母細胞
、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞）を含み得る。あるいは、このバイオレ
ポーターは、１つ以上のポリペプチド、酵素、酵素複合体、またはこのような遺
伝的に操作された生物体からの抽出物であり得る。例示的な細菌細胞は、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔ
ｅｕｓ属などの腸内生物体を含むＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのメンバー、な
らびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属における細菌のような好気性細菌を含む。例証
的な実施態様において、本発明者らは、トルエンなどのような標的分析物の量を
検出する際に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の中に含まれるバイオレポーターを使
用する容易さを実証した。
【００１５】 選択的透過性容器は、流体（例えば、ガスまたは液体）がこのバイオレポータ
ーと接触させ得る、ポリマーマトリックスを含み得る。好ましくは、このマトリ
ックスは、光学的に清澄か、または近光学的に清澄で、検出器によって検出され
得るように、マトリックスを通過する光の透過を許容する。必要に応じて、この
ＩＣは、衛星航法システム（ＧＰＳ）を備え得る。このＢＢＩＣは、ガスまたは
液体の自由な通過を可能にするが、周囲の光をブロックするハウジング（例えば
、射出成形したプラスチック）において調製され得る。このようなハウジングは
、艶消黒色仕上げ（ｆｌａｔ−ｂｌａｃｋ ｆｉｎｉｓｈ）および迷路のような
通路を備え得る。この液体またはガスは、通路における曲がり角（ｔｕｒｎ）ま
たは曲がり（ｂｅｎｄ）を通って容易に流動し得るが、周囲の光は、各々の曲が
り角で大きく減弱される（艶消黒色仕上げに起因する）。
【００１６】 本発明のさらなる実施態様は、液体のような物質を検出するための装置であり
、この装置は、光すなわちこの物質を代謝し得、そしてこのような代謝に対する
結果として光を放射し得るバイオレポーター（このレポーターは、この物質に接
触するために適合されている）に応答して電気シグナルを回路に入力するために
適合された光トランスデューサー；およびこの光トランスデューサーとこのバイ
オレポーターとの間にバイオレポーターから放射される光が光トランスデューサ
ーに衝突することを可能にするために配置された透明で、生体適合性かつ生体抵
抗性のセパレーターを備えるＩＣを備える。このバイオレポーターは、細菌細胞
、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞、あるいは発光レポーター分
子をコードするヌクレオチド配列であり得る。この装置はまた、このバイオレポ
ーターを包み、かつこの物質とこのバイオレポーターとの間の接触を可能にする
プラスチックマトリックスを含み得る。このようなマトリックスは、この物質に
対して透過性であり得る。
【００１７】 本発明の１つの例証的な実施態様において、特定の物質の濃度を検出するため
の装置が提供され、ここでこのバイオレポーターは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細
胞である。特に、このバイオレポーターは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４細胞を含み、この細胞は、特定の標的物質を代謝し得
、そしてこのような標的物質の代謝に際して、この細胞は、次いで、検出器によ
って検出される光を放射する。次いで、この細胞によって放射される光強度のレ
ベルを定量し、次いで、サンプル中に存在する標的物質の量を決定する。この装
置はまた、この基板とこの容器との間に、少なくとも１つの窒化ケイ素の層；基
板上に流体および栄養リザーバおよび微小流体ポンプを備える。この栄養リザー
バは、その代謝活性が維持され得、そして標的物質がこの生物体によって取り込
まれ得、そして代謝され得るように、生物体の増殖および生存を可能にするため
に必要である。このポンプは、特定の増殖培地の補充および微生物集団の中での
増殖培地の循環を可能にする。天然では、この特定の増殖培地、栄養素、至適増
殖温度、ｐＨ、および他のこのような培養条件は、バイオレポーターとして利用
される生物体に依存して変動するが、各々の特定のＢＢＩＣに利用される特定の
バイオレポーター生物体に対する適切な増殖培地および適切な増殖条件を利用す
ることは、当業者の技術範囲内である。
【００１８】 好ましくは、このＩＣは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＯＭＳ）ＩＣであり、
そして好ましくは、このデバイスは、放射される光に応答して電流を発生するよ
うに作動する少なくとも１つのフォトダイオード、電流から周波数への変換器、
デジタルカウンターおよび無線送信器、ならびに送信器からの送信を受け得る中
央データ収集ステーションを備える。
【００１９】 本発明のさらなる局面は、サンプル中の物質を検出するためのモノリシックの
生体電気デバイスに関する。このデバイスは、一般に、この物質を代謝し得、そ
してこのような代謝の結果として光を放射するバイオレポーター、および放射さ
れる光の受け取りに応答して電気シグナルを発生し得るセンサーを備える。この
ようなデバイスはまた、このバイオレポーターとこのセンサーとの間に置かれた
、透明で、生体抵抗性かつ生体適合性のセパレーターを備え得る。
【００２０】 標準ＩＣは、二酸化ケイ素または窒化ケイ素のような絶縁材料の１つ以上の層
で覆われ得る。このプロセスは、パシベーションと呼ばれ、そして水分、夾雑物
、および機械的なダメージからこのチップの表面を保護するように働く。このコ
ーティングは、通常の目的のチップに対しては適切であるが、ＢＢＩＣは、標準
的なパシベーションプロセスが不適切な種々の過酷であり得る条件において使用
され得る。ＢＢＩＣは、第２のコーティングを必要とし、このコーティングは、
生体適合性かつ生体抵抗性でなければならず、化学ストレスからＯＡＳＩＣを保
護しなければならず、検査におかれている材料から光を効率的に伝達するために
光学的に調製されなければならず、酸化物コーティングに接着しなければならず
、針穴がないものでなけらばならず、そしてポンディングパッドおよびバイオレ
ポーターを維持するかまたはサンプルを収集するために必要とされ得るどんな構
造に対する開口でも形成するためにパターン化され得なければならない。
【００２１】 本発明中に記載される本発明の個々の部分が、得られ、そして個々に組み立て
られ得るが、本発明者らは、便宜上、このバイオセンサーの部分がキットの形態
で包装され得ることを意図する。キットは、適切な容器手段において、１つ以上
のバイオレポーターおよび光トランスデューサーを備えるＩＣを含み得る。この
キットは、１つ以上のバイオレポーターおよび光トランスデューサーを備えるＩ
Ｃを含む単一の容器手段を含み得る。あるいは、本発明のキットは、各成分に対
して異なる容器手段を含み得る。このような場合、１つの容器は、本明細書中で
開示される適切な培地において、前被包性または被包性のいずれかにおいて１つ
以上のバイオレポーターを含み、そして別の容器は、このＩＣを含む。このバイ
オレポーターが前被包性である場合、このキットは、１つ以上の被包培地を含み
得る。各成分に対する異なった容器手段の使用は、このキットの種々の成分の調
節を可能にする。例えば、いくつかのバイオレポーターが利用可能であり、検出
することを望む物質に依存して、このことから選択し得る。バイオレポーターを
置換することによって、このキットの残りの成分を完全に異なる目的に利用し得
、従って、成分の再使用が可能になる。
【００２２】 この容器手段は、バイアル、試験管、パケット、スリーブ、収縮包装のような
容器、またはこのキットの成分が置かれ得る、他の容器手段であり得る。このバ
イオレポーターはまた、所望されるべき、より小さい容器にアリコート（ａｌｉ
ｑｕｏｔｅ）され得る。
【００２３】 本発明のキットはまた、商業的な販売のために（例えば、中に、所望のバイア
ルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器）、密接に閉
じ込められて個々の容器を含む手段を含み得る。
【００２４】 容器の数に関係なく、本発明のキットはまた、このＩＣ上へのバイオレポータ
ーの配置を補助するための機器を含み得るか、またはこの機器とともに包装され
得る。このような機器は、シリンジ、ピペット、鉗子、または任意の他の同様の
デバイスであり得る。
【００２５】 実際、実質的に任意の適切な包装および必要とされる成分の送達は、バイオレ
ポーターが機能的なままである限り、有用であることが意図される。例えば、ア
ルギン酸のようなマトリックス上のバイオレポーターチップおよび細菌懸濁液の
長期間の貯蔵は、生物体が生存可能なままであるために冷却および乾燥防止を必
要とし得る。
【００２６】 このキットは、１つ以上の異なるバイオレポーターおよび単一の光検出器を含
み得る。例えば、サンプル中のナフタレンおよびトルエンを検出するためのキッ
トは、１つのバイオレポーター、ならびにナフタレンを検出するための生体フィ
ルム、ならびにトルエンを検出するための異なる生体フィルムおよび／またはセ
パレート生体フィルムを含み得る。この２つの生体フィルムは、別々に検査され
る各化合物とともに連続してこのセンサーに適用され得、または特定の場合では
、この生体フィルムは、このチップおよび同時に検査された化合物に直列型に適
用され得る。種々の例は、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、および図９Ｄにおいて示さ
れる。いくつかの生体フィルムは、図９Ａに示されるような配置（ａｒｒａｙ）
で置かれ得、いくつかの異なるバイオレポーターが同時に検査されることを可能
にする。本発明者らは、単一の個々の生体フィルムにより生じるシグナルが光検
出器により検出可能である場合、異なる生体フィルムの数は、無限であり得るこ
とを意図する。あるいは、図９Ｂに示されるように、各々の異なる生体フィルム
は、連続的にチップに適用され得る。さらに、図９Ｃに示されるように、いくつ
かのバイオレポーターは、１つ以上の生体フィルム内で混合され得る。また、こ
の生体フィルムは、図９Ｄのように重層されて、いくつかの生体フィルムが同時
に測定されることを可能にし得る。
【００２７】 （３．０） 図面は本明細書の一部分を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すた
めに含まれる。本発明は、本明細書で提示される特定の実施態様の詳細な記載と
組み合わせてこれらの図面の１つ以上を参照することによってより良好に理解さ
れ得る。
【００２８】 （４．０ 例示の実施態様の説明） 本発明の好適な実施態様を、図面の図１−３２に示し、用いられる同様の番号
は、種々の図面の同様および対応する部分を示す。
【００２９】 （４．１ システムの概観） フォトダイオードは、シグナルプロセッシングエレクトロニクス、およびデー
タ格納エレクトロニクス、ハード配線連絡ネットワークを経由する測定データの
送信のためのエレクトロニクスまたはデータの遠隔読み出しのための無線連絡エ
レクトロニクスのいずれかとともに半導体基板中に集積される。微小ルミノメー
ターシステムの鍵となる要素は、付随的なエレクトロニクスを製作するために採
用される半導体プロセスと適合するフォトダイオード、電気的ノイズの存在下に
おいて低レベルの光シグナルの検出用の新規な低ノイズエレクトロニクス、およ
びデータをデータプロセッシングおよび格納システムに送信する連絡エレクトロ
ニクス（ワイヤまたは無線）である。
【００３０】 図１は、本発明の斜視図を示す。検出される物質２０は、ポリマーマトリック
ス２２を通ってＢＢＩＣ２１に入る。この物質が一旦検出されると、ＢＢＩＣが
、物質の濃度を示すシグナルを中央位置に送信する。
【００３１】 図６は、本発明の側面図を示す。バイオレポーターは、ポリマーマトリックス
１０３に取り囲まれ、これは、保護コーティング１０１により光検出器１０２か
ら分離されている。単一の基板１００は、これらの要素およびシグナルをプロセ
スし、かつ送信するさらなる回路１０４を含む。
【００３２】 図３Ａは、標準的なＮウェルＣＭＯＳプロセスを用いて作成された高品質光検
出器を示す。光検出器は、２つのパラレルである逆バイアスダイオードからなる
。上部ダイオードは、Ｐ＋活性層４５とＮウェル４６との間に形成され、そして
底部ダイオードは、Ｎウェル４６とＰ基板４７との間に形成される。上部ダイオ
ードは、良好な短波長光感受性（４００−５５０ｎｍ）をもち、その一方底部ダ
イオードは、良好な長波長感受性（５００−１１００ｎｍ）を提供する。したが
って、完全なダイオードは、４００〜１１００ｎｍの範囲にわたって感受性であ
る。試験４１下の発光化合物は、Ｓｉ3Ｎ4の層４０およびＳｉＯ2の層４２によ り光検出器から分離されている。
【００３３】 図４は、単一の集積回路６０上のシグナル調整６５およびプロセッシング回路
６４とカップルした図１の光検出器６６を示す。アナログシグナル調整回路の目
的は、比較的小さな光検出器シグナルを増幅およびフィルターをかけることにあ
り、その結果、それは、送信のためにデジタル化または変調された閾値に比較さ
れ得る。広帯域ノイズの影響は、シグナルの積分により低減され得るが、積分は
１／ｆノイズに対する影響はかなり弱い。低周波ノイズの影響は、相関二重サン
プリング（ＣＤＳ）を用いることにより低減され得、ここでは２つのサンプルが
、１つのサンプルがシグナルおよびノイズからなり、そして他のサンプルがノイ
ズのみからなるように、時間の短いインターバル内で採取される。ノイズの低周
波数成分は、これら２つのサンプルの差異の中で、多いに減衰する。
【００３４】 標的にされた基質がバイオレポーターに到達するとき、それは代謝され、そし
てバイオレポーターは、約４００と約７００ｎｍとの間（可視範囲内）からの波
長で光を発出する。バイオレポーターは、光検出器上に配置されたバイオレポー
ターを維持するポリマーマトリックス中に入れられ、サンプルであるガスまたは
流体をバイオレポーターに到達させることを可能にし、そして発出した光を光検
出器に到達させることを可能にする。
【００３５】 本発明のシグナルプロセッシング部分の１つの可能な実施態様を示すブロック
ダイヤグラムを図５に示す。図３Ａ中の光検出器は、電流をグラウンドに伝導す
ることにより光に応答するフォトダイオード８１である。電流から周波数へのコ
ンバーター８２は、この電流を、デジタルカウンター８３によりカウントされる
パルスのシークエンスに転換する。固定された時間にカウントされるパルスの数
は、フォトダイオードにより収集される光の量に正比例し、それは、次に、標的
物質の濃度に正比例する。次いで、無線送信器８４は、この測定濃度８５を中央
データ収集ステーションにリレーする。
【００３６】 図８は、水および栄養分が提供されるバイオレポーターを示す。流体および栄
養分リザーバ１４１は、栄養分および流体１４４が、バイオレポーターを取り囲
むポリマーマトリックス１４３を通じて流れ得るように、微小流体ポンプ１４２
に連結される。これらの組成物の各々は、単一基板１４０上に構成される。
【００３７】 本発明の例示の実施態様は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４、ナフタ
レンバイオレポーターを、ＯＡＳＩＣにカップルすることにより構成された。得
られるＢＢＩＣデバイスは、ナフタレンに曝された。測定シグナルを図２に示す
。バックグラウンドの読み取り値は、０〜１０分まで示され、そして誘導生物発
光の間の読み取り値は、１０〜２０分まで示される。
【００３８】 必要に応じてさらなる回路がＢＢＩＣ中に含まれ得る。例えば、ＢＢＩＣは、
センサーの位置を測定するためのＧｌｏｂａｌ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓａ
ｔｅｌｌｉｔｅシステムを含み得る。
【００３９】 （４．２ 光検出器） 微小ルミノメーターシグナルプロセッシング鎖中の最初の要素は、光検出器で
ある。光検出器の鍵となる要求は： −試験下の生体発光または化学発光化合物により発光された光の波長に対する感
受性； −寄生の逆バイアスダイオードに起因する低バックグラウンドシグナル（すなわ
ち、漏出電流）； −半導体デバイス中の材料が、研究中の生体発光または化学的発光プロセスを妨
害することを防ぐため、および研究中のプロセスが微小ルミノメーターの性能を
壊すことを防ぐための適切なコーティング；および −微小ルミノメーター回路を作成するために用いた製作プロセスとの適合性、で
ある。
【００４０】 これらの要求を満足する２つの光検出器配置を以下に記載する。しかし、この
ような光検出器を構成する代替の方法が、請求項に規定されたような本発明の思
想および範囲を逸脱することなく当業者により用いられ得ることを理解すべきで
ある。
【００４１】 第１の実施態様では、光検出器は、標準的なＮウェルＣＭＯＳプロセスで製作
される。図３Ａに示されるように、この検出器は、ＰＭＯＳ活性領域とパラレル
のＮウェルとの間のＰＮ接続部を、ＮウェルとＰ型基板との間のＰＮ接続部と連
結することにより形成される。得られる検出器は、約４００ｎｍと約１１００ｎ
ｍとの間の光に感受性であり、この範囲は、最も共通に用いられる生体発光およ
び化学的発光化合物または生物の４５０−６００ｎｍの発出範囲を包含する。デ
バイスが低バックグラウンドシグナルをもつという要求を満たすために、デバイ
スは、ダイオードの作動電圧を、基板電圧に等しく設定し、ゼロバイアスで作動
される。フォトダイオードコーティングが、沈着窒化シリコン層またはその他の
半導体プロセッシング技法に適合する材料を用いて形成され得る。
【００４２】 第２の光検出器実施態様では、検出器は、シリコン−オン−絶縁体（ＳＯＩ）
ＣＭＯＳプロセスで製作される。ＳＯＩプロセス中の内部漏出電流は、活性層と
基板との間の包埋酸化絶縁層の存在に起因して、標準的なＣＭＯＳにおけるより
も２〜３オーダー低い。２つの光検出器構造は、ＳＯＩプロセス中で考案される
。図３Ｂの左に示される第１の構造は、側面ＰＩＮ検出器からなり、ここではＰ
層が、Ｐ＋接触層により形成され、このＩ（内在性）領域は、光でドープされた
活性層により形成され、そしてＮ領域は、ＳＯＩ ＣＭＯＳプロセスのＮ＋接触
層により形成される。この側面検出器のスペクトル感受性は、活性層の厚さによ
りセットされ、それは、特定の生物発光および化学的発光化合物に対してチュー
ニングされ得る。
【００４３】 図３Ｂの右側に示される第２の構造は、接続部が、沈着コバルトケイ化物（Ｃ
ｏＳｉ2）またはその他の適切な材料の層と、光によりドープされた活性層との 間のＳｃｈｏｔｔｋｙ接続で形成されていることを除いて第１と同様である。
【００４４】 本発明者らは、その他の光検出器配置が、上記で提示された規準に合致するシ
リコンまたはその他の半導体プロセスで考案され得ることを予期する。
【００４５】 （４．３ 低ノイズ電子工学） 低ノイズ電子工学は、微小照度計シグナル処理鎖における第２のエレメントで
ある。低ノイズ電子工学のための要件は、以下のとおりである： ・光検出器によって提供される非常に低いシグナルレベルに対する感度； ・シグナル処理鎖における電気的ノイズに対する免疫またはそれについての補
償； ・温度変化に対する最小感度； ・電源の電圧の変化に対する最小感度（電池出力の適用のため）； ・いくつかの適用については、電子工学は、検出されたシグナルレベルを正確
に記録するために十分な線形性およびダイナミックレンジを有さなければならな
い；および ・他の適用において、電子工学は、電気的および環境的なノイズの存在下でさ
え、シグナルの存在を単に検出しなければならない。
【００４６】 これらの要件を満足する３つの実施態様が以下に考慮される。しかし、これら
の要件を満足する一方、小さなシグナルを検出する代替の方法は、請求の範囲に
規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく使用され得ることが理
解されるべきである。
【００４７】 図７Ａは、非常に小さなシグナルの検出に対する第１のアプローチを模式的に
示す。このデバイスは、Ｐ−拡散／Ｎ−ウェルフォトダイオード、標準的なＣＭ
ＯＳ ＩＣプロセスと適合性の構造を、読み出し増幅器を用いた開路において使
用する（フォトダイオードを備えた同一のＩＣ上で作成した）。発光シグナルは
、Ｐ−拡散およびＮ−ウェルにおいて電子空孔対を生成する。Ｐ−拡散における
光生成された電子は、Ｎ−ウェル中に注入されるが、一方Ｎ−ウェル中の光生成
された空孔は、Ｐ−拡散中に注入される。Ｎ−ウェルは、大地電位に繋がれ、電
荷がこの領域で蓄積しないようにする。しかし、Ｐ−拡散は、ＣＭＯＳ増幅器の
入力インピーダンス（これは、低周波数で無限大に近づく）に結合しているだけ
なので、正電荷がこの領域に蓄積する。従って、Ｐ−拡散ノード上の電圧が上昇
し始める。
【００４８】 Ｐ−拡散電圧が上昇し始めるにつれ、Ｐ−拡散／Ｎ−ウェルフォトダイオード
は、順方向バイアスされるようになり、それによって光生成された電流とは反対
向きに電流が生成する。このシステムは、Ｐ−拡散ノード上の電圧が、光電流と
正確に等しい大きさの（しかし、極性は反対である）順方向バイアス電流を作製
する場合に、定常状態に達する。このＰＮ接合は、理想的なダイオード式からの
偏差を有さない場合、その出力電圧は
【００４９】
【数１】 であり、ここでＶtは熱電圧（室温で約２６ｍＶ）、Ｉpは光電流、ＡはこのＰＮ
接合の断面積、そしてＩsは単位断面積を有するＰＮ接合についての逆飽和電流 である。Ｉsの値は、ＩＣプロセスおよび材料のパラメータに大きく依存する。
【００５０】 ２つの主要な誤差電流（：再結合電流および生成電流）が、低電流密度で作動
するＰＮ接合に存在する。非常に低温度である場合を除き、遊離の搬送波は、Ｐ
Ｎ接合空間荷電領域において無作為に作成される。この領域は、強い場を有する
ので、これらの熱で誘発される搬送波は、迅速に接合を横切って一掃され、そし
て光電流と同じ方向に電流成分（生成電流）を形成する。空間電荷領域を横切る
搬送波はまた、再結合する有限の機会を有する。これは、光電流とは反対向きの
別の電流成分（再結合電流）を生成する。従って、これらの誤差電流を考慮する
と、式（１）は、以下のようになる。
【００５１】
【数２】 この出力電圧は、一般的に我々の制御し得ないパラメータの関数である。しか
し、我々は、接合領域Ａにわたって制御を有する。不運なことに、我々の出力シ
グナルをより大きくするためには、我々はＡが小さいことを望む。一方、我々は
、高い量子効率（ＱＥ）を求めるために大きなＡを望む。
【００５２】 図７Ｂは、これらの必要性の両方を満足する第２の微小照度計の実施態様を示
す。この回路は、効率的な光収集のための大きな領域のフォトダイオードを使用
するが、光電流を相殺する順方向のバイアス電流を供給するためのフィードバッ
クループにおいて小さな領域のダイオードを使用する。再び、その増幅器および
フィードバックダイオードは、フォトダイオードと同じＩＣ上で作成される。こ
の回路のために、
【００５３】
【数３】 ここで、Ａfbはフィードバックダイオードの小さい断面積である。１つより多
いダイオードが、任意の引き続く増幅段階のＤＣオフセットに比較して出力シグ
ナルを大きくするためにフィードバックパスにおいて使用される。この技術によ
り、大面積フォトダイオードでの光の効率的な収集が可能になり、なおかつフィ
ードバックパスにおけるその小面積ダイオードのために大きな出力電流を生じる
。
【００５４】 図７Ｂのフィードバック回路は、ゼロバイアスでフォトダイオードを維持する
。電位がかけられていない場合、電流の再結合および生成は消失するべきである
。式（３）は、より小さいフィードバックダイオードにおけるより小さい再結合
および生成電流を無視する場合、
【００５５】
【数４】 となる。
【００５６】 図７Ｂに示される第２の微小照度計の実施態様の原則的な利点は、以下の通り
である： ・ＳＮＲは、フォトダイオードによって完全に決定される。小さいダイオード
および増幅器からのノイズは無視できる； ・ダイオードは、増幅器の出力でのシグナルレベルが、引き続く段階のオフセ
ット電圧（およびオフセット電圧ドリフト）に比較して有意となるまで、フィー
ドバックパスにおいて加えられ得る； ・この方法は、さらにマスク、材料、または製作工程を加えることなしに、標
準的なＣＭＯＳプロセスと完全に適合性である； ・この検出スキームは、アナログおよびデジタルシグナル処理回路ならびにＲ
Ｆ通信回路を有する同じＩＣ上で作製し得る；ならびに ・測定は、回路に出力がかけられずになされ得る。出力は、測定が読まれる前
にかけられなければならないが、その測定は、出力なしに得ることができる。
【００５７】 図７Ｃに示した第３の微小照度計の実装は、相関二重抽出法（ｃｏｒｒｅｌａ
ｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ ｓａｍｐｌｉｎｇ）（ＣＤＳ）を使用して、低周波数（
ちらつき（ｆｌｉｃｋｅｒ））増幅器ノイズの効果および増幅器オフセット電圧
における時間または温度依存性変化を最小にするために使用する。図７Ｃに示す
ように、キャパシタンスＣdおよび雑音電力スペクトル密度Ｓiを有する光ダイオ
ードは、フィードバックキャパシタンスＣfおよび入力雑音電力スペクトル密度 Ｓvを有する集積前置増幅器に、フリップフロップ出力の論理レベルによって制 御される一組のスイッチを介してつながれる。そのフリップフロップ出力が低い
場合、そのスイッチは、光電流が増幅器から流れだし、積分器の出力電圧を増大
させるように配置される。ローパスフィルター化した積分器出力電圧が、閾値Ｖ HI を超える場合、上方のコンパレーターが「始動」し、そのフリップフロップを
設定し、そしてその出力が高くなることを引き起こす。検出器は、変化の位置を
スイッチし、電流の積分化増幅器への流れを引き起こし、次いでこれは増幅器出
力電圧が減少することを引き起こす。積分器出力が、第２の閾値ＶLOを下回る場
合、より低いコンパレーターが「始動」し、フリップフロップを再設定し、そし
て出力を再び低くする。このプロセスは、光電流が存在する限り、それ自体を反
復する。
【００５８】 出力パルスの平均期間Δｔは、以下によって与えられる：
【００５９】
【数５】 ここで、ＶHIおよびＶLOはコンパレーターの閾値電圧であり、Ｉpはダイオー ド光電流である。２つのノイズ供給源が、Δｔの測定値における誤差に寄与する
。Ｓiは、主に光ダイオードと関連する入力雑音電流電力スペクトル密度であり 、そしてＳvは、主に前置増幅器と関連する入力雑音電圧電力スペクトル密度で ある。ダイオードノイズは以下によって与えられる：
【００６０】
【数６】 ここで、Ｉsは光ダイオード逆飽和電流であり、そしてＩpは光電流である。光
電流がゼロに近づくにつれ、雑音電力スペクトル密度は、４ｑＩs Ａ2／Ｈｚの 有限値に近づく。前置増幅器のノイズ電圧Ｓvは、そのデザインによって決定さ れ、そしてＶ2／Ｈｚの単位を有する。
【００６１】 ダイオードノイズが積分器の出力に導入される点からの伝達関数は、大体以下
によって与えられる：
【００６２】
【数７】 ここで、ω1は積分増幅器のコーナー周波数であり、そしてｓ＝ｊωである。 スイッチの効果を一時無視すれば、増幅ノイズが集積器の出力に導入される点か
らの伝達関数は、大体以下によって与えられる：
【００６３】
【数８】 このスイッチは、出力パルス記号列のスイッチング周波数より下に現れるノイ
ズを減弱する相関二重抽出関数を実行する。相関二重抽出回路の伝達関数は、以
下の式によって一次のオーダーまで近似される：
【００６４】
【数９】 ここで、Δｔは出力パルス記号列の平均期間である。従って、スイッチを考慮
に入れると、増幅器ノイズが積分器の出力に導入される点からの伝達関数は、ほ
ぼ以下によって与えられる：
【００６５】
【数１０】 これは、重要な結果である。なぜなら、雑音電圧伝達関数に導入された有効ゼ
ロが、増幅器のちらつきノイズの効果を減少させるからである。これは、ちらつ
きノイズが優勢な効果を有し得る場合、微小照度計のＣＭＯＳ実装において特に
有用である。
【００６６】 積分器の出力における平均二乗出力ノイズは、
【００６７】
【数１１】 であり、次いでＲＭＳノイズ電圧は、以下によって与えられる：
【００６８】
【数１２】 測定された期間におけるＲＭＳ誤差は、以下の関係式に従って、積分されたシ
グナルの勾配および積分器の出力におけるノイズによって決定される：
【００６９】
【数１３】 または、大体、
【００７０】
【数１４】 。
【００７１】 Δｔを測定するときの誤差は、多くの出力パルスを収集し、そして平均の期間
を得ることによって減少させ得る。測定された平均のパルス期間の誤差は、以下
のような収集されたパルスの数の平方根に比例して改善する：
【００７２】
【数１５】 または
【００７３】
【数１６】 ここで、ｔmeasは、全測定時間である。
【００７４】 従って、微小照度計の実装は、以下の利点を有する： ・増幅器の低周波数「ちらつき」ノイズは、相関二重抽出プロセスによって低
減される；および ・理想的には、測定された光電流の精度が、漸増する時間の間データを収集す
ることによる限定なしに改善され得る。
【００７５】 当然に、試験される発光化合物によって生成されるシグナルの寿命および安定
性によって課される実施上の制限によって、この実装の分解能が最終的に決定さ
れる。
【００７６】 （４．４ 読み出し電子工学） 微小照度計からのデータの読み出しのいくつかの方法が使用され得る。これら
には以下が含まれる： ・光電流に比例するＤＣ電圧レベルの生成； ・光電流に比例するＤＣ電流レベルの生成； ・その割合が光電流に比例する論理パルス信号列の生成； ・光電流に比例する数値を報告するアナログからデジタルへの変換器のオンチ
ップ実装； ・光電流に比例する数を報告する連続的または平行な通信ポートのオンチップ
実装； ・光電流の値を報告するオンチップ無線通信システムの実装； ・光電流が予備決定されたレベルを超える場合の論理フラグの生成；および、 ・光電流が予備決定されたレベルを超える場合の高周波シグナルまたはビーコ
ンの生成。
【００７７】 （４．５ 栄養素送達システム） 図８は、ＢＢＩＣ上の生きているバイオレポーターに栄養素を提供する方法の
１つを例示する。その概念は、３つの主要な構成要素を有する： ・液体および栄養素リザーバ； ・微小流体ポンプ；および ・ＢＢＩＣ。
【００７８】 ＢＢＩＣとは異なる基板上の流体および栄養素リザーバおよび微小流体ポンプ
は、実装するのがより容易であり得る。しかし、３つ全ての構成要素を同じモノ
リシック基板上に配置する実装がまた使用され得る。
【００７９】 リザーバは、適切な栄養素を溶液中に保持する単なる容器である。これは、チ
ップの流体領域にわたって厚い酸化物を沈着させ、そして写真平板術によってリ
ザーバ空間を規定することによってオンチップで実装され得る。このような実装
の容量を増大させるために、外部容器（例えば、プラスチックのピペットチップ
）を、適切なエポキシでオンチップリザーバに付着させ得る。
【００８０】 微小流体ポンプが、蠕動ポンプ、導電性ポリマーポンプ、および電気浸透圧性
ポンプを含む多くの様式で実現されている。オンチップポンプについて、電気浸
透圧性ポンプは、最も適合性である。このデバイスは、Ｓｉへと食刻され、次い
で熱で発生する酸素で被覆されているキャピラリーからなる。上部のプレートは
、適切なポンプ操作のために必要とされる。Ｓｙｌｇａｒｄ１８４（Ｄｏｗ Ｃ
ｏｒｎｉｎｇ）の商標名で販売されているポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）
が、上部のプレートを被覆するために使用され得る。ガラスまたはクォーツのス
ライドがまた、上部のプレートを形成するために使用され得る。キャピラリーは
、数十ミクロンの幅であり、そして数十ミクロンの深さである。その長さは、数
センチメートルであり得るが、ＢＢＩＣ上では、数ｍｍの大きさである可能性が
高い。ポンプを活性化するために、電圧をキャピラリーを横切ってかける。キャ
ピラリー電気泳動の適用において、１ｋＶ程の大きさの電圧が、迅速な分離のた
めに必要とされる。しかし、この適用において、本発明者らは、わずか数ボルト
での操作を期待する。
【００８１】 重力ポンプはまた、キャピラリーのフロアがスラント（斜め）である場合、使
用され得る。バイオレポーターへ流体を供給するキャピラリーの末端は、流体の
流れを調節するために制限され得るか、またはアクチュエーター（例えば、微小
カンチレバー）が流体の流れをゲートし得る。実際には、小さく、低電力であり
、そして低電圧から操作し得る任意のポンプが、オンチップまたは別々の基板上
のいずれかで使用され得る。
【００８２】 （４．６ 化学的および生物学的薬剤のためのバイオセンサー） 「バイオセンサー」は、一般に、認識生体分子と適切なトランスデューサーと
の組み合わせに基づく、小さく、可搬性の、分析用デバイスをいい、これは、選
択的に、そして高感度で、化学的または生物学的材料を検出する。この主題に関
する論文が、Ｐａｄｄｌｅ（１９９６）によって与えられ、これから以下が引用
される： これらは、空気、水、または土サンプルのような種々の供給源から毒性基質を
検出するために使用され得るか、または囲われた環境をモニターするために使用
され得る。これらはまた、インビボで薬物および代謝産物レベルをモニターする
ためのカテーテルとして、または例えば、血液および尿のサンプル中の毒性物質
、薬物、もしくは代謝産物の分析のためのプローブとして処方され得る。これら
の可能性を有するいくつかのバイオセンサーは、現在、市販されているか、また
は商業的開発中であるかのいずれかである（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、１９８９；Ｇ
ｕｉｌｂａｕｌｔおよびＳｃｈｍｉｄｔ、１９９１；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｉｃａｚ
ａおよびＢｉｌｉｔｅｗｓｋｉ，１９９３）。
【００８３】 大多数の総説的文献（例えば、Ｎｏｒｔｈ，１９８５；ＦｒｅｗおよびＨｉｌ
ｌ，１９８７；Ｓｃｈｕｌｔｚ，１９８７；ＧｕｉｌｂａｕｌｔおよびＬｕｏｎ
ｇ、１９８８；Ｂｌｕｍら、１９８９；Ａｒｎｏｌｄ，１９９０；Ｂｌｕｅｓｔ
ｅｉｎおよびＣｈｅｎ，１９９０；Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ，１９９０；Ｈｅｎｄ
ｒｙら，１９９０；Ｋａｒｕｂｅ，１９９０；ＫｉｍｕｒａおよびＫｕｒｉｙａ
ｍａ，１９９０，ＲｅｃｈｎｉｔｚおよびＨｏ，１９９０；Ｗｉｎｇａｒｄ，１
９９０；Ｔｉｅｎら、１９９１；ＫａｕｆｆｍａｎおよびＧｕｉｌｂａｕｌｔ，
１９９２；Ｇｒａｔｅら、１９９３）およびいくつかの書籍（例えば、Ｊａｎａ
ｔａ，１９８９；Ｔｕｒｎｅｒら，１９８９；Ｈａｌｌ，１９９１）は、個々の
バイオセンサー技術およびそれらの開発の理論的および実践的な局面の両方を記
載している。
【００８４】 （４．６．１ バイオセンサー） バイオセンサーにおいて、異なる生物学的エレメントは、生物学的エレメント
の基質との反応がモニターされ得る場合、種々の種類のトランスデューサーと組
み合わせられ得る。表１は、利用可能なトランスデューサーのタイプ、およびバ
イオセンサーを形成するようにそれらと組み合わせられている生物学的エレメン
トを列挙する（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、１９８９；ＧｕｉｌｂａｕｌｔおよびＳｃ
ｈｍｉｄ，１９９１；Ｓｗａｉｎ，１９９２；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｉｃａｚａおよ
びＢｉｌｉｔｅｗｓｋｉ，１９９３；ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨａｌｌ，１９
９３）。
【００８５】 （４．６．１．１ バイオセンサーの生物学的構成要素） バイオセンサーの生物学的構成要素は、分析物の選択的認識を担うのみではな
く、トランスデューサー上でモニターされる物理化学的シグナルの生成、そして
最終的に最終デバイスの感度もまた担う（Ｌｏｗｅら，１９９０）。これらは、
２つの異なる分類に分割され得る：触媒および非触媒（Ｓｃｈｅｌｌｅｒら、１
９８９；ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨａｌｌ，１９９３）。触媒のグループには
、酵素、微生物、および組織が含まれる。これらのエレメントを取り込むデバイ
スは、ミリモル濃度からマイクロモル濃度の範囲で代謝物をモニターするために
適切であり、そして連続的なモニタリングに使用され得る。非触媒性または親和
性クラスの生物学的構成要素は、マイクロモル濃度〜ピコモル濃度範囲の濃度に
おいて、ホルモン、ステロイド、薬物、微生物トキシン、癌マーカー、およびウ
イルスの測定のための「単回使用」の使い捨てデバイスに一層適用可能な抗体（
または抗原）、レクチン、レセプター、および核酸を含む。より最近には、抗体
またはＤＮＡ／ＲＮＡプローブの高親和性（「不可逆」）結合の両方の寄与を祖
嘘の増幅特徴と組み合わせるバイオセンサーのハイブリッドコンフィギュレーシ
ョンが導入されている。これらのシステムは、ピコモル濃度〜フェムトモル濃度
（１０-12〜１０-15Ｍ）の濃度範囲およびより低い濃度範囲で分析物をモニター
し得る（Ｌｏｗｅら，１９９０）。
【００８６】
【表１】 （４．６．１．２ 酵素） 分析的な観点から、最も重要な酵素クラスは、酸素またはＮＡＤを用いて化合
物の酸化を触媒する酸素還元酵素、ならびに化合物の加水分解を触媒する加水分
解酵素である（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９７８、１９７９
；Ａｌｖａｒｅｚ−ＩｃａｚａおよびＢｉｌｉｔｅｗｓｋｉ、１９９３）。陽子
、イオン、熱、光、電子、および質量のような変換可能な成分の値域は、酵素の
触媒機構の一部として交換され得るため、最も成功したバイオセンサーは、生物
学的な認識／応答システムとして酵素を利用する（Ｌｏｗｅ、１９８９）。この
触媒活性を、ｐＨ、イオン強度、温度、および補因子の存在によって制御する。
酵素安定性は、通常、バイオセンサー酵素に基づく寿命の決定における決定的要
因である（代表的には、１日と１または２ヶ月との間（Ｒｅｃｈｎｉｔｚおよび
Ｈｏ、１９９０）。
【００８７】 動物または植物の供給源に由来するオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉
緑体）、細胞全体（例えば、細菌）、または組織切片は、広範な臨床的な目的の
代謝産物に対するバイオセンサーにおける生体触媒パッケージとして使用されて
きた。多数の酵素と共に、進化によって最適化されてきた環境において基質を産
物に変換することを必要とされる全ての他の必要な成分が存在する（Ｓｃｈｅｌ
ｌｅｒら、１９８９；ＲｅｃｈｎｉｔｚおよびＨｏ、１９９０）。このようなシ
ステムの使用の主な欠点は、それらの多機能酵素的な振る舞いであり、基質特異
性の減少を生じる。しかし、このような振る舞いは、単に外部の実験条件を変化
させることにより異なる基質を同じ生体触媒材料を用いて測定し得るため、時に
は利点を提供し得る。酵素の阻害剤、活性化剤、および安定化剤の適切な使用は
また、組織に基づくバイオセンサーの選択性および寿命を増強するために使用さ
れ得る（ＲｅｃｈｎｉｔｚおよびＨｏ、１９９０）。
【００８８】 （４．６．１．３ レセプター） 天然に存在するレセプターは、細胞膜に架かる非触媒性のタンパク質であり、
細胞内部および細胞外部の両方の領域に伸長する。これらは、嗅覚および味覚の
ような化学感覚、ならびに代謝経路および神経生化学的経路に関与する。生物体
において、これらは、標的細胞の膜を介してメッセージを伝達するために、他の
細胞から遊離した可逆的な結合特異性の神経伝達物質およびホルモンによる、細
胞−細胞の情報伝達におけるリンクとして作用し、その細胞の活性を始動または
減退する。これらはまた、多数の薬物および毒の結合部位である。レセプターの
細胞外側への伝達物質分子の結合が、それによって細胞内プロセスの修飾を誘導
する、２つの方法が定義されてきた。
【００８９】 バイオセンサーにおける認識エレメントとして神経レセプターを使用する試み
は、大部分は、電気ウナギの電気器官から単離され得たニコチン性アセチルコリ
ンレセプター（ｎ−ＡｃｈＲ）、あるいは比較的に大量な放射光に限定されてき
た。バイオセンサーの使用についての他のレセプターの利用不可能性は、おそら
く、それらは通常、組織において微量でしか存在せず、いったん天然の脂質膜環
境から取り出すと不安定であるという事実の反映である。しかし、外来の細胞株
におけるレセプターＤＮＡの発現産物は、天然の開始材料と完全に同一ではない
が、バイオセンサー用途に有用なタンパク質を産生し得る（Ｗｉｎｇａｒｄ、１
９９０）。このｎ−ＡｃｈＲおよび会合したイオンチャンネル複合体は、天然に
存在するいくつかの毒素に結合する。
【００９０】 （４．６．１．４ 抗原および抗体） 抗原は、自身に対して外来であるとして動物の生物体によって認識され得る任
意の抗原分子種である。従って、これらは免疫応答として公知の防御機構を誘起
する。認識は、約１０，０００Ｄａのより低い分子量の、切り捨てを有する（Ｖ
ａｎ ＥｍｏｎおよびＬｏｐｅｚ−Ａｖｉｌａ、１９９２）。天然の環境におい
て、このような抗原は、代表的に、ウイルス、細菌、および微小真菌の表面のタ
ンパク質またはリポ多糖類、あるいは細胞表面、および他の種の血液または組織
における溶液、あるいは同種の異なる個体の血液または組織における溶液にさえ
存在するタンパク質またはリポ多糖類である。外来のＤＮＡまたはＲＮＡはまた
、植物起源の物質である場合、抗原性である。
【００９１】 抗体（Ａｂ）は、抗原への応答において、動物によって産生される分子であり
、特異的に抗原に結合する。農薬、除草剤、微生物毒素、および化成物のような
、より微小な分子量の環境性の汚染に対する抗体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアタン
パク質への後者の第１の共有結合的付着の後に作られ得る（Ｖａｎ Ｅｍｏｎお
よびＬｏｐｅｚ−Ａｖｉｌａ、１９９２）。生じた結合体の微小な分子成分は、
抗原認識のために修飾され、これはハプテンとして公知である。細菌、植物、お
よび動物起源の他の生体毒素の宿主は、ハプテン−タンパク質結合体の形成によ
って、抗原性であるかまたは抗原性を与えられ得るかのいずれかである。
【００９２】 哺乳動物において、異なる型の２つの分子は、抗原の認識に関与する。これら
は免疫グロブリンと呼ばれるタンパク質で、血清および組織液に存在し、そして
分化した血液細胞Ｔリンパ球の表面の抗原レセプターである。免疫グロブリン、
すなわち抗体の、抗原に対する選択的かつ堅固な結合特性は、免疫学的方法の分
析において使用される。最も高度な動物における免疫グロブリン、すなわち抗体
は、５つの異なるクラスに分類される（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｉ
ｇＤ、およびＩｇＥ）。これらは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、および炭水化
物含量において互いに異なる。これらは全て、糖タンパク質であるらしいが、炭
水化物含量は２〜３％（ＩｇＧ）から１２〜１４％（他の免疫グロブリン）にわ
たる。全ての免疫グロブリン分子の基本構造は、ジスルフィド結合によって共に
連結された２つの同一の軽鎖ポリぺプチド鎖および２つの同一の重鎖ポリペプチ
ド鎖からなるＹ形状単位である。Ｙの「アーム（ａｒｍ）」のアミノ末端は配列
可変性によって特徴付けられ、そして抗原結合部位である。ＩｇＧは、抗体の排
他的な抗毒素クラスである。ＩｇＭは、５つのＹ形状単位の五量体であり、この
分子の役割は、感染性の生物体を複合体化することのようである（Ｔｕｒｎｅｒ
、１９８９）。
【００９３】 トランスデューサー表面での抗体への抗原の結合は、直接的および間接的に測
定され得る。結合は、抗原または抗体の蛍光標識との結合体化によって検出され
得る（Ａｎｉｓら、１９９２；Ｏｇｅｒｔら、１９９２；ＬｅｅおよびＴｈｏｍ
ｐｓｏｎ、１９９３）。
【００９４】 （４．６．１．５ 核酸） ＤＮＡの鎖に沿う塩基の特定の配列、および二重へリックスにおいて隣接する
鎖の塩基対間の結合の独特の相補的な性質（アデニンおよびチミン、またはシト
シンおよびグアニン）は、生物多様性の根底をなす。試料において一重鎖の核酸
分子のその相補的なパートナーを認識し、そして結合（ハイブリダイズ）する能
力は、遺伝学的分析に使用されており、またバイオセンサーにも使用され得る。
【００９５】 試料調製は、１つ以上の以下の工程を含み得る：（ａ）試料中の細胞からＤＮ
Ａを抽出する工程；（ｂ）一重鎖形態のＤＮＡの調製；および（ｃ）ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）（Ｓａｉｋｉら、１９８５）の使用によって存在するＤ
ＮＡ総量を増加させる工程。
【００９６】 別の可能性は、ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーター、リプレッサー、および制
限酵素のようなＤＮＡ結合タンパク質を使用することであり、これらは、二重鎖
形態の特定のＤＮＡ配列に結合する能力を示し、バイオセンサーを発現する（Ｋ
ｕｎｇら、１９９０；Ｄｏｗｎｓ、１９９１）。一重鎖形態のＤＮＡの調製およ
びその引き続くハイブリダイゼーションを必要としないので、この方法はより短
時間の調製時間を必要とする。
【００９７】 （４．６．２ ウイルス、細菌、および真菌） ウイルスは、微小な細胞寄生生物であり、自身では複製をし得ない。これらは
、特異的なレセプターを介して細胞に付着し、そしてこれらは、どの細胞型に感
染するかを部分的に決定する。感染した特定の細胞は、ウイルスの細胞内部複製
に伴なって生じる複雑な生化学的妨害によって、究極的に破壊される。ウイルス
は一重鎖または二重鎖のいずれかのＲＮＡまたはＤＮＡを含み、通常、ウイルス
に特異的な１つ以上のタンパク質または糖タンパク質の外殻によって囲まれてい
る。いくつかのウイルスにおいては、主として脂質からなるが、いくつかのウイ
ルスに特異的なタンパク質も含むさらに外側の包膜が存在する。表面被膜タンパ
ク質はウイルス抗原であり、免疫応答および抗原産生を誘起する（Ｒｏｏｋ、１
９８９；Ｄａｒｎｅｌｌら、１９９０）。ウイルス（および細菌）は、自身の表
面に大量の抗原決定基を有するため、各生物体は多くの抗体単位に結合し得る。
この結果は、ハプテン−抗体複合体を越える、ウイルス−抗体複合体の安定性の
顕著な増加を生じる（抗体に依存して１０3〜１０4倍まで増加する）。
【００９８】
【表２】 特定の病原性の細菌は、それらが産生する疾患の特定の症状の基礎を成す機構
の一部として外毒素を合成し、そして分泌する。感受性の哺乳動物細胞を毒する
かまたは殺傷するこれらのタンパク質の例は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔ
ｅｒｉａトキシン、Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓエンテロトキシン、破傷風毒素お
よびｂｏｔｕｌｉｎｕｍ神経毒、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅにより産生
される毒素である。他の病原性の細菌（表２のＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＢｒ
ｕｃｅｌｌａ種）は、それらが溶解した場合、毒素を遊離する。これらの毒素は
、細菌細胞壁の成分であり、そしてタンパク質、脂質および炭水化物の接合体で
あり、そして内毒素と呼ばれている。両タイプの毒素は、抗原性である。異なっ
たタイプの細菌は、細胞壁構造が異なる。全タイプは（グラム陽性（Ｇ＋）、グ
ラム陰性（Ｇ−）および放線菌）は、内部細胞膜およびペプチドグリカン壁を有
する。グラム陰性細菌はまた、リポ多糖が時々見出される外部脂質二重層を有す
る。細菌の外表面はまた、線毛もしくはべん毛を含み得るか、または保護性カプ
セルにより覆われ得る。これらの構造におけるタンパク質および多糖類は、抗体
応答に対する標的として作用し得る。
【００９９】 いくつかの真菌は、ヒトに対して病原性である。なぜなら、それらは、身体組
織に侵入し得、毒素を遊離するというよりはむしろそこで増殖し得るからである
。これらのうちの３つは、表２に列挙される。他の真菌は、それらが産生し、そ
して環境中に遊離する毒素のためにヒトに対して危険である。後者の特定の例は
、上述のトリコテセンミコトキシンを産生するフサリウム種である。
【０１００】 真菌は、バイオレポーターとして利用され得る。本発明者らは、本発明の方法
において、真菌（例えば、酵母）の使用を意図する。例えば、酵母株は、酵母が
環境シグナルまたはストレスへの応答における生物発光シグナルを発する細菌種
について本明細書中に開示された方法と類似の方法により構築され得る。
【０１０１】 （４．６．３ 抗体に基づいたバイオセンサー） 酵素ベースおよびレセプターベースのストラテジーが、バイオセンサーの開発
のために利用可能でない広範な毒素が存在する。しかし、適切な抗体を入手し得
ることを想定して、抗体に基づいたバイオセンサーは、毒素化学のいくつかにつ
いて、およびおそらく全ての毒素について、そして表２に列挙された病原性の微
生物について可能である。
【０１０２】 免疫センサーの開発において連続するチャレンジの１つは、適切な表面上に高
密度で抗体を固定し得る事であるが、一方、結合部位のステアリン酸の妨げを機
能的に配置し、そして予防することをさらに維持することである。これは、ガラ
ス、またはシリカおよび金表面上に、自己集合長鎖アルキル膜系（ＳＡＭＳ）の
使用を導いた。それぞれの鎖における末端官能基は、抗原結合部位の均一な幾何
学的配列を形成する抗体または抗体画分の特定のグループと反応するように設計
される（Ｂｈａｔｉａら、１９８９；Ｚｕｌｌら、１９９４；Ｍｒｋｓｉｃｈお
よびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、１９９５）。
【０１０３】 固定化抗体の安定性はまた、将来の免疫センサー研究のための重要な因子であ
る。これに関連した問題は、捕捉プロセスについての系の現場での調製が必要と
される場合、これは、これをスピードアップするために開発される必要のあるい
くつかの時間および方法をとり得ることである。圧電デバイス上の固定化につい
てより重要であるさらなる要求は、センサー表面への非特異的なタンパク質の結
合を減少する必要がある（Ａｈｌｕｗａｌｉａ、１９９１）。おそらく、この問
題への１つのアプローチは、例えば、１つはＦａｂ−ＳＨ基との反応に対する末
端官能基を有し、そして他方は、膜表面のタンパク質の非特異的吸着に抵抗する
エチレングリコールの短いオリゴマーを示す、２つの長鎖アルカンチオレートの
混合物から形成されたＳＡＭを使用することである（Ｚｕｌｌら、１９９４；Ｍ
ｒｋｓｉｃｈおよびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、１９９５）。この混合物は、共有結
合した抗体画分の間隔を調節し、そして特定の抗原結合の最適化する可能性を許
容する。
【０１０４】 ほとんどの免疫学的反応は、それらの大きな会合定数（１０5〜１０9Ｍ-1のＫ a ）のせいで基本的に不可逆である。Ｋaは、それぞれ１０7〜１０9Ｍ-1ｓ-1およ
び１０2〜１０-4ｓ-1の範囲の大きな正方向［ｋ1］および小さな逆方向［ｋ-1］
の速度定数から構成される（ＢａｒｎａｒｄおよびＷａｌｔ、１９９２）。リア
ルタイムでの可逆的な測定を可能にする十分に速い抗原解離定数を有する抗体の
開発は（Ｎｏｒｔｈ、１９８５；Ｒｏｅ、１９９２）、抗体の置換またはカオト
ロピック溶液の使用による結合の可逆を必要とせずに抗原の持続的または少なく
とも連続的な測定を導き得る（Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、１９９０；Ｗｉｊｅｓｕ
ｒｉｙａら、１９９４ｂ）。組換え技術は、新規の結合特性を有する抗体の産生
を最終的に可能にする。
【０１０５】 不可逆性の問題を解決し得るアプローチは、触媒抗体の開発である（Ｌｅｒｎ
ｅｒら、１９９１；Ｈａｙｎｅｓら、１９９４）。遷移状態の立体電気的な特性
を模倣して設計されたハプテンは、エステルおよびアミドの単純な加水分解から
生理的対応物を欠くか、または通常の不利益である反応までの範囲の、化学的形
質転換の幅広い範囲を触媒する能力のある抗体を誘導し得る（Ｌｅｒｎｅｒら、
１９９１；Ｈａｙｎｅｓら、１９９４）。（分子認識エレメントとして触媒抗体
を使用する電位差測定のバイオセンサーは、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、（１９９０
）により記載された。）従って、触媒抗体が、毒性化学物質および毒素について
得られ得る場合、次いで、これらの物質に対するバイオセンサー（無人の連続的
な実行を可能にし、そしてセンサー材料の新鮮な供給を必要としない）は、現実
味を帯びてきていると考えられる。
【０１０６】 あるいは、センサーの設計において効率的に免疫反応を利用するために、不可
逆性の問題は、特定のデバイスの検出部分に免疫試薬を受動的に放出するリザー
バーを作成することにより回避され得る。調節された放出ポリマーは、この問題
に対して使用された（ＢａｒｎａｒｄおよびＷａｌｔ、１９９２）。
【０１０７】 近年、Ｗａｌｌａｃｅおよび共同研究者ら（Ｓａｄｉｋら、１９９４を参照の
こと）は、Ａｇ−Ａｂ相互作用が複数工程プロセス（離れた距離に従う種々の異
なった分子相互作用を含む）なので、特異性が、初期の段階で閉じ込められ、そ
して不可逆性が、構造変化に伴って後の段階で引き起こされることが可能である
ことを示唆した。Ｗａｌｌａｃｅらは、タウマチンに対する抗体を含むポリピロ
ールのフィルムでコートされた白金電極を用いてパルスされた電流測定から、こ
の特異性の証拠を示した。抗原の存在下において適用された電位の連続したパル
スの間、電流の迅速かつ可逆的なピークは、その高さが抗原濃度に直接比例して
観察された。ＢＳＡおよび他のタンパク質の注入は、非常に減少した応答を与え
たが、どれくらいこれが電荷構造の差異に起因するか明らかでない。
【０１０８】 （４．６．４ 核酸に基づいたバイオセンサー） 遺伝子プローブアッセイにおける調製工程に消費する時間は、病原性微生物の
現場での検出のためのバイオセンサーの基礎として考慮されるそれらを困難にす
る。主要な時間消費工程は、ＤＮＡ単離および増幅（ＰＣＲTM）手順ならびにハ
イブリダイゼーション検出工程である。近年、光ファイバーの表面上でｓｓ−Ｄ
ＮＡを増殖すること、および結合したＤＮＡの二本鎖領域にトラップされた臭化
エチジウムの蛍光を用いることにより、試料中の相補ｓｓ−ＤＮＡとのハイブリ
ダイゼーションプロセスを検出することが可能である（Ｐｉｕｎｎｏら、１９９
４）。一方、このような核酸に基づくセンサーが、非常に感受性でありそして選
択的である可能性は、抗体に基づくバイオセンサーを越えていくつかの利点を有
する。最初に、それはより安定であり、そして長期間貯蔵され得る。また、プロ
ーブは、熱い緩衝液中で短い浸漬によりさらに使用するために繰り返し再生され
得る。さらなる研究は、病原性の細菌および真菌に対する適切なＤＮＡプローブ
の開発（Ｓｍｉｔｈら、１９９４）、およびセンサー表面上にそれらを固定する
方法の改善に対して指向している。ハイブリダイゼーションの検出は、ガラスフ
ァイバー表面に固定化されたｓｓ−ＤＮＡに直接ｄｓ−ＤＮＡ感受性蛍光色素を
共有結合で固定化することによりさらに改善され得る（Ｐｉｕｎｎｏら、１９９
４）。
【０１０９】 （４．７ 多重化生物発光を用いる微生物バイオセンサー） 全細胞バイオセンサーは、シグナル伝達機構により、および非特異的干渉によ
り感受性および信頼性の点から時折制限される。ＷｏｏｄおよびＧｒｕｂｅｒは
、容易に測定可能なシグナルに微生物の遺伝的感覚性機構を正確に形質導入する
ことの概観を提供する（ＷｏｏｄおよびＧｒｕｂｅｒ、１９９６、本明細書に参
考として援用される）。生細胞が、何百の相互作用している生物化学的経路の定
常状態アンサンブルであるので、影響のない経路の１つに、いくつかの程度まで
、いくつかの他の経路を変化することは困難である。細胞において同時に検出さ
れる多くの潜在的な内部および外部状態とともに、任意の１つの変化は、予測不
可能な方法において細胞生理に影響し得る。微生物センサーにおいて、これは、
環境条件に信頼できない応答および解釈できない応答でさえ導き得る。
【０１１０】 さらに信頼性のある微生物センサーを作成するために、非特異的刺激の効果を
確認すること、およびセンサー応答からそれらを除去することが必要であり得る
。非特異的刺激の累積的な効果は、内部標準シグナルを生じる第２シグナルトラ
ンスデューサー（特異的遺伝的検出系に結合しない）を介して決定され得る。こ
のコントロールシグナルは、標的シグナルと比較する動的ベースラインとして使
用し得る。標的トランスデューサーからのシグナルが、コントロールシグナルに
標的シグナルを規準化することにより標的化刺激および非特異的刺激の両方の効
果を示すので、標的刺激の効果は単離され得る。
【０１１１】 これは、生細胞の複合体化学環境と本質的に同一のふるまいをするが、容易に
分化したシグナルを生じる２つの遺伝的レポーターを使用することにより成し遂
げられ得る。好ましい実施態様において、２つの遺伝的レポーターは、互いの間
にかすかな改変を有する生物発光タンパク質を含み得、このような改変は、発光
波長の識別可能な変化を提供する。このような改変体の例は、多くの生物発光レ
ポーターとして市販され、当該分野で周知である（例えば、Ｗｏｏｄ、１９９０
を参照のこと）。
【０１１２】 多重生物発光レポーターは、２つの機能的バイオレポーターを含む単一のポリ
ペプチドに翻訳されるように構築され得る。１つ以上のレポーターの発光スペク
トルは、このような構築物中の１つ以上の他のレポーターの発光の範囲内である
場合、本発明者らは、この「ハイブリッド」構築物が、増加したシグナルの強度
または感受性、あるいは１つのみのレポーターを含むそれらの両方を提供するこ
とを意図する。あるいは、単一のポリペプチドに翻訳さるように対立した場合、
多重生物発光レポーターは、互いに結合するレポーターを許容するか、または互
いに近接している領域をコードする別々のポリペプチドに翻訳され得る。「近接
する」とは、１つ以上のレポーターの発光が１つ以上の他のレポーターを励起し
得る配置をいう。
【０１１３】 （４．８ 組換えベクター発現生物発光遺伝子） 本発明の１つの重要な実施態様は、１つ以上の生物発光ポリペプチドをコード
する１つ以上の核酸セグメントを含む組換えベクターである。このようなベクタ
ーは、原核生物または真核生物宿主（細菌細胞が原核生物宿主として特に好まし
く、酵母細胞が真核生物宿主として特に好ましい）に移入され得るかまたは複製
され得る。
【０１１４】 他の実施態様において、特定の利点は、組換えプロモーターの制御下または異
種プロモーターの制御下で、ＤＮＡセグメントをコードする配置により得られる
ことを意図する。本明細書で使用される場合、組換えまたは異種プロモーターは
、その天然の環境において結晶タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡセ
グメントと通常関連していないプロモーターをいうことを意図する。このような
プロモーターは、任意の細菌、ウイルス、真核生物、または植物細胞、あるいは
両方から単離された他の遺伝子またはプロモーターと通常関連したプロモーター
を含み得る。天然に、発現のために選択された細胞型、生物、またはさらに動物
において、ＤＮＡセグメントの発現を有効に指向するプロモーターを使用するこ
とが、重要である。タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型の組み合
わせの使用は、一般に、分子生物学の分野の当業者に公知である（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと）。使用されたプロモーターは、構成型
または誘導型であり得、そして導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指
向するのに適切な条件下で使用され得る。
【０１１５】 第１の実施態様において、組換えベクターは、１つ以上の生物発光ポリペプチ
ドをコードする核酸セグメントを含む。高度に好ましい核酸セグメントは、Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉｉのｌｕｘ遺伝子であるｌｕｘＣＤＡＢＥである。
他の好ましい核酸セグメントは、ホタルルシフェラーゼ、他のカブトムシのルシ
フェラーゼタンパク質、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（Ｇｏｎｙｌａｕｌａ
ｘ；Ｐｙｒｏｃｙｓｔｉｓ）、Ａｎｎｅｌｉｄｓ（Ｄｉｐｏｃａｒｄｉａ）、Ｍ
ｏｌｌｕｓｃｓ（Ｌａｔｉｖａ）、Ｃｒｕｓｔａｃｅａ（Ｖａｒｇｕｌａ；Ｃｙ
ｐｒｉｄｉｎａ）、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａまたはＲｅｎｉｌｌａ
ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのグリーン蛍光タンパク質、あるいは生物発光の能力の
ある他の生物由来のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含み得るがこれらに限
定されない。
【０１１６】 本発明の第２の実施態様において、本発明者らは、発光産物または発光シグナ
ルに直接変換され得る産物を生じる反応を生成し得る、１つ以上の酵素をコード
する核酸セグメントを含む組換えベクターを意図する。例えば、通常使用される
β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素の基質は、市販されて
おり、それぞれの酵素により変換された場合、発光性（化学発光）である。
【０１１７】 本発明の第３の実施態様において、本発明者らは、発色体産物または発色体シ
グナルに直接変換され得る産物を生じる反応を生成し得る１つ以上の酵素をコー
ドする核酸セグメントを含む組換えベクターを意図する。例えば、通常使用され
るβ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素の基質は、市販され
ており、それぞれの酵素により変換された場合、発色体である。励起および発光
波長の適切な選択は、発色体化合物の検出および定量を可能にする。その上、標
準アッセイが分光学的分析のために利用可能であるための任意の発色体基質は、
本方法における使用のために容易に適合されるべきである。
【０１１８】 本発明の第４の実施態様において、本発明者らは、細胞の表面で発現されるか
、または細胞から分泌される１つ以上のポリペプチドをコードする核酸セグメン
トを含む組換えベクターを意図する。好ましい実施態様において、核酸セグメン
トは、１つ以上のＴｈＰｈｏＡポリペプチドをコードする。別の実施態様におい
て、ポリペプチドは、生物発光、化学発光または発光体産物を直接的にまたは間
接的に産生し得る抗体の抗原である。
【０１１９】 上記の実施態様のそれぞれにおいて、組換えベクターは、環境因子に応答性で
あるプロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子を含み得る。好ましい実
施態様において、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉｉのｌｕｘ遺伝子であるｌｕ
ｘＣＤＡＢＥは、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５トランスポゾン内のｔｏｄオペロンに作動可
能に連結される。しかし、本発明者らは、環境因子に応答性であるプロモーター
に作動可能に連結された目的の核酸セグメントを許容する実質的に任意の組換え
ベクターが使用され得ることを意図する。有用な組換えベクターは、遺伝子融合
、オペロン融合、またはタンパク質融合の手段により、環境因子に応答性である
プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子を含み得るがこれらに限定さ
れない。
【０１２０】 本発明の別の重要な実施態様は、１つ以上のこれらの組換えベクターを発現す
る形質転換された宿主細胞である。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞のいず
れかであり得、そして特に好ましくは、宿主細胞は、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈ
ｅｒｉｉのｌｕｘ遺伝子であるｌｕｘＣＤＡＢＥをコードする組換えベクターを
含む核酸セグメントを発現する細胞である。細菌細胞が、原核生物宿主として特
に好ましく、そして酵母細胞が、真核生物宿主として特に好ましい。
【０１２１】 幅広い種々の方法は、遺伝子の安定な維持および発現を可能にする条件下で、
微生物宿主に、生物発光または化学発光を提供し得るポリペプチドを発現する核
酸セグメントを導入するために利用可能である。１つは、核酸セグメントの発現
のための転写および翻訳調節シグナル、それらの調節制御下の核酸セグメントお
よび宿主生物における配列とのＤＮＡ配列相同性を含むＤＮＡ構築物を提供し得
、これによって、組み込みが起こるか、または宿主に機能的である複製系が起こ
り、これによって、組み込みまたは安定維持あるいはその両方が起こる。
【０１２２】 転写開始シグナルは、プロモーターおよび転写開始地点を含む。好ましい例と
して、生物発光または化学発光を提供し得る核酸セグメントの調節性の発現のた
めに提供することが望ましくあり得、ここで、核酸セグメントの発現は、適切な
環境への放出後にのみ起こる。これは、オペレーター、あるいは微生物の物理的
または化学的環境における変化の際に誘導され得るアクティベーターまたはエン
ハンサーに結合する領域で達成され得る。転写開始については、リボソーム結合
部位および開始コドンが存在する。
【０１２３】 種々の操作は、メッセンジャーＲＮＡの発現を増強するために（特に、活性プ
ロモーターの使用により、ならびにメッセンジャーＲＮＡの安定性を増強する配
列を使用することにより）使用され得る。転写および翻訳終止領域は、停止コド
ン、ターミネーター領域、および必要に応じてポリアデニル化シグナル（真核生
物系において使用される場合）を含む。
【０１２４】 転写の方向において、すなわちコード配列またはセンス配列の５’〜３’方向
において、構築物は、転写調節領域、および任意の場合、プロモーターを含み、
ここで、調節領域は、プロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン、開始コ
ドンと一致しているオープンリーディングフレームを有する構造遺伝子、停止コ
ドン、ポリアデニル化シグナル配列、および任意の場合ターミネーター領域の５
’または３’のどちらかであり得る。二本鎖としてのこの配列は、微生物宿主の
形質転換のためにそれ自体により使用され得るが、マーカーを含むＤＮＡ配列で
通常含まれ、ここで、第２のＤＮＡ配列は、宿主へのＤＮＡの導入中に発現構築
物に結合し得る。
【０１２５】 「マーカー」によって、本発明者らは、改変されたか、または形質転換された
これらの宿主の選択を提供する構造遺伝子をいう。マーカーは、例えば、殺生剤
耐性（例えば、抗生物質または重金属に対する耐性）；栄養要求性の宿主などに
栄養を提供するための補完性を提供する選択的利点を通常提供する。１つ以上の
マーカーは、構築物の開発ならびに宿主の改変のために使用され得る。
【０１２６】 機能的複製系が存在しない場合、構築物はまた、少なくとも５０塩基対（ｂｐ
）、好ましくは少なくとも約１００ｂｐ、さらに好ましくは少なくとも約１００
０ｂｐ、および通常約２０００ｂｐより多くない、宿主における配列と相同な配
列を含む。この方法において、正当な組換えの確率は、その遺伝子が宿主に組み
込まれてそして宿主により安定に維持されるように増強される。望ましくは、生
物発光または化学発光を提供し得る核酸セグメントは、補完性を提供する遺伝子
、ならびに競合性の利点を提供する遺伝子に近接する。従って、生物発光または
化学発光を提供し得る核酸セグメントが欠損される場合において、生じた生物体
は、相補遺伝子および競合性の利点を提供する遺伝子、またはその両方をまた欠
損するようである。
【０１２７】 多数の転写調節領域は、細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類
、真菌などのような微生物宿主の幅広い種類から入手可能である。種々の転写調
節領域は、ｔｒｐ遺伝子、ｌａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、λLおよびλRプロモー
ター、ｌａｃプロモーターと関連した領域を含む。例えば、米国特許第４，３３
２，８９８号；米国特許第４，３４２，８３２号；および米国特許第４，３５６
，２７０号を参照のこと。終結領域は、転写開始領域、または２つの領域が宿主
において適合性でありかつ機能的である限りは異なった転写開始領域と通常関連
した終結領域であり得る。
【０１２８】 安定なエピソームの維持または組み込みが所望される場合、宿主において機能
的である複製系を有するプラスミドが、使用される。複製系は、染色体由来であ
り得、エピソームエレメントは、通常、宿主または異なった宿主に存在するか、
あるいは宿主において安定であるウイルス由来の複製系である。多数のプラスミ
ドは、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ＲＳＦ１０１０、ｐＲ０１６１４など
のように入手可能である。例えば、Ｏｌｓｏｎら、１９８２；Ｂａｇｄａｓａｒ
ｉａｎら、１９８１；および米国特許第４，３５６，２７０号、同第４，３６２
，８１７号、同第４，３７１，６２５号、および同第５，４４１，８８４号（そ
れぞれを、本明細書中に参考として特に援用する）を参照のこと。
【０１２９】 所望の遺伝子は、開始領域の調節制御下で存在するように、転写および翻訳開
始領域と、転写および翻訳終結領域との間に導入され得る。この構築物は、少な
くとも１つの複製系を含むが、１つより多い複製系を含み得るプラスミドに含ま
れ、ここで、１つの複製系は、プラスミドの開発の間、クローニングのために使
用され、そして第２の複製系は、究極の宿主において機能するために必要である
。さらに、１つ以上のマーカーが、前記のように存在し得る。組み込みが所望さ
れる場合、プラスミドは、望ましくは宿主ゲノムとの相同な配列を含む。
【０１３０】 形質転換体は、存在する場合、改変されていない生物体または転移生物体に対
して所望の生物体の選択を可能にする、通常使用する選択技術である慣用的な方
法に従って単離され得る。次いで、形質転換体は、生物発光または化学発光活性
について試験され得る。所望の場合、望まれないまたは付属的なＤＮＡ配列は、
本明細書中に参考として特に援用された米国特許第５，４４１，８８４号に記載
されているように、部位特異的組換え系を使用することにより組換え細菌から選
択的に除去され得る。
【０１３１】 （４．９ 抗体を調製するための方法） 別の局面において、本発明は、ポリペプチドに免疫反応性である抗体を意図す
る。本明細書にわたっての抗体に対する言及は、ポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体（ｍＡｂ）の全体、およびその部分（単独であるか他の成分と結
合化されているかのどちらでも）を含む。抗体の部分は、Ｆａｂフラグメントお
よびＦ（ａｂ）2フラグメントならびに単鎖抗体を含む。これら抗体は、適切な 実験室動物中でインビボで、または組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで、
作製し得る。好ましい実施態様において、抗体は、ポリクローナル抗体である。
【０１３２】 手短には、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む抗原で動物を
免疫し、そしてその免疫された動物から抗血清の収集することにより、調製する
。広範な動物種が、抗血清の作製のために使用し得る。代表的には、抗抗血清の
作製のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、または
モルモットである。ウサギの血液容量が比較的大きいので、ウサギが、ポリクロ
ーナル抗体の作製のための好ましい選択である。
【０１３３】 所定のポリペプチドに特異的な抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの
両方）は、当業者に一般的に公知であるような、従来の免疫化技術を使用して調
製し得る。特定のポリペプチドの抗原エピトープを含む組成物を使用して、１つ
以上の実験動物（例えば、ウサギまたはマウス）を免疫し得る。この動物は、そ
の後、このポリペプチドに対する特異的抗体を作製し始める。ポリクローナル抗
血清は、抗体生成を可能にする時間の後、この動物から採血し、そして全血から
血清サンプルを調製することにより、簡単に入手し得る。
【０１３４】 ポリクローナル抗体の作製において使用される免疫原組成物の量は、この免疫
原の性質、および免疫のために使用される動物に基づいて変化する。種々の経路
を使用して、免疫原を投与し得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）
。ポリクローナル抗体の作製は、免疫後の種々の時点で、免疫された動物の血液
をサンプリングすることにより、モニターし得る。第２の追加免疫注射も行い得
る。追加免疫および力価測定のプロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返
す。所望のレベルの免疫原性が得られる場合は、免疫した動物から採血し、そし
てその血清を単離し、そして貯蔵し得るか、またはその動物を使用してｍＡｂ（
下記）を作製し得るか、あるいはその両方を行い得る。
【０１３５】 本発明により提供される１つの重要な特徴は、その中の抗体の特異性に関して
比較的同質なポリクローナル血清である。代表的には、ポリクローナル抗血清は
、種々の異なる「クローン」（すなわち、異なる系統のＢ細胞）に由来する。ｍ
Ａｂは、対照的に、共通のＢ細胞祖先を有する抗体産生細胞由来であり、従って
、これらの「モノ」クローン性として定義される。
【０１３６】 ペプチドを抗原として使用してポリクローナル血清を惹起する場合、その血清
のクローン性のバリエーションは、抗原全体を使用する場合よりも相当少ないと
予測される。不幸にも、エピトープの不完全なフラグメントが提示される場合、
そのペプチドは、複数の（そしておそらくネイティブでない）コンホーメーショ
ンをとる可能性が非常に高い。その結果として、短いペプチドさえ、比較的複数
の特異性を有するポリクローナル抗血清、および不幸にも、ネイティブ分子に反
応しない抗血清または不充分にしか反応しない抗血清を作製し得る。
【０１３７】 本発明に従うポリクローナル抗血清は、完全なエピトープ全体を含むと推定さ
れるペプチドに対して作製される。従って、これらのエピトープは、免疫学的意
味においてより安定であり、従って、免疫系に対するより一貫した免疫学的標的
を表現すると考えられる。このモデルの下で、このペプチドに応答する、可能性
のあるＢ細胞クローンの数は、かなりより小さく、従って、生じる血清の同質性
はより高い。種々の実施態様において、本発明は、クローン性（すなわち、同一
の分子決定基に反応するクローンの割合）が少なくとも８０％であるポリクロー
ナル抗血清を提供する。９０％までまたは９５％までまたはそれを越えるより高
いクローン性さえ意図される。
【０１３８】 ｍＡｂを得るために、また、最初に実験動物（しばしば好ましくはマウス）を
ポリペプチド含有組成物で免疫する。抗体生成を可能にするために十分な時間の
後、この動物から脾臓細胞またはリンパ細胞の集団を得る。これら脾臓細胞また
はリンパ細胞を、次に、細胞株（例えば、ヒト骨髄腫株またはマウス骨髄腫株）
と融合し、抗体分泌ハイブリドーマを作製し得る。これらのハイブリドーマを単
離して個別のクローンを得ることができ、次いでこれらクローンは、所望のポリ
ペプチドに対する抗体の産生についてスクリーニングされ得る。
【０１３９】 免疫後、脾臓細胞を取り出し、そして標準融合プロトコルを使用してプラズマ
細胞腫細胞と融合し、目的のポリペプチドに対するｍＡｂを分泌するハイブリド
ーマを作製する。選択された抗原に対するｍＡｂを産生するハイブリドーマは、
標準技術（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法）を使用して同定す
る。次いで、ハイブリドーマクローンは、液体培地中で培養し得、そしてその培
養上清を精製して目的のポリペプチドに特異的なｍＡｂを提供し得る。
【０１４０】 蛍光性分子または酵素分子でタグされた抗体は、本発明にとって特に有用であ
る。抗体をタグする方法は、当業者に周知であり、そして多数のこのような抗体
が市販されている。蛍光性タグは、フルオレセイン、フィコエリトリン、および
Ｔｅｘａｓ ｒｅｄを含むが、これらに限定されない。酵素タグは、アルカリホ
スファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されな
い。
【０１４１】 （４．１０ 核酸セグメント） 本発明はまた、核酸セグメントに関し、これら核酸セグメントは、実質的に任
意の供給源から単離し得、全ゲノムＤＮＡがなく、そして本明細書中に開示され
る生物発光ペプチドをコードする。これらのペプチド種をコードする核酸セグメ
ントは、ｌｕｘ関連遺伝子産物または他の非関連遺伝子産物の、タンパク質、ポ
リペプチド、サブユニット、機能的ドメインなどをコードすることが判明しても
よい。さらに、これらの核酸セグメントは、当業者に周知の方法を使用して、完
全にインビトロで合成し得る。
【０１４２】 本明細書中で使用される場合、用語「核酸セグメント」は、特定の種の全ゲノ
ム核酸なしに単離された核酸分子をいう。従って、生物発光ペプチドをコードす
る核酸セグメントは、生物発光ポリペプチドコード配列を含むが、その核酸セグ
メントが得られた種の全ゲノム核酸から単離されたか、またはその核酸セグメン
トが得られた種の全ゲノム核酸がないように精製された、核酸をいう。核酸セグ
メントおよびこのようなセグメントのより小さいフラグメント、そして組換えベ
クター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスな
どを含む）もまた、用語「核酸セグメント」の内に含まれる。
【０１４３】 同様に、単離された生物発光遺伝子または精製された生物発光遺伝子を含む核
酸セグメントは、ペプチドをコードする配列に加え、他の天然に存在する遺伝子
またはタンパク質をコードする配列から実質的に単離された特定の他のエレメン
ト（例えば、調節配列）を含み得る核酸セグメントをいう。この点で、用語「遺
伝子」は、機能的タンパク質をコードする単位、機能的ポリペプチドをコードす
る単位、機能的ペプチドをコードする単位を、単純にいうために使用される。当
業者に理解されるように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチド、また
はペプチドを発現するか、または発現するように適合され得る、ゲノム配列、ｃ
ＤＮＡ配列、およびより小さい操作された遺伝子セグメントを含む。好ましい実
施態様において、この核酸セグメントは、ｌｕｘ遺伝子のオペロンを含む。
【０１４４】 「他のコード配列から実質的に単離された」とは、目的の遺伝子またはオペロ
ン（この場合には、生物発光ポリペプチドをコードするオペロン）が、ＤＮＡセ
グメントのコード領域の有意な部分を形成することを意味し、そしてこのＤＮＡ
セグメントは、天然に存在するコードＤＮＡの大きな部分（例えば、大きな染色
体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコード領域）を含まない
ことを意味する。もちろん、これは、当初は単離されたＤＮＡセグメントをいい
、そして人の手によって後にそのセグメントに加えられた遺伝子もコード領域も
除外しない。
【０１４５】 アミノ酸配列および核酸配列は、その配列が上記の基準（タンパク質発現に関
係する場合は生物学的なタンパク質活性の維持を含む）を満たす限り、追加の残
基（例えば、追加のＮ末端アミノ酸もしくＣ末端アミノ酸または５’配列もしく
は３’配列）を含み得、なおかつ、実質的に、本明細書中に開示される配列の１
つに示されるものであり得ることもまた理解される。末端配列の付加は、核酸配
列に特に適用され、これら核酸配列は、例えば、コード領域の５’部分または３
’部分に隣接する種々の非コード配列を含み得るか、または遺伝子内に存在する
ことが公知である種々の内部配列（すなわち、イントロン）を含み得る。
【０１４６】 本発明の核酸セグメントは、コード配列自身の長さに関わらず、他のＤＮＡ配
列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、
マルチプルクローニング部位、他のコードセグメントなど）と連結され、その結
果、その全長は相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメン
トが使用され得、その全長は、好ましくは、調製の容易さおよび意図される組換
えＤＮＡプロトコルにおける使用により制限される。
【０１４７】 開示される本発明の核酸配列の周囲に設計される種々のプローブおよびプライ
マーは、任意の長さであり得る。配列に対して数値を割り当てることにより（例
えば、第１の残基は１、第２の残基は２、など）、全てのプライマーを規定する
以下のアルゴリズムを提案し得る： ｎ〜ｎ＋ｙ ここで、ｎは、１からその配列の最後の数までの整数であり、そしてｙは、プラ
ーマーの長さ−１であり、ここで、ｎ＋ｙは、その配列の最後の数を越えない。
従って、１０マーについて、そのプローブは、塩基１〜１０、２〜１１、３〜１
２などに対応する。１５マーについて、そのプローブは、塩基１〜１５、２〜１
６、３〜１７などに対応する。２０マーについて、そのプローブは、塩基１〜２
０、２〜２１、３〜２２などに対応する。
【０１４８】 本発明は、本発明のペプチドをコードする特定の核酸配列に制限されないこと
もまた、理解される。従って、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメン
トは、ペプチドコード領域自身、基本のコード領域中に選択された変化または改
変を有するコード領域を種々に含み得るか、あるいは、組換えベクターおよび単
離されたＤＮＡは、より大きなポリペプチドを含み得（それでもやはり、これら
のペプチドコード領域を含む）、あるいは、組換えベクターおよび単離されたＤ
ＮＡは、改変アミノ酸配列を有する生物学的機能が等価なタンパク質またはペプ
チドをコードし得る。
【０１４９】 本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的に機能が等価なペプチドを包含する。
このような配列は、核酸配列、およびこの核酸配列においてコードされるタンパ
ク質中に天然に生じることが公知であるコドンの縮重および機能的等価性の結果
として生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換
えＤＮＡ技術の適用を介して作製し得、ここで、タンパク質構造における変化は
、交換されるアミノ酸の特性についての考慮に基づいて、操作し得る。部位特異
的変異誘発技術の適用を通じて、人間により設計された変化を導入し、例えば、
そのタンパク質の生物発光に対する改良を導入し得るか、または分子レベルで活
性を試験するために変異体を試験し得る。
【０１５０】 所望ならば、融合タンパク質および融合ペプチドもまた調製し得る。例えば、
ペプチドコード領域が、色素体標的化シグナルあるいは精製または免疫検出目的
の「タグ」（例えば、それぞれ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製
され得るタンパク質および酵素標識コード領域）のような所望の機能を有する他
のタンパク質またはペプチドと同一の発現単位内に配置される場合である。
【０１５１】 組換えベクターは、本発明のさらなる局面を形成する。特に有用なベクターは
、そのＤＮＡセグメントのコード部分が、完全長のタンパク質をコードしていよ
うと、またはより小さいペプチドをコードしていようと、プロモーターの制御下
に配置されているベクターであることが意図される。このプロモーターは、例え
ば、組換えクローニング技術またはＰＣＲTM技術またはその両方を、本明細書中
に開示される組成物と組合せて使用し、コードセグメントの上流またはエキソン
の上流に位置する５’非コード領域を単離することにより入手し得るような、本
発明のペプチドをコードする遺伝子と天然に結合しているプロモーターの形態で
あり得る。
【０１５２】 他の実施態様において、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下
にコード核酸セグメントを配置することにより、特定の利点が得られることが意
図される。本明細書中で使用される場合、組換えプロモーターまたは異種プロモ
ーターとは、その天然の環境において、１つ以上の生物発光ポリペプチドをコー
ドする核酸セグメントと通常は結合していないプロモーターをいうと意図される
。このようなプロモーターは、他の遺伝子と通常結合しているプロモーター、あ
るいは任意の細菌細胞、ウイルス細胞、真核細胞、または植物細胞から単離され
たプロモーター、あるいはその両方を含み得る。当然のことながら、発現のため
に選ばれた細胞型、生物、または動物におけるこのＤＮＡセグメントの発現を効
果的に指向するプロモーターを使用することが、重要である。タンパク質発現の
ためのプロモーターおよび細胞型の組合せの使用は、分子生物学の当業者に一般
に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。使用され
るプロモーターは、構成的または誘導性であり得、そして適切な条件下で使用し
て、導入されるＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指向し得、例えば、組換え
タンパク質または組換えペプチドの大規模産生において有利である。好ましいプ
ロモーターは、環境要因または環境ストレスの存在下で誘導されるプロモーター
である。
【０１５３】 このような核酸プローブの、生物発光ポリペプチドをコードする配列に特異的
にハイブリダイズする能力により、このような核酸プローブは、所定のサンプル
における相補的な配列の存在を検出することにおいて有用となる。しかし、変異
体種のプライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝子構築物を調
製することにおける使用のためのプライマーの調製のための配列情報の使用を含
む、他の使用が想像される。
【０１５４】 約１２，００１、１２，００２、１３，００１、１３，００２ヌクレオチドな
どくらいの配列まで（上限の数値を含む）の２００〜５００；５００〜１，００
０；１，０００〜２，０００；２，０００〜３，０００；３，０００〜５，００
０；５，０００〜１０，０００の範囲中の全ての整数を含む、１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，２７、２８
、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９，４０
、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５３など；６０、６１、６２、６３など；７０、７１、７２、７３など；８０
、８１、８２、８３など；９０、９１、９２、９３など；１００、１０１、１０
２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３などのような連続するヌクレ
オチドの領域からなる配列領域を有する核酸分子は、本明細書中に開示される核
酸配列と同一または相補的であっても、例えば、サザンブロッティングおよびノ
ーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブと
して、特に意図される。より小さいフラグメントは、ハイブリダイゼーションの
実施態様における使用を一般に見出され、ここで、その連続する相補的領域の長
さは、（例えば、約１０〜１４ヌクレオチドと約１００または２００ヌクレオチ
ドとの間で）変化し得るが、より大きい連続する相補的領域は、検出したい相補
的配列の長さに従って、使用し得る。
【０１５５】 長さ約１４、１５、１６、１７、１８、または１９ヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションプローブの使用は、安定的かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能に
する。ハイブリッド分子の安定性および選択性を増大させるために、長さ１４、
１５、１６、１７、１８、または１９塩基を越える領域にわたる連続する相補的
配列を有することが一般に好ましく、そしてそれにより、得られる特定のハイブ
リッド分子の質および程度を改良する；しかし、所望される場合は、１５〜２０
連続ヌクレオチドまたはさらに長い、遺伝子に相補的な領域を有する核酸分子を
設計することが、一般に好まれる。
【０１５６】 もちろん、フラグメントはまた、例えば、機械的剪断または制限酵素消化のよ
うな他の技術により、入手し得る。小さい核酸セグメントまたは小さい核酸フラ
グメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施され
るように、化学的手段により直接そのフラグメントを合成することにより、容易
に調製し得る。また、フラグメントは、米国特許第４，６８３，１９５号および
第４，６８３，２０２号（各々本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲTM 技術のような核酸複製技術の適用により、組換え体作製のための組換えベクター
に選択された配列を導入することにより、そして分子生物学の当業者に一般に公
知である他の組換えＤＮＡ技術により、入手し得る。
【０１５７】 従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的な領域と
二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用し得る。意図される適用に
依存して、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成するために、
種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが、所望される。高い選択性
を必要とする適用のために、代表的には、比較的ストリンジェントな条件を使用
してハイブリッドを形成することが所望される。例えば、比較的低い塩または高
い温度の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５
ＭのＮａＣｌにより提供される）またはその両方の条件が選択される。このよう
な選択的条件は、そのプローブと鋳型または標的の鎖との間のミスマッチ（存在
するならば）を、ほとんど許容せず、そして生物発光ポリペプチドをコードする
ＤＮＡセグメントを単離するのに特に適している。ハイブリダイゼーションを介
するＤＮＡセグメントの検出は、当業者に周知であり、そして米国特許第４，９
６５，１８８号および第５，１７６，９９５号（各々本明細書中に参考として援
用される）の教示は、ハイブリダイゼーション解析方法の例示である。Ｍａｌｏ
ｙら、１９９０；１９９４；Ｓｅｇａｌ １９７６；Ｐｒｏｋｏｐ、１９９１；
およびＫｕｂｙ、１９９４の教科書に見出されるような教示は、特に関連する。
【０１５８】 もちろん、いくつかの適用、例えば、基本的鋳型にハイブリダイズされる変異
体プライマー鎖を使用して変異体を調製することが所望される場合、または関連
の種、機能的等価物などから生物発光ポリペプチドをコードする配列を単離する
ことが求められる場合、より弱いストリンジェントのハイブリダイゼーション条
件が、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために代表的に必要とされる。このよう
な場合においては、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ塩、約２０℃〜約５５℃の範囲の
温度のような条件を使用することが所望され得る。それにより、クロスハイブリ
ダイズする種は、コントロールハイブリダイゼーションに対してポジティブにハ
イブリダイズするシグナルとして、容易に同定し得る。いずれの場合においても
、条件は、ホルムアミド（温度の増加と同じように、ハイブリッド二重鎖を不安
定にするために役立つ）の量を増加しての添加により、よりストリンジェントに
し得ることが、一般に認識されている。従って、ハイブリダイゼーション条件は
、容易に操作し得、従って、一般に、所望の結果に依存する選択方法である。
【０１５９】 特定の実施態様において、本発明の核酸配列を、ハイブリダイゼーションを決
定するための適切な手段（例えば、標識）と組合せて使用することは有利である
。広範な適切な指標手段が当該分野で公知であり、これらは、検出可能なシグナ
ルを提供し得る蛍光性および酵素学的なものを含む。好ましい実施態様において
、蛍光性標識または酵素タグ（例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼま
たはペルオキシダーゼ）を使用することが所望される可能性が高い。酵素タグの
場合において、比色定量指標基質が公知であり、これは、相補的な核酸を含有す
るサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するための、肉眼または
分光光度計により可視である手段を提供するために使用され得る。同様に、蛍光
性タグの場合において、本発明の装置で可視である手段を提供するために使用さ
れ得る、蛍光指標が公知である。
【０１６０】 一般に、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハ
イブリダイゼーションにおける試薬としても、固相を使用する実施態様における
試薬としても、有用であると考えられる。固相に関する実施態様において、試験
ＤＮＡ（またはＲＮＡ）を、選択したマトリックスまたは表面に吸着させるか、
さもなくば付着させる。次いで、この固定した一本鎖核酸を、所望の条件下で選
択したプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに供す。この選択した条件は
、必要とされる特定の基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含量、標的核酸の型、核酸の供給源
、ハイブリダイゼーションプローブのサイズなどに依存する）に基づく特定の条
件に依存する。非特異的に結合したプローブ分子を除去するためにハイブリダイ
ズした表面を洗浄した後、標識により、特異的ハイブリダイゼーションが検出さ
れ、または定量さえされる。プローブ標識およびハイブリッド検出のための手段
は、例えば、ＳａｙｌｅｒおよびＬａｙｔｏｎ（１９９０）ならびにＨｉｌｌら
（１９９１）（各々参考として本明細書中に援用される）のような参考文献によ
り証拠付けられるように、当業者に周知である。
【０１６１】 （４．１１ 変異誘発したＤＮＡセグメントを調製するための方法） 特定の環境において、本明細書中に開示された１つ以上のプロモーター配列中
の１つ以上のヌクレオチドを改変または変更することは、プロモーター領域の転
写活性または他の特性を改変または変化させるために所望され得る。一般的に、
ＤＮＡセグメントを変異誘発するための手段および方法は、当業者に周知である
。このようなセグメントに対する改変は、ランダムまたは部位特異的変異誘発手
順によって作製され得る。このプロモーター領域は、対応する非改変プロモータ
ー領域をコードする配列から１つ以上のヌクレオチドの付加または欠失によって
その構造を変化させることにより改変され得る。
【０１６２】 変異誘発は、当該分野で公知の技術のいずれかに従って行われ得、このような
技術には、特定のプロモーター領域の配列内に１つ以上の変異を有するオリゴヌ
クレオチドを合成するような技術であるが、これらに限定されない。詳細には、
部位特異的変異誘発は、根本的なＤＮＡの特異的変異誘発によって、プロモータ
ー変異の調製において有用な技術である。この技術はさらに、配列改変体を調製
し、そして試験する容易な能力を提供し、この配列改変体は、例えば、１つ以上
のヌクレオチド配列の変化をＤＮＡに導入することによって、前述の考慮すべき
事項の１つ以上を組み込む。部位特異的変異誘発は、十分なサイズのプライマー
配列を提供し、交差している欠失連結点（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ
）の両方の端に安定な二重鎖を形成する配列複雑性を提供するように、所望の変
異および十分多くの隣接するヌクレオチドのＤＮＡ配列をコードする特異的オリ
ゴヌクレオチド配列の使用によって変異の生成を可能にする。代表的には、改変
されている配列の連結点の両方の端に約１０〜約２５以上の残基を有する、約１
７〜約７５ヌクレオチド以上の長さのプライマーが好ましい。
【０１６３】 一般的に、部位特異的変異誘発の技術は、種々の刊行物によって例示されるよ
うに、当該分野で周知である。理解されるように、この技術は、代表的には、一
本鎖化および二本鎖化形態の両方で存在するファージベクターを使用する。部位
特異的変異誘発において有用な代表的なベクターとしては、Ｍ１３ファージのよ
うなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に入手可能であり、そし
てそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖化プラスミドもまた、
目的の遺伝子をプラスミドからファージに移入する工程を排除する部位特異的変
異誘発で慣用的に使用される。
【０１６４】 一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、まず一本鎖化ベクターを得
るかまたは二本鎖化ベクターの２つの鎖を融解して別々にすることによって行わ
れる。この二本鎖ベクターは、その配列内に、所望のプロモーター領域またはペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を含む。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレ
オチドプライマーは、一般的には、合成によって調製される。次いで、このプラ
イマーは、一本鎖化ベクターとアニールされ、そして変異保有鎖の合成を完了す
るために、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重
合酵素に供される。従って、ヘテロ二重鎖が形成され、ここで、一方の鎖は、本
来の非変異配列をコードし、そして第２の鎖は、所望の変異を保有する。次いで
、このヘテロ二重鎖ベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な細胞
に形質転換またはトランスフェクトする。そして変異配列の再配置を保有する組
換えベクターを含むクローンを選択する。遺伝子選択スキームは、変異原性オリ
ゴヌクレオチドを組み込んでいるクローンを富化するために、Ｋｕｎｋｅｌら（
１９８７）によって考案された。あるいは、市販の熱安定性酵素（例えば、Ｔａ
ｑポリメラーゼ）を用いるＰＣＲTMの使用は、増幅されたＤＮＡフラグメントに
変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むために用いられ得、次いで、
これは、適切なクローニングベクターまたは発現ベクターにクローニングされ得
る。Ｔｏｍｉｃら（１９９０）およびＵｐｅｎｄｅｒら（１９９５）のＰＣＲTM 媒介変異誘発手順は、このようなプロトコルの２つの例を提供する。熱安定性ポ
リメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するＰＣＲTMもまた、増幅したＤＮ
Ａフラグメントにリン酸化した変異原性オリゴヌクレオチドを組み込むために使
用され得る。次いで、これは、適切なクローニングベクターまたは発現ベクター
にクローニングされ得る。Ｍｉｃｈａｅｌ（１９９４）によって記載された変異
誘発手順は、このような１プロトコルの１例を提供する。
【０１６５】 部位特異的変異誘発を使用する、選択したプロモーターがコードするＤＮＡセ
グメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を生成する手段として提供さ
れ、そしてさらに限定されることを意味しない。なぜなら、ＤＮＡ配列の配列改
変体が得られ得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のプロモーター
配列をコードする組換えベクターが変異原性薬剤（例えば、ヒドロキシルアミン
）で処理されて、配列改変体が得られ得る。
【０１６６】 本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド指向性変異誘発手順」は、
テンプレート依存性プロセスおよびベクター媒介増殖をいい、これは、その最初
の濃度に対して特異的核酸分子の濃度の増加または検出可能なシグナルの濃度の
増加を生じる（例えば、増幅）。本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオ
チド指向性変異誘発手順」はまた、プライマー分子のテンプレート依存性伸長を
包含するプロセスをいうことが意図される。用語テンプレート依存性プロセスは
、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新たに合成された核酸鎖の
配列は、相補的塩基対形成という周知の規則によって命令される（Ｗａｔｓｏｎ
、１９８７）。代表的には、ベクター媒介性方法論は、核酸フラグメントのＤＮ
ＡベクターまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン性増幅、および
増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、米国特
許第４，２３７，２２４号（これは、その全体が本明細書中に参考として詳細に
援用される）によって提供される。
【０１６７】 多くのテンプレート依存性プロセスは、サンプル中に存在する目的の標的配列
を増幅するために利用可能である。最も良好な公知の増幅方法のうちの１つは、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲTM）であり、これは、米国特許第４，６８３，１
９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号（これら
の各々は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に詳細に記載される
。簡潔には、ＰＣＲTMでは、２つのプライマー配列が調製され、これらは、標的
配列の対向する相補鎖における領域に対して相補的である。過剰のデオキシヌク
レオシド三リン酸が、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とと
もに反応混合物に添加される。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマ
ーは、標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドに対して添加するこ
とによって標的配列に沿ってプライマーが伸長することを引き起こす。反応混合
物の温度を上下させることによって、伸長したプライマーが標的から解離して、
反応産物を形成し、そして過剰なプライマーは、標的および反応産物に結合する
。次いで、このプロセスが繰り返される。好ましくは、逆転写酵素ＰＣＲTM増幅
手順は、増幅したｍＲＮＡの量を定量するために行われ得る。ポリメラーゼ連鎖
反応方法論は、当該分野で周知である。
【０１６８】 増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応であり（ＬＣＲといわれる）、欧
州特許出願公開番号第３２０，３０８号（本明細書中にその全体が参考として援
用される）に開示される。ＬＣＲでは、２つの相補性プローブ対が調製され、そ
して標的配列の存在下で、各対は、それらが接触するように標的の対向する相補
鎖に結合する。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対が連結して、単一ユニッ
トを形成する。ＰＣＲTMのような温度サイクリングによって、結合した連結ユニ
ットは、標的から解離して、次いで、過剰なプローブ対の連結のために「標的配
列」として作用する。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が本明細書中
に参考として援用される）は、標的配列へのプローブ対の結合についてＬＣＲに
類似する、増幅の代替方法を記載する。
【０１６９】 国際出願公開ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０（その全体が本明細書中に参考と
して援用される）において記載されたＱβレプリカーゼもまた、本発明のなお別
の増幅方法として使用され得る。この方法では、標的の領域に相補的な領域を有
するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される
。このポリメラーゼは、複製配列をコピーし、次いで、これが検出され得る。
【０１７０】 等温増幅方法（ここでは、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して
、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’[α−チオ]三リン酸を含む標的
分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２）（その全体が本明細書中に
参考として援用される））もまた、本発明の核酸の増幅において有用であり得る
。
【０１７１】 鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、核酸の等温増幅を行う別の方法であり、この方法は、
複数回の鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を包含する
。類似の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（
ＲＣＲ）と称される）は、増幅の別の方法である。この方法は、本発明において
有用であり得る別の増幅方法であり、かつ増幅のために標的化した領域全体にい
くつかのプローブをアニールさせる工程、次いで、４つの塩基のうち２つのみが
存在する修復反応を包含する。他の２つの塩基は、容易な検出のためにビオチン
化誘導体として添加され得る。類似のアプローチがＳＤＡで使用される。
【０１７２】 英国特許出願番号第２ ２０２ ３２８号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ
８９／０１０２５号（これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用
される）に記載された、さらに他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。
前者の出願において、「改変された」プライマー方法は、ＰＣＲTM様の、テンプ
レートおよび酵素依存性合成で使用され得る。このプライマーは、捕捉部分（例
えば、ビオチン）および／または検出部分（例えば、酵素）で標識することによ
って改変され得る。後者の出願において、過剰な標識化プローブがサンプルに添
加される。標的配列の存在下でプローブが結合し、かつ触媒で切断される。切断
後、標的配列は、インタクトなまま放出されて、過剰なプローブに結合する。標
識化プローブの切断は、標的配列の存在を伝える。
【０１７３】 他の核酸増幅手順は、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）（国際特許出願公
開ＷＯ８８／１０３１５、本明細書中にその全体が参考として援用される）を包
含し、これは、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを包含する。
ＮＡＳＢＡでは、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの
熱変性、溶解緩衝液での処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ単離のためのミニス
ピンカラム、またはＲＮＡのグアニジン塩酸塩抽出によって増幅のために調製さ
れる。これらの増幅技術は、結晶タンパク質特異的配列を有するプライマーをア
ニールさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、ＲＮａ
ｓｅＨで消化されるが、二本鎖化ＤＮＡ分子は、再び熱変性される。いずれにし
ても、一本鎖化ＤＮＡの場合は、第２の結晶タンパク質特異的プライマーを添加
して、次いで、重合化によって完全に二本鎖化される。次いで、二本鎖化したＤ
ＮＡ分子は、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって転写されて増幅さ
れる。等温サイクル反応において、ＲＮＡは、二本鎖化ＤＮＡに逆転写され、そ
してＴ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼで再び転写される。得られた産物は
、短縮型または完全型のいずれでも、結晶タンパク質特異的配列を示す。
【０１７４】 欧州特許出願公開第３２９，８２２号（本明細書中にその全体が参考として援
用される）は、核酸増幅プロセスを開示し、このプロセスは、一本鎖化ＲＮＡ（
ｓｓＲＮＡ）、一本鎖化ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、および二本鎖化ＤＮＡ（ｄｓＤ
ＮＡ）をサイクルで合成する工程を包含し、本発明に従って使用され得る。ｓｓ
ＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチドについての第１のテンプレート
であり、これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長
される。次いで、このＲＮＡは、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレ
アーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖
でＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって取り除かれる。得られたｓｓＤ
ＮＡは、第２のプライマーについての第２のテンプレートであり、これはまた、
そのテンプレートに対して５’にその相補性を有するＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む。次いで
、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大きな「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長され、
プライマー間で本来のＲＮＡの配列に同一な配列を有し、かつ一方の末端にさら
にプロモーター配列を有する二本鎖化ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子として得られる
。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために、適
切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーは、非
常に迅速な増幅を導くサイクルに再び入る。酵素の適切な選択によって、この増
幅は、各サイクルで酵素を添加することなく、等温で行われ得る。このプロセス
のサイクル的な性質のために、開始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形
態にあるように選択され得る。
【０１７５】 ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ８９／０６７００（本明細書中にその全体が参考
として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の標的ｓｓＤＮＡへのハ
イブリダイゼーション、次いで、この配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく
核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクルではない。すなわ
ち、新たなテンプレートは、得られたＲＮＡ転写物から生成されない。他の増幅
方法としては、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）、および「片末端（
ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲTM」（Ｏｈａｒａ、１９８９）が挙げられ、これら
の方法は、当業者に周知である。
【０１７６】 得られた「２オリゴヌクレオチド」の配列を有し、これによって、２オリゴヌ
クレオチドを増幅する核酸の存在下における２つ（以上）のオリゴヌクレオチド
の連結に基づく方法（（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６）本明細書中に参考とし
て援用される）はまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
【０１７７】 （４．１２ 生物学的機能等価物） 改変および変更は、本発明のペプチド、およびそれらをコードし、かつ所望の
特性を有するタンパク質またはペプチドをコードする機能的分子をさらに得るＤ
ＮＡセグメントの構造中に作製され得る。以下は、等価、または改善すらされる
、第２世代の分子を作製するためにタンパク質のアミノ酸を変更することに基づ
く議論である。アミノ酸の変更は、表３に列挙されたコドンに従って、ＤＮＡ配
列のコドンを変更することによって達成され得る。
【０１７８】
【表３】 例えば、特定のアミノ酸は、構造（例えば、抗体の抗原結合領域または基質分
子の結合部位）を伴う相互作用的な結合能力の、認識しうるほど損失することな
く、タンパク質構造中で他のアミノ酸と置換され得る。それは、タンパク質の生
物学的な機能的活性を規定する、タンパク質の相互作用的能力および性質である
ため、そして類似の特性を有するタンパク質を得るにもかかわらず、特定のアミ
ノ酸配列置換がタンパク質配列；および、当然のことながら、配列をコードする
、基本的なＤＮＡ中で作製され得る。従って、種々の変更が、開示された組成物
のペプチド配列、またはこのペプチドを、それらの生物学的利用性または活性を
認識し得るほど損失することなくコードする、対応するＤＮＡ配列中に作製され
得ることが、本発明者らによって意図される。
【０１７９】 このような変更を作製することにおいて、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮
され得る。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけ
るアミノ酸のヒドロパシー指数の重要性は、一般的に、当該分野で理解される（
（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｅｌｅ、１９８２）これは、本明細書中に参考
として援用される）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性は、得られたタンパク
質の二次構造に寄与し、次いで、これは、このタンパク質の他の分子（例えば、
酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。
【０１８０】 各アミノ酸は、それらの疎水性および荷電特徴に基づいたヒドロパシー指数を
割り当てられており（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｅｌｅ、１９８２）、これ
らは、以下のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；
ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン
（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−
０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−
０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．
２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（
−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニ
ン（−４．５）。
【０１８１】 特定のアミノ酸が、類似するハイドロパシー指数またはスコアを有する他のア
ミノ酸によって置換され得、そしてなお、類似の生物学的活性を有するタンパク
質を生じる（すなわち、生物学的に機能的等価なタンパク質をなお得る）ことが
当該分野で公知である。このような変更を作製することにおいて、ハイドロパシ
ー指数が±２以内であるアミノ酸置換が好ましく、詳細には、±１以内であるア
ミノ酸置換が好ましく、なおより詳細には、±０．５以内であるアミノ酸置換が
好ましい。
【０１８２】 類似のアミノ酸置換が親水性に基づいて効率的に作製され得ることは、当該分
野でもまた理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書中に参考と
して援用される）は、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性が、その隣接す
るアミノ酸の親水性によって左右されるように、タンパク質の生物学的特性と相
関する。
【０１８３】 米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値は、ア
ミノ酸残基に対して割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋
３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；
セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グ
リシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン
（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン
（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−
１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトフ
ァン（−３．４）。
【０１８４】 アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸で置換され得、かつ生物学
的等価物（そして詳細には、免疫学的に等価なタンパク質）をなお獲得すること
が理解される。このような変更において、親水性値が±２以内であるアミノ酸置
換が好ましく、詳細には、親水性値が±１以内であるアミノ酸置換が好ましく、
そしてなおより詳細には、±０．５以内であるアミノ酸置換が好ましい。
【０１８５】 従って、上記に概説されるように、アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸側
鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、荷電性、サイズな
ど）に基づく。前述の種々の特性を考慮に入れた例示的な置換は、当業者に周知
であり、そしてこれには以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミ
ン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパ
ラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０１８６】 (４．１３ 本発明のさらなる局面） 本明細書に詳細に記載される実施態様に加え、本発明者らはさらに、本発明の
ＢＢＩＣが地下水、小川、河川、海洋のような領域または他の環境において存在
する汚染物、爆発物、重金属、または他の化学的薬剤または生物学的薬剤を検出
するために使用され得ることを意図する。さらに、本発明のＢＢＩＣは、生物医
学的薬物および抗癌スクリーニング、石油探査のためのセンサー、産業過程制御
、および生物医学的機器におけるコンビナトリアル化学において使用され得る。
本発明のＢＢＩＣは、試験化学物質（例えば、Ｆｅ+2またはＰＯ4 -2）の非存在 または低発生量に対して応答するために使用され得る。化合物に加え、本発明の
ＢＢＩＣは、環境状態（例えば、温度、放射性（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）および圧
力）を検出するために使用され得る。本発明者らは、ＢＢＩＣの生物体が、物質
または状態の存在または非存在を検出し得、そしてレポーター遺伝子に作動可能
に連結されるプロモーターの発現を変えることを条件に、本質的に任意のシグナ
ル伝達経路が利用され得ることを意図する。
【０１８７】 本明細書に詳細に記載される方法に加えて、本発明者らは、本発明のＢＢＩＣ
を増強するさらなる方法を意図する。それらは、ＲＦ、光学的エネルギー（太陽
光を含む）、機械的エネルギー（振動、水流、気流など）、化学エネルギー、ま
たは熱エネルギーの誘導により遠隔操作的に増強され得る。本発明のいくつかの
実施態様において、探知する生物体または化合物により発生する光が、ＢＢＩＣ
に動力を増強するために使用され得る。
【０１８８】 本発明者らは、本発明のＢＢＩＣは、無線手段（例えば、ＲＦまたはオン−チ
ップ光放射装置）か、あるいは、電線手段（例えば、直接的アナログ、デジタル
、または受動手段（レジスタンス、キャパシタンス、およびインダクタンスなど
を含む））により出力され得ることを意図する。本発明のＢＢＩＣはまた、二極
式シリコン、シリコン−ゲルマニウム、ＧａＡｓ、ＩｎＰまたは他の半導体ＩＣ
プロセスにおいて実現され得る。
【０１８９】 本発明の光放射薬剤は、生物学的または化学的であり得、ここで、光生成機構
は発光、蛍光または燐光であり得る。本発明者らはさらに、光放射薬剤は、製造
時にＩＣ上に置かれ得るか、または使用時に選択され、ＩＣ上に置かれ得ること
を意図する。本発明の別の実施態様において、本発明者らは、光放射薬剤のアレ
イを含むＢＢＩＣがさらに光検出装置の適合アレイを含むことを意図する。シグ
ナルプロセッシング（アナログ、デジタル、神経網など）に加え、このアレイデ
バイスは、個々の化学物質の代わりに化学物質のファミリーを検出するために使
用され得る。さらに、異なる放射波長を有する光放射エレメントのアレイを含む
ＢＢＩＣはさらに、統合された光分光計を含む。例えば、放射光のスペクトルの
測定により、本実施態様は、単一の化学物質を検出する代わりに、多くの化学物
質を同時にまたは連続的に検出するために使用され得る。
【０１９０】 本発明のＢＢＩＣをパッケージングする多くの方法は、構想され得る。一般に
、選択されるパッケージングの型は、ＢＢＩＣがさらされると予想される環境を
反映し得る。このような環境は、水性環境、気体環境または固体環境を含むが、
これに限定され得ない。例えば、本発明者らは、レバー近くでコンクリートで覆
われたＢＢＩＣが腐食を検出することを意図する。別の実施態様において、本発
明者らは、生物医学的適用（例えば、疾患の検出、患者状態の探知など）のため
のインビボでの測定を許容し得る様式においてＢＢＩＣをパッケージングするこ
とを意図する。一般に、ＢＢＩＣは、調査される特定の流体（例えば、血液）が
通過するのを許容する半透過性膜においてパッケージングされるが、ＢＢＩＣを
害するまたはＢＢＩＣを妨害する物質（例えば、動物宿主防御機構）は、ブロッ
クされる。
【０１９１】 特定の実施態様において、本発明の光放射剤は、多細胞生物（例えば、昆虫）
を含み得る。より大きな生物体（例えば、昆虫）が遺伝学的に操作され得、標的
化された物質の存在下において生物発光するようになることは、周知である。こ
のような場合、ＢＢＩＣのＩＣ部分は、チップが生じた生物発光を検出するよう
な方法において昆虫に付着され得る。この昆虫自体は可動でありそして付着ＢＢ
ＩＣの存在により付加されないため、このような系は可動である。本明細書で開
示される装置のこの適用のこのような例の１つを、図３３に図示する。本発明者
らはさらに、光放射剤が多細胞生物である場合、ＢＢＩＣは自己推進および／ま
たは自己増強し得ることを意図する。
【０１９２】 本発明者らは、ＢＢＩＣが特定の化合物または生物学的薬剤の位置ならびに有
無を検知し得る全体的な所在の検知を含むＢＢＩＣを意図する。
【０１９３】 本発明者らは、人工的にインテリジェントな検知ネットワークを形成するため
に電線または無線で配置されるネットワークにおいて連結されるＢＢＩＣのアレ
イを意図する。このＢＢＩＣのアレイは、各ＢＢＩＣにおけるオン−チッププロ
セシング能力を含み得る。
【０１９４】 ＢＢＩＣは、広範にわたり配置され得る。さらに、図３４に示されるように無
線でともに連結される。各ＢＢＩＣがオン−チッププロセシング能力（例えば、
神経網プロセシング）を有する場合、この配置されるネットワークは 人工的にインテリジェントなセンサーシステムを形成する。例えば、有毒ガスの
漏出が生ずる大きな領域にわたって配置されるＢＢＩＣの大きなネットワークを
考慮せよ。このガス雲はＢＢＩＣネットワークの領域に入り得るため、有用な情
報（例えば、ガスの組成、速さ、および雲の方向）は、センサーネットワークに
より決定され得る。他の情報（例えば、風の状態、地形地勢学、温度など）がそ
のネットワークに利用可能である場合、このネットワークは、人集団への危険度
を予測し得る。
【０１９５】 （５．０ 実施例） 本発明の好ましい実施態様を実証するために、以下の実施例が含まれる。以下
の実施例で開示される技術は、本発明者らによって発見された技術が本発明の実
施における良好に機能することを表し、従って、その実施のための好ましい様式
を構成すると見なされ得ることは、当業者によって理解されるべきである。しか
し、当業者は、本発明の開示を考慮し、多くの変化が開示される特定の実施態様
においてなされ得、そしてさらに本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様ま
たは類似の結果を得ることを理解すべきである。
【０１９６】 （５．１ 実施例１−−染色体導入したＬＵＸレポーターに対する改変ミニ−
ＴＮ５系） 本実施例は、挿入物がミニＴｎ５トランスホゾンベクターへの方向的にクロー
ニングされるのを可能にするクローニングプラスミドを記載する。このようなベ
クターは、本発明の方法において有用なバイオレポーター構築物の調製について
有用である。例示的な実施態様として、ＢＴＥＸ化合物およびＪＰ−４ジェット
燃料構成成分の水溶液にさらした場合のｔｏｄオペロンの誘導を試験するために
、ｔｏｄ−ｌｕｘ融合物を構築し，そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄ
ａ Ｆ１に導入した。この系は完全なｌｕｘカセット（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）を含
むので，細菌性生物発光はアルデヒド基質を添加する必要なしに、細胞全体にお
いて測定され得る。結果として生じた株はまた、野生型株Ｆ１と比較してその安
定性および適合性を評価された。
【０１９７】 （５．１．１ 材料および方法） （５．１．１．１ 生物体および培養条件） 本研究で使用した菌株を、表４に示す。全ての培養物は、Ｅ．ｃｏｌｉ株（３
７℃で増殖した）を除き、２８℃で増殖させた。
【０１９８】 （５．１．１．２ ＤＮＡの単離および操作） 大規模なプラスミドＤＮＡの単離を、改変アルカリ溶解プロトコル（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，１９９２）を使用して成し遂げた。染色体ＤＮＡは、Ａｕｓｕｂｅｌら
（１９８９）によって概要されるプロトコルを使用して調製した。全てのＤＮＡ
調製物を、ＣｓＣｌ ＥｔＢｒ超遠心分離によって、さらに精製した（Ｓａｎｂ
ｒｏｏｋら、１９８９）。ＤＮＡの改変および制限エンドヌクレアーゼ消化を、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に概要されるように実行した。
【０１９９】 （５．１．１．３ クローニングおよびトランスポゾン構築） トランスポゾン ミニＴｎ５ＫｍＮＸを、部位特異的変異誘発およびポリメラ
ーゼ連鎖反応を使用して構築した。２つの５８塩基オリゴヌクレオチド（ｐＣＲ
ＩＩTM中のカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR）に関する５’および３’）（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、製造プロトコルに従ってＢ
ｅｃｋｍａｎ Ｏｌｉｇｏ １０００ＤＮＡシンセサイザー（Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，ＣＡ）を使用して合成した。塩基の置換により、ＩおよびＯ両方の挿入配列
ならびにクローニングのためのトランスポゾン内の固有のＮｏｔＩおよびＸｂａ
Ｉ部位を生じた。ミニＴｎ５ＫｍＮＸの送達ベクターｐＵＴへのクローニングを
可能にするために、ＥｃｏＲＩ部位およびＮｈｅＩ部位を、各オリゴヌクレオチ
ドの末端にそれぞれ付加した（Ｈｅｒｒｅｒｏら、１９９０）。配列および塩基
の変化は、図１０に見られ得る。プライマーを使用し、以下のサーマルサイクラ
ー条件で製造されるプロトコルを使用して、ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲTM（Ｄｏ
ｎら、１９９１）を使用して、ｐＣＲＩＩTMからカナマイシン耐性遺伝子を増幅
させた：９４℃初期変性、５分；９４℃１分間で５サイクル、７２℃１分間でア
ニーリング、７２℃２分間で伸長；アニーリングの温度は、８サイクルが実行さ
れた４２℃まで５サイクルごとに５℃下降させ、続いて７２℃にて１５分最終伸
長させた。１．３ｋｂの産物を、製造業者のプロトコルに従ってＴＡクローニン
グキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ｐ
ＣＲＩＩTMにクローニングした。ＩおよびＯ挿入配列の両方が組み込まれている
かを証明するために、この結果生じたミニＴｎ５ＫｍＮＸを含むプラスミドｐＵ
ＴＫ２１０を、配列決定した。確認後、ｐＵＴＫ２１０をＮｈｅＩおよびＥｃｏ
ＲＩで切断し、そしてアガローズゲル電気泳動法（Ｓａｎｂｒｏｏｋら、１９８
９）を使用してゲル精製した。この精製されたミニＴｎ５ＫｍＮＸフラグメント
を、ミニＴｎ５送達ベクター（ｐＵＴ）のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩにクローニング
し、そしてＥ．ｃｏｌｉ Ｓ １７−１（λｐｉｒ）にエレクトロポーレーショ
ンした。適当な挿入物でのエレクトロポーレーション産物は、５０μｌ／ｍｌカ
ナマイシンを有するＬＢプレート上で選択された。ＤＮＡミニプレップ（Ｈｏｌ
ｍｅｓら、１９８１）が得られ、そして挿入物は制限エンドヌクレアーゼでの切
断により証明された。
【０２００】 クローニングベクター、ｐＬＪＳは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＫＳ）（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａＣＡ）からＢｓｓＨ ＩＩを用いて切断
し、そしてマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を除去するために再連結すること
により、構築された。連結されたＤＮＡは、ＤＨ５αに形質転換され、そしてア
ンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）が補充され
たＬＢプレート上で拡散された。ＭＣＳを含まない形質転換物は、それらがα相
補し得ないため、白色であった。この結果生じたプラスミドをｐＢＳＭＣＳ（−
）と名付けた。塩基の置換された２つのオリゴヌクレオチド（４７マーおよび４
４マー）は、先に記載されるように、合成されて、マルチクローニング部位を再
生し、そして以下の制限部位、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ、およびＡｖｒＩ
Ｉが付加された。付加された部位の配列および方向が、図１０に示され得る。こ
の新しいマルチクローニング部位は、以下のサーマルサイクラー条件で製造業者
のプロトコルを使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＫＳ）から増幅された
：９４℃初期変性、５分；９４℃３０秒間で３８サイクルの変性、４２℃１分間
でアニーリング、７２℃３０秒間で伸長；そして７２℃１５分間で最終伸長。増
幅されたフラグメントは、ＢｓｓＨＩＩで切断され、ｐＢＳＭＣＳ（−）に連結
され、そしてＤＨ５αTMへ形質転換された。形質転換物は、アンピシリン（５０
μｇ／ｍｌ）およびＸ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ寒天上でスクリ
ーニングされた。それらは、回復したα相補性を示すため、青色のコロニーを選
択した。塩基の置換およびＭＣＳの組込みを確認するために、この構築物を配列
決定した。ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
．Ｊ）由来の５ＳリボソームｒｒｎＢＴ1Ｔ2転写ターミネーターを含む０．７７
ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｃＩＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳ
ｍａＩで切断されるｐＬＪＳに方向的にクローニングすることにより、ｐＬＪＳ
Ｔ２を生成した。ｐＬＪＳＴ２由来のＮｏｔＩ−ＡｖｒＩＩターミネーターフラ
グメントは、ミニＴｎ５ＫｍＮＸのＮｏｔＩ−ＸｂａＩ部位に実質的にクローニ
ングされた。これは、異種連結によるＸｂａｌ部位の後の破壊、およびターミネ
ーター（ｐＵＴＫ２１１）下流のミニＴｎ５ＫｍＮＸにおけるＮｏｔＩおよびＸ
ｂａＩ固有部位の再生を可能にした。ミニＴｎ５Ｋｍｔｏｄ−ｌｕｘ（ｐＵＴＫ
２１４）は、ｐＵＣ １８ Ｎｏｔ ｔｏｄ−ｌｕｘ（表４）由来の１０．２ｋ
ｂ ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ ｔｏｄ−ｌｕｘフラグメントを，ｐＵＴＫ２１１のＮ
ｏｔＩ−ＸｂａＩ部位に方向的にクローニングすることによって、生じた。挿入
物およびベクターＤＮＡの両方は、クローニング前のアガロースゲル電気泳動法
および電気溶出により精製された。全ての他のプラスミドおよび関連構築物は、
表４に記載される。
【０２０１】
【表４】 （５．１．１．４ エレクトロポーレーション） エレクトロコンピテント細胞を、製造業者（ＢＴＸ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ）により概要されるように調製した。エレクトロポーレーションを、ＢＴＸ
Ｅｌｅｃｔｒｏｐａｒａｔｏｒ ６００を使用して、以下の条件で実行した：４
０μｌ細胞、１μｌ連結混合物、２ｍｍギャップキュベットを用いて約４．７ｍ
ｓに対して２．５ｋＶパルス。このパルスの後、細胞は、すぐにＬＢに（１ｍｌ
まで）再懸濁され、そして適切な抗生物質選択で、ＬＢプレート上にプレートす
る前に３７℃１時間（２００ｒｐｍ）において回収された。
【０２０２】 （５．１．１．５ ＤＮＡ配列決定） ｐＣＲＩＩTMのための正方向および逆方向配列決定プライマーの両方を使用し
てｐＣＲＩＩTM中のｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＫｍＮＸを配列決定して、部位特異的変異
誘発が成功したことを確認した。配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して行
った。
【０２０３】 （５．１．１．６ トランスポゾン変異誘発） ｐＵＴＫ２１４を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｓ １７−１（λｐｉｒ）を、プレート
接合によってＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｆ１中に接合させた。ドナーおよびレシピエン
ト細胞を、約５〜１の比で混合し、ＬＢプレート上にスポットし、そして２５℃
で２４時間インキュベートした。変異を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンで補充し
たＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ単離寒天上で選択した。次に、コロニーをグリッドプ
レートに継代培養して、そしてトルエン蒸気に曝露した。トルエン蒸気を有する
無機塩培地（ＭＳＭ）（Ｓｔａｉｎｅｒら、１９６６）中で光を発するコロニー
を増殖させ、トランスポゾンが細胞に必要とされる遺伝子中に挿入されたかどう
かを確認した。その株をまた、液体中の増殖細胞アッセイにおけるバイオレポー
ターとしてのそれらの性能について評価した（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２）。
【０２０４】 （５．１．１．７ 遺伝子転移の確認） 選択された株を、ｐＵＴに含まれるＴｎ５トランスポザーゼ（ｔｎｐ）に特異
的な32Ｐ標識プローブを使用して、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに供
して、組換えに対する遺伝子転移を確認した。等しい標的量のｌｕｘＡ、ｔｏｄ
Ｃ、およびｔｎｐ ＤＮＡを、Ｂｉｏｓｌｏｔ ｂｌｏｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ
（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、製造業者のプロトコールに従っ
て使用して、ＢｉｏｔｒａｎｓTMナイロンメンブレン（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、
ＣＡ）上にロードした。ブロットは、Ｆ１由来の染色体ＤＮＡ、ＴＶＡ８、およ
び上述のコントロールからなった。そのＤＮＡを、三連でロードし、そしてその
ブロットをさらに分割して、そして各々の別個のブロットを、ｌｕｘＡ、ｔｏｄ
Ｃ、またはｔｎｐ ＰＣＲTM−生成32Ｐ−標識ＤＮＡプローブのいずれかを用い
てハイブリダイズした。ブロットをハイブリダイズし、そして先に述べたように
洗浄した（Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、１９９７）。
【０２０５】 （５．１．１．８ 安定性アッセイ） バッチ安定性アッセイを、増殖曲線について記載された唯一の炭素源としてト
ルエンを使用して、５０μｇ／ｍｌ カナマイシン（Ｋｍ50）を有するＬＢ上で
増殖させた１００ｍｌのオーバーナイト培養物の１ｍｌを、２５０ｍｌのエーレ
ンマイヤーフラスコに移すことによって行った。培養物の１ｍｌを、毎日、５日
間にわたって、トルエン蒸気を供給した１００ｍｌ ＭＳＭを有するフラスコ（
Ｋｍなし）に移した。アッセイを三連で行った。各々の移動の前に、細胞を選択
培地（ＬＢＫｍ50）および非選択培地（ＬＢ）上にプレートし、トランスポゾン
の欠失または切除から生じるカナマイシン耐性の損失を確認した。コロニーを、
２９５ｂｐ ｌｕｘＡ ＤＮＡプローブ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、１９９６）を使用
して、コロニーハイブリダイゼーションに供した。
【０２０６】 安定性をまた、３７０ｍｌベッセルを備え、２８℃で１８０ｒｐｍで操作した
Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｂｉｏ Ｆｌｏｗファーメンター（Ｅｄｉｓｏｎ
，ＮＪ）を使用する連続培養中でアッセイした。供給物は、流速１．０ｍｌ／分
で約１００ｍｇ／Ｌでトルエンを補充するＭＳＭからなった。これを、１分間に
０．２ｍｌの流速のトルエン飽和−ＭＳＭ、および１分間に０．８ｍｌの流速の
ＭＳＭを、ＦＭＩ計量ポンプ（Ｏｙｓｔｅｒ Ｂａｙ、ＮＹ）を使用して同時に
添加することによって達成した。ケモスタットを、冷やした指および冷蔵した循
環水槽（Ｂｒｉｎｋｍａｎ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）を使用して２８℃に維持
した。ケモスタットを、約１００世代に相当する１４日間操作した。生物発光と
光学密度の両方のモニタリングを毎日行った。ケモスタット由来の細胞をまた、
７日ごとにプレートし、そしてコロニーハイブリダイゼーションを上記のように
行った。
【０２０７】 （５．１．１．９ 増殖曲線） ＴＶＡ８およびＦ１の増殖曲線を、２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中で
唯一の炭素源として供給されるトルエン蒸気を有する１００ｍｌのＭＳＭ中にお
ける増殖細胞によって得た。培養を、新しいオーバーナイト培養物から開始し、
１００ｍｌのＬＢ中で１．０のＯＤＳ546まで増殖させ、そして１００ｍｌ Ｍ ＳＭ中で２回洗浄し、そして培地１００ｍｌ中に再懸濁した。この懸濁液の１ｍ
ｌのアリコートを、トルエンフラスコに添加した。その培養物を、２８℃で２０
０ｒｐｍで振とうさせ、そして約１時間ごとにサンプリングした。ＯＤ546を、 各々の培養物について測定し、そして光学密度における増加速度を、曲線の直線
部分から決定した。
【０２０８】 （５．１．１．１０ 生物発光の感度） 生物発光アッセイを、Ｈｅｉｔｚｅｒら（１９９２）によって記載されるよう
に行った。ＴＶＡ８の冷凍ストック由来のオーバーナイト培養物を、５０μｇ／
ｍｌ カナマイシンを有する１００ｍｌ ＬＢを含む２５０ｍＬエーレンマイヤ
ーフラスコ中に調製した。継代培養物を、酵母抽出物−ペプトン−グルコース培
地（ＹＥＰＧ）中に調製し、０．３５〜０．４５のＯＤ546まで増殖させ、そし て３０分間ごとにアッセイした。予備的な研究において、２時間のインキュベー
ション時間が、シグナル強度を最大化する一貫した光応答を提供することが示さ
れた。２時間後、最終的なＯＤ546を測定し、値を特異的な生物発光（ｎａｍｐ ／ＯＤ546）として表現する。
【０２０９】 （５．１．１．１１ 試験サンプルの調製） ＪＰ−４ジェット燃料成分の水溶液を、１：１０のジェット燃料：水比で、滅
菌した脱イオン水にＪＰ−４を添加することによって調製した。その溶液を、回
転式振とう機で２４時間振とうした。相分離後、水槽のアリコートを試験バイア
ル中に添加した。上記のように、トルエン、ベンゼン、エチルベンゼン、フェノ
ール、およびキシレンの異性体の試験溶液を調製した。
【０２１０】 （５．１．１．１２ 生物発光測定） ２５ｍＬシンチレーションバイアルを使用した以外は、以前に記載されたよう
に（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２）、サンプルバイアルを光遮断箱中に置き、そ
して液体光パイプおよびＯｒｉｅｌ光電子増倍管およびデジタルディスプレイ（
Ｍｏｄｅｌ ７７３４０およびＭｏｄｅｌ ７０７０、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ、Ｃ
Ｔ）を使用して光出力を測定した。生物発光の読みとりを、３０分間ごとに行っ
た。光遮断箱がキュベットを保持するように改変され、このことがＯＤ読みとり
後に光測定を可能にするという例外を有する、増殖曲線についての光測定および
ケモスタットを上記のように測定した。
【０２１１】 （５．１．２ 結果） （５．１．２．１ 株の構築） 生じたｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＫｍＮＸの配列決定分析は、ＩおよびＯ挿入配列の両
方が、トランスポゾンを生成するために使用されたプライマーと同一であること
を示した（図１０を参照のこと）。誤って付加された余分のアデニンは、この構
築物に影響を与えなかった。プラスミドｐＬＪＳ（図１２）をまた配列決定し、
付加された部位が取り込まれたことを確認し、そしてマルチクローニングサイト
（ＭＣＳ）の完全性を決定した。配列決定データは、ＭＣＳおよびすべての付加
された部位がインタクトであることを示した。生じたクローニングベクターはま
た、α−相補についての能力を維持した。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＫｍＮＸ構築物の図
的表現および最終的な構築物ｍｉｎｉ−Ｔｎ５Ｋｍｔｏｄ−ｌｕｘは、図１１に
見られ得る。
【０２１２】 ｍｉｎｉ−５Ｋｍｔｏｄ−ｌｕｘを有するＥ．ｃｏｌｉのＳ１７−１（λｐｉ
ｒ）株はＦ１と接合し得、そして生じた変異体を、トルエンに曝露した場合に生
物発光を産生するそれらの能力についてスクリーニングした。１４の株を、トル
エンＭＳＭ上で増殖するそれらの能力について評価し、そして番号８を選択し、
ＴＶＡ８と名付けた。この株を試験して、これは遺伝子転移事象の結果であり、
組換え事象ではないことを確認した。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションは
、ＴＶＡ８がｌｕｘ遺伝子を含むが、ｔｎｐとのハイブリダイゼーションを示さ
ないことを示した。ｔｎｐとハイブリダイズしたブロットを、ｔｏｄＣで再プロ
ーブして、ＤＮＡが存在することを確認した。ネガティブトランスポザーゼの結
果は、遺伝子転移が起こったことを確認した。
【０２１３】 （５．１．２．２ ＴＶＡ８の安定性） バッチおよび連続培養を使用する安定性研究において、Ｆ１におけるトランス
ポゾン挿入は安定なようである。選択培地（ＬＢＫｍ50）および非選択培地（Ｌ
Ｂ）からのプレート計数を、カナマイシンマーカーが失われたかを決定するため
に比較し、続いてｌｕｘＡプローブを使用して、コロニーブロットにハイブリダ
イズし、すべてのコロニーがｌｕｘトランスポゾン挿入物を含むこと（および夾
雑物が存在しないこと）を確認した。抗生物質選択なしのコハク酸ケモスタット
について、選択プレート計数は、１０日後の非選択プレート計数よりも約５％低
かったが、しかし、両方のプレートタイプからのコロニーの１００％がｌｕｘポ
ジティブであった。唯一の炭素源として供給されるトルエン蒸気を使用するバッ
チの安定性研究において、同じ評価を受ける場合にＴＶＡ８は不安定性を例証し
なかった。選択プレート：非選択プレート計数比は、５日目の移動後に１．１２
±０．１３であり、そしてすべてのコロニーがｌｕｘＡプローブとハイブリダイ
ズした。同様の結果を、約１００ｍｇ／Ｌで供給されるトルエンを使用する連続
的な培養条件下でＴＶＡ８安定性について観察した。１４日間の期間の後（約１
００世代）、選択プレート：非選択プレート計数比は、１．０５±０．１３であ
り、そして選択プレートおよび非選択プレートからの全てのコロニーは、ｌｕｘ
ポジティブであった。
【０２１４】 （５．１．２．２ トルエン、ＢＴＥＸ化合物およびＪＰ−４ジェット燃料に
対するｔｏｄ−ｌｕｘレポーター株の定量的応答） トルエン濃度の増加に対する生物発光応答の増加が観察された（図１３を参照
のこと）。５〜２０ｍｇ／Ｌの範囲にわたるトルエン濃度に対する生物発光応答
は、１３３〜２２８ｎａｍｐ／ＯＤ546の特定の生物発光の値で直線的であった 。２０ｍｇ／Ｌより高い濃度についての光応答の倍数増加はより少なく、５０ｍ
ｇ／Ｌについて２９０ｎａｍｐ／ＯＤ546を示した。全体の生物発光応答曲線は 、ミカエリス−メンテン（酵素キネティックス）型を示し、このことはより高い
インデューサー濃度での飽和を示す。トルエン検出限界を、５０μｇ／ｌ未満で
あると決定した。
【０２１５】 ＢＴＥＸ化合物、ならびにフェノール、および水溶性ＪＰ−４ジェット燃料成
分に対する生物発光応答について、ＴＶＡ８を試験した。ベンゼン、ｍ−および
ｐ−キシレン、フェノール、ならびにＪＰ−４（表５）、ならびにトルエンに対
して有意な光応答が存在した。同じ濃度のトルエンおよびベンゼン（５０ｍｇ／
ｌ）は、類似の光応答を生じた。ｏ−キシレンに対する曝露の際の生物発光の増
加は存在しなかった。ＪＰ−４による光応答は、ＪＰ−４の見積もられた濃度（
Ｓｍｉｔｈら、１９８１）に存在するＪＰ−４成分（すなわち、ＢＴＥＸ化合物
）についての付加的な応答よりも有意に大きかった。増加した応答は、試験され
なかったＪＰ−４の他の成分に起因する誘導の結果であり得る。有意な光応答を
、４時間後のエチルベンゼンについて観察した。２時間のインキュベーション後
、エチルベンゼン処理のための細胞密度は、他のサンプルと比較して有意に低く
、このことは毒性効果が存在していたことを示し得る。他の研究は、細胞が以前
にエチルベンゼン上で増殖し、次いで増殖細胞アッセイに供された場合、５０ｍ
ｇ／Ｌエチルベンゼンが、ラグ期間なしで生物発光応答を誘導することを示した
。
【０２１６】
【表５】 （５．１．２．２ Ｆ１を有する生物発光レポーターのトルエン増殖比較） ＴＶＡ８および親の株Ｆ１についてのトルエン蒸気での増殖曲線を図１４に示
す。この曲線はＴＶＡ８およびＦ１についての異なるラグ時間との類似性を示し
、これはわずかに異なる接種濃度に起因し得る。両方の株についての増殖曲線の
直線部分の傾きから速度が計算された。Ｆ１およびＴＶＡ８についての光学密度
の増加の平均速度は、それぞれ、２．１４±０．３および２．２±０．３分-1×
１０-3であり、統計学的に異なっていなかった（α＝０．０５）。これらの結果
は、生物発光反応が細胞増殖に影響を与えないらしいことを例証する。
【０２１７】 ＴＶＡ８の生物発光を、トルエンでの増殖の間に測定し、そして図１５の細胞
密度のデータとともに示す。この生物発光プロットは、ＴＶＡ８増殖曲線と類似
の傾きを示すが、これらのプロットはより初期の時点にシフトする。このグラフ
は、バイオマスの増加と光産生の増加との間の規定された相関が存在することを
示す。より高い細胞密度において、細胞は、酸素について制限され、その結果生
物発光値の減少を生じる。
【０２１８】 （５．１．３ 染色体に挿入されたｔｏｄ−ｌｕｘ系の利点） 現在使用されている生物発光レポーターの大部分は、ｐＵＣＤ６１５中のプロ
モーターのないｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子カセットの前方へのプロモーターのクロ
ーニングおよび特定のプロモーターを含む株中へのプラスミド構築物の移入の結
果である。プラスミドに基づく系は、Ｒｉｃｅら（１９９５）によって観察され
るような、プラスミドの維持を確実にする一定の選択圧の必要性のような、明白
な弱点を有する。別の重要な考慮はプラスミドコピー数の考慮である。この系が
ポジティブに調節されている場合、コピー数は遺伝子発現にネガティブな効果を
与え得る。プラスミド上の調節タンパク質についてのプロモーター結合領域の多
数コピーは、研究されたオペロンのより少ない発現を引き起こす染色体の結合部
位と競合する（Ｌａｕら、１９９４）。このネガティブな効果は、細菌プロセス
のオンラインモニタリングのためにｌｕｘ融合を使用する場合に、重要である。
【０２１９】 生物発光レポーターの構築において使用される別のストラテジーは、ｌｕｘト
ランスポゾンＴｎ４４３１（Ｓｈａｗら、１９８８）の使用である。所望される
レポーター株は、ｎａｈ−ｌｕｘレポーターＨＫ４４の場合におけるように、ト
ランスポゾン変異誘発され、そして構築物は特定の誘導物質の付加に際して生物
発光について選択される（Ｋｉｎｇら、１９９０）。しかし、トランスポゾン挿
入によるｌｕｘ融合の作製に伴う問題は、挿入が生じる経路が通常破壊されるこ
とである。例えば、ＨＫ４４において、ｌｕｘ挿入はｎａｈＧ（サリシレートヒ
ドロゲナーゼ）を破壊し、それゆえに、この株はもはやｎａｈ経路およびｓａｌ
経路を介するナフタレンの完全な分解を媒介し得ない（Ｋｉｎｇら、１９９０；
Ｍｅｎｕら、１９９３）。ナフタレン分解をモニターするうえでの使用のための
株を開発するために、レポータープラスミドに、ナフタレンの完全な代謝が可能
な別の株を結合しなくてはならない。これらの関心のために、研究者らはトラン
スポゾン送達系を使用することにシフトしている。
【０２２０】 Ｈｅｒｒｅｒｏら（１９９０）は、独特なＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ制限部位を
有するｍｉｎｉ−Ｔｎ５トランスポゾン、および多重クローニング部位に隣接す
るこれら２つの制限部位のいずれかを含むｐＵＣ誘導体からなるｍｉｎｉ−Ｔｎ
５送達系を構築した。このトランスポザーゼを、最終構築物中で安定性を提供す
るためにイントランスで供給した。このアプローチは、関連する挿入物を特定の
ｐＵＣ誘導体にサブクローニングする工程、ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ベクター中にそれ
をクローニングする工程、および目的の株の染色体にそれをトランスポーズする
工程を含んだ。この系の弱点は、この系はＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ部位に限定さ
れていること、およびこれらの２つの酵素のいずれかが挿入ＤＮＡ中で切断され
た場合には、代替的なストラテジーが追求されなければならないことである。さ
らに、例えば１２ｋｂｐより大きいような、大きなＤＮＡフラグメントを方向付
けずにクローニングすることが困難であり得る。
【０２２１】 本明細書中に記載される系は、以前に記載された系の改変である。本研究で構
築されたｍｉｎｉ−Ｔｎ５系は、２つに対して、５つの酵素、ＡｖｒＩＩ、Ｎｈ
ｅＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、およびＮｏｔＩの使用に基づく。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５
ＫｍＮＸは、挿入物の方向付けたクローニングを可能にする、独特なＮｏｔＩお
よびＸｂａＩ部位を含み、ベクターＤＮＡの脱リン酸化を打ち消す。ｍｉｎｉ−
Ｔｎ５誘導体の最終バージョンであるｐＵＴＫ２１１もまた、独特なクローニン
グ部位に対して５’に強力な転写ターミネーターを含み、トランスポゾンが挿入
された遺伝子からの読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写が存在しないこ
とを保証する。ｍｉｎｉ−Ｔｎ５ＫｍＮＸとともに使用されるクローニングベク
ターｐＬＴＳは、１つの側でＡｖｒＩＩ、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、およ
びＮｏｔＩと、他方でＡｖｒＩＩ、ＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ、およびＸｂａＩと隣接
する多重クローニング部位の大きな領域の利用を可能にする。クローニングされ
るフラグメント中にＮｏｔＩ部位が存在する場合、ＸｂａＩ部位は方向付けをし
ないクローニングのために使用され得る。これらの酵素についての制限認識配列
はまれである（８塩基配列を認識するＮｏｔＩの例外を有する６塩基配列）。Ｘ
ｂａＩ部位の利点は、この部位がＡｖｒＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＳｐｅＩの異種
クローニングを可能にすることである。なぜなら、これらすべての酵素は同一の
５’突出であるＣＴＡＧを有するからである。この系はまた、ＡｖｒＩＩを使用
する異種クローニングによってＸｂａＩ部位を破壊する転写ターミネーターのク
ローニングによって見られるように、より大きい挿入物のアセンブリを可能にす
る。生じたクローニング工程はまた、独特のＸｂａＩ部位を再生した。この独特
のＸｂａＩ部位の破壊および再生の異種クローニングストラテジーを使用して、
所望の構築物についての異なるＤＮＡフラグメントをアセンブルさせ得る。この
系を使用して、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＴＶＡ８、すなわち染色体にコードされたｔ
ｏｄ−ｌｕｘ生物発光レポーターを構築した。
【０２２２】 ＴＶＡ８は、トルエンまたはコハク酸を有する無機塩培地上で増殖可能であり
、トランスポゾン挿入が増殖に必要な遺伝子を破壊しないことを例証した。これ
は、さらなる評価の前にこの株の全体の適合性を確かめるために行われなくては
ならない、重要な点検である。さらに、ＴＶ８Ａは、連続培養中の１００世代後
に、またはバッチ培養中の５回の連続する移動後に、トランスポゾン挿入の損失
、または生物発光の損失を示さなかった。これらの結果は、選択圧が、この株の
完全性に必ずしも必要でないことを示唆する。この安定性は重要である。なぜな
ら、この安定性が、必要とされる場合、インサイチュのこのバイオレポーターの
使用を排除する抗生物質選択の必要性を除外するからである。この株はまた、細
胞上で生物発光レポーターが有意な代謝ドレインであるかどうかを確認するため
に、ならびに遺伝子転移の部位が細胞にとって障害であるかどうかを確認するた
めに、野生型株Ｆ１と比較される。トルエン蒸気でのＴＶＡ８およびＦ１の増殖
は、２つの株の間で増殖において違いがないことを示し、このことは、挿入また
はレポーターのいずれもが細胞に有意なハンディキャップではないことを示唆し
た。
【０２２３】 ｔｏｄ−ｌｕｘレポーターは、５０μｇ トルエン／Ｌより下の検出限界で非
常に感受性である。この濃度における生物発光値は、バックグラウンドの生物発
光レベルよりも８０倍より高かった。このバイオレポーターは、生物発光の非常
に低いバックグラウンドレベル（１ｎａｍｐ／ＯＤ546未満）を示した。ＴＶＡ ８は、水溶液に低濃度で存在するトルエンを定量するために有用であることが示
された。有意な光レベルは、非常に低い光学密度について観察された（図１５）
。
【０２２４】 ＴＶＡ８は、単なるトルエンバイオレポーターとしてよりも、一般化されたＢ
ＴＥＸバイオレポーターとして記載され得る。なぜなら、ＴＶＡ８は、ベンゼン
、エチルベンゼン、ならびにｍ−およびｐ−キシレンに同様に応答性であったか
らである。これらのすべての化合物が生物発光応答を誘導するので、ＴＶＡ８は
ＪＰ−４ジェット燃料汚染またはＢＴＥＸ化合物を含む任意の燃料の存在につい
てのバイオレポーターとして使用され得る。この株は、ＴＣＥ同時代謝のオンラ
インモニタリングのために使用され得る。なぜなら、ｌｕｘおよびｔｏｄオペロ
ンは同一の調節下にあり、そしてトルエンジオキシゲナーゼはまた、ＴＣＥを異
化するからである。生物発光レポーターは、野外の使用適用について大きな可能
性を有し得る。なぜなら、これらは遺伝子発現のオンラインおよび非破壊的な分
析、ならびに化学的夾雑物の検出を提供し得るからである。環境の単離物へのレ
ポーター遺伝子の安定なトランスポゾン挿入物の開発は、遺伝子発現のインサイ
チュ検出のためのバイオレポーター株の有用性を拡大する。
【０２２５】 （５．２．実施例２−Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２：トルエンおよびトリクロロエ
チレン共代謝のためのｔｏｄ−ｌｕｘ生物発光およびレポーター） トリクロロエチレン（ＴＣＥ）の環境運命およびバイオレメディエーションの
可能性は、その広範な産生、使用（Ｓｔｏｒｃｋ，１９８７）および毒性および
発ガン性に関わる地下水地下水優先汚染物質としての出現（Ｇｅｉｇｅｒおよび
Ｍｏｌｎｅｒ−Ｋｕｂｉｃａ，１９７７；Ｐｅｔｕｒａ，１９８１；Ｓｈａｈｉ
ｎおよびＶｏｎ Ｂｏｒｓｔｅｌ，１９７７；Ｖａｎ ＤｕｒｅｎおよびＢａｎ
ｅｒｆｅｅ，１９７６；Ｗｅｓｔｒｉｃｋら、１９８４）に起因して、考慮すべ
き注目を受けてきた。ＴＣＥの細菌代謝は、広範に概説されている（Ｅｎｓｌｅ
ｙ，１９９１）。ＴＣＥ分解は、ＴＣＥが炭素源としては使用されないが偶発的
に分解される、共代謝である。嫌気性分解の間の発ガン性塩化ビニルの強力な産
生に起因して（ＭａｌｔｏｎｉおよびＬａｆｅｍｉｎｅ，１９７４）、ＴＣＥ生
分解における近年の焦点の多くは、好気性オキシゲナーゼ媒介性ＴＣＥ共代謝に
おけるものである（Ｎｅｌｓｏｎら、１９８８；Ｏｌｄｅｎｈｕｉｓら、１９８
９）。実質的な情報は、メタンモノオキシゲナーゼおよび種々のトルエンモノオ
キシゲナーゼに特に重点をおいて、ＴＣＥのモノオキシゲナーゼ媒介性共代謝に
おいて発達してきた（Ｏｌｄｅｎｈｕｉｓら、１９８９；Ｗａｃｋｅｔｔら、１
９８９）。
【０２２６】 トルエン分解は、モノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼ（これらは、Ｔ
ＣＥを酸化する能力を有する）の両方を含む代謝経路を介して起こる（Ｅｎｓｌ
ｅｙ，１９９１；ＳｈｉｅｌｄｓおよびＲｅａｇｉｎ，１９９２；Ｗａｃｋｅｔ
ｔおよびＧｉｂｓｏｎ，１９８８）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
Ｆ１に含まれるトルエンジオキシゲナーゼ（ｔｏｄＣ１Ｃ２ＢＡ）もまた、ＴＣ
Ｅを変換し得る（Ｚｙｌｓｔｒａら、１９８９）。
【０２２７】 好気性共代謝性ＴＣＥバイオレメディエーションの使用およびさらなる開発に
対する中心は、このような生分解プロセスをモニターし、コントロールし、そし
て最適化する能力である。１つのこのようなストラテジーは、オンラインレポー
ター技術における使用のための生物発光ｌｕｘ遺伝子融合体の開発であった（Ｂ
ｕｒｌａｇｅら、１９９０；Ｋｉｎｇら、１９９０）。ナフタレン分解のオンラ
インモニタリングの研究におけるｌｕｘレポーター系の使用は、充分考証されて
いる（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９５；Ｋｉｎｇら、１９９０）。これらのレポー
ター系はまた、汚染物質の異化生物に対する生体利用効率を評価するために使用
されてきた（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２；Ｋｉｎｇら、１９９０）。
【０２２８】 この実施例は、ＴＣＥのような汚染物質の共代謝性酸化をモニタリングおよび
最適化するためのｌｕｘバイオレポーターの構築を記載する。この目的のために
、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｆ１に含まれるｔｏｄ系を選択して、ｔｏｄ−ｌｕｘ遺伝
子融合体を開発して、トルエンジオキシゲナーゼの発現をモニターした。
【０２２９】 （５．２．１ 材料および方法） （５．２．１．１ 株の構築） この実施例で使用した株およびプラスミドを、表６に示す。Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスおよびＬＢ寒
天プレートで３７℃にて増殖させた。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
Ｆ１を、１Ｌの蒸留水中に０．２ｇのイースト抽出物、２．０ｇのポリペプトン
、１．０ｇのＤ−グルコースおよび０．２ｇの硝酸アンモニウムからなるイース
ト抽出物−ペプトン−グルコース（ＹＥＰＧ）培地（ｐＨ７．０）で２８℃にて
増殖させた。
【０２３０】
【表６】 適切なプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９およびＨＢ１０１の１
リットル培養物を収集し、そしてプラスミドＤＮＡを、改変型アルカリ溶解手順
を使用して単離した（Ｐｒｏｍｅｇａ，１９９２）。このプラスミドＤＮＡを、
ＣｓＣｌ密度勾配精製に供し、続いてブタノール抽出およびエタノール沈殿に供
した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。プラスミドＤＮＡを、ＴＥ緩衝液（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓベース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、そして
使用するまで４℃にて保存した。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手し
、そして製造業者のプロトコルに従って使用した。クローニング技術を、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら（１９８９）に概説されるように行った。このレポータープラスミ
ドｐＵＴＫ３０を、ｐＵＣＤ６１５（Ｒｏｇｏｎｓｋｙら、１９８７）のｌｕｘ
遺伝子カセットの前に、ｐＤＴＧ５１４（Ｍｅｎｎ，１９９１；Ｍｅｎｎら、１
９９１）からｔｏｄプロモーター（Ｌａｕら、１９９４；Ｗａｎｇら、１９９５
）をクローニングすることによって生成した。これは、ｐＤＴＧ５１４からｐＵ
ＣＤ６１５のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化物への２．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｂ
ａＩフラグメントをディレクショナリークローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ
ｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ）することにより達成した（図１６）。形質転換を、サブ
クローニング効率コンピテント細胞（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造業者のプロトコルに従って用いて行った。形質転換体
を、５０μｇ ｍｌ-1カナマイシンを含むＬＢプレートで選択した。形質転換体
のプラスミドミニプレップを、ＨｏｌｍｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ（１９８１）に
記載されるように行い、そしてＢａｍＨＩで切断して、ｔｏｄフラグメントの挿
入を確認した。得られたＥ．ｃｏｌｉ株ＪＢＦ−７は、レポータープラスミドｐ
ＵＴＫ３０を保有した。
【０２３１】 三親接合を、フィルター技術の改変型バージョンを用いて行った。ドナー（Ｊ
ＢＦ−７、ｐＵＴＫ３０）、ヘルパー（ＤＦ１０２０、ｐＲＫ２０１３；Ｆｉｇ
ｕｒｓｋｉおよびＨｅｌｓｉｎｋｉ，１９７９）、およびレシピエント（Ｆ１）
の純粋培養物を、適切な抗生物質を含むＬＢブロス中で、約１．０の５４６ｎｍ
での光学密度（ＯＤ546）まで増殖させた。細胞を、９８００×ｇにて１０分間 遠心分離することによって収集した。このペレットを懸濁し、そして１００ｍｌ
の５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、そして５０ｍｌの５０ｍ
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4に懸濁した。
【０２３２】 その３つの株を、２：１：１（ドナー／ヘルパー／レシピエント）の比を用い
て混合した。テフロン膜（４７ｍＭ、０２２μｍ孔サイズ）およびフィルターを
通してろ過した細胞懸濁物を、ＬＢプレートに置いた。２８℃にて一晩のインキ
ュベーションの後、このフィルターを除去し、そして１．５ｍｌの５０ｍＭ Ｋ
Ｈ2ＰＯ4で洗浄した。系列希釈を行い、そして希釈物を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ａｇａｒプレート（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）においた。４８時間のインキュベーションの後、トルエン蒸気を導入し、そ
して光を産生するコロニーを、さらなる特徴づけのために選択した。５つのカナ
マイシン耐性株（トルエン蒸気に応答して光を発光する）のうちの１つ（Ｐ．ｐ
ｕｔｉｄａ Ｂ２）を、残りの研究における使用のために選択した。
【０２３３】 （５．２．１．２ 生物発光分析） バッチおよびリアクター研究において、生物発光を、光電子増倍管（これは、
光を電流に変換する）を用いて測定した。休止細胞アッセイおよびリアクターシ
ステムにおける光電子増倍管を、コンピューターに接続し、そしてナンプ電流（
ｎａｍｐｓ ｃｕｒｒｅｎｔ）として生物発光を記録した。
【０２３４】 （５．２．１．３ バッチ研究） 増殖細胞のアッセイを、Ｈｅｉｔｚｅｒら（１９９２）に記載のように行った
。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２の凍結ストックからの一晩培養物を、１００ｍｌのＬ
Ｂおよび５０μｇ ｍｌ-1のカナマイシンを含む２５０ｍｌ三角フラスコ中で調
製した。継代培養物を調製し、そして中期対数増殖期（０．４５〜０．４８のＯ
Ｄ546）の細胞を使用した。２．５ｍｌのアリコートを、０〜５０ｍｇ Ｌ-1の トルエンを含む２．５ｍｌの金属塩培地（ＭＳＭ）または１０〜１００μｌのＪ
Ｐ４ジェット燃料飽和ＭＳＭに添加した。ＪＰ４ジェット燃料で飽和した水中の
トルエンの濃度は、約８ｍｇ Ｌ-1である（Ｓｍｉｔｈら、１９８１）。生物発
光を、３０分ごとに測定した（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２）。
【０２３５】 休止細胞アッセイのための細胞を、２．７ｇ Ｌ-1スクシネートを補充したＭ
ＳＭで増殖させた。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２の培養物を、約０．８のＯＤ546で 収集した。この細胞を、１５０００×ｇので１０分間遠心分離し、そして０．６
のＯＤ546までＭＳＭ中に再懸濁した４ミリリットルの培養物を、Ｍｉｎｉｎｅ ｒｔバルブを備えた６つの２６ｍｌバイアル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｃｈａｎｔｉ
ｌｌｙ，ＶＡ）の各々に、スターラーバーとともに添加した。１つのバイアルを
、複数回のトルエン暴露のために使用し、一方、残りを単回の暴露のために使用
した。このバイアルを、光を通さないサンプリングセル中で磁気によって攪拌し
た。トルエン飽和ＭＳＭおよびＭＳＭ単独を添加して０．４７のＯＤ546を得、 そして１０ｍｇ Ｌ-1のトルエンを、１３０時間の複数回暴露バイアルにわたっ
て６回注入した。同時点で、単回暴露バイアルに１０ｍｇＬ-1トルエンを注入し
た。光応答を、データ収集コンピューターに接続した光電子増倍管を用いて、３
分ごとに記録した（Ｋｉｎｇら、１９９０）。
【０２３６】 （５．２．１．４ 固定化細胞リアクターシステム） Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２を、固定化細胞リアクターシステムのために、アルギ
ン酸ビーズにカプセル化した。細胞を、１ＬのＬＢ中で、１．２のＯＤ546まで 増殖させ、そして５５００×ｇにて１０分間遠心分離し、０．９％ ＮａＣｌで
３回洗浄し、そして４０ｍｌの０．９％ ＮａＣｌに懸濁した。この細胞懸濁物
を、８０ｍｌのアルギン酸溶液（２８ｇ Ｌ-1低密度アルギネート、０．９％
ＮａＣｌ）に添加した（Ｗｅｂｂ，１９９２ａ；ｂ）。細胞−アルギネート懸濁
物を、６０ｍｌのシリンジに、２５ｈゲージの針を介して吸引し、そして０．５
Ｍ ＣａＣｌ2溶液に滴下した。アルギネートをＣａ2+イオンによって架橋し、 このようにして細胞をカプセル化した。この細胞を、続いて、０．１Ｍ ＣａＣ
ｌ2の新鮮な溶液におき、そして３０分間静置して使用した。
【０２３７】 差動容量リアクター（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｖｏｌｕｍｅ ｒｅａｃｔ
ｏｒ）（ＤＶＲ）を使用して、理想プラグ流れリアクター（ｉｄｅａｌ ｐｌｕ
ｇ ｆｌｏｗ ｒｅａｃｔｏｒ）のセクションをシュミレートした。このリアク
ターに対する流入を、多孔性金属フリットを介して分散させて、ベッドに対する
平坦速度（ｆｌａｔ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）プロフィールを提供した。このリアク
ターは、内径５．０ｃｍ×５．０ｃｍ長を測定した。このリアクターの完全な説
明は、Ｗｅｂｂら（１９９１）に見出され得る。この研究において、システムは
、図１７で図示されるように、ＤＶＲを組み込んで設計される。このシステムを
、６９０ｋＰａに定格された３つのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
）ステンレス鋼基板容器を備えている。基板導管からリアクター入口への給送を
、２つのＦｉｌｓｏｎ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）３０１ ＨＰＬＣポンプに
よって制御した。０．４ｍｌ 分-1の流速を維持した。基板導管を酸素で加圧し
て、電子受容体を備えたシステムを提供した。全ての培地導管は、３ｍｇ Ｌ-1 のピルビン酸およびＴｒｉｓベースの０．１Ｍ溶液とともに、微量の金属培地を
含んだ（Ｌａｃｋｅｙら、１９９３）。リン酸緩衝液は使用しなかった。なぜな
ら、リン酸イオンはＣａ2+イオンと複合体化し、そしてアルギン酸架橋を破壊す
るからである。この培地に加えて、２つの容器は、ＴＣＥまたはトルエンのいず
れかを含んだ。トルエンの入口濃度を、タイマーによって制御されるＨＰＬＣポ
ンプを用いて、２０時間サイクル（１０時間はトルエンあり、１０時間はトルエ
ンなし）で方形波摂動を用いることによって変更した。サイクルの給送部分の間
、１０ｍｇＬ-1のトルエンを、リアクターの入口に導入した。入口ＴＣＥ濃度を
、２０ｍｇＬ-1で一定にした。
【０２３８】 （５．２．１．５ ＴＣＥおよびトルエン分析） リアクター廃液中のＴＣＥの分析を、３ｍｍガラスビーズを封入したストリッ
ピングカラム（１２．５ｃｍ長および０．４ｃｍ内径）を用いてオンラインで実
行して、ＴＣＥ分離についての適正表面積を提供した。ＴＣＥをヘリウム（ＧＣ
キャリアガス）で取り除いた。ストリッピングカラム出口を、７５℃で維持した
過熱サンプルラインによる電子捕獲検出器を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ，
Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）（ＨＰ）５８
９０ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩ）に接続した。自動注入（２５μｌ）を、コンピュー
ター化したコントロールプロセス（ＨＰ Ｃｈｅｍ Ｓｔａｔｉｏｎソフトウエ
ア）によって行った。このＧＣは、架橋メチルシリコーンキャピラリーカラム（
３０ｍ長、内径０．２ｍｍ、フィルム厚０．３３μｍ）を備え、一方、オーブン
は、６０℃で等温的に操作した。他の操作パラメータは、１５０℃の注入温度、
２００℃の検出器温度および１０：１のスプリット比を含んだ。このシステムは
、ストリッピングカラムを較正するために、リアクターの周りにバイパスライン
を備えた。
【０２３９】 トルエンサンプルを、０．５ｍｌのアリコートで、流出サンプリングポート（
図１７）から取り出し、そして１．５ｍｌサンプルバルブに注入した。ヘッドス
ペース分析を、２．４４ｍ、３．２ｍｍ直径のＰｏｒｏｐａｋ Ｎ封入カラムお
よび炎光イオン化検出器を備えたＳｈｉｍａｚｕ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）Ｇ
Ｃ−９Ａガスクロマトグラフを用いて行った。このオーブンの等温温度は、２１
０℃であり、そして検出器および注入器の両方の温度は２２０℃であった。
【０２４０】 （５．２．２ 結果） （５．２．２．１ バッチ研究） 増殖細胞のアッセイは、９０分の暴露後に、１０ｍｇ Ｌ-1のトルエンまでの
トルエンの濃度の増加とともに、生物発光応答が増加することを示した（図１８
）。この関係は、この範囲にわたって線形であった。この生物発光応答は、０．
１ｍｇ／ｌトルエンで２．４ナンプから１０、２０および５０ｍｇ／ｌトルエン
について約９０ナンプまで変化した。０および０．０１ｍｇ／ｌトルエンについ
て有意な生物発光応答は存在しなかった。同様に、光応答は、水溶性ジェット燃
料成分の濃度の増加とともに増加した（図１８）。１０μｌのジェット燃料飽和
ＭＳＭの添加で（約０．０２ｍｇ／ｌトルエン）、この光応答は１６ナンプであ
り、一方、１００μｌの添加で（約０．２ｍｇ／ｌトルエン）、この応答は３１
ナンプまで増加した。ジェット燃料の０．１ｍｇ／ｌトルエン当量についての生
物発光応答は、０．１ｍｇ／ｌトルエンについての約１０倍であり、故にトルエ
ンに加えたほかの成分は、生物発光に影響するようである。
【０２４１】 休止細胞アッセイにおいて、トルエンの単回暴露に対する生物発光応答は迅速
かつ再現性であった（図１９）。複数回暴露バイアルへの最初の注入は、各単回
暴露バイアルと同じ特徴的な光応答を示した。しかし、以前にトルエンを暴露し
た細胞の応答と比較して、トルエンへの最初の暴露の際には遅い応答であった（
生物発光における増加の速度、Ｈ-1）。さらに、応答速度は、トルエンへの各暴
露とともに増加した（表７）。しかし、単回および複数回暴露の両方についての
最大生物発光応答は、５７３±１２７ナンプで同じであった。
【０２４２】
【表７】 （５．２．２．２ 固定化細胞リアクターシステム） アルギン酸カプセル化Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２を充填したＤＶＲシステムを使
用して、固定化システムにおいてトルエンを暴露した場合に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ
Ｂ２の光応答およびＴＣＥ共代謝を決定した。実験結果は、トルエンの導入下
で、迅速な生物発光応答を示した。図２０は、入口トルエン濃度における変化に
対するリアクターにおけるレポーター株の光応答およびＴＣＥの除去を示す。デ
ータは、トルエン濃度に関する生物発光の直接応答を示す。サイクルの間、光発
光は、１６．３±１．２ナンプ／時間まで増加した。トルエン給送後にゼロに近
づいたトルエン流出濃度を停止し、そしてリアクターにおける光応答は、３，４
±０．８ナンプ／時間の速度で減少した。生物発光とＴＣＥ分解との間の直接相
関が観察された。最大光応答は、４３．４±６．８ナンプであった。トルエンが
このシステムに導入される場合の定常状態のＴＣＥ流出濃度は、１６．５±０．
２ｍｇ／ｌであり（２０％除去）、一方、流出トルエン濃度は、５．８±０．１
ｍｇ／ｌ（５０％除去）であった。このことは、分解されたＴＣＥ１μモルあた
り１．７μモルの分解されたトルエンの比を示す。異なるアッセイ型からの結果
はトルエンに対して同様の応答示したのに対し、生物発光の程度は、実験条件（
すなわち、サンプル攪拌、細胞学、光モニタリング）の間のいくらかの相違に起
因して比較し得ない。
【０２４３】 （５．２．３ 考察） 増殖細胞のアッセイは、トルエンに対する定量的生物発光応答のみでなく、定
性的応答も同様に実証した。生物発光と、増殖細胞のアッセイにおける０ｍｇ／
ｌと１０ｍｇ／ｌとの間のトルエン濃度との間には線形関係が存在した。さらに
、生物発光応答は、環境的に関連する複合夾雑物であるジェット燃料の希釈に比
例した。しかし、ジェット燃料に対する生物発光応答の程度は、その応答が単に
ジェット燃料中のトルエンに起因する場合に予測されるより高かった。別の生物
発光株を用いた研究は、近年、溶媒に対する有意な生物発光応答が存在すること
を示している（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９６）。これは、細胞が、ルシフェラー
ゼ反応のアルデヒド基質について制限されることを実証した。溶媒が細胞膜を摂
動させ、脂肪酸の細胞内濃度の増加を引き起こすと仮定した。脂肪酸は、ｌｕｘ
酵素によって、対応するアルデヒドに還元されるので、量の増加はアルデヒドの
制限を打ち消し、より高い生物発光を生じる。この溶媒効果は、増殖細胞アッセ
イにおける純粋なトルエンと溶媒マトリックス中のトルエンとの間の生物発光の
程度において観察された差異を説明し得る。
【０２４４】 代表的には、環境において、細胞は、中期対数増殖期にはない。それゆえ、本
発明者らは、同様に、休止細胞条件下で生物発光特性を試験した。断続的な唯一
の炭素源としてトルエンを用いる細胞においてさえ、生物発光応答は、少なくと
も５日間再現性があった。より迅速な生物発光応答が、トルエンに対して以前に
暴露された細胞について観察されたが、最大生物発光は一定のままであった。
【０２４５】 固定されたＰ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２は、ＤＶＲにおいてトルエンおよびＴＣＥ
を指向する分解活性のオンラインモニタリングを可能にした。このシステムは、
トルエン分解と生物発光との間の直接相関を示した。ｌｕｘおよびｔｏｄオペロ
ンは、同じプロモーター制御の下にあるので、生物発光は、ｔｏｄオペロンが発
現され、そしてＴＣＥが共代謝されることを示した。それゆえ、生物発光とＴＣ
Ｅ共代謝との間の直接機構的相関が存在する。この研究において、ＴＣＥは、別
のＰ．ｐｕｔｉｄａ株について報告されたように（ＨｅａｌｄおよびＪｅｎｋｉ
ｎｓ，１９９４）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ Ｂ２においてｔｏｄオペロンを誘導しな
いようであった。図２０は、トルエンの非存在下において、ＴＣＥの入口濃度お
よび流出濃度が等しく、そして生物発光の増加を示さなかったことを示す。
【０２４６】 ＴＣＥおよび／またはその代謝物に対する暴露は毒性であり得、そして分解酵
素活性に影響し得る。しかし、生物発光の強度は、ＴＣＥの存在下でさえ、トル
エンの連続的な摂動において再現性があった（図２０）。これらのデータは、ｔ
ｏｄ−ｌｕｘレポーターがｔｏｄ遺伝子発現のオンライン測定を提供し、そして
また、ＴＣＥの連続暴露に起因する強力な毒性効果の指標を提供することを示し
た。２０ｍｇ／ｌのＴＣＥで、毒性効果は全く無いようであった。このサンプル
は、種々の生理的条件（増殖および休止なし細胞ならびに固定化細胞）の下で、
トルエンに対して別々かつ再現性の応答が存在することを実証した。
【０２４７】 （５．３ 実施例３−Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオセンサの速度論およ
び応答） 多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）は、毒性かつ発ガン性の持続性環境夾雑物で
ある（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９７５）。１キログラムの土壌あたり１グラムの
ＰＡＨを超える濃度で高度に汚染される何百もの場所が、全国に存在する。これ
らの場所は、１〜１００エーカー以上におよぶ。常在する土壌生物は、これらの
化合物を分解する能力が実証されている。
【０２４８】 Ｋｉｎｇら（１９９０）は、原型ＮＡＨプラスミドｐＫＡ１内のｌｕｘＣＤＡ
ＢカセットおよびｎａｈＧ遺伝子の転写融合によるｐＵＴＫ２１の構築を報告し
た（Ｋｉｎｇら、１９９０）。Ｂｕｒｌａｇｅら（１９９０）もまた、同様の構
築を報告した。ｐＵＴＫ２１が操作された代謝性プラスミドｐＫＡ１は、２つの
オペロン（ナフタレンオペロンおよびサリチレートオペロン）において組織化さ
れ、そしてナフタレン、サリチレート、および多くの他の汚染物質の分解を媒介
する（Ｓａｙｌｅｒら、１９９０）。ｐＵＴＫ２１は、２つの経路を含み、上流
経路はナフタレンのサリチレートへの分解をコードし（ナフタレンオペロン）、
そして下流の操作された経路はｌｕｘ経路をコードする。下流経路はもはや、サ
リチレート分解をコードしない。なぜなら、ｎａｈ遺伝子は、ｌｕｘＣＤＡＢＥ
カセットの挿入により破壊されているからである。ＰＵＴＫ２１の両方の経路は
、サリチレートによって誘導されるプロモーターによって制御される（Ｓｃｈｅ
ｌｌ，１９９０）。レポーター細菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４（ＨＫ４４）は、ｐＵＴＫ２１を保有する。このＨＫ４
４は、ｎａｈと無関係の経路によってサリチレートを天然に分解することによっ
て、無効なサリチレートオペロンを補充する（ＤｉＧｒａｚｉａ，１９９１；Ｈ
ｅｉｔｚｅｒら、１９９２；Ｋｉｎｇら、１９９０）。生物発光とインデューサ
ー濃度との間（ナフタレンおよびサリチレート）の陽性の定量的関係ならびにこ
れらの化合物の分解が実証された（ＤｉＧｒａｚｉａ，１９９１）。生物発光活
性は、酸素、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＦＭＮＨ2、およびアルデヒド基質を必要と する（Ｈａｓｔｉｎｇｓら、１９８５；Ｍｅｉｇｈｅｎ，１９８８，１９９１）
。ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子は、ヘテロダイマールシフェラーゼ、レダクターゼ、
トランスフェラーゼ、およびシンセターゼをコードする。この光反応は、長鎖ア
ルデヒド基質を必要とし、これは、光反応の間に脂肪酸に変換される。脂肪酸レ
ダクターゼ複合体（レダクターゼ、トランスフェラーゼ、およびシンセターゼ）
は必須である。なぜなら、脂肪酸生成物から長鎖アルデヒド基質を再生するから
である。
【０２４９】 遊離ＨＫ４４を使用する以前の研究は、サリチレートおよびナフタレン濃度と
の線形光応答を示す（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２；Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９
４）。この実施例は、固定化ＨＫ４４によるサリチレートの形成およびパラメー
タを記載する。強力な差異は、遊離状態と固定化状態との間の細菌生理学に存在
する。これらは「非侵襲性、非破壊性、迅速、かつ集団特異的」であるので（Ｄ
ｉＧｒａｚｉａ，１９９１）、生物発光レポーター株は、生体利用効率、分解活
性、およびインサイチュでの至適分解条件を迅速に示す能力を有する（Ｂｕｒｌ
ａｇｅら、１９９０；Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２；Ｋｉｎｇら、１９９０；Ｓ
ａｙｌｅｒら、１９９０）。本明細書中に記載されるＨＫ４４バイオセンサは、
光が最高に達するデバイス（例えば、光学繊維）にＨＫ４４を固定することによ
って産生され得る。次いで、このＨＫ４４センサは、土壌における条件および分
解を連続的にモニターするために使用され得る。このようなセンサの使用として
は、以下が挙げられ得る：（１）プルーム（ｐｌｕｍｅ）の検出（例えば、サリ
チレートは、ナフタレンおよびいくつかのほかのＰＡＨの生物学的分解によって
産生される移動性娘化合物である）、または（２）ＰＡＨ濃度が減少されるよう
なレメディエーションの後期段階の間のレメディエーションのモニタリング。固
定化ＨＫ４４によるサリチレート分解の機構的説明が提供される。アルギン酸固
定化ＨＫ４４を備えた充填層リアクター（ＰＢＲ）を有する例示的なシステムが
示される。
【０２５０】 （５．３．１ 数学モデル） 本実施例は、固定されたＨＫ４４のベッドを有するプラグフローリアクターを
記載する。軸方向にのみ有意な流動が生じると仮定して、ｔ時間〜ｔ＋Δｔ時間
およびｚ位〜ｚ＋Δ位のバルク液相上の非定常状態シェル質量バランスは、以下
の結果である：
【０２５１】
【数１７】 式（１７）は、積分法の平均値定理を適用すること、ΔｚおよびΔｔで除算す
ること、ΔｔおよびΔｚが０に収束する時の極限をとること、ならびに質量移動
の速度、球状ビーズの表面領域、および表在性速度を代入することにより、式（
１８）に減少する：
【０２５２】
【数１８】 式（１８）は、以下の代入により無次元になされ得る。
【０２５３】
【数１９】 式（２０）は、代入により生じる：
【０２５４】
【数２０】 最初の条件をクリーンなベッドと仮定する。無次元の式における境界条件は、
以下である。
【０２５５】
【数２１】 固体相産生での非定常状態の質量バランスは以下である：
【０２５６】
【数２２】 ここで液体拡散速度は、優勢であると仮定され、そして平衡は細孔中であると
仮定される。項は、上記の展開に項を加えることにより吸収された固相について
展開され得る。式（２３）は、積分法の平均値の定理を適用し、ΔｚおよびΔｔ
で除算し、ΔｔおよびΔｚが０に収束する時の極限をとり、式（１９）に代入を
し、ならびに直線的吸着を仮定した後に帰着する：
【０２５７】
【数２３】 Ｒｉの正確な式はこのシステムについては未知である。ミカエリス−メンテン
反応モデル（ＭＭＲＭ）は、一般的であり、そして分解速度および基質濃度速度
と基質濃度との間の非線形関係を示す。この非線形関係は、生物学的システムの
限られた分解能力に起因する。低濃度で、ＭＭＲＭは、基質濃度において一次で
ある反応速度に達する。このシステムの分解能力は、到達され、または超えられ
た時に、ＭＭＲＭは、濃度においてゼロ次になる。従って、反応レジームにわた
って分布した多数の条件が、２つのＭＭＲＭ速度定数を厳密に測定するために必
要とされる。この反応速度の式および定数は、最初にＨＫ４４の定常状態の挙動
をＭＭＲＭの限られた場合と比較することで解明された。これらの限定例は、以
下のようにサリチル酸においては一次およびバイオマスにおいては一次として数
学的に表現された：
【０２５８】
【数２４】 ならびに以下のように濃度においてはゼロ次およびバイオマスにおいては一次
として数学的に表現された：
【０２５９】
【数２５】 式（２４）および式（２５）はそれぞれ、ミカエリス−メンテンモデルにより
必要とされるような２つに代わり、単独の速度定数を必要とする。実際的に、線
形速度モデルである式（２４）および式（２５）は、２パラメーターの非線形Ｍ
ＭＲＭよりも、よりストリンジェントな挙動の記述を提供する。
【０２６０】 最初の条件および境界条件は、クリーンなベッド、ビーズ内の対称性、および
固体界面での蓄積が無いことを仮定する：
【０２６１】
【数２６】 式（２０）および（２３）は、基質の分布およびコンバージョンに影響するプ
ロセスを示す。このプロセスには以下が挙げられる：（１）バルク相における分
散および対流輸送；（２）バルクおよび内部固相質量移動抵抗性；（３）ビーズ
細孔内のアルギン酸への吸着；および（４）ビーズ内のみの細菌による化学的コ
ンバージョン。バイオマスの定常分布は、成長無しと仮定される。成長が起こる
場合、従ってバイオマス分布はビーズ半径の関数になり得る（Ｋｕｈｎら、１９
９１）。このモデルは、質量移動抵抗性を無視できると仮定することによりベッ
ドの定常状態の挙動を分析するために簡易化された。この簡易モデルは、反応速
度式（２４）と組み合わせた場合、解を有する（Ｄａｎｃｋｗｅｒｔｓ，１９５
３）：
【０２６２】
【数２７】 ここでは、以下である：
【０２６３】
【数２８】 この簡易モデルは、反応速度式（２６）と組み合わせた場合、解を有する：
【０２６４】
【数２９】 次いで、この非定常状態の挙動および完全モデル予測は、臨界仮定の評価につ
いて比較され得た。解析解が利用できないという数学的な問題は、ＰＤＥＣＯＬ
ソフトウエアパッケージ（ＭａｄｓｅｎおよびＳｉｎｃｏｖｅｃ、１９７９）を
用いて解決された。利用可能な解析解および数的結果を、拡散、輸送、および反
応プロセスについて比較した（Ｃｒａｎｋ、１９７５）。他の研究者らもまた、
ＰＢＲプロセスのシミュレーションのためにＰＤＥＣＯＬを用いた（Ｃｏｓｔａ
およびＲｏｄｒｉｇｕｅｓ、１９８５）。
【０２６５】 （５．３．２ 物質および方法） オンライン計測を有する、すでに発展したＰＢＲシステム（Ｗｅｂｂ，１９９
２ａ；ｂ；Ｗｅｂｂら、１９９１）は、細菌分解および生物発光活性を地下のそ
れらを模倣した条件下で測定するために用いられた。このリアクターデザインは
図２１に詳しい。このＰＢＲは、温度制御され、そして固定された培養へ供給を
保持および分配するために注入口および流出口に溶接された金属フリットを装備
されていた。さらなる内腔挿入体は、パックされたベッドと流出口フリットとの
間にフィルター（例えば０．２−ｍｍ無機および重合体の）の設置を可能にした
。このフィルターは、オンラインの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）へ
の自動注入のための流出液を濾過し、そしてリアクターへの全体的な分布を改善
した流動に対する均一な抵抗性を実現した（Ｗｅｂｂ，１９９２ａ；ｂ）。この
リアクターは、１．３４ｃｍの内部直径を有し、ここでベッド長は０．８〜１１
．０ｃｍに動かされ得た。ＨＰＬＣポンプは、加圧された供給リザーバからそれ
ぞれのリアクターへ培地を供給した。リアクターに入れられた酸素を含む全ての
栄養素は、液相に溶解した。ナフタレンおよびサリチル酸を、ＦＬ−４ ２重モ
ノクロメーター蛍光検出器（ｄｕａｌ−ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒ ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａ
ｌｋ，ＣＴ）でＶｙｄａｃ ＴＰ２０１５４ カラム（Ｓｅｐ／Ａ／Ｒａ／Ｔｉ
ｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を用いることによりオンライン
ＨＰＬＣで検出した。サリチル酸検出のための励起および発光波長はそれぞれ、
２９０ｎｍおよび３６０ｎｍであった。このリアクターは、生物発光活性をモニ
タリングするためのオンライン光検出器（Ｄｕｎｂａｒ、１９９２）を装備され
た。この検出器は、このリアクターの注入口から約２．５ｃｍに置かれた接着さ
れたファイバー束（Ｅｎｓｉｇｎ Ｂｉｃｋｆｏｒｄ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｓｉｍｓ
ｂｕｒｙ，ＣＴ）からなっている。７７３４８モデル光電子増倍管（５００ｎｍ
近傍で８０ＭＡ／Ｗの放射感度）を用いたＯｒｉｅｌ Ｉｎｃ．（Ｓｔｒａｔｆ
ｏｒｄ，ＣＴ）７０７０ 光電子増倍検出システムを用いた。
【０２６６】 第２の装置は、アルギン酸バイオセンサーを通過した流動をシミュレーション
した。この装置はフロー細胞およびアルギン酸に固定されたＨＫ４４の付着層を
有するＨａｍａｍａｔｓｕ フォトダイオード（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ
）からなる。このフロー細胞量は５ｍｌであり、ここでこの流速を１．５ｍｌ／
分に維持した。光をフォトダイオードでモニターしている間、サリチル酸の濃度
を変化した。無機塩培地を誘導物質の濃度を変えてこれらの実験に用いた。
【０２６７】 無機塩培地（ｐH７．２）は、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ（０．１ｇ／ｌ）、ＮＨ4Ｎ
Ｏ3（０．２ｇ／ｌ）、ｔｒｉｚｍａTMｂａｓｅ（３．０３ｇ／ｌ）、ＭｇＯ（ １．０×１０-3ｇ／ｌ）、ＣａＣｌ2（２．９×１０-4ｇ／ｌ）、ＦｅＣｌ3・６
Ｈ2Ｏ（５．４×１０-4ｇ／ｌ）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１．４×１０-4ｇ／ｌ ）、ＣｕＳＯ4（２．５×１０-5ｇ／ｌ）、Ｈ3ＢＯ4（６．２×１０-6ｇ／ｌ） およびＮａ2ＭｏＯ4・Ｈ2Ｏ（４．９×１０-5ｇ／ｌ）からなり、これを分解お よび生物発光の研究のために適切な炭素供給源と共にリアクターに供給した。反
応速度論的な細菌の研究試験を、供給物およびリアクターの制御された加圧によ
りリン酸塩制限し、そして好気的に維持した。
【０２６８】 このＨＫ４４をグルコース（１．０ｇ／ｌ）、ポリペプトン（２．０ｇ／ｌ）
、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（０．２ｇ／ｌ）、ＮＨ4ＮＯ3（０．２ｇ／ｌ）
、およびテトラサイクリン（１４ｍｇ／ｌ）を含む１００ｍＬのＴＥＰＧ培地に
新鮮な解凍種菌（使用まで−７０℃で冷凍）を添加することによる固定のために
調製した。この培養物を、２５℃で１５時間、振とうし、次いで１０分間、８０
００ｒｐｍで遠心した。次いで、このペレットを固定化の前に０．９％ＮａＣｌ
溶液で３回洗浄した。ＨＫ４４の濃度は、５４６ｎｍでの光学密度測定により求
めた。ＨＫ４４を０．９％ＮａＣｌ溶液に細菌を懸濁すること、ならびに１：２
の容量比の低粘度アルギン酸（２８ｇ／Ｌ）およびＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）溶液と
混合することにより固定した。ビーズを、精密なレギュレーター（Ｐｏｒｔｅｒ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）および０．００３
−ｉｎ（内径）チュービングの断片により制御されたエアージェットに設置され
た注射針（Ｋｌｅｉｎら、１９８３）により、０．１Ｍ ＣａＣｌ2溶液へ制御 された滴状添加をすることにより形成した。ビーズの直径を穏やかな湿潤ふるい
を用いて測定した。アルギン酸ビーズをヘキサメタフォスフェートナトリウム５
０ｍＭに溶解した。
【０２６９】 アルギン酸カルシウムのナフタレンおよびサリチル酸ナトリウム吸着等温線を
バッチ平衡およびブレークスルー曲線法（Ｒｕｔｈｙｅｎ、１９８４）を用いて
測定した。分散のための滞留時間分布および液相質量移動測定をリアクターの上
流の６ポートＨＰＬＣバルブを通して導入したサリチル酸塩（０．１Ｍ）、カリ
ウムおよび／または臭化物（１．０Ｍ）を用いて推定した。トレーサー濃度は、
５１０シリーズＨＰＬＣポンプ、ＩＣ−ＰＡＫ陰イオン交換カラム、および４３
１コンダクタンス検出器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｃａｍ−ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を有す
るＷａｔｅｒｓ イオンクロマトグラフィーシステムを用いて測定、または蛍光
を用いて連続モニターした。
【０２７０】 （５．３．３．非生物的特性） 代表的には、ほとんど全てのビーズの直径は、３．９×１０-2ｃｍと７．５×
１０-2ｃｍとの間の範囲であった。例えば、４，６５および３１重量％がそれぞ
れ７．５×１０-2、４．５×１０-2、および３．９×１０-2ｃｍのスクリーンに
保持された。サリチル酸は、アルギン酸には測定できるほど吸着しない。ここで
ナフタレンの等温線は８．４の無次元比を有する線形であった（図２２）。最終
的な平衡状態の液相濃度は、０．０〜１．５×１０-4Ｍの範囲であった。ここで
固体の濃度はアルギン酸１リットルあたりナフタレン１．１×１０-3モルにおよ
んだ。分散を、Ｒｕｔｈｖｅｎ（１９８４）により示唆されたように、Ｈａｙｎ
ｅｓおよびＳａｒｍａ（１９７３）により引き出された解析的関係を線形化する
ことにより測定した。勾配は、１×１０-2と２×１０-2ｍ2／分との間の範囲で あり、これは分散が１０-2ｃｍ2／分のオーダーにあったことを示している。リ アクター量および平均滞留時間の比較は、チャネリングが有意ではないことを実
証した。他の試験（Ｗｅｂｂ，１９９２ａ：ｂ）において言及されたように、疎
水性フィルターは、リアクター流出口を超えて流れるために均一な抵抗性に効果
をもたらし、そして流動特性を大きく改善した。ブロット数は、約１００におよ
び、そして質量移動が有意でないことを示す（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９８７）
。
【０２７１】 アルギン酸は、その有利な輸送特性および吸着特性により、ナフタレンおよび
サリチル酸レポーター細菌のためのよい固定化培地であるようである。また、ア
ルギン酸は、センサー適用のために有用な形状（例えば、光プローブに直接付着
する薄いシートとして）に形成され得る（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９４）。サリ
チル酸およびナフタレンは良好な試験化合物である。なぜならナフタレンは大量
の環境汚染物質であり、そして一般に他のＰＡＨ混雑物とともに見出されるから
である。ここでサリチル酸は、ナフタレンおよびいくつかの他のＰＡＨの代謝物
である。他のＰＡＨを検出するための固定マトリックスの選択においては注意す
べきである。なぜならより大きいＰＡＨは、その可溶性および吸着特性において
これらのモデル化合物から有意に逸脱し得るからである。
【０２７２】 （５．３．４．Ｐ．ＨＫ４４の反応速度論的な評価蛍光） 表８の２〜４のカラムに列挙された供給物濃度、バイオマスおよび流速の異な
る組み合わせを、１８の試験において変化させ、分解速度式および関連の定数の
方式を決定した。これらの研究に用いられた固定された細胞の５つの荷電をカラ
ム１の数の指示により示した。液相質量移動をＫａｔａｏｋａら（１９７３）の
相関関係を用いて推定した。定常状態の挙動は摂動後のいくつかのベッド容量内
で達成され、測定したパラメーターを用いた式（２０）および式（２３）による
予測と一致していた。次いで、細菌の分解活性は変化しなかったが、少量のドリ
フトがいくつかの研究において認められた（より高い標準偏差により示される）
。バイオマス、サリチル酸の濃度および滞留時間についての範囲は、それぞれ、
１．９×１０9〜３．５×１０9細胞／ｍｌ、２．２５〜４．５ｍｇ／ｌおよび１
４〜１５０分であった。サリチル酸を４．５ｍｇ／ｌ以下でリアクターに供給し
た。溶解した酸素の化学量論のレベルは、高いサリチル酸濃度でＨＫ４４に対す
る毒性を証明し得た。上記のこの範囲の濃度は、おそらく現実的ではない。なぜ
なら、１ｍｇ／ｌ濃度より大きい濃度では、ごくわずかのＰＡＨしか可溶でない
からである（Ｌｅｅら、１９７９）。サリチル酸コンバージョン（カラム５に列
挙された）は、流出液濃度へ標準化された１．０８％〜２．９６％の範囲の標準
偏差を有する、９％〜９２％の範囲である。カラム５における標準偏差および平
均コンバージョンを、それぞれの場合について１００のデータポイントの平均を
用いて計算した。
【０２７３】 ５つの独立した研究を繰り返し、基質コンバージョン、バイオマス、供給物濃
度およびリアクター滞留時間の間の再現可能な相関関係を実証した：研究４ｂお
よび３ｄは、０．６２のコンバージョンを有し；（２）研究４ｆおよび４ｃは、
０．５０のコンバージョンを有し；（３）研究３ｅおよび４ｄは、０．４１およ
び０．３９のそれぞれのコンバージョンを有し；（４）研究ｌａおよびｌｃは、
０．６４および０．７３のそれぞれのコンバージョンを有し；そして（５）研究
３ｃおよび３ｆは、０．７７および０．７０のそれぞれのコンバージョンを有し
た。
【０２７４】 単一の調節可能パラメーターとして分解速度定数を用いた、式（２７）は、実
験データの良好な描写を提供した。図２３および図２４に描写したように、反応
速度は基質濃度の低下を伴って減少した。実験セット１ａ−ｃ、３ａ−ｆ、およ
び４ａ−ｆに由来する退行した分解速度定数は、緊密に集合した。完全なデータ
セットおよびサブセットを用いて得られた速度定数は、以下である：（１）完全
なセットに適合した２．２３×１０-2ｄｍ3ｇ-1分-1；（２）サブセット１ａ− ｃに適合した１．８８×１０-2；（３）サブセット２ａ−ｃに適合した２．８５
×１０-2；（４）サブセット３ａ−ｆに適合した２．０６×１０-2；（５）サブ
セット４ａ−ｆに適合した２．２８×１０-2。図２３および図２４は、完全なデ
ータセットと２．２３×１０-2を用いた式（２７）との間の良好な一致を実証し
た。研究２ａ−ｃは、１８の研究全てについての総残差にほとんど寄与する。Ｄ
ｉＧｒａｚｉａ（１９９１）は、ＨＫ４４によるナフタレン分解がナフタレンに
おいての一次およびバイオマスにおいての一次である速度項により記載され得る
ことを見出した。
【０２７５】 式（２８）は、式（２７１）よりもＨＫ４４の反応速度論を描写するために適
切さがより劣る。残差は一般に、式（２７）を用いるよりも大きいオーダーであ
った。また、式（２８２）により示唆される基礎的な関係は、データからは生じ
なかった。式（２８）を用いて得られた速度定数は、ほぼ半分のオーダー、４．
３３×１０-5〜１．３５×１０-4分-1に渡っていた。
【０２７６】
【表８】 モデル予想およびデータの両方は、サリチル酸コンバージョンが質量移動の効
果ではなく反応速度により制限されることを実証する。流速、有効性因子、シー
ル係数、レイノルド数、およびビオ数を表９に列挙した。ビオ数を１００次にし
た。最適一次反応速度定数を用いる有効性因子の計算は、ビーズが内部の質量移
動抵抗性によってではなく、反応速度により制限されたことを示す。解析解を用
いて得られた良好な適合はまた（ここで外部のおよび内部の質量移動を無視し得
ると仮定した）、質量移動効果が最小限であるという結論を支持する。このモデ
ルは、サリチル酸の分布が約７分でアルギン酸ビーズ（最終の９９％）内で定常
状態に達することを予想する。拡散係数がアルギン酸マトリックスにおけるオー
ダーで大きく低下したと仮定しても、定常状態は１５分内に達した。Ｏｙａｓｓ
ら（１９９５）は、アルギン酸カルシウムにおける拡散係数が、９つの溶質（単
糖類および二糖類ならびに有機酸）についての水におけるそのおよそ８５％であ
ったことを見出した。おそらく１％より少ないと推定された細胞容積は、分散に
ほとんど効果を有さなかった（ＷｅｓｔｅｒｉｎおよびＡｘｅｌｓｓｏｎ、１９
９１）。このモデルはまた、液体質量移動抵抗性が定常状態到達にほとんど効果
を有さないことを予想した。ナフタレンのような吸着基質の場合、このモデルは
、吸着を考慮すべきであることを実証した。測定した吸着係数における正の５０
％誤差は、定常状態に達するのに必要とされる時間を倍化するであろう。このモ
デルは、ナフタレンについての定常状態がクリーンなアルギン酸ベッドから開始
しておよそ１時間で到達されることを予想した。モデルパラメーターは、測定さ
れ（液体質量移動係数、ペレット空隙容積、および吸着係数）、報告され（液体
拡散係数）（Ｄｕｎｂａｒ、１９９２）、推定されている（固体分散係数）（Ｔ
ｒｅｙｂａｌ、１９８０）。ナフタレンについてのそれぞれの係数は、液体拡散
、固体拡散、およびラングミュア平衡定数について９．０×１０-6ｃｍ2ｓ-1、 ９．０×１０-8ｃｍ2ｓ-1、および８．４ｃｍ2ｓ-1ｍｏｌ-1であった。対となる
無細胞研究がフリーの反応速度論および固定された反応速度論ならびに反応の評
価をさらに助けるために必要とされる。
【０２７７】
【表９】 （５．３．５ 生物発光） コントロール研究を行い、ＨＫ４４の光放出に対する、グルコースおよびミネ
ラル塩培地（炭素を含まない）の効果を決定した。測定された流出酸素レベルは
、常に大過剰であった（＞１０ｐｐｍ）。リン酸がそのリアクターに供給されな
かったので、ＨＫ４４の有意な増殖は生じる可能性はなかった。グルコースは、
ｌｕｘ経路のための誘導因子ではない。生物発光活性は、ミネラル塩培地のみを
使用して、一定であり、そして最小であった。さらなる研究において、ミネラル
塩培地中のグルコースを、１．０ｍＬ／分の流速で５ｍｇ/ＬでＨＫ４４に供給 した。グルコースに曝露された場合、光放出は、サリチル酸応答より少ないオー
ダーであったが、ベースラインのノイズを越えて２６時間で緩慢に上昇した。次
いで、放出は、グルコースが栄養分（ｆｅｅｄ）から除去されるまでの１２時間
、一定であった。グルコースは、優れた炭素およびエネルギー源であり、そして
１つ以上の光物質のプールを増加させ得る可能性があり得た。Ｓｃｈｅｌｌ（１
９９０）は、低レベルのｎａｈ ｍＲＮＡが、誘導されていない細胞中に存在す
ることを見出した。添加されたミネラル塩中のｔｒｉｚｍａTM基礎緩衝液は、長
い滞留時間での研究の間でさえ、ｐＨを７．２に維持した。従って、ｐＨは、光
応答における因子ではないようである。これらのデータは、光放出におけるわず
かな増加が、反応物質のプールの増加、および低くかつ構成的なレベルのｌｕｘ
酵素の存在から生じたことを示唆する。
【０２７８】 分解研究の間に、グルコース溶液を、研究を通して一定の濃度でリアクターに
添加した。その研究の開始の１５時間後に、誘導因子を添加した。ほとんどすべ
ての場合において、光強度は、サリチル酸濃度における変化を模倣した。誘導因
子が増加した場合、光強度が増加した。逆に、誘導因子濃度が減少した場合、光
強度が減少した。この振る舞いについての１つの例外が、ＨＫ４４の新鮮なベッ
ドが誘導因子濃度における段階的な変化によって最初に衝撃を受けた場合に、研
究の開始時にのみ観察された。この衝撃条件下で、光生成は最初にオーダーで増
加し、そして最大で約１のより遅い持続時間に達した（図２５）。４〜６持続時
間内で、光強度は一定の状態に接近した。対照的に、流出濃度は、２の持続時間
内に一定になった。従って、一定状態ではない光放出は、サリチル酸バルク相濃
度における迅速な変化、および細胞膜を通しての輸送と分解との間の不均衡に起
因して、細胞内のサリチル酸の最初の増強から生じ得た。また、誘導因子の添加
前の１５時間のグルコースの添加は、光物質プールを増加させてい得、ｌｕｘ補
因子の過剰供給を生じた。従って、さらなる研究は、この一過性現象を調べるた
めに適切である。例えば、補因子濃度は、供給された物質の関数として直接的に
測定され得た。
【０２７９】 図２６は、光プローブでの推定されるサリチル酸濃度の関数としての、平均の
特異的光応答（単位バイオマスあたりの光）を示す。分解研究の間に得られた図
２６におけるデータは、平均および標準偏差として示される。すべての研究の間
に、酸素を、化学量論の要求を越えるレベルで維持した。酸素流出濃度は、常に
、１リットルあたり数ミリグラムよりも多かった。図２６中に示される光強度を
、流出濃度ではなく、光プローブでの局所的な誘導因子濃度の関数として報告す
る。局所的なサリチル酸濃度を、以前に議論されたモデルおよび変数を使用して
計算した。図２６の目的は、放出と誘導因子濃度との間の関係を定性的に比較す
ることである。光放出と誘導因子濃度との間に正の関係が存在した。最も良好に
適合した線は、研究２ａ〜ｃ、３ｃ〜ｅ、および４ｃ〜ｆについて、それぞれ１
．４、２．３、および１．５の傾きを有した。本分析は、定性的に処理されなく
てはならない。なぜなら、光値は、研究間の較正のための参照光源が存在しない
場合（例えば、可変のアルギン酸不透明度）、研究内で相対的であったからであ
る。従って、曲線についての真の妨害は未知であるが；傾きは類似し、そして光
放出は誘導因子の濃度の正の関数であったことを示す。
【０２８０】 ナフタレン（サリチル酸の親化合物）に対する応答を調べるための研究を行っ
た。サリチル酸を、１６時目に、コントロールとしてのＰＢＲに添加した（研究
５ａ）。サリチル酸に対する応答は、以前の研究において同じであった。ナフタ
レン添加の前に、光放出を一定にさせた。
【０２８１】 アルギニン酸固定化ＨＫ４４の光応答は、４５時目でのナフタレンの添加の際
に強力であった。ナフタレンに対するＨＫ４４の一定状態の応答は、同一の条件
下でのサリチル酸に対する応答よりもおよそ２オーダー大きかった。研究を繰り
返した場合、これらの結果を確認した。
【０２８２】 分解研究と独立した第２のセットの研究において、光強度を、誘導因子の濃度
の関数として測定した。分解研究は、光応答を測定するために十分には適切でな
かった。これらの研究において、ＨＫ４４を、フォトダイオードに添加されたア
ルギン酸の薄層中に固定した。非常に短い滞留時間（３分）を、流動細胞内に維
持した。さらに、これらの研究は、細胞が、誘導因子濃度における段階変化によ
って衝撃を受けなかった分解研究の結果とは異なった。むしろ、サリチル酸濃度
は、次第に増加した。図２７および２８は、光応答および誘導因子濃度を示す。
光強度は、遅れはあるが誘導因子濃度を模倣した。ナフタレン研究において、サ
リチル酸研究においてよりも非常に長い遅れが観察された。遅れは、恐らく、少
なくとも一部には、バルク溶液から固定された細胞への質量輸送によって、そし
てナフタレンの場合においてはアルギニン酸上への吸着によって引き起こされた
。遅延時間における差異はまた、ナフタレンおよびサリチル酸が、細胞内に輸送
され、そして消費される異なる方法の結果であり得る。このセットの研究と同様
に以前の研究（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９４）において、一定状態ではない振る
舞いが、誘導因子濃度を模倣した。
【０２８３】 ＨＫ４４は、ナフタレンおよびサリチル酸の両方についての１００万分の１の
濃度での強い応答を実証した。土壌中のＰＡＨ濃度は、代表的には、１０００分
の１で観察される。ＨＫ４４の至適な使用は、プリュムフロント（ｐｌｕｍｅ
ｆｒｏｎｔ）の検出であり、ここでＰＡＨおよび分解産物濃度は、かなり低減さ
れる。ＨＫ４４は、サリチル酸に対してよりも、ナフタレンに対して、かなりよ
り感受性であった。取り込み機構、誘導因子のエネルギーレベル、および細胞膜
流動性に対する誘導因子の効果は、これらの化合物に対するＨＫ４４の応答にお
ける差異に寄与する。ナフタレンは、液体に優先的に吸着し、これは、潜在的に
膜流動性に影響を及ぼし、そして液体合成からの増加したアルデヒド物質を生じ
得る。さらに、ナフタレン取り込みは、おそらく受動的である（Ｂａｔｅｍａｎ
ら、１９８６）。サリチル酸は荷電イオンであるので、取り込みは、能動輸送に
よって生じ得る。ナフタレンは、サリチル酸より多い炭素およびエネルギー源で
あり、ナフタレンは、ｌｕｘ物質を増加し、光強度を上昇し得た。
【０２８４】 （５．３．６ 命名法）
【０２８５】
【化１】 （５．４ 実施例４−栄養枯渇化環境におけるカプセル化された生物発光細
菌の展開） Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４を、ナフタレンまたはサリチル酸に曝
露した場合、青緑色の光を生じる。生物発光についての遺伝子は、ナフタレン分
解経路のサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子ｎａｈＧのプロモーターと、Ｖｉｂ
ｒｉｏ ｆｉｓｈｅｒｉのプロモーターを有さないｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子カセ
ットとの間の転写融合を有するプラスミド中に配置される（Ｋｉｎｇら、１９９
０）。プロモーターを有さないｌｕｘオペロンおよび活性は、他に記載される（
Ｓｈａｗら、１９８８）。
【０２８６】 より早い研究において、ＨＫ４４細胞によって生成される誘導された光の量は
、曝露したナフタレンまたはサリチル酸の量に比例することが示されている（Ｈ
ｅｉｔｚｅｒら、１９９２、１９９４）。液体アッセイにおいて、細胞は、０．
７２μｇ／ｌ〜３．２５ｍｇ／ｌのナフタレンおよび０．４ｍｇ／ｌ〜２０ｍｇ
／ｌのサリチル酸での線形発光応答を示すことが示されている（Ｈｅｉｔｚｅｒ
ら、１９９２）。細胞はまた、環境の夾雑物中のナフタレンの検出のためのバイ
オアッセイにおいて有用であることが示されている（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９
４）。ＨＫ４４での至適なオンラインバイオセンサーの実証において、固定され
た細胞はまた、土壌スラリー、ＪＰ−４ジェット燃料、および製造されたガスプ
ラント土壌の浸出液中のナフタレンに曝露した場合、特定の蛍光応答を放出した
ので、適用可能であることが証明された（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２、１９９
４）。これらの研究からの情報は、生物発光技術が、終点および調節標準が決定
される場合に有意である環境汚染物質のバイオアベイラビリティーおよび生物分
解の評価において使用され得る（ＧｉｂｓｏｎおよびＳａｙｌｅｒ １９９２；
ＨｅｉｔｚｅｒおよびＳａｙｌｅｒ、１９９３）。
【０２８７】 生物発光は、それが分子のＯ2を消費するので高価な（ｅｘｐｅｎｓｉｖｅ） 代謝機能であり、そして低減されたフラビンモノヌクレオチド、およびアルデヒ
ド物質の合成を必要とする（Ｈａｓｔｉｎｇｓら、１９８５）。アルデヒドは、
拡大された光放出の間に、ＡＴＰ媒介環状反応およびＮＡＤＰＨ媒介環状反応を
介して再生されなくてはならない（Ｕｌｉｔｚｕｒら、１９８１）。生理学的荷
重は、ＨＫ４４および類似の遺伝的に操作された株（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｂ２（Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、１９９３））の、栄養の
チャレンジされた環境における誘導の際に安定かつ特異的な生物発光を生じると
いう固有の能力に関する基本的な疑問を生じる。
【０２８８】 （５．４．１ 材料および方法） （５．４．１．１ 細菌株） 生物発光バイオレポーターＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ
ＨＫ４４（微生物のドイツコレクション）を、本研究において使用した（Ｋｉ
ｎｇら、１９９０）。ＨＫ４４は、異化プラスミドｐＵＴＫ２１（ｎａｈ+、ｓ ａｌ-、ｔｅｔ+）を有し、これは、ナフタレンおよびサリチル酸の利用可能性お
よび分解のモニタリングを可能にするｎａｈ−ｌｕｘ転写融合を含む。ｌｕｘ遺
伝子カセットｌｕｘＣＤＡＢＥは、ｓａｌオペロンのｎａｈＧ遺伝子に注入され
、そしてプラスミドコード経路を介してサリチル酸の異化を阻害する。しかし、
サリチル酸は、染色体遺伝子によってコードされる酵素によって分解される。
【０２８９】 （５．４．１．２ 培養条件） ＨＫ４４株を、１４ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含む、１００ｍｌの酵母抽
出物／ペプトン／グルコース（ＹＥＰＧ）増殖培地を含む、５００ｍｌのコニカ
ルフラスコ中で増殖させた。ＹＥＰＧの組成は、他に記載される（Ｈｅｉｔｚｅ
ｒら、１９９２）。培養物を、攪拌器で２７℃にて増殖させた。
【０２９０】 生物をＹＥＰＧ培地中で対数相（Ａ546０．８）まで増殖させ、アルギン酸／ ＳｒＣｌ2中で固定し、そして地下水中でインキュベートさせた。擬似の地下水 を、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏａｋ
Ｒｉｄｇｅ，ＴＮでのインサイチュ地下水チームによって提供される調製法から
、実験室中で調製した。この調製法は、地下水夾雑物を研究する場合、このチー
ムによって分析された種々の地下水サンプルの組成に基づいた。擬似の地下水は
、以下の成分を含んだ（ｍｇ／リットル 蒸留水）：ＣａＣｌ2 １６６、Ｍｇ Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏ ８５、ＢａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １．８、ＳｒＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０
．６、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５、およびＫＮＯ3 １７。二倍の強度の地下水 を調製し、それぞれの緩衝液で希釈してｐＨレベル３、４、５、６、および７を
有する一倍強度の地下水を得た。緩衝液の以下のストックを、地下水を所望のｐ
Ｈに調整する際に使用した。０．２Ｍフタル酸水素カリウム／０．２Ｍ ＨＣｌ
の溶液を使用して、地下水をｐＨレベル３および４に、０．２Ｍフタル酸水素カ
リウム／０．２Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ７に調整した。地下水を十分に混合し、
Ｗｈａｔｍａｎ濾紙を通し、そしてオートクレーブによって滅菌した。
【０２９１】 （５．４．１．３ インキュベーションおよび誘導） カプセル化したＨＫ４４を、地下水中、および０．１×ＹＥＰＧ培地中でイン
キュベートした。カプセル化を、他に記載されるように行った（Ｈｅｉｔｚｅｒ
ら、１９９４）。ＨＫ４４をカプセル化する、アルギン酸ビーズの５００ｍｇサ
ンプルを、３ｍｌのインキュベーション培地（すなわち、地下水（栄養欠損）お
よび０．１×ＹＥＰＧ（栄養過剰））を含む滅菌した２５ｍｌのバイアル（Ｐｉ
ｅｒｃｅ、Ｉｌｌ）中に分散させた。各型のインキュベーション培地について、
三連のバイアルのセットが誘導および分析について使用（ｓａｃｒｉｆｉｃｅ）
され得るように、十分なバイアルを調製した。以下の６つの誘導日数が存在した
：１、７、１４、２１、２８、および３５。すべてのバイアルを、２７℃にてイ
ンキュベートした。
【０２９２】 細胞の誘導を、バイアルに１ｍｌの誘導溶液を添加することによって開始した
。光出力を、０時点から５時間目まで、３０分毎に測定した。誘導されていない
光応答を示すコントロールについて、１ｍｌの蒸留水およびＹＥＰ溶液を、各型
のインキュベーション培地からの三連のバイアルに添加した。存在する場合、そ
れぞれの処理から得られた光由来のバックグラウンド光として、光値を調整した
。
【０２９３】 （５．４．１．４ 誘導因子溶液） サンプル（ＳＳ）および複合体（ＣＳ）誘導因子溶液を、本実験において使用
した。前者は、蒸留水中に溶解されたサリチル酸ナトリウムからなり、後者はＹ
ＥＰ溶液中のサリチル酸ナトリウムからなった。両方の溶液は、最終濃度が約１
００ｍｇ／ｌのサリチル酸ナトリウムを提供した。ＣＳ中のＹＥＰは、０．２ｇ
／ｌおよび２ｇ／ｌの蒸留水での、それぞれ酵母抽出物およびポリペプトンを示
す。
【０２９４】 （５．４．１．５ 光測定） 生物発光を、以前に記載されるように（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２）、光電
子増倍管を使用して検出し、そしてアンペアで測定した。光出力を、ｎＡ／ｃｆ
ｕとして示す。
【０２９５】 （５．４．１．６ 集団カウント） ＨＫ４４の生存細胞コロニー形成単位（ｃｆｕ）の数を、カプセル化ビーズに
ついて決定した。カプセル化ＨＫ４４を、０．５Ｍ ヘキサメタホスフェートナ
トリウムでアルギニン酸マトリクスを溶解させることによって遊離させ、リン酸
緩衝化生理食塩水中に滅菌希釈し、そして１４ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを含
むＹＥＰＧ／寒天プレートに展開した。このプレートを、２７℃にて３６〜６０
時間インキュベートし、そして細菌コロニーをカウントした。
【０２９６】 （５．４．１．７ ＨＰＬＣ分析） サリチル酸の濃度を、誘導応答の前後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）によって決定した。上清の２ｍｌサンプルを、各処理型についての１セッ
トの各バイアルから取り出し、そしてＨＰＬＣ分析の前に、０．２μｍ孔サイズ
のＴｅｆｌｏｎ膜フィルターを通して濾過し、細胞およびアルギニン酸ビーズの
砕片を除去した。ＨＰＬＣユニットは、ＬＣ ２５０バイナリーポンプ（Ｐｅｒ
ｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ，Ｇｒｏｔｏｎ，ＣＴ）、およびＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ Ｌ Ｃ−１８カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）、およびＬＳ
−２３５フォトダイオードアレイ検出器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）からなっ
た。クロマトグラフィーの条件は、０．５分〜８分の間の、０から６０％までの
アセトニトリル水溶液の連続的勾配、および９分〜１４分の間の６０％から１０
０％までのアセトニトリルの第２の連続的勾配であった。プログラムは、１００
％水での２．０分間のカラム平衡化で終了した。ＨＰＬＣ等級のアセトニトリル
および水を、この分析において使用した。サリチル酸についてのＵＶ吸光度を、
２０μｌ容量のサンプルを流すこと、および２５５ｎｍの波長でのピークを検出
することによって決定した。濃度を、高質水中に溶解された、公知の量のサリチ
ル酸ナトリウムを用いて作成した標準曲線から計算した。
【０２９７】 （５．４．２ 結果） データは、本実施例の３つの別々の繰り返しのうちの１つの結果を示す。カプ
セル化されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４は、地下水および０．１×
ＹＥＰＧ中でのインキュベーション後に、ＳＳおよびＣＳの両方での誘導に応答
した。応答時間、生物発光の大きさ、および生存可能性は、誘導因子溶液のｐＨ
および組成に依存して変化した。６の異なる日数間の誘導の５時間について、観
察を行った。この実験を通して、インキュベーション培地のｐＨは、±０．２５
単位内で変動した。
【０２９８】 （５．４．２．１ ＳＳおよびＣＳでの誘導） 誘導因子溶液中のサリチル酸ナトリウムは、ｌｕｘ遺伝子を誘導し、そして経
時的に光放出を増加させた（図２９Ａおよび図２９Ｂ）。６未満のｐＨを有する
地下水中の細胞からは、誘導因子のいずれについても生物発光は観察されなかっ
た。図２９Ａおよび図２９Ｂにおいて示される他のインキュベーション条件下で
、対数光レベルは、インキュベーション期間の５時間後以内に、特定かつ最大の
応答を示す。光レベルは、アルギニン酸／ＳｒＣｌ2ビーズ中の生存細胞（ｃｆ ｕ）の数に基づいて規格化された。光レベルは、ＳＳでよりもＣＳで１オーダー
より大きいレベルであった。
【０２９９】 ＳＳによる誘導について図２９Ａに示されるように、ｌｏｇ蛍光は、１日を除
いてすべての日で、ｐＨ６の地下水中で一定のままであり、光の大きさは、２ｅ -6 〜９ｅ-6のｎＡｃｆｕ-1の範囲に及んだ。ｐＨ７の地下水および０．１×ＹＥ
ＰＧにおいて、最大光の大きさにおける周期的パターンを観察した。例えば、応
答は、実験の最初の半分の間に次第に減衰し、そしてその後の誘導の際（２８日
目および３５日目）に進行的に増加した。
【０３００】 ＣＳで誘導された場合、地下水中と、０．１×ＹＥＰＧ中とで、異なる応答が
観察された。図２９Ｂにおいて示されるように、ｐＨ６およびｐＨ７での地下水
中の細胞からの光レベルは、すべての誘導の日数にほぼ安定であった。ｐＨ６お
よび７での地下水中で観察された応答は、数日にわたって減衰する０．１×ＹＥ
ＰＧ中での応答と比較した場合、パターンがほぼ類似していた。にもかかわらず
、ＳＳまたはＣＳを用いた場合、カプセル化ＨＫ４４は、少なくとも３５日間の
周期的誘導間の能力を示した。
【０３０１】 応答についての対数時間は、カプセル化細胞の生理学的状態の活性な誘導因子
であると考えられ得る。これは、時間間隔として測定され、ここで光レベルは０
時点のレベルを越えて増加した。ｐＨ６および７での地下水において、対数時間
は、最初の３の誘導日数間で同じままであり、次いでＳＳを用いて約１時間ごと
にｐＨ７で伸長された。しかし、０．１×ＹＥＰＧにおいて、対数時間は、すべ
ての誘導日数で同じままであった。興味深いことに、対数時間は、ＣＳでのイン
キュベーション培地にもかかわらず、すべての日数で同じであった。
【０３０２】 （５．４．２．２ 固定されたＨＫ４４によるサリチル酸取り込み） 誘導前後のサリチル酸の濃度を使用して、サリチル酸取り込みの割合を計算し
た。％特異的取り込みを、生存細胞（ｃｆｕ）の数から決定した。データは、開
始濃度のわずか５０％〜６０％が利用されたので、５時間の間に十分過剰であっ
たことを示す（図３０Ａおよび図３０Ｂ）。ＳＳの存在下で、ｐＨ７の地下水で
の％取り込みは、ｐＨ６の地下水および０．１×ＹＥＰＧ中と比較して高度に一
定であり、このことは、カプセル化細胞に対するｐＨおよび飢餓の組み合わせ効
果を示す。一方で、ＣＳに関して、取り込みは、１日目および３５日目を除くす
べての誘導間に、ｐＨ６にてほぼ一定（約２０％）のままであり、このことは、
カプセル化細胞による安定な応答を示す。ｐＨ７の地下水および０．１×ＹＥＰ
Ｇ中で、２１目までに次第に減衰し、ならびに２８日目および３５日目での一定
の増加を有する周期的パターンが観察された。
【０３０３】 （５．４．２．３ 固定されたＨＫ４４の生存可能性） 細胞の生存可能性を、溶解されたビーズ懸濁液のアリコートをＹＥＰＧ／寒天
培地を含むテトラサイクリン（１４ｍｇ／ｌ）上にプレートすることによって決
定した。コロニー形成単位の数を図３１に示す。これらの値は、３５日間の間、
ｐＨ６およびｐＨ７の０．１×ＹＥＰＧおよび地下水中で安定であった。これら
は、６未満のｐＨを有する地下水中で高度に影響を及ぼされ、そして２１日目に
検出レベル未満に減衰した。これらは、未知の理由で、２８日および３５日目に
検出可能になった。
【０３０４】 （５．４．４ 生物発光反応速度） 光生成を、３０分ごとにモニタリングし、そしてこの反応速度を、誘導期間後
５時間以内の全てのアッセイ時間についてｎＡ 分-1ｃｆｕ-1として計算した。
正規化した光レベルのセットを、図３２Ａおよび図３２ＢにおいてｐＨ６、ｐＨ
７の地下水および０．１×ＹＥＰＧについてプロットする。この光レベルは、飽
和濃度のサリチレートの存在下における発光の経時的線形増加を示す。しかし、
速度増加のトレンドおよび大きさは、インキュベーション日数および溶液に依存
して異なる。２つのインデューサー溶液に関して、全ての誘導日数に対する、ｐ
Ｈ６の地下水における速度増加は、ＳＳについてがＣＳについてよりも少なかっ
た。１日目に、遅延した応答は、細胞が馴化していないことに起因し得る。ｐＨ
７の地下水および０．１×ＹＥＰＧの場合、応答のトレンドおよび大きさは、同
等に類似していた。
【０３０５】 光応答に関する回帰フィットからの傾きを、誘導事象の各々について表１０に
示す。ＳＳに関しては、１日目を除いて、ｐＨ６の地下水における傾きは、同じ
桁の大きさの中で安定であった。しかし、ＣＳに関しては、傾きの絶対値は、イ
ンキュベーションの日数の増加に従って増加した。ＳＳに関しては、ｐＨ７の地
下水および０．１×ＹＥＰＧにおける傾きの値は、大きさが変動した。インデュ
ーサーにかかわらず、増加した傾きの値が、ｐＨ６および７の地下水において実
験のより後の段階の間に観察された。
【０３０６】
【表１０】 （５．４．３ 考察） 本実施例において行った観察は、誘導の際の頻繁な応答、測定可能な発光およ
びカプセル化されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４の栄養制限条件下で
の生存に関する証拠を支持した。さらに、カプセル化プロセスは、単独で、長期
生物学的活性に関して持続可能であることを証明した。これらの特徴は、Ｐ．ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４を用いるフィールドバイオセンサーの設計およ
び適用に重要である。
【０３０７】 本研究において試験したシミュレーション化環境条件の中でも、細胞は、効率
的な誘導および生存率に関してｐＨ６および７の地下水を明らかに好んでいた。
これは、ＨＫ４４の直接適用における潜在的な制限を反映した。なぜなら、これ
らは、６未満のｐＨの地下水において応答できなかったからである。これは、生
物発光反応の阻害または細胞生存の阻害のいずれかまたは両方による。興味深い
ことに、多くの天然の生物発光細菌では、ルシフェラーゼ活性に関する至適ｐＨ
は、伝えるところによれば、わずかに酸性である（ＤａｎｉｌｏｖおよびＩｓｍ
ａｉｌｏｖ，１９８９）。
【０３０８】 長期のバイオセンサー適用における細菌の連続有効度に関する関心は、本研究
において慎重に取り扱った。観察されたように、生物発光反応速度は、３５日間
の期間にわたってｐＨ６とｐＨ７とで地下水における大きさおよびトレンドが異
なった。「カットオフ」性能期間が地下水サンプルの各々について導かれ得る場
合、細菌の性能効率は、最終的な時間枠について設定され得、時間枠の終わりで
の古いカプセル化された細胞の新たな細胞での置換を可能にし、そしてバイオセ
ンサーの連続操作を可能にする。例えば、本研究では、２８日間および１４日間
の保存的カットオフ期間を、それぞれ、ｐＨ６および７のＧＷに関して応答に基
づいて設定し得る（表１０、図２９Ａおよび図２９Ｂ）。
【０３０９】 カプセル化は、土壌への細菌の制御導入について他者が調査することによって
観察されたように、この型の長期適用を支持することを証明した（Ｔｒｅｖｏｒ
ｓら，１９９３）。しかし、遊離細胞を用いて行われた研究に基づいて、これが
、基質取込みおよび生物発光反応に影響を与えることを示すものはなかった。Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．における他の類似の比較はまた、固定化が、生理
学的活性に対して一般化された効果を有さないことを示した（Ｓｈｒｅｖｅおよ
びＶｏｇｅｌ，１９９３）。
【０３１０】 （５．５ 実施例５−−ＩＣ上での微生物細胞の固定化およびカプセル化） ＩＣ上での微生物生物の沈着を、下記の種々のプロトコルにより達成し得る。
これらのカプセル化方法の最終的な目的は、細胞に、外の環境のストレスが制限
された安定な微小環境を提供することである。カプセル化した細胞を、選択した
方法に依存してほぼ任意の所望の厚さまたは直径のシート状にまたはビーズ状に
形成し得る。ＩＣ上の細胞沈着に利用可能な小さい面積は、薄いシート（０．１
〜２ｍｍ）または小さな直径のビーズ（＜５０μｍ）が製造されることを必要と
する。しかし、ＩＣの高い感度は、より少ない細胞質量が使用されることを可能
にする。下記の手順に関しては、約１×１０6〜約１×１０8ｃｆｕ／ｍｌを含有
する細胞培養物が、代表的に増殖し、そして約１〜約５ｇの湿重量のこれらの細
胞をカプセル化プロトコルにおいて利用し得る。
【０３１１】 （５．５．１ 寒天／アガロース） 細胞を、（約１％〜約５％の）溶融寒天またはアガロースに添加し得る。ゲル
化は、寒天またはアガロースが室温まで冷却されるにつれて生じる（Ｋａｎａｓ
ａｗｕｄら，１９８９）。
【０３１２】 （５．５．２ カラゲナン） カラゲナンの２％溶液を、約７０℃〜約８０％まで温めて溶解を開始し得、次
いで約２５℃〜約５０℃の温度で保持し得る。細胞培養物をまた、温めてカラゲ
ナン溶液に添加する。ゲル形成は、冷０．１Ｍ塩化カリウムの添加により生じる
（Ｃａｓｓｉｄｙら，１９９６）。
【０３１３】 （５．５．３ ポリアクリルアミド） 細胞を、アクリルアミド（３５ｇ）およびＢＩＳ（２．４ｇ）の溶液中で混合
する。次いで、過硫酸アンモニウム（０．４０ｇ／ｍｌ溶液を４０μｌ）および
ＴＥＭＥＤ（１００μｌ）を添加して重合を開始する。２０分以内に、任意の所
望の厚さのカプセル化細胞のシートをスライスし得る。細胞小滴はまた、シリン
ジによりアクリルアミド溶液に添加されて、（直径約１ｍｍ〜約３ｍｍの）カプ
セル化細胞のビーズを生成し得る。（約２μｍ〜約５０μｍの）直径の小さなマ
イクロビーズを、ネブライザーまたは蒸発器によって細胞混合物を噴霧すること
により生成し得る（Ｋａｎａｓａｗｕｄら，１９８９；ＳｔｏｒｍｏおよびＣｒ
ａｗｆｏｒｄ，１９９２）。
【０３１４】 （５．５．４． アルギネート） 細胞を、約１％〜約８％のアルギネート溶液に添加する。０．５Ｍ塩化カルシ
ウムまたは０．１Ｍ塩化ストロンチウムの添加は、重合を開始する。シート、ビ
ーズ、またはマイクロビーズを生成し得る（Ｃａｓｓｉｄｙら，１９９６）。
【０３１５】 （５．５．５ ポリウレタン／ポリカルボミルスルホネート（ＰＣＳ）） ３０〜５０％のポリマー含量のポリウレタンまたはＰＣＳを、１％塩化カルシ
ウム溶液と混合する。ｐＨを約６．５に調整し、そして細胞塊を添加する。この
混合物を０．７５％アルギン酸カルシウムに噴霧してビーズを形成する。１時間
後、ビーズを取り出し、洗浄し、そして２％トリポリリン酸ナトリウム緩衝液中
に導入する。この緩衝液は、アルギネート層を溶解して、細胞の周囲のポリウレ
タン／ＰＣＳの層のみを残す（Ｖｏｒｌｏｐら，１９９２）。
【０３１６】 （５．５．６ ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）） 細胞懸濁物を、１３％ ＰＶＡ、０．０２％アルギン酸ナトリウム混合物と混
合する。飽和ホウ酸および２％塩化カルシウムの溶液との接触により、ゲル化が
生じる（ＷｕおよびＷｉｓｅｃａｒｖｅｒ，１９９１）。
【０３１７】 （５．５．７ ゾル−ゲル） ゾル−ゲルプロセスは、室温条件下でのケイ素ガラスの形成を可能にする。細
胞を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌおよびテトラメチルオルトシリケート（ＴＭＯ
Ｓ）、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン
（ＭＴＭＳ）、エチルトリメトキシシラン（ＥＴＭＳ）、プロピルトリメトキシ
シラン（ＰＴＭＳ）、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）と合わせる。
凝固時間は、（約０．０２％〜約０．５％の）使用する濃度に依存して変化する
。シート、ビーズ、またはマイクロビーズを生成し得る（Ａｒｍｏｎら，１９９
６）。
【０３１８】 （５．５．８ 手順の組合せ） 上記の方法の多くを組合せ得る。例えば、細胞を最初にアルギネート、カラゲ
ナン、寒天、またはアガロース中にカプセル化し、次いでＰＣＳ、ＰＶＡ、また
はゾル−ゲルのより強い層中に再度カプセル化し得る。カプセル化の層もまた、
生成し得る；アルギネートマイクロビーズを、ゾル−ゲルの層の間に「サンドイ
ッチ」し得る。このことは、細胞に、単一の層単独よりも大きな程度の保護を提
供し、そして外層がＩＣとより適合性であるが内層は細胞とより適合性であるこ
とを維持することを可能にする。
【０３１９】 （５．５．９ 改変） 種々の改変を、細胞生存を補助するためにカプセル化プロセスの間に加え得る
。これらは、酸素キャリア（例えば、ポリジメチルシロキサン（Ｌｅｏｎｈａｒ
ｄｔら，１９８５））；栄養源（例えば、粉末脱脂乳（Ｃａｓｓｉｄｙら，１９
９６））；水分貯蔵物（例えば、クレー粒子（Ｃａｓｓｉｄｙら，１９９６））
；および強度および可撓性を改善する化合物（例えば、豆ゴム（Ｃａｓｓｉｄｙ
ら，１９９６））を含む。
【０３２０】 （５．６ 実施例６−−生物発光の毒性適用） 生物発光細菌に対する化合物の効果に基づく、所定の化合物の毒性の測定を可
能にする多数のアッセイが、開発されている。基本的には、毒性は、試験細菌の
生物発光シグナルの減少により示される。市販のアッセイは、Ｍｉｃｒｏｔｏｘ
システムおよびＬｕｍｉｔｏｘシステムを含む。これらのアッセイシステムは、
天然で生物発光性である細菌を利用する。生物発光細菌を用いる毒性アッセイの
適用の例を、市販の場合は使用される生物の型およびアッセイの名称を含めて、
表１１に示す。
【０３２１】 （５．７ 実施例７−−生物発光遺伝子毒性アッセイ） 近年、生物発光細菌を利用する多数のアッセイが開発されて、化合物が突然変
異原であるか、または変異原性化合物が細菌と接触したかが決定されている。こ
れらのアッセイは、疑わしい突然変異原が細菌のＤＮＡにおいて明確な変化を生
じて、生物発光またはこの突然変異原により生じる損傷ＤＮＡに対する細胞の応
答を可能にする能力に基づく。生物発光遺伝子毒性アッセイの適用の例を、使用
される生物の型および生物発光遺伝子を含めて、表１２に示す。
【０３２２】 （５．８ 実施例８−−抗微生物剤のスクリーニング方法） 天然で生物発光性であるかまたは生物発光性であるように操作された生物を用
いて、生物の生存度に影響を与える能力について化合物をスクリーニングし得る
。基本的には、これらのアッセイでは、生物発光は、生物致死活性と逆に比例す
る。生物発光抗微生物スクリーニングアッセイの提供例を、使用される生物の型
および生物発光遺伝子（利用可能な場合）を含めて、表１３に示す。
【０３２３】
【表１１】
【０３２４】
【表１２】
【０３２５】
【表１３】 （５．９． 実施例９−−生物発光アッセイを用いた汚染の検出） 微生物の代謝の一般的な特徴は、環境における化合物を認識し代謝産物を利用
するために必要な遺伝子の発現を起こし、そしてその後、その代謝産物がもはや
存在しなくなったら、これらの遺伝子を停止させる能力を含む。その古典的な例
は、ｌａｃオペロンである。このｌａｃオペロンプロモーターは、単糖の存在ま
たはラクトースの欠如により抑制される。しかし、単糖が、利用可能ではなく、
そしてラクトースが存在する場合、ｌａｃオペロンは、高発現する。単糖のレベ
ルが、充分である場合、またはラクトースが枯渇している場合は、ｌａｃオペロ
ンは、再び抑制される。
【０３２６】 微生物は、広範な種々の化合物を代謝する能力を有している。いくつかの細菌
は、人に対して毒性があり、そして汚染物質であると考えられる化合物を代謝し
得る。汚染物質の代謝を可能にする遺伝子の発現は、ｌａｃオペロンの発現と類
似している。特定の細菌が、環境における汚染物質の存在を認識し得、汚染物質
の代謝に必要な遺伝子を発現させ得、そして汚染物質がもはや存在しない場合は
、その遺伝子を抑制し得る。生物発光を与える遺伝子を汚染物質代謝遺伝子また
はオペロンのプロモーターに作動可能に連結することにより、汚染物質の存在に
対する微生物の応答を検出し得る。そのような利用についてのいくつかの例を、
生物体、ｌｕｘ遺伝子、およびｌｕｘ遺伝子が作動可能に連結されたプロモータ
ーを含めて、表１４に示す。
【０３２７】 （５．１０ 実施例１０−−生物発光酸素センサー） 分子酸素に応答して光を放射するＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの能力を、低
い溶解酸素濃度をモニターするために用いた（Ｌｌｏｙｄら、１９８１）。他の
例を、表１５に示す。
【０３２８】
【表１４】 （５．１１ 実施例１１−−真核生物レポーターにおける生物発光） ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質は、真核生物系におけるレポーター
遺伝子として広範に用いられている。哺乳動物細胞株におけるルシフェラーゼ遺
伝子の使用例を、使用した細胞株の名前、使用したプロモーターおよび生物発光
遺伝子、ならびに適用の簡単な説明を含めて、表１６に示した。
【０３２９】 （５．１２ 実施例１２−−ＯＡＳＩＣによる生物発光シグナルの測定） Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４は、ナフタレン
またはサリチレートに曝露した場合、青緑色の光を産生する。生物発光のための
遺伝子は、ナフタレン分解経路のサリチル酸ヒドロキシラーゼ遺伝子であるｎａ
ｈＧのプロモーターとＶｉｂｒｉｏ ｆｉｓｈｅｒｉのプロモーターを持たない
ｌｕｘＣＤＡＢＥ遺伝子カセットとの間の転写融合物を有するプラスミド中に位
置する（Ｋｉｎｇら、１９９０）。プロモーターを持たないｌｕｘオペロンおよ
び活性は、他にも記載される（Ｓｈａｗら、１９８８）。
【０３３０】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４の培養物を有す
る顕微鏡スライドを、ＯＡＳＩＣ上に置いた。得られたデバイスをナフタレンに
曝露し、そして出力電圧を、継時的に測定した（図２）。
【０３３１】
【表１５】
【０３３２】
【表１６】 （５．１３ 実施例１３−−ＢＢＩＣ形態の新しい全細胞バイオセンサー） ＢＢＩＣは、ＩＣとインターフェースで連結した遺伝子操作したバイオレポー
ター生物からなる、全細胞バイオセンサーの開発に新しい進歩を示す。バイオレ
ポーターは、標的物質に遭遇した場合、発光するように操作され、回路は、この
発光を検出し、シグナルを加工し、そしてその結果を伝達するように設計される
。従って、このバイオレポーターは、生存物であるにもかかわらず、トランジス
タまたはレジスタ同様に、回路設計者にとって別の構成要素として利用可能であ
る。
【０３３３】 バイオセンサーは、生物学的検知構成要素と分析測定エレメントとを組み合わ
せた、ハイブリッドデバイスである。代表的には、生物学的構成要素は、目的の
分析物と反応および／または相互作用して電気的、光学的または機械的トランス
デューサにより定量化され得る反応を生じる。最も一般的な構成は、酵素または
抗体のような固定化した高分子を生物学的構成要素として用いる；別の、より一
般的でないアプローチは、生きた微生物または器官もしくは組織の切片を生物学
的エレメントとして用いる。本来、しばしば全細胞バイオセンサーといわれる（
Ｂｏｕｓｓｅ、１９９６）これらのバイオセンサーは、増殖中の細胞の活性を検
出するために電気化学的トランスデューサを用いた（Ｂｕｅｒｋ、１９９３）。
全細胞バイオセンサーは、制御された環境において機能したが、大部分は、標的
分析物以外の栄養分上での増殖により引き起こされる妨害のために、広範には、
適用可能でない。
【０３３４】 あるいは、分子生物学的技術を用いて、より大きな選択性を有する細胞または
バイオレポーター株を生成した。代表的には、特定のプロモーター配列をコード
するＤＮＡ配列を、レポーター酵素をコードする遺伝子と融合し、そして宿主細
胞に導入する。この分析物が存在する場合、このレポーター遺伝子は発現して、
測定したシグナルの産生を担う酵素を生産する。従って、微生物増殖の結果とい
うより、遺伝子調節が、選択性を提供する。
【０３３５】 一般的に使用されるレポーター酵素は、以下を含む：ｌａｃＺ遺伝子にコード
されたβ−ガラクトシダーゼ、およびｘｙｌＥ遺伝子にコードされたカテコール
−２，３−ジオキシゲナーゼ。これらの系のどちらにおいても、シグナルを生産
するために細胞破壊を必要とする熱量測定の検出方法を用いる。過去１０年間で
、生物発光バイオレポーターが、一般的なものとなった。というのも、生物発光
応答は、容易に検出され、そしてこのアッセイは、細胞に対して破壊的である必
要がないためである。従って、このバイオレポーターは、リアルタイムで連続的
にモニターされ得る。真核生物および原核生物の生物発光酵素を用いる遺伝子操
作された生物発光バイオレポーターは、両方において、水および土壌中の毒素お
よび汚染物質を検出するために、そして汚染物質の生物分解の生物学的利用能お
よび機能的プロセスを評価するために開発された。
【０３３６】 バイオレポーター生物発光は、以下を含む多くの異なる型の光学的トランスデ
ューサにより検出された：光電子増倍管、フォトダイオード、マイクロチャネル
プレート、写真フィルム、および電荷結合素子。これらの適用の多くにおいて、
光を集め、そしてレンズ、光ファイバーケーブル、または液体光ガイドを用いて
、光をトランスデューサへ移動させる。しかし、小さな容積、遠隔性検出、また
は多重並行検知を必要とする適用において、小さくそして携帯だが高感度を維持
する、新しい型の計器が必要である。
【０３３７】 本発明に記載される生物発光−バイオレポーターＩＣ（ＢＢＩＣ）バイオセン
サーは、生物発光バイオレポーターを低レベルの生物発光の検出、加工、および
報告の作業のために特別に設計されたＩＣに直接連結しているので、転送デバイ
スおよび広規模検出装置の必要性を排除した新しいアプローチを示す。バイオセ
ンサーは安価に操作されて、環境的、医学的、薬学的、および産業的サンプルに
ついての情報を提供し得る。
【０３３８】 （５．１３．１ ＢＢＩＣ） 特定の物質の存在下、生物発光するように操作した全細胞のバイオレポーター
は、光を検出し、このシグナルを処理し、そして次に結果を報告するように設計
したＩＣの上に置かれる。この局面において、バイオレポーターを、ＩＣ設計者
が入手可能な（トランジスタ、抵抗器、コンデンサーに類似した）別の構成部品
として考え得る。このアプローチの主な利点は、全てのシグナル処理および情報
伝達機能を含む完全なセンサーを、単チップ、低電力、頑丈で、安価なデバイス
として作製し得ることである。他の変換器は、光のみを検出し、そして他の構成
部品を、完全なシステムを作るために要求する、しかしこのＩＣは、完全な独立
型のセンサーを作るために要求される、アナログ、デジタル、および無線周波数
（ＲＦ）回路の性能を提供する。さらに、安価なので、ＩＣ製造は設備と、ＢＢ
ＩＣを、特定の適用に合うように別個に巧妙に作り得る。従って、衛星航法シス
テム（ＧＰＳ）のような特徴を、分散した検知の処理のために設計されたＢＢＩ
Ｃに含み得る。
【０３３９】 ＢＢＩＣの成功した開発は、標的物質に敏感であるように操作したバイオレポ
ーター、バイオレポーターをＩＣに付着するための固定化および／またはカプセ
ル化手順、生体抵抗性ＩＣコーティングおよび生体適合性ＩＣコーティング、お
よび所望の機能を実行するように設計されたＩＣを必要とする。
【０３４０】 （５．１３．２ 生物発光バイオレポーター） 微生物は、深海の熱水噴出口、氷点下の北極の海水、ハイパーサリン溶液、有
機溶媒で飽和した水、汚染した土壌、および工業廃液のような多種の環境に存在
する。このような厳しい環境において生存する生物体の能力は、それらの環境条
件の変化を検出する能力および適応する能力に関係している。従って、バイオレ
ポーター株の成功した開発のために、研究下の環境において容易に存続し得る生
物体を、まず初めに選択しなければならない。２番目に、生物体は、適切な遺伝
子調節系を有さなければならないか、あるいは遺伝子工学の技術を介してこのよ
うな系を受け入れることが可能でなければならない。３番目に、生物発光遺伝子
を、必須の細胞機能に悪影響することなく生物体の遺伝子系に組み込まなければ
ならない。微生物は、優れた候補である。なぜならば、それらはほとんど全ての
型の種類の環境に存在し、かなり遺伝的に操作し易く、そして遺伝子調節系の多
種のセットを有する。
【０３４１】 昆虫、魚、イカ、ゼラチン質の海洋動物、真菌類、渦鞭毛藻類、原虫、および
細菌の多くの種は、光を発生する能力を有する。生物発光の分子生物学は、多数
の異なる経路に沿って進化しているが、もっとも一般的な生物発光系は、ルシフ
ェリンと呼ばれる基質を酸化するルシフェラーゼ酵素を利用する。その反応は、
通常、酸素分子を必要とする。
【０３４２】 原核生物において、（ｌｕｘと命名した）遺伝子系は、遺伝子ｌｕｘＡおよび
ｌｕｘＢがコードする二つの異なるサブユニットから構成されるルシフェラーゼ
からなり、脂肪酸に相当する長鎖脂肪アルデヒドを酸化し、４９０ｎｍ付近で青
緑色の光の放射を生じる（ＴｕおよびＭａｇｅｒ，１９９５；Ｍｅｉｇｈｅｎ，
１９９１；Ｏ’ＫａｎａおよびＰｒａｓｈｅｒ，１９９２）。その系はまた、脂
肪酸をアルデヒド基質へ初めに変換し、そして次に再生する、３つのタンパク質
から成る多酵素脂肪酸レダクターゼ（レダクターゼはｌｕｘＣがコードし、トラ
ンスフェラーゼはｌｕｘＤがコードし、そしてシンセターゼはｌｕｘＥがコード
する）を含む。この遺伝子は、ｌｕｘＣＤＡＢＥで示される、単一のオペロンを
含む。この遺伝子配置は、異なるプロモーターの下流のレポーター遺伝子として
挿入される完全なｌｕｘ遺伝子カセットを可能にし、遺伝子発現をモニターする
生物発光の利用を可能にする。ｌｕｘＡＢ遺伝子を単独で含むバイオレポーター
もまた、遺伝子発現をモニターするのに用いられている（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ
およびＭｅｉｇｈｅｎ，１９９５；ＨｉｌｌおよびＳｔｅｗａｒｔ，１９９４）
。しかし、多酵素脂肪酸レダクターゼが存在しないので、アルデヒド基質（代表
的にはｎ−デカナール）を、生物発光（例えば、酵素活性）を測定するために外
因的に添加しなければならない。
【０３４３】 真核生物ルシフェラーゼ遺伝子もまたクローン化され、そしてレポーター遺伝
子として細菌中で用いられる（主に、５６０ｎｍ付近で光を発生するホタルルシ
フェラーゼ（ｌｕｃ）、および５９５ｎｍ付近で光を発生するコメツキムシルシ
フェラーゼ（ｌｕｃＯＲ））（Ｃｅｂｏｌｌａら、１９９５；Ｈａｓｔｉｎｇｓ
，１９９６）。単一細胞内の、コメツキムシ系およびホタル系の両方を使用する
多重化系が、提唱されている（ＷｏｏｄおよびＧｒｕｂｅｒ，１９９６）：理論
的には、もう一方を、調節しないか、または構成性にスイッチを入れて、そして
非特異的な生理的変化、生物発光細胞の濃度における変動、および環境パラメー
ターのにおける変化を補正するコントロールシグナルとして用いながら、一色の
光を発生する一つの酵素をプロモーターの制御下に置く。
【０３４４】 ＢＢＩＣに関するバイオレポーター株の使用にいて内在するのは、もっとも望
ましくは選択的様式および定量的様式において、発生した生物発光シグナルが、
標的物質の濃度に直接的に関係するという前提である。一般的には、ｌｕｘレポ
ーター遺伝子は、天然のプラスミド中、広域宿主範囲（ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−
ｒａｎｇｅ）プラスミド中、または宿主株中の染色体に組み込まれて維持され、
誘導オペロンの調節制御下に置かれる。これらの遺伝子系において、標的分析物
またはその分解産物は、生物発光遺伝子の誘導物質として作用し、そして選択性
および結果として生じる応答の原因となる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４は、ナフタレンの存在下、光を発生するバイ
オレポーターである。この株は、ＮａｈＲ、ＬｙｓＲ型タンパク質がポジティブ
に調節する２つの遺伝子オペロンを有する。オペロンの１つは、ｌｕｘ生物発光
遺伝子を含み、そしてもう一方は、ナフタレンのサリチル酸（ナフタレン分解の
代謝中間体）への分解を担う。サリチル酸が、調節タンパク質ＮａｈＲと相互作
用する場合、両オペロンを誘導する。従って、ナフタレンまたはサリチル酸のい
ずれかへのＨＫ４４の曝露は、遺伝子発現の増大および生物発光の増強を生じる
。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４の連続培養物の研究は、生物発光応答
の規模が、パルス摂動条件下、ナフタレンの水相濃度と相関することを示してい
る（Ｋｉｎｇら、１９９０）。生物発光アッセイは、ナフタレン（または、存在
する場合、サリチル酸）のバイオアベイラビリティーの評価のために開発されて
いる（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９２）。増殖細胞培養物を用いて、生物発光に対
する直線的関係が、２桁の濃度範囲にわたり、ナフタレンおよびサリチル酸両方
について見出された[ナフタレンに関して０．９９０の相関係数（ｒ2）、および
サリチル酸に関して０．９９１の相関係数（ｒ2）]。再現可能な生物発光を、水
溶性のナフタレンサンプル中のみならず、ナフタレンを加えた土壌スラリーサン
プル、複合土壌（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｏｉｌ）浸出液、およびジェット燃料の水
溶性成分からも観察した（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９４）。Ｐ．ｆｕｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ ＨＫ４４とは、汚染物の存在の定量分析、またはバイオアベイラビ
リティー測定のいずれかの環境的使用に適用し得る。しかし、このような適用に
ついて、環境の化学的複雑性および生物体の生理学的条件の両方を、生物発光応
答の解釈において考慮しなければならない。多くの型の生物発光（ｌｕｘ）転写
遺伝子融合物を、トルエン（Ａｐｐｌｅｇａｔｅら、１９９７）およびイソプロ
ピルベンゼン（ＳｅｌｉｆｏｎｏｖａおよびＥａｔｏｎ、１９９６）を含む他の
汚染物質の、存在、バイオアベイラビリティー、および生物分解性を検出する、
光放射バイオレポーター細菌株を開発するために使用されている。類似の遺伝的
アプローチもまた、重金属の解毒系および耐性系（水銀を含む（Ｓｅｌｉｆｏｎ
ｏｖａら、１９９３））の誘導性、および熱ショック応答（Ｖａｎ Ｄｙｋら、
１９９４）、および酸化的ストレスについて報告されている。さらに、遺伝的に
操作したグラム陽性バイオレポーターは、抗菌薬剤の効力（減少した光が、より
大きな効力に等しい）の試験に用いられている（ＡｎｄｒｅｗおよびＲｏｂｅｒ
ｔｓ、１９９３；Ｃｏｏｋｓｅｙら、１９９３）。真核生物バイオレポーターも
また、有毒な化合物（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９５；ＧｕｐｔａおよびＧｏｌ
ｄｗａｓｓｅｒ，１９９６）、酸素（Ｆｉｌａｔｏｖら、１９９６）、紫外線光
（ＢｉｂｅｒｇｅｒおよびＡｎｇｅｒｅｒ，１９９６）、ならびにエストロゲン
および抗エストロゲン化合物（Ｐｏｎｓら、１９９０）の検出のため生成されて
いる。生物発光測定を含む環境適用は、総説されている（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇお
よびＰｏｚｉｏｍｅｋ，１９９５）。
【０３４５】 （５．１３．３ バイオレポーター捕捉） 種々の方法が、ＩＣの光検出部分でまたは光検出部分近傍で、細菌細胞の捕捉
に関して存在する。例えば、細胞を、多孔性メンブランの後ろに簡単に捕捉し得
るか、または天然のまたは合成の高分子にカプセル化し得る（Ｃａｓｓｉｄｙら
、１９９６）。高分子マトリックスは、細胞活性および増殖に必要とされる栄養
素および補因子を含む水和した環境を提供し得る。さらにカプセル化した細胞は
、それらの環境中の毒性物質から保護され、そして増加したプラスミドの安定性
を維持する（Ｃａｓｓｉｄｙら、１９９６）。細胞は、ＩＣ上で利用可能な小さ
な表面領域に適合可能となるために、薄層フィルムまたは小径ビーズ中にカプセ
ル化され得る。薄層フィルムを、液体高分子中に細胞を混合し、次に薄層中のＩ
Ｃ上にマイクロピペットで加え、そして重合化させるすることにより形成され得
る；細胞のより大きなブロックもまた、作製され得、そこから実質的に任意に所
望された厚さのフィルムを薄く切り、そしてＩＣに付着し得る。マイクロビーズ
を、液体ポリマー細胞混合物を噴霧器を通して重合化剤にスプレーすることによ
り作製する。以下のカプセル化手順は、ＩＣ用途の有用性を示す。 ・ アガー／アガロース：細胞を、溶解したアガーまたはアガロース（１〜５％
）に添加し得る。ゲル化は、アガーまたはアガロースを室温まで冷却したときに
生じる（Ｋａｎａｓａｗｕｄら、１９８９）。 ・ カラゲナン：カラゲナンの２％溶液を、７０〜８０℃まで温め溶解を開始し
、そして次に３５〜５０℃に維持する。細胞培養物もまた、温め、そしてカラゲ
ナン溶液に添加する。ゲルの形成は、冷０．１Ｍ塩化カリウムの添加を通して生
じる（Ｃａｓｓｉｄｙら、１９９６）。 ・ アルギナート：細胞を、アルギナートの１〜８％溶液に添加する；０．５Ｍ
塩化カルシウム、または０．１Ｍ塩化ストロンチウムの添加は、重合化を生じる
（Ｃａｓｓｉｄｙら、１９９６）。生物発光バイオレセプターＰ．ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｓ ＨＫ４４は、本方法で用いる液体光導波路の末端に固定化されてい
る（Ｈｅｉｔｚｅｒら、１９９４）。 ・ ポリウレタン−ポリカルボミルスルホン酸（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ−ｐ
ｏｌｙｃａｒｂｏｍｙｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＰＣＳ）：ポリウレタンまた
はＰＣＳを、３０〜５０％のポリマー含有量で、１％塩化カルシウム溶液と混合
し、ｐＨを約６．５に調整し、そして細胞塊を加える。この混合物を、０．７５
％カルシウムアルギナート中へスプレーし、ビーズ形成を生じる。一時間後、こ
のビーズを取り除き、洗浄し、そしてアルギナート層を溶解し、細胞を包囲する
ポリウレタン−ＰＣＳの層だけを残す、２％トリポリリン酸ナトリウム緩衝液中
へ導入する（Ｋａｎａｓａｗｕｄら、１９８９）。 ・ ポリアクリルアミド：細胞を、アクリルアミドおよびビスアクリルアミドの
溶液中に混合する。次に、過硫酸アンモニウムおよびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、重合化の開始のために添加する（
Ｖｏｒｌｏｐら、１９９２）。 ・ ポリビニルアルコール：細胞懸濁液を、１３％ポリビニルアルコール、０．
０２％アルギナートナトリウム混合物と混合する。ゲル化は、飽和ホウ酸および
２％塩化カルシウムの溶液との接触で生じる（ＷｕおよびＷｉｓｅｃａｒｖｅｒ
、１９９１）。 ・ ゾル−ゲル：細胞を、０．１Ｍトリス−Ｃｌおよびテトラメチルオルトケイ
酸、テトラエトキシシラン、メチルトリメトキシシラン、エチルトリメトキシシ
ラン、プロピルトリメトキシシラン、またはポリジメチルシロキサンと組み合わ
せる。凝固時間は、使用した濃度に応じて異なる（Ｒｉｅｔｔｉ−Ｓｈａｔｉら
、１９９６）。
【０３４６】 （５．１３．４ 集積回路） ＩＣは、以下のことを行う装置および回路を含む：（１）光信号（ｏｐｔｉｃ
ａｌ ｓｉｇｎａｌ）を検出する；（２）この信号（シグナル）をノイズから弁
別する；（３）アナログまたはデジタル信号処理を行う（例えば、アラーム閾値
と比較する）；（４）結果を通信する；および（５）補助機能（例えば、位置感
知、温度測定）を行う。さいわい、これらの機能はすべて、相補型金属酸化膜半
導体（ＣＭＯＳ）ＩＣプロセスにおいて行われ得る。半導体産業の主力として、
ＣＭＯＳは、ＢＢＩＣに対して大きな柔軟性および有用性をもたらしている。Ｃ
ＭＯＳは当初デジタル電子機器に対して使用されたが、現在ではＣＭＯＳプロセ
スを使用して高品質アナログ回路が一般に製造される。加えて、最近では、ＣＭ
ＯＳが電子光学の検出について大きな可能性を有することが実証されてきた（Ｓ
ｉｍｐｓｏｎら、１９９７年）。最後に、小型形状および絶縁体上シリコンのＣ
ＭＯＳプロセスによって、ＲＦ通信回路および位置感知回路をアナログ回路、デ
ジタル回路、および電子光学の検出回路のように同じＩＣに集積することが可能
になる。ＢＢＩＣと組み合わせれば、この機能性は、まさに「研究機器が１つの
チップに載った」デバイスの開発において大きなブレークスルーを意味する。
【０３４７】 ＢＢＩＣは、その最も基本的な形態において、バイオレポーターによって出射
された光の量を測定し、この値をデジタル化し、そしてその結果をデータ受信器
に送信する。その最小検出可能信号は、量子効率（η）、漏れ電流、光検出器の
ノイズ、ならびに信号処理回路のノイズおよびフィルタリング特性の関数である
。光電子倍増管と異なり、シリコン光検出器は、単一光子をカウントし得ない。
しかし、バイオルミネセンスが通常寿命の長い現象であるように、長い積分時間
を使用して低い光レベルを検出し得る。その限界内で、光子で測定される最小検
出可能信号（ＭＤＳ）が以下の式でその限界に接近する：
【０３４８】
【数３０】 ここで、ｑは電荷、ＡPDは光ダイオードの面積、Ｔintは積分時間、および Ｉsは強いプロセス依存性の光飽和電流である。この式が成り立つのは、光ダイ オードの暗電流がゼロ（すなわち、光ダイオードにかかるバイアスがゼロ）かつ
後続信号処理回路のノイズが光ダイオードのノイズに比べて無視し得る場合のみ
である。
【０３４９】 この式が示すように、ＭＤＳは、ηおよびＴintを最大にし、そしてＩsおよび
ＡPDを最小にすることによって最小にされる。しかし、Ｔintは、測定に利用し 得る時間量によって拘束され得、そしてＡPDが小さいと、バイオレポーターがＩ
Ｃの小さい面積に集中されない場合、集光効率がより低くなる。しかし、Ｉsは 表面特性に部分的に依存し、そしてそのためにＩＣ保護コーティングの堆積およ
びアニーリングプロセスを最適化してＩsを最小にし得る。また、薄膜ＩＣ保護 コーティングは、化学的および生物学的に十分に凸凹である場合、光検出器のた
めの反射防止コーティングを形成し得、ηを最大にするのに役立つ。
【０３５０】 ＣＭＯＳの最大有用性が発揮されるのは、光が検出された後である。ＣＭＯＳ
アナログ信号処理回路は、電圧増幅器、トランスインピーダンス増幅器、電荷感
受性増幅器、および電流対周波数変換器を含み、そして信号処理の選択肢は、ア
ナログフィルタリング、デジタルフィルタリング、ニューラルネットワーク処理
、およびアラーム弁別を含む。ＢＢＩＣは、無線ネットワークを介して、中央デ
ータ収集センターに接続され得、または互いにも接続され得る。他の環境感知（
例えば、温度測定）、時間スタンプ、または位置感知を含む多くの補助機能が、
アプリケーションの必要に応じて、ＩＣ上に実装され得る。
【０３５１】 （５．１３．５ 保護コーティング） アモルファス二酸化シリコン（ＳｉＯ2）は、ＩＣのための誘電体として一般 に使用される。残念ながら、ＳｉＯ2は、種々の化学的および生物学的材料によ る作用を受けやすいので、バイオセンサのアプリケーションにおける保護コーテ
ィングとしては不適当である。しかし、アモルファスシリコン窒化物（ＳｉＮ）
膜は一般に不純物拡散に対してより強い耐性を有し、そしてＳｉＮの所定の形態
は化学的および生物学的材料による作用により強い耐性を有する。これらの特徴
により、ＳｉＮは、ＢＢＩＣアプリケーションのための材料として有望である。
ＳｉＮの光学特性はまた、可視領域において動作する光感受性デバイスにとって
魅力的である：堆積条件に依存して、アモルファスＳｉＮの屈折率は、６３３ｎ
ｍにおいて、２．０と３．５の間で変化する、このことは、シリコン光検出器の
ための単一層反射防止コーティングとしてＳｉＮを理想的なものにする。水素化
ＳｉＮ膜をＳｉ光検出器のための反射防止コーティングとして使用することは、
その膜をアニーリングするといくらかの水素を放出するというさらなる利点を有
する。その水素はその後、界面に拡散し、シリコン表面において「ダングリング
ボンド」を結合するので（Ｋｉｓｈｏｒｅら、１９９２年）、青色光に対する光
検出器の応答を向上させる。
【０３５２】 ほとんどのＳｉＮは、膜成長の前にＲＦエネルギー源を使用して１つ以上のソ
ースガスをイオン化するプラズマ強化化学的気相成長法（ＰＥ−ＣＶＤ）を使用
して製造される。この成長技術は、高品質光学膜を得るために比較的低い基板温
度（約３００℃）を必要とするが、膜特性は、ソースガス圧力および成長チェン
バの形状に極めて依存する。ＰＥ−ＣＶＤを使用して堆積されたアモルファスＳ
ｉＮの厚い層（約５００ｎｍ）は、ＩＣ適合性、バイオ耐性、バイオ適合性であ
るコーティングを形成し得ることが最近知られている。ＰＥ−ＣＶＤ成長ＳｉＮ
は多くの好ましい特性を有するが、膜パラメータ（屈折率および膜厚など）にお
ける製造ごとの差違は、たとえ他の膜成長パラメータが名目上同じとしても、一
般的に１０〜２０％である。
【０３５３】 最近、ＳｉＮ膜は、新規の連続ジェット気相成長法（ＪＶＤ）技術を使用して
室温でシリコン上に首尾よく堆積されてきた（Ｗａｎｇら、１９９５年；Ｍａｌ
ｉｋら、１９９６年）。しかし、これは、非常に高いガス負荷を生み出し、ＩＣ
製造ライン上に使用される複雑な真空システムに適合しない。さらに、この技術
を使用して膜厚を制御することは困難である。
【０３５４】 分子ジェットＣＶＤ（ＭＪ−ＣＶＤ）として公知の薄膜成長技術が開発されて
きた（ＲｅｓおよびＬｏｗｎｄｅｓ、１９９２年）。この技術は、ソースガスを
小さなオリフィスに通す工程を含むので、膜成長表面での速度を増加させる。オ
リフィスは、迅速に開閉され得（約２０ｍｓ）、表面および成長環境の残部を非
常に短い期間だけソースガスにさらすことを可能にする。パルス化ジェット技術
は、超音波フリージェット膜成長に固有のすべての利点を有し、そしてガス負荷
を減少させつつ同時に層ごとに薄膜を成長し得る。
【０３５５】 （５．１３．６ 結果） ＢＢＩＣは、ＯＡＳＩＣ上にトルエン感受性バイオレポーターであるＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＴＶＡ８を設置することによって構成した。図
３６Ａ、図３６Ｂ、および図３６Ｃは、例示的なセンサおよびエンクロージャを
示し、そして図３７は、光ダイオードを製造するために通常トランジスタ接合を
形成するダイオードを使用したＯＡＳＩＣの一例を示す。前端信号処理回路は、
周波数が光電流に正比例する出力パルス列を生成した。漏れおよび光電流の合計
に比例するデジタル信号は、特定の時間（積分時間）の間にパルスをカウントす
ることによって生成された。従来の電位計回路と比較して、このＢＢＩＣ前端信
号処理回路は、より低いノイズ（フィードバックパス中にレジスタなし）、過負
荷からの早い回復（高い時定数なし）、およびより大きなダイナミックレンジを
提供した。ＯＡＳＩＣ全体の寸法は、２．２×２．２ｍｍであり、そして標準的
な１．２μｍでｎ−井戸のＣＭＯＳ ＩＣプロセスにおいて製造された。
【０３５６】 セルによってルミネセンスが生成されなかった場合、１分の積分時間を用いて
複数の測定を行った。漏れ電流は、１分あたり約６カウント（ｃｐｍ）の信号を
生成した［０．２２ｃｐｍの標準偏差（σ）を有する］；予想されるように、そ
の標準偏差は、積分時間の平方根とともに減少する。より長い積分時間は、１分
間の測定を合計することによってオフラインで生成した。
【０３５７】 バイオルミネセンスを、ＢＢＩＣセルおよびコントロールサンプル中に、トル
エン気相にさらすことによって誘発させた。コントロールサンプルの測定から、
発明者らは、トルエン濃度が１ｐｐｍ以下でしかないと推定する［１２ｃｐｍの
信号（バックグラウンドより６ｃｐｍ上）が測定された］。以前の測定から、Ｐ
．ｐｕｔｉｄａ ＴＶＡ８は、飽和するまでトルエン濃度に対して線形応答を有
することが公知である。飽和時の濃度は、約１０ｐｐｍのレベルに達する（Ｓｅ
ｌｉｆｏｎｏｖａおよびＥａｔｏｎ、１９９６年）。最小検出可能信号がバック
グラウンドよりも２σ上であると仮定すると、そのときこのＢＢＩＣに対するト
ルエンの最小検出可能濃度（ＭＤＣ）［１０億分率（ｐｐｂ）であらわす］は、
以下の式で与えられる：
【０３５８】
【数３１】 ここでＳsatは１０ｐｐｍ濃度におけるｃｐｍ単位の信号、そしてＴintは分単位
の積分時間。積分時間の関数としてのこのＢＢＩＣに対する最小検出可能トルエ
ン濃度は、図３８において示される。
【０３５９】 （６．０ 参考文献） 以下の参考は、それらが、本明細書に示すそれらの模範的な手順または他の詳
細な補足を提供する範囲を、詳細に参考として援用する。 米国特許第４，２３７，２２４号、１９８０年１２月２日発行。 米国特許第４，３３２，８９８号、１９８２年６月１日発行。 米国特許第４，３４２，８３２号、１９８２年８月３日発行。 米国特許第４，３５６，２７０号、１９８２年１０月２６日発行。 米国特許第４，３６２，８１７号、１９８２年１２月７日発行。 米国特許第４，３７１，６２５号、１９８３年２月１日発行。 米国特許第４，５５４，１０１号、１９８５年１１月１９日発行。 米国特許第４，６８３，１９５号、１９８７年７月２８日発行。 米国特許第４，６８３，２０２号、１９８７年７月２８日発行。 米国特許第４，８００，１５９号、１９８９年１月２４日発行。 米国特許第４，８８３，７５０号、１９８９年１１月２８日発行。 米国特許第４，９６５，１８８号、１９９０年１０月２３日発行。 米国特許第５，１７６，９９５号、１９９３年１月５日発行。 米国特許第５，４４１，８８４号、１９９５年８月１５日発行。 欧州特許出願公開第３２０，３０８号。 欧州特許出願公開第３２９，８２２号。 国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号。 国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号。 国際特許出願公開第ＷＯ ８８／１０３１５号。 国際特許出願公開第ＷＯ ８９／０６７００号。 英国特許出願第２２０２３２８号。
【０３６０】
【表１７】 本明細書に開示され、そして請求の範囲に記載される装置、組成物、および方
法の全ては、本開示を考慮して過度の実験を要せずに、作製および実施され得る
。本発明の装置、組成物、および方法が、好ましい実施態様に関して記載されて
いるが、バリエーションが、本明細書に記載される組成物、方法、およびその方
法の工程または工程の配列に、本発明の概念、精神、範囲を逸脱することなく適
用され得ることが、当業者には明らかである。より詳細には、化学的かつ生理学
的に関連する特定の薬剤が、本明細書に記載される薬剤と置換され得る一方、同
一または類似の結果を達成することが明らかである。当業者に明らかな全てのこ
のような類似の置換基および改変が、添付の請求の範囲によって規定される本発
明の精神、範囲、および概念内にあると推定される。従って、特許化されるよう
に求められる排他的な権利は、添付の請求の範囲に記載されるとおりである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の１つの実施態様の斜視図である。
【図２】 本発明の例示のＢＢＩＣのテストから得られた測定シグナルを示す図である。
【図３Ａ】 標準のＮウェルＣＭＯＳプロセスを用いて作成され得る高品質の光検出器を示
す図である。
【図３Ｂ】 シリコン−オン−絶縁体ＣＯＭＳプロセスで製作された２つの光検出器構造を
示す図である。左は側面ＰＩＮ検出器；右は、接続部がＳｃｈｏｔｔｋｙ接続部
で形成されることを除いて左と同様なデバイスである。
【図４】 単一のＩＣ上の関連シグナル調整およびプロセッシング回路をともなう図１中
の光検出器を示す図である。
【図５】 本発明のシグナルプロセッシング部分の１つの可能な実施態様のブロックダイ
アグラムを示す図である。
【図６】 本発明の１つの実施態様の側面図である。
【図７Ａ】 Ｐ拡散層、Ｎウェル、およびＰ基板からなる簡単なフォトダイオードを示す図
である。
【図７Ｂ】 効率的な光収集のための大面積フォトダイオード、および光電流を相殺する前
方バイアス電流を供給する、フィードバックループ中の小面積ダイオードを用い
る回路を示す図である。
【図７Ｃ】 低周波数（フリッカー）増幅器ノイズ、および増幅器オフセット電圧における
時間または温度依存性変動の影響を最小にするために、相関ダブルサンプリング
（ＣＤＳ）を用いる回路を示す図である。
【図８】 水および栄養分を提供されるバイオレポーターを示す図である。
【図９Ａ】 複数のバイオレポーターを利用する方法を示す概念的ダイアグラムを示す図で
ある。異なるバイオレポーターをＡ、Ｂ、Ｃなどのシンボルによって示す。多く
の目立たないセクションに分けられ、各セクションが異なるバイオレポーターを
備えたバイオフィルムを示す。
【図９Ｂ】 複数のバイオレポーターを利用する方法を示す概念的ダイアグラムを示す図で
ある。異なるバイオレポーターをＡ、Ｂ、Ｃなどのシンボルによって示す。各々
が、異なるバイオレポーターを備える、多くのバイオフィルムを示す。
【図９Ｃ】 複数のバイオレポーターを利用する方法を示す概念的ダイアグラムを示す図で
ある。異なるバイオレポーターをＡ、Ｂ、Ｃなどのシンボルによって示す。単一
のバイオフィルム内に組み合わされた複数のバイオレポーターを示す。
【図９Ｄ】 複数のバイオレポーターを利用する方法を示す概念的ダイアグラムを示す図で
ある。異なるバイオレポーターをＡ、Ｂ、Ｃなどのシンボルによって示す。各層
が異なるバイオレポーターを備える、いくつかの目立たない層を備えたバイオフ
ィルムを示す。
【図１０】 改変ミニＴｎ５およびクローニングベクターｐＬＪＳを生成するための部位特
異的変異誘発で用いられるプライマーの配列を示す図である。アスタリスクは、
プライマーと標的配列との間のミスマッチを示す。＊Ａ＊は、不注意に合成され
た余分のアデニンを示す。
【図１１】 ミニＴｎ５Ｋｍｔｏｄ−ｌｕｘの構築のためのダイアグラムを示す図である。
Ａ／ＸおよびＮｈ／Ｘは、ＡｖｒＩＩ−ＸｂａＩおよびＮｈｅＩ−ＸｂａＩ異種
クローニング部位をそれぞれ示す。略語：Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ、Ｘ、
ＸｂａＩ。
【図１２】 唯一の制限部位をもつｐＬＪＳを示す。略語：Ａ、ＡｖｒＩＩ；Ａｃ、Ａｃｃ
Ｉ；Ａｐ、ＡｐａＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｓ、ＢｓｔＸＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｄ、
ＤｒａＩＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｅａ、ＥａｇＩ；ＥＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｈ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ；Ｈｃ、ＨｉｎｃＩＩ；Ｋ、ＫｐｎＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｎｈ、ＮｈｅＩ
；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｐｅＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｓｃ、ＳａｃＩ；ＳｃＩＩ、
ＳａｃＩＩ、Ｓｍ、ＳｍａＩ；Ｘ、ＸｂａＩ、Ｘｈ、ＸｈｏＩ。
【図１３】 増加する濃度のトルエンに対する曝露２時間後の、ＴＶＡ８の生物発光応答を
示す図である。値は３回の平均値であり、そして細胞密度（ＯＤ546）に対して 補正されている。
【図１４】 トルエン蒸気とともにＭＳＭ上で生育したＴＶＡ８（丸）およびＦ１（三角）
の回分培養の成長曲線を示す図である。値は３回の平均であり、そして誤差棒は
、１標準偏差を示す。
【図１５】 回分条件下トルエン蒸気に関するＴＶＡ８の生物発光および成長を示す図であ
る。白丸、白四角、白三角は、経時的な生物発光の読み取り値の個々の２回の繰
り返しを示す。黒四角は、５４６ｎｍ（ＯＤ546）における３回の平均の光学的 密度を示す。
【図１６】 ｔｏｄ−ｌｕｘレポータープラスミドｐＵＴＫ３０の構築を示す図である。ｐ
ＤＴＧ５１４（Ｍｅｎｎ、１９９１；Ｍｅｎｎら、１９９１）からの２．７５ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＵＣＤ６１５中のプロモーターの
ないｌｕｘ遺伝子カセットの前にクローン化した（Ｒｏｇｏｗｓｋｙら、１９８
７）。略語：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｇｂ、ＢｇｌＩＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、Ｈｉｎ
ｄＩＩ；Ｋ、ＫｐｍＩ；Ｐｓ、ＰｓｔＩ；Ｐｖ、ＰｖｕＩＩ；Ｓｃ、ＳａｃＩ；
Ｓ、ＳａｌＩ；Ｓｍ、ＳｍａＩ；Ｘ、 ＸｂａＩ。
【図１７】 ＴＣＥの同時代謝をモニターするために用いられるオンラインＤＶＲシステム
のダイヤグラムを示す図である。
【図１８】 変化する濃度のトルエン（黒丸）、およびｍｇＬ-1トルエンで表されたＪＰ４
ジェット燃料（黒三角）に対する曝露１．５時間後の増殖細胞アッセイにおける
生物発光応答を示す図である。
【図１９】 回分研究におけるＰ．ｐｕｔｉｄａＢ２の休止細胞による１０ｍｇＬ-1トルエ
ンの複数および単回曝露に対する生物発光応答を示す図である。シンボル：白丸
、複数曝露；白三角、単回曝露。
【図２０】 ２０時間サイクルにおける１０ｍｇＬ-1トルエンの矩形波摂動に応答するＰ．
ｐｕｔｉｄａＢ２による生物発光およびＴＣＥの同時代謝を示す図である。シン
ボル：黒丸、生物発光、黒三角、溶出液中のＴＣＥ、黒四角、溶出液中のトルエ
ン、−−−−供給液中のＴＣＥ、−−−供給液中のトルエン。
【図２１】 リアクターの分解切り取り図である。供給液は、小アルギン酸塩ビーズ中に固
定化された細胞で満たされたリアクター腔に、リアクター本体中にエッチングさ
れたチャンネルにより、および付着の金属フリットにより分配される。環状挿入
物は、０．２μＭ疎水性フィルターを、頂部金属フリットに対して、流れに対す
る有意に均一な抵抗性を提供し、そしてＨＰＬＣ中への自動注入のための清澄溶
出液を提供する効果とともに保持する。フィルターにより引き起こされる流れに
対する抵抗性は、きれいなフィルターについて代表的には５０ｐｓｉｇであった
。
【図２２】 アルギン酸カルシウム上のナフタレンおよびサリチル酸ナトリウムの吸着等温
線を示す図である。ナフタレンは、実験条件において直線的に吸着し、その一方
サリチル酸塩は認知し得る分配をしなかった。
【図２３】 研究１ａ−ｃおよび４ａ−ｆの実際および予想された濃度を示す図である。誤
差棒は、平均値とともに示される。実線は、完全なデータセットに対して最小二
乗反応速度定数を用いるモデル予想を示す。このモデルは、速度定数２．２３×
１０-2ｄｍ3／ｇｍｏｌの、全体としては二次であり、バイオマスにおいては一 次そしてサリチル酸塩中では一次である。記載された経験的データは、表８由来
である。
【図２４】 研究２ａ−ｃおよび３ａ−ｆの実際および予想された濃度を示す図である。誤
差棒をデータ点とともに示す。実線は、完全なデータセットに対して最小二乗反
応速度定数を用いるモデル予想を示す。このモデルは、速度定数２．２３×１０ -2 ｄｍ3／ｇｍｏｌの、全体としては二次であり、バイオマスにおいては一次そ してサリチル酸塩中では一次である。記載された経験的データは、表８由来であ
る。
【図２５】 ＨＫ４４のきれいなベッドが、サリチル酸塩の段階的添加により「ショック」
を受けた場合に観察された異常な一時的応答を示す図である。一次的応答は、イ
ンデューサーの細胞中への急速な移動および初期の分解の遅い速度から生じる初
期の不均衡により生じ得る。この初期の一時的挙動の後、光強度は、インデュー
サーの濃度を模倣した。この一時的挙動は、研究の開始で観察されたのみであっ
た。光強度は、インデューサー濃度における次の変化に追従した。
【図２６】 アルギン酸塩固定化Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４による、光プロー
ブでＰＢＲ内部の推定濃度の関数としての特異的定常状態の発光を示す図である
。標準偏差を平均値とともに示す。直線は、各データセットに対する平均の直線
状応答を示す。
【図２７】 フローセルにおけるサリチル酸塩に対するＨＫ４４の応答を示す。光強度は、
フローセル中のサリチル酸塩濃度の上昇および低下を模倣した。ＨＫ４４はフォ
トダイオード上のアルギン酸塩中に固定化された。
【図２８】 フローセルにおけるナフタレンに対するＨＫ４４の応答を示す。光強度は、フ
ローセル中のナフタレン濃度の上昇および低下を模倣した。ＨＫ４４はフォトダ
イオード上のアルギン酸塩中に固定化された。応答において図２７におけるより
大きな遅延が観察された。遅延時間は、ナフタレンおよびサリチル酸塩が細胞中
に輸送されそして消費される経路の結果である得る。吸着のような物理的プロセ
スもまた、遅延時間に影響を有する。
【図２９Ａ】 誘導の５時間以内の補正された対数光レベルを示す図である。光レベルは、ｎ
Ａ ｃｆｕ-1で表す。単純溶液ＳＳを用いた誘導に起因する応答を示す。ｐＨ３
−５の地下水に対してはデータは示していない。光が発生しなかったからである
。ＹＰＥＧは酵母エキス／ペプトン／グルコース培地を表す。
【図２９Ｂ】 誘導の５時間以内の補正された対数光レベルを示す図である。光レベルは、ｎ
Ａ ｃｆｕ-1で表す。複雑溶液ＣＳを用いた誘導に起因する応答を示す。ｐＨ３
−５の地下水に対してはデータは示していない。光が発生しなかったからである
。ＹＰＥＧは酵母エキス／ペプトン／グルコース培地を表す。
【図３０Ａ】 固定化ＨＫ４４によるサチリル酸塩取り込み％を示す図である。ＳＳを用いた
誘導後の取り込みを示す。
【図３０Ｂ】 固定化ＨＫ４４によるサチリル酸塩取り込み％を示す図である。ＣＳを用いた
誘導後の取り込みを示す。
【図３１】 アルギン酸塩ビーズ中のＨＫ４４の作動を示す図である。コロニー形成単位／
アルギン酸塩ビーズの数の対数が示される。
【図３２Ａ】 ＳＳを用いた生物発光反応の速度を示す。補正された速度は、誘導後５時間の
期間内に収集された光データのセットから計算された。このデータセットは、回
帰共分散の計算に用いた。
【図３２Ｂ】 ＣＳを用いた生物発光反応の速度を示す。補正された速度は、誘導後５時間の
期間内に収集された光データのセットから計算された。このデータセットは、回
帰共分散の計算に用いた。
【図３３】 微小送信機に関するＯａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙの研究の一部として、普通のミツバチ上に取り付けられたＩＣの概略を示
す図である。
【図３４】 分配された神経ネットワークにおいて一緒に連結された複数のＢＢＩＣを示す
図である。
【図３５】 図３４に示された分配された神経ネットワークからの単一のＢＢＩＣを示す図
である。
【図３６Ａ】 例示のＢＢＩＣであって、４０ピンのセラミックチップカンター中に取り付け
られた光学用途特異的集積回路（ＯＡＳＩＣ）および細胞用のエンクロージャー
を示す図である。
【図３６Ｂ】 例示のＢＢＩＣであって、実験のために構成されたような、チップ上に取り付
けられたエンクロージャーを示す図である。
【図３６Ｃ】 例示のＢＢＩＣであって、寒天プラグ上のバイオレポーターをともなうエンク
ロージャーを示す図である。Ｏリングを用いて、セラミックチップキャリアとバ
イオレポーターエンクロージャーとの間に光に密なシールを作成する。
【図３７】 ＢＢＩＣの例示の実施態様で用いられるＯＡＳＩＣを示す図である。このデバ
イスは、２．２×２．２ｍｍの大きさで、そして標準的な相補型金属酸化膜半導
体集積回路プロセスで製作された。
【図３８】 バイオレポーターＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＴＶＡ８を採用す
る例示のＢＢＩＣに対し、積分時間の関数としてのトルエンの最小検出可能濃度
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 ザ・ユニバーシティ・オブ・テネシー・リ サーチ・コーポレイション ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦＴＥ ＮＮＥＳＳＥＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯ ＲＰＯＲＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国 37996−1527テネシー州 ノックスビル、ホワイト・アベニュー 1534番、スウィート403 (72)発明者 シンプソン， マイケル エル． アメリカ合衆国 テネシー 37919， ノ ックスビル， ヌビン リッジ ロード 7745 (72)発明者 セイラー， ギャリー エス． アメリカ合衆国 テネシー 37709， ブ ライン， マッキンニー ロード， ボッ クス 60， ルート ２ (72)発明者 ポウラス， マイケル ジェイ． アメリカ合衆国 テネシー 37922， ノ ックスビル， ムーアゲイト ドライブ 1516 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA04 EA01 EA06 EA18 EA19 FA02 HA01 HA05 JA02 KA02 KA05 LA02 MA01 MA03 NA05 NA14 2G054 AA06 BB03 BB13 CA22 CD01 CE03 EA02 FA07 FA09 FA12 FA16 FA17 FA19 FA21 FA28 FA32 GA03 GB01 JA10 2G057 AA04 AA14 AB01 AC01 BA03 CA01 DA01 DA02 DA04 DB01 DB02 DB03

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 選択された物質の濃度を検出するためのモノリシック生体電
    子工学デバイスであって、該モノリシック生体電子工学デバイスは以下： ａ）基板； ｂ）バイオレポーター； ｃ）光に応答してシグナルを生成するように作用する光トランスデューサーを
    含む、該基板上の集積回路； を含み、該バイオレポーターが選択された物質を代謝または認知して発光し得る
    ことにおいて特徴付けられ、ここで光シグナルが該物質の存在および濃度を示し
    、そして選択的に透過性の容器が該バイオレポーターを保持し得る該基板に固定
    されていることにおいて特徴付けられる、モノリシック生体電子工学デバイス。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のデバイスであって、前記基板と前記容器と
    の間に生体抵抗性材料および生体適合性材料の層をさらに含む、デバイス。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のデバイスであって、前記生体抵抗性／生体
    適合性材料が窒化珪素を含む、デバイス。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のデバイスであって、前記集積回路が相補型
    金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）集積回路である、デバイス。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のデバイスであって、前記光トランスデュー
    サーがフォトダイオードを含む、デバイス。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のデバイスであって、前記集積回路が周波数
    変換器およびデジタルカウンターへの電流をさらに含む、デバイス。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のデバイスであって、前記集積回路がフォト
    ダイオードおよび周波数変換器への電流をさらに含む、デバイス。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載のデバイスであって、前記集積回路が送信機
    をさらに含む、デバイス。
  9. 【請求項９】 請求項８に記載のデバイスであって、前記送信機が無線であ
    る、デバイス。
  10. 【請求項１０】 請求項８に記載のデバイスであって、前記送信機からの送
    信を受信し得る受信機をさらに含む、デバイス。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のデバイスであって、送信がデジタルデ
    ータを含む、デバイス。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載のデバイスであって、前記基板上に液体お
    よび栄養素リザーバならびに微小流体ポンプをさらに含む、デバイス。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載のデバイスであって、前記バイオレポータ
    ーが、遺伝子操作された酵母、細菌、真菌、動物および植物細胞からなる群から
    選択される、デバイス。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載のデバイスであって、前記選択的に透過性
    の容器がポリマーマトリックスを含む、デバイス。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のデバイスであって、前記ポリマーマト
    リックスが、気体または液体が前記バイオレポーターに到達することを可能にし
    得る、デバイス。
  16. 【請求項１６】 請求項１４に記載のデバイスであって、前記ポリマーマト
    リックスが光学的に清澄である、デバイス。
  17. 【請求項１７】 請求項１に記載のデバイスであって、前記集積回路が衛星
    航法システムをさらに含む、デバイス。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載のデバイスであって、前記バイオレポータ
    ーが生物発光マーカーをコードする核酸セグメントを含む、デバイス。
  19. 【請求項１９】 請求項１に記載のデバイスであって、前記バイオレポータ
    ーを維持するように適応された水および栄養素の供給源をさらに含む、デバイス
    。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のデバイスであって、前記バイオレポータ
    ーがｌｕｘ遺伝子をコードする核酸配列を含む、デバイス。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載のデバイスであって、前記バイオレポータ
    ーがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＨＫ４４である、デバ
    イス。
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