KR20010013353A - 고-활성 피타제 입상물 - Google Patents

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KR20010013353A
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바렌세루돌프카롤루스마리아
미스테르스가브리엘마리누스헨리쿠스
안델라카를시도니우스마리아
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윌리암 로엘프 드 보에르
디에스엠 엔.브이
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Abstract

동화성 탄소원과 질소원(예, 글루코스 및 암모늄염)을 함유한 배지에 아스퍼질러스속 또는 트리코더마속의 미생물을 배양하고, 배지를 여과한 다음 생성된 여과액을 한외여과시켜 최소 14,000 FTU/g을 지닌 수성 조성물을 얻는 단계를 수반하는 피타제-함유 수용액의 제조방법에 관해 기술하고 있다. 이 수용액은 동물 사료에 혼입될 수 있는 입상물의 제조에 이용될 수 있다.

Description

고-활성 피타제 입상물{HIGH-ACTIVITY PHYTASE GRANULATE}
동물, 예를 들어 가축의 사료에서 피타제와 같은 다양한 효소의 사용이 좀더 널리 일반화되어있다. 이들 효소는 동물이 사료에서 나온 영양분 또는 미네랄 섭취를 개선시키기 위해 포함되고, 또한 소화율을 높힐 수 있다. 이들은 보통은 산업 효소 생산자에 의해 가동된 대규모 발효조에서 미생물을 배양하여 생성된다. 발효 마지막에 생성된 "브로쓰"는 보통 (용액에서) 원하는 효소로부터 바이오매스(미생물)를 분리하기 위해 일련의 여과 단계를 거친다. 효소액은 액상(종종 각종 안정제의 첨가 후)으로 판매되거나 건조 제형으로 프로세싱된다.
효소액과 건조 제형은 동물 사료 산업에서 공업적 규모로 이용된다. 액상 제형은 펠릿화 공정동안 일어날지도 모르는 효소의 열 불활성을 피하기 위해 펠릿화 이후에 사료에 첨가될 수 있다.
건조 제형은 보통 펠릿화 이전에 사료가 증기 주입(들)을 받는 증기 펠릿화를 수반한다. 차후 펠릿화 단계에서 사료는 매트릭스 또는 다이를 통과하고 생성된 스트립은 다양한 길이의 적당한 펠릿으로 절단된다. 이 공정동안 온도는 60-95℃로 오를 수 있다.
피타제는 피테이트(myo-이노시톨헥사키스 포스페이트)를 myo-이노시톨과 무기 포스페이트로 (최소한 부분)가수분해하는 효소이다. 이들 효소는 밀기울, 식물 종자, 동물 장내에서 발견되고 미생물에 의해 생성될 수 있다. 피타제는 동물 사료에 제공되는데 이는 이들이 피타제를 분해할 수 있어서, 동물에 대한 인과 기타 영양 성분의 활용도를 증가시킬 수 있다. 피타제도 칼슘의 소화율을 증가시킬 수 있다.
인은 유기체의 생장에 필수 요소이다. 가축의 경우, 단위 동물에서 우수한 성장을 위해 사료에 종종 무기 인이 보충된다. 그러나 혹위에 존재하는 미생물이 피타제를 이노시톨과 무기 포스페이트로의 전환을 촉진하는 효소를 생성하기 때문에 반추동물의 사료에는 이것이 종종 불필요하다. 피테이트의 분해가 종종 바람직한데 이는 피트산이 칼슘, 아연, 마그네슘 및 아연과 같은 유용한 미네랄을 킬레이팅할 때 항-영양적일 수 있고, 또한 동물에 대한 생물효용을 감소시키는 단백질과 역으로 반응할 수 있기 때문이다. 피타제의 첨가도 첨가될 필요가 있는 무기 공급물의 양을 감소킬 수 있고, 거름에서 인이 적게 배출되어 환경에 보다 유리할 수 있다.
각종 피타제 효소를 위한 유전자가 클로닝 및 발현되어왔다. EP-A-0,420,358(Gist-Brocades)는 미생물 피타제의 발현에 관해 기술하고 있다.
이후 출원 EP-A-0,684,313(Hoffmann-La Roche)에는 피타제 활성을 지닌 각종 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 DNA 서열을 기술하고 있다.
EP-A-0,758,018(Gist-Brocades)은 효소, 특히 동물 사료로 유용하고, 피타제로 불리는 효소의 안정성을 개선시키는 방법에 관해 언급하고 있다.
WO-A-94/03612(Alko)는 트리코더마(Trichoderma)에서 효소를 분해하는 피타제의 생성에 관해 기술하고 있지만 WO-A-97/16076(Novo Nordisk)는 각종 소수성 물질을 포함하는 동물 사료의 제조에 이용되는 효소-함유 제조물에 관해 기술하고 있다.
동물 사료는 가축과 기타 동물을 기르는데 드는 비용 중 가장 많은 부분을 차지하는 것중 하나이다. 또한, 피타제와 같은 효소와 같은 첨가제는 동물 사료 비용에 상당부분 추가될 수 있다. 본 발명의 목적은 보다 값싸게 생산되는 피타제 조성물을 제공하는데 있다. 이는 고 활성 또는 상당히 농축된 피타제 조성물을 제조함으로써 달성될 수 있다. 본 출원인이 이들 고 활성 조성물을 제조할 수 있게끔 해주는 다수의 인자가 존재하며, 이들은 후에 논의될 것이다.
출원인이 주목한 고 활성 피타제 조성물의 제조를 가능케하는 추가 이점은 이들 조성물이 특히 동물 사료(펠릿)의 제조에서 펠릿화 공정동안 안정성의 뚜렷한 증가를 보여주고, 기존의 조성물보다 고 피타제 활성을 장기간 보유가능케 해준다는데 있다.
본 발명은 피타제 효소의 제조 및 제형과, 동물 사료에서 사료-효소용 입상물의 제조시 이들의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 측면은
(a) 피타제의 재조합 발현을 허용하는 조건하에, 글루코아밀라제(아스퍼질러스(Aspergillus)의 경우) 또는 셀룰로바이오하이드롤라제(트리코더마의 경우) 프로모터의 통제하에서 이종 피타제 유전자를 지닌 아스퍼질러스속 또는 트리코더마속 미생물을 수성 배지(배지는 미생물을 위한 공급물로서, 동화성 탄소원과 동화성 질소원을 포함함)에서 배양하고;
(b) 미생물을 제거하기 위해 수성 배지를 여과시켜 수성 여과액을 만든 다음;
(c) (b)의 여과액을 한외여과시켜 적어도 14,000 FTU/g의 피타제 농도를 지닌 수용액을 제조하는 단계를 포함하는, 피타제를 포함하는 수용액의 제조방법이 제공된다.
본 공정은 생성된 수성 조성물에서 특히 고농도의 피타제를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이는 좀더 값싼 공정일 뿐만 아니라(효소 활성 단위당), 보다 농도가 큰 피타제-함유 조성물이 보다 적은 농도를 지닌 것보다 좀더 안정한 것으로 밝혀졌음을 의미하는, 고 활성 수준에서, 기타 피타제 조성물의 제조를 가능케한다.
미생물은 바람직하게는 아스퍼질러스 나이저종, 아스퍼질러스 오리제종 또는 트리코더마 리제이종이다. 아스퍼질러스 유기체의 경우, 피타제 유전자는 적당하게는 글루코아밀라제(또는 아밀로글루코시다제, AG) 프로모터의 통제하에 있다. 트리코더마 유기체의 경우는, 셀로바이오하이드롤라제 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다.
동화성 탄소원은 글루코스 및/또는 말토덱스트린을 포함할 수 있고/있거나, 동화성 질소원은 암모늄 이온을 포함할 수 있다. 글루코스와 암모늄 이온은 수성 배지에서 단지 동화성 탄소 또는 질소원일 수 있다. 즉, 복합 탄소 또는 질소원은 사용되지 않는 것으로 간주된다. 암모늄 이온은 암모니아 또는 암모늄염 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 암모늄염은 암모늄 나이트레이트, 암모늄 설페이트 및 암모늄 포스페이트를 포함한다.
바람직하게는 탄소 및/또는 질소원은 발효 공정동안 배양 배지에 공급된다. 원료원의 공급 속도는 실질적으로는 미생물이 소비하는 속도와 동일할 수 있다. 따라서 탄소 및/또는 질소원은 연소 또는 계속적인 방법으로 제공될 수 있다. 탄소 및 질소원은 개별적으로, 또는 동시에 제공될 수 있다.
생성된 수용액은 최소 16,000, 가능하게는 18,000 이상 FTU/g의 피타제 농도를 가질 수 있다.
이러한 조건하에 이들 특정 유기체를 사용함으로써 여과액은 상대적으로 농축될 것이다. 이는 한외여과를 가능케한다. 몇몇 기존 방법에서는, 생성된 여과액이 한외여과를 위한(필터 방해물) 상당수의 파편과 기타 물질을 함유한다. 그러나, 본 발명의 공정에서, 여과액은 추가 프로세싱없이, 한외여과될 정도로 비교적 "맑고", 한외여과에 의해 특히 고 농도의 수성 조성물이 얻어질 수 있다.
기존의 방법은 여과액 또는 수성 조성물이 결정화 및/또는 색 제거 단계, 예를 들면 목탄 여과될 가능성에 관해 논의되었다. 그러나, 이들 첨가 단계 모두(피타제의 제조가에 포함됨) 본 발명에서 실시될 수 있다.
바람직하게는 미생물은 글루코아밀라제 유전자를 가지지 않거나, 적어도 이를 발현시키지 않는다. 이는 미생물이 피타제의 생성에 좀더 많은 에너지를 할애할 수 있음을 의미한다.
미생물은 피타제 유전자의 복수개 사본을 소유할 수 있다. 이는 좀더 많은 피타제 유전자가 발현될 수 있기 때문에 피타제의 생성 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
수성 조성물은 실질적으로는 taka-아밀라제가 없을 수 있다.
본 발명의 공정에서 (실질적으로)모든 탄소 및/또는 질소원은 (b)의 여과단계 이전에 미생물에 의해 소비되는 것이 바람직하다. 이는 탄소 및/또는 질소원의 마지막 공급이 일어난 후 몇시간 동안 계속 발효시켜 달성될 수 있다. 다르게는, 모든 탄소 및/또는 질소원이 첨가되는 단계 이상으로 계속 발효시킬 수 있다. 이의 이점은 분명히 수성 조성물에 탄소 및/또는 질소원(예, 글루코스 및/또는 암모늄 이온)이 (실질적으로)존재하지 않을 수 있다는 점이다. 또한, 이는 부산물을 보다 적게 함유할 수 있는 보다 맑은 수용액을 제조할 수 있다. 부산물의 수를 줄임으로써 수용액을 사용할 수 있거나, 원하는 고 피타제 활성을 얻을 수 있는데 필요한 프로세싱 단계의 수를 줄일 수 있다.
가장 바람직한 유기체는 아스퍼질러스 나이저이다. 피타제가 글루코아밀라제 시그널 서열로 미생물에서 발현되는 것도 바람직하다.
생성된 피타제-함유 수용액은 각종 목적에 사용될 수 있지만, 동물 사료에서 이의 적용이 좀더 구체적으로 고려되고 있다. 본 발명의 제 2 측면은 제 1 측면의 공정에 의해 제조가능한 것과같이, 최소 14,000 FTU/g 농도의 피타제를 포함하는 수용액에 관한 것이다.
명세서에서 "피타제"는 본래부터 있는 피타제 효소뿐만 아니라, 피타제 활성, 예를 들어 myo-이노시톨 포스페이트로부터 무기 인(포스페이트)을 제거하거나 분비하는 것과 관련된 반응을 촉진하는 능력을 소유한 효소를 의미한다. 바람직하게는 피타제는 부류 EC 3.1.3.8에 속할 것이다. 피타제 자체는 바람직하게는 아스퍼질러스 또는 트리코더마종에서 유도된 진균 피타제이다.
본 발명은 또한 식용 탄수화물 중합체를 캐리어로 사용하는 입상물 형태의 피타제 제형의 제조방법을 제공한다. 캐리어는 입상물 또는 분말 형태일 수 있다. 용액 또는 슬러리와 같은, 피타제-함유 수용액은 고형 캐리어와 혼합될 수 있고 캐리어상으로 흡수될 수 있다. 혼합 도중 또는 이후에, 피타제-함유액과 캐리어는 입상물로 되어, 차후 건조될 수 있다. 탄수화물 캐리어의 사용은 조성물(및 이에따른 피타제)을 다량 흡수할 수 있다. 혼합물은 예를 들어 압출가능한 과립으로 쉽게 공정될 수 있는 플라스틱 페이스트 또는 비-탄력성 반죽을 형성하는데 사용될 수 있다. 적당하게는 캐리어는 보다 쉽게 입상화하는 비-섬유질이다: 섬유질 물질은 압출에 의해 입상화를 방해할 수 있다.
다수의 기존 자료에서는 각종 효소를 함유하지만, 종종 세척 조성물에서 세제로 사용되는 펠릿에 관해 언급하고 있다. 반면, 본 출원은 동물 사료에 이용되고 이러한 이유로 인해 본 발명의 입상물은 식용성이고(동물에 의해) 바람직하게는 소화 가능하다. 따라서 본 발명의 입상물, 과립 및 조성물이 비누, 세제 및 표백 또는 표백 화합물, 제올라이트, 바인더, 충진제(TiO2, 카올린, 실리케이트, 활석 등)에는 존재하지 않는다는 사실이 놀랍지 않을 것이다.
식용 탄수화물 중합체는 동물이 사료를 먹을 수 있고, 바람직하게는 소화도 가능하도록 선택되어야 한다. 중합체는 바람직하게는 글루코스(예, 글루코스-함유 중합체), 또는 (C6H10O5)n단위를 포함한다. 바람직하게는 탄수화물 중합체는 α-D-글루코피라노스 단위, 아밀로스(선형(1→4)α-D-글루칸 중합체) 및/또는 아밀로펙틴(α-D-(1→4) 및 α-D-(1→6)링키지를 지닌 측쇄 D-글루칸)를 포함한다. 전분이 바람직한 탄수화물 중합체이다. 전분 대신, 또는 전분 이외에 사용될 수 있는 기타 적당한 글루코스-함유 중합체는 α-글루칸, β-글루칸, 펙틴(예;프로토-펙틴), 및 글리코겐을 포함한다. 에테르 및/또는 에스테르와 같은 이들 탄수화물 중합체의 유도체도 고려되지만, 젤라틴화된 전분은 종종 피해진다. 적당하게는 탄수화물 중합체는 수-불용성이다.
본원에 기재된 실시예에서는 옥수수-, 감자- 및 쌀-전분이 사용된다. 그러나, 타피오카, 카사바, 밀, 옥수수, 사고, 호밀, 귀리, 보리, 삼, 수수 또는 칡과 같은 기타(예를 들면, 야채 또는 작물과 같은 식물) 원료에서 얻은 전분이 동일하게 적용가능하다. 마찬가지로 천연 또는 변형(예, 덱스트린)된 형태의 전분 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게는 탄수화물(예, 전분)은 단백질을 거의 함유하지 않거나 전혀 함유하지 않는데, 예를 들면, 5% (중량/중량) 이하, 2%(중량/중량) 이하, 바람직하게는 1%(중량/중량) 이하를 함유한다.
고형 캐리어의 최소 15%(중량/중량)는 탄수화물 중합체(예를 들어 전분)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 고형 캐리어의 최소 30%(중량/중량), 최적으로는 최소 40%(중량/중량)가 탄수화물을 포함한다. 유리하게도 고형 캐리어의 주요 성분은 탄수화물(예를 들어 전분), 예를 들어 50%(중량/중량)이상, 바람직하게는 최소 60%(중량/중량), 적당하게는 최소 70%(중량/중량), 및 최적으로는 최소 80%(중량/중량)이다. 이들 중량 퍼센티지는 최종 건조 입상물에서 비-효소적 성분의 총 중량을 기준으로 한다.
캐리어상으로 흡수될 수 있는 피타제-함유액의 양은 보통은 흡수될 수 있는 물의 양에 의해 제한된다. 천연, 과립상, 전분의 경우 이는 승온(전분을 팽윤시키는 온도)을 사용함이 없이, 25-30%(중량/중량)으로 달라질 수 있다. 실제로 탄수화물에 첨가될 수 있는 효소액의 퍼센티지는 종종 이보다 클 수 있는데 이는 효소 함유액이 보통 상당한 양의 고형물을 함유할 것이기 때문이다. 피타제 용액은 약 25%(중량/중량) 고형물을 함유할 수 있어, 그 결과 탄수화물(예, 전분)과 피타제 용액은 약 60%(중량/중량):40%(중량/중량)비와 같이, 각각 탄수화물:피타제 용액의 비 0.5:1 내지 2:1, 예를 들면 1.2:1 내지 1.6:1로 혼합될 수 있다. 바람직하게는 고형 캐리어에 첨가되는 액체의 양은 (수)용액의 (실질적으로) 모든 물이 고형 캐리어에 존재하는 탄수화물에 의해 흡수될 정도이다.
승온에서 전분과 기타 탄수화물 중합체는 팽윤하에 다량의 물을 흡수할 수 있다. 이러한 이유로 인해 탄수화물 중합체는 물(또는 효소-함유 수용액)을 원하는 바대로 흡수할 수 있다. 예를 들어, 옥수수 전분은 60℃에서 물 중량의 3배까지 흡수할 수 있고 70℃에서는 10배까지 흡수할 수 있다. 보다 많은 양의 효소-함유액을 흡수하기 위해 보다 높은 온도의 사용이 본 발명에서 고려되고, 실제로는 열안정성 피타제 효소를 다룰 때 특히 바람직하다. 이들 효소의 경우 따라서 고형 캐리어와 액상 캐리어의 혼합은 승온(예, 주위 온도 이상), 예를 들면 30℃ 이상, 바람직하게는 40℃ 이상, 최적으로는 50℃ 이상에서 수행될 수 있다. 달리 또는 이외에 액체는 이 온도에서 제공될 수 있다.
그러나, 일반적으로, 보다 높은 온도에서 (열 민감성)피타제의 불안정성으로 인해 일어나는 활성 손실을 최소화하기위해 보다 낮은(예, 주위) 온도에서 비-팽윤성 조건이 바람직하다. 적당하게는 효소와 액체의 혼합동안 온도는 20 내지 25℃이다.
피타제-함유액과 고형 캐리어의 혼합물을 과립으로 만들기 위해(즉 입상화) 사용되는 기계 프로세싱은 식품, 사료 및 효소 제형 공정에서 종종 사용된 공지 기술을 이용할 수 있다. 이는 팽윤, 압출, 구형화, 펠릿화, 고 전단 입상화, 드럼 입상화, 유동층 응집 또는 이의 배합을 포함할 수 있다. 이들 공정은 보통 스크루 드라이브, 혼합 메카니즘의 반복, 펠릿화 도구의 롤링 메타니즘의 압력, 유동층 응집기의 회전 바닥판에 의한 입자 이동 또는 가스 스트림에 의한 입자 이동, 또는 이의 병행과 같은 기계적 에너지의 주입이 특징적이다. 이들 공정은 고형 캐리어(예, 분말 형태)를 피타제-함유액(수용액 또는 슬러리)과 혼합하여, 차후 입상화시킨다.
본 발명의 추가 양태에서 입상물(예, 응집물)은 유동층 응집기에서 피타제-함유액을 캐리어상으로 분무 또는 코팅시켜 형성된다. 생성된 과립은 유체층 응집기에서 생성될 때 응집물을 포함할 수 있다.
바람직하게는 피타제-함유액과 고형 캐리어의 혼합은 추가로 혼합물의 반죽을 포함한다. 이는 입상화(예, 압출)를 촉진하기 위해 혼합물의 가소성을 개선시킬 수 있다.
입상물이 압출에 의해 형성되면 이는 바람직하게는 낮은 압력에서 수행된다. 이는 압출되는 혼합물의 온도가 증가하지 않거나, 단지 약간 증가되는 이점을 제공할 수 있다. 저-압 압출은 예를 들어 Fuji Paudal 바스켓- 또는 돔- 압출기에서의 압출을 포함한다. 바람직하게는 압출은 압출되는 물질의 온도를 40℃ 이상으로 올리지 않는다. 압출은 본래 과립(과립은 다이 통과 후에 파쇄될 수 있음)을 생성하거나 커터가 이용될 수 있다.
적당하게는 과립은 30 내지 40%, 예를 들면 33 내지 37%의 수분 함량을 가질 것이다. 효소 함량은 적당하게는 3 내지 10%, 예를 들면, 5 내지 9%이다.
얻어진 과립은 구형화기, 예를 들면, MARUMERISERTM기에 의해 원형화(예, 구형화)되고/되거나 압착될 수 있다. 과립은 최종 입상물에서 분진 형성을 줄일 수 있고/있거나 입상물의 코팅을 촉진할 수 있기 때문에 건조 이전에 구형화될 수 있다.
과립은 유동층 건조기에서 건조될 수 있거나, 유동층 응집의 경우, (고형 건조)입상물을 얻기위해 즉시 건조될 수 있다(응집기에서). 숙련인은 식품, 사료 또는 효소 산업에서 과립을 건조하는 기타 알려진 방법을 사용할 수 있다. 적당하게는 입상물은 유동성이다.
건조는 바람직하게는 25 내지 60℃의 온도, 예를 들면 30 내지 50℃의 온도에서 일어난다. 건조는 10분에서 수시간 동안, 예를 들면 15 내지 30분간 지속될 수 있다. 요구되는 시간은 물론 건조될 과립의 양에 의존하지만, 안내서에 따르면 이는 과립 1 kg당 1 내지 2초이다.
과립 건조 후, 생성된 입상물은 바람직하게는 3 내지 10%의 수분 함량, 예를 들면 5 내지 9%의 수분 함량을 가진다.
코팅제가 입상물에 도포되어 추가 (예, 선호되는) 특성 또는 성질, 예를 들어 낮은 분진 함량, 색, 주위 환경으로부터 효소 보호, 하나의 입상물에서 상이한 효소 활성 또는 이들을 복합시킨 것들을 제공할 수 있다. 과립은 지방, 왁스, 중합체, 염, 고약 및/또는 연고 또는 (2차) 효소를 함유하는 코팅제(예, 액체), 또는 이들의 조합물로 코팅될 수 있다. 원한다면 (상이한) 코팅제의 다수층이 적용될 수 있음을 알 수 있다. 코팅제(들)를 입상물에 도포하기위해 유동층, 고전단 입상화기, 믹서 제립기, 또는 Nauta-믹서의 사용을 포함하는 다수의 공지법이 이용될 수 있다.
기타 양태에서는 추가 성분들이 펠릿화 안정성 및/또는 입상물의 저장 안정성의 추가 개선을 위해 프로세싱 보조제로서 입상물에 혼입될 수 있다. 다수의 이러한 바람직한 첨가제가 하기에 논의되고 있다.
염이 입상물에 포함될 수 있다(예, 고형 캐리어 또는 액체와 함께). 바람직하게는 (EP-A-0.758,018에서 제시된) 무기염(들)이 첨가될 수 있는데, 이는 건조 피타제 제조의 프로세싱 및 저장 안정성을 개선시킬 수 있다. 바람직한 무기염은 2가 양이온, 예를 들면 아연, 마그네슘, 및 칼슘을 포함한다. 설페이트가 가장 선호되는 음이온이다.
바람직하게는 (EP-A-0,758,018에 제시된) 무기 염(들)이 첨가될 수 있고, 이는 건조 효소 제조의 프로세싱 및 저장 안정성을 개선시킬 수 있다. 바람직한 무기염은 수용성이다. 이들은 2가 양이온, 예를 들면 아연(특히), 마그네슘, 및 칼슘을 포함할 수 있다. 설페이트가 가장 선호되는 음이온이지만 수용성인 기타 음이온도 사용될 수 있다. 염은 고형물 형태로 (예, 혼합물에) 첨가될 수 있다. 그러나, 염(들)은 고형 캐리어와의 혼합이전에 물 또는 효소-함유액에 용해될 수 있다. 적당하게는 염은 최소 15%(효소를 기준으로 중량/중량), 예를 들면 최소 30%의 양으로 제공된다. 그러나, 이는 최소 60% 또는 심지어 70%(효소를 기준으로 중량/중량)만큼 높을 수 있다. 이들 양은 과립 또는 입상물에 적용될 수 있다. 입상물은 따라서 염의 12%(중량/중량) 이하, 예를 들면 2.5 내지 7.5%, 4 내지 6%를 포함할 수 있다.
염이 물에 공급되면 5 내지 30%(중량/중량), 예를 들면 15 내지 25%의 양일 수 있다.
펠릿화 안정성의 추가 개선은 소수성, 겔-형성 또는 느린 용해(예. 물에서) 화합물의 혼입에 의해 얻어질 수 있다. 이들은 1 내지 10%, 예를 들면 2 내지 8%, 바람직하게는 4 내지 6 중량%(물과 고행 캐리어 성분들의 중량을 기준으로)로 제공될 수 있다. 적당한 물질은 HPMC(하이드록시-프로필-메틸-셀룰로스), CMC(카복시-메틸-셀룰로스), HEC(하이드록시-에틸-셀룰로스)와 같은 유도 셀룰로스; 폴리비닐 알콜(PVA); 및/또는 식용유를 포함한다. 콩기름 또는 카놀라유와 같은 식용유가 프로세싱 보조제로 (예, 입상화될 혼합물에) 첨가될 수 있지만, 대체로 소수성 물질(예, 팜유)은 바람직하게는 부존재한다.
바람직하게는 과립은 비교적 좁은 크기 분포(예, 이들은 단분됨)를 가진다. 이는 과립에서 피타제 및/또는 동물 사료에서 효소 입상물의 균일한 분포를 촉진할 수 있다. 본 발명 공정은 좁은 크기 분포를 지닌 입상물을 생성하는 경향이 있다. 그러나, 필요하다면, 첨가 단계는 선별과 같은 과립의 크기 분포를 추가로 좁히는 공정에 포함될 수 있다. 입상물의 크기 분포는 적당하게는 100 ㎛ 내지 2000 ㎛, 바람직하게는 200㎛ 내지 1800㎛, 최적으로는 300㎛ 내지 1600㎛이다. 과립은 불규칙한(하지만 바람직하게는 균일한) 형상, 예를 들면 대략 구형일 수 있다.
기타 적당한 효소(들)은 페트 식품을 포함하는 동물 사료에 포함될 수 있다. 이들 효소의 기능은 예를 들어, 점도를 감소시키거나 특정 사료 화합물의 항-영양소적 효과를 감소시킴으로써, 종종 공급 전환 속도를 개선시키는데 있다. 사료 효소도 퇴비 환경에 해로운 화합물의 양을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 효소는 β-글루카나제와 같은 셀룰라제, 자일라나제와 같은 헤미셀룰로스, 또는 갈락타나제를 포함하는 아밀로리틱 효소와 식물 세포벽 분해 효소와 같은 카보하이드라제; 펩티다제, 갈락토시다제, 펙티나제, 에스테라제; 바람직하게는 중성 및/또는 산성 pH 옵티맘을 지닌 프로테아제; 및 리파제, 바람직하게는 포유류 췌장 포스포리파제 A2와 같은 포스포리파제이다. 바람직하게는, 효소는 전분 분해 효소(예를 들어 아밀라제)를 포함하지 않는다. 몇몇 양태에서 프로테아제는 이들이 섭취시 해로울 수 있는 경우에는 제외될 수 있다. 효소가 식물 세포벽 분해 효소, 예를 들어 셀룰라제, 및 특히 자일라나제와 같은 헤미셀룰로스이면, 최종 입상물은 3,000 내지 100,000, 바람직하게는 5,000 내지 80,000, 최적으로는 8,000 내지 70,000 EXU/g 범위의 효소 활성을 가질 수 있다. 효소가 β-글루코나제와 같은 셀룰라제이면, 최종 입상물은 500 내지 15,000, 바람직하게는 1,000 내지 10,000, 최적으로는 1,500 내지 7,000 BGU/g의 효소 활성을 가질 수 있다.
과립은 5 내지 20, 예를 들어 7 내지 15%의 효소(들)를 포함할 수 있다. 효소는 본래 존재하는 것이거나 재조합될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 공정은 따라서
a. 피타제-함유 수용액 및, 최소 15%(중량/중량)를 포함하는 고형 캐리어 또는 식용 탄수화물 중합체를 혼합, 예를 들면 고형 캐리어를 효소-함유 수용액과 혼합하고;
b. 임의로는 생성된 혼합물을 반죽하며;
c. 예를 들면 기계적 프로세싱에 의해, 효소-함유 과립을 얻도록 예를 들어 제립기를 사용하거나 압출에 의해 혼합물을 입상화하며;
d. 임의로는 과립을 구형화한 다음;
e. 생성된 과립을 건조시켜 효소-함유 입상물을 얻는 단계를 포함한다.
전 공정동안 본 출원인은 효소(들)가 80℃ 이하로 노출되도록 최대 온도를 유지하는 것을 목표로 하고있다.
본 발명의 입상물은 동물 사료의 제조에 사용하기 적당하다. 가장 광범위하게는 본 발명의 측면은 피타제와 식용 탄수화물 중합체로 구성된 입상물을 포함하고, 입상물은 최소 6,000 FTU/g의 활성을 가진다. 이러한 공정에서 입상물은 예비믹스 또는 이의 일부 형태로 사료 물질과 혼합된다. 본 발명에 따른 입상물의 특성은 특히 혼합물이 증기 처리되어 차후 펠릿화되면, 동물 사료로 매우 적합한 혼합물의 성분으로서 사용되는데 있다. 건조된 과립은 이러한 펠릿에서 눈에 띠거나 구분될 수 있다.
따라서 본 발명의 제 3 측면은 하나 이상의 동물 사료 물질(예를 들면 종자) 또는 성분들을 제 2 측면의 조성물과 혼합시키는 것을 포함하는, 동물 사료, 또는 동물 사료의 예비믹스 또는 전구체의 제조방법에 관한 것이다. 이는 멸균, 예를 들면 열처리될 수 있다. 생성된 조성물은 적당하게는 펠릿으로 프로세싱된다.
본 발명의 제 4 측면은 바람직하게는 동물 사료와 같은 식용 사료 조성물인 제 2 측면의 입상물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 바람직하게는 펠릿 형상이다(펠릿당 1-5, 예를 들면, 2-4 건조된 과립일 수 있음).
적당하게는 조성물은 0.05 내지 2.0, 예를 들면 0.3 내지 1.0, 최적으로는 0.4 내지 0.6 FTU/g의 피타제를 포함한다. 자일라나제는 0.5 내지 50, 예를 들면, 1 내지 40 EXU/g으로 존재할 수 있다. 달리 또는 추가로 셀룰라제는 09.1 내지 1.0, 예를 들면 0.2 내지 0.4 BGU/g으로 존재할 수 있다.
조성물은 10 내지 20%, 예를 들면 12-15%의 수분 함량을 가질 수 있다. 효소(들)의 양은 적당하게는 0.0005 내지 0.0012%, 예를 들면 최소 5 ppm이다.
제 5 측면은 동물의 성장을 촉진하는 공정에 관한 것으로, 이 공정은 제 2 측면의 조성물 또는 제 4 측면의 조성물을 포함하는 먹이를 동물에게 공급하는 단계를 포함한다. 여기서, 동물 먹이는 입상물 자체, 또는 사료에 존재하는 입상물을 포함할 수 있다.
본 발명의 제 6 측면은 동물 사료에서 동물 먹이로 유용한 성분인 조성물의 사용에 관한 것이다.
본 발명의 제 7 측면도 피타제의 펠릿화 안정성을 개선하기 위해 피타제용 캐리어로서 최소 15%(중량/중량) 식용 탄수화물 중합체를 포함하는 조성물의 사용에 관한 것이다.
적당한 동물은 농장 동물(돼지, 가금, 가축), 비반추 또는 단위 동물(돼지, 닭, 가금, 어류와 같은 해저 동물), 반추동물(소 또는 양, 예를 들면, 암소, 양, 염소, 사슴, 송아지, 어린 양)을 포함한다. 가금은 병아리, 암탉 및 칠면조를 포함한다.
본 발명의 일 측면의 바람직한 모습과 특성은 또다른 무타티스 무탄디스(mutatis mutandis)에서도 동일하게 적용된다.
하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 제시된 것이고, 제한적인 의도로는 해석되지 않는다.
실시예 1
에이. 나이저 CBS 513.88의 발효
하기 표준 기술을 이용하여 아스퍼질러스 나이저 진균 포자 제조물을 제조한다.
포자 및 차후 세포를 에를렌마이어 플라스크에서 일련의 뱃치 발효를 위해 10ℓ 발효조로 옮긴다. 뱃치 배양액에서 생장 후, 이 발효조의 내용물을 최종 500 리터 뱃치 발효를 위한 접종물로 이용한다.
사용된 배지는 하기를 포함한다: 91 g/ℓ 옥수수 전분(BDH 화학물질), 암모늄 38 g/ℓ 글루코스.H2O; 0.6 g/ℓ MgSO4.7H2O; 0.6 g/ℓ KCl; 0.2 g/ℓ FeSO4.7H2O 및 12 g/ℓ KNO3. 4N NaOH 또는 4N H2SO4를 이용한 자가 적정에 의해 pH를 4.6±0.3으로 유지한다.
세포를 25% 공기 포화도에서 자동 제어된 용존 산소 농도에서 28℃에서 생장시킨다. 피타제 생성은 발효 10일 후 최대 수준 5-10 U/㎖에 이른다.
옥수수 전분 대신 암모늄 설페이트를 이용하여 발효를 반복한다(동일한 동화성 질소 함량을 제공하기위해).
실시예 2
피타제의 정제 및 특징화: 피타제 활성 평가
(필요시 희석된) 브로쓰 여과액 또는 상등액 100 ㎕ 또는 참조용으로 데미수 100㎕를 하기 조성물을 지닌 배양 혼합물에 첨가한다:
- 0.25 M 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5.5, 또는
- 글리신 HCl-완충액; pH 2.5
- 1 mM 피트산, 나트륨염
- 데미수 900㎕ 이하
생성된 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한다. 10% TCA(트리클로로아세트산) 1 ㎖를 첨가하여 반응을 멈춘다. 반응 종료 후, 시제(50 ㎖ 암모늄 몰리브데이트 용액(2.5 g(NH4)6Mo7O24.4H2O 및 8㎖ H2SO4, 데미수로 250㎖까지 희석)중 FeSO4.7H2O 3.66 g) 2 ㎖를 첨가한다.
청색 강도를 750 nm에서 분광 광도계로 측정한다. 측정값은 0-1 mMol/ℓ 범위의 포스페이트 보정 곡선과 관련지어서 나온 포스페이트의 양을 나타낸다.
실시예 3
A. 에이.나이저 아밀로글루코시다제 (AG) 유전자의 프로모터 및/또는 시그널 서열에 융합된 에이.피쿰 피타제 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 에이.나이저 CBS 513.86에서 피타제 발현
에이.나이저에서 피타제의 과발현을 얻기위해 에이.피쿰 피타제 유전자가 시그널 서열과 함께 에이.나이저 아밀로글루코시다제 (AG) 프로모터의 통제하에 있는 발현 카세트가 유도된다. 보다 긴 선도 서열의 경우 AG 프로모터 서열이 성숙 단백질을 암호화하는 피타제 유전자 단편에 융합된 피타제 선도 서열을 포함하는 피타제 암호 서열에 융합된다(EP-A-0,420,358의 참조 실시예 10 참조).
B. 에이.나이저에서 AG 프로모터의 통제하에 피타제 유전자의 발현
에이.나이저 균주 CBS 513.88(1988년 10월 10일에 기탁됨)은 공지 과정에 의해 10 ㎍ DNA 단편으로 형질전환된다(예를 들면, EP-A-0,420,358의 실시예 9 참조). 각각의 발현 카세트에서 단일 에이.나이저 형질전환체를 분리하고, 포자를 선별 아세타미드-아가 플레이트상에서 스트리킹한다. 각 형질전환체의 포자를 0.4% 감자-덱스트로스(영국 옥소이드) 아가 플레이트상에서 3일간 37℃에서 자란 세포에서 모은다. 피타제 생성을 하기 조건하에 교반 플라스크에서 시험한다:
대략 1 x 108포자를 (리터당) 1 g KH2PO4; 30 g 말토스; 5 g 효모 추출물; 10 g 카제인-가수 분해물; 0.5 g MgSO4.7H2O 및 3 g Tween 80을 함유하는 100 ㎖ 예비-배양 배지에 접종한다. pH를 5.5에 맞춘다.
회전 교반기에서 34℃에서 밤새 생장시킨 후, 1 ㎖ 생장 배양물을 (리터당) 2 g KH2PO4; 70 g 말토덱스트린(말덱스 MDO3, 아밀룸); 12.5 g 효모 추출물; 25 g 카제인-가수 분해물; 2 g K2SO4; 5g MgSO4.7H2O; 0.03g ZnCl2; 0.02g CaCl2; 0.05 MnSO4.4H2O 및 FeSO4를 함유하는 100 ㎖ 본-배양액에 접종한다. pH를 5.6에 맞춘다.
최소 140시간 동안 균사체가 자란다. 실시예 2에서와 같이 피타제 생성을 측정한다. 탄소원 및 질소원으로서 동일량의 글루코스와 암모늄 설페이트를 이용하여 발효를 반복한다. 브로쓰를 여과하여 바이오매스로부터 분리된 여과액을 얻는다. 발현 카세트 PFYT3(AG-프로모터/피타제 리더)를 이용하여 최대 피타제 활성 280 U/㎖를 얻는다.
실시예 4
여과액으로부터 피타제의 정제
고도로 정제된 피타제를 얻기위한 정제는 하기와 같다:
1. pH 4.9에서 양이온 교환 크로마토그래피
2. pH 3.8에서 양이온 교환 크로마토그래피
3. pH 6.3에서 음이온 교환 크로마토그래피
4. 한외여과
1. 피타제 여과액을 물로 20배 희석하고 pH를 4.9에 맞춘다. 이 물질을 20 mM 시트르산/NaOH pH 4.9 완충액으로 평형이 유지된 S Sepharose Fast Flow 컬럼을 통과시킨다. 피타제와 결합하지 않은 물질을 모아 다음 단계에 사용한다.
2. pH 4.9 물질을 pH 3.8에 맞추고 피타제를 2-mM 시트르산/NaOH pH 3.8 완충액으로 평형이 유지된 S Sepharose Fast Flow 컬럼상에 결합시킨다. 20 mM NaPO4, 50 mM NaCl pH 7.6 완충액을 이용하여 피타제를 컬럼에서부터 용출해낸다.
3. 제 2 양이온 교환 단계로부터 약한 피타제 분획을 pH 6.3에 맞추고 피타제를 10 mM KPO4pH 6.3 완충액으로 평형이 유지된 Q Sepharose Fast Flow 컬럼상에 결합시킨다. 동일 완충액에서 1 M NaCl에 대한 구배를 이용하여 피타제를 용출한다.
요약 정제 결과
샘플 정제 인자
출발 여과액 1
pH 4.9에서 양이온 교환 후 1.07
pH 3.8에서 양이온 교환 후 1.2
음이온 교환 후 1.46
10 mg 단백질/㎖를 함유하는 최종 (음이온 교환) 산물을 3바에서 Kalle E35막을 지닌 아미콘 교반 세포(2 L 모듈)를 이용하여 한외여과에 의해 10배 농축한다.
정제된 피타제의 최종 농도는 280-300 g/ℓ(28-30%)에 이른다. 100 FTU/mg 단백질의 특정 활성과 함께, 이는 28,000-30,000 FTU/g의 피타제 활성을 낳는다.
실시예 5
고 활성 피타제 안정성 시험
보다 높은 효소 농도(고 활성 피타제액을 이용하여 제조된 과립에서)가 보다 높은 펠릿화 안정성을 제공함을 입증하기 위해, 입상물을 효소 농도를 증가시켜가면서 제조하고 이들 샘플의 펠릿화 안정성을 시험한다.
비교 샘플 A: 혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의한 옥수수 전분-기제 낮은 활성 효소 입상물의 제조.
73% (중량/중량) 옥수수 전분 및 저농도 4%(중량/중량) 피타제 한외 여과액 및 23% (중량/중량) 물을 혼합 및 반죽하여 혼합물을 제조한다. Nica E-220 바스켓 압출기를 이용하여 이 혼합물을 압출한 다음 600 ㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 2분간 Fuji Paudal MarumeriserTM에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는다. 이들 입자를 차후 Glatt GPCG 1.1 유동층 건조기에서 건조한다. 입상물의 최종 활성은 610 FTU/g이다.
비교 샘플 B: 혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의해 옥수수 전분-기제 중간 활성 효소 입상물의 제조.
70%(중량/중량) 옥수수 전분 및 17%(중량/중량) 피타제 한외 여과액 및 13% (중량/중량) 물을 혼합 및 반죽하여 혼합물을 제조한다. 600㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 2분간 Fuji Paudal Marumeriser에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는데 Nica E-220 바스켓 압출기를 이용하여 이 혼합물을 압출한다. 이들 입자를 차후 Glatt GPCG 1.1 유동층 건조기에서 건조한다. 입상물의 최종 활성은 4170 FTU/g이다.
샘플 C
혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의해 옥수수 전분-기제 고 활성 효소 입상물의 제조.
67% (중량/중량) 옥수수 전분 및 실시예 4(18,400 FTU/g으로 희석되는 것은 제외됨)에서 제조된 30% (중량/중량) 피타제 한외 여과액 및 3%(중량/중량) 물을 혼합 및 반죽하여 혼합물을 제조한다. 600㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 2분간 Fuji Paudal Marumeriser에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는데 Nica E-220 바스켓 압출기를 이용하여 이 혼합물을 압출한다. 이들 입자를 Glatt GPCG 1.1유동층 건조기에서 차후 건조한다. 입상물의 최종 활성은 6830 FTU/g이다.
펠릿화 안정성의 비교
상이한 효소 입상물을 차후 펠릿화 시험에 두고 이들의 펠릿화 안정성을 비교한다. 펠릿화 시험은 각각 1500, 320 및 200 ppm으로 사료 예비믹스와 효소 입상물을 혼합하는 것으로 이루어진다. 이들 혼합물을 증기 주입에 의해 전처리하여 온도를 75℃까지 올린 후, 혼합물을 펠릿화기에서 펠릿화시켜 82℃의 온도에서 사료 펠릿을 얻은 다음, 차후 건조한다. 이러한 타입의 공정은 사료 펠릿을 얻기위한 사료 산업에 전형적이다.
표 1은 펠릿화 시험의 결과를 요약하고 있다. 가장 높은 효소 농도를 지닌 두 과립이 보다 높은 펠릿화 안정성을 가짐을 알 수 있다.
펠릿화 시험 결과
샘플 번호 FTU/g의입상물 활성 곡물의 온도(℃) 펠릿 온도(℃) 펠릿화 이후 효소 수율(%)
비교(A) 610 75 82 ＜17
비교(B) 4,170 75 82 37
(C) 6,830 75 82 48
실시예 6
혼합, 반죽, 펠릿화 및 건조에 의해 콩기름 및 MgSO4첨가물을 함유한 감자 전분-기제 효소 입상물의 제조
믹서/반죽기에서 감자 전분 30 kg을 첨가하고 콩기름 2.5 kg을 혼합한다. 차후 MgSO4.7H2O(14 kg의 한외-여과액에 MgSO4.7H2O 3.5 kg이 용해됨)를 함유하는 아스퍼질러스에서 유도된 피타제 한외-여과액(16,840 FTU/g)을 첨가한다. 산물을 반죽기에서 철저히 혼합하고, 압출시킨 다음 실시예 1에서와 같이 유동층 건조기에서 건조한다. 이는 5870 FTU/g의 산물을 생성한다.
실시예 7
혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의한 쌀 전분-기제 효소 입상물의 제조
62% (중량/중량) 쌀 전분 및 실시예 6에서 사용된 동일한 피타제 한외-여과액 38% (중량/중량)을 혼합 및 반죽하여 혼합물을 제조한다. 이 혼합물을 FuJI Paudal 바스켓 압출기를 사용하여 압출시켜 785 ㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 1분간 MARUMERISERTM에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는다. 이들 입자를 실시예 1에서 처럼 유동층 건조기에서 차후 건조한다. 입상물의 최종 활성은 7280 FTU/g이다.
실시예 8
혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의해 HPMC 첨가물을 함유하는 옥수수 전분-기제 효소 입상물의 제조
54%(중량/중량) 옥수수 전분, 5% HPMC (하이드록시-프로필-메틸-셀룰로스) 및 실시예 6에 사용된 41% (중량/중량) 피타제 한외-여과액의 혼합물을 반죽하여 효소 제조물을 얻는다. 이 혼합물을 Fuji Paudal 바스켓 압출기를 사용하여 압출시켜 780 ㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 1분간 MARUMERISERTM에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는다. 이들을 40℃ 층 온도, 및 75℃ 유입 온도에서 20분간 유동층 건조기에서 차후 건조시킨다. 이렇게 얻어진 건조 효소 입상물은 8470 FTU/g의 활성을 가진다.
실시예 9
혼합, 반죽, 압출, 구형화 및 건조에 의해 HEC 첨가물을 함유하는 옥수수 전분-기제 효소 입상물의 제조
54% (중량/중량) 옥수수 전분, 5% (중량/중량) HEC(하이드록시-에틸-셀룰로스)를 실시예 6에서 사용된 동일한 피타제 한외-여과액 41% (중량/중량)과 혼합 및 반죽시켜 효소 제조물을 얻는다. 이 혼합물을 Fuji Paudal 바스켓 압출기를 사용하여 압출시켜 780㎛ 평균 직경의 원형 입자를 얻기위해 1분간 MARUMERISERTM에서 구형화된 습윤 압출물을 얻는다. 이들을 40℃ 층 온도, 및 75℃ 유입 온도에서 20분간 유동층 건조기에서 차후 건조한다. 이렇게 얻어진 건조 효소 입상물은 8410 FTU/g의 활성을 가진다.
실시예 10
18,000 FTU/g의 한외여과액이 이용되고, 이는 실시예 4의 한외여과액에서 유도되어, 희석된다.
샘플
제조된 3 샘플의 활성은 610(A, 비교); 4170(B, 비교) 및 6830(C) FTU/g이다. 이는 각각 활성 1.153, 1.685 및 1.745 FTU/g 사료의 3가지 사료를 제공한다.
첫번째 샘플 150 g을 하기에 기술하듯이 20 kg 사료와 혼합한다. 이 후, 예비믹스를 80 kg 사료와 혼합하고 두가지 상이한 온도에서 두가지 시험을 위한 사료로 두 부분으로 나눈다. 제 2 샘플은 20 kg 사료에서 153.6 g이다. 이 20,153.6 g 샘플을 10.076 kg의 두 동일한 부분으로 나눈다. 각 부분을 230 kg 사료와 혼합하여 시험용 곡물을 얻는다.
제 3 시험을 위해 입상물 96 g을 20 kg 사료와 혼합하고 10.048g의 두 부분으로 나눈다. 각 부분을 230 kg 사료와 혼합하여 시험용 곡물을 얻는다. 펠릿화 속도는 600 kg/시간이다.
사료 혼합물은 하기로 구성된다:
옥수수 20.00%
밀 30.00%
(가열된)대두 10.00%
콩(조악한 곡물 46.7/3.7) 18.20%
타피오카(65% 전분) 6.97%
동물성 곡물(56.5/10.9) 4.00%
어류성 곡물(70.6% re) 1.00%
조류성 곡물, hydr. 1.00%
콩 기름/옥수수 기름 1.30%
동물성 지방 4.00%
Vit./Min.예비믹스(옥수수) 1.00%
칼슘 카보네이트 0.85%
모노-칼슘 포스페이트 1.05%
염 0.26%
L-라이신 HCl 0.16%
DL-메티오닌 0.21%
세가지 혼합물을 펠릿화한다. 사료를 직접 증기가 곡물에 첨가되는 컨디셔너에 공급한다. 온도는 75℃로 오른다. 차후 곡물은 5 mm 구멍과 65 mm 두께를 지닌 다이 플레이트를 통해 푸싱되는 펠릿화기에서 나온다. 이 시점에서 공급 온도는 또다시 4℃에서 79℃로 오른다.
세가지 사료의 활성은 10.11(A); 10.04(B) 및 9.81(C)이다.
잔류 활성을 위해 이 시험 결과는 본래 610; 4170; 6830 및 FTU/g 샘플의 경우 각각 63(A); 66(B) 및 72%(C)이다. 이는 심지어 유사한 활성(B 및 C)을 지닌 최대 활성 제형(C; 본 발명의 경우 6830 FTU/g)이 보다높은 펠릿화 안정성을 제공함을 보여준다. 이는 (비교) 샘플 B의 경우 보다 6% 높은데, 이는 활성에 있어 매우 큰 증가(610 내지 4170 FTU/g)를 지니면서(A에서 B) 단지 3% 증가가 관측될 때 주목할 만하다.

Claims (38)

  1. (a) 피타제의 재조합 발현을 허용하는 조건하에, 글루코아밀라제(아스퍼질러스의 경우) 또는 셀로바이오하이드롤라제(트리코더마의 경우) 프로모터의 통제하에서 이종 피타제 유전자를 지닌 아스퍼질러스속 또는 트리코더마속의 미생물을 수성 배지(배지는 미생물에 대한 공급물로서, 동화성 탄소원과 동화성 질소원을 포함함)에서 배양하고;
    (b) 미생물을 제거하기위해 수성 배지를 여과시켜 수성 여과액을 얻은 다음;
    (c) (b)의 여과액을 한외여과시켜 적어도 14,000 FTU/g의 피타제 농도를 지닌 수용액을 얻는 단계를 포함하는, 피타제를 포함하는 수용액의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 미생물이 아스퍼질러스 나이저, 아스퍼질러스 오리제 또는 트리코더마 리제이인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미생물이 글루코아밀라제 (AG) 유전자를 소유하고 있지 않거나, 발현시키지 않는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 피타제 유전자의 복수개 사본을 소유하고 있는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액이 실질적으로는 taka-아밀라제가 없는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 배지에서 실질적으로 모든 탄소원과 수소원이 (b)의 여과 이전에 미생물에 의해 소비되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액에 탄소 및/또는 수소원이 없는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 피타제가 글루코아밀라제 시그널 서열을 지닌 미생물에서 발현되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 여과액 또는 수용액이 결정화 및/또는 색-제거 단계를 거치는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 수용액이 18,000 FTU/g 이상의 피타제 활성을 지닌 방법.
  11. 최소 14,000 FTU/g 농도의 피타제를 포함하는 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조될 수 있는 수용액.
  12. 제 11 항에 있어서, 피타제가 발현되는 배양 배지에서 유도되는 수용액.
  13. 피타제-함유 과립을 얻기위해 최소 15% (중량/중량) 식용 탄수화물 중합체를 포함하는 고형 캐리어와 제 11 항 또는 제 12 항에 따른 수용액을 프로세싱하는 단계를 포함하는, 동물 사료에 이용하기 적당한 피타제-함유 입상물의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 수용액과 캐리어를 혼합하고, 생성된 혼합물을 반죽하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 과립이 차후 건조되는 방법.
  16. a) 피타제를 함유하는 수용액을 고형 캐리어와 혼합하고;
    b) a)에서 얻은 혼합물을 기계적으로 프로세싱하여 효소-함유 과립을 얻은 다음;
    c) b)에서 얻은 효소-함유 과립을 건조하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 프로세싱이 압출, 펠릿화, 고-전단 입상화, 팽윤, 유동층 응집 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 제조될 수 있는 피타제-함유 입상물.
  19. 피타제와, 식용 탄수화물 중합체를 최소 15% (중량/중량) 포함하는 고형 캐리어로부터 형성된 건조된 과립을 포함하는 입상물.
  20. 제 19 항에 있어서, 과립이 적어도 하나의 2가 양이온을 포함하는 입상물.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 과립이 하나 이상의 소수성, 겔-형성 또는 수 불용성 화합물(들)을 포함하는 입상물.
  22. 제 21 항에 있어서, 소수성, 겔-형성 또는 수 불용성 화합물이 유도 셀룰로스, 폴리비닐 알콜(PVA) 또는 식용유를 포함하는 입상물.
  23. 제 22 항에 있어서, 유도 셀룰로스가 하이드록시-프로필-메틸-셀룰로스, 카복시-메틸-셀룰로스 또는 하이드록시-에틸-셀룰로스이고/이거나 식용유가 콩기름 또는 카놀라유인 입상물.
  24. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도-자일라나제 및/또는 β-글루카나제를 추가로 포함하는 입상물.
  25. 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 캐리어가 전분을 포함하는 입상물.
  26. 제 19 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 피타제가 내열(열안정성) 피타제가 아닌 입상물.
  27. 제 19 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 피타제가 진균성 피타제인 입상물.
  28. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 진균성 피타제가 아스퍼질러스 또는 트리코더마종에서 유도되는 조성물.
  29. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 피타제-함유 입상물을 하나 이상의 동물 사료 물질(들) 또는 성분(들)과 혼합하는 단계를 포함하는, 동물 사료, 또는 동물 사료에 대한 예비믹스 또는 전구체의 제조방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 사료 물질(들)과 조성물 또는 입상물의 혼합물이 증기 처리, 펠릿화 및 임의로 건조되는 방법.
  31. 제 19 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 따른 입상물 및/또는 최소 6,000 FTU/g의 활성을 지닌 피타제-함유 입상물을 포함하는 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 식용성 사료 조성물인 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 동물 사료인 조성물.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 입상물과 혼합된 하나 이상의 사료 물질(들) 또는 성분(들)의 펠릿을 포함하는 조성물.
  35. 제 31 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 29 항 또는 제 30 항 에 따른 공정에 의해 제조가능한, 동물 사료, 또는 동물 사료에 대한 예비믹스 또는 전구체인 조성물.
  36. 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 입상물 또는 제 31 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 먹이를 동물에게 제공하는 단계를 포함하는 동물의 성장 촉진방법.
  37. 동물 사료의 성분으로서, 또는 동물 먹이에 유용한 성분으로서, 제 19 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 따른 입상물의 사용.
  38. 피타제의 펠릿화 안정성을 개선하기위해 피타제용 캐리어로서 식용 탄수화물 중합체 최소 15% (중량/중량)을 포함하는 조성물의 사용.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100382662B1 (en) * 2001-09-19 2003-05-09 Dodram Bio & Feed Co Ltd Microorganism trichoderma reesei x18 and process for producing xylanase using the same microorganism

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU760737B2 (en) * 1998-06-29 2003-05-22 Dsm Ip Assets B.V. Phytase formulation
DE60010381T2 (de) * 1999-02-10 2004-09-09 Basf Ag Enzyme enthaltende futtergranulate
DE19922753A1 (de) * 1999-05-18 2000-11-23 Basf Ag Enzym-Instantformulierungen für die Tierernährung
DE19929257A1 (de) * 1999-06-25 2000-12-28 Basf Ag Polymerbeschichtete, granulierte enzymhaltige Futtermittelzusätze und Verfahren zu deren Herstellung
DK1441599T3 (da) * 2001-10-26 2007-11-12 Novozymes As Fremstilling af spiselige produkter
DK1467629T3 (da) * 2002-01-15 2009-11-09 Basf Se Granulater, der indeholder forderenzymer
ATE369043T1 (de) * 2002-01-15 2007-08-15 Basf Ag Enzymhaltige futtergranulate
US20040071685A1 (en) * 2002-10-09 2004-04-15 Devin Houston Compositions and methods for increasing the bioavailability of plant polyphenols
ES2374191T3 (es) * 2003-06-11 2012-02-14 Glatt Ingenieurtechnik Gmbh Procedimiento de preparación de granulados de enzimas y granulados de enzimas así obtenidos.
CN1909796A (zh) * 2004-01-30 2007-02-07 巴斯福股份公司 稳定化的磷酸酶制剂
US20060008512A1 (en) * 2004-07-07 2006-01-12 Hooge Danny M Composition and methods for improved animal performance
DK2258209T3 (da) * 2004-09-27 2015-08-31 Novozymes As Phytasegranuler i dyrefoder
US20060073193A1 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Novozymes A/S Enzyme granules
FR2879075B1 (fr) * 2004-12-15 2007-01-19 Adisseo France Sas Soc Par Act Procede de preparation de granules de principe actif hydrophile par extrusion
FR2879074B1 (fr) * 2004-12-15 2007-08-03 Adisseo France Sas Soc Par Act Granules de principe actif hydrophile
WO2006121220A1 (en) * 2005-05-13 2006-11-16 Sharp Kabushiki Kaisha Liquid crystal display device
US20070031555A1 (en) * 2005-08-05 2007-02-08 Axelrod Glen S Direct starch molding
NO20054430L (no) * 2005-09-23 2007-03-26 Uni For Miljo Og Biovitenskap Fremgangsmate ved okning av ernaeringsverdien hos konsumprodukter sa som dyrefôr, spesielt fiskefôr
ZA200803025B (en) * 2005-10-12 2010-07-28 Genencor Int Stable, durable granules with active agents
NZ569494A (en) * 2005-11-28 2011-12-22 Jorrocks Pty Ltd Low temperature forming of starch based and protein based feeds
GB0600913D0 (en) * 2006-01-17 2006-02-22 Syngenta Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US20080044398A1 (en) * 2006-07-13 2008-02-21 Vesta Ingredients, Inc. Soluble composition having enzymatic activity and improved stability
US8399230B2 (en) * 2006-10-12 2013-03-19 Kemin Industries, Inc. Heat-stable enzyme compositions
EP1925215B1 (de) * 2006-11-17 2012-01-04 Hügli Holding AG Verfahren zur Herstellung eines fetthaltigen granulären Nahrungsmittelkonzentrats
US20100323945A1 (en) * 2007-01-11 2010-12-23 Novozymes A/S Particles Comprising Active Compounds
FR2918990B1 (fr) * 2007-07-20 2012-12-21 Innov Ia Procede de preparation de compositions pulverulentes stables
ITRN20080042A1 (it) * 2008-07-17 2010-01-17 N C T New Chemical Technology Srl Uso dell'alcool polivinilico in tutte le sue forme in soluzioni e dispersioni acquose per il trattamento di mangimi animali con medicamenti, spezie e additivi di sapone.
CN102651973A (zh) 2009-12-18 2012-08-29 希尔氏宠物营养品公司 包含益生菌的宠物食物组合物及其制造和使用方法
US9980910B2 (en) 2010-11-16 2018-05-29 Provimi North America, Inc. Enteric-coated sodium metabisulfite livestock feed additive for vomitoxin detoxification
GB201102857D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
GB201102865D0 (en) * 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
JP5828551B2 (ja) * 2011-06-16 2015-12-09 ユニ・チャーム株式会社 ペットフードの製造方法
EP2750520B1 (en) * 2011-09-29 2018-08-08 P. Guinane Pty Ltd Animal feed composition
GB201308843D0 (en) * 2013-03-14 2013-07-03 Verenium Corp Phytase formulation
EP3051959A4 (en) 2013-10-02 2017-10-04 Can Technologies Inc. Feed pellets and related systems and methods
US11337445B2 (en) 2016-02-22 2022-05-24 General Mills, Inc. Cereal food product and method of making the same
EP4072295A1 (en) 2019-12-09 2022-10-19 Novozymes A/S Baking additive

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB931635A (en) 1961-08-22 1963-07-17 Noda Inst For Scientific Res Method of producing a proteolytic enzyme by use of black aspergillus type molds
FR1501782A (fr) 1965-08-06 1967-11-18 Quaker Oats Co Aliments à base de viande et ayant l'aspect d'une viande persillée, qui sont destinés à des animaux familiers, et procédé de préparation de ces aliments
US3661786A (en) 1970-01-27 1972-05-09 Procter & Gamble Detergent compositions containing stabilized alpha-amylase
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
JPS5988088A (ja) 1982-11-12 1984-05-21 Nagase Seikagaku Kogyo Kk 酵素含有顆粒剤の製造方法
GB2139868B (en) 1983-05-16 1987-04-23 Vaasanmylly Oy Feedstuff for ruminants and a process for its production
DE3344104A1 (de) 1983-12-07 1985-06-13 Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf Zur verwendung in pulverfoermigen waschmitteln geeignete enzymzubereitung
JPS6192570A (ja) 1984-10-12 1986-05-10 Showa Denko Kk 酵素造粒法
FR2589479B1 (fr) * 1985-11-05 1988-02-05 Hoechst France Nouvel enzyme, son procede d'obtention et son application a la preparation de n-(l-aspartyl-1)l-phenylalaninate de methyle
US4725544A (en) * 1986-04-25 1988-02-16 Tan Larry U Method for purifying xylanase
US5780292A (en) 1987-04-29 1998-07-14 Alko Group Ltd. Production of phytate degrading enzymes in trichoderma
FI77359C (fi) 1986-08-22 1989-03-10 Suomen Sokeri Oy Foderfix och foerfarande foer framstaellning av densamma.
WO1988001512A1 (en) 1986-08-28 1988-03-10 Thomas Ko Sai Ying Animal growth promotant
US4959240A (en) 1987-02-20 1990-09-25 Horizons International Foods, Inc. Potato-based foodstuff
DK435687D0 (da) 1987-08-21 1987-08-21 Novo Industri As Enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling deraf
CA1341226C (en) 1988-08-16 2001-05-01 Wim Van Hartingsveldt Gene replacement as a tool for the construction of aspergillus strains
US4897465A (en) 1988-10-12 1990-01-30 Abbott Laboratories Enrichment and concentration of proteins by ultrafiltration
US4988520A (en) 1988-11-07 1991-01-29 W. R. Grace & Co.-Conn. Binder for pelleted animal feeds
US5010008A (en) 1988-12-12 1991-04-23 Enzyme Bio-Systems Ltd. Stable liquid enzyme concentrate and process for its production
CZ289014B6 (cs) 1989-09-27 2001-10-17 Dsm N. V. Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy
WO1991009117A1 (en) 1989-12-20 1991-06-27 The Procter & Gamble Company Process for isolating galactose oxidase
ES2060360T3 (es) 1989-12-21 1994-11-16 Novo Nordisk As Metodo para la cristalizacion de enzimas.
US5316769A (en) * 1989-12-27 1994-05-31 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Drug for preventing and treating fish diseases
HU212783B (en) * 1990-12-22 1996-11-28 Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar Process for producing new thiobenzoyl morpholide derivatives and weight increasing agents comprising such compounds
DE4041752A1 (de) 1990-12-24 1992-06-25 Henkel Kgaa Enzymzubereitung fuer wasch- und reinigungsmittel
DK13491D0 (da) 1991-01-25 1991-01-25 Novo Nordisk As Anvendelse af et enzymholdigt granulat og fremgangsmaade til fremstilling af et forderstof i tabletform
JPH04271785A (ja) 1991-02-28 1992-09-28 Kao Corp 酵素固形製剤及びその製造方法
DK0556883T3 (da) 1992-01-24 1999-04-26 Dsm Nv Fremgangsmåde til fremstilling af foderpellets
JPH06277055A (ja) 1993-03-25 1994-10-04 Kikkoman Corp グルコシダーゼの保存法
EP0675952A1 (en) 1993-05-18 1995-10-11 Genencor International, Inc. Process for dust-free enzyme manufacture
DK71993D0 (da) 1993-06-18 1993-06-18 Novo Nordisk As Enzym
US5397834A (en) 1993-09-03 1995-03-14 Iowa State University Research Foundation, Inc. Biodegradable thermoplastic composition of aldehyde starch and protein
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
DK1142485T3 (da) 1994-04-22 2008-06-02 Novozymes As Fremgangsmåde til forbedring af oplöseligheden af planteproteiner
ES2268687T3 (es) 1994-04-25 2007-03-16 Dsm Ip Assets B.V. Polipeptidos con actividad fitasa.
GB9409336D0 (en) * 1994-05-10 1994-06-29 Finnfeeds Int Ltd Use of an enzyme for manufacturing an agent for the treatment and/or prophylaxis of coccidiosis
US5597809A (en) * 1994-06-23 1997-01-28 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Treatment of optic neuritis
DE4422433A1 (de) * 1994-06-28 1996-01-04 Cognis Bio Umwelt Mehrenzymgranulat
GB9416841D0 (en) 1994-08-19 1994-10-12 Finnfeeds Int Ltd An enzyme feed additive and animal feed including it
US5480673A (en) * 1994-10-25 1996-01-02 Wenger Manufacturing, Inc. Extruded high soluble protein animal feed and method of preparing same
US5609817A (en) * 1995-06-06 1997-03-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Extrusion-blown films from graft polymers prepared from cereal flour
ATE268817T1 (de) 1995-07-28 2004-06-15 Basf Ag Salz-stabilisierte enzymzubereitung
WO1997012958A2 (en) 1995-10-06 1997-04-10 Genencor International, Inc. Microgranule for food/feed applications
AU7489896A (en) 1995-11-02 1997-05-22 Novo Nordisk A/S Feed enzyme preparations
CN1135265C (zh) 1996-04-12 2004-01-21 诺沃奇梅兹有限公司 含酶颗粒及其生产方法
DE19619222A1 (de) 1996-05-13 1997-11-20 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Enzymgranulat für lebensmitteltechnologische Anwendungen
DE19619219A1 (de) * 1996-05-13 1997-12-04 Hoechst Ag Enzym-Vorgranulat für Tierfuttermittel-Granulate
JPH1042869A (ja) 1996-08-01 1998-02-17 Eiken Chem Co Ltd ビリルビンオキシダーゼの安定化方法
DE19651446A1 (de) 1996-12-11 1998-06-18 Henkel Kgaa Umhüllte Enzymzubereitung mit verbesserter Löslichkeit
NZ501409A (en) 1997-06-04 2002-02-01 Dsm N High-activity phytase compositions containing a carbohydrate polymer

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100382662B1 (en) * 2001-09-19 2003-05-09 Dodram Bio & Feed Co Ltd Microorganism trichoderma reesei x18 and process for producing xylanase using the same microorganism

Also Published As

Publication number Publication date
US7611701B2 (en) 2009-11-03
US20030049811A1 (en) 2003-03-13
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US6500426B1 (en) 2002-12-31
TW409035B (en) 2000-10-21
ZA984835B (en) 1999-01-04
ZA984834B (en) 1999-01-04
CY1105760T1 (el) 2011-02-02
KR20010013352A (ko) 2001-02-26
US20020034798A1 (en) 2002-03-21
US20050054065A1 (en) 2005-03-10
AR012913A1 (es) 2000-11-22

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