KR20000023648A - 식물 추출물로부터의 항바이러스제 및 바이러스 감염의 치료를 위한 사용 - Google Patents

식물 추출물로부터의 항바이러스제 및 바이러스 감염의 치료를 위한 사용 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 중국산 생약, 약용 식물 및 그 추출물로부터 유래하는 조성물과, 바이러스, 특히 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 감염된 동물을 치료하기 위한 그것의 사용에 관한 것이다. 더 상세히는, 본 발명의 조성물은, 오랜 역사동안 사람이 소비해 온 다양한 중국산 생약 또는 약용 식물로부터 유래한다. 본 발명의 조성물은 특정한 기술을 통하여 얻어지며, 사람 HBV 보균자와 C형 감염 환자를 치료하는 효능이 현저함이 증명되었다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 쥐 백혈병 바이러스(MuLV) 및 HIV에 대해 생체외 항바이러스 활성을 보이고 있다. HIV는 사람에게 후천성 면역 결핍증(AIDS)을 일으키는 것으로 알려진 바이러스이고, AIDS는 의료 집단에 본 발명이 제기하는 특별한 문제점을 제기한다.

Description

식물 추출물로부터의 항바이러스제 및 바이러스 감염의 치료를 위한 사용{ANTIVIRAL AGENTS FROM PLANT EXTRACTS AND USE FOR TREATMENT OF VIRAL INFECTIONS}
현대의 의료 과학은, 세균 및 바이러스 감염을 예방, 치료, 또는 억제하고 그리고 그들이 일으키는 질병을 치유하기 위한, 새롭고 더 강력한 제제를 계속하여 찾고 있다. 사람 및 가축의 세균 및 바이러스 감염으로 연간 수천억 달러의 대가를 치르고 있다. 심각한 문제가 되고 있는 새로이 출현한 약물 저항 균주와 싸울 새로운 항생제 및 항바이러스제를 확인하고, 특성화하고, 그리고 생성하는 데에 엄청난 돈이 매년 제약회사에 의해 소비되고 있다. 질병 예방에 대한 신뢰할 수 있는 예방 처치 또한 주요 관심사이다. 그러나, 간염 및 AIDS와 같은 바이러스 감염에 대한 치료를 밝히기 위한 비용과 노력에도 불구하고, 효과적인 치료법은 여전히 해결되지 않은 채로 남아 있다.
간염은 사람의 간의 질환이다. 그것은 간의 염증으로서 나타나며, 일반적으로 바이러스 감염에 의해, 그리고 가끔은 독물로부터 초래된다. 간염은 간경화, 간암, 그리고 종국적으로는 사망으로 진행할 수 있다. A, B, C, D, E 및 G형 간염과 같은 몇몇 바이러스들이 다양한 유형의 바이러스성 간염을 일으킨다고 알려져 있다. 이들 가운데, HBV 및 HCV가 가장 심각하다. HBV는 42㎚의 비리온 크기를 갖는 DNA 바이러스이다. HCV는 30-60nm의 비리온 크기를 갖는 RNA 바이러스이다. D. S. Chen, J. Formos. Med. Assoc., 95(1), 6-12(1996) 참조.
B형 간염은 전세계적으로, 특히 아시아와 아프리카에서 중요한 건강 문제이다. 세계적으로 대략 3억의 사람들이 HBV에 만성적으로 감염되어 있다. 백만명이상의 HBV 보균자가 미국에서 발견되었다. HBV 감염은 현재 간경화 및 간암의 주요 원인이다. HBV 보균자는 바이러스의 장기적인 병원보유자일 뿐만 아니라, 만성 간 질환이 발병될 수도 있고, 그리고 간경화 및 간암 발병 위험성이 매우 증가된다. 만성 B형 간염으로부터 간경화로의 진행은 종종 잠행성이며, 눈치챌 수 있는 증상 변화 없이 일어난다. 일단 경화 또는 암의 증상이 명백히 드러나면, 치료는 거의 유용성이 없다.
HBV 감염의 예방은 안전하고 효과적인 백신 접종을 통하여 가능하다. 그러나 백신 접종은 이미 감염된 자, 즉 보균자 및 환자들올 치료하는 데에는 효과적이지 않다. 많은 약물들이 만성 B형 간염의 치료에 사용되어 왔는데 인터페론 이외에는 어떠한 것도 효과적이라고 판명되지 않았다. 인터페론 치료는 그 성공이 제한적이며, 종종 피로, 열, 오한, 두통, 근육통, 관절통, 심하지 않은 탈모증, 정신병적 작용 및 관련된 장애, 자가면역 현상 및 관련된 장애, 그리고 갑상선 기능장애와 같은 부작용을 동반한다. 16주 동안의 인터페론 치료는 B형 간염 환자의 대략 40%에 있어서, 바이러스 증식의 지속적인 감소에 효과적인 것으로 나타났다. 대다수의 응답자는 정상적인 혈청 아미노기전이효소 수준을 가졌으며 재발율은 낮은 것으로 나타났다. R.P.Perrillo, Digestive Diseases and Sciences, 38(4), 577-593 (1993) 참조. 그러나 인터페론 치료를 받은 만성 B형 간염 중국 환자들사이에서는 보다 장기적인 재발율(24%)이 보고되었다. A.S.F.Lok, H.T.Chung, V.W.S.Liu, & O.C.K.Ma, Gastroenterology, 105(6), 1833-1838(1993) 참조.
더욱이, 인터페론으로 치료한 환자의 10-15%가 B형 혈청 간염 표면 항원(HBsAg)이 사라졌다. HBsAg의 감소는 HBV의 소실과 일치하였다. HBsAg-음성 환자내에서 간 조직의 개선은 그 후 몇 년간 지속되었다. 경화전 상태의 감염에서 치료가 제공될 때 질병이 진행하지 않음으로써 예상대로 간암을 예방할 수 있었다. R.P.Perrillo, Digestive Diseases and Sicences, 38(4), 577-593 (1993) 참조.
C형 간염은 A형이나 B형 간염이 아닌, HCV에 의해 초래되는 것으로 이전에 기술되었다. 세계적으로 대략 1억의 HCV 보균자가 있다. 미국에서는 350만의 사람이 만성 C형 간염을 가지고 있는 것으로 추정된다. HCV 감염은 임상적인 표시가 적으면서 간경화 및 간암을 초래할 것이다. 대부분의 C형 간염 환자는 특별한 증상이 없으며, 따라서 치료하기에는 너무 늦어버릴 때까지 쉽게 간과할 수 있다. 이는 B형 간염보다 잠재적으로 더욱 심각한 문제를 제기한다. HCV 보균자는 또한 바이러스의 장기적 병원보유자가 되며, 결국에는 만성 간 질환이 발병하고, 간경화 및 간암이 발병할 위험이 매우 높다. D.S.Chen, Science, 262, 369-370 (1993) 참조.
현재는 이용할만한 효과적인 면역법이 없으며, C형 간염은 위생 및 청결 상태를 개선하고 전염의 근원을 저지하는 것과 같은 예방적인 조치에 의해서 단지 조절될 수 있을 뿐이다. 현재, 만성 C형 간염에 대한 만족할만한 유일한 치료는 적어도 6개월의 치료를 요구하는 인터페론 치료이다. 초기 치료는 약 50%의 반응율을 갖는다. 그러나, 이들 반응자의 절반은 인터페론 치료 중단 후 다시 재발한다. 그러므로 단지 25%의 환자만이 반응이 지속된다. D.S.Chen, J. Formos. Med. Assoc., 95(1), 6-12(1996)과 N.Terrault & T. Wright, New Engl. J. Med., 332(22), 1509-1511 (1995) 참조. 인터페론 치료는 효능이 제한적이며 종종 부작용을 일으키므로, 더욱 효과적인 양생법이 필요하다.
AIDS는 HIV에 의해 초래되는 치명적인 질병이다. 그것은 1981년에 처음 질병으로 기재된 이후로, 그리고 1983년에 원인물질인 HIV의 발견 이후로 전 세계를 괴롭혀왔다. 1993년에는 세계적으로 약 1300만 명의 사람들이 HIV에 감염되었고, 그 숫자는 1996년 약 2100만으로 증가하였다. B.Jasny, Science, 260(5112), 1219(1993)과 P.Piot, Science, 272(5270), 1855(1996) 참조.
아지도부딘(AZT), 디다노신(디데옥시노신, ddI), d4T, 잘시타빈(디데옥시사이토신, ddC), 네비라핀, 라미부딘(에피바, 3TC), 사퀴나바(Invirase), 리토나바(Norvir), 인디나바(Crixivan), 및 델라비르딘(Rescriptor)와 같은 몇몇 약물들이 이 파괴적인 질병의 치료제로 인정되어 왔다. M.I.Johnston & D.F.Hoth, Science, 260(5112), 1286-1293(1993) and D.D.Richman, Science, 272(5270), 1886-1888 (1996) 참조.
AIDS 치료제로 현재 인정된 모든 약물들은 바이러스 증식의 저해를 이용하며, 바이러스 역전사효소 저해제 또는 바이러스 프로테아제 저해제이다. 넬피나바 및 개량된 사퀴나바와 같은 더 많은 프로테아제 저해제가 현재 개발 중이다. AIDS 백신(Salk 백신)이 시험되어서 CD8로부터의 키모카인(chemokine)인 몇몇 단백질이 HIV 저해제로서 작용한다는 것을 발견하였다.
상기 합성 뉴클레오시드 유사체, 단백질, 그리고 항체 이외에, Lonicera japonica 및 Prunella vulgaris, 그리고 Glycurrhiza radix로부터의 글리시리진과 같은 몇몇 식물 및 식물로부터 유래된 물질들도 생체외 항 HIV 활성을 갖는다는 것이 발견되었다. R.S.Chang & H.W.Yeung, Anitiviral Research, 9, 163-175(1988) 및 M.Ito, 외, Antiviral Research, 7,127-137 (1987) 참조.
HIV의 치료를 위한 모든 이용가능한 약제들에도 불구하고, 그 치명적인 질병에 대한 치유법은 아직 없다. HIV 바이러스는 계속하여 돌연변이되고, 역전사효소 저해제 및 프로테아제 저해제와 같은 현존하는 약물에 대해 내성을 가지게 된다. 최근에는, 2 또는 3가지의 항 HIV 약물을 조합하여 이용하는 치료법이 AIDS 환자내의 HIV 부담을 상당히 낮추는 데에 효과적이라는 것이 발견되었다. 그 결과는 가망성이 보여졌다. 그러나, 바이러스는 계속하여 약물에 대한 내성을 발달키고 있으며, 장기적인 성과(생존 및 치료율)는 아직 미지수이다. 따라서 전세계의 의료 집단은, HIV 감염을 예방하고, HIV 보균자를 치료하여 말기의 치명적 AIDS로 진행하는 것을 방지하고, AID 환자를 치료할 수 있는 약물을 계속하여 찾고 있다·
생약
허브 약물의 이용 및 민간 의료는 중국에서 수천년간 알려져 온 것이다. 관절염에서 바이러스 감염까지 수많은 병의 치료에 대한 이러한 약초적 접근에 대해 이전에 서양 의학은 효과없고 위험한 것이라고 판단하였다. 19세기 동안, 허브를 함유하는 많은 가정 의약품들이 특허되고 판매되었다. 현대의 의약은 이러한 의약품들을 대신하였지만, 많은 현대의 의약들은 허브로부터 유래된 성분들을 함유한다. 예를 들어, 1776년에, 영국 식물학자이자 의사인 월리암 위더링은, 늙은 농부가 만든 허브 차가 심장이 충분히 강하게 펌핑할 수 없음으로써 생기는 수종 또는 조직 내의 과잉 수분을 치료하는 데 효과적이라는 것을 알았다. 그는 폭스글로브 식물의 잎으로 만든 차의 한 성분이 심장의 펌핑 능력을 강화한다는 것을 발견하였다. 폭스글로브로 만든 약물은 현재 디기탈리스라고 알려져 있다.
민간 의료는 서양에서는 비교적 현대적 용어이며, 여러 가지 생약을 통하여 병을 치료하고 간호하는 것을 의미하는 것으로 되었다. 최근 수년간, 민간 의료는 서양의 과학적 의료 집단의 많은 사람들에게 관심이 증가되고 있다.
종래기술의 생약
AEGINETIAE HERBA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로, 인후 팽대 및 통증, 요로 감염증, 골수염, 부스럼, 편도염, 갑상선종, 인두염, 갑상선염, 장염, 간 질환, 암, 류마티즘, 토혈증, 신경쇠약, 안구 충혈, 치핵, 월경 불순, 수종, 황달, 탈장, 뱀교상, 및 소아 발달 지연 등과 같은 병의 치료에 사용되어 왔다. AEGINETIAE HERBA는 Orobanchaceae과에 속하는 Aeginetia indica 식물 전체를 말린 것으로부터 제조된다. 말린 식물을 이용하는 치료 투여량은 4 내지 150g/일이 보통이다. 그 식물은 쓴 맛이 나고, 독성이라는 것을 주의해야 한다.
오쿠보(Okubo) 등은 Aeginetia indica의 씨앗으로부터의 인산완충식염수 (PBS) 추출물(주위 온도 4℃에서 pH 7.2)이 탁월한 항암 효과를 나타내며, 인터류킨-2 및 인터페론-γ유도 효능을 갖는다는 것을 개시하고 있다. PBS는, 칼슘이나 마그네슘 이온을 함유하지 않는, pH 7.2의 0.1M 인산완충 생리식염수이다. 추출된 물질은, 추출이 부탄올을 사용하여 행해졌는가 페놀을 사용하여 행해졌는가에 따라서 단백질과 결합한 지방 A를 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 거대분자 다당류라고 설명된다. 추출된 물질은 물에 가용성이며, n-부탄올에는 불용성이다. 그것의 분자량은 100,000 내지 200,000 달톤의 범위 내이다. S.Okubo, M.Sato, & K.Himeno, 미국특허 제5,366,725호, 1994년 11월 22일에 발행 참조.
BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 열, 농양, 단독, 인후 팽대 통증, 두통, 황달, 페스트, 백대하 및 매독과 같은 수많은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다.
BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX는 Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica 또는 Polygonum tinctorium의 뿌리 및 뿌리줄기를 말린 것으로부터 제조된다. 이 생약은 생체 외에서 인플루엔자 바이러스의 저해작용을 나타내는 것으로 보고되고 있다. Isatis tinctoria의 뿌리를 물에서 끓여서 전출한 것 또한 항세균 효능을 나타내었다. Baphicacanthes cusia 및 Strobilanthes cusia는 Acanthaceae과에 속한다. Isatis tinctoria 및 Isatis indigotica는 Cruciferae과에 속한다. Polygonum tinctorium은 Polygonaceae과에 속한다. 치료 투여량은 보통 BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX 10 내지 19g/일이다.
호(Ho) 등은 Isatis tinctoria를 포함하는 허브 혼합물로부터의 추출물이, 생체외에서 사람 T 임파구 세포와 단핵 식세포 계열 세포 내에서 HIV 감염을 저해하는데 이용된다는 것을 개시하고 있다. 그 활성은 3가지 허브: Isatis tinctoria(또는 Isatis indigotica), Lonicera japonica, 및 Polygonum bistorta의 혼합물로부터의 물 추출물의 시험결과에 기초한다. D.D.Ho & X.S.Li, 미국특허 제5,178,865호(1993년 1월 12일 발행) 참조.
트립탄트린으로 알려진 화합물은 Strobilanthes cusia의 잎 내의 주요 항진 균제로, 그리고 Polygonum tinctorium 및 Isatis tinctoria의 잎 내의 주된 항피부병 물질로 확인되었다. H.Y.Hsu, Y.P.Chen, & M.Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Vol, 2, Oriental Healing Arts lnstitute, Los Angeles, California, U.S.A., 758-759 (1985) 참조.
BLECHNI RHIZOMA로 알려진, 또한 DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA라고도 알려진 중국산 생약은 전통적으로 벤 상처, 종창, 열, 홍역 및 단독과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. BLECHNI RHlZOMA는 Polypodiaceae 또는 Blechnaceae과에 속하는 Blechnum orientale의 줄기 및 뿌리 말린 것으로부터 제조된다. DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE RHIZOMA는 Aspidiaceae과에 속하는 Dryopteris crassirhizoma의 뿌리 및 줄기 말린 것으로부터 제조된다. Osmunda japonica(Osmundaceae과), Woodwardia orientalis 및 Woodwardai unigemmata(Blechnaceae과), Athyrium acrostichoides(Aspidiaceae 또는 Athyriaceae과), Sphaeropteris lepifera(Cyatheaceae과), Cyrtomium falcatum, 및 Cyrtomium fortunei(Aspidiacea과) 또한 이들 생약의 제조에 사용되어 오고 있다. 이들 생약은 쓴맛 및 떫은 맛이 나며, 약간의 독성이다. 치료 투여량은 통상 4 내지 11g/일이다.
Blechnum orientale은 인플루엔자 바이러스에 대한 강한 저해 작용을 또한 나타낸다. Dryopteris crassirhizoma 내에서 발견되는 필마론, 필리신, 아스피딘, 알바스피딘, 및 필릭산은 구충 효과를 갖는 것으로 특성화되었다. H.Y.Hsu, Y.P.Chen, S.G.Hsu,. J.S.Hsu, C.J.Chen,& H.C.Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, R.O.C., 577-578(1985); 그리고 H.Y.Hsu, Y.P.Chen, & M.Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 249-250 (1982) 참조.
호즈미(Hozumi) 등은 항헤르페스바이러스제, 항폴리오바이러스제, 및 항수두대상포진바이러스제로서 Dryopteris crassirhizoma의 뿌리줄기를 개시하고 있다. Cyrtomium fortunei의 뿌리줄기 및 Woodwardia orientalis의 뿌리줄기 또한 항 DNA 및 항 RNA 바이러스제로서 뿐만 아니라, 항헤르페스바이러스제, 항폴리오바이러스제, 항홍역바이러스제, 항수두대상포진 바이러스제 및 항시토메갈론바이러스(CMV)제로서 개시되었다. T.Hozumi, T.Matsumoto, H.Ooyama, T.Namba, K.Shiraki, M.Hattori, M.Kurokawa, & S.Kadota, 미국특허 제5,411,733호(1995년 5월 2일 발행) 참조.
BLETILLAE TUBER로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 객혈, 비출혈, 토혈중, 농양, 화상, 건조하고 갈라진 피부, 결핵, 위궤양, 및 통증과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. BLETILLAE TUBER는 수렴, 항세균 및 항진균 특성을 갖는다. BLETILLAE TUBER는 Orchidaceae과에 속하는 Bletilla striata의 괴경 말린 것으로 부터 제조된다. BLETILLAE TUBER는 쓰고도 단 맛과 떫은 맛이 나고 무독성이다. 치료 투여량은 보통사람에 대하여 보통 2 내지 11g/일이다.
CIRSII RHIZOMA ET RADIX 및 BREEAE RADIX로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 토혈증, 감염성 급성 간염, 상처 출혈, 통증 및 농양과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. CIRSII RHIZOMA ET RADIX는 Compositae과에 속하는 Cirsim japonicum, Cirsium albescens, 및 Cirsium japonicum 변종 australe과 같은 식물의 식물 전체 또는 뿌리 또는 뿌리줄기를 말린 것으로부터 제조된다. BREEAE RADIX는 Breea segetum(Cephalanoplos segetum으로도 알려짐) 및 Breea setosum과 같은 Compositae과 식물의 뿌리 말린 것으로부터 제조한다. 두 생약은 달고 약간 쓴 맛이나며, 무독성이다. 치료 투여량은 보통사람에 있어서 보통 5 내지 75g/일이다.
DICHONDRAE HERBA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 황달, 이질, 임질, 수종, 수종 부스럼, 경련, 뇌염, 류마티즘, 탈장, 진성 당뇨, 및 고혈압과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. DICHONDRAE HERBA는 Convolvulaceae과에 속하는 Dichondra repens 또는 Dichondra micrantha의 식물 전체를 말린 것으로부터 제조된다. 이 식물은 쓴맛이 나며 무독성이다. 말린 식물의 치료 투여량은 보통 10 내지 40g/일이다. Dichonadra micrantha 약초 전체의 n-헥산 및 에탄올 추출물로부터 분리된 9가지 화합물이 확인되었다. 이들 화합물들은 말톨, 움벨리페론, 스코폴레틴, 움벨리페론-7-O-글루코피라노시드, 스코폴린, 아스트라갈린, 이소퀘르시트린, 카엠프페롤-3-O-루티노시드, 및 퀘르세틴-3-O-루티노시드이다. C.-J. Chou, L.-C. Lin, S.-Y. Hsu and C.-F. Chen, J. Chin. Med., 4(2), 143-149 (1989) 참조.
FORSYTHIAE FRUCTUS로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 궤양, 농양, 림프절종창, 요도염 및 고혈압과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. 또한 이것은 몇몇 세균 및 인플루엔자바이러스를 저해한다는 것도 발견되었다. FORSYTHIAE FRUCTUS는 Oleaceae과에 속하는 Forsythia suspensa, Forsythia viridissima 또는 Forsythia koreana의 건조된 익은 과실로부터 제조된다. 이 생약은 맛이 쓰고 무독성이다. 치료 투여량은 전형적으로 3 내지 11g/일이다.
호즈미 등은 Forsythia suspensa의 과실이 폴리오바이러스 및 홍역바이러스 감염을 치료하는 데 유용한 항폴리오바이러스제 및 항홍역바이러스제라고 개시하고 있다. T. Hozumi, T. Matsumoto, H.Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa 및 S. Kadota, 미국특허 제5,411,733호 (1995년 5월 2일 발행) 참조.
화합물 포르시토시드 A(Forsythia suspensa의 잎에서 발견됨), 포르시토시드B(Forsythia koreana의 줄기에서 발견됨) 그리고 포르시토시드 C 및 포르시토시드 D(Forsythia suspensa의 과실에서 발견됨)는 2mM 미만의 농도에서 Staphylococcus aureus에 대해서 항세균활성을 나타내는 것으로 보고되었다. 또한 수스펜사시드 (Forsythia suspensa의 과실에서 발견됨, 포르시토시드 C와 동일할 것 같음)는 2.6㎎/mL의 최소저해농도(MIC)로 Staphylococcus aureus Terashima에 대해서 항세균활성을 나타내는 것으로 보고되었다. H.Y. Hsu, T.P. Chen & M. Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Vol.2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 53-55, 142-143 (1985) 참조.
HEDYOTIS(OLDENLANDIAE HERBA로도 알려짐)로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 요도감염, 인두염, 후두염, 편도염, 아급성 또는 만성 미골통, 충수염, 장암, 좌상성 손상 및 눈병과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. 또한 이것은 시험관내에서 약한 항세균활성을 갖는다는 것도 발견되었다. HEDYOTIS는 Rubiaceae과에 속하는 Hedyotis diffusa(Oldenlandia diffusa로도 알려짐)의 건조 식물 전체로부터 제조된다. 이 생약은 맛이 달고 무독성이다. 치료 투여량은 전형적으로 19 내지 300g/일이다.
LESPEDEZAE HERBA 및 SENECINIS HERBA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 요실금, 임질, 천식, 위통, 전신 무력감 및 탈진, 설사, 좌상성 손상, 눈병, 안구 충혈, 신질환, 급성 염증성 질환, 백내장, 이질, 장염, 황달, 유행성 감기, 패혈증, 궤양, 종창 및 수장질환과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. LESPEDEZAE HERBA는 Leguminosae과에 속하는 Lespedeza cuneata의 건조 식물 전체로부터 제조된다. SENECINIS HERBA는 Compositae과에 속하는 Senecio scandens의 건조 식물 전체로부터 제조된다. Lespedeza cuneata 및 Senecio scandens의 추출물은 항세균효과를 갖는 것으로 증명되었다. 이 두 허브는 맛이 시고 떫고 쓰다. 치료 투여량은 전형적으로 4 내지 40g/일이다.
LIGUSTRI FRUCTUS로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 강장제로서 사용되어 왔고 또한 불면증, 변비증, 새치, 경부핌프절결핵증 및 수증과 같은 병을 치료하는데 사용되어 왔다. LIGUSTRI FRUCTUS는 Oleaceae과에 속하는 Ligustrum lucidum 또는 Ligustrum japonicum의 건조된 익은 과실로부터 제조된다. Ligustrum lucidum의 잎은 해열, 진통 및 항염증제로서 사용되어 왔다. 또한 Ligustrum japonicum의 잎은 안통, 궤양성 구내염, 유방염, 종창 및 화상과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. Ligustrum lucidum의 과실은 맛이 쓰고 무독성이다. 건조 과실의 치료 투여량은 전형적으로 6 내지 20g/일이다. 건조 잎의 치료 투여량은 전형적으로 40 내지75g/ 일이다.
LONICERAE FLOS로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 열병, 급성 감염병, 홍역, 옹종, 이질, 장염, 백선 및 유사 피부질환과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. LONICERAE FLOS는 Lonicera japonica 또는 Lonicera coonfusa의 건조 꽃눈으로부터 제조된다. 이 두 식물은 Caprifoliaceae과에 속한다. Loniceera japonica의 꽃은 이뇨, 해열, 항염증, 항경련, 항세균 및 항바이러스 특성을 갖는다. 또한 꽃눈은 이뇨제로서 사용되어 왔다. 이 생약은 맛이 달고 무독성이다. 치료 투여량은 일반인에 대해 전형적으로 11 내지 75g/일이다.
호 등은 Lonicera japonica, Isatis tincrotia(또는 Isatis indigotica) 및 Polygonum bistorta의 혼합물 또는 Lonicera japonica 및 Scutellaria baicalensis의 혼합물의 시험관내 항 HIV 활성을 개시하고 있다. 항 HIV 활성 조성물의 제조를 위한 이 혼합물의 물추출, 에탄올침전처리 및 목탄흡착이 개시되어 있다. D.D. Ho 및 X.S. Li, 미국특허 제5,178,865호 (1993년 1월 12일 발행) 참조. Lonicera japonica로부터 분리된 카페오일퀴네이트와 같은 몇몇 탄닌은 HIV-1 역전사효소활성에 대한 저해효과를 갖는 것으로 보고되었다. C.-W. Chang, M.-T. Lin, S.-S. Lee, K.C.S.C. Liu, F.-L. Hsu, & .J.-Y. Lin, Antiviral Research, 27, 367-374 (1995) 참조.
Lonicera japonica 꽃눈 및 Fosythia suspensa 과실의 수성 추출물과 Scutellaria baicalensis로부터의 조(粗)플라베노이드의 혼합물은 항세균 및 항바이러스 특성을 갖는 것으로 증명되었다. 심한 호흡기질환 환자의 군을 이 혼합물로 치료한 바, 콘트롤군 뿐만 아니라 이들 군도 표준 항생물질요법에 대해 응답하였다. P.J. Houghton, Z. Boxu, & Z. Xisheng, Phytother. Res., 7, 384-386 (1993) 참조.
PHELLODENDRI CORTEX로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 이질, 설사, 황달, 혈변, 복통, 소화불량, 박테로이드 장염 및 유결핵설사와 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. 또한 이 생약은 세안제를 제조하고 위 및 장을 강화시켜 식욕을 자극하는 데에도 사용되어 왔고 수렴제, 항염증제 등으로서도 사용되어 왔다. 이것은 항세균, 항염증 및 창상치유 특성을 갗는다. PHELLODENDRI CORTEX는 Phellodendron amurense, Phellodendron chinense, Phellodendron amrense 변종 sachalinense 및 Phellodendron wilsonii와 같은 Rutaceae과 식물의 건조 피층으로부터 제조된다. PHELLODENDRI CORTEX는 맛이 쓰고 무독성이다. 치료 투여량은 전형적으로 1 내지 11g/일이다.
호즈미 등은 항헤르페스바이러스제, 항폴리오바이러스제, 항홍역바이러스제, 항수두대상포진바이러스제 및 항 CMW제로서의 Phellodendron amurense의 수피를 개시하고 있다. T. Hozumi, T. Matsumoto, H.Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, 미국특허 제5,411,733호 (1995년 5월 2일 발행) 참조.
POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 이질, 월경과다, 월경곤란, 배뇨곤란, 영아성장지연 및 충수염과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA는 Polygonaceae과에 속하는 Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum, 또는 Polygonum reynoutria(Reynoutrua japonica로도 알려짐)의 건조 뿌리줄기로부터 제조된다. 또한 어린 잎은 좌상 및 벤 상처를 치료하는 데에도 사용되어 왔다. 이 생약의 추출물은 시험관내에서 항세균 및 항바이러스효과를 나타내었다. 이 생약의 과다 사용은 경미한 설사를 유발할 수 있다. 이 생약은 맛이 쓰고 치료 투여량은 전형적으로 6 내지 40g/일이다.
호즈미 등은 항헤르페스바이러스제, 항폴리오바이러스제, 항수두대상포진바이러스제 및 항 CMV제로서의 Polygonum cuspidatum의 뿌리 및 뿌리줄기를 개시하고 있다. T. Hozumi, T. Matsumoto, H.Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, 미국특허 제5,411,733호 (1995년 5월 2일 발행) 참조.
레스베라트롤은 Polygonum cuspidatum 뿌리중의 항진균 및 항세균 성분으로 서 보고되었다. H.Y. Hsu, Y.P. Chen & M. Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Vol.2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 51 (1985) 참조.
PRUNELLAE SPICA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 갑상선종, 치질, 종창성 눈, 안통, 임질, 자궁질환, 유방염, 유방농양, 유방암, 만성 관절염, 결막염 및 고혈압과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. PRUNELLAE SPICA는 Prunella vulgaris 또는 Prunella vulgaris 아종 asiatica(Prunella vugaris 변종 lilachina로도 알려짐)의 건조 이삭 또는 식물 전체로부터 제조된다. 이 두 식물은 Labiatae과에 속한다. 식물 전체가 이뇨제로서 사용될 수 있고 또한 시험관내에서 항세균효과를 갖는다. 이 생약은 맛이 쓰고 무독성이다. 치료 투여량은 보통사람에 대해 전형적으로 4 내지 110g/일이다.
호즈미 등은 헤르페스바이러스 감염을 치료하기 위한 항헤르페스바이러스제로서의 Prunella vulgaris의 이삭을 개시하고 있다. T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, 미국특허 제5,411,733호 (1995년 5월 2일 발행) 참조. 또한 Prunella vulgaris의 물 추출물(물 100mL중의 3g을 45분 동안 비등시킴)은 항 HIV(균주 H9/3B) 활성을 갖는 것으로도 보고되었다. 또한 이 추출물은 지도부딘(AZT) 및 디다노신(ddI)과 함께 상승적 항 HIV 활성을 나타내었다. Prunella vulgaris와 잘시타빈(ddC)에 대해서는 단지 경미한 부가효과만이 관찰되었다. J.F. John, R. Kuk, & A. Rosenthal, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol., 94, 481 (1994) 참조.
야마사키(Yamasaki) 등은 일본에서 통용되고 있는 204가지의 조약(組藥)을 시험관내에서 항 HIV-1 활성에 대해 평가하고 Prunella vulgaris(이삭)의 뜨거운 물 추출물이 16㎍/mL,의 IC100으로 강한 시험관내 항 HIV-1 활성을 나타낸다고 보고하였다. K. Yamasaki, T.Otake, H. Mori, M. Morimoto, N. Ueba, Y. Kurokawa, K. Shiota,& T. Yuge, Yakugaku Zasshi, 113(11),818-824 (1993) 참조.
야오(Yao) 등은 Prunella vulgaris의 건조 식물 전체의 물 추출물이 MT-4 세포에 대해 비교적 적은 세포독성으로 시험관내에서 HIV-1 복제를 저해하는 데 있어서 활성이었다고 보고하였다. 또한 이 추출물은 역전사효소 저해에서도 활성이었다. 이 활성인자는 정제되었고 약 10,000달톤의 분자량을 같는 음이온물질로서 동정되었다. 이 활성성분은 타바(Tabba) 등에 의한 하기 기재와 같이 푸르넬린과 동일한 것일 수 있다. 정제된 추출물은 각각 6, 30 및 12.5㎍/mL의 유효농도에서 림프세포주 MT-4, 모노시토이드세포주 U937 및 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 HIV-1 복제를 저해하였다. 바이러스에 노출되기 전에 이 추출물로 비감염 세포를 사전처치하면 HIV-1 감염이 방지되지 않았다. 정제된 추출물과 함께 HIV-1을 사전배양하면 감염률이 극적으로 감소되었다. 또한 정제된 추출물은 HIV-1의 세포 대 세포 전이를 차단하고, 신티튬 형성을 방지하고, HIV-1 과 정제 gp120이 둘 다 CD4에 결합하는 능력을 저해할 수 있었다. PCR(중합효소연쇄반응)분석으로, 이 추출물의 존재하에서는 바이러스에 노출된 세포에 HIV-1 프로바이러스 DNA가 존재하지 않음이 확인되었다. 이 결과는 정제된 추출물이 CD4 리셉터에 대한 부착을 방지함으로써 감수성 세포의 HIV-1 감염에 대해 길항작용하였음을 제안해주었다. X.J. Yao, M.A. Wainberg, & M.A. Parniak, Virology, 187(1), 56-62 (1992) 참조.
타바 등은 Prunella vugaris의 건조 꽃의 수성 추출물로부터 항 HIV 성분인 프루넬린을 분리하고 부분적으로 특성화하였다. 프루넬린은 시험관내에서 항 HIV-1에 대해 2.2㎍/mL의 MIC(최소저해농도)를 갖는 탄수화물이다. 이것은 약 10,000달톤의 분자량을 갖는 부분황화 다당류로서 동정되었다. H.D. Tabba, R.S. Chang, & K.M. Smith, Antiviral Research, 11, 263-273 (1989) 참조.
정(Zheng)은 472가지의 전통적 약초를 타입 1 단순포진바이러스(HSV1)에 대한 효과에 대해 평가하였다. Prunella vulgaris는 시험관내에서 아주 유효한 것으로 발견된 1O가지 허브중 하나이었다. 임상적으로, HSV1로 인한 헤르페스성 각막염 78건을 Prunella vugaris 및 Pyrrosia lingua 점안제로 치료하였다. 이들 중,38건은 효과적으로 치료되었고, 37건은 개선을 보였고,3건은 전혀 이점이 없었다. M. Zheng, J. Tradit. Chin. Med., 8(3), 203-206 (1988) 참조.
Prunella vulgaris로부터 분리된 트리테르펜 1 및 트리테르펜 2는 HSV-1에 대해 항세균활성을 나타내었다. 트리테르펜 1은 베툴린산으로서 동정되고 트리테르펜 2는 2α,3α-디히드록시우르스-12-엔-28-오산으로서 동정되었다. EC50은 플라크 감소분석에 의해 트리테르펜 1에 대해서는 30㎍/mL로, 트리테르펜 2에 대해서는 8㎍/mL로 추정되었다. S.Y. Ryu, C-K, Lee, C.O. Lee, H.S. Kim, & O.P. Zee, Arch. Pharmacal Res.(Seoul), 15(3), 242-245 (1992) 참조.
SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 토혈, 혈흔이 있는 임질, 궤양, 암, 경련, 폐렴, 장염, 미골통, 충수염, 천식, 말라리아 및 류마티즘과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. 또한 이것은 항세균효과를 갖는 다는 것도 발견되었다. SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA는 Labiatae과에 속하는 Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis 또는 Scutellaria dependens의 건조 식물 전체로부터 제조된다. 이 생약은 맛이 쓰고 빈혈이 있는 자는 복용해서는 않된다. 임신부도 이 허브의 복용을 피해야 한다. 치료 투여량은 전형적으로 4 내지 300g/일이다.
Scutellaria rivularis의 건조 식물 전체는 중국 및 대만에서 종양, 간염, 간경변 및 기타 질환의 치료를 위한 민간의료에 사용되어 왔다. Y.L. Lin, Y.H. Kuo, G.H. Lee, and S.M. Peng, J. Chem. Research (S), 320-321 (1987) 참조.
Scutellaria rivularis의 허브 전체로부터 분리된 아피게닌은 항인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 것으로 발견되었다. T. Nagai, et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), 1329-1332 (1990) 참조.
SOLANI HERBA로 알려진 중국산 생약은 전통적으로 종기, 급성 신장염, 암 및 궤양과 같은 병을 치료하는 데 사용되어 왔다. SOLANI HERBA는 Solanaceae과에 속하는 Solanum nigrum의 건조 식물 전체로부터 제조된다. SOLANI HERBA의 추출물은 입증된 항염증 특성을 갖는다. 또한 과실은 기침을 억제하고 기관지염증을 완화시키는 효과가 입증되었다. 이 생약은 맛이 쓰고 약간 달며, 무독성이다. 치료 투여량은 전형적으로 11 내지 60g/일이다.
화합물 솔라소닌(Solanum nigrum의 허브 전체, 과실, 잎 및 신선한 미숙 베리류에서 발견됨)은 코르티손과 유사한 항염증효과를 갗는다. 솔라소닌 및 솔라닌(Solanum nigrum에서도 발견됨)은 동물의 상태에 따라 래트의 혈당 레벨을 상승 또는 저하시키는 능력을 갖는다. 또한 솔라소닌은 심장자극효과를 갖는 데 대하여, 솔라닌은 억제효과를 갖는다. 솔라소닌은 소량으로 투여될 때는 동물(즉, 래트 및 토끼)중추신경계의 자극과정을 향상시킨다. 한편, 솔라소닌은 다량으로 투여될 때는 억제과정을 향상시킨다. 또한 솔라소닌은 혈액응고성을 저하시킬 수도 있다.
(1) H.Y. Hsu, Y.P. Chen, S.G. Hsu, J.S. Hsu, C.J. Chen,& H.C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, R.O.C., 176-177 (1985); (2) H.Y. Hsu, Y.P. Chen, ＆ M. Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A, 1400-1401, 1406 (1982); 및 (3) H.Y. Hsu, Y.P. Chen, ＆ M. Hong, The Chemical Constituents of Oriental Herbs, Vol.2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 742 (1985) 참조.
LONICERAE FLOS, BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX 및 FORSYTHIAE FRUCTUS와 같은 생약의 조합물은 해열제 및 해독제로서 그리고 급성 간염을 치료하는 데 사용되어 왔다. 생약 BLECHNI RHIZOMA 및 POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMA는 B형 간염을 치료하기 위한 처방에서 다른 생약과 병용되어 왔다. 생약 SCUTELLARIAE BARBATAE HERBA 및 LIGUSTRI FRUCTUS는 치료 개선을 위해 상기 처방에 다른 생약과 함께 가해진 경우도 있었다. 생약 LIGUSTRI FRUCTUS는 주로 강장제로서 다른 생약과 병용되어 왔고 생약 HEDYOTIS는 해독제로서 다른 생약과 병용된 경우도 있었다. 또한 생약 PRUNELLAE SPICA는 간 긴장을 완화시키기 위해 다른 생약과 병용되어 왔다.
창(Chang) 및 영(Yeung)은 27가지 약초의 비등수 추출물을 항 HIV 활성에 대해 스크리닝하였다. 이들은 추출물중 11가지는 H9 세포에서 HIV를 저해하는 데 활성임을 발견하였다. 활성인 것들 중에서 Lonicera japonica, Prunella vulgaris, Woodwardia unigemmata 및 Senecio scandens는 중간 활성을 갖는 것이었다. 시험한 것들 중에서 Forsythia suspensa, Isatis tinctoria 및 Polygonum cuspidatum은 항 HIV 분석에서 활성을 나타내지 않았던 것이었다. Viola yedoensis의 항 HIV 활성 추출물은 더 시험한 바, 상당히 특이적임이 발견되었다. 이 추출물은 세포외에서는 HIV를 불활성이게 하지 않았고 단순포진바이어스, 폴리오바이러스 또는 소수포성구내염바이러스의 성장을 저해하지 않았다. R.S. Chang ＆ H.W. Yeung, Antiviral Research, 9, 163-175 (1998) 참조.
항세균제는 Syzygium aromaticum, Sapium sebiferum, Scutellaria baicalensis 및 Scutellaria rivularis로부터 분리되어 왔다. Syzygium aromaticum으로부터 분리된 에우게니인(탄닌) 및 Sapium sebiferum으로부터 분리된 갈락트산메틸은 시험관내에서 항단순포진바이러스 활성을 나타내었다. 또한 Scutellaria baicalensis 뿌리로부터의 5,7,4'트리히드록시-8-메톡시플라본 및 Scutellaria rivularis 허브 전체로부터의 아피게닌(5,7,4'-트리히드록시플라본)과 같은 식물 플라베노이드는 항인플루엔자바이러스 활성을 갖는 것으로 보고되었다. (1) T. Hozumi, et al., 미국특허 제5,411,733호 (1995); (2) M.Takechi & Y. Tanaka, Planta Medica, 42, 69-74 (1981); (3) C.J.M. Kane, et al, Bioscience Reports, 8, 85-94 (1998); 및 (4) T. Nagai, et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), 1329-1322 (1990) 참조.
호즈미 등은 91가지 생약을 연구하여 항세균 활성을 입증하였다. 보다 구체적으로는, 이들 중 52가지는 항헤르페스바이러스 활성을, 64가지는 항폴리오바이러스 활성을, 37가지는 항홍역바이러스 활성을 27가지는 항수두대상포진바이러스 활성을, 23가지는 항 CMV 활성을, 28가지는 항 DNA 바이러스 및 항 RNA 바이러스 활성을 가졌다. T. Hozumi, T. Matsumoto, H.Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, 미국특허 제5,411,733호 (1995년 5월 2일 발행) 참조. 특허 제5,411,733호에 개시된 28가지 생약의 항 DNA 바이러스 및 항 RNA 바이러스 활성은 이들의 항헤르페스바이러스, 항폴리오바이러스, 항홍역바이러스, 및/또는 항수두대상포진바이러스 및 항 CMV 활성에 의거한 것이었다. 그러나, 항 DNA 바이러스 활성과 항 RNA 바이러스 활성 둘다를 커버하는 외삽은 수행된 실험으로부터는 발견되지 않는다.
이하에 나타낸 본 발명의 데이터에 의해, Cyrtomium fortunei의 뿌리줄기 및 Phellodendron anurense의 수피로부터 유래되는 2가지 생약은 2.5 및 0.5mg/mL에서 항 HIV 활성이 거의 없거나 또는 전혀 없음이 증명되었다. 이와 달리, Prunella vulgaris의 이삭, Forsythia suspensa의 과실, 및 Polygonum cuspidatum 의 뿌리줄기를 사용하는 3가지 생약은 2.5㎎/mL에서 강한 항 HIV 활성 내지 중간의 항 HIV 활성을 갖는 것이 증명될 것이다. 또한 Prunella vulgaris는 매우 양호한 항 HIV 활성을 갖는다는 것이 상기한 바와 같은 다른 사람들에 의해 보고되었다.
전통적 중국의약의 관행에서는 생약이 질환 또는 원인물질 자체가 아니라 환자의 증상을 치료하는 데 사용되었고, 따라서 특정 질환에 특이적이라고는 알려져있지 않음에 주의한다. 생약은 각 환자의 증상에 따라 처방되었다. 또한 생약의 조성은 하나하나 변화되고 각 치료결과에 따라 치료과정 동안 각각의 환자에 대해 완전히 변경될 수 있다. 따라서 특정 질환을 치료하는 데 적합한 종래기술의 특정 본초 조성을 설명하기는 매우 어렵다.
본 발명은 항바이러스성 허브 조성물, 그것의 추출물 및 그것의 활성 화학성분의 발견에 관한 것이다. 본 발명의 항바이러스성 허브 조성물은 각각의 허브, 허브 혼합물 및 시중에서 입수가능한 중국산 생약으로부터 유래된다. 신규한 이들 허브 조성물과 그것의 추출물 및/또는 유효성분은 HBV 및 HCV 보균자, B형 간염, C형 간염, HIV 감염 및 AIDS와 같은 바이러스질환에 대해 활성이라고 본 명세서에 입증되어 있다.
본 출원은, 일련 번호 60/016,100이며 "항바이러스제"("ANTI-VIRAL AGENTS")라는 명칭을 갖는 1996년 7윌 9일에 출원된 가출원과; 일련 번호 60/021,467이며 "중국산 약초로부터의 항바이러스제"("ANTI-VIRAL AGENTS FROM CHINESE MEDICINAL HERBS")라는 명칭을 갖는 1996년 7월 10일에 출원된 가출원에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은, 중국산 생약(herbal medicine), 약용 식물 및 그 추출물로부터 유래하는, 항바이러스 활성성분을 포함하는 조성물과, 바이러스, 특히 B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 및 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 감염된 사람과 동물을 치료하기 위한 그것의 사용에 관한 것이다. 더 상세히는, 본 발명의 조성물은, 오랜 역사동안 사람이 소비해 온 다양한 중국산 생약 또는 약용 식물로부터 유래한다. 본 발명의 조성물은 특정한 기술을 통하여 얻어지며, 사람 HBV 보균자와 C형 감염 환자를 치료하는 효능이 현저함이 증명되었다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 쥐 백혈병 바이러스(MuLV) 및 HIV에 대해 생체외 항바이러스 활성을 보이고 있다. HIV는 사람에게 후천성 면역 결핍증(AIDS)을 일으키는 것으로 알려진 바이러스이고, AIDS는 의료 집단에 본 발명이 제기하는 특별한 문제점을 제기한다. 개별적인 항바이러스 활성 생약 또는 약용 식물 또는 그 추출물의 유효성분은 특정한 분리 기술올 통하여 분리되며 일반적으로 용인된 화학적 기술을 이용하여 특성화된다.
당업자가 본 발명의 원리에 정통하기 위해서는, 본 명세서의 일부를 이루는 첨부 도면을 참조한다.
도 1은 산 형태의 No.5(5)E-A의 1회 정제된 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-A-AP1X의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이다. 여기서 No.5(5)E-A는 No.5(5)의 C18-SPE-LC 물용출 분획이다.
도 2는 산 형태의 No.5(5)E-C의 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-C-AP의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이다. 여기서 No.5(5)E-C는 No.5(5)의 C18-SPE-LC 1% HCl/물용출 분획이다.
이들 도 1 및 도 2에 대해, HPSEC(고성능 크기배제 크로마토그래피)분석용 칼럼은 TSK PWXL가드 칼럼(6.0mm ID×4.0cm L)과 직렬로 연결된 Varian MicroPak TSKge1-G3000 PWXL칼럼(7.8mm ID×30cm L)이고, 이동상은 유량 0.80mL/분의 0.1N NH4HCO3이고, 시료는 O.92 내지 O.93mg/mL의 이동상에서 제조되고, 주사용량은 100μL이었다.
도 3A는 No.5(5)E-A-AP1X의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이고 도 3B는 RI프로파일이다. 수집된 HPSEC 분획을 6-18 및 7-12로서 나타낸다.
도 4A는 No.5(5)E-C-AP의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이고 도 4B는 RI 프로파일이다. 수집된 HPSEC 분획을 6-18 및 7-12로서 나타낸다.
도 3A,3B,4A 및 4B의 HPSEC 조건은 시료농도가 6.1 내지 6.2mg/mL이었던 것을 제외하고는 도 1 및 2에 대한 것과 동일하였다.
도 5A는 No.5(5)E-C-AP의 크로마토그래피로 정제된 HPSEC 분획 8의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이고 도 5B는 RI 프로파일이다. HPSEC 조건은 이동상이 O.2N NH4HCO3이고 시료농도가 O.55mg/mL이었던 것을 제외하고는 도 1 및 2에 대한 것과 동일하였다.
도 6A는 크로마토그래피로 정제된 No.5(5)E-C-AP HPSEC 분획 8의 214nm에서 의 C18-HPLC UV 프로파일이고 도 6B는 No.5(5)E-C-AP HPSEC 분획 9의 것이다. C18-HPLC(옥타데실 고성능 액체크로마토그래피)분석용 칼럼은 Rainin Microsorb-MVC18 칼럼(입자 5㎛, 공극크기 100Å, 4.6mm ID×25cm L)이고, 이동상은 유량 O.8OmL/분의 3O% 에탄올을 함유하는 O.1N NH4HCO3이고, 시료는 1.Omg/mL의 이동상에서 제조되고, 주사용량은 5μL이었다.
도 7은 암모늄염 형태의 No.5(5)E-A의 1회 정제된 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-A-AP1X-NH4의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이다.
이 도 7과 이하의 도 13 및 17에 대한 HPSEC 조건은 이동상이 30% 아세토니트릴을 함유하는 O.3N NH4HCO3이고 시료가 O.3N NH4HCO3에서 제조되고 시료농도가 도 7에 대해서는 O.65mg/mL, 도 13 및 도 17에 대해서는 1.4mg/mL이었던 것을 제외하고는 상기 도 1 및 2에 대한 것과 동일하였다.
도 8은 암모늄염 형태의 No.5(5)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-AP1X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다.
이 도 8과 이하의 도 14, 18, 21, 24 및 27에 대한 HPSEC 조건은 시료농도가 1.0mg/mL이고 주사용량이 50μL이었던 것을 제외하고는 도 1 및 도 2의 것과 동일하였다.
도 9는 암모늄염 형태의 No.5(5)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분 No.5(5)E-AP1X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다.
이 도 9와 이하의 도 15, 19, 22, 25 및 28에 대해, RP-HPLC(역상 고성능 액체크로마토그래피)분석에 사용된 칼럼은 PerSeptive Biosystems의 POROS R2/H 칼럼(4.6mm ID×1Ocm L)이고, 이동상은 2.0mL/분의 유량에서 도 17의 구배에 따라 2% 내지 60%로 변화되는 에탄올을 함유하는 0.1N 중탄산암모늄이고, 시료는 1.0㎎/mL로 2% 에탄올을 함유하는 O.1N 중탄산암모늄에서 제조되고, 주사용량은 20μL이었다.
도 1OA는 No.5(5)E-AP6X의 UV 스펙트럼이고, 도 1OB는 GE-AP6X의 UV 스펙트럼이고, 도 1OC는 HE-AP6X의 UV 스펙트럼이다. 시료의 UV 스펙트럼은 중탄산암모늄 용액에서 측정하였다. 용매 블랭크 보정은 행하지 않았다.
도 11은 산 형태의 No.5(5)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-AP6X의 IR 스펙트럼이다.
도 12는 암모늄염 형태의 No.5(5)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(5)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼이다.
도 11 및 12와 이하의 도 16, 20, 23, 26 및 29에 대해, 각 시료의 IR 스펙트럼은 KBr 펠렛에서 측정하였다.
도 13은 산 형태의 G의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 GE-AP의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면 및 이하의 도 17에 대한 HPSEC 조건은 시료 농도가 1.4mg/mL이었던 것을 제외하고는 상기 도 7의 것과 동일하였다.
도 14는 암모늄염 형태의 G의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 GE-AP2X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도 8의 것과 동일하였다.
도 15는 암모늄염 형태의 G의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 GE-AP2X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 구배식 RP-HPLC 조건은 상기 도 9의 것과 동일하였다.
도 16은 암모늄염 형태의 G의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 GE-AP2X-NH4의 IR 스펙트럼이다.
도 17은 산 형태의 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 HE-AP의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도 13의 것과 동일하였다.
도 18은 암모늄염 형태의 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 HE-AP1X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도 8의 것과 동일하였다.
도 19는 암모늄염 형태의 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 HE-AP1X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 구배식 RP-HPLC 조건은 상기 도 9의 것과 동일하였다.
도 20은 암모늄염 형태의 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 HE-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼이다.
도 21은 암모늄염 형태의 No.5(8)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(8)E-AP1X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도8의 것과 동일하었다.
도 22는 암모늄염 형태의 No.5(8)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(8)E-AP1X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 구배식 RP-HPLC 조건은 상기 도 9의 것과 동일하였다.
도 23은 암모늄염 형태의 No.5(8)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(8)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼이다.
도 24는 암모늄염 형태의 No.5(11)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(11)E-AP1X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도 8의 것과 동일하였다.
도 25는 암모늄염 형태의 No.5(11)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(11)E-AP1X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 구배식 RP-HPLC 조건은 상기 도 9의 것과 동일하였다.
도 26은 암모늄염 형태의 No.5(11)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.5(11)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼이다.
도 27은 암모늄염 형태의 No.4(2)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.4(2)E-AP1X-NH4의 HPSEC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 HPSEC 조건은 상기 도 8의 것과 동일하였다.
도 28은 암모늄염 형태의 No.4(2)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.4(2)E-AP1X-NH4의 구배식 RP-HPLC UV 프로파일이다. 이 도면에 대한 구배식 RP-HPLC 조건은 상기 도 9의 것과 동일하였다.
도 29는 암모늄염 형태의 No.4(2)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분인 No.4(2)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼 이다.
본 발명의 한 양태는 도 1, 2, 5A, 5B, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 21, 24 및 27의 HPSEC 프로파일; 도 6A 및 6B의 C18-HPLC 프로파일; 도 9, 15, 19, 22, 25 및 28의 구배식 RP-HPLC 프로파일; 도 1OA, 1OB 및 1OC의 UV 스펙트럼; 및 도 11, 12, 16, 20, 23, 26 및 29의 IR 스펙트럼을 특징으로 하는 각종 중국산 생약 또는 약초로부터 물 추출성 및 산 침전성 항 HIV 활성성분을 포함하는 본발명의 조성물에 관한 것이다.
발명의 개요 .
여기서 사용되고 특허청구범위에서 사용된 바, 다음의 명칭들이 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 및 HHT888-54로 알려진 4가지 허브혼합물을 확인하는데 사용될 것이다.
HHT888-4는 약 3:3:3:3:4(w/w)의 No.4(1):No.4(2):No.4(3):No.4(4):No.4(5)의 바람직한 비율의 5가지의 단일 허브 중국산 생약의 혼합물이다. 중량비는 성분당 50%까지 달라질 수 있다. "50%의 중량비의 변동"은 비율의 각 성분의 각 값이 50% 증가될 수도 감소될 수도 있다는 것을 의미한다. 따라서, 예를들면, 1:1은 1.5:0.5내지 0.5:1.5(또는 3:1 내지 1:3)의 범위가 될 수 있다.
HHT888-5는 11가지 단일 허브 중국산 생약, No.5(1) 내지 No.5(11)의 바람직하게는 대략 같은 중량비율의 혼합물이다.
중량비는 성분당 50% 까지 달라질 수 있다.
HHT888-45는 약 1: 1: 1: 1: 0-1: 0-1(w/w)의 No.4(3): No.4(4): No.5(4): No.5(5): No.5(8): No.4(2)의 바람직한 비의 단일 허브 중국산 생약의 혼합물이다. 중량비는 각 성분당 50% 까지 달라질 수 있다.
HHT888-54는 No.5(5) 또는 H와, No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(2), No.5(4), No.5(7), No.5(8) 및 No.5(11)로부터 선택된 적어도 하나의 단일 허브 생약의 혼합물인데, 여기서 No.5(5) 또는 H의 기타 단일 허브 생약의 각각에 대한 바람직한 중량비는 1:1이다.
따라서, 바람직한 구체예에서 HHT888-54는 No.5(5) 또는 H 더하기 No.4(3), No.4(4), No.5(8) 및 No.5(11)로 구성되고, 바람직한 중량비는 1:1:1:1:1이다. 더 일반적으로, No.5(5) 또는 H의 기타 단일 허브 생약의 합에 대한 중량비는 1:10 내지 10:1 이다.
No.4(1)은 No.5(1)(HEDYOTIS)과 같음을 주목해야 한다. 단일허브성분들에 대한 중국산 생약의 명칭들은 대문자로 나타내고 이어서 그것들의 식물공급원을 이탤릭체로 열거하였다.
여기서 사용되고 특허청구범위에서 사용된 바, 용어 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 및 HHT888-54는 실제 본초블렌드, 그것의 수성추출물 및 추출물의 활성 성분 또는 주성분을 포함한다. 유사한 방식으로, 용어 No.5(5), No.5(8)등의 사용은 실제 허브, 그것의 추출물 및 분리된 활성분자 약제를 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 또한 사용된 바, G는 허브 Aeginetia indica 또는 No.5(5)의 공급원 식물이다. No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(2), No.5(3), No.5(4), No.5(5) , No.5(6) , No.5(7) , No.5(8), No.5(9), No.5(10), No.5(11) 및 H는 상기한 단일 허브 성분들이며 그것들의 각각의 공급원 식물을 포함한다.
상기 열거한 중국산 생약 및 약초의 구체적인 설명은 다음 참고문헌에서 찾아볼 수 있다:(1) H. C. Chang, Medicinal Herbs I, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.O.C., 15, 36, 100, 113, 127, 147(1990); (2) H. C. Chang, Medicinal Herbs II, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.O.C., 15, 27, 131, 135, 155 (1991); (3) W. S. Kan, Pharmaceurical Botany, National Research Institute Of Chinese Medicine, Taipei, Taiwan, R.O.C., 113, 124-130, 200-201, 206-207, 289-290, 353-354, 442-444, 460-461, 485, 487-488, 497, 505, 513-514, 522, 527-529, 558, 562-563, 648-649 (1971); (4) M. S. Lee, Frequently Used Chinese Crude Drugs And Folk Medicines Handbook, 12th Ed., Sheng-Chang Medicinal Record Magazine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.O.C., 4-6, 17, 21, 29, 36, 38, 40, 48, 58, 64, 71, 79, 85 (1992); 및 (5) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen, & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.0.C., 90, 97, 105-106, 117-118, 126-127, 130-131, 133, 138, 144-145, 152-153, 156-157, 161-162, 174, 176-177, 357-358, 381-382, 384-385, 456-457, 577-578 (1985).
본 발명은 가장 넓은 관점에서는 기술된 생약혼합물 및 바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 그것들의 용도에 관련된다. 본 발명은 또한 약초 및 그것으로부터 유도된 생약의 신규한 조합에 관한 것이다. 예를들면, 본초혼합물은 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, No.5(5)-H, No.5(5)-No.4(3), No.5(5)-No.4(4), No.4(3)-No.4(4), No.5(5)-No.5(11), H-No.4(4), H-No.4(3), H-No.4(5), H-No.5(8), H-No.5(11), 그것들의 혼합물과 그것들의 약학적으로 허용되는 염등을 칭하였다. 더 상세히는 바이러스 감염은 HBV, HCV 및 HIV로 말미암은 것들이다. 본발명에 따르는 항바이러스 혼합물은 상기에 HTT888-4, HHT888-5, HHT888-45 및 HHT888-54로 기재되었다. 게다가 No.4(2), No.4(5), No.5(5), No.5(7), No.5(8), No.5(11) 및 H로 지칭된 단일 허브 약제들은 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이들 단일 허브약제는 종래기술에 의해 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타난적이 없다.
No.5(5)의 활성성분에 대해 도 1 내지 도 5, 도 7 및 도 8에 제시된 HPSEC 분석을 특징으로 하는 본발명 조성물들을 또한 개시한다. 도 13 및 14는 HPSEC에 의한 G의 활성성분을 특징짓는 한편 도 17 및 도 18은 H를 특징짓는다. 도 21은 HPSEC 분석에 의한 No.5(8)을 특징짓고, 도 24는 No.5(11)을 특징짓는 한편 도 27 은 No.4(2)를 특징짓는다.
도 6A와 도 6B에 보여지고 있는 구배 C18-HPLC분석은 No.5(5)의 활성성분을 특징짓는다. 도 9에 보여지는 RP-HPLC분석은 No.5(5)의 활성성분을 특징짓는 한편 도 15는 G의 활성성분을, 도 19는 H의 활성성분을, 도 22는 No.5(8)의 활성성분을, 도 25는 No.5(11)의 활성성분을 특징짓고, 도 28은 No.4(2)의 활성성분을 특징짓는다. 도 11과 도 12에서 보여지는 IR 스펙트럼은 No.5(5)의 활성성분을 특징짓고, 도 16은 G의 활성성분을 특징짓고, 도 20은 H의 활성성분을, 도 23은 No.5(8)의 활성성분을 특징짓고, 도 26은 No.5(11)의 활성성분을 특징짓고, 도 29는 No.4(2)의 활성성분을 특징짓는다. 본발명의 더 구체적인 관점은 HHT888-5가 HBV보균자들의 B형 간염바이러스를 감소시키는 효과가 있다는 발견에 있다. 본 발명의 추가의 관점 도 HHT888-45가 C형 간염환자의 치료와 간기능의 정상으로의 회복에 효과가 있다는 발견에 있다. 허브혼합물 HHT888-4 및 허브혼합물 HHT888-5 그리고 그혼합물들의 수성추출물들은 모두 체외에서 MuLV와 HIV에 대하여 항 레트로바이러스 작용을 기지고 있다고 발명가에 의하여 보여졌다. 이러한 증거는 그것들이 체내에서도 효과를 갖는다는 결론을 강력하게 지지한다. 게다가 HHT888-4와 HHT888-5를 구성하는 15가지의 단일허브성분들중 11가지,즉 No.4(2), No.4(3), No4(4), No.4(5), No5(1), No.5(2), No5(4), No.5(5), No.5(7), No.5(8), No.5(11)과 생약 H 는 HIV에 감염된 사람의 말초혈임파구(PBLs)에서의 바이러스 증식을 효과적으로 억제함으로서 항 HIV 활성을 나타내었다. 이 모델은 체내에서 항 HIV 활성이 있을것이라고 크게 예상된다. 공급식물인 Aeginetia indica로 부터 직접 제조된 단일 허브 성분 No.5(5)의 수성추출물은 훌륭한 항 HIV 활성을 보였다. 더 나아가 단일허브성분 No4(3), No4(4), 및 No5(11)의 수성추출물들은 중간 내지 강한 항 HIV 활성을 나타내었다. 단일허브성분들 No.4(2), No.4(5), No.5(1), No.5(4)와 No.5(8)의 수성 추출물들은 단지 약한 항 HIV 활성을 보였다. No.4(2), No4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8)과 H의 성분중 물 추출성 및 산 침전성 성분들은 활성의 항 HIV제임을 보여준다. 마찬가지로 물 추출성 및 산 침전성 성분들이 No.4(4)와 No.5(11)에서도 분리되었고 역시 항HIV임을 보여준다. 이러한 물 추출성 및 산 가용성 항 HIV 활성성분들은 서로 유사하며 이전에 보고된 적이 없으며 따라서 신규하고 진보성이 있다. 물 추출성 및 산 가용성 항 HIV 활성성분들은 또한No.4(4),및No.5(11)에서 분리되었다. No.5(11)의 물 추출성 및 산 가용성 활성성분은 이전에 기술된 적이 없으며 신규하다. No.4(4)의 물 추출성 및 산 가용성 활성성분은 이전에 기술된부분 황산염화된 다당류나 프루넬린과 같을 수도 있다. 단지 한가지 활성성분만이 산에 용해성인 No.4(3)의 수용성 추출물에서 분리되었다. 본 발명조성물로서 허브 혼합물 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 및 HHT888-54가 또한 개시된다. 이들 본 발명 조성물들은 이전에 기술된 적이 없으며 자명한것이 아니다. 더욱이 No.4(2), No.4(4), No4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11)과 H로 이루어진 군에서 선택된 단일 허브생약들이나 그것들의 공급식물으로 부터 따로 혹은 조합하여 분리된 개개의 물추출성 및 산 침전성 항 HIV 활성성분들중 최소한 한가지 이상으로 이루어지는 본 발명 조성물이 개시된다. 이러한 본발명 조성물은 이전에 기술된 적이 없고 따라서 신규하며 진보성이 있다. 그러한 조성물의 용도는 바이러스 감염의 치료에 그들이 사용된다는 점이다. 따라서 포유동물에서 바이러스 감염의 치료방법이 또한 개시되며, 이 방법은 그 포유동물에 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, No.4(2), No4(5), No5(1), No5(1), No.5(2), No5(4), No5(5), No5(7), No5(8), No5(11)과 H로 이루어진 군에서 선택된 최소한 한가지 이상 조성물이나 그것들의 각각의 추출물 또는 활성성분들을 치료하기에 효과적인 양(하루에 0.4 내지 120g)을 투여하는 것으로 이루어진다.
더욱 구체적으로는 HBV에 감염된 사람의 바이러스 양(virus load)을 감소시 키는 방법이 개시되는데 이 방법은 HHT888-5나 이로부터 얻어진 추출물로 이루어지는 조성물을 치료하기에 효과적인 양(하루에 0.4 내지 120g)을 사람에게 투여하는 것으로 이루어져 있다.
또한 HCV에 감염된 사람의 치료를 위한 방법도 개시되는데 이 방법은 HHT888-45나 이로부터 얻어진 추출물로 이루어지는 조성물을 치료하기에 효과적인 양(하루에 0.4 내지 120g)을 사람에게 투여하는 것으로 이루어 진다.
또한 HBV의 사람보균자의 바이러스 양를 감소시키는 방법과 사람의 B형 간염을 예방하거나 치료하는 방법도 개시되는데, 이 방법은 No.5(5)와, No5(1), No.5(2), No5(3), No5(4), No.5(6), No.5(7), No.5(8), No5(9), No5(10), No.5(11)로 구성되는 군에서 선택된 최소한 한가지의 약제로 부터 선택된 최소한 한가지 조성물의 효과적인 양을(하루에 0.4 내지 120g)을 상기 환자에게 투여하는 것으로 이루어 진다.
또한 HCV 보균자의 치료방법과 사람에서 C형 간염의 예방 혹은 치료 방법도 개시되는데 이 방법은 단일허브생약 No.5(5), 이것의 추출물 또는 활성성분과 No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.5(4), No.5(8)과 No.5(11)로 구성되는 군에서 선택된 최소한 한가지 단일허브 생약, 이것의 추출물또는 활성성분의 혼합물로 구성되는 조성물을 치료하기에 효과적인 양(하루에 0.4 내지120g)을 환자에게 투여하는 것으로 이루어 진다.
또한 사람에서 B형 간염을 치료하는 방법도 개시되는데 이 방법은 HHT888-45 와 HHT888-5로 부터 선택된 최소한 한가지 조성물을 치료하기에 효과적인 양(하루에 0.4내지120g)을 상기환자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
B형간염의 치료에 있어서는 더 자세한 내용이 개시되어있는데 이 방법은 다음의 혼합물로부터 선택된 최소한 한가지 이상의 조성물을 치료하기에 효과적인 양을 환자에게(하루에 0.4 내지 120g)투여하는 것이다. 다음의 혼합물:(1)단일 허브생약 No.5(5),이것의 추출물 또는 활성성분과 No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.5(4), No.5(8)과 No.5(11)로 이루어지는 군에서선택된 최소한 한가지 단일허브생약, 또는 이것의 추출물 또는 활성물질들)의 혼합물 (2) 단일의 허브생약 No.5(5), 이것의 추출물 또는 활성물질과 No5(1), No.5(2), No5(3), No5(4), No.5(6), No.5(7), No.5(8), No5(9), No5(10), 및 No.5(11)로 구성되는 군에서 선택된 최소한 한개의 단일허브생약, 이것의 추출물또는 활성물질들의 혼합물
HIV에 감염된 사람의 치료에 대해서는 더욱 자세한 방법이 개시되는데 이방법은 HHT888-4로 구성되는 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로(하루에 0.4내지120g) 환자에게 투여하는 것이다. HIV에 감염된 사람의 치료에 대한 방법이 개시되는데 이 방법은 HHT888-5로 구성되는 조성물을 치료적으로 효과적인 양(0.4내지120 g)을 사람에게 투여하는 것으로 이루어 진다. HIV에 감염된 사람의 치료방법에 관한 방법이 개시되는데 이 방법은 HHT888-45로 구성되는 조성물을 치료하기에 효과적인 양을(하루에 O.4내지 120g)을 환자에게 투여하는 것으로 이루어진다. HIV, HBV, HCV에 감염된 사람의 치료에 대한 방법이 개시되는데 이 방법은 HHT888-54로 구성되는 조성물을 치료하기에 효과적인 양을 (하루에 0.4에서 120g)환자에게 투여함으로써 이루어 진다.
또한 HIV에 감염된 사람의 치료에 대한 방법이 개시되는데 이 방법은 No.4(2), No.4(5), No5(1), No.5(2), No5(4), No.5(5), No.5(7), No.5(8), No.5(11)과 H로 이루어지는 군으로부터 선택된 최소한 한가지 단일허브생약,이것의 추출물 또는 활성물질들로 구성된 조성물을 치료하기에 효과적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 이루어 진다.
또한 신규한 본초 블렌드와 HIV에 감염된 사람의 치료방법이 개시되는데, 이방법은 No.5(5)와 그들의 혼합물로부터 선택된 최소한 한가지 생약과 No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No5(1), No.5(2), No5(4), No.5(7), No.5(8), 및 No.5(11)로 구성되는 군에서 선택된 최소한 한가지의 생약으로 이루어지는 본초블렌드를 치료하기에 효과적인 양을 상기환자에게 투여하는 것으로 이루어진다.
또한 HIV에 감염된 사람의 치료방법이 개시되는데 이 방법은 No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No5(1), No.5(2), No5(4), No.5(5), No.5(7), No.5(8), No.5(11)과 H로 구성되는 군에서 선택된 단일허브생약들이나 그들의 기원식물로 부터 분리된 최소한 2가지의 항 바이러스 성분으로 이루어지는 혼합물을 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 것이다. 또한 HIV에 감염된 사람의 치료방법도 개시되는데 이 방법은 No.4(2), No.4(4), No.4(5), No5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11)과 H 로 구성되는 군에서 선택된 단일허브생약이나 그들의 기원식물들로 부터 분리된 물 추출성 및 산 침전성 항바이러스 성분이나 화합물로 이루어지는 조성물을 치료하기에 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것이다.
따라서 본 발명은 (1) 본 발명조성물(즉, 본초블렌드및 분리된 화학적 실재)(2) HCV나 HBV 보균자의 치료 (3) B형 간염과 C형 간염에 대한 예방과 치료 (4)HIV보균자에 대한 처치 (5) 본 발명에 따른 조성물의 투여를 통한 에이즈의 예방과 치료에 관련된다.
본발명의 조성물의 투여용량은 치료가 필요한 포유동물에 대해 하루에 0.4 내지 120g까지의 범위가 될 수 있다. 당업자들은 개개인의 몸무게와 바이러스 감염의 진행정도에 따라 더 많은 투여용량을 사용할 수 있다는 것에 대하여 인정할 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 실지로 어떤 부작용도 나타내지 않았으므로 고 투여용량으로 시작하여 치료 효과에 따라(즉,바이러스양의 감소)투여용량을 줄일수 있을 것이다. 당업자들이라면 괜한 실험없이도 주어진 개인에 대한 각 투여용량비율를 계산해 낼수 있을 것이다. 더 구체적으로 주어진 조성물에 대한 투여용량은 하루에 0.4 내지 100g 범위가 될 수 있고, 하루에 1 내지 25g 정도가 더 바람직하다. 이 조성물은 하루에 최소한 3번 이상 투여되는 것이 바람직하며, 큰 환약으로 투여하는 것도 효과적일 것이다. 더 구체적으로는 HHT888-5를 1회에 5.5g씩 하루에 3번 투여하면(하루 총투여용량은 16.5g이 된다.)보균자에게서 HBV의 양을 감소시키기에과 효과적임이 밝혀졌다. 허브혼합물 HHT888-45를 1회에 2.7-5.7g씩 하루 3회 투여하면(하루 총투여용량은 8-17g이 된다.) C형 간염환자에게서 정상적 간 기능으로 회복되는데 효과적임이 밝혀졌다. HHT888-5에 대해 하루 121g, 그리고하거나 HHT888-45에 대해 하루 63g 만큼의 높은 투여량도 심각한 부작용이 있다는 증거는 없었다. 여기에 열거된 투여용량은 건조형태의 생약(분쇄된 식물 또는 흡착제에 침착시킨 추출물)에 대한 것이다. 더욱이 본발명 조성물의 추출물은 활성성분의 농도를 증가시킬것이며 따라서 투여량수준의 감소도 실현될 것이다.본 발명 조성물에 대하여 여기서 열거된 투여용량의 1O%만큼 낮은 투여용량도 생각된다. HCV 감염을 치료하는데 필요한 No.5(5)의 바람직한 투여용량은 하루에 0.4에서 17g이다.
본 발명의 조성물은 경구나 장에 투여되는것이 바람직하나 정맥주사나 근육주사투여도 생각되며 당업자들은 근육/정맥투여시의 처방의 조제와 유효 투여용량을 얻는 방법을 알것이다.
본 발명에 의한 방법에서 포유동물이라 함은 사람 또는 동물일 수 있고 사람은 성인, 어린이, 유아가 될 수 있다. 따라서 HBV, HCV, HIV 등에 감염된 유아의 치료에 있어서는 이하에 설명될 식물 추출물 또는 활성성분을 함유하는 유아용 제제가 효과적일 것이다. 어린이나 성인의경우에는 우유나 요구르트같은 약용식품 또는 영양제품에 식물 추출물이나 활성성분을 함유시킴으로서 HBV, HCV, HIV에 감염된 사람을 치료하는데 효과적일 것이다. 본 발명은 또한 열거된 생약이나 약용식물로부터 유효한 성분을 분리하는 방법과, 분리된 화합물자체에도 연관된다. 본 발명에서 출발물질로 사용되는 허브들은 단일 허브생약으로서 상업적으로 얻어질 수 있는 것이고 이것들은 혼합되거나 추출 및 농축되어서 사람에 투여하기 위한 조성물로 만들어 질 수 있다. 일단 식물로부터 분리된 식물 추출물은 농축된후에 사람에게 투여되기 쉬운 제형으로 알맞게 바뀌어 진다(즉 환제,정제,캅셀제등). 일단 식물에서 분리되거나 합성된 활성성분들도 사람에게 투여하기 위한 조성물로 만들어 진후에 캅셀이나 정제, 분말, 캔디, 음료, 차, 영양제품등과 같은 여러 제형으로 만들어 지게된다.
또한 다음과 같은 단계들로 이루어지는 방법에 의해 제조된 의약품도 개시된 다;
(a) No.5(1) 내지 No.5(11), No.4(2) 내지 No.4(5), H 및 그들의 혼합물과 같은 분쇄된 식물물질을 물과 접촉시켜 수성 분산액을 형성하는 단계
(b) 수성분산액을 약 100℃까지 가열하여 그 온도를 약 0.5시간 내지 3시간동안 유지 시키는 단계
(c) 수상으로부터 불용성 식물물질을 분리하는 단계
(d) 수상에 함유되어 있는 용질을 농축하는단계. 농축된 용질은 동결건조,분무건조,증발,또는 한외여과에 의하여 얻을수 있다.
또한 다음단계들로 이루어지는 방법에 의해 제조된 의약품도 개시된다.
(a) No.4(2), No.4(4), No.4(5), No5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11)과 H 및 그것들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된 분쇄된 식물원료를 물과 접촉시켜 수성 분산액을 형성하는 단계
(b) 위 수성 분산액을 100℃까지 가열하여 그 온도를 0.5시간 내지 3시간동안 유지 시키는 단계
(c) 수상으로부터 불용성 식물물질을 분리하는 단계
(d) 수용액을 산으로(염산등) pH를 약 2미만으로 산성화 시키는 단계
(e) 산 침전물을 상청액으로부터 분리하는 단계
(f) 산 침전물을 염기성용액(O.1N 탄산수소암모늄둥)에 녹인 후에 다시 산으로 침전시켜 이를 정제하는 단계. 선택적으로 산 침전물들을 0.1 노르말의 탄산수소암모늄용액에 녹인후 이를 농축할수도 있다. 농축된 용질은 동결건조, 분무건조, 증발, 또는 한외여과에 의하여 얻어진다.
수성 추출물들을 산성화 시키는데 사용되는 산들의 대표적인것은 염산, 인산, 황산, 빙초산 등이다. 중요한것은 그러한 산은 활성성분들을 산형태로 전환하기에 충분한 pKa값을 가지고 있어야 하는 것이다, 추출물의 배는 3미만이여야 하고 침전이 일어나기 위하여는 pH가 2.0미만인 것이 바람직하다.
또한 다음 단계들로 이루어지는 방법에 의해 제조된 의약품도 개시된다.
(a) No.4(2), No.4(4), No.4(5), No5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11)과 H 및 그것들의 혼합물로부터 선택된 최소한 한가지 생약을 물과 접촉시켜 수성 분산액을 형성하는 단계
(b) 수성분산액을 주위온도에서 약 0.5시간 내지 3시간 동안 교반하는 단계
(c) 수상으로부터 불용성 식물물질을 분리하는 단계
(d) 수용액을 산으로 대략 pH2미만으로 산성화하여 침전을 형성시키는 단계
(e) 산 침전물을 상청액으로 부터 분리하는 단계
(f) 산 침전물을 정제하는 단계. 침전물들은 O.1N의 탄산 수소암모늄용액에 녹인후 다시 산으로 침전시키는 과정을 반복함으로서 정제할수 있다.
본 출원은 본 발견에 유용한 데이타를 나타내고 있으며 조성물, 그것들의 제제, 임상적 응용, 및 여러가지 활성성분들을 특징짓기 위해 사용되는 분석도구들에 대하여 기술하고 있다. 본 발명의 이들 및 기타 면들은 다음의 실시예를 통하여 당업자들에게 분명해질것이다. 다음의 실시예들은 발명을 설명하기 위한 것일뿐 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.
본 기술분야의 숙련자가 본 발명의 원리를 알기 위해, 다음 실시예들이 제시되고 이것은 예시적이나 제한적이지 않도록 의도된다. 모든 퍼센트는 다르게 특정화되지 않는 한 중량 퍼센트이다.
실시예
허브 혼합물의 제조
본 발명에 따른 본초 조성물의 제조시에, 단일 허브 포맷의 중국산 생약을 분말형태의 시판 공급원으로부터 구입하였다. 개개의 단일 허브 생약을 각각의 허브 혼합물을 제조하기 위해 적당한 비율로 혼합하였다.
HHT888-4에 대한 허브 혼합물을 3:3:3:3:4의 중량비로 No.4(1), No.4(2), No.4(3), No.4(4) 및 No.4(5)를 혼합함으로써 제조하였다. 허브 혼합물 HHT888-5는 동일한 중량의 No.5(1), No.5(2), No.5(3), No.5(4), No.5(5), No.5(6), No.5(7), No.5(8), No.5(9), No.5(10) 및 No.5(11)을 혼합함으로써 제조하였다.
허브 혼합물 HHT888-45는 1:1:1:1:0-1:0-1의 중량비로 4 내지 6개의 단일 허브 생약 No.4(3), No.4(4), No.5(4), No.5(5), No.5(8) 및 No.4(2)를 혼합함으로써 제조하였다. 단일 허브 생약 No.5(8) 또는 No.4(2), 또는 둘 다는 초기 투여를 위해 HHT888-45인 몇몇 경우에서 사용하지 않았다. 두 개의 단일 허브 생약 또는 둘다중 한가지를 치료법을 증강시키는 것이 필요할 때 가하였다. 또한 허브 혼합물 HHT888-45에서의 단일 허브 생약 No.4(2)의 중량비는 사용할 때에 0.5와 1 사이에서 그때그때 다양하게 하였다.
단일 허브 생약의 식물 공급원으로부터 각각 제조한 탕약의 혼합물 또는 각
허브 혼합물의 단일 허브 성분의 예비혼합된 식물 공급원으로부터 제조된 탕약이 본 발명의 범위내에 있다는 것을 주의한다.
실시예 2
단일 허브 생약의 저조
각각의 단일 허브 생약이 얻어지는 식물 공급원은 본원의 종래 기술 및 개요부분에 나열되어 있다. 약초중 1종 또는 1속 이상이 동일한 생약을 제조하는데 사용될 수 있다는 것을 이해한다. 에를들면, 생약 No.5(8) 또는 FORSYTHIAE FRUCTUS는 Forsythia 속 식물의 3가지 종, 즉 Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana 또는 그것의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 생약No.5(6)(BAPHICACANTHIS RHIZOMA ET RADIX)는 5가지 식물 Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica, Polygonum tinctorium 또는 그것의 혼합물중의 한가지로부터 제조될 수 있다. 생약은 다음과 같은 그것의 각 식물로부터 제조되었다.
식물의 적당한 부분 또는 전체를 얻고, 냉수로 세척하고 건조시키고 분쇄하였다. 다음에 식물 재료를 식물 재료 1중량부 대 물 약 5 내지 10중량부에 의거하여 비등수로 추출하였다. 사용된 물의 양은 추출용기중에서 식물 재료를 적어도 다 커버되어야 한다. 원하는 성분을 효과적으로 추출하기 위해 시료를 0.5 내지 1시간 동안, 그러나 3시간은 초과하지 않게 비등시켰다. 보다 짧거나 또는 보다 긴 가열은 수율 및 비용을 제외하고는 실질적으로 추출에 영향을 끼치지 않았다. 수용액을 식물 재료로부터 여과에 의해 분리하였다.
수용액을 냉동건조 또는 분무건조시킬 수 있고, 또는 인위적 진공이거나 또는 그렇지 않은 가열에 의해 부피감소시킬 수 있다. 다음에 농축물을 동일한 식물 재료, 전분 또는 다른 흡수제의 분말화된 형태로 분무건조 또는 냉동건조 또는 흡수시킬 수 있다. 따라서 단일 허브 생약이 제조된다.
탕약은 약 0.5 내지 1시간동안 상기한 바와 같은 식물재료를 물에 비등시킴으로써 제조한 식물 재료의 수용액이다. 당약은 이것을 제조한 다음에 따뜻한 온도, 즉 주위온도로 냉각시키고 나서 바로 마실 수도 있고 나중에 마시기 위해 적당히 멸균하여 보존될 수도 있다. 멸균은 마이크로여과 또는 가열에 의해 수행한다.
실시예 3
B형 간염바이러스 보균자의 치료
정상 수준의 혈청 글루타민 옥살아세테이트 트랜스퍼라제(SGOT) 및 글루타민피루베이트 트랜스퍼라제(SGFT)(간장 효소)를 갖는 29명의 HBV 보균자를 HHT888-5로 치료하였다. 상승된 SGOT 및 SGPT 수준을 가진 몇 명의 HBV 보균자를 먼저 다른 치료약으로 치료하여 이들의 혈청 간장 효소를 정상 수준(SGOT에 대해서는 8-40단위/mL 및 SGPT에 대해서는 5-35단위/mL)으로 되돌렸으나 HBV 적재를 감소시키는데는 실패하였다. 다음에 HHT888-5에 의한 치료를 시작하였다. HHT888-5는 시판 공급원으로부터 구입하고 굿 매뉴팩쳐 프랙티스(GMP) 가이드라인을 수행하여 제조된 11개의 단일 허브 생약을 혼합함으로써 실시예 1에 기재된 대로 제조하였다. 각 환자의 동의는 그들의 치료를 시작하기 전에 얻었다.
환자에게 하루에 HHT888-5를 3회 마시도록 지시하였다. 각 투여량은 5.5g이었다. 허브 혼합물의 각 5.5g 패킷을 온수와 혼합하여 경구로 마셨다. 각 환자의 혈청 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 타이터를 치료의 진행을 모니터하기 위해 표 1에 나타낸 간격으로 측정하였다. 혈청 HBsAg 타이터를 (1) Instruction of "Taifu"Serodia-HBs Test Reagent for HBsAg Detection, Taifu Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan, R.0.C.; (2) D.S.Chen & .J.L.Sung, J. Formosan Med. Assoc., 77, 263-270(1978); 및 (3) T,Juji ＆ T.Yokochi, Japan, J. Exp. Med., 39, 615-620(1969)에 기재된 바와 같은 역-비활성 응집시험을 사용하여 측정하였다.
표 1은 29명의 HBV 보균자의 치료 결과를 나타낸다. 환자들은 이들의 HBsAg타이터 감소로 나타난 바와 같이 치료동안에 질병 상태의 개선과 안녕을 보였다. HBsAg 타이터의 범위가 20 내지 81,920인 14명의 보균자(48%)에서 35 내지 964일의 치료후에 현저하게 저하되었다(4 내지 256배 감소, 또는 양성에서 음성으로). 4명의 보균자(14%)에서 56-153일의 치료후에 그들의 HBsAg 타이터를 20, 40 및 2,560에서 음성(즉, 20ng/mL 검출수준 미만)으로 감소시켰다. 14명의 보균자(48%)는 치료 동안에(63-284일) HBsAg 타이터에서 어떤 현저한 변화도 없었다(2배 타이터 감소 또는 증가 또는 무변화). 한명의 보균자(3%)는 약간의 4배 타이터 증가를 가졌다.
본 실시예에 기재한 HHT888-5 치료를 현재 허용된 인터페론 치료법과 매우 유리하게 비교한다. HBV에 의해 감염된 환자에서 HBsAg 타이터를 저하시키기 위해 인터페론 치료법 및 HHT888-5 치료에 대한 반응율은 각각 대략적으로 40% 대 48%로 유사하다. 혈청 HBsAg 제거율도 둘다에 대해서, 즉 인터페론 치료에 대해서는 10-15%/ 및 HHT888-5 치료에 대해서는 약 14%로 유사하였다. 더욱이, 인터페론 치료법은 자주 역효과가 있는, 근육내 또는 정맥내로 전형적으로 투여된다. HHT888-5 치료약을 치료한 모든 환자에서 겉보기 부작용이 없는 경구(차를 마시는 것과 같이)로 마셨다. 경구투어는 근육내 또는 정맥내 투여보다 횔씬 더 편리하고 보다 경제적이다. 따라서 HHT888-5는 HBV 보균자 및 B형 간염 환자에서 HBV 증식을 감소 또는 콘트롤하는데 의거하여 안전하고 편리하게 마실 수 있다.
HBV 보균자에서의 HBV 바이러스 적재를 층분히 낮은 수준으로 감소 또는 유지시킬 수 있으면, 보균자는 간염, 간장 경화증, 간장암 및 사망으로 훨씬 덜 진행된다. 따라서 HHT888-5는 B형 간염을 예방 및 치료하는데 사용될 수 있고, 또는 HBV 감염으로 인한 간장 경화증 또는 간장암을 예방하는데도 사용될 수 있다.
본 실시예에서 먼저 물에 분말을 혼합하고 나서 경구로 마심으로써 HHT888-5 를 투여하기 때문에, HHT888-5의 활성성분의 분리 및 그것의 사람에의 투여는 HBV의 치료에 효과적이다. 하루에 120g으로 높은, 허브 혼합물 HHT888-5의 투여량은 중대한 부작용이 없이 수행되었다.
실시예 4
허브 혼합물 및 그 물 추출물의 항레트로바이러스 시험
본 실시예에서, 두 개의 허브 혼합물인 HHT888-4 및 HHT888-5를 그것의 항레트로바이러스 활성에 대해 시험하여 시험관내의 분석으로 EMuLV 및 HIV에 대해 활성이라는 것을 알았다. 두가지의 시험관내 분석인 항자기지향성 쥐 백혈병 바이러스(anti-Ecotropic Murine Leukemia Virus; 항 EMuLV) 및 항 HIV를 본 발명의 조성물의 항레트로바이러스 활성을 시험하는데 사용하였다.
항 EMuLV 분석은 HIV와 동일한 바이러스과에 속하고 HIV에 유사한 많은 특징을 갖는 큰 봉해진 RNA 함유 레트로바이러스, EMuLV을 사용한다.
1. 항자기지향성 쥐 백혈병 바이러스 분석
분석은 두 개의 부분, 세포독성 시험 및 바이러스 억제 시험을 포함하였다. QBI Protocol 39014 Final Report 및 QBI Protocol 39016 Final Report, Quality Biotech, Camden, NJ, USA, 1992 참조. 각 시료를 XC 전염병(plague) 분석에서 감염성 EMuLV를 적정하는데 사용한 SC-1 인디케이터 세포에 대한 그 세포독성에 대해 초기 시험하였다. 여기서 보고된 바와 같이 세포독성은 콘트롤 증식 %로 표현된다. 퍼센트가 높다는 것은 시험물질이 세포에 대해 독성이 없다는 것을 의미한다. 이것은 매우 독성인 화합물이 분석결과를 설명해 주기 때문에 매우 중요하다. 예를 들면, HIV 분석에서의 고 활성 및 고 세포독성(저 콘트롤 증식 %)은 시험 화합물이 숙주 세포의 성장을 억제하여 바이러스의 성장을 제한한다는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 항바이러스 활성에 대한 위양성(false positive)은 설명할 수 있다·QBI protocol C30015, Quality Biotech, Camden, NJ, USA 참조. 각 시료를 바이러스가 없는 바이러스 재현탁 완충액(50mM 트리스, pH 7.8, 10mM KCL, 0.1mM EDTA)에 분산하였다. 다음에 용액에 EMuLV 타이터의 측정에 대한 조건과 동일한 조건하에서 XC 전염병 분석을 행하였다. 시료는 분석용 인디케이터 세포가 50% 컨플루언트 미만이면 세포독성이라고 생각된다. 비세포독성 시료 농도는 바이러스 억제 시험에 대해 선택되었다.
바이러스 억제 시험에서, 각 시료를 12-32분동안 23-25mg/mL(예, 100mg/4.0mL)의 바이러스 재현탁 완충액에서 배양하였다. 처리한 바이러스 현탁액을 필요하다면 6.8-7.2내의 pH로 조정하고 그 다음에 XC 전염병 분석에서 그 타이터에 대해 시험하였다.
분액(1.5mL)을 세포 배지에서 종점(100,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7및 10-8희석, 또는 적당하게)으로 희석하였다. 각 희석액을 존재한다면 모든 미립자를 재현탁하기 위해 와동시키고 XC 전염병 분석에 의해 감염성 바이러스 입자에 대해 쌍으로 분석하였다. 양성 콘트롤(처리하지 않은 바이러스 현탁) 및 음성 콘트롤(세포 배지, 바이러스 없음)도 분석을 확인하기 위해 동시에 분석하였다.
시료의 항 EMuLV 활성은 양성 콘트롤과 비교하였을 때 EMuLV 타이터의 log10감소로 표현되었다. 0.5보다 큰 log10타이터 감소한 시료는 활성이라고 생각된다.
HHT888-4 및 HHT888-5를 "그대로" 초기 시험하고 실온에서 바이러스가 있는 배양을 12분 및 25㎎/mL에서 양호한 항바이러스 활성(바이러스 타이터에서 1.0내지 1.4 log10감소)을 나타내었다. 다음에 이들을 동일한 농도에서 바이러스가 있는 보다 긴 배양(32분)으로 다시 시험하였다. 각 시료를 어떤 활성성분이 수용성인지를 알기 위해 상기 바이러스 재현탁 완충액에 그 가용성 및 불용성 분획에 대해 시험하였다. 가용성 부분을 10분동안 10,000 ×g 및 실온에서 원심분리기에 의해 불용성 부분으로부터 분리하였다. 가용성 분획을 두 분액, 즉 여과된 0.45㎛인 것 및 비여과된 것으로 분할하고 잔류 미립자가 활성에 어떤 영향을 끼치는지를 알기 위해 시험하였다.
표 2는 항 EMuLV 활성 시험결과를 나타낸다. 결과는 두 HHT888-4 및 HHT888-5 및 그것의 가용성 및 불용성 분획이 항 EMuLV 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 시료는 이것이 32분동안 23-25mg/mL에서 바이러스가 있는 채로 배양되었을 때 바이러스 타이터를 1.0 내지 2.6 log10감소시켰다. 마이크로여과는 가용성 분획의 활성에 현저하게 영향을 끼치지 않았다.
2. 항사람 면역결핍 바이러스 분석
또한 이 분석은 두 부분인 독성시험 및 HIV 억제시험을 포함하였다. 시료를1.0OmL중 50mg으로 세포 배지에 혼합하였다. 혼합물을 와동시키고 불용성물로부터 가용성물을 분리하기 위해 원심분리하였다. 상청액을 0.45㎛ 필터를 통해 여과한 다음에 세포 배지로 분석을 위해 적당한 농도로 희석하였다. 분석에 사용된 세포 배지는 10% 태아단계의 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 50U/mL 페니실린 및 50㎍/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640(pH 7.3 ±0.3)이었다.
시료를 표적세포, 사람 말초혈 림프구(PBL)에 대한 그 세포독성 및/또는 세포증식억제 활성에 대해 시험하였다. 림프구 증식 분석은 독성시험에 사용하였고, 시료 100μL를 HIV 억제시험과 동일한 조건하에 비감염된 PBL(3×105세포)의 세포 현탁액 100μL로 배양하였다. 림프구 증식은 비색정량분석(MTT 시험)으로 측정하였다. T. Mosmann, J. Immunological Methods, 65, 55-63(1983) 참조. 림프구 증식의 콘트롤의 ≥70%가 되는 시료 농도는 HIV 억제시험에 대해 허용가능하다고 생각된다.
HIV 억제시험에서, HIV-1 감염된 PBL을 독성시험에서와 같이 4일동안 시료의존재하에서 배양하였다. H. Ruebsamen-Waigmann, et al., J. Med. Virology, 19, 335-344(1986)참조. 분비된 바이러스 코어 단백질 p24 및/또는 바이러스 RNA를 각각 HIV-1 p24 포획 ELISA 기술 및 HIV-RNA 도트 블롯 혼성화(hybridization) 기술에 의해 제3일 및 제4일 둘다에서 바이러스 증식 상태에 대한 인디케이터로서 측정하였다. HIV 감염된 세포에 의해 합성된 p24의 농도를 샌드위치 ELISA로 측정하였다. 재조합 p24(MicroGeneSys, USA)의 표준 제제를 ELISA의 측정에 사용하였다. Ch. Mueller, et al., Fresenius Z. Anal. Chem., 330, 352-353(1988) 참조.
감염된 세포중 합성된 HIV-RNA를 핵산 혼성화 기술에 의해 측정하였다. 세포 RNA를 감염된 세포로부터 제조하고 도트 블롯 혼성화 기술에 의해 분석하였다. 혼성화 용액은 HIV 분리 D31의 5.5킬로베이스 DNA 단편을 포함한 P32-표지된 DNA 프로브를 함유하였다. H.v. Briesen, et a1., J. Med. Virology, 23, 51-66(1987) 참조. 바이러스의 개그/폴(gag/pol) 영역을 커버하는 이 단편을 올리고누클레오티드 표지화에 의해 P32알파-d CTP로 표지한다. 바이러스 분리 D31의 개그/폴 영역으로부터 유도된 플러스-가닥 RNA 전사물을 혼성화를 위한 외부 표준으로서 사용하였다. 이들 "런-오프(run-off)" 전사물은 T7-프로모터 콘트롤하에서 음성으로 분극화된 HIV-DNA로부터 T7 폴리머라제 반응에 의해 생성되었다. RNA 전사물의 농도를 분광 광도법으로 측정하였다. 혼성화된 프로브를 자동방사선사진법으로 검출하고 처리된 자동방사선사진을 농도계측으로 평가하였다.
양성 콘트롤, 음성 콘트롤 및 AZT 큰트롤을 HIV 억제시험의 타당성을 확인하기 위해 동시에 시행하였다. 모든 시험은 3개 한벌로 수행하고 96-웰 둥근바닥 마이크로타이터 플레이트를 모든 분석에 사용하였다.
양성 큰트롤은 시료가 없은 세포 배지의 존재하에서 배양된 HIV-1 감염된 림프구였다. 음성 콘트롤은 복제할 수 없는 열-불활성화된 바이러스 접종물로 감염된 림프구였다. 이들 “모의감염된” 림프구를 배양하고 감염된 세포와 동일한 방법으로 분석하였다. 잔류 접종물로 인해 전적으로 배양물에 존재하는 바이러스 단백질의 양은 바탕수준으로 측정하였다. 다음에 바이러스 복제에 의한 양성 콘트롤 및 시험 시료중 바이러스 단백질 p24의 양은 바탕수준 미만의 각 p24 수준으로 측정하였다.
바이러스 증식으로 인해 시료 함유 배양물에 존재하는 바이러스 단백질의 양을 양성 콘트롤, 즉 시료가 없는 배양물에서의 것과 비교하였다. HIV 증식의 % 억제를 양성 콘트롤과 시료 사이의 p24 수준차로 측정하고, 양성 콘트롤의 p24 수준으로 분할하여 100%에 맞추었다.
AZT 콘트롤을 각각 100, 10, 1 및 0.1ng/mL의 농도에서 아지도티미딘(AZT)의 존재하에서 배양된 HIV-1 감염된 림프구를 통해 시행하였다. 이것은 AZT, HIV-1 복제의 공지된 저해제에 대한 림프구의 감도측정을 제공하였다. 10ng/mL의 농도의 AZT로 인한 HIV-1 증식의 억제는 미처리된 양성 콘트롤과 비교하여 50% 보다 커야 한다.
표 3은 AZT 콘트롤 뿐만 아니라 HHT888-4 및 HHT888-5의 세포독성 및 HIV 억제 시험결과를 요약한다. 두 허브 혼합물은 2.5-5.0mg/mL,에서 감염된 사람 림프구의 HIV 증식을 억제하는데 활성이었으나, 50㎍/mL(50-100배 희석)에서는 아니었다. 모든 세트로부터 AZT 콘트롤은 기대된 활성을 나타내어 시험의 타당성을 확인하였다.
2.5-5.0mg/mL의 HHT888-4 및 HHT888-5에서, 감염된 사람 림프구에서의 HIV 증식은 본질적으로 완전히 억제, 즉 처리후 제3일 및 제4일 둘다에서 측정한 바이러스 단백질 p24에 의거하여 97-100% 억제 및 바이러스 RNA에 의거하여 99-100% 억제되었다. 50㎍/mL에서의 항 HIV 활성은 두 허브 혼합물에 대해 무시될 수 있는 0-12%였다. 활성은 불용성 미립자가 분석전에 0.45㎛ 필터에 의해 여과되기 때문에 불용성 미립자에 기인할 수 없었고 활성은 세포독성에 기인하지 않았다. 3 로트의 HHT888-4에 대한 반복 시험은 허용가능한 세포독성(콘트롤 증식 71-100%)으로 제3일 및 제4일 둘다에서 2.5㎎/mL에서 100% 억제를 나타냈다. 2.5mg/mL에서 3 로트의 HHT888-5에 대한 반복 시험은 허용가능한 세포독성(콘트롤 증식 85-91%)으로 제3일에 93-98% 및 제4일에 89-99% 억제를 나타냈다. 반복 실험의 결과는 표 4에 나타낸다.
로트 3의 HHT888-4 또는 HHT888-5를 동일한 중량 농도에서 각각의 단일 허브성분을 혼합함으로써 제조하였다. 로트 3의 HHT888-5는 No.5(10) 및 No.5(11)을 제외하고 9개의 단일 허브 성분을 포함하였다.
1 내지 2 로트의 HHT888-4 및 HHT888-5의 물 추출물(E 내지 E2)을 활성성분이 물 추출성인지를 알기 위해 더 시험하였다. HHT888-4 및 5의 물 추출물을 MilliQ 정제수 25mL로 2회 분말 5g을 추출함으로써 제조하였다. 각각의 물 현탁액을 1분동안 와동시키고 5분동안 방치하고 다시 1분동안 와동시켜 추출을 촉진시켰다. 추출물을 20분동안 1,000-2,000rpm에서 원심분리기에 의해 불용성물로부터 분리하였다. 상청액을 깨끗한 미리 칭량된 50mL 원심분리기관으로 옮기고 냉동건조시키고 칭량하여 항 HIV 활성에 대해 시험하였다.
추출한 물질의 중량%는 HHT888-4(로트 2)의 제1추출물 25mL에 대해서는 17.3% 및 제2추출물 25mL에 대해서는 10.8%였다. HHT888-5(로트 2)의 제1추출물 25mL에 대해서는 25% 및 제2추출물 25mL에 대해서는 4.6%였다. HHT888-4(로트 2)의 제1(E1), 제2(E2) 및 합한(E) 추출물을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 모든 다른 추출물을 합한 제1 및 제2추출물로 시험하였다. 또한 결과는 표 4에 기재되어 있다.
각 허브 혼합물의 모든 3 로트는 HHT888-4에 대해서는 2.5mg/mL에서 100% 억제 및 HHT888-5에 대해서는 2.5-5.0mg/mL에서 89-100% 억제로 매우 활성이었다. IC50은 HHT888-4에 대해서는 0.05-2.5mg/mL 사이 및 HHT888-5에 대해서는 0.5-2.5mg/mL 사이에 있다. IC50은 바이러스 증식의 50% 저해를 일으키는 시험물질의 농도이다.
HHT888-4의 물 추출물은 O.5-1.0mg/mL에서 93-100% 억제로 매우 양호한 활성을 나타냈다. 로트 2의 제1(El) 및 제2의 물 추출물(E2)은 1.0mg/mL에서 제3일에 100% 억제 및 제4일에 87-96% 억제로 유사한 활성을 나타냈다. HHT888-4의 물 추출물의 IC50은 0.1-O.5㎎/mL 사이에 있다.
HHT888-5(로트 2)의 물 추출물은 1.0mg/mL에서 제3일에 71% 억제가 제4일에 26% 억제로 떨어져 실질적으로 낮은 활성을 나타냈다. 주 활성성분은 외관상 불용성 분획으로 남아 있고 상기한 조건하에서 HHT888-4에서와 같이 용이하게 물로 추출되지 않았다. HHT888-5(로트 2)의 물 추출물은 19중량%의 허브 혼합물을 이룬다는 것을 주의한다. 1.0mg/mL에서 HHT888-5(또는 HHT888-5-E)의 물 추출물의 시험농도는 5.3㎎/mL의 HHT888-5 자체에 상당한 것이다. HHT888-5는 2.5mg/mL(제3일에 93-98%, 억제 및 제4일에 89-99%) 및 5.0mg/mL(제3일에 100% 억제 및 제4일에 97%) 둘다에서 매우 활성이라는 것을 시험하였다.
상기 결과는 두 HHT888-4 및 HHT888-5 및 그것의 물 추출물이 시험관내에서 항레트로바이러스 활성, 보다 구체적으로 항 EMuLV 및 항 HIV 활성을 갖는다는 것 을 분명하게 입증하였다. 또한 HHT888-5는 B형 간염 바이러스 보균자를 치료하는데 효과적이라는 것도 나타냈다.
실시예5
개개의 단일 허브 생약의 항레트로바이러스 시험
본 실험에서, HHT888-4 및 HHT888-5의 개개의 단일 허브 성분을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 표 5는 시험결과를 기재하고 있다.
HHT888-4의 모두 5개의 단일 허브 성분은 2.5mg/mL에서 제3일에 73-100% 억제 및 제4일에 50-100% 억제의 다양한 정도로 항 HIV 활성을 나타냈다. No.4(3) 및 No.4(4)는 제3일 및 제4일 둘다에서 2.5mg/mL에서 100% 억제의 최고의 활성을 나타냈다. No.4(2) 및 No.4(5)는 2.5mg/mL에서 제3일에 92-98% 및 제4일에 92-94% 억제로 그 다음이었다. No.4(1)은 2.5㎎/mL에서 제3일에 73% 억제 및 제4일에 50% 억제로 보통의 활성을 나타냈다. No.4(5)는 0.5와 2.5㎎/mL 사이의 ID50을 갖는 관찰된 활성에 기여할 수 있는 약간의 세포독성(콘트롤 증식 41-79%)을 나타냈다.
HHT888-5의 11개의 단일 허브 성분중 3개인 No.5(4), No.5(5) 및 No.5(8)은 2.5mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 HIV 증식의 93-100% 억제로 매우 양호한 활성을 나타냈다. No.5(11)은 2.5mg/mL에서 제3일에 92% 억제및 제4일에 74% 억제로 그 다음이었다. 다시, No.4(1)과 동일한 No.5(1)은 2.5mg/mL에서 제3일에 73% 억제 및 제4일에 50% 억제로 보통의 활성을 나타냈다. No.5(2) 및 No.5(7)은 2.5mg/mL에서 제3일에 18-50% 억제 및 제4일에 29-38% 억제로 단지 한계 활성을 나타냈다. No.5(10)은 2.5mg/mL에서 제3일에 65% 억제였고 이것이 제4일에 O%로 떨어진 매우 적은 활성을 나타냈다. 남은 3개의 단일 허브 성분인 No.5(3), No.5(6) 및 No.5(9)는 0.5-2.5mg/mL에서 활성을 나타내지 않았다. No.5(9)는 그 세포독성:이미 O.5mg/mL에서의 콘트롤 증식 24-78%로 인해 2.5mg/mL 수준에서는 시험하지 않았다.
No.5(4) 및 No.5(8)이 No.5(5)보다 약간 더 활성이지만(2.5㎎/mL에서 100% 대 93% 억제), 그것의 활성은 일부 세포독성(2.5mg/mL에서 콘트롤 증식 32-64%)때문일 수 있다. 이것은 0.5-1.0mg/mL의 저 수준에서 시험하였을 때 활성 소실(0% 억제)에 의해 유지되고 세포독성은 분석에 대해 보다 낮고 더욱 허용가능하였다.
실시예 6
약초의 항 HIV 시험
단일 허브 생약 No.5(5)의 식물 공급원인 Aeginetia indica는 대만에 있는 지방 본초 가게로부터 얻고 그 항 HIV 활성에 대해 시험하있다. 이것은 활성이 시판 공급원으로부터 구입하는 대신에 그 식물 공급원으로부터 직접 제조된 생약에서 재현될 수 있는지를 알기 위해서였다.
식물 전체를 실시예 2에 기재된 대로 냉수로 세척하고 건조시키고 분쇄하고 비등수로 추출하였다. 수용액을 여과에 의해 식물 재료로부터 분리하였다. 다음에 수용액을 가열하여 부피를 감소시켰다. 농축물을 동일한 식물 재료의 분말화된 물질에 흡수 및 분무건조시켜 이하 원(raw) No.5(5)로 지정된 분말 형태의 생약을 제조하였다.
Aeginetia indica, 또는 원 No.5(5)로부터 제조된 분말화된 생약을 주위 온도에서 물로 추출하였다. 2개의 시료 5.00g을 각각 1분동안 와동시키고 10분동안 방치하고, 다시 1분동안 와동시킴으로써 별도의 50mL 플라스틱 원심분리기관에서 매회 약 40mL의 물로 2회 추출하였다. 관을 불용성 잔류물로부터 추출물을 분리하기 위해 20분동안 150Orpm에서 원심분리하였다. 추출물을 와트만 No.4 여과지를 통해 여과하고 냉동건조 또는 질소건조시키고 칭량하였다.
원 No.5(5)의 물(pH ∼ 5.1)에 의한 상기 추출을 반복하고 제1추출물의 pH는 5.7로 측정되었다. 제1 및 제2추출물을 각각 잔류물로부터 분리하고 공기건조시키고 칭량하였다. 추출가능한 중량%는 18.7±2.8%(n=2)로 측정되었다.
원 No.5(5)의 제1물 추출물을 항 HIV 활성에 대해 시험하여 1.0㎎/mL에서 제3일에 91% 억제 및 제4일에 97% 억제로 활성이라는 것을 알았다. 세포독성 시험은 추출물이 이 수준, 콘트롤 증식 99%에서 세포독성이 아니라는 것을 나타냈다.
실시예 7
C형 간염 환자의 치료
HHT888-5는 사람에서 HBV 감염을 시험하는데 효과적이고 안전하다는 것이 입증되었다. 이것은 HHT888-5의 유효성분이 실시예 3에서 나타낸 HBV 표면항원(HBsAg)의 감소로 지적된 바와 같이 치료될 환자에서 HBV를 감소시키기 위해 경구 투여를 통해 사람에서 생물학적 이용 효능이 있어야 한다는 것을 의미한다. 또한 호즈미 등은 시험관내에서 항바이러스 활성을 나타내는 물질이 종래 기술 부분에서 기재된 바와 같이 생체내에서 항바이러스 활성을 갖는다는 생각을 지지하기 위해 미국특허번호 5,411,733에 실시예를 제공하였다. 또한 HHT888-4 또는 HHT888-5 및 그것의 물 추출물 또는 유효성분은 사람에서 HIV 감염을 치료하는데 효과적이라고 생각하는 것이 논리적이다.
이 생각을 시험해 보기 위해, HHT888-4 및 HHT888-5의 항 HIV 활성 단일 허브 주성분 6개를 선택하여 HCV 감염을 일으키는 C형 간염 환자를 치료하였다. 이 논리는 두 HCV 및 HIV가 레트로바이러스인 것이다. C형 간염 바이러스는 만성병이 되는 경향이 있어 치료약을 시험하는데 보다 적당하다. 치료약이 HCV에 감염된 환자에게 잘 듣는다면, 또한 HIV에 감염된 환자에게도 잘 들을 것이다. 실시예 7은 이 생각의 타당성을 분명하게 입증하고 있다.
HHT888-4 및 HHT888-5의 항 HIV 활성 단일 허브 주성분 6개를 선택하고 혼합하여 HCV 감염을 일으킨 C형 간염 환자를 치료하였다. 선택된 6개의 단일 허브 생약은 No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.5(4), No.5(5) 및 No.5(8)이었다. No.4(5)는 이것이 어떤 미확인 독성을 가질 수 있다고 생각되었기 때문에, 매우 양호한 활성을 나타냈지만 포함되지 않았다.
6개의 단일 허브 생약은 시판 공급원으로부터 구입하고 굿 매뉴팩쳐 프랙티스(GMP) 가이드라인을 수행하여 제조하였다. 이것은 각종 조합에서 원하는 비율에 따라 혼합하여 허브 혼합물 HHT888-45를 실시예 1에 기재된 대로 제조하였다. 환자의 동의는 치료를 시작하기 전에 얻었다.
환자에게 매회 2.7-5.7g씩 하루에 3번 허브 혼합물을 마시도록 지시하였다. 허브 혼합물 HHT888-45의 단위 투여량을 개개의 패킷에서 제조하였다. 허브 혼합물의 각 단위 투여량 패킷(2.7-5.7g)을 온수와 혼합하고 경구투여하였다. 모든 환자를 No.4(3), No.4(4), No.5(4) 및 No.5(5) 함유 HHT888-45로 치료하였다. No.5(8) 또는 No.4(2) 또는 둘다를 치료약의 유효성을 증강시키기 위해 치료 초기 또는 그 동안 일부 환자의 치료를 위해 HHT888-45에 가하였다.
치료과정 동안에, No.4(3), No.4(4), No.5(4) 및 No.5(5)의 1일 투여량은 각각 2 내지 3g에서 변화시켰다. 또한 No.5(8)의 1일 투여량도 사용할 때에 2 내지 3g에서 변화시켰다. No.4(2)의 1일 투여량은 사용할 때에 1.5 내지 2g에서 변화시켰다. 투여량은 질병의 진행에 따라 변화시켰다.
7명의 C형 간염 바이러스 환자를 치료하였다. 이들의 혈청 간장 효소인 SGOT 및 SGPT를 질병의 진행을 모니터하기 위해 치료과정 동안에 지방 임상 실험실에서 자주 측정하였다. SGOT 및 SGPT를 효소 분석을 사용하여 측정하였다. (1) Instruction of Kyokuto TA-E Transaminase Assay Reagents, Permit No.(62AM)0885, Kyokuto Pharmaceutical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan, 1994; (2) Instruction of Yatrozyme TA-Lq Transaminase-assay Reagent Solution (Enzyme Assay), Commodity No.817245(RM163-K), Yatron Co., Ltd., Diayatron Co., Ltd., Tokyo, Japan; 및 (3) U.Lippi & G Guidi, Clin. Chem. Acta., 28, 431-43(1970) 참조.
혈청 GOT 및 GPT의 수준은 간장에서 세포 손상정도와 분명하게 상관한다. 이들 시험은 간장 질환의 진단에서 그리고 간장 기능의 인디케이터로서 폭넓게 사용된다. SGOT의 정상 범위는 8-40단위/mL이고 SGPT는 5-35단위/mL이다. 상승된 SGOT 및 SGPT 수준은 통상 손상된 간장 기능을 나타낸다.
HHT888-45 치료 결과는 표 6에 나타낸다. 모두 7명의 치료환자는 상승된 수준(48 내지 166단위/mL SGOT 및 41 내지 291단위/mL SGPT)에서 치료한 지 17 내지 178일 후에 본질적으로 정상 범위(8 내지 40단위/mL SGOT 및 5 내지 35단위/mL SGPT)로 복귀된 이들의 혈청 간장 효소를 가졌다. 따라서, 환자들의 간장 기능은 본 발명 조성물을 마시고 나서 정상으로 회복되었다.
결과는 허브 혼합물 HHT888-45가 C형 간염 환자를 치료하는데 효과적이라는 것을 분명하게 입증하고 있다. 이것을 이루기 위해, 원인 HCV를 근절시키거나 또는 내성이 있는 수준으로 감소시킬 필요가 있다. HHT888-45 성분이 매우 강한 항 HIV 시험관내 활성을 나타내고 몇몇 성분이 보균자에서 HBV를 감소시키는 효능을 나타내기 때문에, 허브 혼합물은 HIV 및 HBV에 감염된 환자를 치료하는데 효과적이다.
따라서 본 발명의 양태는 본 발명에 따른 허브 혼합물 함유 항바이러스 생약 및 각종 농도의 그 단일 허브 성분 및 유효량이 C형 간염, B형 간염 및 AIDS와 같은 다른 레트로바이러스 질환을 치료하는데 효과적이다.
본 발명 조성물의 약리학적 메카니즘 및 정확한 화학적 동정을 아직 설명할 수 없기 때문에, 항바이러스 활성이 단일 본초 성분, 성분의 조합 또는 생물학적 대사산물 또는 그 유도체에 기인할 수 있다는 것이 가능하다. 다음 실시예는 본원에 기재한 활성성분의 화학적 동정을 연구한다.
실시예 8
활성 단일 허브 성분의 분류
HHT888-5중 3개의 항 HIV 활성 단일 허브 주성분인 No.5(4), No.5(5) 및 No.5(8)을 물 추출, C18 고상 추출(SPE) 칼럼 액체 크로마토그래피(C18-SPE-LC) 및 C18 칼럼 고성능 액체 크로마토그래피(C18-HPLC)로 분류하였다. 또한 허브 혼합물 HHT888-4를 비교하기 위해 동시에 분류하었다. 목적은 각 항 HIV 활성 생약 또는 약초의 활성 화합물 또는 화합물들을 동정하기 위해서였다.
1. 물 추출
단일 허브 생약인 No.5(4), No.5(5) 및 No.5(8) 및 허브 혼합물인 HHT888-4를 매회 시료 g당 물 8 내지 1OmL(예를들면, 물 40mL로 분말 5g 및 물 50OmL로 분말 50g)로 주위 온도(약 25℃)에서 물로 2회 추출하였다. 물 현탁액을 15분동안 교반하고 1분동안 와동시키고 10분동안 방치하고 다시 1분동안 와동시켰다. 물 추출물을 20분동안 1,500rpm에서 원심분리기에 의해 불용성물로부터 분리하고 와트만 No.4 여과지로 여과하였다.
2. C18-SPE-LC
각 물 추출물을 C18-SPE 칼럼 액체 크로마토그래피로 분류하였다. 추출물의 분액 10mL를 에탄올 50mL 및 물 100mL로 미리 처리한 10g ISOLUTE C18(EC)-SPE 칼럼(International Sorbent Technology, Ltd., Hengoed, Mid-Glamorgan, UK 또는 Jones Chromatography, Lakewood, Colorado, USA에서 구입)에 적재하였다. SPE 칼럼(2.6cm 내직경 2.7cm 길이 플러스 내용적 60mL)에 19%의 탄소 적재 및 평균입경 61㎛인 끝이 밀폐된(EC) C18 흡수입자 10g을 충전하였다.
적재된 칼럼을 물 90mL, 에탄올 100mL, 에탄올중 1% HCl 100mL 및 10/90, v/v에서 에탄올/물중 0.1% HCl 50mL로 순서대로 그리고 중력으로 용리하였다. 용출물을 시료 50mL로 수집하였다. 물용출물을 유리 플라스크에서 냉동건조시키거나 또는 플라스틱 칭량접시에서 공기건조시켰다. 에탄올, 산성 에탄올 및 산성 에탄올/물용출물을 각각 플라스틱 칭량접시에서 공기건조시켰다. 공기건조시킨 산성 에탄올(에탄올중 1% HCl) 및 산성 에탄올/물(10/90, v/v에서 에탄올/물중 0.1% HCl) 용출물을 각각 1% HCl/에탄올 및 물에 재용해하고; 그 다음에 4mL WISP 바이알로 옮기고 질소하에서 다시 건조시켰다. 제1 물 용출물(A) 50mL, 제1 에탄올 용출물(B) 50mL, 제1의 1% HCl/에탄올 용출물(C) 50mL 및 0.1% HCl/10% 에탄올/90% 물 용출물 (D) 50mL의 건조시킨 분획을 상기한 바와 같은 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 표 7에 나타낸다.
표 7은 HHT888-4E, No.5(4)E, No.5(5)E 및 No.5(8)E의 C18-SPE-LC 분획인 A, B, C 및 D의 세포독성 및 항 HIV 활성 시험결과를 기재하고 있다.
3 내지 5회 실시로 측정한 각 시료의 물 추출물(E)에 대한 각 C18-SPE-LC 분획의 평균 중량% 및 표준편차도 표 7에 나타나 있다. 회마다 칼럼에 적재된 시료는 건조 중량에 의거하여 HHT888-4E에 대해서는 199 내지 205mg, No.5(4)E에 대해서는 94 내지 95㎎, No.5(5)E에 대해서는 124 내지 130mg 및 No.5(8)에 대해서는 165 내지 178mg이었다.
결과는 No.5(5)E의 물 용출물(A) 및 1% HCl/에탄올 용출물(C) 분획 및 HHT888-4E의 1% HCl/에탄올 용출물 분획(C)이 큰 활성 분획(0.1mg/mL에서 제3일에 HIV 증식의 91 내지 96% 억제 및 제4일에 85 내지 96% 억제) 및 비세포독성(85 내지 99%의 콘트롤)이라는 것을 나타낸다. 공기건조는 No.5(5)E의 물 용출 분획(A)의 활성에 영향을 끼치지 않았다. 공기건조시킨 No.5(5)E-A는 0.3mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 99% 억제 및 O.1mg/mL에서 제3일에 91% 억제 및 제4일에 86% 억제의 활성을 나타냈다. 비교를 위해, 냉동건조시킨 No.5(5)E-A는 1.0mg/mL에서 제3일및 제4일 둘다에서 100% 억제 및 O.3mg/mL에서 제3일에 100% 억제 및 제4일에 94% 억제의 활성을 나타냈다.
또한 HHT888-4E, No.5(5)E 및 No.5(8)E의 에탄올 용출물 분획(B)은 HHT888-4E에 대해서는 O.2mg/mL에서 제3일에 100% 억제 및 제4일에 87% 억제, No.5(5)E에 대해서는 O.1㎎/mL에서 제3일에 98% 억제 및 제4일에 90% 억제, 그리고 No.5(8)E에 대해서는 O.3mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 100% 억제의 양호한 항 HIV 활성을 나타냈다. 그러나, 관찰된 활성은 세포독성에 일부 기인할 수 있는데, 콘트롤 증식은 HHT888-4에 대해서는 21 내지 95%, No.5(5)E에 대해서는 48% 그리고 No.5(8)E에 대해서는 24 내지 68%였다. 이 가정은 시료농도가 보다 낮은 세포독성 수준으로 저하되었을 때 현저한 활성 감소에 의해 지지되었다. 예를들면, 활성은 농도가 0.1에서 O.07mg/mL로 감소되었을 때 No.5(5)E-B에 대해서 제4일에 90%에서 41% 억제로 감소되었다. 활성은 농도가 O.3에서 O.1mg/mL로 감소되었을 때 No.5(8)E-B에 대해서 제4일에 100%에서 30% 억제로 감소되었다.
HHT888-4E 및 No.5(8)E의 물 용출 분획(A)은 HHT888-4E에 대해서는 0.7mg/mL에서 제3일에 98% 억제 및 제4일에 61% 억제를 그리고 No.5(8)E에 대해서는 0.5mg/mL에서 제3일에 93% 억제 및 제4일에 54% 억제의 보통의 항 HIV 활성을 나타냈다. 그러나, 활성은 세포독성에 일부 기인할 수 있는데, 이것은 HHT888-4E에 대해서는 50 내지 73% 및 No.5(8)E에 대해서는 70%였다. No.5(8)E-A의 활성은 농도가 O.5에서 0.3mg/mL으로 감소되었을 때 제4일에 54%에서 5%로 감소되었고, 세포독성 수준(70-100%의 콘트롤)이 보다 허용가능해졌다.
No.5(4)E의 물 용출 분획(A)는 각각 O.2 내지 1.0mg/mL에서 제3일에 90 내지 99% 억제 및 제4일에 14 내지 20% 억제의 한계 활성이었다. No.5(4)E의 에탄올 용출물 분획(B), No.5(4)E 및 No.5(8)E의 1% HCl/에탄올 용출물 분획(C) 및 모두 4개의 시료중 O.1% HCl/10% 에탄올/90% 물 용출 분획(D)은 0.05 내지 O.1mg/mL에서 제3일에 14 내지 80% 억제 및 제4일에 0 내지 2% 억제로, 시험한 수준에서 본질적으로 활성이 아니었다.
No.5(5)E의 C18-SPE-LC 분류의 추가의 조작을 시행하여 다른 평가를 위해 보다 많은 No.5(5)E-A 및 C 분획을 얻었다. No.5(5)의 물 추출물(E)을 바로 (칼럼당 10mL) 적재하거나 먼저 냉동건조 또는 공기건조하고 물(20 내지 80㎎/mL)에 재용해한 다음에 분류를 위해 적재(칼럼당 5mL)하였다. No.5(5)E의 이들 조작으로부터 각 분획의 전체 중량% 분포는 A=74.2±6.0%, B=12.2±4.0%, C=8.2±2.1% 및 D=2.1±0.9%였다. 이들 값은 표 7에 나타낸 값과 양호하게 일치하였다.
3. C18-HPLC
상기 공기건조시킨 No.5(5)E를 C18-HPLC로 더 분류하였다. 시료 500.9mg을 물 5.0OmL에 용해하고 그 다음에 20분동안 1500rpm에서 원심분리기에 의해 용액을 불용성물로부터 분리하였다. 상청액을 0.45㎛ 필터로 여과하여 모든 불용성 잔류물을 제거하여 수용성 분획(WS)을 나타내었다. 침전물을 물 5.0OmL로 3회 이상 추출하고 수불용성 분획(WI)으로서 질소건조시켰다. 수용성 분획(WS)을 Rainin Dynamax C18 제조컬럼(21.4×250㎜,5㎛ 입자) 및 다음 조건을 사용하여 구배 HPLC로 분류하였다:
유속 : 9.00mL/분
주입 부피 : 200 μL
검출 : 2.0OAUFS에서 UV 214nm
구배 : 시간 아세토니트릴/물
0-10분 2/98
10-25분 2/98→98/2(선형)
25-30분 98/2
30-35분 98/2→2/98
35-70분 2/98
분획을 2.5분 간격으로 수집하였다. 전체 28개의 분획을 각 분획에 대해 22.5mL로 수집하였다. 표 8은 어떤 분획을 분석을 시행하기 전에 푸울화하였음을 나타냈다.
상기 질소건조시킨 C18-HPLC 분획의 각각을 0.33㎎/mL의 출발물질, 즉 공기 건조시킨 No.5(5)E-A의 수용성 분획(WS)에 상당한 농도에서 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 목적은 O.3mg/mL에서 HIV 증식 99% 억제(표 7 참조)로 매우 활성이라는 것을 시험한 공기건조시킨 No.5(5)E-A의 활성 분획 또는 분획들을 동정하기 위해서였다. 0.33㎎/mL의 출발물질에 상당한 농도에서 어떤 활성 분획이 99% 억제의 매우 양호한 활성을 갖는다는 것도 기대되었다. 또한 공기건조시킨 No.5(5)E-A의 제1 물 추출물(WS) 및 침전물(WI)을 O.33mg/mL에서 동시에 시험하였다. 표 8은 이 결과를 기재한다. 각 분획의 중량%가 포함되고 분획 3은 주 피크를 함유한다.
표 8은 분획 WS-HPLC-F3이 대부분의 물질을 포함하나 본질적으로 항 HIV 분석에서 활성이 아니라는 것을 나타낸다.
이들 결과는 매우 놀랍다. 시험한 모든 C18-HPLC 분획은 제3일에 0-46% 억제및 제4일에 0-4% 억제로 본질적으로 불활성이었다. 또한 수용성 분획(WS)은 기대했던 것보다 현저하게 저 활성(0.33mg/mL에서 제3일에 86% 억제 및 제4일에 63% 억제)을 나타내었다. 약초로부터 활성성분의 분리 및 정제동안에 소실된 이 유형의 활성은 화합물이 그 매트릭스로부터 분리될 때 공동 효과의 소실에 주로 기인함으로써 폭넓게 행해져 왔다.
본 발명자들의 결과는 활성성분이 원래 기대했던 수용성 분획(WS) 대신에 수불용성 분획(WI)에 놀랍게도 남아 있다는 것을 나타내었다. 불용성 분획은 0.33㎎/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 100% 억제로 매우 활성이라는 것을 시험하였다. 이것은 공기건조시킨 No.5(5)E-A의 주 활성성분이 가용성 분획(WS) 대신에 수불용성 분획(WI)이라는 것을 의미한다.
No.5(5)E-A의 활성성분은 이것이 C18-SPE-LC 물 용출 분획이기 때문에 원래
수용성이었다. 공기건조동안에 수불용성이 되어 수불용성 분획으로 잔류하였다. 다음에 수불용성 분획은 활성을 시험하기 위해 중성의 세포 배지에서 가용성이 되어야 한다. 이것은 세포 배지중 시료 용액을 원심분리하고 0.45㎛ 여과하여 항 HIV분석을 하기 전에 불용성 물질을 제거하는 경우이어야 한다.
실시예 9
활서성분의 동정
1. No.5(5) E-A
항 HIV 분석을 위해 시료를 용해하는데 사용된 세포 배지의 pH는 7.3±O.3이었다. 따라서 No.5(5)E-A의 활성성분은 세포 배지와 같은 중성 수용액에 가용성이나 HCl을 함유한 다른 C18-SPE-LC 분획과 함께 후드에서 공기건조시키는 동안 HCl 증기 함유 분위기에 노출되었을 때 산성화되어 불용성이 된다고 가정하였다. 이것은 No.5(5)E-A의 활성성분의 산 형태가 수불용성이고 산성화되었을 때 침전된다는 것을 의미한다. No.5(5)E-A는 No.5(5) 물 추출의 C18-SPE-LC 물 용출 분획이다.
이 가정을 시험하기 위해, 본 발명자들은 다양한 용매중의 No.5(5)E-A로부터 상기 활성 침전물(WI)의 용해도를 시험하였다. 침전물은 에탄올중 1% HCl 및 에탄올/물(10/90, v/v)중 0.1% HCl과 같은 산성 에탄올 용액 및 물에 약간 가용성이어서 암갈색 침전물이 있는 매우 밝은 담황색 용액을 형성하였다. 침전물은 메탄올, 아세톤 및 1% 염산에 불용성이었다. 침전물은 중성 포스페이트 완충염수(PBS, pH 7.2)에 가용성이나 서서히 용해되어 밤새 암갈색 용액이 되었다. 침전물은 1% 수산화암모늄 용액(pH 10.4)에 신속하고 완전하게 용해되어 신속하게 암갈색 용액이 되었다. 이것은 활성성분이 중성 또는 알칼리성 용액에는 가용성이나 산성 용액에는 불용성이라는 상기 가정을 확인하였다.
용해도 시험에 의거하여 No.5(5)E-A의 활성 침전물은 산이어야 한다. 알콜(메탄올, 에탄올, 이소프로판올), 아세톤 및 다른 통상의 유기용매(아세토니트릴,클로로포름 및 헥산)에 불용성인 사실은 벤조산과 같은 단순한 유기산일 수 없다는 것을 제시하고 있다. pH의 증가에 따라 수용액에 보다 더욱 가용성이 되는 사실은 그것의 산 형태에서 보다 가용성인 염 형태로의 전이를 나타내었다.
No.5(5)E-A의 활성성분을 보다 분명하게 동정하기 위해, 다르게 건조시킨 No.5(5)E의 3가지 물 용출 분획을 상기 HPLC 분류에서 사용된 공기건조시킨 No.5(5)E-A에서와 동일한 방법으로 물로 추출하였다. 한 분획은 냉동건조시켰고 (FD) 두 개는 공기건조시켰다(AD1 & AD2). AD1 및 FD를 동일한 물 용출물로부터 제조하였다. AD2는 활성을 놀랍게도 수불용성 분획(WI)에서 발견한 것이었다.
각 시료를 100mg/mL에서 물에 용해하고 원심분리(20분동안 1,500rpm)하여 불용성물로부터 가용성물을 분리하였다. FD 및 AD1에 대해, 시료 1.20g을 물 12.0mL에 용해하였다. AD2에 대해, 0.567g을 물 5.67mL에 용해하였다. 각 침전물을 동일한 양의 물로 3회 이상 추출하였다. 각 추출물의 분액 O.40mL를 질소건조시키고 칭량하였다. 잔류 추출물을 각각 0.45-㎛ 여과하고 1% HCl로 산성화(추출물 10mL에 대해 산 4mL)하고 원심분리(20분동안 1,500rpm)하였다. 산 침전물(AP)을 0.01% HCl(pH 2.82) 1OmL로 2회 그리고 물 10mL로 2회 세척하고 질소건조시키고 칭량하였다.
표 9는 냉동건조(FD) 및 공기건조(AD1, AD2) No.5(5)E-A의 각 물 추출물의 pH, 각 추출물 및 침전물의 중량% 분포, 각 추출물의 산 침전물 형성 및 각 No.5(5)E-A로부터 합한 산 침전물의 중량%를 나타낸다.
AD2의 물 추출물은 AD1(pH 4.8-5.5) 및 FD(pH 5.8-6.1)의 것보다 더욱 산성(pH 3.2-3.9)이라는 것을 분명하게 나타내었다. AD2 시료는 AD1(3.1%) 및 FD(0.9%)보다 더 수불용성 물질(9.4%)을 함유하였다. 물 추출물이 보다 산성일수록 분리되는 불용성 물질의 양은 많았다.
물 추출물을 산성화하였을 때, FD 및 AD1의 제1 및 제2 추출물은 침전물을 형성하였고, 반면 AD2의 것은 그렇지 않았다. 대신에, 원래의 pH가 3.9인 AD2의 제3 및 제4추출물에서 일부 침전물이 형성되었다. 미량의 침전물이 FD의 산성화된 제3추출물에서 관찰되었고, 한편 FD의 제4추출물 및 AD1의 제3 및 제4추출물에서는 침전물이 관찰되지 않았다.
이것은 활성 침전물이 pH 3.2-3.5에서 물에 불용성이고, pH 3.9에서는 약간 가용성이고 pH 4.8 이상에서는 가용성이 된다는 것을 나타내었다. 용액의 pH가 5.8-6.1인 대부분의 FD는 물에 가용성이었다. 단지 O.9%만이 불용성이었다. 용액의 pH가 4.8-5.5인 AD1은 약간 많은 불용성 물질 또는 침전물을 3.1% 함유하였다. 용액의 pH가 3.2-3.9인 AD2는 더욱 많은 불용성 물질 또는 침전물을 9.4% 함유하였다. FD 및 AD1의 물 추출물이 산성화되었을 때, 침전물이 형성되었다(8.3-8.5%). FD(9.4%) 또는 ADl(11.4%)의 전체 침전물은 AD2(9.7%)의 것과 비교할 수 있었다. 냉동건조시킨 No.5(5)E-A 또는 FD의 제1추출물로부터의 산성 상청액의 중량%는 78.4%이고, 이것은 물질의 나머지에 대해 계수하였다.
FD의 제1물 추출물 및 침전물, 그리고 FD의 제1물 추출물의 산성 상청액 및 산 침전물을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 표 1O에 나타내고, FD 또는 냉동건조시킨 No.5(5)E-A의 활성성분이 원래 물에 가용성이어서 산에 의해 침전된다는 것을 분명하게 나타내었다. FD의 주 활성은 물 추출물에 있었고(0.3㎎/mL에서 제3일에 89% 억제 및 제4일에 96% 억제) 침전물에는 없었다(0.3mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 13% 억제). 다음에 물 추출물의 주 활성은 산 침전물에 있었고 (0.3mg/mL에서 제3일에 97% 억제 및 제4일에 98% 억제) 산성 상청액에는 없었다 (0.3mg/mL에서 제3일에 4% 억제 및 제4일에 22% 억제). 물 추출물(세포독성: O.3㎎/mL에서 75%의 콘트롤)의 세포독성 인자는 산(세포독성: 0.3mg/mL에서 60%의 콘트롤)에 외관상 가용성이었고 활성 산 침전물(세포독성: 0.3㎎/mL에서 90%의 콘트롤)으로부터 분리될 수 있었다.
따라서 냉동건조시킨 No.5(5)E-A의 활성성분은 공기건조시킨 No.5(5)E-A의 것과 본질적으로 동일하고, 둘 다는 산에 불용성이라고 가정하였다. No.5(5)E-A를 냉동건조시켰을 때, 활성성분은 물에 가용성이었고 용액이 산성화되었을 때는 불용성이 되었다. No.5(5)E-A를 공기건조시켰을 때, 활성성분중 일부 또는 전부를 AD1 및 AD2의 경우에서와 같이 산성화하여 불용성이 되었다·산의 공급원은 물 및 에탄올 용출물(A 및 B)이 동일한 후드내에서 산성 에탄올/물 용출물(C 및 D)와 함께 공기건조되기 때문에 산성 에탄올/물 분획으로부터의 HCl 증기였다.
이 가정을 입증하기 위해, AD2의 활성 물침전물을 중성 및 염기성 용액에 재용해하고 산으로 재침전시켰다. 따라서, 각 침전물의 두 개의 시료 50㎎을 PBS 완충액(pH 7.2) 또는 염기성 1% NH40H 용액(pH 10.4) 40mL에 용해하였다. 시료는 PBS 완충액에서는 서서히 용해되고 1% 수산화암모늄 용액에서는 신속하게 용해하였다. 두 시료를 냉장기에서 밤새 저장한 후조차도 완전히 용해되지 않았다. 다음에 용액을 40분동안 1,500 내지 2,000rpm에서 원심분리하여 가용성물을 불용성물로부터 분리하였다. 각 상청액을 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 각 갈색 침전물을 그 각각의 용매 10mL 및 물 10mL로 세척하였다. 세척물을 20분동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 분리하고 따라내었다. 각 세척된 침전물 및 각 여과된 상청액의 분액 4.00mL를 질소건조시키고 칭량하였다. 또한 PBS 완충액 4.00mL를 PBS 상청액의 용매 블랭크 보정을 위해 동시에 건조시켰다.
각 상청액의 두 분액 17.0mL을 별도의 50mL 원심분리기관으로 피펫으로 옮졌다. 한 분액을 침전물이 형성될 때까지 1% HCl로 적정하여 산성화하였다. 다른 분액을 침전물이 형성될 때까지 먼저 1% 아세트산으로 그 다음에 1% HCl로 적정하여 산성화하였다. 1% 아세트산 단독에 의한 적정은 침전물이 형성되는데 충분히 낮은 용액 pH를 얻는데 불충분하였다. 용액 pH를 침전물이 육안관찰되지 않는 약 3.4 내지 3.8의 pH에서 수준을 낮추기 위해 1% 아세트산으로 적정하였다. 1% HCl의 첨가는 침전물이 형성되는데 약 1.5 내지 1.8의 낮은 용액 pH를 얻는데 필요하였다. 육안관찰되는 침전물은 약 2.2 내지 2.5의 용액 pH에서 형성되기 시작하였다. 상청액 을 1% HCl로 적정하고 용액 pH를 1.4 및 1.5로 낮추어 침전물이 형성되였다. 침전물은 PBS 상청액에 대해서는 약 2.3 및 HCl로 적정한 NH4OH 상청액에 대해서는 약 3.3의 pH에서 형성되기 시작하였다.
산성 상청액을 20분동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 산 침전물로부터 분리하였다. 각 산성 상청액(AS)을 0.45㎛ 필터로 여과하고 질소건조시켰다. 각 산 침전물(AP)을 1% HCl 5mL로 1회 세척하고 질소건조시켰다. PBS 상청액 및 침전물, PBS 상청액의 침전물 및 산(HCl) 상청액, 및 NH4OH 상청액의 산(HCl) 침전물을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 표 11에 나타낸다.
결과는 AD2-WI의 활성성분이 pH 7.2에서 PBS에 그리고 pH 10.4에서 1% NH4OH 용액에 가용성이고 산에 의해 침전될 수 있다는 것을 분명하게 나타낸다. AD2-WI의 PBS 상청액은 매우 활성(0.3mg/mL에서 제3일에 94% 억제 및 제4일에 98% 억제)인 반면 PBS 침전물은 한계 활성(0.3㎎/mL에서 제3일에 26% 억제 및 제4일에 34% 억제)이다. 이것은 활성성분이 항 HIV 분석을 위해 중성 세포 배지에 용해되어야 하는 AD2-WI의 관찰된 활성과 일치한다.
AD2-WI의 활성성분을 HCl로 재침전시켰다. AD2-WI의 PBS 상청액의 HCl 침전물은 적당히 활성(0.3㎎/mL에서 제3일에 83% 억제 및 제4일에 92% 억제)인 반면 HCl 상청액은 보통 활성(0.3㎎/mL에서 제3일에 60% 억제 및 제4일에 65% 억제)이었다. HCl 상청액의 보통 활성은 세포독성(콘트롤 증식 50%)에 일부 기인될 수 있다. AD2-WI의 활성성분의 산 침전성은 매우 활성(0.3㎎/mL에서 제3일에 93% 억제 및 제4일에 97% 억제)인 AD2-WI의 NH4OH 상청액의 HCl 상청액에 의해 더 확인되었다.
이 정보로부터, No.5(5)E-A의 활성성분은 중성 또는 염기성 용액에 가용성이고 HCl과 같은 산에 의해 침전될 수 있다는 결론에 도달할 수 있다. 약 3.4 내지 3.8로 낮춰진 용액 pH를 단지 얻을 수 있는 아세트산은 활성성분을 침전시킬 정도로 충분히 강하지 않다. 이것은 그 산형태의 활성성분이 아세트산보다 강하고 염산보다는 약하다는 것을 의미한다. NH4OH와 같은 염기로 중화될 때, 활성 불용성산은 수용성 염이 되고 이것은 또한 HIV에 대해 활성이다.
보다 많은 활성성분을 "그대로"의 물 용출물 No.5(5)E-A 또는 1% HCl에 의한 적정으로 냉동건조된 No.5(5)E-A의 물 추출물로부터 산침전에 의해 제조하였다. 산 침전물을 물로 세척하고 냉동건조시켰다. 냉동건조시킨 산 침전물을 0.1N 중탄산암모늄(NH4HCO3)에 용해하고 물중 1% HCl의 1.5배 부피로 그것을 재침전함으로써 더 정제하였다. 예를들면, 시료 520.8mg을 0.1N NH4HCO320mL에 완전히 용해하였다. 용액을 22분동안 2.000rpm에서 원심분리하고 상청액을 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 용액의 분액을 18.7㎎/mL에서 20.0mL가 되게 0.1N NH4HCO3으로 희석하고, 다음에 이것을 물중 1% HCl 30.0mL로 산성화하여 암갈색의 보풀있는 현탁액 및 침전물을 형성하였다. 산성화된 용액을 22분동안 2,000rpm에서 원심분리하였다. 산성 상청액을 따라내고 제거하였다. 산 침전물을 물중 1% HCl 30 내지 45mL로 6회 세척하였다. 산 세척물을 22분동안 2,000rpm에서 원심분리하여 침전물로부터 각각 분리하여 버렸다. 한번 정제된 산 침전물(AP1X)을 냉동건조시키고 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 No.5(5)E-A의 AP1X가 0.31mg/mL에서 제3일에 75% 억제 및 제4일에 87% 억제의 활성이라는 것을 나타냈다. 즉 항 HIV 활성은 정제 공정에서 잔존하였다.
2. No.5(5)E-C
No.5(5)E-A의 활성성분은 중성 및 염기성 용액에 가용성이고 HCl에 의해 침전될 수 있는 것으로 동정하였기 때문에, No.5(5)E-C의 활성성분이 유사한 특징을 가지는지를 알기 위한 것이 논리적이었다.
공기건조된 No.5(5)E-C는 한 개는 갈색이고 다른 한 개는 거의 흑색에 가까운 암갈색인 두 개의 별개의 착색된 고형물을 함유하였다. 용해도 시험은 시험한 각 용매 1mL에 시료 1.1-1.2mg을 혼합함으로써 시행하였다. 공기건조된 No.5(5)E-C는 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름 및 헥산에 불용성이었다. 메탄올에는 약간 가용성이고 물, 물중 1% HCl, 에탄올중 1% HCl 및 10% 에탄올/90% 물중 0.1% HCl에는 일부 가용성이었다. 소량의 회백색 현탁액 또는 침전물로 물중 PBS, 0.1N NH4HCO3, 1% NH4OH 및 1% NaOH에 대부분 용해되었다. 용해도는 용액 pH가 산성에서 중성 내지 약간 염기성으로 점차 증가된 다음에 물중 1% NaOH와 같은 강염기에서 감소되는 것으로 나타났다.
물중 공기건조된 No.5(5)E-C, PBS, 0.1N NH4HCO3, 1% NH4OH 및 1% NaOH의 용액 1mL를 각각 0.45-㎛ 여과하고 물중 1% HCl로 산성화하였다. 침전물이 관찰되지 않은 산성수 용액만 제외하고 모든 산성화된 용액은 황갈색 내지 갈색 용액이 되고 갈색의 보풀있는 침전물이 형성되었다.
또한, 1% HCl/물 및 1% HCl/에탄올중 공기건조된 No.5(5)E-C의 용액 1mL를 각각 0.45㎛ 여과하고 1% NaOH와 혼합하여 용액을 알칼리성으로 하였다. 목적은 이들 용액이 불용성 물질을 함유하는지를 알기 위해서였다. 알칼리성 1% HCl/물 용액은 황색의 맑은 용액이 되고 알칼리성 1% HCl/에탄올 용액은 황갈색 내지 갈색 용액이 되었다. 둘다를 밤새 냉장기에서 저장한 후에 부분 금색인 갈색의 보풀있는 침전물이 형성되었다. 또한 0.1% HCl/10% 에탄올/90% 물중 No.5(5)E-C의 갈색 용액 1mL를 1% NH4OH 1.5mL만 제외하고 동일한 방법으로 알칼리성화하였다. 갈색 용액은 알칼리성이 되었을 때 담황색의 맑은 용액이 되었다. 밤새 냉장저장한 후에 침전물은 형성되지 않았다. 결과는 산성 및 염기성 물질을 각각 강산 및 강염기로 침전에의해 No.5(5)E-C로부터 분리할 수 있다는 것을 나타낸다.
No.5(5)E-C의 공기건조된 시료 100.4mg을 0.1N NH4HCO320.0mL에 용해하였다. 용액을 20분동안 2,000rpm에서 원심분리하고 상청액을 별도의 50mL 원심분리기관으로 옮겼다. 침전물을 0.1N NH4HCO315.0mL로 2회 이상 추출하였다. 상청액을 푸울화하였다(총 50mL). 침전물을 0.1N NH4HCO315.OmL로 1회 이상 세척하였다. 세척물을 30분동안 2,000rpm에서 원심분리기로 분리하여 버렸다. 침전물을 1 내지 2mL의 물이 있는 WISP 유리 바이알로 옮기고 질소건조시키고 건조후 0.5mg 또는 0.5%의 공기건조된 No.5(5)E-C 출발물질을 칭량하였다.
상청액을 O.45㎛ 필터로 여과하였다. 여과한 상청액의 두 분액 20.0mL를 두 50mL 원심분리기관으로 피펫으로 옮겼다. 제1분액 20mL를 물중 1% HCl 30mL로 산성화하고 보풀있는 침전물을 형성하였다. 제2분액 20mL를 1% NaOH 30mL로 알칼리성으로 만들었다. 알칼리성 용액은 밤새 냉장저장한 후에 맑고 현탁액 또는 침전물이 육안관찰되지 않았다. 또한 알칼리성 용액은 30분동안 2,000rpm에서 원심분리하거나 또는 50mL에서 14mL로 농축한 다음에 원심분리한 후에도 맑은 상태였다. 용액이알칼리성(22.5℃에서 pH 13.23)인 것을 보장하기 위해 1N NaOH 20mL를 추가로 첨가해도 어떤 육안관찰가능한 침전물은 제조되지 않았다.
산성화된 용액을 30분동안 2,000rpm에서 원심분리하여 보풀있는 산 침전물을 분리하였다. 산 침전물을 물중 1% HCl 2OmL로 3회 세척하였다. 각 세척물을 3O분동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 분리하여 버렸다. 세척한 산 침전물을 냉동건조시키고, 항 HIV 활성에 대해 시험하여 O.3mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 76% 억제로 나타낸 활성이라는 것을 알았다.
공기건조된 No.5(5)E-C를 산 침전성 활성성분을 제조하기 위해 다시 물중 1% HCl에 바로 용해함으로써 분류하였다. 산성 상청액을 염기 침전성 성분을 제조하기 위해 알칼리성으로 하였다. 공기건조된 No.5(5)E-C 시료 203.8mg을 1분동안 3회 현탁액을 와동시킴으로써 물중 1% HCl 20mL에 용해하였다. 산 가용성 부분을 30분동안 2,000rpm에서 원심분리하여 산 불용성물로부터 분리하였다. 산성 상청액(적갈색용액)을 0.22㎛ 필터로 여과하였다. 산성 상청액의 분액 2.0OmL를 질소건조시키고 12.2㎎, 또는 59.9%의 공기건조된 No.5(5)E-C 출발물질을 칭량하였다. 침전물은 약 5분동안 냉장기에서 냉각시킨 후에 형성되었다. 염기 침전물을 60분동안 2,000rpm에서 원심분리하여 염기성 상청액으로부터 분리하였다. 염기성 상청액을 0.22㎛ 필터로 여과하여 물중 1% HCl 5.0mL로 pH 3.7로 중화하였다(맑은 갈색 용액). 중화된염기성 상청액의 분액 3.0OmL을 질소건조시키고 54.5mg을 칭량하였다.
공기건조된 No.5(5)E-C의 산 불용성 분획을 물중 1% HCl 20mL로 2회 세척하였다. 염기 침전물을 1% NaOH로 1회 세척하였다. 세척한 산 불용성 분획 및 염기 침전물을 냉동건조시키고 각각 66.6mg 및 18.6mg 또는 32.7% 및 10.1%의 공기건조된 No.5(5)E-C를 칭량하였다.
건조시킨 산 불용성 분획, 산 가용성 분획, 염기 침전물 및 중화된 염기성 상청액을 출발물질인 공기건조된 No.5(5)E-C와 함께 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 표 12에 나타내고, 또한 No.5(5)E-C의 각 분획의 중량%도 나타낸다.
결과는 산 불용성 분획이 공기건조된 No.5(5)E-C의 주 활성성분을 함유하고 있음을 분명하게 나타내었다. 산 불용성 분획은 0.30mg/mL에서 제3일에 84% 억제 및 제4일에 85% 억제의 적당한 활성이었다. 산 가용성 분획은 O.31㎎/mL에서 제3일에 12% 억제 및 제4일에 19% 억제의 단지 한계 활성이었다. 또한 No.5(5)E-C의 산 가용성 분획의 두 염기 침전물 및 염기성 상청액도 O.30 내지 0.31mg/mL에서 제3일에 12 내지 16% 및 제4일에 10 내지 20%의 한계 활성이었다.
따라서 No.5(5)E-A의 활성성분과 같은 No.5(5)E-C의 활성성분도 중성 내지 약간 염기성 용액에는 가용성이나 강산 용액에는 불용성이라는 결론을 얻는다.
3. No.5(5)E
No.5(5)E(표 7)의 주 활성 C18-SPE-LC 분획 A 및 C 둘다의 활성성분이 유사한 용해도 특성(중성 내지 염기성 용액에의 가용성 및 강산에의 침전성)을 갖기 때문에, No.5(5)E의 주 활성성분은 No.5(5)의 물 추출물로부터 직접적인 산침전에 의해 제조될 수 있다. 산 침전물은 O.1N NH4HCO3에 재용해하고 염산으로 1회 이상 재침전하여 더 정제할 수 있다. 산 침전물의 NH4HCO3을 정제 사이클 동안에 0.22㎛ 또는 0.45㎛ 필터로 여과하여 잔류 불용성 입자를 제거하였다.
No.5(5)E의 6회 정제한 산 침전물 또는 No.5(5)E-AP6X를 항 HIV 활성에 대해 시험하고 표 13에 나타낸 바와 같이 0.25㎎/mL에서 제3일에 99% 억제 및 제4일에 97% 억제로 매우 활성이라는 것을 알았다. No.5(5) 및 원 No.5(5)E의 항 HIV 활성을 비교를 위해 나타낸다. 두 측정으로부터 No.5(5)E-AP6X의 수율%도 나열한다.
No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(4), No.5(5), No.5(8), No.5(11), G, H의 물 추출성(E), 산 침전성(AP) 및 산 가용성(AS)분획의 항 HIV 활성
4. GE
No.5(5)의 원 식물을 동일한 산 침전성의 항 HIV 활성성분이 식물로부터 직접적으로 분리될 수 있는지 보기 위해 시험하였다. 건조된 식물 G를 대만에 있는 지방 약초 가게로부터 구입하였다. 100.8g의 시료를 "그대로" 건조된 식물 전체를 매번 2,90OmL 물에서 75-76분 동안 비등함으로써 물로 두 번 추출하였다. 제1(증발 후 ∼50OmL) 및 제2(증발 후 ∼120mL) 추출물을 구배분리를 통해 잔류물로부터 각각 분리하고 와트만 No.4여과지를 통해 여과하였다. 제1추출물을 물에서 40OmL 1% HCl로 산성화하고 제2추출물을 물에서 145mL 1% HCl로 산성화하였다. 양쪽의 산성화된 추출물(제1에서는 pH 1.5 및 제2에서는 pH 1.4)에서 침전물을 형성하였다. 산 침전물(거의 흑색인 어두운 고형물)을 30분 동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 산성 상청액(암적갈색 용액)으로부터 분리하였다.
제1추출물의 산 침전물의 일부를 물에서 30mL 1% HCl로 세척하고; 그리고 나서 50mL 원심분리기관의 내벽을 약 15mL 물로 세정하였다. 세척한 산 및 세정한 물을 30분 동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 산 침전물로부터 분리하고 폐기하였다. 산 침전물을 질소건조하고(GE-AP), 항 HIV 활성에 대해 실험하여 매우 활성인 것을 발견하였다: 0.30mg/mL(표 13)에서 제3일 및 제4일 둘다에서 100% 억제. 그러나, GE-AP는 이 수준에서 세포독성이고, 33% 콘트롤이며, 세포독성을 감소시키기 위해 더 정제하는 것이 필요하다.
비등수로의 추가 추출을 대략 1cm 길이 이하로 절단된 건조된 식물 조각으로 행하였다. 식물의 두 개의 군으로부터 결정된 건조된 식물 조각으로부터의 추출 퍼센트(%)는 21 내지 27%이었다. 조각 시료로부터의 물 추출물을 HCl로 산성화하여 No.5(5)E-AP6X에 있어서 기술한 바와 같이 6 사이클의 용해 및 침전으로 정제되는 산 침전물을 생성하였다. 6번 정제된 GE-AP6X를 항 HIV 활성에 대해 시험하였고 표13에 나타낸 것처럼 No.5(5)E-AP6X와 같이 활성인 것을 발견하였다. GE-AP6X는 O.25mg/mL에서 제3일에 HIV 증식의 100% 억제 및 제4일에 99% 억제를 나타낸 반면, No.5(5)E-AP6X는 동일한 레벨에서 제3일에 99% 억제 및 제4일에 97% 억제를 나타내었다. 세포독성 시험은 또한 두 개의 활성성분 사이에서 동일한 0.25mg/mL에서 GE-AP6X에 있어서 콘트롤 증식 66-93% 및 No.5(5)E-AP6X에 있어서 63-98%의 밀접한 유사성을 나타내었다.
5. HE
식물 H(Dichondra micrantha)를 단일 허브 약초 No.5(5)의 원 식물이라고 원래 생각해왔는데, 왜냐하면 식물이 약초 No.5(5)와 동일한 중국식 속명을 갖고 있기 때문이다. H.C. Chang, Medicinal Herbs Ⅱ, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R.O.C., 27(1991) 참조. 식물 H를 상기한 식물 G와 같이 동일하게 물 추출 및 산 침전물을 거치게 하였다.
건조된 Dichondra micratha(H)의 식물 전체를 식물 G의 추출에서 기술한 바와 같이 비등수로 추출하였다. 물 추출물을 여과하고 HCl로 산성화하여 침전물을 형성하였다. 산 침전물(HE-AP) 및 산성 상청액(HE-AS)을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과는 표 13에 나타낸 바와 같이, 식물 G 및 No.5(5)에서와 동일한 상태로 산 침전물 HE-AP가 식물 H 물 추출물의 활성성분인 것을 명백하게 증명하였다.
산 침전물 HE-AP는 양호한 항 HIV 활성을 나타내었다: 0.30mg/mL에서 제3일에 85% 억제 및 제4일에 88% 억제. 산성 상청액 HE-AS는 활성이 아니었다: 0.25mg/mL에서 제3일에 24% 억제 및 제4일에 O% 억제. 제2군으로부터 한 번 정제된 산 침전물 HE-AP1X를 또한 활성에 대해 시험하였다: 0.25mg/mL에서 제3일에 95% 억제 및 제4일에 90% 억제(표 13). 시료는 HE-AP에 있어서는 콘트롤 증식 83%, HE-AP1X에 있어서는 93 내지 100%의 콘트롤, HE-AS에 있어서는 87 내지 91%의 콘트롤로 시험수준에서는 독성이 아니었다.
6. No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No5.(4) 및 No.5(8)
No.5(5)의 활성성분 및 식물 G 및 H가 모두 물 추출성 및 산 침전성이기 때문에 다른 항 HIV 활성 단일 허브 생약의 활성성분이 유사한 성질을 갖는지 보는 것이 논리적이다. 따라서, 활성 생약을 그들이 산 침전물 성분을 갖는지 그리고 만약 그렇다면 이러한 성분들이 활성인지를 보기 위하여 조사하였다.
No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(4) 및 No.5(8) 각 단일 허브 생약의 5.0g 시료를 약 40mL물로 50mL 플라스틱 원심분리기관에서 두 번 추출하였다. 각 추출물을 40분 내지 120분 동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 불용성 물질로부터 분리하였다. 각 시료의 제1 및 제2추출물을 조합하고 그리고 나서 O.22㎛ 필터를 통해 분리하였다. 각 추출물의 분액 2.00mL를 질소건조하고 칭량하였다. 각 시료의 잔류 추출물을 물에서 1OmL 1% HCl로 산성화하였다. No.4(3) 및 No.5(4)를 제외하고 모든 산성화된 추출물에서 침전물이 형성되었다. No.4(3)의 산성화된 추출물에서는 심지어 냉장고에 연장된 저장(9시간) 및 물에서 10mL 1% HCl의 추가후에도 어떠한 침전물도 형성되지 않았다. No.5(4)의 산성화된 추출물은 단지 흐림을 나타내었고 20분 동안 2,000rpm에서 원심분리한 후에 극미량의 침전물을 형성하였다.
각 산 침전물을 20분 동안 2,000rpm에서 원심분리에 의해 그 상청액으로부터 분리하였다. 각 산 침전물을 물에서 5mL 1% HCl로 세척하였다. 산 세척물을 20분 동안 2,000rpm에서 원심분리에 의해 분리하였고 폐기하였다. 각 산 침전물을 질소건조하였고 칭량하였다.
각 산성 상청액을 물에서 10mL 1% HCl의 추가로 조합하였다. 실온에서 4일동안 저장한 후에, No.4(3)을 제외하고 모두 또 다른 산성화된 상청액에서 다양한 정도로 다시 침전물을 형성하였다. 각 산성 상청액을 80분 동안 2,000rpm에서 원심분리기에 의해 침전물로부터 분리하고,0.22㎛ 필터를 통해 여과하고 공기 건조하였다. 각 건조된 산성 상청액을 0.1N NH4HCO3에 재용해하고 WISP 유리 바이알로 옮기고 냉동건조하었다.
건조한 물 추출물(E), 산 침전물(AP), 및 No.4(2), No.4(4), 및 No.4(5)의 산성 상청액(AS)을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. No.5(1) 및 No.5(8)의 물 추출물(E) 및 산 침전물(AP)을 또한 시험하였다. No.4(3)이 산 침전물을 갖지 않고 No.5(4)가 단지 산 침전물의 미량(0.3mg)을 갖기 때문에, 단지 그들의 물 추출물(E)만 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.
결과는 No.4(3) 및 No.4(4)의 물 추출물(E)이 매우 활성이라는 것을 나타낸다: No.4(3)E에 있어서 제3일에 97% 억제 및 제4일에 89% 억제 및 No.4(4)E에 있어서 0.5㎎/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 100% 억제. 그러나, No.4(2), No.4(5), No.5(1), No.5(4) 및 No.5(8)의 물 추출물(E)의 활성은 현저하게 낮다: 동일한 시험 레벨 0.5mg/mL에서 제3일에 2 내지 62% 억제 및 제4일에 0 내지 24% 억제. 대조로서, 원 생약 분말은 매우 양호한 활성으로 절제성을 갖는다: 2.5mg/mL에서 제3일에 73 내지 100% 억제 및 제4일에 50 내지 100% 억제.
더 놀랍게도, 모든 산 침전물(AP)이 양호한 항 HIV 활성으로 절제성을 나타내었다: 0.1 내지 0.3mg/mL에서 No.4(2)E-AP에 있어서 제3일 및 제4일 둘다에서 83% 억제, No.4(4)E-AP에 있어서 제3일에 85% 억제 및 제4일에 95% 억제, No.4(5)E-AP에 있어서 제3일에 86% 억제 및 제4일에 80% 억제, No.5(1)E-AP에 있어서 제3일에 62% 억제 및 제4일에 74% 억제, No.5(8)E-AP에 있어서 제3일에 45% 억제 및 제4일에 61% 억제. No.4(4)E의 산성 상청액(AS)은 0.25㎎/mL에서 제3일에 91% 억제 및 제4일에 82% 억제로 상당히 활성이었다. No.4(2)E 및 No.4(5)E의 산성 상청액(AS)은 부분적으로 비활성이었다: 0.25mg/mL에서 제3일에 0 내지 4% 억제 및 제4일에 0 내지 1% 억제.
No.4(2), No.4(5), No.5(1), No.5(4) 및 No.5(8)의 물 추출물(E)이 그 원분말보다 훨씬 덜 활성이고 No.4(2), No.4(5), No.5(1), 및 No.5(8)의 산 침전물(AP)이 상당히 활성이므로, 따라서 이러한 분말의 활성성분의 대부분이 물(pH 4.0 내지 5.1)로 효과적으로 추출되지 않았다고 가정한다. 용액의 pH를 중성 또는 약알칼리성으로 조절하는 것이 추출의 개선을 도울 것이라고 기대된다.
No.4(2) 및 No.4(5)의 활성성분이 산에 의해 침전가능하다고 결론지어진다. No.4(3)의 활성성분은 물 및 산에서 용해가능하다. No.4(4)는 하나는 산 가용성이고 하나는 산 침전성인 두 활성성분을 포함한다. No.5(1) 및 No.5(8)은 산 침전성활성성분을 포함한다.
7 . No.5(11)
단일 허브 성분 No.5(10) 및 No.5(11)은 HBV 보균자를 치료하기 위한 허브 혼합물 HHT888-5에 포함된다(실시예 3 참조). No.5(10) 및 No.5(11) 둘 다는 그들 의 항바이러스 분석과의 잠재적인 간섭을 피하기 위하여 초기의 항 EMuLV 및 항 HIV 스크리닝 시험에 포함되지 않았다.
상기 발견은 모든 산 침전성의 성분 또는 단일 허브 생약 및 약초 No.4(2), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(5) 및 No.5(8) 및 H로부터 분리된 산 침전물이 항 HIV 활성이라는 것을 나타낸다. 따라서 만약 있다면 다른 생약 또는 식물로부터 분리된 산 침전성의 성분 또는 산 침전물이 또한 항 HIV 활성일 것이라고 생각할 수 있다.
가정을 시험하기 위하여, 단일 허브 생약 No.5(10) 및 No.5(11)을 물로 추출하고 그 물 추출물을 산 침전물이 형셩되는지 보기 위하여 HCl로 산성화하였다. No.5(10) 시료 90.4g을 물(1804 내지 1808mL)로 스무(20)번 추출하고 실온에서 두번, 뒤이어 0.1 N NH4HCO3900mL로 한번 추출하였다. No.5(11) 시료 90.8g을 물(908mL)로 열(10)번 추출하고 실온에서 두 번, 뒤이어 0.1 N NH4HCO3870mL로 한번 추출하였다. 추출을 2000-mL 유리 삼각 플라스크에서 행하였고 한시간에서 하룻밤 동안 자기교반하였다. 추출물을 40분 동안 8,000rpm에서 원심분리하여 불용성물로부터 분리하였다.
추출물 1.0mL를 물에서 1.5mL 1% HCl로 산성화할 때, No.5(10)의 두 개의 물 추출물 및 NH4HCO3추출물은 심지어 하룻밤동안의 냉장된 저장후에도 눈에 보이는 침전물을 나타내지 않았다. No.5(11)의 제 1 물 추출물은 갈색으로 되었고 거의 즉시 침전물을 형성하였다. No.5(11)의 제 2 물 추출물은 옅은 누르스름한 빛 그리고 약간 불투명하게 되었고, 실온에서 하룻밤동안 저장한 후에 소량의 침전물을 형성하였다. No.5(11)의 NH4HCO3추출물은 거의 무색이었고 흰색의 클로이드같은 침전물이었다. No.5(11) 및 그 산 침전물은 아마 항 HIV 활성이라고 예견하였다.
각 추출물의 10.0mL 분취량을 냉동건조하고 칭량하였다. No.5(10)의 총 추출 가능물은 66.3%이었다. No.5(11)의 총 추출가능물은 53.8%이었다. No.5(10)의 대부분의 추출가능물을 두 번의 물 추출에 의해 추출하였고 총 추출가능물의 97.9%를 구성하였다. No.5(11)의 대부분의 추출가능물을 제 1 물 추출(93.5%)에서 추출하였다. No.5(10)에 있어서 총 추출가능물의 31.2%를 구성한 제 2 물 추출이 필요하였다. No.5(11)에 있어서, 제 2 물 추출 및 NH4HCO3추출은 각각 단지 5.4% 및 1.1%를 구성하였다.
No.5(11)의 제 1 물 추출물의 잔류 868mL, 제 2 물 추출물의 898mL, NH4HCO3추출물의 828mL를 각각 농축된 HCl(37%)의 14.6, 14.6, 및 13.4mL로 산성화하였다.산성화된 제 1 물 추출물은 거의 즉시 침전물을 형성하였다. 산성화된 제2물 추출물 및 NH4HCO3추출물은 흐리게 되었고 하룻밤동안 냉장 저장후에 침전물을 형성하였다. 각 산화된 추출물의 산 침전물(AP)을 그 산성 상청액(AS)으로부터 40분 동안 2,000rpm에서 원심분리하여 분리하였다. 제 1 및 제 2 물 추출물의 산성 상청액을 200mL 유리 삼각 플라스크에 부었다. 산성화된 물 추출물 및 NH4HCO3추출물로부터 산성 상청액의 각 200mL 시료를 8,000rpm에서 40분동안 원심분리하고 0.22mm 필터를 통해 여과하였다. 각각의 미량 여과된 산성 상청액의 20.0mL를 질소건조하고, 물에 재용해하고, 냉동건조하였다.
산성화된 제1 및 제2물 추출물 및 산성화된 NH4HCO3추출물로부터 No.5(11)E 산 침전물을 약 20 내지 40mL의 물로 두 번 세척하였다. 린스한 물을 2,000 rpm에 서 40분동안 원심분리기에 의해 분리하였고 폐기하였다. 산 침전물을 냉동건조하고 칭량하였다. 산 침전물의 퍼센트(%) 수율은 No.5(11)의 4.36% 이었다. 산 침전물의 대부분(96.3%)을 제 1 물 추출에 의해 원 분말로부터 분리하였다.
No.5(10), No.5(11), No.5(10) 또는 No.5(10)E의 물 추출물, No.5(11) 또는 No.5(11)E의 제 1 물 추출물, No.5(11) 또는 No.5(11)E-AP의 산성화된 제 1 물 추출물로부터의 산 침전물, No.5(11) 또는 No.5(11)E-AS의 산성화된 고인 제 1 및 제 2 물 추출물로부터의 산성 상청액을 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. 결과(표 13)는 No.5(10) 및 그 물 추출물 No.5(10)E가 본질적으로 활성이 아니라는 것을 나타낸다: 2.5㎎/mL에서 No.5(10)에 있어서 제3일에 65% 억제 및 제4일에 0% 억제, No.5(10)E에 있어서 2.0mg/mL에서 제3일 및 제4일 둘다에서 0% 억제. No.5(11), 그물 추출물 No.5(11)E, 및 산성 상청액 No.5(11)E-AS는 약간 활성이다: 2.5㎎/mL에서 No.5(11)에 있어서 제3일에 92% 억제 및 제4일에 74% 억제; 2.0mg/mL에서 No.5(11)E에 있어서 제3일에 87% 억제 및 제4일에 73% 억제; 0.5㎎/mL에서 No.5(11)E-AS에 있어서 제3일에 84% 억제 및 제4일에 65% 억제. 다시 No.5(11)E-AP의 산 침전물은 상당히 활성이다: 0.3㎎/mL 에서 제 3일에 91% 억제 및 제 4일에 87% 억제.
결과는 No.5(11)이 하나는 산 가용성이고 하나는 산 침전성인 두 개의 활성성분을 함유한다는 것을 나타낸다. 두 개의 활성성분은 물에 의해 No.5(11)로부터 추출가능하다. 이것은 모든 산 침전성의 성분 또는 본 출원에 기재된 선택된 식물 및 가능하게는 어떤 식물로부터의 산 침전물이 효과적인 약제라는 본 발명의 추가적인 양태를 지지한다.
실시예 10
활성성분의 분리
활성성분을 상업용 추출 분말 또는 물과 함께 추출에 의해 식물로부터 분리하였다. 바람직하게는 건조 식물 물질에 대한 물의 양은 5 내지 10배의 범위(w/v)일 수 있고 적어도 두 번의 추출을 행한다. 추출 용액의 pH는 바람직하게는 추출을 용이하게 하도록 NaOH와 같은 알칼리 용액으로 중성 또는 약알칼리성(7 내지 8)으로 조절하였다. 추출은 실온(상업용 분말) 또는 비등점(잘게 자른 또는 분말화한 식물)에서 한 시간 또는 더 길게 행할 수 있다.
가용성의 추출물을 여과(즉, 나일론 스크린 및 여과지) 또는 원심분리기(40분 또는 그 이상동안 2,000 내지 8,000rpm)에 의해 불용성의 식물 물질로부터 분리할 수 있다. 그리고나서 추출물을 HCl(대략 0.6% 최종 농도 또는 용액 pH≤2)과 같은 어떤 강산으로 산성화하여 활성 산 침전물을 생성한다. 산 침전물을 40분 또는 그 이상 동안 8,000rpm과 같은 원심분리기에 의해 분리할 수 있다. 침전물을 0.1N NH4HCO3와 같은 중성 또는 알칼리성 용액에서 반복적인 용해 및 차후 산에서의 침전에 의해 정제할 수 있다. 불용성물질은 원심분리기(40분 또는 그 이상 동안 8,000rpm) 또는 미량 여과(0.2 내지 0.45㎛ 필터를 통해)에 의해 제거할 수 있다.
정제된 산 침전물을 냉동건조, 질소건조 또는 공기 건조할 수 있다. 또한 그것은 중탄산 암모늄 또는 수산화 암모늄 용액과 같은 암모늄 용액에서 산을 용해함으로써 암모늄염으로 전환할 수 있고 그리고나서 냉동건조 또는 분무건조한다. 정제된 산 침전물은 또한 NaHCO3와 같은 적당한 용액에서 산을 용해함으로써 나트륨염과 같은 다른 염으로 전환할 수도 있다. 산 침전물을 또한 C18 칼럼 크로마토그래피에 의해 매트릭스로부터 분리할 수도 있다.
화학적으로 관련된 물 추출성 및 산 침전성의 항 HIV 활성성분을 항 HIV 활성 단일허브 생약 일곱개로부터 분리하였다: No.4(2), No.4(3), No.4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11) 및 상기한 물 추출 및 산침전 과정에 의해 실시예 5 및 6에서 동정된 두 개의 약초 Aeginetia indica(G) 및 Dichondra micrantha(H).
특정의 실시예에서처럼, No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(4), No.5(5), No.5(8) 및 No.5(11)를 실시예 2에 따라 제조하였고 실온에서 (약 25℃) 물로 두 번 추출하였고 시료의 그램당 물 8 내지 10mL(예를 들어, 40mL 물과 5g의 분말 또는 500mL 물과 50g의 분말 또는 1000mL 물과 100g의 분말)로 두 번 추출하있다. 물 현탁액을 일분동안 와류시키고, 십(10)분 동안 대기하고 일(1)분 동안 와류시키거나; 시료 크기 및 현탁액 부피에 따라 십오(15)분 이상 동안 자기교반함으로써 혼합하여 추출하였다. 예를 들어, 40mL 물에 5g의 분말을 포함하는 현탁액을 추출동안 일분동안 와류시키고, 10분 동안 방치하고 다시 1분 동안 와류시켰다. 500 내지 1000mL 물에 50 내지 100g 분말을 함유하는 현탁액을 추출동안 15분 이상 자기교반하였다. 물 추출물을 20분 내지 40분동안 1,500 내지 8,000rpm에서 원심분리기 및 와트만 No.4 여과지와 같은 필터를 통한 여과에 의해 불용성 물질로부터 분리하였다.
약초 Aeginetia indica(G) Dichondra 및 micrantha(H) 또는 No.5(5) 및 H 생약의 원 식물을 상기한 실시예 2에서처럼 냉수로 세척하고, 건조하고, 분쇄하고 비등수로 추출하였다. 물 추출물을 실온으로 냉각하고 구배분리 및 나일론 스크린(1.3 내지 1.5mm 개구)을 통한 여과, 20분 내지 40분 동안 1,500 내지 8,000rpm에서 원심분리기 및 와트만 No.4 여과지와 같은 필터를 통한 여과에 의해 불용성 식물 물질로부터 분리하였다.
그리고 나서 물 추출물을 염산의 첨가를 통해 침전물을 형성하여 pH≤2로 산성화하였다. 각 산 침전물을 플라스틱 원심분리기관 또는 병에서 원심분리기에 의해 산 용액으로부터 분리하였다. 각 산 침전물을 물 또는 0.1 또는 1% 염산으로 적어도 세 번 세척하였다. 시료의 각각의 물 추출물, 산 침전물(산 불용성 성분) 및 산성 상청액(산 가용성 성분)의 시료를 질소건조, 공기 건조 또는 냉동건조하였다. 그리고나서 이러한 시료를 또 다른 시험 및 특성화를 거치게 하였다.
상기한 바와 같이 이렇게 정제된 산 침전물 No.5(5)E-AP1X, No.5(5)E-AP6X, GE-AP1X, GE-AP2X, GE-AP6X, HE-AP1X, HE-AP6X, No.4(2) E-AP1X, No.5(8)E-AP1X, No.5(11)E-AP1X, 및 그 암모늄 염 No.5(5)E-AP1X-NH4, GE-AP2X-NH4, HE-AP1X-NH4, No.5(8)E-AP1X-NH4, No.5(11)E-AP1X-NH4, 및 No.4(2)E-AP1X-NH4를 제조하였다. 명세서와 청구항에 사용된 명칭은 다음과 같이 설명할 수 있다: No.5(5)E-AP1X는 물 추출되고(E), 산침전되고(AP) 중성 또는 알칼리성 용액에서 재용해 및 산과의 재침전에 의해 한번 정제된(1X) Aeginetia indica로부터 유도된 단일 생약 No.5(5)를 의미하고 No.5(5)E-AP1X로 칭해지는 최종 화학 실체를 야기한다.
예를 들어, No.5(5)E-AP1X-NH4를 우선 50mL 원심분리기관에 No.5(5)E-AP1X 4.0 내지 4.9g으로 세척하고, 각각 약 40mL 물로 네 번 세척하여 제조하였다. 세척수를 2,000 rpm에서 40분동안 원심분리기에 의해 분리하였고 폐기하였다. AP1X′를세척한 물을 냉동건조(총 11.4g)하고 약 600mL 0.1 내지 0.2 N NH4HCO3에 용해하였다. 용액을 2,000 rpm에서 40분동안 원심분리하였고 상청액을 진공하에서 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. 여과물을 냉동건조하였고 이렇게 No.5(5)E-AP1X-NH4를 제 조하였다.
GE-AP2X-NH4를 20.0mL 0.2N NH4HCO3에서 GE-AP2X 690.8㎎에 용해함으로써 제조하였다. 용액을 8,000rpm에서 40분동안 원심분리하였다. 어떠한 침전물도 관찰되지 않았다. 상청액을 0.22㎛ 필터를 통해 여과하였다. 여과액을 냉동건조하고 이렇게 하여 GE-AP2X-NH4를 제조하였다.
실시예 11
활성성분의 특성
1. No.5(5) 활성성부
No.5(5)E-A-AP 및 No.5(5)E-C-AP를 미리 No.5(5)의 활성성분으로 식별하였다. 이 화합물들은 그 가용성, HPSEC, C18-SPE-LC, 및 원소 분석에 기초하여 동족의 중합 유기산인 것이 분명하다. 양쪽의 산은 분자량 분포 및 C18칼럼 상에서 잔류를 제외하고는 유사한 성질을 갖는다. 양쪽의 산은 산성 수용액에 불용성이지만 중성 및 염기성 수용액에서는 염으로서 용해된다. 그것들은 공기, 열, 산, 약 알칼 리, 및 일반적인 유기 용매에 대해 안정하다.
표 14에 나타낸 것처럼 여섯 번 정제한 산 침전물 No.5(5)E-AP6X의 원소 분석은 높은 탄소 함유량(50.98%) 및 낮은 회분 함유량(2.35%)을 나타낸다. 이것은 No.5(5)E-AP6X가 유기산임을 가리킨다. No.5(5)E-AP6X의 SEM(주사 전자 현미경) x-레이 표면 원소 분석은 탄소, 산소, 인, 염소 및 황의 존재를 나타내었다. 비소, 납, 수은 또는 철은 검출되지 않았다. 그러나, No.5(5)E-AP6X 및 그 성분 No.5(5)E-A-AP 및 No.5(5)E-C-AP는 모두 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름, 및 헥산을 포함하는 일반적인 유기용매에 불용성이다.
No.5(5)E-A-AP는 또한 메탄올에도 불용성이다. 이것은 이러한 활성 산 침전물은 단순한 유기산이 아니라는 것을 가리킨다.
조사한 모든 산 침전물(AP)은 느린 용해 속도로 물에서 약간 가용성이다. 모든 것이 물 대 에탄올 부피비 40 대 60의 비율과 같은 물 및 에탄올의 혼합물에서 더 가용성이고 더 빠른 비율로 용해된다. 이것은 산 침전물이 HPSEC 분석에 의해 지지되는 것과 같이 중합성임을 나타낸다.
도 1은 No.5(5)E-A-AP1X의 214nm에서의 UV프로파일에서의 HPSEC 프로파일을 나타내고 그리고 도 2는 No.5(5)E-C-AP의 프로파일을 나타낸다. HPSEC 분석에 사용 된 칼럼은 TSK PWXL보호 칼럼(6.0mm ID×4.0cm L)을 갖는 Varian MicroPak TSKge1-G3000 PWXL칼럼(7.8mm ID×30cm L)이었다. 이동 상태는 0.1 N NH4HCO30.80mL/분의 유속이었다. 시료를 0.92 내지 0.93 ㎎/mL 이동 상태에서 제조하였다. 주입 부피는 100㎕이었다. 결과는 No.5(5)E-A-AP1X가 두 개의 UV 흡수 피크를 갖고, 하나는 체류시간 7.55분으로 작고 하나는 체류시간 9.55분으로 크고 넓다는 것을 나타낸다. 더 작은 피크는 주요 넓은 피크의 제일 앞쪽 에지에서 용리하였고 더 큰 분자를 함유한다. 또한 주요 넓은 피크의 말단 에지상에 겹치는 몇 개의 작은 피크가 있다. No.5(5)E-C-AP는 체류시간 9.93분에서 주요 넓은 UV 흡수 피크를 함유하였는데 이것은 No.5(5)E-A-AP1X의 주요 피크와 유사하다. 그러나, No.5(5)E-C-AP는 No.5(5)E-A-AP1X의 주요 피크의 제일 앞쪽 에지에서처럼 큰 분자를 함유하는 피크를 가지지는 않았다.
No.5(5)E-A-AP1X 및 No.5(5)E-C-AP를 이동 상태 0.80mL/분의 유속으로 0.1 N NH4HCO3를 사용하여 상기한 조건하에서 HPSEC(고압 크기별 배제 크로마토그래피)에 의해 분별하였다. 각 시료를 이동 상태 6.1 내지 6.2㎎/mL로 제조하였고 주사당 100 내지 200μl로 주사하였다. 24 분획을 각 30분 가동동안 1.25분 또는 1.00mL 간격으로 수집하였다. 도 3A는 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일을 나타내고 도 3B는 No.5(5)E-A-AP1X의 RI 프로파일을 나타낸다. 도 4A는 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일을 나타내고 도 4B는 No.5(5)E-C-AP의 RI 프로파일을 나타낸다.
No.5(5)E-A-AP1X의 HPSEC 분획은 분획 8에서 피크인 갈색 분획을 포함하고 UV 프로파일(도 1)상에서 체류시간 9.55분 또는 RI 프로파일(도 3B)상에서 9.66분의 주요 넓은 피크와 일치한다. 또한 No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획은 분획 8 및 9에서 피크인 갈색 분획을 포함하고 UV 프로파일(도 2)상에서 체류시간 9.93분 또는 RI 프로파일(도 4B)상에서 10.08분의 주요 피크와 일치한다. HPSEC 분획 6 내지 14의 각각의 일(1)mL 분취량을 100㎕의 주입 부피에서 동일한 HPSEC 시스템에 의해 분석하였다. 결과는 각 분획이 다른 피크 체류시간을 갖고 No.5(5)ErA-AP1X 및 No.5(5)E-C-AP의 피크 퍼짐이 실재한다는 것을 나타낸다. 따라서 No.5(5)E-A-AP1X 및 No.5(5)E-C-AP는 비교적 넓은 분자량 분포를 갖는 중합체 또는 올리고머로 이루어져 있다.
No.5(5)E-A-AP1X의 HPSEC 분획 6 내지 16의 1.30mL 분취량을 각각 질소건조하고 WISP 바이알에 부었다. No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획 7 내지 16의 각각의 1.31mL 분취량을 또한 각각 질소건조하고 같은 방식으로 하였다. 건조된 시료를 그들의 각각의 0.30mg/mL의 출발물질에 상당한 수준에서 항 HIV 활성에 대해 시험하였다. No.5(5)E-A-AP1X를 또한 0.31mg/mL에서 동시에 시험하였다. 표 15는 No.5(5)E-A-AP1X 및 No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획의 항 HIV 활성을 그들의 퍼센트(%) 중량 분포와 함께 나타낸다.
이 결과는 No.5(5)E-A-AP1X의 주활성이 분획 7 내지 9의 3개의 분획에 퍼져있고, 매스피크 분획 8에서 피크(0.1mg/mL에서 제3일에 80% 억제 및 제4일에 83% 억제)를 보인다는 것을 명확히 보여준다. No.5(5)E-C-AP의 주활성은 또한 분획 8 내지 10의 3개의 분획에 퍼져 있고,분획 8 및 9에서 피크(0.05㎎/mL에서 제3일에 95 내지 98% 억제 및 제4일에 85 내지 92% 억제)를 보인다. No.5(5)E-C-AP의 매스는 분획 10에서 피크를 이루지만, 이 분획 10은 0.08mg/mL에서 제3일에 80% 억제 및 제4일에 35% 억제로서 단지 한계적으로 활성을 나타냈다는 것을 주목해야 한다.
한외여과에 의해 No.5(5)E-C-AP의 하나의 HPSEC 분획인 분획 8이 1,000과 3,000 달톤 사이의 분자량의 올리고머 분자를 함유한다는 것을 발견하였다. 다른 HPSEC 분획인 분획 9가 3000 달톤을 초과하는 분자량의 폴리머 분자를 함유한다는 것을 발견하였다. 분획 9는 분획 8보다 더 큰 분자들을 함유하지만 0.1N NH4HCO3를 이동상으로서 사용하는 HPSEC 상에서 분획 8보다 늦게 용리되었기 때문에, 분획 9가 분획 8보다 더 친유성이었다. 두 경우 모두 시험한 결과 상대적으로 활성을 보였다.: 즉, 0.05 내지 0.25mg/mL에서 분획 8에 대해 제3일에 95% 억제 및 제4일에 85% 억제, 그리고 분획 9에 대해 제3일에 91 내지 98% 억제 및 제4일에 87 내지 92% 억제를 보였다. 더욱이, 크로마토그래피로 2회 정제된 No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획은 HIV 증식에 대해 용량반응을 보였고, 제3일에 6㎍/mL 및 제4일에 17㎍/mL의 IC50(50% 저해 농도)를 가졌다. 그 결과를 표 16에 나타내었다. 비교대상으로서, 동시에 시험하였을 때, AZT의 IC50은 제3일에 3 ng/mL 및 제4일에 21 ng/mL, 그리고 d4T의 IC50은 제3일에 32 nM 및 제4일에 50 nM이었다.
도 5A는 214 nm에서의 HPSEC UV 프로파일을 도시하고, 도 5B는 크로마토그래피로 2회 정제된 No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획 8의 RI 프로파일을 도시한다.
No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획 9는 분획 8보다 약간 늦게 용리되었고, 자체의 친유성에 의해 야기되는 칼럼 충전물과의 불특정한 반응으로 인해, 유사하지만 더 넓은 분포 및 피크 테일링을 갖는다. 각 분획을 HPLC에 의해 더 분석하였다.
도 6A은 No.5(5)E-C-AP의 정제된 HPSEC 분획 8의 214 nm에서의 C18-HPLC UV 프로파일을 도시하고, 도 6B는 0.80 mL/분의 유속에서 이동상으로서 30%의 에탄올을 함유하는 0.1 N의 NH4HCO3를 사용한 HPSEC 분획 9를 도시한다. HPLC 칼럼은 Rainin Microsorb-MV C18 칼럼(5㎛ 입자, 공극크기 100Å, 4.6mm ID×25cm L)이었고, 시료를 1.0mg/mL에서 이동상 내에서 제조하였고, 주입 부피는 5μL이었다.
이 결과는 정제된 분획 8(도 6A)이 2.48 분의 체류시간에서의 주피크를 포함하고, 2.24 분의 체류시간을 갖는 친유성이 덜한 피크를 포함한다는 것을 보여준다. 분획 9(도 6B)는 2.56 분의 체류시간에서의 피크를 주로 포함한다. 분획 8과 분획 9 양쪽의 주피크는 매우 유사하다.
No.5(5)E-A-AP1X-NH4 및 그것의 정제된 HPSEC 분획 8의, 만약 있다면, 융점을 400℃ 보다 높도록 결정하였다. 300℃ 미만의 융점을 갖는 대부분의 유기 화합물로서는 매우 특이한 것이다.
도 11은 산 형태를 갖는 No.5(5)(No.5(5)E-AP6X)의 물 추출성 및 산 침전성활성성분의 IR 스펙트럼을 도시하고, 도 12는 암모늄염의 형태(No.5(5)E-AP6X-NH4)이다. 시료를 KBr 펠릿 내에서 제조하고, 측정을 위해 Perkin Elmer FT-IR 스펙트로미터를 사용하였다. 1636, 1452 및 1402 cm-1에서의 산 형태의 흡수는 C=C 결합을 나타낸다. 2362 cm-1에서의 흡수는 오염물질일 수 있는 CO(기체)를 나타낸다. 2850-2975 cm-1사이의 흡수 영역은 H-C-H(굽힘)을 나타낸다. 600-700 cm-1아래에서 흡수가 일어나지 않는 것은 방향족기가 없다는 것을 나타내고, 698 cm-1에서의 급격한 피크는 캘리브레이션 표준으로부터 벗어난다.
No.5(5)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분은 침유성 물질을 함유한다는 발견은 아래에 기술되는 바와 같이 No.5(5)E-AP의 HPSEC 분석에 의해 더욱 뒷받침된다.
2. G 및 H 활성성분
식물 G 및 H의 활성성분은 No.5(5)의 활성성분과 유사하게 거동한다. 양쪽 모두 중성 및 약염기성 수용액에 가용성이었고 산에 의해 침전시킬 수 있다. GE 및 HE의 6회 정제된 산 침전물을 원소분석(표 14)한 결과는 양쪽 모두 높은 탄소 함량 (46.47 내지 54.69%) 및 낮은 회분 함량(0.60 내지 1.99%)을 함유한다는 것을 보여준다.
도 7, 도 13 및 도 17은 0.80mL/분의 유속에서 이동상으로서 30%의 아세토니트릴을 함유하는 0.3N의 NH4HCO3를 사용하여, No.5(5), G 및 H 각각의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 214nm에서의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 칼럼은 TSK PWXL가드칼럼(6.0mm ID×4.0cm L)을 갖는 Varian MicroPak TSKge1-G3000PWXL칼럼 (7.8mm ID×30cm L)이었다. 0.65 내지 1.4㎎/mL에서 0.3N의 NH4HCO3중에서 시료를 제조하였다. 주입 부피는 100μL이었다.
도 8은 암모늄염 형태의 No.5(5) 또는 No.5(5)E-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 도 14는 암모늄염 형태의 G 또는 GE-AP2X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 도 18은 역시 암모늄염 형태의 H 또는 HE-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 이동상은 0.80mL/분의 유속에서 0.1N의 NH4HCO3이었다. 칼럼은 TSK PWXL가드칼럼(6.0mm ID×4.0cm L)을 갖는 Varian MicroPak TSKge1-G3000PWXL칼럼(7.8mm ID×30cm L)이었다. 시료는 활성성분의 암모늄염인, 1.0mg/mL에서 0.1N NH4HCO3중에서 제조된 No.5(5)E-AP1X-NH4(도 8), GE-AP2X-NH4(도 14) 및 HE-AP1X-NH4(도 18)이다. 주입 부피는 50μL이었다.
No.5(5), G 및 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 분자량을 HPSEC 분석에 의해 평가한 결과 대부분 1,000과 12,000 달톤의 사이에 있지만, 일부는 1,000달톤 미만이었다.
도 9는 No.5(5)E-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시하고, 도 15는 GE-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시하고, 도 19는 HE-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시한다. 칼럼은 PerSeptive Biosystems′ POROS R2/H 칼럼(4.6mm ID×10cm L)이었다. 이동상은 표 17에 기술된 구배에 따르고 유속이 2.00mL/분인, 2% 내지 60%의 에탄올을 함유하는 0.1N 중탄산암모늄이었다. 주입 부피는 50μL이었다.
도 10은 보정을 위한 용매 블랭크를 갖지 않는 중탄산암모늄 용액 중의 No.5(5)E-AP6X의 UV 스펙트럼(도 10A), GE-AP6X의 UV 스펙트럼(도 10B) 및 HE-AP6X의 UV 스펙트럼(도 10C)을 도시한다. 3개의 스펙트럼은 유사하고 204 내지 206㎚에서 모두 최대 흡수를 갖는다.
도 16은 암모늄염 형태의 G(GE-AP2X-NH4)의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 IR 스펙트럼을 도시한다. 도 20은 HE-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 IR 스펙트럼을 도시한다. 시료를 KBr 팰릿 내에서 제조하였고, 측정을 위해 Perkin Elmer FT-IR 스펙트로미터를 사용하였다.
3. No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(8) 및 No.5(11) 활성성분
활성을 시험한 모든 시료들의 활성성분은 중성 세포배지에 가용성이었다. No.4(2), No.4(5), No.5(1), No.5(8) 및 No.5(11)의 활성성분을 산에 의해 침전시키고, 반면에 No.4(3)의 활성성분은 침전시키지 않았다. No.4(3)의 활성성분은 물과 산성용액 모두에 가용성이었다. No.4(4)의 활성성분은 또한 물에 가용성이었다. 그러나, No.4(4)의 활성성분의 일부는 산에 의해 침전시킬 수 있었고, 일부는 침전시킬 수 없었다.
도 21은 암모늄염 형태의 No.5(8)인 No.5(8)E-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 도 24는 No.5(11)E-AP1X-NH4의 물 추출성 산 침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시하고 도 27은 No.4(2)E-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 HPSEC UV 프로파일을 도시한다. 이동상은 0.80 mL/분의 유속에서의 이동상으로서 0.1N의 NH4HCO3이었다. 칼럼은 TSK PWXL가드칼럼(6.0mm ID×4.0cm L)을 갖는 Varian MicroPak TSKge1-G3000PWXL칼럼(7.8mm ID×30cm L)이었다. 시료를 1.0mg/mL에서 0.1N의 NH4HCO3중에서 제조하였다. 주입 부피는 50μL이었다.
도 22는 No.5(8)E-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시하고, 도 25는 No.5(11)E-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시하고, 도 28은 No.4(2)E-AP1X-NH4의 구배 RP-HPLC UV 프로파일을 도시한다. 칼럼은 PerSeptive Biosystems′ POROS R2/H 칼럼(4.6mm ID×10cm L)이었다. 이동상은 표 17에 기술된 구배에 따르고 유속이 2.00mL/분인, 2% 내지 60%의 에탄올을 함유하는 0.1N 중탄산암모늄이었다. 주입 부피는 20μL이었다.
도 23은 No.5(8)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼을 도시하고, 도 26은 No.5(11)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼을 도시한다. 도 29는 No.4(2)E-AP1X-NH4의 IR 스펙트럼을 도시한다. 시료를 KBr 펠릿 내에서 제조하였고, 측정을 위해 Perkin Elmer FT-IR 스펙트로미터를 사용하였다.
No.5(8)E-AP1X-NH4의, 만약 있다면, 융점은 400℃ 보다 높다.
4. 항 HIV 활성 용량반응 및 독성
상기한 바와 같이, 크로마토그래피로 2회 정제된 No.5(5)E-C-AP의 HPSEC 분획 8(도 5A 및 도 5B의 HPSEC 프로파일과 도 6A의 C18-HPLC 프로파일에 의해 또한 명시된)은 표 16에 나타난 바와 같이 HIV 증식에 대한 용량반응 활성을 보이고, 제3일에 6㎍/mL 그리고 제4일에 17㎍/mL의 IC50을 갖는다. 표 18은 또한 암모늄염의 형태인 No.5(5)E-AP1X-NH4, GE-AP2X-NH4, HE-AP1X-NH4, No.5(8)E-AP1X-NH4, No.5(11)E-AP1X-NH4및 No.4(2)E-AP1X-NH4의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분의 항 HIV 활성 용량반응를 도시한다. 2회의 서로 다른 실시로부터의 AZT의 용량반응을 비교를 위해 열거한다.
GE-AP2X-NH4는 0.5㎎/mL에서 세포독성이 높기 때문에(콘트롤 증식 35%) 이 농도에서 시험하지 않았다. 그 세포독성은 낮은 수준에서 지속되었다.: 즉, 0.25mg/mL에서 콘트롤 증식 34% 그리고 0.13㎎/mL에서 콘트롤 증식 41%이었다. No.4(2)E-AP1X-NH4는 또한 0.5㎎/mL에서 높은 세포독성(콘트롤 증식 44%)을 보였으나, 낮은 수준에서는 세포독성이 훨씬 낮아졌다.: 즉, 0.25mg/mL에서 콘트롤 증식 72% 그리고 0.13㎎/mL에서 콘트롤 증식 100%(세포독성이 없음)이다.
No.5(5)E-AP1X-NH4는 1mg/mL 이상에서 시험관 내에서 사람 PBLs에 대해 독성을 갖는다.: 즉, 1㎎/mL에서 콘트롤 증식 55%, 2㎎/mL에서 콘트롤 증식 46%, 5mg/mL에서 콘트롤 증식 11%, 그리고 10 및 20mg/mL에서 콘트롤 증식 0%이다. No.5(5)E-AP6X는 0.5㎎/mL에서 약간의 독성(콘트롤 증식 63%)을 보이고 0.1mg/mL이하의 수준에서 독성을 보이지 않는다(0.1mg/mL에서 콘트롤 증식 98% 그리고 0.02mg/mL에서 콘트롤 증식 100%). No.5(5)E-AP의 활성성분의 하나의 분획, 즉, No.5(5)E-C-AP의 크로마토그래피로 정제된 HPSEC 분획 8은 독성을 없는 것으로 나타났다.: 즉,1mg/mL에서조차 콘트롤 증식 100%(표 16 참조)이다.
No.5(5)E-AP1X-NH4의 급성 독성을 조사하였다. 급성 독성을 측정하기 위해 마우스를 사용하였고, 체중의 단위 킬로그램당 5,000 mg의 시험물질(대형환약을 경구 투여함)에서조차 독성을 보이지 않는다는 것이 발견되지 않았다. 급성 독성 시험을 위해 군당 10마리의 수컷 ICR 마우스(체중이 각각 18 내지 21 그램)가 있는 4개 군을 사용하였다. 경구 투여 72시간 후 40마리의 마우스 중 한 마리도 죽지 않았다. 그러므로, No.5(5)E-AP1X-NH4의 LD50은 5,000 mg/kg보다 크다(po, 마우스, 72시간). 더욱이, 경구 투여 1시간 및 3시간 후에 관찰한 바로는, 5,000 ㎎/kg에서의 No.5(5)E-AP1X-NH4의, 반사기능저하, 행동기능저하, 근육이완과 같은 시험 동물의 중추신경계에 대한 영향과 운동자극 및 자율신경계에 대한 영향에 시험은 모두 음성이었다.
5. 활성성분의 안정성
No.5(5), No.5(8), No.5(11), No.4(2), G 및 H의 물 추출성 및 산 침전성 활성성분은 열, 공기, HCI 및 중탄산암모늄, 수산화암모늄 또는 중탄산나트륨과 같은 강산 및 약염기, 그리고 에탄올과 같은 알코올에 대해 안정하다. 이것들은 산 형태나 또는 암모늄염 또는 나트륨염과 같은 염 형태이다.
No.5(5)E-AP1X-NH4는 주위온도에서 15.6개월 동안 저장한 후 시험했을 때 매우 강한 활성을 유지하였다(0.1mg/mL에서 제3일에 94%/ 억제 및 제4일에 87% 억제)다. GE-AP2X-NH4및 HE-AP1X-NH4는 주위온도에서 13개월 동안 저장한 후 시험했을때 그 활성을 유지하였다(0.1mg/mL에서 GE-AP2X-NH4에 대해서는 제3일 및 제4일 둘다에서 100% 억제 그리고 HE-AP1X-NH4에 대해서는 제3일에 83% 억제 및 제4일에 81% 억제). No.5(8)E-AP1X-NH4및 No.4(2)E-AP1X-NH4는 주위온도에서 12.5개월 동안 저장한 후 시험했을 때 상당한 활성을 유지하였다(0.1mg/mL에서 No.5(8)E-AP1X-NH4에 대해서는 제3일에 85% 억제 및 제4일에 81% 억제 그리고 No.4(2)E-AP1X-NH4에 대해서는 제3일에 92% 억제 및 제4일에 88% 억제). No.5(11)E-AP1X-NH4도 역시 주위온도에서 12개월 동안 저장한 후 시험했을 때 상당한 활성을 유지하였다(0.1mg/mL에 서 제3일에 84% 억제 및 제4일에 78% 억제).
본 발명은 특정한 약초 또는 생약 또는 이것들의 혼합물이 숙주 세포에 손상을 주지 않으면서 놀랄만한 항바이러스 활성을 갖는다는 발견에, 부분적으로, 관련된 것이다. 또한, 본 발명은 HBV, HCV 또는 HIV와 같은 바이러스에 감염된 사람 및 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 출원명세서에서 제시된 데이터는 확인된 조성물이 숙주 세프에 대한 독성 없이 항바이러스 활성을 갖는다는 것을 명확히 증명한다.
상기 실험으로부터 HHT888-4로 명명된 허브 혼합물이 HBV 보균자를 치료하는 데 효과적이고, 따라서 HBV에 감염된 사람을 치료하는데 사용될 수 있다는 결론을 얻을 수 있다. 따라서, HBV 환자 및 보균자에서 바이러스 적재를 감소시키면 사람에게 HBV 질환이 발생하는 것을 예방하게 되고 또한 HBV 질환의 증세를 보이는 사람의 치료에도 효과가 있을 것이다. 임상 시험을 한 결과에서도 허브 혼합물 HHT888-45가 C형 간염 환자를 치료하는데 효과적이고, 따라서 단독으로 또는 HHT888-5 또는 그것의 단일 허브 성분과 함께 조합하여 투여하였을 때 B형 간염 환자를 치료하는데에도 효과적일 것으로 예상된다는 것이 밝혀졌다.
게다가, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54 및 개별 항 HIV 활성 단일 허브 성분은 천연 사람 세포에서 HIV 증식을 억제하는데 효능이 있다는 것이 증명되었다. 또한, HHT888-5, HHT888-45 및 HHT888-54는 HBV 및 HCV에 감염된 환자를 치료하는 데 효능을 보였다. HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, 물 추출물 및 활성 주성분은 또한 HIV 보균자 및 AIDS 환자를 포함하여, HIVDP 감연된 사람을 치료하는데 효과적이다.
여기에서 원하는 치료효과는 생약을 "그대로", 또는 차, 탕약, 음료, 캔디 또는 기타 당제, 유아용 제제 및 성인용 영양제품과 같은 장용성 액체 영양제품, 의료용 식품, 1종 이상의 생약 또는 그것의 추출물 또는 활성 주성분을 함유하는 영양보충제 또는 뉴트라슈티컬로서 투여함으로써 얻을 수 있다. 약학적 조제에 대해서는, 상기 항바이러스성 생약 또는 그것의 추출물 또는 활성 주성분의 1종 이상을 서방성 코팅을 갖거나 또는 갖지 않는 캡슐, 패킷 또는 정제와 같은 단위 제형으로 투여할 수 있다.
의료계는 바이러스 감염을 효과적으로 치료하는 방법 및 제품, 특히 HBV, HCV 및 HIV에 감염된 사람을 치료하기 위한 방법 및 제품을 계속 찾고 있다. 허브 혼합물 HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, 단일 허브 성분, 그것의 추출물, 활성 주성분 및 이러한 본초 조성물을 함유하는 제품이 이러한 참혹한 병을 예방 및 치료하는 추가적인 도구로서 의료계에 의해 쉽게 수용될 것이다.
특정한 대표적인 실시예가 여기에서 기술되는 반면, 본 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않는다면 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 게는 명백히 이해될 것이다.

Claims (10)

  1. 동물에서의 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 조성물로서, HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, No.5(5)-H, No.5(5)-No.4(3), No.5(5)-No.4(4), No.4(3)-No.4(4), No.4(3)-H, No.4(4)-H, No.5(5)-No.5(11), No.5(11)-H, 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 식물 재료의 블렌드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 포유동물에서의 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 조성물로서, No.4(2), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11), H, 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 생약 및 원료 식물 재료의 군으로부터 유래되는 산 침전성 활성성분을 적어도 1종 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 포유동물에서의 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 조성물로서, No.4(3), No.4(4), No.5(11), 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어지는 생약 및 원료 식물 재료의 군으로부터 선택된 산 가용성 성분을 적어도 1종 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 포유동물에서의 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 조성물로서,
    a) No.4(2), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11), H, 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 유래되는 산 침전성 활성성분의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 성분; 그리고
    b) No.4(3), No.4(4), No.5(11), 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 유래되는 산 가용성 성분의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 성분
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 포유동물에서의 바이러스 감염을 치료하는데 유용한 조성물로서,
    a) No.5(5), H, 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 성분; 그리고
    b) No.4(2), No.4(3), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(4), No.5(8), No.5(11), 그것의 혼합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염의 군으로부터 선택된 적어도 1종의 성분
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 포유동물에서의 바이러스 감염을 치료하기 위한 방법으로서, 제 1 항, 제 2항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 치료적으로 유효한 양을 치료가 필요한 포유동물에게 장내 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 HBV, HCV 및 HIV로부터 선택된 바
    이러스에 의해 발생되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 음료, 캡슐, 정제, 분말, 캔디, 겔, 차, 영양제품 또는 영양보충제의 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 의약제품:
    a) No.4(2), No.4(4), No.4(5), No.5(1), No.5(5), No.5(8), No.5(11), H, HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54 및 그것의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 식물 재료를 물과 접촉시켜 수성 분산액을 형성하는 단계;
    b) 수성 분산액으로부터 불용성 물질을 분리하는 단계;
    c) 수용액을 pH가 약 4.0 이하가 되도록 산성화시켜 산 침전물을 형성하는 단계;
    d) 상기 산 침전물을 상청액으로부터 분리하는 단계;그리고
    e) 상기 산 침전물을 정제하여 상기 의약제품을 얻는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 산은 염산인 것을 특징으로 하는 의약제품.
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