PL245314B1 - Zastosowanie soli sodowej kwasu 5,5’-indygodisulfonowego do hamowania infekcji bakteriofagowych w procesach biotechnologicznych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie soli kwasu 5,5'-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5'-indygodisulfonowego o stężeniu co najmniej 0.0001 mg/ml, korzystnie co najmniej 0.01 mg/ml do przeciwdziałania infekcjom bakteriofagowym w procesach biotechnologicznych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób zwalczania infekcji bakteriofagowych z wykorzystaniem indygotyny (sól sodowa kwasu 5,5’-indigodisulfonowego), która wykorzystywana jest powszechnie jako barwnik spożywczy (E132). W metodzie według wynalazku opisano nowe zastosowanie tego związku do ochrony bakterii przez bakteriofagami.

Bakteriofagi (fagi) to wirusy atakujące bakterie. W większości przypadków zakończenie cyklu reprodukcyjnego fagów powoduje zniszczenie komórki bakteryjnej. Bakterie są powszechnie wykorzystywane do produkcji środków aktywnych w przemyśle biotechnologicznym. Dlatego bakteriofagi powodują znaczne straty w wyniku utraty partii produktów oraz nawracających infekcji. Ochrona bioreaktorów przed infekcjami bakteriofagowymi jest jednym z największych wyzwań w przemyśle biotechnologicznym, spożywczym, oraz w farmacji. Dzięki zastosowaniu metody według wynalazku możliwa jest ochrona bakterii w bioreaktorze przed infekcją bakteriofagową. Ponieważ indygotyna nie ma znaczących właściwości antybakteryjnych i charakteryzuje się niską cytotoksycznością, można ją dodawać bezpośrednio do bioreaktorów.

Dzięki rozwojowi biologii molekularnej i biotechnologii stało się możliwe wykorzystanie mikroorganizmów w różnych gałęziach przemysłu, między innymi do produkcji i oczyszczania biopaliw, redukcji zanieczyszczeń, produkcji leków oraz produkcji i przetwarzania żywności, napojów oraz innych środków aktywnych [1]. Drobnoustroje znajdują zastosowania biotechnologiczne, takie jak produkcja jogurtu i sera [2], fermentacja warzyw np. kapusty [3], produkcja bionawozów [4], produkcja leków, np. insuliny [5], oraz w leczeniu chorób (takich jak mukowiscydoza, hemofilia, wirusowe zapalenie wątroby typu B [6]). Sprzedaż leków pochodzenia mikrobiologicznego przekracza obecnie 13 miliardów dolarów rocznie [6]. Co więcej, badania nad mikrobiomem jelitowym wykazały znaczenie symbiotycznego związku między bakteriami a człowiekiem [8]. We wszystkich tych przypadkach bakterie są naszymi sojusznikami. Dlatego często konieczna jest ochrona przed czynnikami mogącymi mieć negatywny wpływ na hodowle bakteryjne.

Jednym z największych czynników ryzyka dla procesów biotechnologicznych wykorzystujących bakterie są bakteriofagi. Bakteriofagi (fagi) to wirusy, których gospodarzem są bakterie. Z pojedynczego wirionu (cząstki fagowej) już w ciągu kilkunastu minut może powstać kilkaset jego kopii. Kopie te atakują kolejne komórki bakteryjne, powodując gwałtowny przyrost ilości wirionów. W większości przypadków zakończenie cyklu namnażania wirusów kończy się zniszczeniem komórki gospodarza. Infekcje takie są trudne do zwalczenia i powodują znaczne straty w produkcji [7]. Jest to problem, szczególnie podczas pracy na dużą skalę, a ryzyko nawracających infekcji fagowych jest wysokie [8]. Dla przykładu, przemysł mleczarski traci od 1% do 10% partii produktów w wyniku zanieczyszczenia fagami [9]. Najczęstszym źródłem fagów w tym przypadku jest substrat - mleko przed obróbką [10]. W badaniu Del Rio fagi wykryto w 37% próbek mleka, którego nie poddano żadnej obróbce [11].

W wyniku zakażenia fagami partia produktu jest zwykle tracona i utylizowana. Przeważnie nie jest to jednak koniec problemu, gdyż nawet jeden ocalały fag może powodować nawracające infekcje. W związku z tym istnieje potrzeba odpowiedniej dezynfekcji. Niestety, ilość metod zwalczania fagów jest ograniczona [12]. Zbadano wpływ czynników fizycznych, takich jak temperatura, kwasowość środowiska lub zasolenie i jony na przeżywalność bakteriofagów [13]. Należy zauważyć, że niektóre fagi mogą wytrzymać ekstremalne warunki, takie jak 90°C przez 15 minut lub, w niektórych przypadkach, nawet gotowanie [12]. Zbadano również wykorzystanie promieniowania UV do inaktywacji bakteriofagów [14]. Stwierdzono, że fagi są wysoce odporne na większość czynników fizycznych, a konsekwencje ekspozycji na promieniowanie UV są trudne do badania ze względu na niską powtarzalność [13, 14]. Zastosowanie promieniowania jest również niedoskonałym środkiem sterylizującym, gdyż w warunkach rzeczywistych często stosuje się media o wysokim zmętnieniu oraz aparaturę o skomplikowanych kształtach i ograniczonych wymiarach geometrycznych, przez co istnieją powierzchnie niedostępne dla światła [15]. Standardowo stosuje się środki chemiczne, takie jak Virkon, które zawierają mononadsiarczan potasu jako główny składnik aktywny i mają silne właściwości antyfagowe i bakteriobójcze [16]. Związki te są zwykle bardzo toksyczne dla ludzi i środowiska.

Niektóre nanocząstki mogą również eliminować wirusy poprzez uwalnianie jonów [17-19] lub w wyniku wytworzenia reaktywnych form tlenu (reactive oxygen species (ROS)) [20, 21]. Jednym z takich przykładów jest zastosowanie tlenku glinu modyfikowanych nanocząstkami tlenku miedzi przeciwko bakteriofagom MS2 [22]. W innej pracy udowodniono, że nanocząstki srebra i tlenku cynku są skuteczne w zwalczaniu MS2 [23]. Inne przykłady takich środków wirusobójczych obejmują polikationowe superparamagnetyczne nanocząstki, które posiadają rdzeń magnetyczny z powłokami z funkcjonalnej krzemionki kowalencyjnie związanej z poli(heksametylenobiguanidem) (PHMBG) lub polietylenoiminą (PEI) [24]. Dzięki swoim unikalnym właściwościom fizykochemicznym i zdolnościom dezynfekującym nanocząstki dwutlenku tytanu mogą być również wykorzystywane w walce z bakteriofagami [21].

Znakomita większość sposobów eliminacji bakteriofagów wykazuje również właściwości antybakteryjne. Z tego powodu rozwiązania te nie nadają się do zastosowań, w których bakterie są podstawą produkcji substancji aktywnych. Rozwiązaniem problemu może być opracowanie związków, które nie wpływając na bakterie, a jednocześnie powodują dezaktywację bakteriofagów. Sposób według wynalazku podaje takie rozwiązanie. Sposób ten wykorzystuje indygotynę do dezaktywacji bakteriofagów i ochrony bakterii przed infekcjami fagowymi.

Nie jest możliwe wykorzystanie standardowych czynników antywirusowych (np. leków) przeciwko bakteriofagom. Dostępne leki antywirusowe w znakomitej większości oddziałują nie bezpośrednio na wiriony, a raczej na komórki gospodarza. Celem jest zablokowanie szlaków metabolicznych prowadzących do namnażania wirionów [25]. Leki antywirusowe, skuteczne w przypadku komórek eukariotycznych (np. ludzkich), są nieefektywne w przypadku bakterii (czyli komórek prokariotycznych).

Dotychczas znane jest jedno rozwiązanie pozwalające chronić bakterie przed bakteriofagami [26]. Autorzy opisali wykorzystanie nanocząstek złota z odpowiednio dobranymi ligandami stabilizującymi. Najważniejszy okazał się balans między ligandami hydrofobowymi, a takimi, które posiadają ładunek ujemny. Rozwiązanie to posiada jednak znaczące ograniczenia:

1) Czynnik antybakteriofagowy nie był dodawany bezpośrednio do bioreaktora.

Nanocząstki inkubowane były w małej objętości z bakteriofagami, a taka mieszanina dopiero później została umieszczona w bioreaktorze zawierającym bakterie. Odpowiada to ochronie w czasie dodawaniu np. antybiotyków, które mogą być zanieczyszczone bakteriofagami. Większości antybiotyków nie można sterylizować standardowymi metodami, ponieważ uległyby zniszczeniu. Jednym z nielicznych wyjątków jest kanamycyna, która jest stabilna w czasie autoklawowania;

2) By nanocząstki opisane przez autorów były skuteczne należy je inkubować z bakteriofagami w 50°C. Taka temperatura może być jednak za wysoka w wielu zastosowaniach;

3) Rdzeń wykorzystanych nanocząstek był wykonany ze złota, co negatywnie wpływa na zasadność zastosowania tego rozwiązania ze względów ekonomicznych.

Istnieją doniesienia, dotyczące wpływu barwników spożywczych na aktywność niektórych wirusów, szczególnie w kontekście tradycyjnej medycyny chińskiej. Barwniki zawierające pierścienie heterocykliczne (TWI296626B) i sulfonowane pierścienie aromatyczne zwróciły uwagę badaczy [27]. Inny przykład bazujący na tradycyjnej medycynie (rdzenni Amerykanie) to wykorzystanie Isatis indigotica (urzet barwierski, inna nazwa Isatis tinctoria) ze względu na jej działanie przeciwbakteryjne, zwłaszcza w jamie ustnej [28].

Isatis i Baphicacanthus to między innymi dwa rodzaje roślin, które można wykorzystać do zwalczania infekcji wirusowych ssaków, takich jak grypa, zapalenie wątroby i HIV. Z kolei wyciągi z P. tinctorium hamują wzrost patogennych wirusów, bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych oraz komórek nowotworowych (US6524625). Indigo naturalis, czyli ekstrakt pozyskiwany z liści roślin zawierających indygo również wykazywały pewne właściwości przeciwgrypowe [29]. Wyciągi roślinne z Isatis tinctoria (Isatis indigotica) lub Polygonumn tinctorium opisano, jako substraty wykorzystywane do przygotowania leków przeciwwirusowych (US6214350). Eksperymenty z ekstraktami z Isatis tinctora przeciwko wirusowi japońskiego zapalenia mózgu (JEV) wykazują potencjalne właściwości wirusobójcze ekstraktu roślinnego i jego zdolność do hamowania adsorpcji wirusa do komórek gospodarza [30]. Wyciągi te mają również działanie hamujące namnażanie się wirusów ssaków. Jako składnik o działaniu aktywnym, spośród wielu obecnych w ekstraktach, sugerowane jest indygo.

Wykazano działanie pochodnych indygo jako inhibitorów indukcji wirusów, których aktywność może prowadzić do chorób nowotworowych (np. wirus Epsteina-Barr) (US6225296B1). Opis nie określa sposobu działania barwników na wirusa. Co więcej, nie jest również jasne, czy komórki uodporniły się na działanie wirusa, czy też wirus stał się niezdolny do ataku.

Zahamowanie replikacji wirusa grypy można również osiągnąć za pomocą izomeru 3,2’-bisindolu indygo - indyrubiny [31]. Ekstrakt, zawierający 65% indyrubiny, 0.1% - 45% indygo i 0.1% - 5% tryptantryny, w niektórych przypadkach wykazuje również działanie przeciwbakteryjne (US10668120).

W opisie tego wynalazku nie jest jasne, czy poszczególne związki działają przeciwbakteryjnie, czy działają synergistycznie. Wynalazek ten nie wspomina również o indygotynie, ani o jego potencjalnych właściwościach antybakteryjnych.

W związku z trwającą pandemią COVID-19 ponownie przyjrzano się działaniu przeciwwirusowemu wielu ziół i naturalnych związków [32]. Przeprowadzono eksperymenty z Indigo naturalis, aby złagodzić szkodliwy wpływ koronawirusa na płuca [33, 34]. Bezpośredni wpływ indygotyny na koronawirusa jest jednak nieznany.

W przeciwieństwie do opisanego działania antywirusowego naturalnych ekstraktów zawierających indygotynę, w metodzie według wynalazku cząsteczki indygotyny działają bezpośrednio na wiriony (cząstki fagowe), a nie komórki gospodarza (np. hamując replikację wirusa). Ponadto używany w metodzie związek indygo jest wynikiem syntezy chemicznej. Oznacza to, że jest to ściśle zdefiniowana substancja, wolna jest od śladowych ilość zanieczyszczeń obecnych w roślinnych ekstraktach, które mogą działać bakteriobójczo lub synergistycznie. Dodatkowo, w przeważającej ilości przypadków rozpatrywanych w literaturze naturalne lub syntetyczne indygo jest obiektem badawczym. Przypadki badań nad indygotyną (syntetycznym analogiem indygo zawierającym grupy sulfonowe) są niezwykle rzadkie i zazwyczaj niezwiązane z przedmiotem tego wynalazku.

Dodatkowo znane są również interakcje indygotyny i bakteriofagów M13 [35]. W opublikowanej pracy badacze wykorzystywali warstwy ze ściśle upakowanych fagów M13, tworząc półprzepuszczalną błonę dla jonów. Materiał ten działał niczym biologiczna dioda. Z wielu prób przeprowadzonych przez autorów, jedna z nich używała indygotynę. Związek wprowadzono do układu w celu zbadania wpływu dużego, hydrofobowego anionu. Na podstawie wyników autorzy wysnuli wniosek, że występuje interakcja ujemnie naładowanej cząsteczki indygotyny z dodatnio naładowaną powierzchnią faga (dodatni ładunek jest wynikiem obniżenia pH) poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Nie było prowadzonych próby sprawdzających aktywność bakteriofagów po potraktowaniu ich barwnikiem. Wyniki prac skupiały się na czysto fizycznym zachowaniu błony podczas przykładania do niej napięcia.

Problemem stawianym przed wynalazkiem jest dostarczenie związku chemicznego do stosowania przemyśle biotechnologicznym w celu ochrony bakterii przed infekcjami bakteriofagowymi, przy czym związek taki powinien wykazywać korzystne działanie już przy stężeniach nie wyższych niż 5 mg/ml, powinien być łatwo dostępny, charakteryzować się niską cytotoksycznością wobec mikroorganizmów roboczych, wykazywać skuteczność wobec bakteriofagów przy typowych temperaturach pracy bioreaktorów (37°C), albo podwyższonej (50°C) jeśli jest to konieczne, oraz powinno być możliwe jego bezpośrednie dodawanie do zawiesin bakterii.

Nieoczekiwanie okazało się, że powszechnie wykorzystywany barwnik spożywczy E132 (indygotyna) posiada właściwości antybakteriofagowe. Czynnikiem aktywnym jest anion kwasu 5,5’-indygodisulfonowego. Indygotyna (E132, sól sodowa kwasu 5,5’-indygodisulfonowego) dysoscjuje w rozpuszczalnikach polarnych na kation metalu (w najbardziej powszechnie stosowanym przypadku kation sodowy) oraz anion kwasu 5,5’-indygodisulfonowego. Czynnik aktywny (anion kwasu 5,5’-indygodisulfonowego) powoduje bezpośrednią dezaktywację wirionów bakteriofagowych. Ochronę przed infekcją bakteriofagową można realizować na dwa sposoby: 1) poprzez preinkubację czynnika aktywnego z dodatkami wykorzystywanymi do kultywacji bakterii oraz 2) w sposób ciągły po dodaniu indygotyny bezpośrednio do bioreaktora zawierającego bakterie. Związek ten można dodawać bezpośrednio do zawiesin bakterii, co nie powoduje ich śmierci, ale chroni je przed infekcją bakteriofagową. Poprawę skuteczności działania indygotyny (tj. zmniejszenie skutecznego stężenia tego związku) można uzyskać poprzez jednoczesne zastosowanie podwyższonej temperatury i/lub mechanicznej agitacji.

Zastosowanie roztworów soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego, korzystnie soli dwusodowej lub potasowej kwasu 5,5’-indygodisulfonowego do przeciwdziałania infekcjom bakteriofagowym w procesach biotechnologicznych, korzystnie do hamowania infekcji bakteriofagowych.

W korzystnej realizacji wynalazku sole kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5'-indygodisulfonowego rozpuszcza się w rozpuszczalniku polarnym lub mieszaninie rozpuszczalników zawierającej co najmniej jeden rozpuszczalnik polarny, korzystnie w wodzie, etanolu, lub mieszaninie wody i etanolu, najkorzystniej w wodzie.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku stężenie soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego, korzystnie soli dwusodowej albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego w roztworze wynosi od 0.00001 mg/ml do 10 mg/ml, korzystnie od 0.001 mg/ml do 10 mg/ml, jeszcze korzystniej od 0.1 mg/ml do 2 mg/ml.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się w dowolnej temperaturze poniżej temperatury wrzenia rozpuszczalników użytych, albo ich mieszaniny, korzystnie w temperaturze od 37°C do 50°C.

W innej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego jest aktywny przeciw bakteriofagom w zakresie temperatur od 0°C do 100°C, korzystnie od 20°C do 50°C, jeszcze korzystniej od 37°C do 50°C, najkorzystniej w temperaturze 50°C.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego jest aktywny przeciw bakteriofagom z dodatkowym zastosowaniem mieszania w zakresie od 0 obr./min do 400 obr./min, korzystnie w zakresie od 0 obr./min do 300 obr./min jeszcze korzystniej 220 obr./min.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się do dodatków hodowalnych i preinkubuje się taką mieszaninę przed jej wprowadzeniem do bioreaktora zawierającego bakterie, korzystnie inkubuje się w temperaturze 50°C.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się bezpośrednio do zawiesiny bakteryjnej, korzystnie inkubuje w trakcie mieszania w temperaturze 37°C.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się bezpośrednio do bioreaktora.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji wynalazku roztwór soli kwasu 5,5'-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się do mieszaniny hodowlanej zawierającej bakterie.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku bakteriofagi są wybrane z grupy obejmującej: bakteriofagi z rzędu Caudovirales albo bakteriofagi filamentowe, korzystnie grupa obejmuje bakteriofagi T4, T1, T7 albo M13.

W innej korzystnej realizacji wynalazku roztwór zawierający anion kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się do mieszaniny hodowlanej zawierającej bakterie. Po dodaniu preinkubuje się mieszaninę hodowlaną w warunkach wzrostu bakterii (mieszanie, odpowiednia temperatura, obecność pożywki i innych dodatków). Obecność anionu kwasu 5,5’-indygodisulfonowego chroni bakterie przed infekcją bakteriofagową.

Sposób według wynalazku można stosować w dwóch konfiguracjach: 1) do eliminacji fagów w dodatkach, które wykorzystywane są do hodowli bakterii (np. antybiotyki, induktory), a które są wrażliwe na standardowe metody sterylizacji, oraz 2) jako bezpośredni dodatek do hodowli bakteryjnych, który zabezpiecza je przed infekcją bakteriofagową (np. przed przeniesieniem wirionów fagowych przez operatora na ubraniach, rękach czy włosach).

Przykłady realizacji wynalazku zobrazowano na rysunku gdzie przedstawiono na:

fig. 1 a) Analiza wpływu indygotyny o stężeniu 2 mg/mL na ilość bakteriofagów T4 w 37°C (bez mieszania), fig. 1 b) Analiza wpływu indygotyny o stężeniu 0.5 mg/mL na ilość bakteriofagów T4 w 50°C (bez mieszania). Stężenie 0.5 mg/ml wykazało jedynie niewielki wpływ w 37°C bez mieszania, fig. 1 c) Wpływ mieszania (220 rpm) na aktywność antybakteriofagową wykazywaną przez indygotynę (IC) w różnych stężeniach (od 0.0001 mg/mL do 1 mg/mL) po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C. Próbki kontrolne (niezawierające czynnika aktywnego) były inkubowane w takich samych warunkach. Bez czynnika aktywnego nie zaobserwowano spadku ilości aktywnych bakteriofagów;

fig. 2. Wpływ stężenia indygotyny (od 0.00001 mg/mL do 1 mg/mL) na bakteriofagi T7 (a), M13 (b), T4 (c), T1 (d), po 24 godzinnej inkubacji w temperaturze 50°C. Szare (jasne) krzywe dopasowano z wykorzystaniem funkcji Hilla i wyznaczono wartość EC50; fig. 3a) Indygotyna zapewnia ochronę płynnym kulturom bakteryjnym przed bezpośrednim dodatkiem bakteriofagów. W warunkach kontrolnych dodatek fagów T4 zmniejsza ilość bakterii o około 6 rzędów wielkości. Jeżeli jednak do bakterii uprzednio dodano indygotyny to nie zaobserwowano znaczącego spadku ilości komórek bakteryjnych, fig. 3b) Profil intensywności fluorescencji białka GFP produkowanego w bakteriach, które inkubowane były bez i w obecności indygotyny (2.0 mg/mL) przez 24 godzin w temperaturze 37°C. Zauważono jedynie niewielki spadek ilości GFP w próbkach zawierających indygotynę.

Przykłady wykonania wynalazku

Materiały i metody

Odczynniki

Skład stałego agaru LB, użytego do przygotowania podłoży do badań mikrobiologicznych, był następujący: 15 g/L agaru, 10 g/L NaCI, 10 g/L tryptonu i 5 g/L ekstraktu drożdżowego. Płynna pożywka LB stosowana do przygotowania całonocnych i odświeżonych kultur nie zawierała agaru. Agar LB, jak i podłoże LB zostały zamówione w postaci gotowej mieszanki (Carl Roth, Niemcy). Bufor TM o pH = 7.4 przygotowano przez zmieszanie 10 mM Tris, 5 μM CaCl2, 10 mM MgSO4 i wody o jakości MiliQ (18,2 MQ). Wszystkie pożywki były sterylizowane przed użyciem.

Materiały zużywalne mL sterylne probówki typu falcon (probówki wirówkowe NeoCulture - wykonane z polipropylenu (PP), 50 mL, wolnostojące - sterylne) oraz probówki 1.5 mL typu Eppendorf (B-1429 i B-2278) były zakupione w firme Bionovo (Polska). Wszystkie materiały zużywalne były odpowiednie do badań z bakteriofagami - brak niekontrolowanej adsorpcji wironów na powierzchniach plastikowych [36].

Bakteriofagi

Aby przygotować lizaty fagów T1, T4, T7, zakażono wczesne hodowle Escherichia coli BL21, a dla M13, E. coli C3000. Inokulum fagów dodano w fazie logarytmicznego wzrostu bakterii. Po zakończeniu lizy przeprowadzono strącanie fagów glikolem polietylenowym. Osad następnie odwirowano i rozcieńczono w 1 M NaCI. Fagi T1, T4, T7 i M13 oczyszczono przez ultrawirowanie w gradiencie CsCI. Ostatnim krokiem była dializa zawiesin wobec buforu TM. Dodano 0.2 μg/ml DNazy w celu zmniejszenia lepkości poprzez trawienie DNA uwolnionego z fagów podczas procedury.

Bakterie

Pojedynczą kolonię E. coli (wymagany szczep) przeniesiono do 10 mL pożywki LB w celu przygotowania hodowli bakteryjnych. Próbkę tę następnie inkubowano przez noc w 37°C w wytrząsarce (Orbital Shaker-Incubator ES-20, 220 rpm). Tę próbkę odświeżono przez zmieszanie 2.5 mL całonocnej hodowli z 7.5 mL pożywki LB i inkubację w 37°C przez około 1 godzinę.

Aby ocenić wpływ indygotyny (sól sodowa kwasu indygo-5,5’-disulfonowego, E132, producent Food Colours (Polska) WS-P-064, nr partii 35) na funkcjonowanie komórek bakteryjnych, przygotowano całonocne hodowle E. coli BL21 DE3 posiadające plazmid kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP). By wywołać nadekspresję białka GFP dodawano IPTG (izopropylo 3-D-1-tiogalaktopiranozyd). Poza próbką kontrolną przygotowano próbkę, w której stężenie indygotyny wynosiło 1 mg/mL. Próbki te odświeżono, jak opisano powyżej, i obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym (Nikon Eclipse 50i).

Test łysinkowy mL podłoża (agar LB) i pozostawiono do zestalenia w szalkach Petriego. Następnie 4 mL agaru górnego (przygotowanego z pożywki płynnej z dodatkiem jedynie 0.5% agaru) zmieszano z 200 μL odświeżonej hodowli E. coli (odpowiedni szczep) i wylano na wcześniej przygotowane szalki. Odpowiednie rozcieńczenia zawiesin fagów nakraplano na wierzchnią warstwę agaru (co najmniej 8 kropel po 5 μL). Liczbę łysinek liczono po inkubacji płytek w 37°C przez 24 godziny. Miareczkowania przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Przykład 1

Indygotyna rozpuszcza się dobrze w polarnych rozpuszczalnikach, w których następuje dysocjacja jonowa i czynnik aktywny obecny jest w postaci anionu kwasu indygo-5,5’-disulfonowego. W szczególności woda, alkohole, DMF, DMSO mogą być wykorzystane jako rozpuszczalniki, ponieważ umożliwiają rozpuszczenie i dysocjację indygotyny, tworząc roztwory rzeczywiste. Dlatego w zastosowaniu według wynalazku można stosować wodę i mieszaniny ją zawierające (jak np. roztwory niskich alkoholów (metanol, etanol), roztwory buforowe itp.) jako rozpuszczalnik. W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku wykorzystano medium wodne jako najczęściej stosowane w standardowych zastosowaniach przemysłowych.

Wynalazku można używać w zakresie temperatur, w którym roztwory rzeczywiste zawierające czynnik aktywny pozostają w stanie ciekłym. Zakres działania wynalazku jest ograniczony temperaturami przejść fazowych użytych rozpuszczalników. Drugim czynnikiem ograniczającym zakres możliwych do realizacji temperatur jest stabilność termiczna mikroorganizmów. Zastosowanie według wynalazku możliwe jest do wykorzystania w przypadku wszystkich temperatur, w których przeprowadza się proces biotechnologiczny. Mikroorganizmy należące do grupy psychrofilów charakteryzują się optymalnymi warunkami wzrostu w temperaturze w zakresie od 0°C do 20°C, podczas gdy dla termofilów zakres temperatur może sięgać 100°C.

W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku zaprezentowano działanie czynnika aktywnego w temperaturze 37°C oraz 50°C. Wybrano takie warunki ze względu na wykorzystanie modelowych mikroorganizmów - bakteriofagów T4 oraz bakterii Escherichia Coli. Należy zauważyć, że 37°C jest standardową temperaturą pracy większości bioreaktorów wykorzystywanych w przemyśle, szczególnie tych, które używają E. Coli.

Indygotyna jest stosunkowo tania i może być stosowana w stosunkowo wysokich stężeniach. W korzystnym przykładzie wykonania użyto roztworu o stężeniu 2 mg/mL. Zauważono umiarkowany spadek o ponad 1 log miana faga T4, z około 2 χ 10⁶ do około 9 χ 10⁴ PFU/mL. Miano roztworu bakteriofagów osiągnęło stałą wartość po około 10 godzinach inkubacji (fig. 1a). W przypadku faga T4 nie zaobserwowano zwiększenia efektu wraz ze wzrostem stężenia indygotyny powyżej 2 mg/mL. Skuteczne stężenie graniczne indygotyny jest warunkowane maksymalną rozpuszczalnością jej w rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników (w wypadku wody jest to około 10 mg/mL).

Indygotyna wykazuje lepszy efekt dezaktywujący w wyższej temperaturze. Przeprowadzono pomiar miana faga w temperaturze 50°C w próbkach z indygotyną o niższym niż poprzednio stężeniu, tj. 0.5 mg/mL (fig. 1b). Miano fagów w próbkach kontrolnych (bez indygotyny) w 50°C spadło bardziej niż w 37°C (fig. 1a). Było to zgodne z oczekiwaniami - wyższa temperatura w większym stopniu wpłynęła na fagi, co spowodowało spadek do około 3.65 χ 10⁵ w 50°C, w porównaniu z 2 χ 10⁶ PFU/ml w 37°C po 24 godzinach inkubacji. Inkubowanie wirusów w medium zawierającym 0.5 mg/mL indygotyny spowodowało spadek o 2 log po około 12 godzinach i całkowitą (miano spadło poniżej granicy wykrywalności, tj. ponad 6 log) inaktywację po około 20 godzinach. W wyższych temperaturach dezaktywacja bakteriofagów jest jeszcze bardziej skuteczna i poza działaniem indygotyny wiąże się także z termiczną nietrwałością wirionów.

Kolejnym czynnikiem zwiększającym antybakteriofagową aktywność indygotyny jest mieszanie. Intensywność mieszania jest zależna od prowadzonego procesu biotechnologicznego. Dla różnych geometrii bioreaktorów i różnych zastosowanych mikroorganizmów inna jest optymalna szybkość mieszania. W warunkach eksperymentu zaprezentowanego jako korzystne wykonanie wynalazku sprawdzono działanie indygotyny przy braku mieszania i przy prędkości 220 obr./min. Jest to szybkość najbardziej rozpowszechniona w większości standardowych procesów technologicznych dla badanych bakterii E. coli. Inkubowano próbki w temperaturze 37°C na wytrząsarce (220 obr./min) przez 24 godziny. Zauważono, że w podwyższonej temperaturze (50°C) spadek PFU/ml o 3 log z mieszaniem nastąpił już dla stężenia 0.1 mg/mL indygotyny, zamiast 0.5 mg/mL jak w przypadku próbki bez mieszania (fig. 1c). Jest to wynik, który zgadza się z przewidywaniem związanym z teorią zderzeń. Przy braku mieszania, zderzenia cząsteczek indygotyny i bakteriofagów są limitowane stochastycznymi ruchami indywiduów w roztworze. W wyniku agitacji mechanicznej, transport masy jest przyspieszony i nielimitowany dyfuzją. W związku z tym jest jasne, że szybsze mieszanie powodować będzie lepsze działanie antybakteriofagowe czynnika aktywnego.

Przykład 2

Czynnik aktywny (anion kwasu indygo-5,5’-disulfonowego) musi tworzyć roztwór rzeczywisty w danym rozpuszczalniku lub mieszaninie rozpuszczalników. W przypadku wody rozpuszczalność indygotyny to około 10 mg/mL w temperaturze pokojowej. Dla etanolu wartość ta wynosi około 3 mg/mL. Dlatego 10 mg/mL jest górnym stężeniem indygotyny w postaci soli dwusodowej kwasu indygo-5,5’-disulfonowego, który można stosować w celu dezaktywacji bakteriofagów.

Z punktu widzenia korzyści z zastosowania wynalazku kluczowe jest jednak określenie minimalnej aktywnej dawki czynnika aktywnego powodującego dezaktywację bakteriofagów. Dlatego wyznaczono wartości EC50 (stężenie powodujące spadek ilości fagów o połowę) dla indygotyny przeciwko fagom T4, T1, T7 i M13 w 50°C po 24-godzinnej inkubacji (fig. 2). Wartości EC50 obliczono zgodnie z równaniem Hilla [33]. EC50 wynosiło około 4.03 χ 10¹⁴ cząsteczek indygotyny na jednego faga T4 (około 0.1 mg/mL indygotyny dla początkowego miana około 4 χ 10⁵ PFU/mL), 8.91 χ 10¹⁴ cząsteczek na jednego faga T7 (około 0.007 mg/mL, początkowe miano około 6 χ 10⁴ PFU/mL), 1.77 χ 10¹⁷ cząsteczek na jednego faga T1 (około 0.1 mg/ml, początkowe miano około 4 χ 10³ PFU/mL) oraz 2.65 χ 10¹⁵ cząsteczek na jednego faga M13 (około 0.04 mg/mL, początkowe miano około 4 χ 10⁴ PFU/mL).

Ponieważ skuteczność czynnika aktywnego zależy zarówno od typu faga, jak i ilości wirionów, które znajdują się w próbce (stężenie faga), to stężenie indygotyny należy regulować w zależności od tego jak silnie zakażony bakteriofagami jest element podlegający odkażaniu. Dlatego w zależności od konkretnej sytuacji stężenie rozpuszczonej indygotyny (w postaci soli dwusodowej kwasu indygo-5,5’-disulfonowego) powinno wynosić między 0.0001 mg/mL a 10 mg/mL i powinno być optymalizowane ze względu na koszty w tym zakresie.

W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku przebadano fagi T1, T4 oraz T7, które należą do Caudovirales, czyli najliczniejszego rzędu fagów. Spośród około 5500 różnych fagów zbadanych pod mikroskopem elektronowym około 96% należało do Caudovirales [37]. Inny przebadany fag - M13 (filamentowy) jest ważny w biotechnologii, ponieważ jest często używany w metodzie phage display [38]. M13 Powoduje przewlekłe infekcje, a potomne wiriony są wydzielane bez niszczenia komórki gospodarza [39].

Przykład 3

W korzystnych przykładach zastosowania wynalazku 1 i 2 pokazano, że indygotyna oddziałuje bezpośrednio na bakteriofagi. Odpowiada to zastosowaniu, w którym zabezpiecza się dodatki do hodowli bakterii (np. antybiotyki, czynniki powodujące nadekspresję białek), których nie można sterylizować standardowymi metodami. Dodatki takie są często wrażliwe np. na temperaturę. Wykorzystanie indygotyny może zabezpieczać bakterie w bioreaktorze przed niepożądaną infekcją fagową w wyniku dodania do hodowli zakażonych składników procesu. Inkubację składników należy prowadzić tak jak opisano w przykładach 1 i 2, dobierając odpowiednio stężenie indygotyny i czas inkubacji.

Korzystny przykład zastosowania numer 3 wskazuje, że również bezpośredni dodatek indygotyny do hodowli bakteryjnej chroni bioreaktor przed infekcjami fagowymi. Eksperyment prowadzono w standardowych warunkach, tj. w temperaturze 37°C i przy mieszaniu 220 obr./min. Zbadano ilość bakterii (o stężeniu początkowym wynoszącym 104 CFU/mL) w ciekłych pożywkach zawierających A) tylko bakterie E. coli, B) E. coli i bakteriofagi T4 (o stężeniu 10³ PFU/mL), C) E. coli i indygotynę (o stężeniu 2.0 mg/mL) oraz D) E. coli, indygotynę (2.0 mg/mL) i bakteriofagi T4 (10³ PFU/mL). Dodatek fagów T4 spowodował drastyczny spadek ilości żywych bakterii (o około 6 rzędów wielkości, czyli milion razy). Dodatek takiej samej ilości fagów do bakterii chronionych przez indygotynę nie spowodował żadnej zmiany w stosunku do próbki kontrolnej (bakterie z dodatkiem indygotyny bez fagów).

Zaobserwowano, że sam dodatek indygotyny nieznacznie wpływa na ilość bakterii (porównanie próbek E. coli i E. coli z dodatkiem indygotyny). Sprawdzono, że indygotyna ma również nieznaczny wpływ na ilość wytwarzanego przez bakterię białka (ekwiwalent substancji czynnej lub produktu w procesach biotechnologicznych). Jest to kluczowe z punktu widzenia biotechnologicznego zastosowania genetycznie modyfikowanych bakterii do produkcji substancji aktywnych. W tym celu wykorzystaliśmy genetycznie zmodyfikowane bakterie, które pod wpływem czynnika indukującego (IPTG) wytwarzają zielone białko fluorescencyjne (GFP). Porównano próbki E. coli z dodatkiem tylko IPTG oraz E. coli z dodatkiem IPTG oraz indygotyny. Po inkubacji liczba bakterii w próbce kontrolnej wynosiła 6 χ 10⁸ CFU/mL, podczas gdy liczba bakterii GFP E. coli z indygotyną wynosiła 5,8 χ 10⁸ CFU/mL. Same bakterie obserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym a ilość wyprodukowanego białka GFP jako funkcję fluorescencji. Zaobserwowano jedynie nieznaczne różnice w ilości pikseli o wysokiej intensywności fluorescencji.

Wyniki te wskazują, że indygotyna może być wykorzystana jako bezpośredni dodatek do hodowli bakterii. Dzięki temu ochrona przez infekcją fagową dotyczy nie tylko dodatków, ale również zakażeń powodowanych przez dostanie się wirionów do bioreaktora ze środowiska (np. przeniesionych przez operatora na ubraniu, rękach lub włosach).

Literatura

1. Studies, D.; Peshawar, A.; Author, C. 2. Methods And Material 3. Review of Microbes Roles in the World Development.

2. Johnson, J.; Curtin, C; Waite-Cusic, J. The Cheese Production Facility Microbiome Exhibits Temporal and Spatial Variability. Front. Microbiol. 2021, 12, 1-13, doi:10.3389/fmicb. 2021.644828.

3. Chen, Z.; Kang, J.; Zhang, Y.; Yi, X.; Pang, X.; Li-Byarlay, H.; Gao, X. Differences in the bacterial profiles and physicochemical between natural and inoculated fermentation of vegetables from Shanxi Province. Ann. Microbiol. 2020, 70, doi:10.1186/s13213-020-01605-5.

4. Nosheen, S.; Ajmal, I.; Song, Y. Microbes as biofertilizers, a potential approach for sustainable crop production. Sustain. 2021,13, 1-20, doi:10.3390/su13041868.

5. Govender, K.; Naicker, T.; Lin, J.; Baijnath, S.; Chuturgoon, A.A.; Abdul, N.S.; Docrat, T.; Kruger, H.G.; Govender, T. A novel and more efficient biosynthesis approach for human insulin production in Escherichia coli (E. coli). AMB Express 2020, 10, doi:10.1186/s13568-020-

-00969-w.

6. Uses, E. Economic Uses and Benefits of Microorganisms | Encyclopedia.com. 2021, 1-5.

7. A. Zahn, J.; C. Halter, M. Surveillance and Elimination of Bacteriophage Contamination in an Industrial Fermentation Process. Bacteriophages - Perspect. Futur. 2020, 1-18, doi:10.5772/intechopen.81151.

8. Łos, M.; Czyz, A.; Sell, E.; Węgrzyn, A.; Neubauer, P.; Węgrzyn, G. Bacteriophage contamination: Is there a simple method to reduce its deleterious effects in laboratory cultures and biotechnological factories? J. Appl. Genet. 2004, 45, 111-120.

9. Bogosian, G. The Bacteriophages. In The Bacteriophages; Calendar, R., Ed.; Oxford University Press, 2006; pp. 667-673.

10. Marcó, M.B.; Moineau, S.; Quiberoni, A. Bacteriophages and dairy fermentations. Bacteriophage 2012, 2, 149-158, doi:10.4161/bact.21868.

11. del Rio, B.; Binetti, A.G.; Martin, M.C.; Fernandez, M.; Magadan, A.H.; Alvarez, M.A. Multiplex PCR for the detection and identification of dairy bacteriophages in milk. Food Microbiol. 2007, 24, 75-81, doi:10.1016/j.fm.2006.03.001.

12. Guglielmotti, D.M.; Mercanti, D.J.; Reinheimer, J.A.; Quiberoni, A. del L. Review: Efficiency of physical and chemical treatments on the inactivation of dairy bacteriophages. Front. Microbiol. 2012.

13. Jończyk, E.; Kłak, M.; Międzybrodzki, R.; Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages-review. Folia Microbiol. (Praha). 2011, 56, 191-200, doi:10.1007/s12223-011-

-0039-8.

14. Tomlinson, S. UV Irradiation On Bacteriophage Survival. 2010.

15. Atamer, Z.; Meike, S.; Neve, H.; Heller, K.J.; Hinrichs, J. Review: Elimination of bacteriophages in whey and whey products. Front. Microbiol. 2013, 4, 1-9, doi:10.3389/fmicb. 2013.00191.

16. Morin, T.; Martin, H.; Soumet, C; Fresnel, R.; Lamaudiere, S.; Le Sauvage, A.L.; Deleurme, K.; Maris, P. Comparison of the virucidal efficacy of peracetic acid, potassium monopersulphate and sodium hypochlorite on bacteriophages P001 and MS2. J. Appl. Microbiol. 2015, 119, 655-665, doi:10.1111/jam. 12870.

17. Gilcrease, E.; Williams, R.; Goel, R. Evaluating the effect of silver nanoparticles on bacteriophage lytic infection cycle-a mechanistic understanding. Water Res. 2020, 181, 115900, doi:10.1016/j.watres.2020.115900.

18. Gokulan, K.; Bekele, A.; Drake, K.; Khare, S. Responses of intestinal virome to silver nanoparticles: safety assessment by classical virology, whole-genome sequencing and bioinformatics approaches. Int. J. Nanomedicine 2018, Volume 13, 2857-2867, doi:10.2147/IJN.S161379.

19. Shimabuku, Q.L.; Ueda-Nakamura, T.; Bergamasco, R.; Fagundes-Klen, M.R. Chick-Watson kinetics of virus inactivation with granular activated carbon modified with silver nanoparticles and/or copper oxide. Process Saf. Environ. Prot. 2018, 117, 33-42, doi:10.1016/j.psep.2018.04.005.

20. Cho, M.; Cates, E.L.; Kim, J.-H. Inactivation and surface interactions of MS-2 bacteriophage in a TiO2 photoelectrocatalytic reactor. Water Res. 2011, 45, 2104-2110, doi:10.1016/j.wa- tres.2010.12.017.

21. Syngouna, V.I.; Chrysikopoulos, C. V. Inactivation of MS2 bacteriophage by titanium dioxide nanoparticles in the presence of quartz sand with and without ambient light. J. Colloid Interface Sci. 2017, 497, 117-125, doi:10.1016/j.jcis.2017.02.059.

22. Mazurkow, J.M.; Yuzbasi, N.S.; Domagała, K.W.; Pfeiffer, S.; Kata, D.; Graule, T. Nano-Sized Copper (Oxide) on Alumina Granules for Water Filtration: Effect of Copper Oxidation State on Virus Removal Performance. Environ. Sci. Technol. 2020, 54, 1214-1222, doi:10.1021/acs.est.9b05211.

23. You, J.; Zhang, Y.; Hu, Z. Bacteria and bacteriophage inactivation by silver and zinc oxide nanoparticles. Colloids Surfaces B Biointerfaces 2011, 85, 161-167, doi:10.1016/j.col- surfb.2011.02.023.

24. Bromberg, L; Bromberg, D.J.; Hatton, T.A.; Bandin, I.; Concheiro, A.; Alvarez-Lorenzo, C. Antiviral properties of polymeric aziridine- and biguanide-modified core-shell magnetic nanoparticles. Langmuir 2012, 28, 4548-4558, doi:10.1021/la205127x.

25. De Clercq, E.; Li, G. Approved antiviral drugs over the past 50 years. Clin. Microbiol. Rev. 2016, 29, 695-747, doi:10.1128/CMR.00102-15.

26. Richter, Ł; Paszkowska, K.; Cendrowska, U.; Olgiati, F.; Silva, P.J.; Gasbarri, M.; Guven, Z.P.; Paczesny, J.; Stellacci, F. Broad-spectrum nanoparticles against bacteriophage infections. Nanoscale 2021, doi:10.1039/d1nr04936d.

27. Meng, T.; Jia, Q.; Wong, S.; Chua, K. crossm In Vitro and In Vivo Inhibition of the Infectivity of Human. 2019, 93, 1-21.

28. Huang, C.Y.; Chang, J.Y.; Riskowski, G.L.; Chan, W.K.; Lai, J.T.; Chang, A.C. Antimicrobial activity of indigowoad (Isatis indigotica fort) and plains wild indigo (Baptisia bracteata) roots. Res. J. Med. Plant 2016,10, 237-245, doi:10.3923/rjmp.2016.237.245.

29. Yang, Z.; Wang, Y.; Zheng, Z.; Zhao, S.; Zhao, J.; Lin, Q.; Li, C; Zhu, Q.; Zhong, N. Antiviral activity of Isatis indigotica root-derived clemastanin B against human and avian influenza A and B viruses in vitro. Int. J. Mol. Med. 2013, 31, 867-873, doi:10.3892/ijmm.2013.1274.

30. Chang, S.J.; Chang, Y.C.; Lu, K.Z.; Tsou, Y.Y.; Lin, C.W. Antiviral activity of Isatis indigotica extract and its derived indirubin against Japanese encephalitis virus. Evidence-based Complement. Altern. Med. 2012, 2012, doi:10.1155/2012/925830.

31. Chan, M.C.; Chan, R.W.; Mok, C.K.; Mak, N.K.; Wong, R.N. lndirubin-3’-oxime as an antiviral and immunomodulatory agent in treatment of severe human influenza virus infection. Hong Kong Med. J. = Xianggang yi xue za zhi 2018, 24, 45-47.

32. Fuzimoto, A.D.; Isidoro, C. The antiviral and coronavirus-host protein pathways inhibiting properties of herbs and natural compounds - Additional weapons in the fight against the COVID-19 pandemic? J. Tradit. Complement. Med. 2020, 10, 405-419, doi:10.1016/j.jtcme.2020.05.003.

33. Tu, P.; Tian, R.; Lu, Y.; Zhang, Y.; Zhu, H.; Ling, L; Li, H.; Chen, D. Beneficial effect of Indigo Naturalis on acute lung injury induced by influenza A virus. Chinese Med. (United Kingdom) 2020,15, 1-18, doi:10.1186/s13020-020-00415-w.

34. Lin, C.W.; Tsai, F.J.; Tsai, C.H.; Lai, C.C.; Wan, L.; Ho, T.Y.; Hsieh, C.C.; Chao, P.D.L. Anti-SARS coronavirus 3C-like protease effects of Isatis indigotica root and plant-derived phenolic compounds. Antiviral Res. 2005, 68, 36-42, doi:10.1016/j.antiviral.2005.07.002.

35. Putra, B.R.; Szot-Karpińska, K.; Kudła, P.; Yin, H.; Boswell, J.A.; Squires, A.M.; Da Silva, M.A.; Edler, K.J.; Fletcher, P.J.; Parker, S.C.; et al. Bacteriophage M13 Aggregation on a Microhole Poly(ethylene terephthalate) Substrate Produces an Anionic Current Rectifier: Sensitivity toward Anionic versus Cationic Guests. ACS Appl. Bio Mater. 2019, 3, 512-521, doi:10.1021/ACSABM.9B00952.

36. Richter, Ł.; Księżarczyk, K.; Paszkowska, K.; Janczuk-Richter, M.; Niedziółka-Jonsson, J.; Gapiński, J.; Łoś, M.; Hołyst, R.; Paczesny, J. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Sci. Rep. 2021, 11, 7387, doi:10.1038/s41598-021-86571-x.

37. Ackermann, H.-W. 5500 Phages examined in the electron microscope. Arch. Virol. 2007, 152, 227-243, doi:10.1007/s00705-006-0849-1.

38. Harada, L.K.; Silva, E.C.; Campos, W.F.; Del Fiol, F.S.; Vila, M.; Dąbrowska, K.; Krylov, V.N.; Balcao, V.M. Biotechnological applications of bacteriophages: State of the art. Microbiol. Res. 2018, 212-213, 38-58, doi:10.1016/j.micres.2018.04.007.

39. Rakonjac, J.; Russel, M.; Khanum, S.; Brooke, S.J.; Rajic, M. Filamentous phage: Structure and biology. In Advances in Experimental Medicine and Biology; 2017; Vol. 1053.

Claims (11)

1. Zastosowanie roztworów soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego, korzystnie soli dwusodowej lub potasowej kwasu 5,5’-indygodisulfonowego do przeciwdziałania infekcjom bakteriofagowym w procesach biotechnologicznych, korzystnie do hamowania infekcji bakteriofagowych.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że sole kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego rozpuszcza się w rozpuszczalniku polarnym lub mieszaninie rozpuszczalników zawierającej co najmniej jeden rozpuszczalnik polarny, korzystnie w wodzie, etanolu, lub mieszaninie wody i etanolu, najkorzystniej w wodzie.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że stężenie soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego, korzystnie soli dwusodowej albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego w roztworze wynosi od 0.00001 mg/ml do 10 mg/ml, korzystnie od 0.001 mg/ml do 10 mg/ml, jeszcze korzystniej od 0.1 mg/ml do 2 mg/ml.

4. Zastosowanie według zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się w dowolnej temperaturze poniżej temperatury wrzenia rozpuszczalników użytych, albo ich mieszaniny, korzystnie w temperaturze od 37°C do 50°C.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego lub kwasu 5,5’-indygodisulfonowego jest aktywny przeciw bakteriofagom w zakresie temperatur od 0°C do 100°C, korzystnie od 20°C do 50°C, jeszcze korzystniej od 37°C do 50°C, najkorzystniej w temperaturze 50°C.

6. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 1 do 5, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego jest aktywny przeciw bakteriofagom z dodatkowym zastosowaniem mieszania w zakresie od 0 obr./min do 400 obr./min, korzystnie w zakresie od 0 obr./min do 300 obr./min, jeszcze korzystniej 220 obr./min.

7. Zastosowanie dowolnego zastrz. od 1 do 6, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się do dodatków hodowalnych i preinkubuje się taką mieszaninę przed jej wprowadzeniem do bioreaktora zawierającego bakterie, korzystnie inkubuje się w temperaturze 50°C.

8. Zastosowanie dowolnego zastrz. od 1 do 6, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się bezpośrednio do zawiesiny bakteryjnej, korzystnie inkubuje w trakcie mieszania w temperaturze 37°C.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się bezpośrednio do bioreaktora.

10. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że roztwór soli kwasu 5,5’-indygodisulfonowego albo kwasu 5,5’-indygodisulfonowego dodaje się do mieszaniny hodowlanej zawierającej bakterie.

11. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzedzających zastrzeżeń, znamienne tym, że bakteriofagi są wybrane z grupy obejmującej: bakteriofagi z rzędu Caudovirales albo bakteriofagi filamentowe, korzystnie grupa obejmuje bakteriofagi T4, T1, T7 albo M13.