DE69738535T2 - Antivirale mittel aus pflanzenextrakten und deren verwendung zur behandlung viraler infektionen - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die Erfindung betrifft Stoffzusammensetzungen, die antiviral aktive Komponenten umfassen, die aus chinesischen Pflanzenarzneimitteln, Heilpflanzen und Extrakten daraus erhalten wurden, und ihre Verwendung bei der Behandlung von Menschen oder Tieren, die mit Viren infiziert sind, insbesondere mit dem Hepatitis B-Virus (HBV), dem Hepatitis-C-Virus (HCV) und dem menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV). Insbesondere sind die Stoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von verschiedenen chinesischen Naturheilmitteln oder Heilpflanzen erhalten worden, die eine lange Tradition im Verzehr durch den Menschen besitzen. Die Stoffzusammensetzungen der Erfindung werden mittels spezifischer Techniken erhalten und haben eine herausragende Wirksamkeit bei der Behandlung von Menschen mit HBV und bei Hepatitis-C-Patienten nachgewiesen. Die erfindungsgemäßen Stoffzusammensetzungen haben auch in vitro eine antivirale Aktivität gegenüber dem Murinen Leukämie-Virus (MuLV) und bei HIV gezeigt. Der HIV-Virus ist der Virus, der dafür bekannt ist das erworbene Immunschwäche-Syndrom (AIDS) in Menschen auszulösen und AIDS stellt besondere Probleme für die ärztliche Gemeinschaft dar, welche die vorliegende Erfindung anspricht. Die aktiven Grundbestandteile von den einzelnen antiviral aktiven Naturheilmitteln oder Heilpflanzen oder den Extrakten daraus, sind durch spezifische Isolierungstechniken isoliert worden und sind durch die Verwendung von akzeptierten chemischen Techniken charakterisiert worden.
  • STAND DER FORSCHUNG
  • Die moderne medizinische Wissenschaft sucht beständig nach neuen und noch leistungsfähigeren Mitteln, um bakterielle oder virale Infektionen zu verhindern, zu behandeln oder zu verlangsamen und die Krankheiten zu heilen, welche durch diese Infektionen verursacht werden. Die bakteriellen und viralen Infektionen von Menschen und Haustieren kosten jährlich Milliarden an Dollar. Unermesslich Summen an Geldern werden jedes Jahr durch pharmazeutische Unternehmen ausgegeben, um neue Antibiotika und antivirale Mittel zu identifizieren, zu charakterisieren und herzustellen, um damit die auftretenden Arzneimittel-resistenten Stämme zu bekämpfen, die mittlerweile ein ernsthaftes Problem darstellen. Für verlässliche prophylaktische Behandlungen zur Krankheitsvorbeugung besteht ebenfalls ein großes Interesse. Dennoch bleiben trotz der Kosten und Bemühungen zur Identifizierung von Behandlungen für virale Infektionen, wie beispielsweise Hepatitis und AIDS, wirksame Therapien schwer fassbar.
  • Die Hepatitis ist eine Erkrankung der menschlichen Leber. Sie offenbart sich durch Entzündung der Leber und ist normalerweise durch virale Infektionen verursacht und manchmal auch durch giftige Substanzen. Hepatitis kann zu Leberzirrhose, Leberkrebs und letztendlich zum Tod fortschreiten. Verschiedene Viren, wie Hepatitis A, B, C, D, E und G, sind dafür bekannt, dass sie verschiedene Typen an viraler Hepatitis verursachen. Unter ihnen sind die HBV- und die HCV-Hepatitis am schwerwiegendsten. Der HBV ist ein DNA-Virus mit einer Viruspartikelgröße von 42 nm. Der HCV ist ein RNA-Virus mit einer Viruspartikelgröße von 30–60 nm. Siehe D. S. Chen, J. Formos. Med. Assoc., 95(1), 6–12 (1996).
  • Hepatitis-B ist weltweit ein großes Gesundheitsproblem, besonders in Asien und Afrika. Annähernd 300 Millionen Menschen sind weltweit chronisch mit HBV infiziert. Mehr als eine Million Träger von HBV sind in den Vereinigten Staaten zu finden. Die HBV-Infektion ist gegenwärtig die Hauptursache für Leberzirrhose und Leberkrebs. Die HBV-Träger stellen nicht nur sogenannte Langzeit- Reservoire von dem Virus dar, sondern sie können ebenfalls eine chronische Lebererkrankung entwickeln und haben ein beträchtlich erhöhtes Risiko, Leberzirrhose und Leberkrebs zu entwickeln. Das Fortschreiten von der chronischen Hepatitis-B zur Zirrhose verläuft häufig heimtückisch und tritt ohne eine erkennbare Änderung in den Symptomen ein. Sobald die Symptome einer Zirrhose oder von Krebs sich manifestiert haben, besitzen Therapien nur noch einen geringen Wert.
  • Die Verhinderung der HBV-Infektion ist durch die Schutzimpfung möglich, die sicher und wirkungsvoll ist. Die Schutzimpfung ist jedoch nicht wirksam in den bereits infizierten Menschen, d. h. den Trägern und Patienten. Viele Arzneimittel sind bei der Behandlung von Hepatitis-B schon verwendet worden und keines davon hat sich als wirksam erwiesen, mit der Ausnahme von Interferon. Die Behandlung mit Interferon besitzt einen eingeschränkten Heilerfolg und ist häufig mit nachteiligen Nebenwirkungen verbunden wie Erschöpfung, Fieber, Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Myalgien, Arthralgien, leichter Haarausfall, psychiatrische Effekte und damit verbundene Erkrankungen, Autoimmun-Phänomene und verbundene Krankheiten sowie eine Fehlfunktion der Schilddrüse. Für eine Behandlung mit Interferon für sechzehn (16) Wochen konnte gezeigt werden, dass sie wirksam ist und mit einem anhaltenden Verlust der viralen Replikation in annähernd 40% der Hepatitis-B-Patienten einhergeht. Die überwiegende Mehrheit der Responder hatte normale Serumwerte der Aminotransferase und die Rückfallraten waren gering. Siehe R. P. Perrillo, Digestive Diseases and Sciences, 38(4), 577–593 (1993). Eine höhere Langzeit-Rückfallrate (24%) wurde jedoch bei chinesischen Patienten mit chronischer Hepatitis-B gefunden, die einer Interferontherapie unterzogen wurden. Siehe A. S. F. Lok, H. T. Chung, V. W. S. Liu, & O. C. K. Ma, Gastroenterology, 105(6), 1833–1838 (1993).
  • Darüber hinaus verschwand das Serum-Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) in 10–15% der Patienten, die mit Interferon behandelt wurden. Der Verlust des HBsAg fiel mit dem Verschwinden von HBV zusammen. Eine Verbesserung der Leberhistologie hielt noch Jahre später in HBsAg-negativen Patienten an. Es könnte demnach vorstellbar sein, dass das fehlende Fortschreiten der Erkrankung in der Verhinderung von Leberkrebs resultiert, wenn eine Behandlung in dem präzirrhotischen Status der Erkrankung bereitgestellt wird. Siehe R. P. Perrillo, Digestive Diseases and Sciences, 38(4), 577–593 (1993).
  • Hepatitis-C ist kürzlich als eine Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis beschrieben worden, die durch den HCV-Virus verursacht wird. Es gibt etwa 100 Millionen HCV-Träger weltweit. Geschätzte 3,5 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten haben chronische Hepatitis C. Die Infektion mit HCV führt zu Leberzirrhose und Leberkrebs mit einer geringen klinischen Manifestation. Die meisten Hepatitis-C-Patienten haben keine bestimmten Symptome und können folglich leicht übersehen werden, bis es für eine Therapie zu spät ist. Dies stellt ein potenziell schwerwiegenderes Problem als bei der Hepatitis-B dar. HCV-Träger können ebenfalls zu längerfristigen Reservoiren für den Virus werden und schließlich eine chronische Lebererkrankung entwickeln und auch ein beträchtlich erhöhtes Risiko, Leberzirrhose und Leberkrebs zu entwickeln, aufweisen. Siehe D. S. Chen, Science, 262, 369–370 (1993).
  • Zur Zeit steht keine wirksame Immunisierung zur Verfügung und Hepatitis-C kann nur durch vorbeugende Maßnahmen, wie beispielsweise die Verbesserung der hygienischen und sanitären Bedingungen und das Unterbrechen des Übertragungsweges kontrolliert werden. Zur Zeit besteht die einzig annehmbare Behandlung von chronischer Hepatitis C in Interferon, welches mindestens eine Behandlungsdauer von sechs (6) Monaten erfordert. Die anfängliche Behandlung weist eine klinische Ansprechrate von etwa 50% auf. Die Hälfte von denjenigen, die auf die Behandlung ansprechen, erleidet jedoch einen Rückfall nach der Beendigung der Interferon-Behandlung. Dementsprechend weisen nur etwa 25% der Patienten eine Daueransprechrate („sustained response") auf. Siehe D. S. Chen, J. Formos. Med. Assoc., 95(1), 6–12 (1996) und N. Terrault & T. Wright, New Engl. J. Med., 332(22), 1509–1511 (1995). Weil die Interferon-Therapie eine eingeschränkte Wirksamkeit besitzt und häufig auftretende Nebenwirkungen wird ein wirksameres Regime benötigt.
  • AIDS ist eine tödliche Krankheit, die durch den HIV verursacht wird. Es hat die Welt seit der ersten Beschreibung der Krankheit in 1981 und der Entdeckung seines verursachenden Virus, HIV, in 1983 geplagt. Etwa 13 Millionen Menschen wurden in 1993 weltweit mit HIV infiziert und die Anzahl der Infizierten ist auf etwa 21 Millionen in 1996 gestiegen. Siehe B. Jasny, Science, 260(5112), 1219 (1993) und P. Piot, Science, 272(5270), 1855 (1996). Mehrere Pharmazeutika sind zur Behandlung von dieser verheerenden Krankheit zugelassen, wie beispielsweise Azidovudin (AZT), Didanosin (Dideoxyinosin, ddI), d4T, Zalcitabin (Dideoxycytosin, ddC), Nevirapin, Lamivudin (Epivir, 3TC), Saquinavir (Invirase), Ritonavir (Norvir), Indinavir (Crixivan) und Delavirdin (Rescriptor). Siehe M. I. Johnston & D. F. Hoth, Science, 260(5112), 1286–1293 (1993) und D. D. Richman, Science, 272(5270), 1886–1888 (1996).
  • Alle Pharmaka, die gegenwärtig für die AIDS-Behandlung zugelassen sind, nutzen die Inhibierung des viralen Wachstums und sind Inhibitoren der viralen Reverse Transkriptase oder virale Protease-Inhibitoren. Weitere Protease-Inhibitoren wie beispielsweise Nelfinavir und verbessertes Saquinavir sind in der Entwicklung. Einen AIDS-Impfstoff („Salk-Vaccine") ist getestet worden und bei verschiedenen Proteinen, welches Chemokine von CD8 sind, ist entdeckt worden, dass sie eine Wirkung als HIV-Suppressoren besitzen.
  • Zusätzlich zu den vorangehenden synthetischen Nukleosidanaloga, Proteinen und Antikörpern, ist für verschiedene Pflanzen und Substanzen, die aus Pflanzen erhalten wurden, eine in vitro Anti-HIV-Aktivität gefunden worden, wie beispielsweise bei Lonicera japonica und Prunella vulgaris, sowie die Glycyrrhizinsäure aus Glycyrrhiza radix. Siehe R. S. Chang & H. W. Veung, Antiviral Research, 9, 163–175 (1988) und M. Ito, et al., Antiviral Research, 7, 127–137 (1987).
  • Trotz all der zur Verfügung stehenden Pharmazeutika zur Behandlung von HIV, gibt es immer noch keine Heilung von dieser tödlichen Erkrankung. Die HIV-Viren fahren fort zu mutieren und werden resistent gegenüber den bestehenden Arzneimitteln wie Reverse Transkriptase- und Protease-Inhibitoren. Kürzlich wurde für eine Therapie unter Verwendung der Kombination von zwei (2) oder drei (3) Anti-HIV-Arzneimitteln gefunden, dass sie wirkungsvoll ist, die HIV-Virusbelastung in AIDS-Patienten signifikant zu erniedrigen. Diese Ergebnisse sind vielversprechend gewesen. Der Virus fährt jedoch fort, eine Resistenz gegenüber den Arzneimitteln zu entwickeln und der Langzeitverlauf (Überlebens- und Heilungs-Raten) ist immer noch unbekannt. Dementsprechend fahren die medizinischen Gemeinschaften überall auf der ganzen Welt fort, nach Arzneistoffen zu suchen, die die HIV-Infektionen verhindern können, zur Behandlung der HIV-Träger, um ein Fortschreiten der Krankheit zum ausgewachsenen tödlichen AIDS zu verhindern und zur Behandlung der AIDS-Patienten.
  • NATURHEILMITTEL
  • Die Verwendung von Pflanzenarzneistoffen und Volksmedizin ist seit Tausenden von Jahren in China bekannt gewesen. Diese pflanzliche Näherungsweise zur Behandlung von zahllosen Krankheiten, von Arthritis bis zu viralen Infektionen, ist bis vor Kurzem von der westlichen Medizin als unwirksam und gefährlich angesehen worden. Während des 19. Jahrhunderts wurden viele häusliche Heilmittel, die Pflanzen enthielten, patentiert und verkauft. Moderne Arzneimittel haben diese Heilmittel ersetzt, aber viele moderne Arzneimittel enthalten Bestandteile, die von Pflanzen abstammen. Beispielsweise machte in 1776 der englische Botaniker und Mediziner William Withering die Erfahrung, dass Kräutertee, der von einer alten Farmersfrau zubereitet wurde, wirksam zur Heilung von Wassersucht, oder gegen überschüssiges Wasser in den Geweben eingesetzt werden konnte, was durch die Unfähigkeit des Herzens, kräftig genug zu pumpen, verursacht wurde. Er fand heraus, dass ein Bestandteil von dem Tee, der aus den Blättern der Fingerhut-Pflanze gemacht wurde, die Pumpaktivität des Herzens kräftigte. Das Arzneimittel, das aus der Fingerhut-Pflanze hergestellt wurde, ist jetzt als Digitalis bekannt.
  • Volksmedizin ist ein relativ moderner Begriff für den Westen und hat die Bedeutung der Fürsorge und Behandlung von den Kranken durch eine Vielzahl von Naturheilmitteln. In den letzten Jahren hat das Interesse an der Volksmedizin bei vielen Menschen in der westlichen wissenschaftlichen Gemeinschaft ständig zugenommen.
  • STAND DER TECHNIK – NATURHEILMITTEL
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als HERBA AEGINETIAE ist traditionell verwendet worden, um Krankheiten wie beispielsweise einen geschwollenen und schmerzenden Hals, Harnwegsinfektionen, Osteomyelitis, Eiterbeulen, Mandelentzündung, Struma, Rachenentzündung, Schilddrüsenentzündung, Darmentzündung, Leberkrankheiten, Krebs, Rheumatismus, Bluterbrechen, Nervenschwäche, Augenrötung, Hämorrhoiden, Menstruations-Unregelmäßigkeiten, Wassersucht, Gelbsucht, Leistenbruch, Schlangenbiss und kindliche Entwicklungsverzögerungen. HERBA AEGINETIAE wird aus der ganzen getrockneten Pflanze Aeginetia indica hergestellt, welche zur Familie der Orobanchaceae gehört. Die Behandlungsdosis bei Verwendung der getrockneten Pflanze beträgt von 4 bis 150 g pro Tag. Es sollte beachtete werden, dass die Pflanze bitter schmeckt und toxisch ist.
  • Okubo et al. Offenbaren, dass ein Extrakt in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)(pH 7,2 bei Umgebungstemperatur bis 4°C) aus den Samen von Aeginetia indica eine ausgezeichnete krebshemmende Wirkung aufweist und eine Interleukin-2- und Interferon-γ-induzierende Potenz besitzt. Die PBS-Lösung war eine 0,1 M phosphatgepufferte physiologische Salzlösung bei pH 7,2, die keine Calcium- oder Magnesiumionen enthält. Die extrahierte Substanz wurde als ein makromolekulares Polysaccharid erkannt, das eine Lipid A-Bindung mit Protein enthalten kann oder nicht, abhängig davon, ob die extraktion unter Verwendung von Butanol oder Phenol durchgeführt wurde. Die extrahierte Substanz war in Wasser löslich und unlöslich in n-Butanol. Ihr Molekulargewicht lag innerhalb des Bereiches von 100.000 bis 200.000 Dalton. Siehe S. Okubo, M. Sato, & K. Himeno, US-Patentschrift Nr. 5366725 , ausgestellt am 22. November 1994.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS, ist traditionell verwendet worden, um zahlreiche Krankheiten zu behandeln wie beispielsweise Fieber, Geschwüre, Wundrose, geschwollenen und schmerzenden Hals, Kopfschmerzen, Gelbsucht, Pest, Leukorrhö und Syphilis. RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS wird aus dem getrockneten Rhizom und der Wurzel von Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica, oder Polygonum tinctorium hergestellt. Es ist berichtet worden, dass dieses Naturheilmittel in vitro den Grippevirus gehemmt hat. Ein Absud aus der in Wasser gekochten Wurzel von Isatis tinctoria hat ebenfalls antibakterielle Eigenschaften gezeigt. Baphicacanthes cusia und Strobilanthes cusia gehören zur Familie der Acanthaceae. Isatis tinctoria und Isatis indigotica gehören zur Familie der Cruciferae. Polygonum tinctorium gehört zur Familie der Polygonaceae. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 10 bis 19 g pro Tag für RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS.
  • Ho et al. offenbaren die Verwendung von einem Extrakt aus einer Mischung von Kräutern einschließlich Isatis tinctoria für die in vitro-Inhibierung der HIV-Infektion in menschlichen T-Lymphozytenzellen und mononuklearen phagozytierenden Zelllinien. Die Aktivität basierte auf den Untersuchungsergebnissen von einem wässrigen Extrakt aus einer Mischung von drei Kräutern: Isatis tinctoria (oder Isatis indigotica), Lonicera japonica und Polygonum bistorta. Siehe D. D. Ho & X. S. Li, US-Patentschrift Nr. 5178865 , erteilt am 12. Januar, 1993.
  • Eine Verbindung, bekannt als Tryptanthrin, ist als das prinzipiell antimykotisch wirkende Mittel in den Blättern von Strobilanthes cusia identifiziert worden und als die hauptsächlich gegen Dermatophyten wirksame Substanz in den Blättern von Polygonum tinctorium und Isatis tinctoria. Siehe H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Band 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 758–759 (1985).
  • Das chinesische Naturheilmittel, bekannt als RHIZOMA BLECHNI, welches ebenfalls als RHIZOMA DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE bekannt ist, ist traditionell verwendet worden, um Krankheiten wie beispielsweise Schnittverletzungen, Schwellungen, Fieber, Masern und Wundrose zu behandeln. RHIZOMA BLECHNI wird aus der getrockneten Wurzel von Blechnum orientale hergestellt, welches zur Familie der Polypodiaceae oder Blechnaceae gehört. RHIZOMA DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE wird aus der getrockneten Wurzel und dem Stängel von Dryopteris crassirhizoma hergestellt, welches zur Familie der Aspidiaceae gehört. Osmunda japonica (Familie der Osmundaceae), Woodwardia orientalis und Woodwardia unigemmata (Familie der Blechnaceae), Athyrium acrostichoides (Familie der Aspidiaceae oder Athyriaceae), Sphaeropteris lepifera (Familie der Cyatheaceae), Cyrtomium falcatum, und Cyrtomium fortunei (Familie der Aspidiaceae) sind ebenfalls für die Herstellung von diesen Naturheilmitteln verwendet worden. Diese Naturheilmittel schmecken bitter und zusammenziehend und sind leicht toxisch. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 4 bis 11 g pro Tag.
  • Blechnum orientale hat ebenfalls eine starke inhibitorische Wirkung gegenüber dem Influenza-Virus gezeigt. Filmaron, Filicin, Aspidin, Albaspidin und Filicisäure, die in Dryopteris crassirhizoma gefunden worden sind, sind durch eine anthelmintische Wirkung gekennzeichnet. Siehe H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen, & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, R. O. C., 577–578 (1985); und H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 249–250 (1982).
  • Hozumi et al. offenbaren das Rhizom von Dryopteris crassirhizoma als ein Anti-Herpesviren-Mittel, ein Anti-Polioviren-Mittel und ein Anti-Varizella-Zoster-Virenmittel. Das Rhizom von Cyrtomium fortunei und das Rhizom von Woodwardia orientalis sind ebenfalls als Mittel gegen Herpesviren, Polioviren, Masernviren, Varizelle-Zoster-Viren und Cytomegaloviren (CMV), sowie als Anti-DNA- und Anti-RNA-Virus-Mittel offengelegt. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai, 1995.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als TUBER BLETILLAE, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Bluthusten, Nasenbluten, Bluterbrechen, Geschwüre, Verbrennungen, trockene und aufgerissene Haut, Tuberkulose, Magengeschwüre und schmerzhafte Stellen zu behandeln. TUBER BLETILLAE weist adstringierende, antibakterielle und antimykotische Eigenschaften auf. TUBER BLETILLAE wird aus der getrockneten Wurzelknolle von Bletilla striata hergestellt, welche zur Familie der Orchidaceae gehört. TUBER BLETILLAE schmeckt bittersüß, adstringierend und ist nicht toxisch. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 2 bis 11 g pro Tag für einen Durchschnittsmenschen.
  • Die chinesischen Naturheilmittel, bekannt als RHIZOMA ET RADIX CIRSII und RADIX BREEAE, sind traditionell zu Behandlungen von Erkrankungen wie Bluterbrechen, akute infektiöse Hepatitis, Blutungen von Schnittwunden, schmerzende Stellen und Geschwüre eingesetzt worden. RHIZOMA ET RADIX CIRSII wird aus dem getrockneten Rhizom oder der Wurzel oder der ganzen Pflanze von Pflanzen wie Cirsium japonicum, Cirsium albescens und Cirsium japonicum rar. australe hergestellt, welche zu der Compositae-Familie gehören. RADIX BREEAE wird aus der getrockneten Wurzel von Pflanzen der Compositae-Familie wie beispielsweise Breea segetum (ebenfalls bekannt als Cephalanoplos segetum) und Breea setosum hergestellt. Diese beiden Naturheilmittel schmecken süß und leicht bitter und sind nicht toxisch. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 5 bis 75 g pro Tag für einen Durchschnittsmenschen.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als DICHONDRAE HERBA, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Gelbsucht, Durchfall, Gonorrhö, Wassersucht, geschwollene Furunkel, Krämpfe, Gehirnentzündung, Rheumatismus, Hernien, Diabetes mellitus und hohen Blutdruck zu behandeln. DICHONDRAE HERBA wird aus der ganzen getrockneten Pflanze Dichondra repens oder Dichondra micrantha hergestellt, welche zur Familie der Convolvulaceae gehört. Die Pflanze schmeckt bitter und ist ungiftig. Die Behandlungsdosis bei Verwendung der getrockneten Pflanze beträgt typischerweise 10 bis 40 g pro Tag. Neun (9) Verbindungen, die aus n-Hexan- und Ethanol-Extrakten der ganzen Pflanze von Dichondra micrantha isoliert wurden, sind identifiziert worden. Diese Verbindungen sind Maltol, Umbelliferon, Scopoletin, Umbelliferon-7-O-glucopyranosid, Scopolin, Astragalin, Isoquercitrin, Kaempferol-3-O-rutinosid und Quercetin-3-O-rutinosid. Siehe C.-J. Chou, L.-C. Lin, S.-Y. Hsu und C.-F. Chen, J. Chin. Med., 4(2), 143–149 (1993).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als FRUCTUS FORSYTHIAE, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise schmerzende Stellen, Geschwüre, Lymphknotenschwellung, Harnröhrenentzündung und Bluthochdruck zu behandeln. Für dieses Naturheilmittel wurde ebenfalls gefunden, dass es verschiedene Bakterien und den Influenza-Virus inhibiert. FRUCTUS FORSYTHIAE wird aus der getrockneten reifen Frucht von Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, oder Forsythia koreana hergestellt, die zur Familie der Oleaceae gehören. Das Naturheilmittel schmeckt bitter und ist ungiftig. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 3 bis 11 g pro Tag.
  • Hozumi et al. offenbaren, dass die Frucht von Forsythia suspensa ein Anti-Poliovirus-Mittel und ein Anti-Masemvirus-Mittel ist, das in der Behandlung dieser viralen Infektionen nützlich ist. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai, 1995.
  • Für die Verbindungen Forsythosid A (gefunden in den Blättern von Forsythia suspensa), Forsythosid B (gefunden in dem Stängel von Forsythia koreana) und Forsythosid C und Forsythosid D (gefunden in der Frucht von Forsythia suspensa) ist berichtet worden, dass sie eine antibakterielle Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus bei einer Konzentration von weniger als 2 nM aufweisen. Für Suspensasid (gefunden in der Frucht von Forsythia suspensa, wahrscheinlich das gleiche wie Forsythosid C) ist ebenfalls berichtet worden, dass es eine antibakterielle Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus Terashima bei einer minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) von 2,6 mg/mL aufweist. Siehe H. Y. Hsu, T. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Band 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 53–55, 142–143 (1985).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als HEDYOTIS (ebenfalls bekannt als HERBA OLDENLANDIAE), ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Harnleiterentzündungen, Rachenkatarrh, Kehlkopfentzündung, Mandelentzündung, subakute oder chronische Kokzygodynie, Blinddarmentzündung, Darmkrebs, Quetschverletzungen und Augenerkrankungen zu behandeln. Es ist ebenfalls gefunden worden, dass es in vitro eine schwache antibakterielle Aktivität aufweist. HEDYOTIS wird aus der ganzen getrockneten Pflanze von Hedyotis diffusa (ebenfalls bekannt als Oldenlandia diffusa), welche zu der Familie der Rubiaceae gehört, hergestellt. Das Naturheilmittel schmeckt süß und ist ungiftig. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 19 bis 300 g pro Tag.
  • Die chinesischen Naturheilmittel, bekannt als HERBA LESPEDEZAE und HERBA SENECINIS, sind traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Harninkontinenz, Gonorrhö, Asthma, Magenschmerzen, allgemeine Schwächung und Ermattung, Durchfall, Quetschverletzungen, Augenerkrankungen, Augenrötungen, Nierenkrankheiten, akute entzündliche Erkrankungen, Katarakt, Ruhr, Darmentzündung, Gelbsucht, Grippe, Blutvergiftung, schmerzende Stellen, Schwellungen und eine Form der Erkrankung der Handfläche zu behandeln. HERBA LESPEDEZAE wird aus der ganzen getrockneten Pflanze von Lespedeza cuneata hergestellt, welche zur Familie der Leguminosae gehört. HERBA SENECINIS wird aus der ganzen getrockneten Pflanze von Senecio scandens hergestellt, welche zur Familie der Compositae gehört. Für die Extrakte aus Lespedeza cuneata und Senecio scandens ist eine antibakterielle Wirkung gezeigt worden. Beide Pflanzen schmecken sauer, adstringierend und bitter. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 4 bis 40 g pro Tag.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als FRUCTUS LIGUSTRI ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Schlaflosigkeit, Darmträgheit, frühes Ergrauen der Haare, Halslymphknotentuberkulose und Wassersucht zu behandeln. FRUCTUS LIGUSTRI wird aus der getrockneten reifen Frucht von Ligustrum lucidum oder Ligustrum japonicum hergestellt, die zur Familie der Oleaceae gehören. Die Blätter von Ligustrum lucidum sind als fiebersenkendes, schmerzlinderndes und entzündungshemmendes Mittel verwendet worden. Die Blätter von Ligustrum japonicum sind ebenfalls verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Augenneuralgie, ulzerierende Stomatitis, Brustentzündung, Schwellungen und Verbrennungen zu behandeln. Die Früchte von Ligustrum lucidum schmecken bitter und sind ungiftig. Die Behandlungsdosis bei Verwendung der getrockneten Früchte beträgt typischerweise 6 bis 20 g pro Tag. Diejenige bei Verwendung der getrockneten Blätter beträgt typischerweise 40 bis 75 g pro Tag.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als FLOS LONICERAE, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Fieber, akute Infektionskrankheiten, Masern, Karbunkel, Ruhr, Darmentzündung, Flechtengrind und ähnliche Hautkrankheiten zu behandeln. FLOS LONICERAE wird aus der getrockneten Blütenknospe von Lonicera japonica oder Lonicera confusa hergestellt. Beide Pflanzen gehören zu der Familie der Caprifoliaceae. Die Blüte von Lonicera japonica weist antidiuretiusche, fiebersenkende, entzündungshemmende, krampflösende, antibakterielle und antivirale Eigenschaften auf. Die Blütenknospe ist ebenfalls als ein Diuretikum verwendet worden. Das Naturheilmittel schmeckt süß und ist ungiftig. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 11 bis 75 g pro Tag für einen Durchschnittsmenschen.
  • Ho et al. offenbaren die in vitro Anti-HIV-Aktivität von einer Mischung aus Lonicera japonica, Isatis tinctoria (oder Isatis indigotica) und Polygonum bistorta oder einer Mischung aus Lonicera japonica mit Scutellarta baicalensis. Wässrige Extraktionen von den Mischungen, Behandlung mit Ethanolfällung und Aktivkohleadsorption sind für die Herstellung von der Anti-HIV-Zusammensetzung offengelegt. Siehe D. D. Ho & X. S. Li, US-Patentschrift Nr. 5178865 , erteilt am 12. Januar, 1993. Von verschiedenen Tanninen, wie beispielsweise, Caffeoylquinate, die aus Lonicera japonica isoliert wurden, ist berichtet worden, dass sie eine hemmende Wirkung auf die HIV-1 Reverse Transkriptase-Aktivität aufweisen. Siehe C.-W. Chang, M.-T. Lin, S.-S. Lee, K. C. S. C. Liu, F.-L. Hsu, & J.-Y. Lin, Antiviral Research, 27, 367–374 (1995).
  • Für eine Mischung von wässrigen Extrakten aus Lonicera japonica Blütenknospen und Forsythia suspensa Früchten mit den ungereinigten Flavonoiden aus Scutellaria baicalensis ist gezeigt worden, dass sie antibakterielle und antivirale Eigenschaften besitzt. Eine Gruppe von Patienten mit schweren Atemwegserkrankungen wurde mit der Mischung behandelt und sie sprachen genau so gut an, wie eine Gruppe mit einer Standard-Antibiotika-Therapie. Siehe P. J. Houghton, Z. Boxu, & Z. Xisheng, Phytother. Res., 7, 384–386 (1993).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als CORTEX PHELLODENDRI, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Ruhr, Durchfall, Gelbsucht, Blut im Stuhl, Bauchschmerzen, Verdauungsstörungen, bakterielle Darmentzündung und tuberkulöse Diarrhoe zu behandeln. Das Naturheilmittel ist ebenfalls zur Herstellung einer Augenspülung, zur Stärkung von Magen und Darm bei Appetitlosigkeit und als ein adstringierendes, entzündungshemmendes Mittel usw. Es weist antibakterielle, entzündungshemmende und wundheilende Eigenschaften auf. CORTEX PHELLODENDRI wird aus der getrockneten Rinde der Pflanzen aus der Rutaceae-Familie wie beispielsweise Phellodendron amurense, Phellodendron chinense, Phellodendron amurense rar. sachalinense, und Phellodendron wilsonii hergestellt. CORTEX PHELLODENDRI schmeckt bitter und ist ungiftig. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 1 bis 11 g pro Tag.
  • Hozumi et al. offenbaren, dass die Rinde von Phellodendron amurense als Mittel gegen Herpesviren, Polioviren, Masemviren, Varizelle-Zoster-Viren und Cytomegaloviren (CMV) wirkt, sowie als ein Anti-DNA- und Anti-RNA-Virus-Mittel. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai, 1995.
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Ruhr, Menorrhagie, Dysmenorrhö, Harnzwang, frühkindliche Wachstumshemmung und Blinddarmentzündung zu behandeln. RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI wird aus dem getrockneten Rhizom von Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum, oder Polygonum reynoutria (ebenfalls als Reynoutria japonica bekannt) hergestellt, welches zu der Familie der Polygonaceae gehört. Die jungen Blätter sind ebenfalls zur Behandlung von Quetsch- und Schnittverletzungen verwendet worden. Der Extrakt von dem pflanzlichen Arzneimittel wies antibakterielle und antivirale Wirkungen in vitro auf. Die übermäßige Anwendung von dem Naturheilmittel kann zu einem leichten Durchfall führen. Das pflanzliche Arzneimittel schmeckt bitter und die Behandlungsdosis beträgt typischerweise 6 bis 40 g pro Tag.
  • Hozumi et al. offenbaren das Rhizom von Polygonum cuspidatum als ein Anti-Herpesviren-Mittel, ein Anti-Polioviren-Mittel, ein Anti-Varizella-Zoster-Virenmittel und ein Anti-CMV-Mittel. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai 1995.
  • Resveratrol ist als eine antimykotische und antibakterielle Komponente am der Wurzel von Polygonum cuspidatum berichtet worden. Siehe H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Band 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 51 (1985).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als SPICA PRUNELLAE ist traditionell verwendet worden, um Krankheiten wie beispielsweise Struma, Hämorrhoiden, geschwollene Augen, Ophthalmalgie, Gonorrhö, Gebärmuttererkrankungen, Brustentzündung, Brustgeschwür, Brustkrebs, chronische Arthritis, Bindehautentzündung und Bluthochdruck zu behandeln. SPICA PRUNELLAE wird aus der getrockneten Fruchtähre oder der ganzen Pflanze von Prunella vulgaris oder Prunella vulgaris subsp. asiatica (ebenfalls bekannt als Prunella vulgaris rar. lilachina) hergestellt. Beide Pflanzen gehören zu der Familie der Labiatae. Die ganze Pflanze kann als harntreibendes Mittel verwendet werden und besitzt ebenfalls eine antibakterielle Wirkung in vitro. Das Naturheilmittel schmeckt bitter und ist ungiftig. Die Behandlungsdosen liegen typischerweise bei 4 bis 110 g pro Tag für einen Durchschnittsmenschen.
  • Hozumi et al. offenbaren die Fruchtähre von Prunella vulgaris als ein Anti-Herpesvirus-Mittel zur Behandlung von Herpesvirus-Infektionen. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai, 1995. Für den wässrigen Extrakt aus Prunella vulgaris (Sieden von 3 g in 100 mL Wasser für 45 Minuten) ist ebenfalls eine Anti-HIV-Aktivität (Stamm H9/3B) berichtet worden. Der Extrakt wies ebenfalls eine synergistisehe Anti-HIV-Aktivität zusammen mit Zidovudin (AZT) und Didanosin (ddI) auf. Nur eine leichte additive Wirkung wurde für Prunella vulgaris und Zalcitabin (ddC) beobachtet. Siehe J. F. John, R. Kuk, & A. Rosenthal, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol., 94, 481 (1994).
  • Yamasaki et al. untersuchten zweihundertundvier (204) natürliche Arzneimittel, die in Japan allgemein zur Anti-HIV-Aktivität verwendet werden und sie berichteten, dass der Heißwasserextrakt aus Prunella vulgaris (Ähre) eine starke in vitro Anti-HIV-Aktivität mit einem IC100 von 16 μg/mL aufwies. Siehe K. Yamasaki, T. Otke, H. Mori, M. Morimoto, N. Ueba, Y. Kurokawa, K. Shiota, & T. Yuge, Yakugaku Zasshi, 113(11), 818–824 (1993).
  • Yao et al. berichteten, dass der Wasserextrakt aus der gesamten getrockneten Pflanze von Prunella vulgaris in vitro bei der Inhibierung der HIV-1 Replikation mit relativ geringer Zytotoxizität gegenüber den MT-4 Zellen aktiv war. Der Extrakt war ebenfalls in der Inhibierung der Reversen Transkriptase aktiv. Der aktive Faktor wurde gereinigt und als ein Anion mit einem Molekulargewicht von annähernd 10.000 Dalton identifiziert. Diese aktive Komponente kann dieselbe sein wie Prunellin, wie nachfolgend durch Tabba et al. beschrieben. Der gereinigte Extrakt inhibierte die HIV-1 Replikation in der Lymphzelllinie MT-4, in der monozytoiden Zelllinie U937 und in den peripheren Blutmonozyten (PBMC) bei wirksamen Konzentrationen von 6, 30, beziehungsweise 12,5 μg/mL. Die Vorbehandlung der nicht infizierten Zellen mit dem Extrakt vor der Behandlung mit den Viren, verhinderte nicht die HIV-1 Infektion. Allerdings erniedrigte die Vorinkubation von HIV-1 mit dem gereinigten Extrakt dramatisch die Ansteckungsfühigkeit. Der gereinigte Extrakt war ebenfalls in der Lage, die Zell-zu-Zell-Übertragung von HIV-1 zu blockieren, verhinderte die Syncytium-Bildung und interferierte mit der Befähigung sowohl von HIV-1 als auch von gp120, an CD4 zu binden. Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-Analyse bestätigte die Abwesenheit der proviralen HIV-1 DNA in Zellen, die dem Virus in der Gegenwart von dem Extrakt ausgesetzt waren. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass der gereinigte Extrakt die Infektion mit HIV-1 von empfänglichen Zellen durch Verhinderung der viralen Anlagerung an den CD4-Rezeptor antagonisierte. Siehe X. J. Yao, M. A. Wainberg, & M. A. Parniak, Virology, 187(1), 56–62 (1992).
  • Tabba et al. isolierten und charakterisierten teilweise eine Anti-HIV Komponente, Prunellin, aus den wässrigen Extrakten des getrockneten Blütenstandes von Prunella vulgaris. Prunellin ist ein Kohlehydrat mit einem MHK (minimale Hemmkonzentration) von 2,2 μg/mL gegen HIV-1 in vitro. Es wurde als ein teilweise sulfatiertes Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von annähernd 10.000 Dalton identifiziert. Siehe H. D. Tabba, R. S. Chang, & K. M Smith, Antiviral Research, 11, 263–273 (1989).
  • Zheng untersuchte vierhundertzweiundsiebzig (472) traditionelle Naturheilmittel auf antivirale Wirkung auf den Typ-1 Herpes-Simplex-Virus (HSV1). Prunella vulgaris wurde als eines von ten Kräutern gefunden, die äußerst wirksam in vitro waren. Klinisch wurden 78 Fälle mit herpetischer Keratitis, die auf HSV1 zurückzuführen war, mit Prunella vulgaris und Pyrrosia lingua Augentropfen behandelt. Unter diesen wurden 38 Fälle wirksam geheilt, in 37 Fällen wurde eine Verbesserung beobachtet und 3 Fälle zeigten keine Besserung. See M. Zheng, J. Tradit. Chin. Med., 8(3), 203–206 (1988).
  • Triterpen-1 und Triterpen-2, die aus Prunella vulgaris isoliert worden sind, zeigten eine antivirale Aktivität gegen HSV1. Triterpen-1 wurde als Betulinsäure und Triterpen-2 als 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-olsäure identifiziert. Der EC50-Wert wurde mit 30 μg/mL für Triterpen-1 und 8 μg/mL für Triterpen-2 durch den Plaque-Reduktionstest ermittelt. See S. Y. Ryu, C-K. Lee, C. O. Lee, H. S. Kim, & O. P. Zee, Arch. Pharmacal Res. (Seoul), 15(3), 242–245 (1992).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Bluterbrechen, Gonorrhö mit Spuren von Blut, schmerzende Stellen, Krebs, Krämpfe, Lungenentzündung, Darmentzündung, Kokzygodynie, Blinddarmentzündung, Asthma, Malaria und Rheumatismus zu behandeln. Es wurde ebenfalls gefunden, dass es eine antibakterielle Wirkung besitzt. HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE wird aus der gesamten getrockneten Pflanze von Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis, oder Scutellaria dependens zubereitet, welche zu der Familie der Labiatae gehören. Das pflanzliche Arzneimittel schmeckt bitter und sollte nicht von Personen mit Anämie eingenommen werden. Schwangere Frauen sollten ebenfalls vermeiden, dieses Kraut einzunehmen. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 4 bis 300 g pro Tag.
  • Ganze getrocknete Pflanzen von Scutellaria rivularis sind in der Volksmedizin zur Behandlung von Tumoren, Hepatitis, Leberzirrhose und anderen Krankheiten in China und Taiwan eingesetzt worden. See Y. L. Lin, Y. H. Kuo, G. H. Lee, und S. M. Peng, J. Chem. Research (S), 320–321 (1987).
  • Für Apigenin, das aus dem ganzen Kraut von Scutellaria rivularis isoliert wurde, wurde gefunden, dass es eine Anti-Influenzavrus-Aktivität aufweist. See T. Nagai, et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), 1329–1332 (1990).
  • Ein chinesisches Naturheilmittel, bekannt als HERBA SOLANI, ist traditionell verwendet worden, um Erkrankungen wie beispielsweise Furunkel, akute Nierenentzündung, Krebs und schmerzende Stellen zu behandeln. HERBA SOLANI wird aus der ganzen getrockneten Pflanze von Solanum nigrum zubereitet, welche zur Familie der Solanaceae gehört. Der Extrakt von HERBA SOLANI hat eine entzündungshemmende Eigenschaft nachweisen können. Die Frucht weist ebenfalls Wirkungen wie Unterdrückung des Hustens und Linderung bei bronchialen Entzündungen auf. Das Naturheilmittel schmeckt bitter und etwas süß und ist ungiftig. Die Behandlungsdosis liegt typischerweise bei 11 bis 60 g pro Tag.
  • Die Verbindung Solasonin (die in dem gesamten Kraut, der Frucht, den Blättern und den frischen, unreifen Beeren von Solanum nigrum gefunden wird) weist eine entzündungshemmende Wirkung ähnlich wie Cortison auf. Solasonin und Solanin (ebenfalls in Solanum nigrum gefunden) besitzt die Fähigkeit zur Erhöhung oder Erniedrigung der Blutzuckerspiegel in Ratten, abhängig von der jeweiligen Situation der Tiere. Von Solasonin ist ebenfalls berichtete worden, dass es einen stimulierenden Effekt auf das Herz besitzt, während Solanin eine unterdrückende Wirkung aufwies. Wenn es mit kleinen Dosen verabreicht wird, erhöht Solasonin die stimulierende Wirkung von dem Zentralnervensystem in Tieren (d. h., in Ratten und Kaninchen). Auf der anderen Seite, verstärkt es den unterdrückenden Prozess, wenn es in großen Dosen verabreicht wird. Solasonin kann ebenfalls die Blutgerinnungsfähigkeit erniedrigen. Siehe (1) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen, & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, R. O. C., 176–177 (1985); (2) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 1400–1401, 1406 (1982); und (3) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, & M. Hong, The Chemical Constituents Of Oriental Herbs, Band 2, Oriental Healing Arts Institute, Los Angeles, California, U.S.A., 742 (1985).
  • Kombinationen der Naturheilmittel wie beispielsweise FLOS LONICERAE, RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS und FRUCTUS FORSYTHIAE sind als fiebersenkende und entgiftende Mittel und zur Behandlung der akuten Hepatitis verwendet worden. Die pflanzlichen Arzneimittel RHIZOMA BLECHNI und RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI sind zusammen mit anderen Naturheilmitteln in einer Formulierung zur Behandlung von Hepatitis-B verwendet worden. Die pflanzlichen Arzneimittel sind gelegentlich zusammen mit anderen Naturheilmitteln zu der obigen Formulierung hinzugefügt worden, um die Behandlung zu verbessern. Das Naturheilmittel FRUCTUS LIGUSTRI wurde gelegentlich zusammen mit anderen pflanzlichen Arzneimitteln hauptsächlich als ein Tonikum verwendet und das Naturheilmittel HEDYOTIS ist gelegentlich zusammen mit anderen pflanzlichen Arzneimitteln als ein Entgiftungsmittel verwendet worden. Das Naturheilmittel SPICA PRUNELLAE ist ebenfalls zusammen mit anderen pflanzlichen Arzneimitteln zur Linderung von übermäßiger Leberbelastung verwendet worden.
  • Chang und Yeung überprüften die Heißwasserextrakte von siebenundzwanzig (27) Heilkräutern aus Anti-HIV-Aktivität. Sie fanden bei elf (11) der Extrakte eine Aktivität in Form von einer Inhibierung von HIV in den H9-Zellen. Lonicera japonica, Prunella vulgaris, Woodwardia unigemmata, und Senecio scandens waren mitten unter denjenigen mit einer moderaten Aktivität. Forsythia suspensa, Isatis tinctoria und Polygonum cuspidatum waren unter denjenigen, die keine Aktivität in dem Anti-HIV-Test aufwiesen. Der Extrakt mit Anti-HIV-Aktivität aus Viola yedoensis wurde weiter untersucht und es wurde gefunden, dass er ziemlich spezifisch war. Der Extrakt inaktivierte HIV nicht extrazellulär und inhibierte auch nicht das Wachstum von Herpes simplex-, Polio- oder vesikulären Stomatitis-Viren in einer humanen Fibroblasten-Kultur. See R. S. Chang & H. W. Yeung, Antiwal Research, 9, 163–175 (1988).
  • Antivirale Mittel sind aus Syzygium aromaticum, Sapium sebiferum, Scutellaria baicalensis und Scutellaria rivularis isoliert worden. Eugeniin (ein Tannin), isoliert von Syzygium aromaticum, und Methylgallat, isoliert von Sapium sebiferum, zeigten in vitro eine Anti-Herpes-Simplex-Aktivität. Für Pflanzen-Flavonoide, wie beispielsweise 5,7,4'-Trihydroxy-8-methoxyflavon aus der Wuzel von Scutellaria baicalensis und Apigenin (5,7,4'-Trihydroxyflavon) aus dem ganzen Kraut Scutellaria rivularis wurde ebenfalls berichtet, dass sie eine Anti-Influenzavirus-Aktivität besitzen. See (1) T. Hozumi, et al., US-Patentschrift Nr. 5411733 (1995); (2) M. Takechi & Y. Tanaka, Planta Medica, 42, 69–74 (1981); (3) C. J. M. Kane, et al, Bioscience Reports, 8, 85–94 (1988); und (4) T. Nagai, et al., Chem. Pharm. Bull., 38(5), 1329–1332 (1990).
  • Hozumi et al. untersuchten einundneunzig (91) pflanzliche Arzneimittel, die eine antivirale Aktivität demonstrierten. Insbesondere wiesen zweiundfünfzig (52) von ihnen eine Anti-Herpesvirus-Aktivität auf, vierundsechzig (64) besaßen eine Anti-Poliovirus-Aktivität, siebenunddreißig (37) zeigten eine Anti-Masemvirus-Aktivität, siebenundzwanzig (27) davon besaßen eine Anti-Varizella-Zoster-Virus-Aktivität, dreiundzwanzig (23) von ihnen wiesen eine Anti-CMV-Aktivität auf und achtundzwanzig (28) davon besaßen eine Anti-DNA-Virus- und eine Anti-RNA-Virus-Aktivität. Siehe T. Hozumi, T. Matsumoto, H. Ooyama, T. Namba, K. Shiraki, M. Hattori, M. Kurokawa, & S. Kadota, US-Patentschrift Nr. 5411733 , erteilt am 2. Mai 1995. Die Anti-DNA-Virus- und eine Anti-RNA-Virus-Aktivität von den achtundzwanzig (28) pflanzlichen Arzneimitteln, die in der 5411733 -Patentschrift offengelegt sind, basierte auf ihren Anti-Herpesvirus-, Anti-Poliovirus-, Anti-Masernvirus- und/oder Anti-Varizella-Zoster-Virus- und Anti-CMV-Aktivitäten. Die Schlussfolgerung, dass sowohl die Anti-DNA-Virus- als auch die Anti-RNA-Virus-Aktivitäten dadurch abgedeckt werden, wird jedoch durch die durchgeführten Experimente nicht begründet.
  • Die Daten der vorliegenden Erfindung, die nachfolgend präsentiert werden, wiesen wenig oder keine Anti-HIV-Aktivität für zwei Naturheilmittel bei 2,5 und 0,5 ng/mL auf, die aus dem Rhizom von Cyrtomium fortunei und der Rinde von Phellodendron amurense erhalten wurden. Im Gegensatz dazu kann für die drei (3) Naturheilmittel, die unter Verwendung der Ähre von Prunella vulgaris, der Frucht von Forsythia suspensa und der Wurzel und dem Rhizom von Polygonum cuspidatum zubereitet wurden, gezeigt werden, dass sie eine starke bis moderate Anti-HIV-Aktivität bei 2,5 μg/mL aufweisen. Für Prunella vulgaris ist ebenfalls von anderen wie oben beschrieben, berichtet worden, dass es eine sehr gute Anti-HIV-Aktivität besitzt.
  • Es ist anzumerken, dass in der praktischen Anwendung der traditionellen chinesischen Medizin die pflanzlichen Arzneimittel verwendet wurden, um die Symptome von dem Patienten, aber nicht die Krankheit oder die eigentliche Ursache zu behandeln und dementsprechend nicht bekannt ist, dass sie für eine bestimmte Erkrankung spezifisch sind. Die Naturheilmittel wurden abhängig von den Symptomen von dem individuellen Patienten verschrieben. Die Zusammensetzung von Naturheilmitteln variiert ebenfalls von Fall zu Fall und kann sich sogar für jeden individuellen Patienten während des Verlaufs der Behandlung entsprechend dem einzelnen Behandlungsergebnis ändern. Es ist dementsprechend sehr schwierig, eine bestimmte Kräuterzusammensetzung nach dem Stand der Technik zu verschreiben, die zur Behandlung einer spezifischen Krankheit geeignet ist.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Entdeckung von antiviralen Kräuterzusammensetzungen, die Extrakte daraus und die aktiven chemischen Bestandteile davon gerichtet. Die antiviralen Kräuterzusammensetzungen dieser Erfindung sind aus einzelnen Kräutern, Kräutermischungen und handelsüblich erhältlichen chinesischen Naturheilmitteln abgeleitet. Die Aktivität dieser neuartigen Kräuterzusammensetzungen und ihrer Extrakte und/oder aktiven Grundbestandteile gegen virale Krankheiten wie beispielsweise bei HBV- und HCV-Trägern, Hepatitis-B, Hepatitis-C, HIV-Infektion und AIDS wird hierin demonstriert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Um Fachleute mit den Prinzipien der Erfindung vertraut zu machen, wird auf die angehängten Zeichnungen verwiesen, die ein Teil dieser Spezifikation bilden.
  • 1 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von Nr. 5(5)E-A-AP1X, der einmalig gereinigten, mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5)E-A in Säureform, wobei Nr. 5(5)E-A die Wasser-Eluatfraktion der C18-SPE-LC Chromatographie von Nr. 5(5) ist.
  • 2 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von Nr. 5(5)E-C-AP der mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5)E-C in Säureform, wobei Nr. 5(5)E-C die 1% HCl/Wasser-Eluatfraktion der C18-SPE-LC Chromatographie von Nr. 5(5) ist.
  • Für diese beiden 1 und 2 wurde als Säule für die HPSEC-(Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie) Analyse eine Varian MicroPak TSKgel-G3000 PWXL-Säule (7,8 mm ID × 30 cm L), in Serie geschaltet mit einer TSK PWXL-Vorsäule (Guard-Column)(6.0 mm ID × 4.0 cm L) verwendet, wobei als mobile Phase 0,1 N NH4HCO3 bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min benutzt wurde, die Proben wurden in der mobilen Phase bei 0,92 bis 0,93 mg/mL zubereitet und das Injektionsvolumen betrug 100 μL.
  • 3A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 3B zeigt das RI-Profil von Nr. 5(5)E-A-AP1X. Die gesammelten HPSEC-Fraktionen sind als 6–18 und 7–12 gezeigt.
  • 4A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 4B zeigt das RI-Profil von Nr. 5(5)E-C-AP. Die gesammelten HPSEC-Fraktionen sind als 6–18 und 7–12 gezeigt.
  • Die HPSEC-Bedingungen für die 3A, 3B, 4A und 4B waren identisch zu denen von 1 und 2 oben, außer dass die Probenkonzentrationen 6,1 bis 6,2 mg/mL betrug.
  • 5A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 5B zeigt das RI-Profil von der chromatographisch gereinigten HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP. Die HPSEC-Bedingungen waren identisch zu denen von 1 und 2 oben, außer dass die mobile Phase 0,2 N NH4HCO3 war und die Probenkonzentration betrug 0,55 mg/mL.
  • 6A zeigt das UV-Profil der C18-HPLC-Chromatographie bei 214 nm von der chromatographisch gereinigten HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP und 6B zeigt das Profil der HPSEC-Fraktion 9 von Nr. 5(5)E-C-AP. Als Säule für die C18-HPLC-(Octadecyl-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) Analyse wurde eine Rainin Microsorb-MV C18-Säule (5 μm Partikel, 100 Å Porengröße, 4,6 mm ID × 25 cm L) verwendet, die mobile Phase war 0,1 N NH4HCO3, mit 30% Ethanol, bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min, die Probe wurde in der mobilen Phase bei 1,0 mg/mL zubereitet und das Injektionsvolumen betrug 5 μL.
  • 7 zeigt das UV-Profil der 1-IPSEC-Chromatographie bei 214 nm von Nr. 5(5)E-A-AP1X-NH4, der einmalig gereinigten, mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5)E-A in Ammoniumsalzform.
  • Die HPSEC-Bedingungen für diese 7 und für die nachfolgenden 13 und 17 waren dieselben wie diejenigen für 1 und 2 oben, ausgenommen dass als mobile Phase 0,3 N NH4HCO3 mit 30% Acetonitril verwendet wurde, die Proben in 0,3 N NH4HCO3 hergestellt wurden und die Probenkonzentrationen 0,65 mg/mL für 7 und 1,4 mg/mL für die 13 und 17 betrugen.
  • 8 zeigt das UV-Profil der, HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren, mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5) in Ammoniumsalzform.
  • Die HPSEC-Bedingungen für diese 8 und für die nachfolgenden 14, 18, 21, 24 und 27 waren dieselben wie diejenigen für 1 und 2 oben, ausgenommen dass die Probenkonzentrationen 1,0 mg/mL betrugen und das Injektionsvolumen 50 μL.
  • 9 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren, mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5) in Ammoniumsalzform.
  • Für diese 9 und für die nachfolgenden 15, 19, 22, 25 und 28 wurde als Säule für die RP-HPLC-(Reversed-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) Analyse eine PerSeptive Biosystems' PORÖS R2/H-Säule (4,6 mm ID × 10 cm L) verwendet, als mobile Phase 0,1 N Ammoniumbicarbonat mit variierenden Konzentrationen von 2% bis 60% gemäß dem Gradienten in Tabelle 17 bei einer Flussgeschwindigkeit von 2,0 mL/min, die Proben wurden in 0,1 N Ammoniumbicarbonat, das 2% Ethanol enthielt, zubereitet und das Injektionsvolumen betrug 20 μL.
  • 10A zeigt das UV-Spektrum von Nr. 5(5)E-AP6X, 10B zeigt das UV-Spektrum von GE-AP6X und 10C zeigt das UV-Spektrum von HE-AP6X. Die UV-Spektren der Proben wurden in Ammoniumbicarbonat-Lösung gemessen. Es wurden keine Korrekturen für den Lösemittelblindwert durchgeführt.
  • 11 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 5(5)E-AP6X, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5) in Säureform.
  • 12 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Saure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5) in Ammoniumsalzform.
  • Für die 11 und 12 und für die nachfolgenden 16, 20, 23, 26 und 29 wurde das IR-Spektrum von jeder Probe in einem KBr-Pressling gemessen.
  • 13 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von GE-AP, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von G in Säureform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur und für die 17 waren dieselben wie diejenigen für 7 oben, ausgenommen dass die Probenkonzentration 1,4 mg/mL betrug.
  • 14 zeigt das UV-Profil der 1-IPSEC-Chromatographie von GE-AP2X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von G in Ammoniumsalzform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 8 oben.
  • 15 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von GE-AP2X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von G in Ammoniumsalzform. Die Bedingungen der RP-HPLC-Gradientenchromatographie für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 9 oben.
  • 16 zeigt das IR-Spektrum von GE-AP2X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von G in Ammoniumsalzform.
  • 17 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von HE-AP, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von H in Säureform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 13 oben.
  • 18 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von HE-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von H in Ammoniumsalzform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 8 oben.
  • 19 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von HE-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von H in Ammoniumsalzform. Die Bedingungen der RP-1-HPLC-Gradientenchromatographie für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 9 oben.
  • 20 zeigt das IR-Spektrum von HE-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von H in Ammoniumsaizform.
  • 21 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren, mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(8) in Ammoniumsalzform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 8 oben.
  • 22 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren, mit Satire ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(8) in Ammoniumsalzform. Die Bedingungen der RP-HPLC-Gradientenchromatographie für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 9 oben.
  • 23 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(8) in Ammoniumsalzform.
  • 24 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(11) in Ammoniumsalzform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 8 oben.
  • 25 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(11) in Ammoniumsalzform. Die Bedingungen der RP-HPLC-Gradientenchromatographie für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 9 oben.
  • 26 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Saüre ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(11) in Ammoniumsalzform.
  • 27 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 4(2) in Ammoniumsalzform. Die HPSEC-Bedingungen für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 8 oben.
  • 28 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 4(2) in Ammoniumsalzform. Die Bedingungen der RP-HPLC-Gradientenchromatographie für diese Figur waren dieselben wie diejenigen für 9 oben.
  • 29 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4, der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 4(2) in Ammoniumsalzform.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf die Stoffzusammensetzungen gerichtet, welche die wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren Anti-HIV aktiven Komponenten aus verschiedenen chinesischen Naturheilmitteln oder Arzneipflanzen umfassen, wie sie charakterisiert sind durch die HPSEC-Profile der 1, 2, 5A, 5B, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 21, 24 und 27; die C18-HPLC-Profile von den 6A und 6B, den RP-HPLC-Gradienten-Profilen der 15, 19, 22, 25 und 28; den UV-Spektren von den 10A, 10B und 10C sowie den IR-Spektren von den 11, 12, 16, 20, 23, 26 und 29.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Wie hierin verwendet, wird die folgende Nomenklatur angewendet werden, um die vier (4) Kräutermischungen, die als HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 und HHT888-54 bekannt sind, zu identifizieren.
  • HHT888-4, das nicht innerhalb des Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung liegt, ist eine Mischung aus fünf (5) chinesischen Einzelkraut-Naturheilmitteln bei einem bevorzugten Verhältnis von Nr. 4(1):Nr. 4(2):Nr. 4(3):Nr. 4(4):Nr. 4(5) von etwa 3:3:3:3:4 (w/w). Das Gewichtsverhältnis kann bis zu 50% pro Komponente variieren. Mit "Variation des Gewichtsverhältnisses von 50%" ist gemeint, dass jeder Wert von der einzelnen Komponente des Verhältnisses mit 50% erhöht oder erniedrigt sein kann. Demnach kann beispielsweise 1:1 in dem Bereich von 1,5:0,5 bis 0,5:1,5 (oder 3:1 bis 1:3) liegen.
  • HHT888-5 ist eine Mischung aus elf (11) chinesischen Einzelkraut Naturheilmitteln, Nr. 5(1) bis Nr. 5(11), vorzugsweise bei etwa gleichen Gewichtsanteilen. Das Gewichtsverhältnis kann bis zu 50% pro Komponente variieren.
  • HHT888-45 ist eine Mischung aus vier (4) bis sechs (6) chinesischen Einzelkraut-Naturheilmitteln bei einem bevorzugten Gewichtsverhältnis von Nr. 4(3):Nr. 4(4): Nr. 5(4):Nr. 5(5):Nr. 5(8):Nr. 4(2) von etwa 1:1:1:1:0–1:0–1 (w/w). Das Gewichtsverhältnis kann bis zu 50% pro einzelner Komponente variieren.
  • HHT888-54 ist eine Mischung aus Nr. 5(5) oder H und mindestens einem Einzelkraut-Heilmittel, ausgewählt aus Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(7), Nr. 5(8) und Nr. 5(11), wobei das bevorzugte Gewichtsverhältnis von Nr. 5(5) oder H zu jedem von den anderen Einzelkraut-Heilmitteln 1:1 beträgt. Dementsprechend besteht HHT888-54 in einer bevorzugten Ausführungsform aus Nr. 5(5) oder H zuzüglich Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(8) und Nr. 5(11), wobei das bevorzugte Gewichtsverhältnis bei 1:1:1:1:1 liegt. Allgemeiner, das Gewichtsverhältnis von Nr. 5(5) oder H zu der Summe der anderen Einzelkraut-Heilmittel beträgt von 1:10 bis 10:1.
  • Die Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 sind:
    Nr. 4(1) = HEDYOTIS (ebenfalls bekannt als HERBA OLDENLANDIAE)
    Herkunft: Hedyotis diffusa (ebenfalls bekannt als Oldenlandia diffusa)
    Nr. 4(2) = HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE
    Herkunft: Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis, Scutellaria dependens
    Nr. 4(3) = FLOS LONICERAE
    Herkunft: Lonicera japonica, Lonicera confusa
    Nr. 4(4) = SPICA PRUNELLAE
    Herkunft: Prunella vulgaris, Prunella vulgaris subsp. asiatica (ebenfalls bekannt als Prunella vulgaris var. lilachina)
    Nr. 4(5) = HERBA SOLANI
    Herkunft: Solanum nigrum
  • Die Einzelkraut-Komponenten von HHT888-5 sind:
    Nr. 5(1) = HEDYOTIS (ebenfalls bekannt als HERBA OLDENLANDIAE)
    Herkunft: Hedyotis diffusa (ebenfalls bekannt als Oldenlandia diffusa)
    Nr. 5(2) = RHIZOMA BLECHNI oder RHIZOMA DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE
    Herkunft: Blechnum orientale, Dryopteris crassirhizoma, Osmunda japonica, Woodwardia orientalis, Woodwardia unigemmata, Athyrium acrostichoides, Sphaeropteris lepifera, Cyrtomium falcatum, Cyrtomium fortunei
    Nr. 5(3) = RHIZOMA ET RADIX CIRSII und RADIX BREEAE
    Herkunft: Cirsium japonicum, Cirsium albescens, Cirsium japonicum var. australe, Breea segetum (ebenfalls bekannt als Cephalanoplos segetum), Breea setosum
    Nr. 5(4) = HERBA LESPEDEZAE oder HERBA SENECINIS
    Herkunft: Lespedeza cuneata, Senecio scandens
    Nr. 5(5) = HERBA AEGINETIAE
    Herkunft: Aeginetia indica
    Nr. 5(6) = RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS
    Herkunft: Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica, Polygonum tinctorium
    Nr. 5(7) = RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI
    Herkunft: Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum, Polygonum reynoutria (ebenfalls bekannt als Reynoutria japonica)
    Nr. 5(8) = FRUCTUS FORSYTHIAE
    Herkunft: Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana
    Nr. 5(9) = CORTEX PHELLODENDRI
    Herkunft: Phellodendron amurense, Phellodendron chinense, Phellodendron amurense var. sachalinense, Phellodendron wilsonii
    Nr. 5(10) = TUBER BLETILLAE
    Herkunft: Bletilla striata
    Nr. 5(11) = FRUCTUS LIGUSTRI
    Herkunft: Ligustrum lucidum, Ligustrum japonicum
  • Die Einzelkraut-Komponenten von HHT888-45 sind:
    Nr. 4(3) = FLOS LONICERAE
    Herkunft: Lonicera japonica, Lonicera confusa
    Nr. 4(4) = SPICA PRUNELLAE
    Herkunft: Prunella vulgaris, Prunella vulgaris subsp. asiatica (ebenfalls bekannt als Prunella vulgaris var. lilachina)
    Nr. 5(4) = HERBA LESPEDEZAE oder HERBA SENECINIS
    Herkunft: Lespedeza cuneata, Senecio scandens
    Nr. 5(5) = HERBA AEGINETIAE
    Herkunft: Aeginetia indica
    Nr. 4(2) = HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE (wahlweise)
    Herkunft: Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis, Scutellaria dependens
    Nr. 5(8) = FRUCTUS FORSYTHIAE (wahlweise)
    Herkunft: Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana
  • Die Einzelkraut-Komponenten von HHT888-54 sind:
    Nr. 5(5) = HERBA AEGINETIAE
    Herkunft: Aeginetia indica; oder
    H = HERBA DICHONDRAE
    Herkunft: Dichondra repens oder Dichondra micrantha; und mindestens eine ausgewählt aus:
    Nr. 4(2) = HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE
    Herkunft: Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis, Scutellaria dependens
    Nr. 4(3) = FLOS LONICERAE
    Herkunft: Lonicera japonica, Lonicera confusa
    Nr. 4(4) = SPICA PRUNELLAE
    Herkunft: Prunella vulgaris, Prunella vulgaris subsp. asiatica (ebenfalls bekannt als Prunella vulgaris var. lilachina)
    Nr. 4(5) = HERBA SOLANI
    Herkunft: Solanum nigrum
    Nr. 5(1) = HEDYOTIS (ebenfalls bekannt als HERBA OLDENLANDIAE)
    Herkunft: Hedyotis diffusa (ebenfalls bekannt als Oldenlandia diffusa)
    Nr. 5(2) = RHIZOMA BLECHNI oder RHIZOMA DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE
    Herkunft: Blechnum Orientale, Dryopteris crassirhizoma, Osmunda japonica, Woodwardia orientalis, Woodwardia unigemmata, Athyrium acrostichoides, Sphaeropteris lepifera, Cyrtomium falcatum, Cyrtomium fortunei
    Nr. 5(4) = HERBA LESPEDEZAE oder HERBA SENECINIS
    Herkunft: Lespedeza cuneata, Senecio scandens
    Nr. 5(7) = RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI
    Herkunft: Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum, Polygonum reynoutria (ebenfalls bekannt als Reynoutria japonica)
    Nr. 5(8) = FRUCTUS FORSYTHIAE
    Herkunft: Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana
    Nr. 5(11) = FRUCTUS LIGUSTRI
    Herkunft:
  • Es sollte beachtet werden, dass Nr. 4(1) mit Nr. 5(1)(HEDYOTIS) identisch ist. Die Namen von den chinesischen Naturheilmitteln für die Einzelkraut-Komponenten sind in Großbuchstaben dargestellt, gefolgt von den Herkunfts-Pflanzen, die in kursiver Schrift angegeben sind.
  • Wie hierin verwendet, schließen die Bezeichnungen HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 und HHT888-54 die aktuellen Kräutermischungen, die wässrigen Extrakte daraus und die aktiven Komponenten oder Grundbestandteile von dem Extrakt ein. In einer ähnlichen Art und Weise schließen die Bezeichnungen Nr. 5(5), Nr. 5(8) und dergleichen das aktuelle Kraut, die Extrakte daraus und die isolierten aktiven molekularen Anteile ein.
  • Wie ebenfalls in den Spezifikationen und in den Ansprüchen verwendet, steht G für das Kraut Aeginetia indica oder die Herkunftspflanze von Nr. 5(5). Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(3), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(6), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(9), Nr. 5(10), Nr. 5(11) und H stehen für die Einzelkraut-Komponenten, die vorangehend beschrieben wurden, einschließlich ihrer entsprechenden Herkunftspflanzen.
  • Die spezifischen Beschreibungen von den vorangehend aufgezählten chinesischen Naturheilmitteln und Heilpflanzen kann in den folgenden Verweisen gefunden werden: (1) H. C. Chang, Medicinal Herbs I, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 15, 36, 100, 113, 127, 147 (1990); (2) H. C. Chang, Medicinal Herbs 11, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 15, 27, 131, 135, 155 (1991); (3) W. S. Kan, Pharmaceutical Botany, National Research Institute Of Chinese Medicine, Taipei, Taiwan, R. O. C., 113, 124–130, 200–201, 206–207, 289–290, 353–354, 442–444, 460–461, 485, 487–488, 497, 505, 513–514, 522, 527–529, 558, 562–563, 648–649 (1971); (4) M. S. Lee, Frequently Used Chinese Crude Drugs And Folk Medicines Handbook, 12. Ausgabe, Sheng-Chang Medicinal Record Magazine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 4–6, 17, 21, 29, 36, 38, 40, 48, 58, 64, 71, 79, 85 (1992); und (5) H. Y. Hsu, Y. P. Chen, S. G. Hsu, J. S. Hsu, C. J. Chen, & H. C. Chang, Concise Pharmacognosy, New Medicine Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 90, 97, 105–106, 117–118, 126–127, 130–131, 133, 138, 144–145, 152–153, 156–157, 161–162, 174, 176–177, 357–358, 381–382, 384–385, 456-457, 577–578 (1985).
  • In ihrem weitestgehenden Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Zusammensetzungen zur Verwendung in der Behandlung von viralen Infektionen, wie in den angehängten Ansprüchen definiert. Zum Beispiel die mit HHT888-5, HHHT888-45, HHT888-54, Nr. 5(5) – Nr. 4(3), Nr. 5(5) – Nr. 4(4), Nr. 5(5) - Nr. 5(11) bezeichneten Kräutermischungen. Insbesondere sind die viralen Infektionen diejenigen, die durch HBV, HCV und HIV verursacht werden. Die erfindungsgemäßen antiviralen Mischungen sind vorangehend als HHT888-5, HHT888-45 und HHT888-54 beschrieben worden. Zusätzlich ist für die Mittel der Einzelkräuter mit der Bezeichnung Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und H gezeigt worden, dass sie antivirale Aktivität aufweisen. Die antiviralen Aktivitäten dieser Mittel der Einzelkräuter sind nicht durch den Stand der Technik gezeigt worden.
  • Ebenfalls offengelegt sind die Stoffzusammensetzungen, die durch die HPSEC-Analysen charakterisiert sind, welche in den 1 bis 5, 7 und 8 für die aktiven Komponenten von Nr. 5(5) dargelegt sind. In den 13 und 14 sind die aktiven Komponenten von G durch HPSEC charakterisiert, während in den 17 und 18 diejenigen von H charakterisiert sind. In 21 ist die Nr. 5(8) durch HPSEC-Analyse charakterisiert, in 24 die Nr. 5(11), während in 27 die Nr. 4(2) charakterisiert ist.
  • Die C18-HPLC-Gradientenanalyse, die in den 6A und 6B dargestellt ist, charakterisiert die aktiven Komponenten von Nr. 5(5). Die RP-HPLC-Gradientenanalyse, die in 9 dargestellt ist, charakterisiert die aktiven Komponenten von Nr. 5(5), während in 15 die aktiven Komponenten von G, in 19 diejenigen aktiven Komponenten von H, in 22 die aktiven Komponenten von Nr. 5(8), in 25 die aktiven Komponenten von Nr. 5(11) und in 28 die aktiven Komponenten von Nr. 4(2) charakterisiert werden. Die IR-Spektren, die in den 11 und 12 dargestellt sind, charakterisieren die aktiven Komponenten von Nr. 5(5), in 16 werden die aktiven Komponenten von G, in 20 die aktiven Komponenten von H, in 23 die aktiven Komponenten von Nr. 5(8), in 26 die aktiven Komponenten von Nr. 5(11) charakterisiert, während in 29 die aktiven Komponenten von Nr. 4(2) charakterisiert werden.
  • Ein spezifischerer Aspekt der vorliegenden Erfindung befindet sich in der Entdeckung, dass HHT888-5 in der Verringerung von Hepatitis-B-Viren in HBV-Trägern wirksam ist. Ein zusätzlicher erfindungsgemäßer Aspekt liegt in der Entdeckung, dass HHT888-45 in der Behandlung von Hepatitis-C-Patienten wirksam ist und ihre Leberfunktion wieder normalisiert.
  • Für die Kräutermischungen HHT888-4 und HHT888-5 und ihre wässrigen Extrakte konnte durch die Erfinder hierin gezeigt werden, dass beide ebenfalls antivirale Aktivitäten gegen MuLV und HIV in vitro aufweisen. Dieser Nachweis ist eine starke Unterstützung für die Schlussfolgerung, dass sie eine in vivo Wirksamkeit besitzen. Zusätzlich zeigten elf (11) von den fünfzehn (15) Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 und HHT888-5, d. h. Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11), und das Heilkraut H Anti-HIV-Aktivität durch die wirkungsvolle Unterdruckung der viralen Proliferation in mit HIV infizierten menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL). Dieses Modell lässt eine Anti-HIV-Aktivität in vivo äußerst wahrscheinlich sein.
  • Der wässrige Extrakt aus der Einzelkraut-Komponente Nr. 5(5), der unmittelbar aus seiner Herkunftspflanze zubereitet wurde, wies eine gute Anti-HIV-Aktivität auf. Ferner haben die wässrigen Extrakte aus den Einzelkraut-Komponenten Nr. 4(3), Nr. 4(4) und Nr. 5(11) starke bis moderate Anti-HIV-Aktivitäten gezeigt. Die wässrigen Extrakte aus den Einzelkraut-Komponenten Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4) und Nr. 5(8) nur schwache Anti-HIV-Aktivitäten gezeigt.
  • Für die mit Wasser extrahierbaren und mit Säure ausfällbaren Komponenten von Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8) und H wird hierin gezeigt, dass sie aktive Anti-HIV-Mittel sind. Ähnliche mit Wasser extrahierbare und mit Säure ausfällbaren Komponenten sind ebenfalls aus Nr. 4(4) und Nr. 5(11) isoliert worden und ihre Anti-HIV-Aktivität wird hierin gezeigt. Diese mit Wasser extrahierbaren und mit Säure ausfällbaren Anti-HIV-aktiven Komponenten sind ähnlich, sind noch nie zuvor beschrieben worden und sind neuartig und nicht offensichtlich.
  • Mit Wasser extrahierbare und mit Säure ausfällbare Anti-HIV-aktive Komponenten sind ebenfalls aus Nr. 4(4) und Nr. 5(11) isoliert worden. Die mit Wasser extrahierbare und mit Säure ausfällbare Komponente von Nr. 5(11) ist zuvor nicht beschrieben worden und somit neuartig. Die mit Wasser extrahierbare und mit Same ausfällbare Komponente von Nr. 4(4) kann identisch zu dem teilweise sulfatierten Polysaccharid oder Prunellin sein, die vorangehend beschrieben wurden. Nur eine aktive Komponente ist aus dem wässrigen Extrakt von Nr. 4(3) isoliert worden, die in Säure löslich ist.
  • Als eine Stoffzusammensetzung sind ferner die Kräutermischungen HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45 und HHT888-54 offenbart. Diese Stoffzusammensetzungen sind zuvor nicht beschrieben worden und sie sind nicht offensichtlich.
  • Ferner ist eine Stoffzusammensetzung offenbart, die mindestens eine von den individuellen, mit Wasser extrahierbaren und mit Säure ausfällbaren Anti-HIV-aktiven Komponenten enthält, die getrennt oder in Kombination aus den Naturheilmitteln der Einzelkräuter oder ihren Herkunftspflanzen isoliert wurden, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Nr. 4(2), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11) and H. Diese Stoffzusammensetzungen sind bisher nicht beschrieben worden und sie sind nicht offensichtlich und sie sind neuartig.
  • Die Nützlichkeit der vorliegenden Stoffzusammensetzungen liegt in ihrer Anwendung bei der Behandlung von viralen Infektionen. Jedes offenbartes Verfahren der Behandlung als solches ist jedoch spezifisch vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen. Ferner ist ein Verfahren zur Behandlung von viralen Infektionen in einem Säugetier offenbart, wobei das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von mindestens einer Zusammensetzung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und H sowie ihren entsprechenden Extrakten oder aktiven Grundbestandteilen, an das Säugetier umfasst.
  • Insbesondere ist ein Verfahren offenbart zur Verringerung der Virusbelastung von Menschen, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, bestehend aus HHT888-5 oder einem Extrakt, der aus HHT888-5 erhalten wurde, an den Menschen umfasst.
  • Des weiteren ist ebenfalls ein Verfahren offenbart zur Behandlung von Menschen, die mit HCV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, bestehend aus HHT888-45 oder einem Extrakt, der aus HHT888-45 erhalten wurde, an den Menschen umfasst.
  • Des weiteren ist ebenfalls ein Verfahren zur Verringerung der Virusbelastung eines menschlichen Trägen von HBV und ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Hepatitis-B bei einem Menschen offenbart, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von mindestens einer Zusammensetzung, ausgewählt aus Nr. 5(5) und mindestens einem Mittel, das aus der aus Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(3), Nr. 5(4), Nr. 5(6), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(9), Nr. 5(10) und Nr. 5(11) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, an einen Menschen umfasst.
  • Des weiteren ist ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von einem HCV-Träger und ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von Hepatitis-C bei einem Menschen offenbart, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, umfassend die Mischung von dem Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(5), seinem Extrakt oder seinem aktiven Grundbestandteil und mindestens ein Einzelkraut-Naturheilmittel, seinen Extrakt oder seinen aktiven Grundbestandteil, die aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4), Nr. 5(8) und Nr. 5(11) bestehenden Gruppe ausgewählt sind, an einen Menschen umfasst.
  • Es ist ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Hepatitis-B in einem Menschen offenbart, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von mindestens einer Zusammensetzung, die aus HHT888-45 und HHT888-5 ausgewählt wurde, an den Menschen umfasst.
  • Ferner ist ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Hepatitis-B in einem Menschen offenbart, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von mindestens einer Zusammensetzung an den Menschen umfasst, die ausgewählt wurde aus: (1) Einer Mischung aus dem Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(5), seinem Extrakt oder seinem aktiven Grundbestandteil und mindestens einem Einzelkraut-Naturheilmittel, seinem Extrakt oder seinem aktiven Grundbestandteil, die aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4), Nr. 5(8) und Nr. 5(11) bestehenden Gruppe ausgewählt sind, und (2) Einer Mischung aus dem Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(5), seinem Extrakt oder seinem aktiven Grundbestandteil und mindestens einem Einzelkraut-Naturheilmittel, seinem Extrakt oder seinem aktiven Grundbestandteil, die aus der aus Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(3), Nr. 5(4), Nr. 5(6), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(9), Nr. 5(10) und Nr. 5(11) bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  • Des weiteren ist ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, die aus HHT888-4 besteht, an den Menschen umfasst.
  • Es ist hier ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, die aus HHT888-5 besteht, an den Menschen umfasst.
  • Es ist hier ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, die aus HHT888-45 besteht, an den Menschen umfasst.
  • Es ist hier ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV, HBC und HCV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge (wie beispielsweise von 0,4 bis 120 g pro Tag) von einer Zusammensetzung, die aus HHT888-54 besteht, an den Menschen umfasst.
  • Es ist hier ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einer Zusammensetzung, die mindestens ein Einzelkraut-Naturheilmittel, seinen Extrakt oder seinen aktiven Grundbestandteil umfasst, die aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und H bestehenden Gruppe ausgewählt sind, an den Menschen umfasst.
  • Es sind hier ebenfalls neuartige Kräutermischungen und ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einer Kräutermischung an den Menschen umfasst, die mindestens ein Heilkraut, ausgewählt aus Nr. 5(5) und Mischungen daraus, und mindestens ein Heilkraut, ausgewählt aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(7), Nr. 5(8) und Nr. 5(11) bestehenden Gruppe, umfasst.
  • Es ist hier ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einer Mischung, die mindestens zwei antivirale Komponenten umfasst, die aus den Einzelkraut-Naturheilmittel oder ihren Herkunftspflanzen isoliert wurden, die aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und H bestehenden Gruppe ausgewählt sind, an den Menschen umfasst.
  • Es ist hier ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Menschen offenbart, die mit HIV infiziert sind, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von einer Zusammensetzung, die mindestens eine der mit Wasser extrahierbaren und mit Säure ausfällbaren antiviralen Komponenten oder Verbindungen umfasst, welche aus den Einzelkraut-Naturheilmittel oder ihren Herkunftspflanzen isoliert wurden, die aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und H bestehenden Gruppe ausgewählt sind, an den Menschen umfasst.
  • Die Dosierung von den Zusammensetzungen der Erfindung kann von 0,4 bis 120 g pro Tag für das die Therapie benötigende Säugetier reichen. Ein Fachmann wird zu schätzen wissen, dass, abhängig von dem Gewicht der einzelnen Person und dem Fortschreiten der viralen Infektion, höhere Dosen von den Zusammensetzungen benötigt werden können. Da die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen praktisch keine Nebenwirkungen aufgezeigt haben, kann mit der Einführung der Reduktion hoher Dosen nach der Manifestierung (d. h, der Verringerung der Virusbelastung) von der therapeutischen Wirkung begonnen werden. Ein Fachmann kann jede Dosierungsrate auf eine bestimmte Person ohne unangemessenes Experimentieren zuschneiden. Insbesondere kann die Dosierung füt eine vorgegebene Zusammensetzung in dem Bereich von 0,4 bis 100 g pro Tag liegen, vorzugsweise 1,0 bis 25 pro Tag. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen mindestens drei (3) mal täglich verabreicht. Eine Einmalverabreichung wird jedoch ebenfalls wirksam sein. Insbesondere ist für eine orale Dosis von 5,5 g HHT888-5, drei (3) mal täglich (insgesamt 16,5 g pro Tag), gefunden worden, dass sie wirksam ist, die HBV-Virusbelastung in HBV-Trägern zu verringern. Für eine orale Dosis von 2,7 bis 5,7 g drei (3) mal täglich (insgesamt 8–17 g pro Tag) von der Kräutermischung HHT888-45 ist eine Wirksamkeit bei der Wiederherstellung der normalen Leberfunktion bei Hepatitis-C-Patienten gefunden worden. Bei Dosierungen so hoch wie 121 g pro Tag für HHT888-5 und 63 g pro Tag für HHT888-45 sind keine ernsthaften Nebenwirkungen nachgewiesen worden. Es sollte gewürdigt werden, dass die hierin wiedergegebenen Dosierungen sich auf das Naturheilmittel (Extrakt deponiert an gemahlener Pflanze oder Adsorptionsmittel) in trockener Form beziehen. Ferner werden Extrakte der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die Konzentration von den aktiven Komponenten steigern und dementsprechend können Verkleinerungen in den Dosierungskonzentrationen verwirklicht werden. Dosierungen so gering wie 10% von den hierin für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen aufgelisteten Konzentrationen können in Erwägung gezogen werden. Die bevorzugte Dosierung für Nr. 5(5) zur Behandlung einer HIV-Infektion beträgt von 0,4 bis 17 g pro Tag.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung werden vorzugsweise oral oder enteral verabreicht, es kann jedoch ebenfalls eine intravenöse (i. v.) und/oder intramuskuläre (i. m.) Verabreichung hierin in Erwägung gezogen werden. Fachleute werden es verstehen, wie man die i. v.- und i. m- Formulierungen zubereiten kann und wie wirksame Dosierungen erhalten werden können.
  • In dem Verfahren kann das Säugetier ein Mensch oder ein Tier sein. Der Mensch kann ein Erwachsener, ein Kind oder ein Säugling sein. Dementsprechend wird für Säuglinge eine Säuglingsformulierung, welche die nachstehend hierin beschriebenen Pflanzenextrakte oder aktiven Grundbestandteile enthält, in der Behandlung von Säuglingen, die mit HBV, HCV oder HIV infiziert sind, wirksam sein. Für Kinder oder Erwachsene wird ein sogenanntes „Medical Food" oder ein Ernährungsprodukt, wie beispielsweise Milch und Yoghurt, welches die hierin beschriebenen Pflanzenextrakte oder aktiven Grundbestandteile enthält, ebenfalls in der Behandlung von Menschen wirksam sein, die mit HBV, HCV oder HIV infiziert sind.
  • Ebenfalls ist ein Verfahrensprozess zur Isolierung der wirksamen Verbindungen aus den aufgelisteten Naturheilmitteln oder Heilpflanzen und den isolierten Verbindungen selbst offenbart.
  • Die Kräuter, die als Ausgangsmaterial für diese Erfindung verwendet werden, können aus handelsüblichen Quellen als medizinische Einzelkräuter erworben werden, die gemischt oder extrahiert oder konzentriert werden können und in Zusammensetzungen für die Verabreichung an einen Menschen hineingegeben werden. Die Pflanzenextrakte, sobald sie aus dem Pflanzenmaterial isoliert sind, können konzentriert und anschließend in eine Form gebracht werden, die für die Verabreichung an den Menschen geeignet ist (d. h. Pillen. Kapseln und Tabletten). Die aktiven Grundbestandteile, sobald sie aus der Pflanze isoliert oder synthetisiert sind, können dann in Zusammensetzungen für die Verabreichung an einen Menschen eingesetzt werden und können eine Vielzahl an Formen einnehmen, wie beispielsweise Kapseln, Tabletten, Pulver, Bonbons, Gele, Erfrischungsgetränke, Tees, Ernährungsprodukte und dergleichen.
  • Es ist ebenfalls ein medizinisches Produkt offenbart, hergestellt durch den Verfahrensprozess, umfassend die Schritte von: (a) Inkontaktbringen von zerkleinertem Pflanzenmaterial, wie beispielsweise das von Nr. 5(1) bis Nr. 5(11), Nr. 4(2) bis Nr. 4(5) und H und Mischungen daraus, mit Wasser zur Bildung von einer wässrigen Dispersion; (b) Erhitzen der wässrigen Suspension auf etwa 100°C und Halten bei dieser Temperatur für etwa 0,5 bis etwa 3 Stunden; (c) Abtrennen des unlöslichen Pflanzenmaterials von der wässrigen Phase, und (d) Konzentrieren der gelösten Substanz in der wässrigen Phase. Die konzentrierte, gelöste Substanz kann durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknen, Verdampfung oder Ultrafiltration erhalten werden.
  • Es ist ebenfalls ein medizinisches Produkt offenbart, hergestellt durch den Verfahrensprozess, umfassend die Schritte von: (a) Inkontaktbringen von zerkleinertem Pflanzenmaterial, das aus der aus Nr. 4(2), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11), H und Mischungen daraus bestehenden Gruppe ausgewählt ist, mit Wasser zur Bildung von einer wässrigen Dispersion; (b) Erhitzen der wässrigen Suspension auf etwa 100°C und Halten bei dieser Temperatur für etwa 0,5 bis etwa 3 Stunden; (c) Abtrennen des unlöslichen Pflanzenmaterials von der wässrigen Phase, (d) Ansäuern der wässrigen Lösung mit Säure (wie beispielsweise Salzsäure) auf einen pH-Wert von weniger als etwa 2,0; (e) Abtrennen des sauren Niederschlages von dem Überstand, und (f) Reinigen des sauren Niederschlages durch Auflösen in einer basischen Lösung (wie beispielsweise 0,1 N Ammoniumbicarbonat) und nochmaligem Ausfallen mit Säure. Gegebenenfalls kann der saure Niederschlag in 0,1 N Ammoniumbicarbonatlösung aufgelöst und konzentriert werden. Die konzentrierte, gelöste Substanz kann durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknen, Verdampfung oder Ultrafiltration erhalten werden.
  • Stellvertretend für die Säuren, die zum Ansäuern der wässrigen Extrakte verwendbar sind, stehen Salzsäure, Phosphorsäure, Eisessig, Schwefelsäure und dergleichen. Hierbei ist von Bedeutung, dass die Säure einen pKa-Wert aufweist, der ausreicht, die aktiven Komponenten in die Säureform umzuwandeln. Der pH-Wert von dem Extrakt sollte weniger als 3,0 betragen und am meisten bevorzugt weniger als 2,0 betragen, damit die Ausfällung eintritt.
  • Es ist ebenfalls ein medizinisches Produkt offenbart, hergestellt durch einen Verfahrensprozess, umfassend die Schritte von: (a) Inkontaktbringen von mindestens einem medizinischen Kraut, das ausgewählt ist aus: Nr. 4(2), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11), H und Mischungen daraus, mit Wasser zur Bildung von einer wässrigen Dispersion; (b) Rühen der wässrigen Dispersion bei Umgebungstemperatur für etwa 0,5 bis etwa 3 Stunden; (c) Abtrennen des unlöslichen Pflanzenmaterials von der wässrigen Phase, (d) Ansäuern der wässrigen Lösung mit Säure auf einen pH-Wert von weniger als etwa 2,0, um einen Niederschlag zu bilden; (e) Abtrennen des sauren Niederschlages von dem sauren Überstand, und (f) Reinigen des sauren Niederschlages. Der Niederschlag kann durch wiederholtes Auflösen in 0,1 N Ammoniumbicarbonatlösung und weiteren Ausfällungen mit Säure gereinigt werden.
  • Diese Anmeldung stellt die vorhandenen Daten von den vorliegenden Entdeckungen dar und beschreibt vollständig die Stoffzusammensetzungen, ihre Zubereitungen, ihre klinischen Anwendungen und die analytischen Instrumente, die zur Charakterisierung der verschiedenen Komponenten verwendet wurden. Diese und andere Aspekte der Erfindung werden für die Fachleute als Ergebnis der nachfolgenden Beispiele, die als Veranschaulichung der Erfindung und nicht einschränkend gemeint sind, offensichtlich werden.
  • BESTE ART UND WEISE ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Um die Fachleute mit den Prinzipien der Erfindung vertraut zu machen, werden die nachfolgenden Beispiele vorgelegt, die als Veranschaulichung der Erfindung und nicht einschränkend gemeint sind. Alle Prozentangaben sind in Gewichtsprozenten gemacht, wenn nichts anderes spezifiziert ist.
  • BEISPIEL 1
  • ZUBEREITUNG VON KRAUTERMISCHUNGEN
  • Bei der Zubereitung der erfindungsgemäßen Kräuterzusammensetzungen, wurden chinesische Naturheilmittel in der Form von Einzelkräutern aus handelsüblichen Quellen in Pulverform bezogen. Die individuellen Einzelkraut-Naturheilmittel wurden in den entsprechenden Verhältnissen gemischt, um jede Kräutermischung zuzubereiten.
  • Die Kräutermischung für HHT888-4 wurde zubereitet durch Mischung von Nr. 4(1), Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4) und Nr. 4(5) bei einem Gewichtsverhältnis von 3:3:3:3:4. Die Kräutermischung für HHT888-5 wurde zubereitet durch Mischung von gleichen Gewichten von Nr. 5(1), Nr. 5(2), Nr. 5(3), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(6), Nr. 5(7), Nr. 5(8), Nr. 5(9), Nr. 5(10) und Nr. 5(11).
  • Die Kräutermischung HHT888-45 wurde durch Mischen von vier (4) bis sechs (6) Einzelkraut-Naturheilmitteln Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(8) und Nr. 4(2) bei einem Gewichtsverhältnis von 1:1:1:1:0–1:0–1 zubereitet. Das Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(8) oder Nr. 4(2) oder beide wurden in einigen Fällen in HHT888-45 bei der anfänglichen Verabreichung nicht verwendet. Eine der beiden Einzelkraut-Naturheitrnittel oder beide wurden später hinzugefügt, wenn sie benötigt wurden, um die Therapie zu verbessern. Das Gewichtsverhältnis von dem Einzelkraut-Naturheilmittel Nr 4(2) in der Kräutermischung HHT888-45 variierte, wenn es verwendet wird, ebenfalls von Fall zu Fall zwischen 0,5 und 1.
  • Es sollte beachtet werden, dass eine Mischung der Absude, die einzeln aus der Herkunftspflanze von dem Einzelkraut-Naturheilmittel zubereitet wurden oder ein Absud, der aus den vorgemischten Herkunftspflanzen von den Einzelkraut-Komponenten jeder Kräutermischung zubereitet wurde, innerhalb des Geltungsbereiches von dieser Erfindung liegt.
  • BEISPIEL 2
  • ZUBEREITUNG VON EINZELKRAUT-NATURHETLMITTELN
  • Die Herkunftspflanze, von der jedes Einzelkraut-Naturheilmittel erhalten wurde, ist in den Abschnitten des Standes der Technik und der Kurzdarstellung von dieser Anmeldung aufgelistet. Es sollte verstanden werden, dass mehr als eine Spezies oder Gattung einer Heilpflanze verwendet werden kann, um dasselbe Naturheilmittel zuzubereiten. Beispielsweise kann das Naturheilmittel Nr. 5(8) oder FRUCTUS FORSYTHIAE, aus drei (3) Spezies von Pflanzen der Gattung Forsythia zubereitet werden, d. h. von Forsythia suspensa, Forsythia viridissima, Forsythia koreana oder Mischungen daraus. Das Naturheilmittel Nr. 5(6)(RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS) kann aus einer von den fünf (5) Pflanzen Baphicacanthes cusia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica, Polygonum tinctorium oder Mischungen daraus zubereitet werden. Die Naturheilmittel wurden aus ihren entsprechenden Herkunftspflanzen wie folgt zubereitet.
  • Ein geeignetes Teil oder Teile oder die ganze Pflanze wurde erhalten, mit kaltem Wasser gewaschen, getrocknet und zerkleinert. Die Pflanzenmaterialien wurden dann mit kochendem Wasser auf der Basis von 1 Gewichtsanteil Pflanzenmaterial auf annähernd 5 bis 10 Gewichtsanteile Wasser extrahiert. Die Wassermenge, die verwendet wird, sollte mindestens das Pflanzenmaterial in dem Extraktionsgefäß bedecken. Die Materialproben wurden für 0,5 bis eine Stunde gekocht, aber nicht mehr als 3 Stunden, um eine wirksame Extraktion von den gewünschten Komponenten zu ermöglichen. Kürzeres oder längeres Erhitzen würden nicht grundsätzlich die Extraktion beeinflussen, abgesehen von der Ausbeute und den Kosten. Die wässrige Lösung wurde durch Filtration von dem Pflanzenmaterial abgetrennt.
  • Die wässrige Lösung kann gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet werden, oder ihr Volumen kann durch Erhitzen mit oder ohne angelegtes Vakuum verringert werden. Das Konzentrat kann anschließend sprühgetrocknet oder gefriergetrocknet werden oder an eine Pulverform von demselben Pflanzenmaterial, Stärke oder ein anderes Absorptionsmaterial absorbiert werden. Dadurch ist das Einzelkraut-Naturheilmittel zubereitet.
  • Ein Absud ist die wässrige Lösung von dem Pflanzenmaterial, die mittels Kochen des Pflanzenmaterials in Wasser, wie vorangehend beschrieben, für etwa 0,5 bis eine Stunde zubereitet wird. Der Absud kann unmittelbar nach seiner Zubereitung verbraucht werden sowie auf eine warme oder Umgebungs- Temperatur gekühlt oder konserviert mit einer ordnungsgemäßen Sterilisation für den späteren Verbrauch. Die Sterilisation kann mittels Mikrofiltration oder Hitze durchgeführt werden.
  • BEISPIEL 3
  • BEHANDLUNG VON HEPATITIS-B-VIRUSTRÄGERN
  • Neunundzwanzig (29) HBV-Träger mit normalen Werten für die Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transferase (SGOT) und die Serum-Glutamat-Pyruvat-Transferase (SGPT)(Leberenzyme) wurden mit HHT888-5 behandelt. Mehrere HBV-Träger, die erhöhte SGOT- und SGPT-Konzentrationen aufwiesen, wurden zuerst mit anderen Gegenmitteln behandelt, welche die Werte ihrer Serumleberenzyme wieder auf normale Spiegel (8–40 Einheiten/ml für SGOT und 5–35 Einheiten/mL für SGPT) zurückbrachten, aber bei der Verringerung der HBV-Belastung versagten. Anschließend begann die Behandlung mit HHT888-5. HHT888-5 war, wie in Beispiel 1 beschrieben, zubereitet worden durch Mischung von elf (11) Einzelkraut-Naturheilmitteln, die von einer handelsüblichen Quelle bezogen wurden und wurde unter Beachtung der Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) produziert. Die Einwilligung von jedem Patienten wurde eingeholt, bevor die Behandlung gestartet wurde.
  • Die Patienten wurden angewiesen, HHT888-5 drei (3) mal täglich zu sich zu nehmen. Jede Dosis betrug 5,5 g. Jedes 5,5-g Paket von der Kräutermischung wurde mit warmem Wasser gemischt und oral eingenommen. Die Serumtiter des Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HbsAg) von jedem Patienten wurden mit den in Tabelle 1 angegebenen Zeitabständen bestimmt, um den Fortschritt der Behandlung zu überwachen. Der Serumtiter von HBsAg wurde bestimmt unter Verwendung eines reversen passiven Hämagglutinationstestes, wie er beschrieben wurde in: (1) Instruction of "Taifu" Serodia-HBs Test Reagent for HBsAg Detection, Taifu Pharmaceutical Co., Ltd., Taoyuan, Taiwan, R. O. C.; (2) D. S. Chen & J. L. Sung, J. Formosan Med. Assoc., 77, 263–270 (1978); und (3) T. Juji & T. Yokochi, Japan, J. Exp. Med., 39, 615–620 (1969).
  • Tabelle 1 zeigt die Behandlungsergebnisse von den neunundzwanzig (29) HBV-Trägern. Die Patienten zeigten im Verlauf der Behandlung eine Verbesserung in ihrem Krankheitszustand, wie es durch die Verringerung ihrer HbsAg-Titer und ihr Wohlbefinden angezeigt wird. Bei vierzehn (14) Trägern (48%), deren HbsAg-Titer von 20 bis 81.920 reichten, wurde dieser signifikant (vier- bis 256-fache Verringerung, oder von positiv in negativ) nach 35 bis 964 Tagen der Behandlung erniedrigt. Bei vier (4) Trägern (14%) verminderten sich ihre HbsAg-Titer von 20, 40 und 2.560 auf negativ (d. h. unter 20 ng/mL Nachweisgrenze) nach einer Behandlungszeit von 56–153 Tagen. Bei vierzehn (14) Trägern (48%) erfolgte keine signifikante Änderung (zweifache Titerabnahme oder -zunahme oder keine Veränderung) in den HbsAg-Titern während der Dauer der Behandlung (63–284 Tage). Bei einem Träger (3%) war ein leichter vierfacher Titeranstieg festgestellt worden. TABELLE 1- Klinische Wirkungen von HHT888-5 auf Hepatitis-B-Virusträger HbsAG-TITER
    PATIENT VORHER NACHHER DAUER (Tage)
    1 40 negativ 56
    2 2560 NEGATIV 72
    3 20 negativ 153
    4 20 negativ 88
    5 2560 80 53
    6 1280 320 101
    7 2560 1280 32
    1280 399
    320 964
    8 2560 1280 79
    640 412
    9 20480 5120 53
    10 20480 5120 60
    11 40960 10240 35
    12 81920 40960 74
    10240 461
    13 81920 20480 63
    14 5120 2560 170
    2560 245
    1280 556
    1280 832
    15 160 80 284
    16 320 160 198
    17 640 320 276
    18 1280 640 120
    19 2560 1280 69
    20 5120 2560 263
    21 20480 10240 77
    22 40960 40960 120
    20480 210
    23 160 160 227
    24 320 320 79
    25 640 640 157
    26 1280 1280 69
    27 40960 40960 137
    28 5120 10240 63
    29 160 640 121
  • Die in diesem Beispiel dargestellte Behandlung mit HHT888-5 lasst sich sehr positiv mit der gegenwärtig akzeptierten Interferontherapie vergleichen. Die Ansprechraten für die Interferon-Therapie und die Behandlung mit HHT888-5 zur Erniedrigung der HbsAg-Titer in Patienten, die mit HBV infiziert sind, sind vergleichbar, annähernd 40%, beziehungsweise 48%. Auch die Raten der Serum-HBsAg Clearance waren für beide vergleichbar, 10–15% für die Interferon-Therapie und annähernd 14% für die HHT888-5-Behandlung. Darüber hinaus wird die Interferon-Therapie typischerweise intramuskulär oder intravenös verabreicht, mit häufig auftretenden nachteiligen Nebenwirkungen. Die Behandlung mit HHT888-5 wurde oral verabreicht (ähnlich wie Teetrinken) mit keinen offensichtlichen Nebenwirkungen bei allen behandelten Patienten. Die orale Verabreichung ist bedeutend angenehmer und ökonomischer als die intramuskuläre oder die intravenöse Verabreichung. HHT888-5 kann demzufolge sicher und bequem eingenommen werden, sogar langfristig, um die HBV-Proliferation in HBV-Trägern und Hepatitis-B-Patienten zu verringern oder zu kontrollieren.
  • Wenn die HBV-Virusbelastung in einem HBV-Träger verringert oder auf einem ausreichend niedrigen Niveau gehalten werden kann, wird der Träger sehr viel weniger wahrscheinlich zu Hepatitis, Leberzirrhose, Leberkrebs und Tod fortschreiten. Dementsprechend kann HHT888-5 zur Behandlung oder Verhinderung von Hepatitis-B oder sogar zur Verhinderung von Leberzirrhose oder Leberkrebs, die durch HBV-Infektion verursacht wurden, verwendet werden.
  • Da HHT888-5 in diesem Beispiel zunächst durch Mischen des Pulvers mit Wasser und anschließender oraler Einnahme verabreicht wurde, würde die Isolation der aktiven Komponenten von HHT888-5 und ihre Verabreichung an Menschen ebenfalls in der Behandlung von HBV wirksam sein. Dosierungen der Kräutermischung HHT88-5 so hoch wie 120 g pro Tag konnten ohne ernsthafte Nebenwirkungen erreicht werden.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel fällt nicht in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, soweit es sich auf die Kräutermischung HHT888-4 bezieht.
  • ANTIRETROVIRALE UNTERSUCHUNG DER KRÄUTERMISCHUNGEN UND IHRER WÄSSRIGEN EXTRAKTE
  • In diesem Beispiel wurden zwei Kräutermischungen, HHT888-4 und HHT888-5 auf ihre antiretroviralen Aktivitäten hin untersucht und es wurde eine Aktivität gegen EMuLV und HIV in einem in vitro Testsystem gefunden. Zwei in vitro-Testsysteme, Anti-Ecotroper Muriner Leukämievirus (Anti-EMuLV) und Anti-HIV wurden verwendet, um die antiretroviralen Aktivitäten der erfinderischen Zusammensetzungen zu untersuchen.
  • Der Anti-EMuLV-Test verwendet einen großen umhüllten, RNA-enthaltenden Virus, EMuLV, der zu derselben Virusfamilie wie HIV gehört und viele Eigenschaften besitzt, die ähnlich zu denen von HIV sind.
  • 1. ANTI-ECOTROPER MURINER LEUKÄMIE-VIRUS TEST
  • Das Testsystem enthält zwei Teile, einen Cytotoxizitätstest und einen Virus-Unterdrückungstest. Siehe QBI Protokoll 39014 Schlussbericht und QBI Protokoll 39016 Schlussbericht, Quality Biotech, Camden, NJ, USA, 1992. Jede Probe wurde anfänglich auf ihre Cytotoxizität gegenüber den SC-1 Indikatorzellen untersucht, welche für die Titration von infektiösen EMuLV in einem XC-Plaque-Test verwendet wurden. Die Cytotoxizität, wie sie hierin berichtet wird, wird in der Form von Prozent Kontrollproliferation angegeben. Je höher die Prozentzahl bedeutet, dass die Substanz, die untersucht wird, für die Zellen nicht toxisch ist. Dies ist sehr wichtig, da Verbindungen, die äußerst toxisch sind, die Interpretation von den Testergebnissen verzerren würden. Zum Beispiel könnte eine hohe Aktivität in einem HIV-Test und eine hohe Cytotoxizität (niedrige %-Kontrollproliferation) bedeuten, dass die Testverbindung das Wachstum der Wirtszellen inhibiert, wodurch das Wachstum von dem Virus eingeschränkt wird. Demzufolge würde dies zu einer falsch-positiven Bewertung der antiviralen Aktivität führen. Siehe QBI Protokoll C30015, Quality Biotech, Camden, NJ, USA. Jede Probe wurde in einem Virus-Resuspensions-Puffer (50 mM Tris, pH 7,8, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA) ohne den Virus dispergiert. Die Lösung wurde anschließend dem XC-Plaque-Test unter denselben Bedingungen unterzogen, wie sie für die Bestimmung des EMuLV-Titers verwendet wurden. Eine Probe wurde als cytotoxisch angesehen, wenn die Indikatorzellen für den Test weniger als 50% konfluent waren. Eine nicht-cytotoxische Probenkonzentration wurde dann für den Virus-Unterdrückungs-Test ausgewählt.
  • In dem Virus-Unterdrückungs-Test wurde jede Probe mit EMuLV (Stamm AKV623, Titer 2,2–4,2 × 105 PFU/mL) in einem Virus-Resuspensionspuffer bei 23–25 mg/mL (z. B. 100 mg/4,0 mL) für 12–32 Minuten inkubiert. Der pH-Wert der behandelten Virussuspension wurde, falls notwendig, auf innerhalb 6,8–7,2 eingestellt und anschließend auf seinen Titer in dem XC-Plaque-Test untersucht.
  • Ein Aliquot (1,5 mL) wurde in dem Zellkulturmedium bis zum Endpunkt (Verdünnungen von 100, 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7 und 10–8, oder wie angebracht) verdünnt. Jede Verdünnung wurde kräftig gemischt, um jegliche Partikel, falls vorhanden, zu resuspendieren und dann als Doppelprobe auf infektiöse virale Partikel durch den XC-Plaque-Test getestet zu werden. Eine positive Kontrolle (Virussuspension ohne Behandlung) und eine negative Kontrolle (Zellkulturmedium, kein Virus) wurden ebenfalls gleichzeitig analysiert, um den Test zu validieren.
  • Die Anti-EMuLV-Aktivität von der Probe wurde in log10-Verringerung des EMuLV-Titers im Vergleich zur positiven Kontrolle ausgedrückt. Eine Probe mit einer Verringerung des log10-Titers von größer als 0,5 wurde als aktiv eingestuft.
  • HHT888-4 nd HHT888-5 wurden anfänglich „wie vorliegend" getestet und wiesen gute antivirale Aktivitäten (1,0 bis 1,4 log10 Verringerung im viralen Titer) bei 25 mg/mL und 12 Minuten Inkubation mit dem Virus bei Raumtemperatur auf. Sie wurden anschließend nochmals bei einer längeren Inkubationszeit (32 Minuten) mit dem Virus bei derselben Konzentration getestet. Jede Probe wurde ebenfalls auf ihre löslichen und unlöslichen Fraktionen in dem obigen Virus-Resuspensionspuffer untersucht, um zu sehen, ob jede aktive Komponente wasserlöslich war. Der lösliche Anteil wurde von dem unlöslichen Anteil durch Zentrifugation bei Raumtemperatur und 10.000 × g für 10 Minuten abgetrennt. Die lösliche Fraktion wurde in zwei Aliquots aufgeteilt, eines über einen 0,45-μm Filter gefiltert und eines blieb ungefiltert, und getestet, um zu sehen, ob zurückgebliebene Partikel irgendeine Wirkung auf die Aktivität besaßen.
  • Tabelle 2 fasst die Ergebnisse des Anti-EMuLV-Aktivitätstests zusammen. Die Ergebnisse bestätigen, dass sowohl HHT888-4 als auch HHT888-5 und ihre löslichen und unlöslichen Fraktionen Anti-EMuLV-Aktivität aufweisen. Diese Proben verursachten eine Verringerung um 1,0 bis 2,6 log10 im viralen Titer, wenn sie mit dem Virus bei 23–25 mg/mL für 32 Minuten inkubiert wurden. Die Mikrofiltration beeinflusste die Aktivität der beiden löslichen Fraktionen nicht signifikant. TABELLE 2 Anti-Ecotroper Muriner Leukämie-Virus Aktivität
    Cytotoxizität* Anti-EMuLV-Aktivität
    Probe Behandlung 25 2.5 0.25 mg/mL Log10 Titer Verringerung**
    HHT888-4 „wie vorliegend" Ja Nein Nein 1,02 (90%)***
    „wie vorliegend" Ja Nein Nein 1,04 (91%)****
    Löslich - - - 1,74 (98%)****
    Löslich, filtriert - - - 1,59 (97%)****
    Unlöslich - - - 2,64 (99,8%)****
    HHT888-5 „wie vorliegend" Ja Nein Nein 1,35 (96%)***
    „wie vorliegend" Ja Nein Nein 2,10 (99,2%)****
    Löslich - - - 2,05 (99,1%)****
    Löslich, filtriert - - - 1,71 (98,1%)****
    Unlöslich - - - 1,72 (98,1%)****
    • * Probe wurde als cytotoxisch angesehen, wenn die SC-1 Indikatorzellen für den Test weniger als 50% konfluent waren.
    • ** Verglichen mit der Virus-Arbeitssuspension mi einem Titer von 2,2–4,2 × 105 PFU/mL (Plaquebildende Einheiten/mL), oder Log10(PFU/mL) = 5,34–5,62. Die Werte in Klammer zeigen die prozentuale Verringerung des Virustiters von der Virus-Arbeitssuspension.
    • *** Inkubationszeit 12 Minuten, bei 25 mg/mL Testwert. Die Aktivität kann durch die Probe verursacht sein, durch mikrobielle Kontamination oder durch eine unspezifische physikalische Interaktion zwischen den Partikeln von der Probe und dem Virus, da die Proben vor dem Test nicht steril gefiltert wurden.
    • **** Inkubationszeit 32 Minuten, bei 25 mg/mL Testwert für die „wie vorliegend" unfraktionierten Proben. Für die löslichen, löslich & steril-filtrierten und die unlöslichen Fraktionen war der Testwert äquivalent zu 23 mg/mL ihrer unfraktionierten Probe.
  • Die Daten in Tabelle 2 demonstrieren, dass HHT888-4 und HHT888-5 wirksame Anti-EMuLV-Mittel sind.
  • 2. ANTI-HUMANER IMMUNSCHWACHE-VIRUS-TEST
  • Dieses Testsystem enthält zwei Teile, einen Toxizitätstest und einen HIV-Unterdrückungstest. Die Probe wurde in einem Zellkulturmedium gemischt, z. B. 50 mg in 1,00 mL. Die Mischung wurde kräftig gemischt und zentrifugiert, um die löslichen von en unlöslichen Anteilen abzutrennen. Der Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert und anschließend mit dem Zellkulturmedium auf zweckmäßige Konzentrationen für den Test verdünnt. Das Zellkulturmedium, das in dem Test verwendet wurde, war RPMI 1640 (pH 7,3 ± 0,3), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, 50 U/mL Penicillin und 50 μg/mL Streptomycin.
  • Die Probe wurde auf ihre Cytotoxizität und/oder cytostatische Aktivität gegenüber den Zielzellen, menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL), getestet. Ein Lymphozyten-Proliferations-Test wurde als Toxizitätstest verwendet, wo 100-μL Probe mit 100 μL einer Zellsuspension von nicht-infizierten PBL (3 × 105 Zellen) unter den gleichen Bedingungen wie in dem HIV-Unterdrückungstest inkubiert wurden. Die Proliferation der Lymphozyten wurde durch einen kolorimetrischen Test (MTT-Test) gemessen. Siehe T. Mosmann, J. Immunological Methods, 65, 55–63 (1983). Eine Probenkonzentration, welche in ≥ 70% der Kontrolle in der Lymphozytenproliferation resultiert, wird als akzeptabel für den HIV-Unterdrückungstest erachtet.
  • In dem HIV-Unterdrückungstest wurden HIV-1 infizierte PBL in der Gegenwart von der Probe fürvier (4) Tage wie in dem Toxizitätstest inkubiert. Siehe H. Ruebsamen-Waigmann, et al., J. Med. Virology, 19, 335–344 (1986). Das sezernierte virale Core-Protein p24 und/oder virale RNA wurden als Indikatoren für den Virus-Proliferationsstatus an Tag 3 und an Tag 4 durch eine HIV-1 p24 Capture ELISA-Technik, beziehungsweise eine HIV-RNA Dotblot-Hybridisierungstechnik bestimmt. Die Konzentration von dem durch die HIV-infizierten Zellen synthetisierten p24 wurde mittels eines Sandwich-ELISA bestimmt. Eine Stardardpräparation von rekombinantem p24/MicroGeneSys, USA) wurde zur Kalibrierung von dem ELISA verwendet. Siehe Ch. Mueller, et al., Fresenius Z. Anal. Chem., 330, 352–353 (1988).
  • Die in den infizierten Zellen synthetisierte 1-HV-RNA wurde durch eine Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik bestimmt. Von den infizierten Zellen wurde die zelluläre RNA präpariert und mittels einer Dotblot-Hybridisierungstechnik analysiert. Die Hybridisierungslösung enthielt die 32P-markierte DNA-Sonde, welche ein 5,5 Kilobasen großes DNA-Fragment von dem HIV-Isolat D31 umfasste. See H. v. Briesen, et al., J. Med. Virology, 23, 51–66 (1987). Dieses Fragment, das die gag/pol-Region von dem Virus überdeckt, ist mit 32P alpha-dCTP mittels Oligonukleotid-Markierung markiert worden. Die Plus-Strang RNA-Transkripte, die von der gag/pol-Region von dem viralen Isolat D31 abgeleitet wurden, wurden als externer Standard für die Hybridisierung verwendet. Diese sogenannten „run-off" Transkripte wurden mittels der T7-Polymerasereaktion aus negativ polarisierter HIV-DNA unter T7-Promotorkontrolle erzeugt. Die Konzentration der RNA-Transkripte wurde spektrofotometrisch bestimmt. Die hybridisierte Sonde wurde mittels Autoradiografie nachgewiesen und das prozessierte Autoradiogramm wurde densitometrisch evaluiert.
  • Eine positive Kontrolle, eine negative Kontrolle und eine AZT-Kontrolle wurden gleichzeitig durchgeführt, um die Gültigkeit von dem HIV-Unterdrückungstest sicherzustellen. Alle Tests wurden als Triplikate ausgeführt und für alle Tests wurden 96-Well Mikrotiterplatten mit rundem Boden verwendet.
  • Eine positive Kontrolle waren HIV-1 infizierte Lymphozyten, die in der Gegenwart von dem Zellkulturmedium ohne die Probe kultiviert wurden. Eine negative Kontrolle bestand aus Lymphozyten, die mit einem hitzeinaktivierten Virus-Inokulum infiziert waren, das unfähig zur Replikation war. Diese „scheininfizierten" Lymphozyten wurden auf demselben Wege kultiviert und getestet, wie die infizierten Zellen. Die Menge an viralem Protein, die in den Kulturen nur aufgrund des restlichen Inokulums vorhanden ist, wurde folglich als Hintergrundwert bestimmt. Die Menge an viralem Protein p24 in der Testprobe und in der positiven Kontrolle, die auf die virale Replikation zurückzuführen war, wurde anschließend durch die respektiven p24-Werte abzüglich des Hintergrundwertes bestimmt.
  • Die Menge an viralem Protein, die in den Kulturen mit den Proben aufgrund der viralen Proliferation vorhanden ist, wurde mit derjenigen in der positiven Kontrolle verglichen, d. h. der Kultur ohne die Probe. Die %-Unterdrückung der HIV-Proliferation wurde über die Differenz in den p24 Konzentrationen zwischen der positiven Kontrolle und der Probe bestimmt, dividiert durch die p24-Konzentration in der positiven Kontrolle und multipliziert mit 100%.
  • Die AZT-Kontrolle wurde mittels HIV-1 infizierter Lymphozyten durchgeführt, die in der Gegenwart von Azidothymidin (AZT) mit Konzentrationen von 100, 10, 1 und respektive 0,1 ng/mL kultiviert wurden. Dieses stellte eine Abschätzung von der Sensitivität der Lymphozyten gegenüber AZT bereit, einem bekannten Inhibitor der HIV-1 Replikation. Die Unterdrückung der HIV-1 Proliferation, die durch AZT in einer Konzentration von 10 ng/mL verursacht wird, sollte größer als 50% sein, verglichen mit der unbehandelten positiven Kontrolle.
  • Tabelle 3 fasst die Cytotoxizität und die Ergebnisse des HIV-Unterdrückungstests von HHT888-4 und HHT888-5 sowie von den AZT Kontrollen zusammen. Beide Kräutermischungen wiesen eine Aktivität bei der Unterdrückung der HIV-Proliferation in infizierten menschlichen Lymphozyten bei 2,5–5,0 mg/mL, aber nicht bei 50 μg/mL (50–100-fach verdünnt) auf. Die AZT-Kontrollen von allen Serien wiesen die erwarteten Aktivitäten auf und stellten demzufolge die Gültigkeit von den Tests sicher. TABELLE 3 Anti-HIV-Aktivitäten von HHT888-4 und HHT888-5
    HIV-Unterdrückung
    Test p24
    RNA
    Sample 4 Konzentration Cytotoxizität* Tag 3 Tag 4 Day 3 Day
    HHT888-4 2,5 mg/mL > 46% 100% 100% 100% 100%
    50 μg/mL 85% 1% 6% - -
    HHT888-5 5,0 mg/mL 75% 100% 97% 99% 100%
    50 μg/mL 86% 0% 12% - -
    AZT 100 ng/mL - 99–100% 100% - -
    10 ng/mL - 85–98% 77–96% -
    1 ng/mL - 20–39% 8–12% -
    0,1 ng/mL - 0% 0–3% -
    • * Prozent Proliferation von der Kontrolle. HHT888-4 war 46% bei 5,0 mg/mL. Sowohl HHT888-4 als auch HHT888-5 waren zytotoxisch (< 50% der Kontrolle) bei einer Konzentration von 25 mg/mL.
  • Bei 2,5–5,0 mg/mL von HHT888-4 und HHT888-5 war die HIV-Proliferation in den infizierten menschlichen Lymphozyten im Wesentlichen vollständig unterdrückt. 97–100% Unterdrückung, basierend auf dem viralen Protein p24 und 99–100%, basierend auf der viralen RNA, bestimmt an Tag 3 und an Tag 4 nach der Behandlung. Die Anti-HIV-Aktivität bei 50 μg/mL war vernachlässigbar, 0–12% für beide Kräutermischungen. Die Aktivitäten konnten nicht auf unlösliche Partikel zurückgeführt werden, da diese mittels eines 0,45-μm Filters vor dem Test herausgefiltert worden waren und die Aktivitäten waren nicht auf Cytotoxizität zurückzuführen. Wiederholungstests an drei Lots von HHT888-4 zeigten eine 100%-ige Unterdrückung bei 2,5 mg/mL an beiden Tagen, Tag 3 und Tag 4, mit annehmbarer Cytotoxizität (71–100% für Kontrollproliferation). Wiederholungstests an drei Lots von HHT888-5 zeigten eine 93–98%-ige Unterdrückung bei 2,5 mg/mL an Tag 3 und 89–99% Unterdrückung an Tag 4, mit annehmbarer Cytotoxizität (85–911% für Kontrollproliferation). Die Ergebnisse der Wiederholungsexperimente sind in Tabelle 4 dargestellt. TABELLE 4 Anti-HIV-Aktivitäten von HHT888-4 und HHT888-5 und ihren wässrigen Extrakten
    Probe Lot % Gewicht Test-Konzentration Cytotoxizität* HIV-Unterdruckeng**
    Tag 3 Tag 4
    HHT888-4 1 100% 2,5 mg/mL > 46% 100% 100%
    2,5 mg/mL 98% 100% 100%
    0,05 mg/mL 85% 1% 6%
    2 100% 2,5 mg/mL 100% 100% 100%
    3*** 100% 2,5 mg/mL 71–79% 100% 100%
    HHT888-4-E1 2 17% 1,0 mg/mL 98% 100% 96%
    E2 2 11% 1,0 mg/mL 96% 100% 87%
    E 2 28% 1,0 mg/mL 47% 100% 100%
    0,5 mg/mL 78% 100% 100%
    4 27 ± 1% (+) 1,0 mg/mL 72% 100% 100%
    1,0 mg/mL 100% 100% 93%
    0,1 mg/mL 97% 34% 12%
    0,02 mg/mL 82% 23% 2%
    HHT888-5 1 100% 5,0 mg/mL 75% 100% 97%
    2,5 mg/mL 89% 93% 91%
    0,05 mg/mL 86% 0% 12%
    2 100% 2,5 mg/mL 91% 94% 89%
    3*** 100% 2,5 mg/mL 44–85% 98% 99%
    0,5 mg/mL 52–100% 0% 0%
    HHT888-5-E 2 19% 1,0 mg/mL 91% 71% 26%
    • * Toxizität in Prozent der Kontroll-Proliferation.
    • ** HIV-Unterdrückung, basierend auf den Protein p24-Konzentrationen
    • *** Gemisch der respektiven Einzelkraut-Komponenten mit gleichen Verhältnissen. Nr. 5(10) und Nr. 5(11) waren nicht in Lot 3 von HHT888-5 eingeschlossen.
    • + Basierend auf zwei (2) Läufen.
  • Es ist anzumerken, dass Lot 3 von HHT888-4 oder HHT888-5 durch Mischen der entsprechenden Einzelkraut-Komponenten bei gleichen Gewichtsverhältnissen zubereitet wurde. Lot 3 von HHT888-5 war aus neun (9) Einzelkraut-Komponenten zusammengestellt, unter Ausschluss von Nr. 5(10) und Nr. 5(11).
  • Die Wasserextrakte von HHT888-4 und HHT888-5 (E bis E2) von einem bis zweit Lots wurden ferner getestet, um zu sehen, ob die aktiven Komponenten mit Wasser extrahierbar waren. Die Wasserextrakte von HHT888-4 und 5 wurden durch zweimalige Extraktion von 5 g des Pulvers mit 25 mL MilliQgereinigtem Wasser zubereitet. Jede Wassersuspension wurde für 1 Minute kräftig mit einem Vortexer geschüttelt, für 5 Minuten stehen lassen und dann nochmals für 1 Minute mit dem Vortexer kräftig geschüttelt, um die Extraktion zu unterstützen. Der Extrakt wurde von dem unlöslichen Material durch Zentrifugation bei 1.000–2.000 U/min für 20 Minuten abgetrennt. Der Überstand wurde in ein sauberes, vorgewogenes 50-mL Zentrifugen-Röhrchen überführt, gefriergetrocknet, gewogen und auf Anti-HIV-Aktivität getestet.
  • Das Prozentgewicht an Material betrug 17,3% für die ersten 25 mL Extrakt und 10,8% für die zweiten 25 mL Extrakt von HHT888-4 (Lot 2). Für HHT888-5 (Lot 2) betrug das Prozentgewicht an Material 14,2% für die ersten 25 mL Extrakt und 4,6% für die zweiten 25 mL Extrakt. Der erste (E1), der zweite (E2) und der vereinigte Extrakt (E) von HHT888-4 (Lot 2) wurden auf Anti-HIV-Aktivität untersucht. Alle anderen Extrakte wurden mit den vereinigten ersten und zweiten Extrakten untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
  • Alle drei Lots von der Kräutermischung waren sehr aktiv, 100% Unterdrückung bei 2,5 mg/mL für HHT888-4 und 89–100% Unterdrückung bei 2,5–5,0 mg/mL für HHT888-5. Der IC50-Wert lag zwischen 0,05 – 2,5 mg/mL für HHT888-4 und zwischen 0,5 und 2,5 mg/mL für HHT888-5.
  • Der IC50 ist die Konzentration von der Testsubstanz, die eine Unterdrückung von 50% der viralen Proliferation verursachen würde.
  • Der Wasserextrakt von HHT888-4 zeigte eine sehr gute Aktivität: 93–100% Unterdrückung bei 0,5–1,0 mg/mL. Der erste (E1) und der zweite Wasserextrakt (E2) von Lot 2 zeigten vergleichbare Aktivitäten: 100% Unterdrückung an Tag 3 und 87–96% Unterdrückung an Tag 4 bei 1,0 mg/mL. Der IC50-Wert von dem Wasserextrakt aus HHT888-4 lag zwischen 0,1–0,5 mg/mL.
  • Der Wasserextrakt von HHT888-5 (Lot 2) wies eine substanziell niedrigere Aktivität auf: 71% Unterdrückung an Tag 3 und 26% Unterdrückung an Tag 4 bei 1,0 mg/mL. Die aktive Hauptkomponente blieb offensichtlich in der unlöslichen Fraktion zurück und konnte unter den vorangehend erwähnten Bedingungen nicht so leicht durch Wasser extrahiert werden wie diejenige von HHT888-4. Es ist anzumerken, dass der Wasserextrakt von HHT888-5 (Lot 2) 19 Gewichts-% von der Kräutermischung ausmachte. Die Testkonzentration von dem Wasserextrakt von HHT888-5 (oder HHT888-5-E) bei 1, 0 mg/mL ist äquivalent zu 5,3 mg/mL von HHT888-5 selbst. HHT888-5 wurde in dem Test als sehr aktiv getestet, sowohl bei 2,5 mg/mL (93–98% Unterdrückung an Tag 3 und 89–99% Unterdrückung an Tag 4) und 5,0 mg/mL (100% Unterdrückung an Tag 3 und 97% Unterdrückung an Tag 4).
  • Die obigen Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass sowohl HHT888-4 als auch HHT888-5 und ihre Wasserextrakte in vitro antiretrovirale Aktivitäten aufweisen, insbesondere Anti-EMuLV- und Anti-HIV-Aktivitäten. Für HHT888-5 ist ebenfalls gezeigt worden, dass in der Behandlung von Hepatitis-B-Trägern wirkungsvoll ist.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel fällt nicht in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, soweit es sich auf die Kräutermischung HHT888-4 bezieht.
  • ANTIRETROVIRALE UNTERSUCHUNG VON INDIVIDUELLEN EINZELKRAUT-NATURHEILMITTELN
  • In diesem Experiment wurden die individuellen Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 und HHT888-5 auf ihre Anti-HIV-Aktivität untersucht. Tabelle 5 stellt die Testergebnisse dar. TABELLE 5 Anti-HIV-Aktivitäten von Einzelkraut-Komonenten von HHT888-4 und HHT888-5
    Probe Lot Test-Konzentration Cytotoxizität* HIV-Unterdrückung**
    Tag 3 Tag 4
    Nr. 4(1)*** 1 2,5 mg/mL 98% 73% 50%
    Nr. 4(2) 1 2,5 mg/mL 74–84% 92% 94%
    Nr. 4(3) 1 2,5 mg/mL 75–78% 100% 100%
    Nr. 4(4) 1 2,5 mg/mL 74–100% 100% 100%
    Nr. 4(5) 1 2,5 mg/mL 41–79% 98% 92%
    0,5 mg/mL 47–100% 0% 0%
    Nr. 5(1)*** 1 2,5 mg/mL 98% 73% 50%
    Nr. 5(2) 1 2,5 mg/mL 73–87% 18% 29%
    Nr. 5(3) 1 2,5 mg/mL 89–100% 0% 0%
    Nr. 5(4) 1 2,5 mg/mL 64% 100% 100%
    1,0 mg/mL 69–91% 0% 0%
    Nr. 5(5) 1 2,5 mg/mL 80–84% 93% 93%
    Nr. 5(6) 1 2,5 mg/mL 94–100% 0% 0%
    Nr. 5(7) 1 2,5 mg/mL 90–100% 50% 38%
    Nr. 5(8) 1 2,5 mg/mL 32–59% 100% 100%
    0,5 mg/mL 65–100% 0% 0%
    Nr. 5(9) 1 0,5 mg/mL 24–78% 0% 0%
    Nr. 5(10) 1 2,5 mg/mL 100% 65% 0%
    Nr. 5(11) 1 2,5 mg/mL 100% 92% 74%
    • * Toxizität in Prozent der Kontroll-Proliferation.
    • ** HIV-Unterdrückung, basierend auf den Protein p24-Konzentrationen
    • *** Nr. 4(1) = Nr. 5(1) Alle fünf (5) Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 wiesen eine Anti-HIV-Aktivität in unterschiedlichem Umfang auf: 73–100% Unterdrückung an Tag 3 und 50–100% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 4(3) und Nr. 4(4) wiesen die beste Aktivität auf 100% Unterdrückung bei 2,5 mg/mL sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4. Nr. 4(2) und Nr. 4(5) waren die nächstbesten: 92–98% Unterdrückung an Tag 3 und 92–94% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 4(1) wies eine moderate Aktivität auf 73% Unterdrückung an Tag 3 und 50% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 4(5) wies eine leichte Cytotoxizität auf (41–79% der Kontrollproliferation), die wahrscheinlich zu der beobachteten Aktivität mit einem IC50 von zwischen 0,5 und 2,5 mg/mL beitrug.
  • Drei (3) von den elf (11) Einzelkraut-Komponenten von HHT888-5: Nr. 5(4), Nr. 5(5) und Nr. 5(8), wiesen sehr gute Aktivitäten auf, 93–100% Unterdrückung der HIV-Proliferation sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 5(11) war die nächstbeste: 92% Unterdrückung an Tag 3 und 74% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Wiederum wies Nr. 5(1), das mit Nr. 4(1) identisch ist, eine moderate Aktivität auf: 73% Unterdrückung an Tag 3 und 50% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 5(2) und Nr. 5(7) wiesen nur eine marginale Aktivität auf: 18–50% Unterdrückung an Tag 3 und 29–38% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL. Nr. 5(10) wies eine sehr geringe Aktivität auf: 65% Unterdrückung an Tag 3, die auf 0% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL abfiel. Die verbleibenden drei (3) Einzelkraut-Komponenten, Nr. 5(3), Nr. 5(6) und Nr. 5(9) wiesen keine Aktivität bei 0,5–2,5 mg/mL auf. Nr. 5(9) wurde nicht bei der 2,5 mg/mL Konzentration aufgrund seiner Cytotoxizität getestet: bereits 24–78% der Kontrollproliferation bei 0,5 mg/mL.
  • Obgleich Nr. 5(4) und Nr. 5(8) leicht aktiver erschienen als Nr. 5(5)(100% versus 93% Unterdrückung bei 2,5 mg/mL), könnten ihre Aktivitäten teilweise auf ihre Cytotoxizität (32–64 der Kontrollproliferation bei 2,5 mg(mL) zurückzuführen sein. Dies wurde unterstützt durch den Verlust der Aktivität (0% Unterdrückung), wenn sie bei niedrigeren Konzentrationen, 0,5–1,0 mg/mL getestet wurden, wo die Cytotoxizität niedriger war und eher für den Test akzeptierbar.
  • BEISPIEL 6
  • ANTI-HIV-UNTERSUCHUNG DER HEILPFLANZE
  • Die Herkunftspflanze von dem Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(5), Aeginetia indica, wurde aus einem lokalen Kräutergeschäft in Taiwan bezogen und auf ihre Anti-HIV-Aktivität untersucht. Dies wurde gemacht, um zu sehen, ob die Aktivität in dem Naturheilmittel reproduziert werden kann, wenn sie direkt aus ihrer Herkunftspflanze zubereitet wird, anstatt von einer handelsüblichen Quelle bezogen zu werden.
  • Die ganze Pflanze wurde mit kaltem Wasser gewaschen, getrocknet, zerkleinert und mit kochendem Wasser wie in Beispiel 2 beschrieben extrahiert. Die wässrige Lösung wurde durch Filtration von dem Pflanzenmaterial abgetrennt. Das Volumen der wässrigen Lösung wurde anschließend durch Erhitzen verringert. Das Konzentrat wurde sprühgetrocknet und an gepulvertem Material aus demselben Pflanzenmaterial absorbiert und dementsprechend das Naturheilmittel in Pulverform zubereitet, nachfolgend hierin als Original-Nr. 5(5) bezeichnet.
  • Das gepulverte Naturheilmittel, das aus Aeginetia indica oder Origial-Nr. 5(5) zubereitet wurde, wurde mit Wasser bei Umgebungstemperatur extrahiert. Zwei (2) 5,00 g Materialproben wurden jeweils mit etwa 40 mL Wasser jedesmal in einem separaten 50-mL Plastik-Zentrifugenrbhrchen durch kräftiges Mischen mit dem Vortexer für eine (1) Minute extrahiert, für zehn (10) Minuten stehen lassen und wiederum für eine (1) Minute durch kräftiges Mischen mit dem Vortexer gemischt. Die Röhrchen wurden bei 1.500 U/min fOr zwanzig (20) Minuten zentrifugiert, um die Extrakte von den unlöslichen Rückständen zu trennen. Die Extrakte wurden durch ein Whatman Nr. 4 Filterpapier filtriert, gefriergetrocknet oder mit Stickstoff getrocknet und gewogen.
  • Die obige Extraktion von der Original-Nr. 5(5) mit Wasser (pH ~5.1) wurde wiederholt und der pH-Wert von dem ersten Extrakt wurde mit pH 5,7 bestimmt. Der erste und der zweite Extrakt wurden von den Rückständen abgetrennt, luftgetrocknet und gewogen. Das Gewichtsprozent von dem extrahierbaren Material wurden mit 18,7 ± 2,8% (n = 2) bestimmt.
  • Der erste Wasserextrakt von der Original-Nr. 5(5) wurde auf Anti-HIV-Aktivität getestet und als aktiv gefunden, 91% Unterdrückung an Tag 3 und 97% Unterdrückung an Tag 4 bei 1,0 mg/mL. Der Cytotoxizitätstest zeigte, dass der Extrakt bei dieser Konzentration nicht cytotoxisch war, 99% der Kontrollproliferation.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel fällt nicht in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, soweit es sich auf die Kräutermischung HHT888-4 bezieht.
  • BEHANDLUNG VON HEPATITIS-C-PATIENTEN
  • Für HHT888-5 ist demonstriert worden, dass es bei der Behandlung von HBV-Infektionen in Menschen wirksam und sicher ist. Dies bedeutet, dass der aktive Grundbestandteil oder die Grundbestandteile von HHT888-5 in Menschen durch die orale Verabreichung bioverfügbar sein müssen, um eine Erniedrigung von HBV in den behandelten Patienten zu verursachen, wie es durch die Abnahme von ihrem HBV-Oberflächenantigen (HbsAg), die in Beispiel 3 beobachtet wird, angezeigt wird. Zusätzlich stellten Hozumi et al. Beispiele in der US-Patentschrift Nr. 5411733 bereit, um die Überzeugung zu unterstützen, dass Substanzen, die eine antivirale in vitro Aktivität aufweisen, ebenfalls eine in vivo antivirale Aktivität besitzen, wie in dem Abschnitt Stand der Technik beschrieben. Es ist dementsprechend logisch, der Überzeugung zu sein, dass HHT888-4 oder HHT888-5 und ihre Wasserextrakte oder aktiven Grundbestandteile ebenfalls bei der Behandlung von HIV-Infektionen in Menschen wirksam sein sollten.
  • Um diese Überzeugung zu testen, wurden sechs (6) der am meisten gegen HIV aktiven Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 und HHT888-5 ausgewählt, um Hepatitis-C-Patienten zu behandeln, deren Erkrankung durch HCV-Infektionen verursacht wurde. Die Logik dahinter ist, dass beide, HCV und HIV, Retroviren sind. Die virale Hepatitis-C hat die Tendenz eine chronische Erkrankung zu werden und ist dementsprechend für den Behandlungstest geeigneter. Wenn die Behandlung bei Patienten wirkt, die mit HCV infiziert sind, wird sie ebenfalls bei Patienten wirken, die mit HIV infiziert sind. Beispiel 7 demonstriert deutlich die Gültigkeit von dieser Überzeugung.
  • Sechs (6) der am meisten gegen HIV aktiven Einzelkraut-Komponenten von HHT888-4 und HHT888-5 wurden ausgewählt und gemischt, um Hepatitis-C-Patienten zu behandeln, deren Erkrankung durch HCV-Infektionen verursacht wurde. Die sechs (6) Einzelkraut-Naturheilmittel, die ausgewählt wurden, waren Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4), Nr. 5(5) und Nr. 5(8). Nr. 4(5) wurde nicht eingeschlossen, obwohl sie eine sehr gute Aktivität aufwies, da wir aus unseren Experimenten entnehmen konnten, dass das Kraut eine unbestätigte Toxizität aufweisen könnte.
  • Die sechs (6) Einzelkraut-Naturheilmittel wurden von einer handelsüblichen Bezugsquelle erhalten und wurden gemäß den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis (GMP) produziert. Sie wurden in Übereinstimmung mit dem gewünschten Verhältnis in verschiedenen Kombinationen gemischt und dann wurde die Kräutermischung HHT888-45 wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet. Die Zustimmung der Patienten wurde vor dem Beginn der Behandlung eingeholt.
  • Die Patienten wurden angewiesen, die Kräutermischung drei (3) mal täglich, jedesmal 2,7–5,7 g, einzunehmen. Einheitsdosierungen von der Kräutermischung HHT888-45 wurden in individuellen Päckchen hergestellt. Jedes Einheitsdosis-Päckchen (2,7–5,7 g) der Kräutermischung wurde mit warmem Wasser gemischt und oral eingenommen. Alle Patienten wurden mit HHT888-45 behandelt, die Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4) und Nr. 5(5) enthält. Nr. 5(8) oder Nr. 4(2) oder beide wurden zu HHT888-45 zur Behandlung von einigen Patienten gleich zu Beginn oder im Verlauf der Behandlung hinzugefügt, um die Wirksamkeit der Behandlung zu steigern.
  • Im Verlauf der Behandlung variierte die tägliche Dosis von Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4) und Nr. 5(5) jeweils von zwei (2) bis drei (3) Gramm. Die tägliche Dosis von Nr. 5(8) variierte ebenfalls von zwei (2) bis drei (3) Gramm, wenn sie verwendet wurde. Die tägliche Dosis von Nr. 4(2) variierte von 1,5 bis zwei (2) Gramm, wenn sie verwendet wurde. Die Dosis wurde entsprechend dem Fortschreiten der Erkrankung variiert.
  • Es wurden sieben (7) Patienten mit viraler Hepatitis-C behandelt. Ihre Serum-Leberenzyme, SGOT und SGPT, wurden von Zeit zu Zeit durch ein lokales klinisches Labor im Verlauf de Behandlung bestimmt, um das Fortschreiten der Erkrankung zu kontrollieren. Die SGOT- und SGPT-Werte wurden unter Verwendung von einem Enzymtest bestimmt. Siehe (1) Gebrauchsanweisung für Kyokuto TA-E Transaminase Assay Reagents, Permit No. (62AM)0885, Kyokuto Pharmaceutical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan, 1994; (2) Gebrauchsanweisung für Yatrozyme TA-Lq Transaminase-assay Reagent Solution (Enzyme Assay), Commodity No. 817245 (RM163-K), Yatron Co., Ltd., Diayatron Co., Ltd., Tokyo, Japan; und (3) U. Lippi & G Guidi, Clin. Chem. Acta., 28, 431–437 (1970).
  • Die Konzentrationen von Serum-GOT und -GPT korrelierten eng mit dem Grad der Zellschädigung in der Leber. Diese Tests werden weitverbreitet in der Diagnose von Leberkrankheiten eingesetzt und als ein Indikator für die Leberfunktion verwendet. Der normale Bereich für SGOT beträgt 8–40 Einheiten/mL und der für SGPT liegt bei 5–35 Einheiten/mL. Erhöhte SGOT- und SGPT-Werte weisen üblicherweise auf beeinträchtigte Leberfunktionen hin.
  • Die Ergebnisse der Behandlung mit HHT888-45 sind in Tabelle 6 dargestellt. Bei allen sieben (7) behandelten Patienten gingen die Werte der Serum-Leberenzyme von den erhöhten Konzentrationen (SGOT von 48 bis 166 Einheiten/mL und SGPT von 41 bis 291 Einheiten/mL) im Wesentlichen auf den Normalbereich (SGOT von 8 bis 40 Einheiten/mL und SGPT von 5 bis 35 Einheiten/mL) nach 17 bis 178 Tagen der Behandlung zurück. Demzufolge gingen die Leberfunktionen von den Patienten auf ihren normalen Zustand nach der Einnahme von der erfinderischen Zusammensetzung zurück. TABELLE 6 Klinische Wirkung von HHT888-45* auf Typ-C Hepatitis-Patienten
    SGOT**, Einheit/mL SGPT**, Einheit/mL Dauer
    Patient Vorher Nachher Vorher Nachher (Tage)
    1 112 53 238 146 3
    SGOT**, Einheit/mL SGPT**, Einheit/mL Dauer
    Patient Vorher Nachher Vorher Nachher (Tage)
    30 35 64
    16 18 77
    2 81 35 103 62 9
    41 61 20
    46 67 29
    32 56 37
    21 43 53
    24 50 70
    23 43 85
    28 55 102
    23 44 117
    23 29 178
    3 117 96 179 123 8
    75 74 19
    66 69 26
    47 51 34
    55 48 42
    42 45 50
    48 40 70
    38 32 79
    30 26 88
    4 48 32 71 65 56
    30 55 70
    21 37 87
    5 83 64 67 54 8
    58 46 14
    56 40 22
    42 34 29
    38 28 36
    6 166 106 291 206 2
    71 121 16
    51 81 22
    57 89 29
    36 45 45
    SGOT**, Einheit/mL SGPT**, Einheit/mL Dauer
    Patient Vorher Nachher Vorher Nachher (Tage)
    31 36 50
    28 37 58
    22 29 64
    28 32 71
    25 27 85
    36 28 103
    23 27 113
    23 22 163
    7 30 28 41 42 9
    29 32 17
    • * Hauptsächlich Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 5(4) und Nr. 5(5) umfassend, und fallweise Nr. 4(2) und Nr. 5(8).
    • ** SGOT = Serum-Glutamat-Oxalacetat-Transferase, Normalbereich = 8–40 Einheiten/mL.
    • SGPT = Serum-Glutamat-Pyruvat-Transferase, Normalbereich = 5–35 Einheiten/mL.
  • Die Ergebnisse demonstrieren deutlich, dass die Kräutermischung HHT888-45 in der Behandlung von Hepatitis-C-Patienten wirksam ist. Um dies zu bewerkstelligen, muss der verursachende HCV-Virus ausgerottet oder auf ein erträgliches Niveau verringert werden. Da die HHT888-45-Komponenten eine sehr starke Anti-HIV in vitro-Aktivität demonstriert haben und mehrere der Komponenten eine Wirksamkeit bei der Verringerung von HBV in HBV-Trägern gezeigt haben, wird die Kräutermischung dementsprechend wirksam sein bei der Behandlung von Patienten, die mit HIV und HBV infiziert sind.
  • Es ist aus diesem Grund ein Aspekt der Erfindung, dass die antiviralen Naturheilmittel, einschließlich der Kräutermischungen der vorliegenden Erfindung und ihrer Einzelkraut-Komponenten mit verschiedenen Verhältnissen und wirksamen Dosen, in der Behandlung von Hepatitis C, Hepatitis B und anderen retroviralen Erkrankungen, wie beispielsweise AIDS, wirksam sind.
  • Da eine präzise chemische Identifizierung und der pharmakologische Mechanismus der Zusammensetzungen dieser Erfindung bis jetzt nicht untersucht worden sind, ist es möglich, dass die antivirale Aktivität auf eine einzelne Kräuterkomponente, eine Kombination an Komponenten oder die biologischen Metabolite oder Derivate daraus zurückzuführen ist. Die folgenden Beispiele untersuchen die chemische Identifizierung von den aktiven Komponenten, die in dieser Anmeldung dargestellt sind.
  • BEISPIEL 8
  • Dieses Beispiel fällt nicht in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, soweit es sich auf die Kräutermischung HHT888-4 bezieht.
  • FRAKTIONIERUNG VON AKTIVEN EINZELKRAUT-KOMPONENTEN
  • Die drei (3) am meisten gegen HIV aktiven Einzelkraut-Komponenten von HHT888-5: Nr. 5(4), Nr. 5(5) und Nr. 5(8) wurden durch Wasserextraktion, C18-Festphasen-Extraktions-(SPE-) Säulenflüssig keitschromatographie (C18-SPE-LC) und C18-Säulen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (C18-HPLC) fraktioniert. Die Kräutermischung HHT888-4 wurde ebenfalls gleichzeitig zu Vergleichszwecken fraktioniert. Der Zweck war die Identifizierung der aktiven Verbindung oder der aktiven Verbindungen von jeder der Anti-HIV-aktiven Naturheilmittel oder Heilpflanzen.
  • 1. WASSEREXTRAKTION
  • Die Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(4), Nr. 5(5) und Nr. 5(8) und die Kräutermischung HHT888-4 wurden jeweils zweifach mit Wasser bei Umgebungstemperatur (etwa 25°C) mit 8 bis 10 mL Wasser pro Gramm der Materialprobe extrahiert (z. B. 5 g Pulver mit 40 mL Wasser und 50 g Pulver mit 500 ml Wasser). Die Wassersuspension wurde für fünfzehn (15) Minuten gerührt oder für eine (1) Minute auf dem Vortexer kräftig gemischt, für zehn (10) Minuten stehen lassen und wiederum auf dem Vortexer für eine (1) Minute kräftig gemischt. Der Wasserextrakt wurde von den unlöslichen Anteilen durch Zentrifugieren bei 1.500 U/min für zwanzig (20) Minuten und Filtern durch ein Whatman Nr. 4-Filter abgetrennt.
  • 2. C18-SPE-LC
  • Jeder Wasserextrakt wurde mittels C18-SPE-Säulen-Flüssigkeitschromatographie fraktioniert. Ein zehn (10) mL Aliquot von dem Extrakt wurde auf eine 10-g ISOLUTE C18(EC)-SPE Säule (von International Sorbent Technology, Ltd., Hengoed, Mid-Glamorgan, UK oder Jones Chromatography, Lakewood, Colorado, USA) geladen, die mit 50 mL Ethanol und 100 mL Wasser voräquilibriert war. Die SPE-Säule (2,6 cm Innendurchmesser mit 2,7 cm Länge, zuzüglich 60 mL Reservoir) wurde mit 10 g endverschlossenen (EC) C18-Sorptionspartikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 61 μm und einer Kohlenstoffbeladung von 19% gepackt.
  • Die beladene Säule wurde sequenziell und mittels Schwerkraft mit 90 mL Wasser, 100 mL Ethanol, 100 mL 1% HCl in Ethanol, und 50 mL 0,1% HCl in Ethanol/Wasser bei einem Volumenverhältnis von 10/90 eluiert. Das Eluat wurde in 50-mL Proben gesammelt. Die Wassereluate wurden entweder in einer Glasflasche gefriergetrocknet oder in Plastik-Wägeschalen luftgetrocknet. Die mit Ethanol, saurem Ethanol und saurem Ethano/Wasser erhaltenen Eluate wurden entsprechend in Plastik-Wageschalen luftgetrocknet. Die luftgetrockneten sauren Ethanol-(1% HCl in Ethanol) und sauren Ethanol/Wasser-Eluate (0,1% HCl in Ethanol/Wasser) wurden in 1% HCl/Ethanol und Wasser wieder aufgenommen und danach in 4-mL WISP-Fläschchen überführt und unter Stickstoff getrocknet. Die getrockneten Fraktionen von dem ersten 50 mL Wasser-Eluat (A), dem ersten 50-mL Ethanol-Eluat (B), dem ersten 50-mL 1% HCl/Ethanol-Eluat (C) und dem 50-mL 0,1% HCl/10% Ethanol/90% Wasser-Eluat (D) wurden auf ihre Anti-HIV-Aktivitäten wie kürzlich beschrieben untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben. TABELLE 7 Anti-HIV-Aktivitäten von C18-SPE-LC Fraktionen von HHT888-4E, Nr. 5(4)E, Nr. 5(5)E und Nr. 5(8)E
    Wasserextrakt C18-SPE-LC-Fraktion** % Gewicht*** Test-Konzentration Toxizität**** Anti-HIV-Aktivität*
    Tag 3 Tag 4
    HHT888-4E A 70,0 ± 4,5% 0,7 mg/mL 50–73% 98% 61%
    B 18,5 ± 1,3% 0,2 mg/mL 21–95% 100% 87%
    Wasserextrakt C18-SPE-LC-Fraktion** % Gewicht*** Test-Konzentration Toxizität**** Anti-HIV-Aktivität*
    Tag 3 Tag 4
    C 6,7 ± 2,7% 0,1 mg/mL 98% 95% 85%
    D 2,1 ± 1,5% 0,1 mg/mL 100% 42% 0%
    Nr. 5(4)E A 78,6 ± 7,6% 1,0 mg/mL 78% 99% 14%
    0,2 mg/mL 76–97% 90% 20%
    B 14,6 ± 3,9% 0,1 mg/mL 68% 80% 2%
    0,05 mg/mL > 68% 63% 0%
    C 4,1 ± 0,3% 0,1 mg/mL 91% 49% 0%
    D 3,0 ± 1,5% 0,1 mg/mL 96% 19% 0%
    Nr. 5(5)E A 73,9 ± 7,9% 1,0 mg/mL 98% 100% 100%
    0,3 mg/mL 97–98% 100% 94%
    0,3 mg/mL 85–90% 99% 99%
    0,1 mg/mL 85% 91% 86%
    B 14,6 ± 4,1% 0,1 mg/mL 48% 98% 90%
    0,07 mg/mL > 48% 99% 41%
    C 8,6 ± 1,8% 0,1 mg/mL 99% 96% 96%
    D 2,5 ± 1,7% 0,1 mg/mL 96% 25% 0%
    Nr. 5(8)E A 43,6 ± 2,6% 0,5 mg/mL 70% 93% 54%
    0,3 mg/mL 70–100% 96% 5%
    B 53,7 ± 5,0% 0,3 mg/mL 24–68% 100% 100%
    0,1 mg/mL 68% 88% 30%
    C 2,2 ± 0,9% 0,1 mg/mL 100% 49% 0%
    D 1,6 ± 0,5% 0,1 mg/mL 95% 14% 0%
    • ** %-Unterdrückung der HIV-Proliferation, basierend auf den Protein p24-Konzentrationen.
    • ** A = Wasser-Eluat; B = Ethanol-Eluat; C = 1% HCl/Ethanol-Eluat; D = 0,1% HCl/10% Ethanol/90% Wasser-Eluat.
    • *** Aus drei bis fünf Läufen bestimmt.
    • **** Toxizität in Prozent der Kontroll-Proliferation.
  • Tabelle 7 stellt die Cytotoxizität und die Testergebnisse der Anti-HIV-Aktivitäten von den C18-SPE-LC Fraktionen A, B, C und D aus HHT888-4E, Nr. 5(4)E, Nr. 5(5)E und Nr. 5(8)E dar.
  • Die durchschnittlichen Gewichts-% und die Standardabweichung von jeder C18-SPE-LC-Fraktion für den Wasserextrakt (E) von jeder Probe, der aus drei (3) bis fünf (5) Läufen bestimmt wurde, ist ebenfalls in Tabelle 7 dargestellt. Die Probenbeladung pro Säulenlauf betrug 199 bis 205 mg für HHT888-4E, 94 bis 95 mg für Nr. 5(4)E, 124 bis 130 mg für Nr. 5(5)E und 165 bis 178 mg für Nr. 5(8)E auf der Basis des Trockengewichtes.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Wassereluat-(A) und die 1% HCl/Ethanoleluat-(C) Fraktionen von Nr. 5(5)E und die 1% HCl/Ethanoleluat-Fraktion (C) von HHT888-4E die aktivsten Fraktionen (91 bis 96% Unterdrückung der MV-Proliferation an Tag 3 und 85 bis 96% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL) und nicht cytotoxisch (85 bis 99% der Kontrolle) sind. Die Luftrocknung beeinflusste nicht die Aktivität der Wassereluat-Fraktion (A) von Nr. 5(5)E. Bei Luftrocknung von Nr. 5(5)E-A wies dieses eine Aktivität von 99% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 bei 0,3 mg/mL auf und 91% Unterdrückung an Tag 3 und 86% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL. Im Vergleich dazu wies die Gefriertrocknung von Nr. 5(5)E-A eine Aktivität von 100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 bei 1,0 mg/mL auf und 100% Unterdrückung an Tag 3 und 94% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL.
  • Die Ethanoleluat-Fraktionen (B) von HHT888-4E, Nr. 5(5)E und Nr. 5(8)E wiesen ebenfalls gute Anti-HIV-Aktivitäten auf 100% Unterdrückung an Tag 3 und 87% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,2 mg/mL für HHT888-4E, 98% Unterdrückung an Tag 3 und 90% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL for Nr. 5(5)E, und 100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 und an Tag 4 bei 0,3 mg/mL für Nr. 5(8)E. Die beobachteten Aktivitäten können jedoch teilweise der Cytotoxizität zugerechnet werden: 21 bis 95% der Kontrollproliferation für HHT888-4, 48% für Nr. 5(5)E und 24 bis 68% für Nr. 5(8)E. Diese Hypothese wurde unterstützt durch die signifikante Abnahme der Aktivität, wenn die Probenkonzentration auf ein weniger cytotoxisches Niveau herabgesetzt wurde. Beispielsweise nahm die Aktivität von 90% auf 41% Inhibierung an Tag 4 für Nr. 5(5)E-B ab, wenn ihre Konzentration von 0,1 auf 0,07 mg/mL herabgesetzt wurde. Die Aktivität nahm von 100% auf 30% Inhibierung an Tag 4 für Nr. 8(5)E-B ab, wenn ihre Konzentration von 0,3 auf 0,1 mg/mL herabgesetzt wurde.
  • Die Wassereluat-Fraktionen (A) von HHT888-4E und Nr. 5(8)E wiesen eine moderate Anti-HIV-Aktivität auf: 98% Unterdrückung an Tag 3 und 61% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,7 mg/mL für HHT888-4E und 93% Unterdrückung an Tag 3 und 54% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,5 mg/mL für Nr. 5(8)E. Die beobachteten Aktivitäten können jedoch teilweise der Cytotoxizität zugerechnet werden, welche 50 bis 73% für HHT888-4E und 70% für Nr. 5(8)E betrug. Die Aktivität von Nr. 5(8)E-A nahm von 54% auf 5% an Tag 4 ab, wenn die Konzentration von 0,5 auf 0,3 mg/mL abnahm, wo das Cytotoxizitätsniveau (70–100% der Kontrolle) eher akzeptierbar war.
  • Die Wassereluat-Fraktion (A) von Nr. 5(4)E war geringfügig aktiv: 90 bis 99% Unterdrückung an Tag 3 und 14 bis 20% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,2 beziehungsweise 1,0 mg/mL. Die Ethanoleluat-Fraktion (B) von Nr. 5(4)E, die 1% HCl/Ethanoleluat-Fraktionen (C) von den Nr. 5(4)E und 5(8)E, und die 0,1% HCl/10% Ethano/90% Wassereluat-Fraktionen (D) von allen vier Proben waren bei den untersuchten Konzentrationen im Wesentlichen nicht aktiv: 14 bis 80% Unterdrückung an Tag 3 und 0 bis 2% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,05 bis 0,1 mg/mL.
  • Zusätzliche Läufe der C18-SPE-LC-Fraktionierung von Nr. 5(5)E wurden durchgeführt, um mehr Nr. 5(5)E-A- und -C-Fraktionen für die weitere Evaluierung herzustellen. Der Wasserextrakt (E) von Nr. 5(5) wurde entweder direkt auf die Säule aufgetragen (10 mL pro Säule) oder wurde zuerst gefriergetrocknet oder luftgetrocknet, wieder in Wasser aufgelöst (20 bis 80 mg/mL) und anschließend zur Fraktionierung auf die Säule geladen (5 mL pro Säule). Die Gesamtgewichts-%-Verteilung von jeder Fraktion aus diesen Läufen von Nr. 5(5)E betrug: A = 74,2 ± 6,0%, B = 12,2 ± 4,0%, C = 8,2 ± 2,1% und D = 2,1 ± 0,9%. Diese Werte stimmen gut mit den in Tabelle 7 dargestellten Werten überein.
  • 3. C18-HPLC
  • Die oben angeführte Nr. 5(5)E-A wurde durch C18-HPLC weiter fraktioniert. Eine 500,9 mg wiegende Probe wurde in 5,00 mL Wasser aufgelöst, anschließend bei 1.500 U/min für zwanzig (20) Minuten zentrifugiert, um die Lösung von den unlöslichen Anteilen abzutrennen. Der Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert, um jegliche unlöslichen Rückstände zu entfernen und wurde als wasserlösliche Fraktion (WS) bezeichnet. der Niederschlag wurde mit 5,00 mL Wasser weitere dreimal extrahiert und unter Stickstoff als die unlösliche Fraktion (WI) getrocknet. Die wasserlösliche Fraktion (WS) wurde mittels einer Gradienten-HPLC unter Verwendung einer präparativen Rainin Dynamax C18-Säule (21,4 × 250 mm, 5 μm Partikel) und der folgenden Bedingungen fraktioniert:
    Flussgeschwindigkeit: 9,00 mL/min
    Injektionsvolumen: 200 μL
    Nachweis: UV 214 nm bei 2,00 AUFS
    Gradient: Zeit Acetonitril/Wasser
    0–10 min 2/98
    10–25 min 2/98 → 98/2 (linear)
    25–30 min 98/2
    30–35 min 98/2 → 2/98 (linear)
    35–70 min 2/98
  • Die Fraktionen wurden mit Zeitintervallen von 2,5 Minuten gesammelt. Insgesamt wurden 28 Fraktionen bei 22,5 mL für jede Fraktion gesammelt. Tabelle 8 zeigt an, dass bestimmte Fraktionen vor der Durchführung des Tests vereinigt wurden.
  • Jede der oben angeführten, unter Stickstoff getrockneten C18-HPLC-Fraktionen wurde auf Anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration getestet, die zu 0,33 mg/mL des Ausgangsmaterials identisch war, d. h. die wasserlösliche Fraktion (WS) von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A. Der Zweck war, die aktive Fraktion oder die aktiven Fraktionen von der Nr. 5(5)E-A zu identifizieren, die als sehr aktiv getestet worden war: 99% Unterdrückung der HIV-Proliferation bei 0,3 mg/mL (siehe Tabelle 7). Bei der Konzentration, die zu 0,33 mg/mL von dem Ausgangsmaterial identisch war, wurde irgendeine aktive Fraktion erwartet, die ebenso eine sehr gute Aktivität von 99% Unterdrückung aufweisen würde. Der erste Wasserextrakt (WS) und der Niederschlag (WI) von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A wurden ebenfalls gleichzeitig bei 0,33 mg/mL untersucht. In Tabelle 8 sind die Testergebnisse dargestellt. Die Gewichts-% von jeder Fraktion sind in der Tabelle eingeschlossen und Fraktion 3 enthält den Hauptpeak. TABELLE 8 Anti-HIV-Aktivitäten der wasserlöslichen und der wasserunlöslichen Fraktionen der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A und der HPLC-Fraktionen von der wasserlöslichen Fraktion
    Anti-HIV-Aktivität****
    Nr. 5(5)E-A Fraktionen* % Gewicht** Toxizität*** Tag 3 Tag 4
    Wasserunlöslich (WI) 10,3% 100% 100% 100%
    Wasserlöslich (WS) 86,0% 100% 86% 63%
    WS-HPLC-F1 & 2 6,8% 86% 0% 4%
    WS-HPLC-F3 109% 73% 0% 1%
    WS-HPLC-F4 2,7% 93% 8% 0%
    WS-HPLC-F5 2,0% 100% 0% 0%
    WS-HPLC-F6 0,7% 100% 15% 0%
    WS-HPLC-F7 < 0,2% 100% 46% 0%
    WS-HPLC-F8 3,0% 100% 0% 0%
    WS-HPLC-F9 < 0,2% 100% 0% 0%
    WS-HPLC-F10 < 0,2% 87% 0% 1%
    WS-HPLC-F11 & 12 0,7% 91% 1% 1%
    WS-HPLC-F13 & 14 10% 96% 0% 0%
    WS-HPLC-F15 & 16 7,0% 89% 18% 0%
    WS-HPLC-F17 & 18 1,5% 77% 25% 3%
    WS-HPLC-F19 to 28 1,2% 80% 0% 0%
    • * WI und WS sind die wasserunlöslichen und die wasserlöslichen Fraktionen von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A.
    • WS-HPLC-F1 bis 28 sind die HPLC-Fraktionen von WS.
    • ** % Gewicht von dem Ausgangsmaterial (WS)
    • *** Toxizität in % der Kontrollproliferation.
    • **** Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration. Die Testkonzentrationen für WI und WS von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A betrugen beide 0,33 mg/mL. Die Testkonzentrationen für alle HPLC-Fraktionen von WS waren äquivalent zu 0,33 mg/mL des Ausgangsmaterials WS.
  • Tabelle 8 zeigt, dass die Fraktion WS-HPLC-F3 das meiste Material enthielt, sie war jedoch im Wesentlichen in dem Anti-HIV-Test nicht aktiv.
  • Diese Ergebnisse sind sehr überraschend. Alle C18-HPLC-Fraktionen wurden als im Wesentlichen inaktiv getestet, 0–46% Inhibierung an Tag 3 und 0–4% Inhibierung an Tag 4. Die wasserlösliche Fraktion (WS) zeigte ebenfalls eine signifikant niedrigere Aktivität (86% Unterdrückung an Tag 3 und 63% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,33 mg/mL) als erwartet. Diese Art des Aktivitätsverlustes während der Auftrennung und Reinigung von aktiven Komponenten aus Heilpflanzen ist häufig auch von anderen erfahren worden, hauptsächlich zurückzuführen auf den Verlust von synergistischen Wirkungen, wenn die Verbindungen von ihrer Matrix getrennt werden.
  • Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die aktive Komponente überraschenderweise in der wasserunlöslichen Fraktion (WI) zurückgeblieben war, anstatt in der wasserlöslichen Fraktion (WS) zu sein, wie es ursprünglich erwartet worden war. Die unlösliche Fraktion erwies sich in dem Test als sehr aktiv, 100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 bei 0,33 mg/mL. Dies bedeutet, dass die hauptsächlich aktive Komponente von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A sich in der wasserunlöslichen Fraktion (WI) anstatt in der wasserlöslichen Fraktion (WS) befindet.
  • Die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-A war ursprünglich in Wasser löslich, da sie sich in der C18-SPE-LC-Wassereluat-Fraktion befand. Sie musste während der Lufttrocknung unlöslich in Wasser geworden sein und verbleib dementsprechend in der wasserunlöslichen Fraktion. Die wasserunlösliche Fraktion musste demzufolge in dem neutralen Zellkulturmedium löslich geworden sein, um sie darin als aktiv zu testen. Dies muss der Fall sein, da die Probenlösung in dem Zellkulturmedium zentrifugiert und durch ein 0,45-μm Filter gefiltert wurde, um unlösliche Substanzen vor den Anti-HIV-Test zu entfernen.
  • BEISPIEL 9
  • IDENTIFIZIERUNG VON AKTIVEN KOMPONENTEN
  • 1. NR. 5(5)E-A
  • Der pH-Wert von dem Zellkulturmedium, das zur Auflösung von der Probe für den Anti-HIV-Test verwendet wurde, betrug 7,3 ± 0.3. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-A in einer neutralen wässrigen Lösung, wie beispielsweise dem Zellkulturmedium, löslich war, aber dass sie angesäuert wurde und somit unlöslich, in Folge des Aussetzen zur Atmosphäre und der Einwirkung von HCl-Dampf während der Lufttrocknung in einem Abzug zusammen mit den anderen C18-SPE-LC-Fraktionen, die HCl enthielten. Dies bedeutet, dass die Säureform von der aktiven Komponente von Nr. 5(5)E-A unlöslich in Wasser sein würde und ausfällt, wenn sie angesäuert wird. Die Nr. 5(5)E-A ist die C18-SPE-LC-Wassereluat-Fraktion von dem Wasserextrakt von Nr. 5(5).
  • Um diese Hypothese zu untersuchen, testeten wir die Löslichkeit von dem obigen Niederschlag (WI) aus Nr. 5(5)E-A in verschiedenen Lösemitteln. Der Niederschlag war geringfügig löslich in Wasser und sauren Ethanollösungen, wie beispielsweise 1% HCl in Ethanol und 0,1% HCl in Ethanol/Wasser (10/90, v/v) und bildete blass- bis hellgelbe Lösungen mit braunen Niederschlägen. Er war unlöslich in Methanol, Aceton und 1%-iger Salzsäure. Er war löslich, aber nur langsam, in neutraler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2), die über Nacht zu einer dunkelbraunen Lösung wurde. Er wurde schnell und vollständig in 1% Ammoniumhydroxid-Lösung (pH von 10,4) aufgelöst, die schnell zu einer dunkelbraunen Lösung wurde. Dies bestätigte die obige Hypothese, dass die aktive Komponente in neutralen oder alkalischen Lösungen löslich war, aber unlöslich in saurer Lösung.
  • Basierend auf dem Löslichkeitstest, sollte der aktive Niederschlag (WI) von Nr. 5(5)E-A eine Säure oder Säuren sein. Die Tatsache, dass er nicht löslich war in Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol), Aceton und anderen gebräuchlichen organischen Lösemitteln (Acetonitril, Chloroform and Hexan) deutet darauf hin, dass es unwahrscheinlich ist, dass der Niederschlag eine einfache organische Säure wie beispielsweise Benzoesäure ist. Die Tatsache, das er mit einer Zunahme des pH-Wertes zunehmend in wässrigen Lösungen löslicher wurde, weist auf einen Übergang von seiner Säureform zu einer löslicheren Salzform an.
  • Um eine endgültige Identifizierung der aktiven Komponente von Nr. 5(5)E-A durchzuführen, wurden drei Wassereluat-Fraktionen von Nr. 5(5)E, die unterschiedlich getrocknet wurden, mit Wasser auf demselben Weg extrahiert, wie die von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A, die für die vorangehende HPLC-Fraktionierung verwendet wurde. Eine Fraktion wurde gefriergetrocknet (FD) und die zwei anderen wurden luftgetrocknet (AD1 & AD2). AD1 und FD wurden aus demselben Wassereluat hergestellt. AD2 war dasjenige, dessen Aktivität überraschenderweise in der wasserunlösliche Fraktion (WI) gefunden wurde.
  • Jede Probe wurde in Wasser bei einer Konzentration von 100 mg/mL aufgelöst und zentrifugiert (1.500 U/min für 20 Minuten), um den löslichen Anteil von dem unlöslichen Anteil zu trennen. Bei FD und AD1 wurden 1,20 g von der jeweiligen Probe in 12,0 mL Wasser aufgelöst. Bei AD2 wurden 0,567 g in 5,67 mL Wasser gelöst. Jeder Niederschlag wurde noch dreimal mit derselben Menge Wasser extrahiert. Ein 0,40 mL Aliquot von jedem Extrakt wurde unter Stickstoff getrocknet und gewogen. Die verbliebenen Extraktmengen wurden jeweils durch ein 0,45-μm Filter filtriert, mit 1% HCl (4 mL Säure auf 10 mL Extrakt) angesäuert und zentrifugiert (2.000 U/min für 20 Minuten). Der saure Überstand (AS) wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert. Der saure Niederschlag (AP) wurde mit 10 mL 0,01% HCl (pH 2,82) zwei mal gewaschen und mit 10 mL Wasser weitere zwei mal, unter Stickstoff getrocknet und gewogen.
  • Tabelle 9 zeigt den pH-Wert von jedem Wasserextrakt von der gefriergetrockneten (FD) und den luftgetrockneten (AD1, AD2) Proben der Nr. 5(5)E-A, die Gewichts-% Verteilung von jedem Extrakt und den Niederschlag, die Bildung des sauren Niederschlags von jedem Extrakt und die Gewichts-% von den vereinigten sauren Niederschlägen von jeder Fraktion von Nr. 5(5)E-A. TABELLE 9 Wasserextrakte, Wasser-Niederschläge und saure Niederschläge von gefriergetrockneten (FD) und luftetrockneten (AD 1. AD2) Nr. 5(5)E-A Fraktionen
    Säure Säure
    Niederschlag Nr. 5(5)E-A Fraktionen* Lösung pH % Gewicht Niederschlag % Gewicht
    FD 1. Wasserextrakt 5,80 86,8% Ja 8.5%**
    2. Wasserextrakt 6,10 2,8% Etwas
    3. Extrakt 5,79 0,3% Spur
    4. Extrakt 5,85 < 0,3% Nein
    Wasser Niederschlag - 0,9% -
    AD1 1.Wasserextrakt 4,83 84,0% Ja 8,3%**
    2. Wasserextrakt 5,14 3,8% Etwas
    3. Wasserextrakt 5,53 0,8% Nein
    4. Wasserextrakt 5,44 < 0,3% Nein
    Wasser Niederschlag - 3,1% -
    AD2 1. Wasserextrakt 3,21 77,3 ± 3,2% Nein 0,3%***
    Säure Säure
    Niederschlag Nr. 5 (5)E-A Fraktionen* Lösung pH % Gewicht Niederschlag % Gewicht
    2. Wasserextrakt 3,51 6,9 ± 0,8% Nein
    3. Wasserextrakt 3,87 0,8 ± 0,4% Etwas
    Wasser Niederschlag - 9,4 ± 1,3% -
    • * Bei 100 mg/mL von Nr. 5(5)E-A in Wasser.
    • ** Saurer Niederschlag aus dem 1. und 2. Extrakt kombiniert.
    • *** Saurer Niederschlag aus dem 3. und 4. Extrakt kombiniert.
  • Es wurde deutlich gezeigt, dass die Wasserextrakte von AD2 (pH 3,2–3,9) saurer waren als diejenigen von AD1 (pH-Werte 4,8–5,5) und FD (pH-Werte 5,8–6,1) Die Probe von AD2 enthielt mehr unlösliche Substanz (9,4%) als die AD1 (3,1%) und FD (0,9%). Je saurer die Wasserextrakte waren, desto größer war die Menge von der unlöslichen Substanz, die isoliert wurde.
  • Wenn die Wasserextrakte angesäuert wurden, bildeten die ersten und zweiten Extrakte von FD und AD1 einen Niederschlag, während diejenigen von AD2 es nicht taten. Stattdessen wurde etwas Niederschlag in den 3. und 4. Extrakten von AD2 gebildet, dessen ursprünglicher pH-Wert bei pH 3,9 lag. Eine Spur an Niederschlag wurde in dem angesäuerten 3. Extrakt von FD beobachtet, während kein Niederschlag in dem 4. Extrakt von FD und dem 3. und 4. Extrakt von AD 1 beobachtet wurde.
  • Dies weist darauf hin, dass der aktive Niederschlag in Wasser bei pH 3,2–3,5 unlöslich war, leicht löslich bei pH 3,9 und bei pH 4,8 und darüber löslich wurde. Das meiste von FD war in Wasser löslich, da dessen Lösung einen pH-Wert von 5,8–6,1 besaß. Nur 0,9% verblieben ungelöst zurück. AD1, dessen Lösung einen pH-Wert von 4,8–5,5 besaß, enthielt ein wenig mehr unlösliches Material oder Niederschlag, 3,1%. AD2, dessen Lösung einen pH-Wert von 3,2–3,9 besaß, enthielt noch mehr unlösliches Material oder Niederschag, 9,4%. Wenn die Wasserextrakte von FD und AD1 angesäuert wurden, bildete sich ein Niederschlag (8,3–8,5%). Der Gesamtniederschlag von FD (9,4) oder AD1 (11,4%) war vergleichbar zu dem von AD2 (9,7%). Die Gewichts-% von dem Säureüberstand aus dem ersten Extrakt von der gefriergetrockneten Nr. 5(5)E-A oder von FD betrug 78,4%, was den Abgleich von dem Material berücksichtigt.
  • Der erste Wasserextrakt und der Niederschlag von FD sowie der saure Überstand und der saure Niederschlag von dem ersten Wasserextrakt aus FD wurden auf ihre Anti-HIV-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse, die in Tabelle 10 dargestellt sind, weisen eindeutig darauf hin, dass die aktive Komponente von FD oder der gefriergetrockneten Nr. 5(5)E-A ursprünglich in Wasser löslich und durch Säure ausfällbar war. Die Hauptaktivität von FD war in dem Wasserextrakt (89% Unterdrückung an Tag 3 und 96% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL) und nicht in dem Niederschlag (13% Unterdrückung sowohl an Tag 3 und an Tag 4 bei 0,3 mg/mL). Die Hauptaktivität von dem Wasserextrakt wiederum war in dem sauren Niederschlag (97% Unterdrückung an Tag 3 und 98% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL) und nicht in dem sauren Überstand (4% Unterdrückung an Tag 3 und 22% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL). Der cytotoxische Faktor von dem Wasserextrakt (Cytotoxizität: 75% der Kontrolle bei 0,3 mg/mL) verblieb offensichtlich gelöst in der Säure (Cytotoxizität: 60% der Kontrolle bei 0,3 mg/mL) und war von dem aktiven sauren Niederschlag (Cytotoxizität: 90% der Kontrolle bei 0.3 mg/mL) abtrennbar. TABELLE 10
    Anti-HIV-Aktivitäten von den gefriergetrockneten Nr. 5(5)E-A (FD) Fraktionen
    FD Fraktionen % Gewicht Test-Konzentration Toxizität* Anti-HIV-Aktivität**
    (mg/mL) Tag 3 Tag 4
    1. Wasserextrakt 86,8% 0,3 75% 89% 96%
    Wasser Niederschlag 0,9% 0,3 90% 13% 13%
    1. Wasserextrakt 78,4% 0,3 60% 4% 22%
    HCl Überstand
    1. Wasserextrakt 8,5% 0,3 90% 97% 98%
    HCl Niederschlag
    • * Toxizität in % der Kontrollproliferation.
    • ** Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration.
  • Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die aktive Komponente von der gefriergetrockneten Nr. 5(5)E-A im Wesentlichen dieselbe war, wie die von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A, und dass beide in Säure unlöslich sind. Wenn Nr. 5(5)E-A gefriergetrocknet wurde, verblieb die aktive Komponente löslich in Wasser und wurde unlöslich, wenn die Lösung angesäuert wurde. Wenn Nr. 5(5)E-A luftgetrocknet wurde, wurde ein Anteil oder alles von der aktiven Komponente angesäuert und wurde unlöslich, wie in dem Fall von AD1 und AD2. Die Quelle für die Säure war der Salzsäuredampf aus den sauren Ethanol/Wasser-Fraktionen, da die Wasser- und Ethanoleluate (A und B) zusammen mit den sauren Ethanol/Wasser-Eluaten (C und D) in demselben Abzug getrocknet wurden.
  • Um diese Hypothese nachzuprüfen, wurde der aktive Wasser-Niederschlag von AD2 in einer neutralen und einer basischen Lösung erneut aufgelöst und mit Säure wiederum ausgefällt. Dementsprechend wurden zwei 50-mg Proben von jedem Niederschlag in 40 mL PBS-Puffer (pH 7,2) oder in einer basischen 1%-igen NH4OH-Lösung (pH 10,4) aufgelöst. Die Auflösung von der Probe war in PBS-Puffer langsam und in der 1%-igen Ammoniumhydroxid-Lösung schnell. Beide Proben wurden nicht vollständig aufgelöst, selbst wenn sie über Nacht in einem Kühlschrank gelagert wurden. Die Lösungen wurden anschließend bei 1.500 bis 2.000 U/min für 40 Minuten zentrifugiert, um die löslichen Anteile von den unlöslichen Rückständen zu trennen. Jeder Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert. Jeder braune Niederschlag wurde mit 10 mL seines entsprechenden Lösemittels und danach mit 10 mL Wasser gewaschen. Die Waschlösungen wurden durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 20 Minuten abgetrennt und verworfen. Jeder gewaschene Niederschlag und ein 4,00 mL Aliquot von jedem filtrierten Überstand wurden unter Stickstoff getrocknet und gewogen. Als Korrektur für den Lösemittel-Blindwert von dem PBS-Überstand wurden ebenfalls 4,00 mL PBS-Puffer gleichzeitig getrocknet.
  • Von jedem der Überstände wurden zwei 17,0-mL Aliquots in getrennte 50-mL Zentrifugenröhrchen pipettiert. Ein Aliquot wurde durch Titration mit 1%-iger HCl angesäuert, bis sich ein Niederschlag bildete. Das andere wurde zuerst angesäuert durch Titration mit 1%-iger Essigsäure und dann mit 1%-iger HCl, bis sich ein Niederschlag bildete. Die Titration mit 1%-iger Essigsäure alleine war nicht ausreichend, um den pH-Wert der Lösung weit genug zu erniedrigen, damit sich ein Niederschlag bilden konnte. Der pH-Wert der Lösung, die mit 1%-iger Essigsäure titriert wurde, pendelte sich bei einem pH-Wert von 3,4 bis 3,8 ohne erkennbare Bildung von einem Niederschlag ein. Die Zugabe von 1%-iger HCl wurde benötigt, um den pH-Wert der Lösung auf etwa 1,5 bis 1.8 zu erniedrigen, um einen Niederschlag zu bilden. Ein sichtbarer Niederschlag begann sich bei einem pH-Wert der Lösung um pH 2,2 bis 2,5 zu bilden. Wenn die Überstände mit 1%-iger HCl titriert wurden, wurden die pH-Werte der Lösungen auf 1,4 bis 1,5 erniedrigt und die Niederschläge begannen sich zu bilden. Bei der Titration mit HCl begann sich der Niederschlag bei einem pH-Wert um pH 2,3 in den PBS-Überständen und um pH 3,3 in den NH4OH-Überständen zu bilden.
  • Der saure Überstand wurde von dem sauren Niederschlag durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 20 Minuten abgetrennt. Jeder saure Überstand (AS) wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert und unter Stickstoff getrocknet. Jeder saure Niederschlag (AP) wurde einmal mit 5 mL 1%-iger HCl gewaschen und unter Stickstoff getrocknet. Der PBS-Überstand und der PBS-Niederschlag, der saure (HCl) Überstand und der Niederschlag von dem PBS-Überstand sowie der saure (HCl) Niederschlag von dem NH4OH Überstand wurden auf ihre Anti-HIV-Aktivitäten untersucht. Die Ergebnisse skid in Tabelle 11 wiedergegeben. TABELLE 11 Anti-HIV-Aktivitäten der Fraktionen von der aktiven luftgetrockneten Nr. 5(5)E-A, wasserunlöslichen Fraktion (AD2-WI)
    AD2-WI Fraktionen % Gewicht Test-Konzentration Toxizität* Anti-HIV-Aktivität**
    (mg/mL) Tag 3 Tag 4
    PBS Überstand 72,3% 0,3 100% 94% 98%
    PBS Niederschlag 28,9% 0,3 74% 26% 34%
    PBS Überstand 47,9% 0,3 50% 60% 65%
    HCl Überstand
    PBS Überstand 52,8% 0,3 100% 83% 92%
    HCl Niederschlag
    NH4OH Überstand 50.2% 0.3 92% 93% 97%
    HCl Niederschlag
    • * Toxizität in % der Kontroll-Proliferation.
    • ** Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration.
  • Die Ergebnisse weisen eindeutig nach, dass die aktive Komponente von AD2-WI in PBS bei pH 7,2 und in einer 1%-igen NH4OH-Lösung bei pH 10,4 löslich ist und durch Säure ausfällbar. Der PBS-Überstand von AD2-WI war sehr aktiv (94% Unterdrückung an Tag 3 und 98% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL), während hingegen der PBS-Niederschlag nur geringfügig aktiv war (26% Unterdrückung an Tag 3 und 34% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL). Dies stimmt mit der beobachteten Aktivität von AD2-WI überein, dessen aktive Komponente in dem neutralen Zellkulturmedium für den Anti-HIV-Test gelöst werden musste.
  • Die aktive Komponente von AD2-W1 wurde erneut durch HCl ausgefällt. Der HCl-Niederschlag von dem PBS-Überstand von AD2-WI war ziemlich aktiv (83% Unterdrückung an Tag 3 und 92% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL), während hingegen der HCl-Überstand nur moderat aktiv war (60% Unterdrückung an Tag 3 und 65% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL). Die moderate Aktivität von dem HCl-Überstand kann teilweise auf seine Cytotoxizität zurückzuführen sein (50% der Kontrollproliferation). Die Ausfällbarkeit von der aktiven Komponente von AD2-WI durch Säure wurde ferner bestätigt durch den HCl-Niederschlag von dem NH4OH-Überstand von AD2-WI, welcher sehr aktiv war (93% Unterdrückung an Tag 3 und 97% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL).
  • Aus dieser Information kann geschlossen werden, dass die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-A in neutralen oder basischen Lösungen löslich ist und durch Säuren, wie beispielsweise HCl, ausfällbar. Essigsäure, die nur in der Lage ist, den pH-Wert der Lösung auf etwa 3,4 bis 3,8 zu erniedrigen, ist nicht stark genug, um eine Ausfällung von der aktiven Komponente zu verursachen. Dies bedeutet, die aktive Komponente in ihrer Säureform ist stärker als Essigsäure und schwacher als Salzsäure. Wenn sie mit einer Base, wie beispielsweise NH4OH, neutralisiert wird, wird die aktive unlösliche Säure zu einem wasserlöslichen Salz, welches ebenfalls gegen HIV aktiv ist.
  • Mehr von der aktiven Komponente wurde durch Säureausfällung aus dem wässrigen Eluat Nr. 5(5)E-A „wie vorliegend" oder den Wasserextrakten der gefriergetrockneten Nr. 5(5)E-A durch Titration mit 1%-iger 140 hergestellt. Der Säureniederschlag wurde mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Säureniederschlag wurde weiter gereinigt durch Auflösen in 0,1 N Ammoniumbicarbonat-Lösung (NH4HCO3) und durch erneutes Ausfällen mit dem 1,5-fachen Volumen von 1% HCl in Wasser. Beispielsweise wurde eine 520,8 mg wiegende Probe vollständig in 20 mL 0,1 N NH4HCO3 aufgelöst. Die Lösung wurde bei 2.000 U/min für 22 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert. Ein Aliquot von der Lösung wurde mit 0,1 N NH4HCO3 auf 20,0 mL bei 18,7 mg/mL, das anschließend mit 30 mL 1%-iger HCl in Wasser angesäuert wurde und eine dunkelbraune, flockige Suspension und einen dunkelbraunen Niederschlag bildete. Die angesäuerte Lösung wurde bei 2.000 U/min für 22 Minuten zentrifugiert. Der saure Überstand wurde abgegossen und verworfen. Der saure Niederschlag wurde mit 30 bis 45 mL 1%-iger HCl in Wasser sechs mal gewaschen. Die sauren Waschlösungen wurden jeweils von dem sauren Niederschlag durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 22 Minuten abgetrennt und verworfen. Der einmal gereinigte saure Niederschlag (AP1X) wurde gefriergetrocknet und auf Anti-HIV-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass der AP1X von Nr. 5(5)E-A aktiv blieb: 75% Unterdrückung an Tag 3 und 87% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,31 mg/mL. Das bedeutet, die Anti-HIV-Aktivität überlebte den Reinigungsprozess.
  • 2. Nr. 5(5)E-A
  • Da die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-A als diejenige identifiziert wurde, die in neutralen und basischen Lösungen löslich ist und durch HCl ausfällbar, war es logisch, nachzusehen, ob die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-C ähnliche Eigenschaften besitzt.
  • Die luftgetrocknete Nr. 5(5)E-C enthielt zwei unterschiedlich gefärbte Feststoffe, einen braunen und einen dunkelbraunen bis fast schwarzen. Ein Löslichkeitstest wurden mittels Mischen von 1,1 – 1,2 mg der Probe in einem (1) mL von jedem untersuchten Lösemittel durchgeführt. Die luftgetrocknete Nr. 5(5)E-C war unlöslich in Ethanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril, Chloroform und Hexan. Der Niederschlag war ein bisschen löslich in Methanol und teilweise löslich in Wasser, 1% HCl in Wasser, 1% HCl in Ethanol und 0,1% HCl in 10% Ethano/90% Wasser. Er war größtenteils löslich in PBS, 0,1 N NH4HCO3, 1% NH4OH und 1% NaOH in Wasser mit einer geringen Menge an cremefarbener Lösung oder Niederschlag. Die Löslichkeit schien schrittweise zuzunehmen, wenn der pH-Wert der Lösung sich von sauer zu neutral zu leicht alkalisch änderte, und um dann in einer starken Base wie 1%-ige NaOH in Wasser wieder abzunehmen.
  • Die 1-mL Lösungen von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C in Wasser, PBS, 0,1 N NH4HCO3, 1% NH4OH und 1% NaOH wurden jeweils durch ein 0,45-μm Filter filtriert und mit 1,5 mL 1%-ige HCl in Wasser angesäuert. Alle angesäuerten Lösungen wurden zu gelblich-braunen bis braunen Lösungen und bildeten braune, flockige Niederschläge, mit Ausnahme von der angesäuerten Wasserlösung, in der kein Niederschlag beobachtet wurde.
  • Darüber hinaus wurden die 1-mL Lösungen von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C in 1% HCl/Wasser und 1% HCl/Ethanol jeweils durch ein 0,45-μm Filter filtriert und mit 1,5 mL 1%-iger NaOH gemischt, um die Lösung alkalisch zu machen. Die Zielsetzung war, zu sehen, ob diese Lösungen unlösliche Basen enthielten. Die alkalisierte 1% HCl/Wasser-Lösung wurde zu einer klar gelben Lösung und die alkalisierte 1% HCl/Ethanol-Lösung wurde zu einer gelblich-braunen bis braunen Lösung. In beiden Lösungen bildete sich nach Lagerung in einem Kühlschrank über Nacht etwas goldbrauner, flockiger Niederschlag. Die braune 1-mL Lösung von Nr. 5(5)E-C in 0,1% HCl/10% Ethanol/90% Wasser wurde ebenfalls auf demselben Weg alkalisiert, aber durch Zugabe von 1,5 mL 1% NH4OH-Lösung. Die braune Lösung wurde nach der Alkalisierung zu einer hellgelben klaren Lösung. Es bildete sich kein Niederschlag bei Lagerung über Nacht im Kühlschrank. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die sauren und die basischen Substanzen von Nr, 5(5)E-C durch Ausfällurig mit einer starken Säure beziehungsweise einer starken Base getrennt werden können.
  • Eine 100,4 mg wiegende luftgetrocknete Probe von Nr. 5(5)E-C wurde in 20,0 mL 0,1 N NH4HCO3 gelöst. Die Lösung wurde bei 2.000 U/min für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde in ein separates 50-mL Zentrifugenröhrchen überführt. Der Niederschlag wurde noch zweimal mit 15,0 mL 0,1 N NH4HCO3 extrahiert. Die Überstände wurden vereinigt (gesamt 50 mL). Der Niederschlag wurde ein weiteres Mal mit 15 mL 0,1 N NH4HCO3 gewaschen. Die Waschlösung wurde durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten abgetrennt und verworfen. Der Niederschlag wurde in ein WISP-Glasfläschchen mit 1 bis 2 mL Wasser überführt, unter Stickstoff getrocknet und 0,5 mg nach dem Trocknen abgewogen, oder 0,5% von dem luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C Ausgangsmaterial.
  • Der Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter filtriert. Von dem gefilterten Überstand wurden zwei 20,0-mL Aliquots in zwei getrennte 50-mL Zentrifugenröhrchen pipettiert. Das erste 20-mL Aliquot wurde mit 30 mL 1%-ige HCl in Wasser angesäuert und bildete einen flockigen Niederschlag. Das zweite 20-mL Aliquot wurde mit 30 mL 1% NaOH alkalisch gemacht. Die alkalisierte Lösung blieb klar und mit keiner sichtbaren Suspension oder Niederschlag nach Lagerung im Kühlschrank über Nacht. Die alkalisierte Lösung blieb ebenfalls klar nach Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten oder Konzentrierung von 50 mL auf 14 mL und anschließender Zentrifugation. Die Zugabe von zusätzlichen 20 mL 1 N NaOH, um sicherzustellen, dass die Lösung alkalisch war (pH 13,23 bei 22,5°C) rief keinen sichtbaren Niederschlag hervor.
  • Die angesäuerte Lösung wurde bei 2.000 U/min für 30 Minuten zentrifugiert, um den flockigen sauren Niederschlag abzutrennen. Der saure Niederschlag wurde mit 20 mL 1%-iger HCl in Wasser drei mal gewaschen. Jede Waschlösung wurde durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten abgetrennt und verworfen. Der gewaschene saure Niederschlag wurde gefriergetrocknet, auf Anti-HIV-Aktivität untersucht und als aktiv gefunden: 76% Unterdrückung sowohl an Tag 3 und an Tag 4 bei 0,3 mg/mL.
  • Die luftgetrocknete Nr. 5(5)E-C wurde wieder durch direktes Auflösen in 1%-iger HCl in Wasser fraktioniert, um die säureausfällbare aktive Komponente herzustellen. Der saure Überstand wurde alkalisch gemacht, um die basisch-ausfällbare Komponente herzustellen. Eine 203, 8 mg wiegende Luftgetrocknete Nr. 5(5)E-C-Probe wurde in 20 mL 1%-iger HCl in Wasser durch kräftiges Mischen der Suspension auf dem Vortexer für eine (1) Minute drei mal geschüttelt. Der säurelösliche Anteil wurde von dem säureunlöslichen Anteil durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten abgetrennt. Der saure Überstand (rötlich braune Lösung) wurde durch ein 0,22-μm Filter filtriert. Ein 2,00-mL Aliquot von dem sauren Überstand wurde unter Stickstoff getrocknet und 12,2 mg abgewogen, oder 59,9% von dem luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C Ausgangsmaterial. Die verbleibenden 18 mL von dem sauren Überstand wurden mit 7,5 mL 1 N NaOH alkalisiert. Es bildete sich ein Niederschlag nach Kühlen in einem Kühlschrank für ungefähr 5 Minuten. Der basische Niederschlag wurde von dem basischen Überstand durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 60 Minuten abgetrennt. Der basische Überstand wurde durch ein 0,22-μm Filter filtriert und mit 5,0 mL 1%-iger HCl in Wasser auf pH 3,7 neutralisiert (klare braune Lösung). Ein 3,00 mL Aliquot von dem neutralisierten basischen Überstand wurde unter Stickstoff getrocknet und 54,5 mg abgewogen.
  • Die säureunlösliche Fraktion von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C wurde mit 20 mL 1&-iger HCl in Wasser zweimal gewaschen. Der basische Niederschlag wurde einmal mit 20 mL 1%-iger NaOH gewaschen. Die gewaschene säureunlösliche Fraktion und der basische Niederschlag wurden gefriergetrocknet und 66,6 mg, beziehungsweise 18,6 mg abgewogen, oder 32,7% und 10,1% von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C.
  • Die getrocknete säureunlösliche Fraktion, die säurelösliche Fraktion, der basische Niederschlag und der neutralisiert basische Überstand wurden auf Anti-HIV-Aktivität zusammen mit dem Ausgangsmaterial, der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C, untersucht.. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt, wobei ebenfalls die Gewichts-% von jeder Fraktion von Nr. 5(5)E-C gezeigt sind. TABELLE 12 Anti-HIV-Aktivitäten von den luftetrockneten Nr. 5(5)E-C Fraktionen
    Nr. 5(5)E-C Fraktionen Gew.-% Test-Konzentration Toxizität** Anti-HIV-Aktivität*
    (mg/mL) Tag 3 Tag 4
    Nr. 5(5)E-C 100% 0,31 89% 78% 76%
    Säureunlöslich 32,7% 0,30 91% 84% 85%
    Säurelöslich 59,9% 0,31 92% 12% 19%
    Basischer Niederschlag 10,1% 0,31 90% 16% 20%
    Basischer Überstand*** 57,9% 0,30 99% 12% 10%
    • * Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration. Die Daten sind wiederholte Ergebnisse unter Verwendung von Probenlösungen die für drei Monate gefroren gelagert waren.
    • ** Toxizität in % der Kontroll-Proliferation.
    • *** Neutralisiert mit 1%-iger HCl in Wasser auf pH 3,7 und unter Stickstoff getrocknet. Die angegebenen Gewichts-% schließen NaCl nicht ein. Die Testprobe enthielt 19,5% der Nr. 5(5)E-C-Fraktion.
  • Die Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass die säureunlösliche Fraktion den Hauptteil der aktiven Komponente von der luftgetrockneten Nr. 5(5)E-C enthält. Die säureunlösliche Fraktion war ziemlich aktiv: 84% Unterdrückung an Tag 3 und 85% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,30 mg/mL. Die säurelösliche Fraktion war nur geringfügig aktiv: 12% Unterdrückung an Tag 3 und 19% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,31 mg/mL. Sowohl der basische Niederschlag als auch der basische Überstand von der säurelöslichen Fraktion von Nr. 5(5)E-C waren ebenfalls nur geringfügig aktiv: 12 bis 16% Unterdrückung an Tag 3 und 10 bis 20% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,30 bis 0,31 mg/mL.
  • Es wird deshalb gefolgert, dass die aktive Komponente von Nr. 5(5)E-C, ähnlich wie die von Nr. 5(5)E-A ebenfalls in neutralen bis leicht basischen Lösungen löslich ist, aber unlöslich in stark sauren Lösungen.
  • 3. Nr. 5(5)E
  • Da die aktiven Komponenten sowohl von den aktiven C18-SPE-LC-Fraktionen A und C von Nr. 5(5)E (Tabelle 7) ähnliche Löslichkeitseigenschaften aufweisen (löslich in neutralen bis basischen Lösungen und ausfällbar mit einer starken Säure), können dementsprechend die hauptsächlich aktiven Komponenten von Nr. 5(5)E direkt durch saure Ausfällung aus dem Wasserextrakt von Nr. 5(5) dargestellt werden. Der saure Niederschlag kann dann weiter gereinigt werden durch Wiederauflösung in 0,1 N NH4HCO3 und erneuter ein- oder zweimaliger Ausfällung mit Salzsäure. Die NH4HCO3-Lösung von dem sauren Niederschlag wurde einmal durch ein 0,22-μm oder 0,45-μm Filter während einem der Reinigungszyklen filtriert, um zurückgebliebene unlösliche Partikel zu entfernen.
  • Ein sechs-(6) fach gereinigter saurer Niederschlag von Nr. 5(5)E, oder Nr. 5(5)E-AP6X, wurde auf seine Anti-HIV-Aktivität untersucht und es wurde gefunden, dass er sehr aktiv blieb, 99% Unterdrückung an Tag 3 und 97% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL, wie in Tabelle 13 gezeigt. Die Anti-HIV-Aktivitäten von Nr. 5(5) und der Original-Nr. 5(5)E sind zum Vergleich gezeigt. Die prozentuale (%) Ausbeute von Nr. 5(5)E-AP6X aus zwei Bestimmungen ist ebenfalls aufgelistet. TABELLE 13 Anti-HIV-Aktivitäten von wasserextrahierbaren (E), mit Säure fällbaren (AP) und säurelöslichen (AS) Fraktionen von Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11), G und H.
    Probe Lot % Ausbeute** Test-Konzentration Toxizität*** Anti-HIV-Aktivität*
    Tag 3 Tag 4
    Nr. 4(2) 1 100% 2,5 mg/mL 74–84% 92% 94%
    Nr. 4(2)E 1 23,7% 0,5 mg/mL 68% 62% 0%
    Nr. 4(2)E-AP 0,39% 0,1 mg/mL 100% 83% 83%
    Nr. 4(2)E-AS 23,3% 0,25 mg/mL 69–90% 0% 0%
    Nr. 4(3) 100% 2,5 mg/mL 75–78% 100% 100%
    Nr. 4(3)E 55,3% 0,5 mg/mL 92% 97% 89%
    Nr. 4(4) 100% 2,5 mg/mL 74–100% 100% 100%
    Nr. 4(4)E 22,0% 0,5 mg/mL 67% 100% 100%
    Nr. 4(4)E-AP 2,1% 0,1 mg/mL 69% 85% 95%
    Nr. 4(4)E-AS 19,9% 0,25 mg/mL 75–100% 91% 82%
    Nr. 4(5) 100% 2,5 mg/mL 41–79% 98% 92%
    Nr. 4(5)E 21,9% 0,5 mg/mL 97% 57% 5%
    Nr. 4(5)E-AP 0,19% 0,3 mg/mL 86–94% 86% 80%
    Nr. 4(5)E-AS 21,7% 0,25 mg/mL 91–96% 4% 1%
    Nr. 5(1) 1 100% 2,5 mg/mL 98% 73% 50%
    Nr. 5(1)E 1 7,4 ± 0,3% 10,5 mg/mL 100% 37% 0%
    Nr. 5(1)E-AP 1 0,30% 0,3 mg/mL 85–94% 62% 74%
    Nr. 5(4) 1 100% 2,5 mg/mL 64% 100% 100%
    Nr. 5(4)E 1 12,8 ± 1,6% 0,5 mg/mL 85% 52% 0%
    Nr. 5(5) 1 100% 2,5 mg/mL 80–84% 93% 93%
    Original-Nr. 5(5)E 1 18,7 ± 2,8% 1,0 mg/mL 99% 91% 97%
    Nr. 5(5)E-AP6X 2 1,6 ± 0,1% 0,25 mg/mL 63–98% 99% 97%
    Nr. 5(8) 1 100% 2.5 mg/mL 32–59% 100% 100%
    Nr. 5(8)E 1 22,3 ± 3,1% 0,5 mg/mL 69% 2% 24%
    Nr. 5(8)E-AP 1 0,26% 0,1 mg/mL 100% 45% 61%
    Nr. 5(11) 1 100% 2,5 mg/mL 100% 92% 74%
    Nr. 5(11)E 1 53,8% 2,0 mg/mL 74–94% 87% 73%
    Nr. 5(11)-AP 1 4,36% 0,3 mg/mL 73–100% 91% 87%
    Nr. 5(11)-AS 1 49,4% 0,5 mg/mL 100% 84% 65%
    GE-AP 1 1,0% 0,30 mg/mL 33% 100% 100%
    GE-AP6X 1 0,50% 0,25 mg/mL, 66–93% 100% 99%
    HE-AP 1 - 0,30 mg/mL 83% 85% 88%
    HE-AS 1 - 0,25 mg/mL 87–91% 24% 0%
    HE-AP1X 2 0.30 ± 0.06% 0.25 mg/mL 93–100% 95% 90%
    • * Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration.
    • ** Aus Einzelbestimmungen, mit Ausnahme derjenigen mit ± Standardabweichung, die aus 2 bis 3 Bestimmungen berechnet wurden.
    • *** Toxizität in % der Kontroll-Proliferation.
  • 4. GE
  • Die Herkunftspflanze G von Nr. 5(5) wurde untersucht, um zu sehen, ob dieselbe mit Säure fällbare, gegen HIV aktive Komponente unmittelbar aus der Pflanze isoliert werden kann. Die getrocknete Pflanze G wurde von einem lokalen Kräutergeschäft in Taiwan bezogen. Ein 100,8 g wiegende Probe wurde „wie vorliegend" zweimal mit Wasser durch Kochen der ganzen getrockneten Pflanze in 2.900 mL Wasser für jeweils 75 – 76 Minuten extrahiert. Der erste (~500 mL nach Verdampfung) und der zweite (~120 mL nach Verdampfung) Extrakt wurden von dem Rückstand entsprechend durch Dekantieren und Filtrieren durch ein Whatman Nr. 4 Filterpapier abgetrennt. Der erste Extrakt wurde mit 400 mL 1%-iger HCl in Wasser angesäuert und der zweite Extrakt wurde mit 145 mL 1%-iger HCl in Wasser angesäuert. Es bildete sich in beiden angesäuerten Extrakten (pH 1,5 für den ersten und pH 1,4 für den zweiten) ein Niederschlag. Der saure Niederschlag (dunkle bis fast schwarze Festsubstanz) wurde von dem sauren Überstand durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten abgetrennt.
  • Ein Teil von dem sauren Niederschlag des ersten Extrakts wurde mit etwa 30 mL 1%-iger HCl in Wasser gewaschen, anschließend wurde die Innenwand von dem 50-mL Zentrifugenröhrchen mit etwa 15 mL Wasser gespült. Die saure Waschlösung und das Spülwasser wurden von dem sauren Niederschlag durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 30 Minuten abgetrennt und verworfen. Der saure Niederschlag wurde unter Stickstoff getrocknet (GE-AP), auf Anti-HIV-Aktivität untersucht und als sehr aktiv gefunden: 100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 und an Tag 4 bei 0,30 mg/mL (Tabelle 13). Das GE-AP ist jedoch bei diesem Level cytotoxisch, 33% der Kontrolle, und benötigt eine weitere Reinigung zur Verringerung der Cytotoxizität.
  • Es wurden daher zusätzliche Extraktionen mit kochendem Wasser und mit getrockneten Pflanzenschnitzeln, die auf eine Länge von annähernd ≤ 1 cm geschnitten wurden, durchgeführt. Die Prozent (%) extrahierbare Substanzen aus den getrockneten Pflanzenschnitzeln, bestimmt von zwei Lots der Pflanze, beliefen sich von 21 bis 27%. Die Wasserextrakte von den geschnitzelten Proben wurden mit HCl angesäuert, um saure Niederschläge herzustellen, die anschließend mit bis zu sechs Zyklen von Auslösung und Ausfällung, wie vorangehend für Nr. 5(5)E-AP6X beschrieben, gereinigt wurden. Die sechs-(6) fach gereinigte GE-AP6X wurde auf Anti-HIV-Aktivität untersucht und wurde als genauso aktiv gefunden wie Nr. 5(5)E-AP6X, wie in Table 13 gezeigt. GE-AP6X wies 100% Unterdrückung der HIV-Proliferation an Tag 3 und 99% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL auf, während Nr. 5(5)E-AP6X 99% Unterdrückung an Tag 3 und 97% Unterdrückung an Tag 4 bei derselben Konzentration aufwies. Der Cytotoxizitätstest zeigte ebenfalls eine große Gemeinsamkeit zwischen den beiden aktiven Komponenten, 66–93% der Kontrollproliferation für GE-AP6X und 63–98% für Nr. 5(5)E-AP6X derselben Konzentration von 0,25 mg/mL.
  • 5. HE
  • Die Pflanze H (Dichondra micrantha) wurde ursprünglich als die Herkunftspflanze für das Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(5) angesehen, weil die Pflanze einen chinesischen Trivialnamen besitzt, der identisch ist zu dem von dem Naturheilmittel Nr. 5(5). Sehe H. C. Chang, Medicinal Herbs II, Holiday Publishing Co., Taipei, Taiwan, R. O. C., 27 (1991). Die Pflanze H wurde dementsprechend derselben Wasserextraktion und Säureausfällung unterzogen, wie vorangehend für Pflanze G beschrieben.
  • Getrocknete, ganze Pflanzen von Dichondra micrantha (H) wurden mit kochendem Wasser wie vorangehend für die Extraktion der Pflanze G beschrieben, extrahiert. Der Wasserextrakt wurde filtriert und mit HCl angesäuert und daraufhin bildete sich ein Niederschlag. Der saure Niederschlag (HE-AP) und der saure Überstand (HE-AS) wurden auf Anti-HIV-Aktivitäten untersucht. Die Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass der saure Niederschlag HE-AP die aktive Komponente von dem Wasserextrakt der Pflanze H ist, die identische Situation wie für Pflanze G und Nr. 5(5), wie in Tabelle 13 gezeigt.
  • Der saure Niederschlag HE-AP wies eine gute Anti-HIV-Aktivität auf: 85% Unterdrückung an Tag 3 und 88% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,30 mg/mL. Der saure Überstand HE-AS war nicht aktiv: 24% Unterdrückung an Tag 3 und 0% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL. Ein einmal (1) gereinigter saurer Niederschlag HE-AP1X aus dem zweiten Lot wurde ebenfalls als aktiv getestet: 95% Unterdrückung an Tag 3 und 90% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL (Tabelle 13). Die Proben waren bei den Testkonzentrationen nicht toxisch, 83% der Kontrollproliferation für HE-AP, 93 bis 100% der Kontrolle für HE-AP1X und 87 bis 91% der Kontrolle für HE-AS.
  • 6. NR. 4(2), NR. 4(3), NR. 4(4), NR. 4(5), NR. 5(1), NR. 5(4) UND NR. 5(8)
  • Weil die aktiven Komponenten von Nr. 5(5) und der Pflanzen G und H alle mit Wasser extrahierbar und durch Säure ausfällbar sind, ist es logisch, nachzusehen, ob die aktiven Komponenten von den anderen gegen HIV aktiven Einzelkraut-Naturheilmitteln ähnliche Eigenschaften aufweisen. Die aktive Naturheilmittel wurden demzufolge überprüft, um zu sehen, ob sie mit Säure ausfällbare Komponenten enthalten, und, falls dies so ist, ob diese Komponenten aktiv sind.
  • Eine 5,0 g wiegende Probe von jedem einzelnen Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4) und Nr. 5(8) wurde zweimal mit ungefähr 40 mL Wasser in einem 50-mL Plastikzentrifugenröhrchen extrahiert. Jeder Extrakt wurde von dem unlöslichen Material durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 40 bis 120 Minuten abgetrennt. Der erste und der zweite Extrakt von jeder Probe wurden vereinigt und dann durch einen 0,22-μm Filter filtriert. Ein 2,00 mL Aliquot von jedem Extrakt wurde unter Stickstoff getrocknet und gewogen. Der verbleibende Extrakt von jeder Probe wurde mit 10 mL 1%-iger HCl in Wasser angesäuert. Es bildeten sich in allen angesäuerten Extrakten Niederschlage, ausgenommen denen von Nr. 4(3) und Nr. 5(4). Kein Niederschlag bildete sich in dem angesäuerten Extrakt von Nr. 4(3), sogar nach längerfristiger (9 Stunden) Lagerung in einem Kühlschrank und bei Zusatz von weiteren 10 mL 1%-iger HCl in Wasser. Der angesäuerte Überstand von Nr. 5(4) zeigte nur eine Eintrübung und bildete eine Spur an Niederschlag nach Zentrifugation bei 2.000 U/min für 20 Minuten.
  • Jeder saure Niederschlag wurde von seinem sauren Überstand durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 20 Minuten abgetrennt. Jeder saure Niederschlag wurde mit 5 mL 1%-iger HCl in Wasser gewaschen. Die saure Waschlösung wurde durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 20 Minuten abgetrennt und verworfen. Jeder saure Niederschlag wurde unter Stickstoff getrocknet und gewogen.
  • Jeder saure Überstand wurde nochmals mit 10 mL 1%-iger HCl in Wasser versetzt. Nachdem sie für vier (4) Tage bei Umgebungstemperatur gelagert wurden, bildeten sich wieder Niederschläge in allen weiter angesäuerten Überständen, ausgenommen bei dem von Nr. 4(3). Jeder saure Überstand wurde durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 80 Minuten von dem Niederschlag abgetrennt, durch einen 0,22-μm Filter filtriert und luftgetrocknet. Jeder getrocknete saure Überstand wurde in 0,1 N NH4HCO3 wieder aufgelöst, in ein WISP-Glasfläschchen überführt und gefriergetrocknet.
  • Die getrockneten Wasserextrakte (E), die sauren Niederschläge (AP) und die sauren Überstände (AS) von Nr. 4(2), Nr. 4(4) und Nr. 4(5) wurden auf Anti-HIV-Aktivität untersucht. Die Wasserextrakte (E) und die sauren Niederschläge (AP) von Nr. 5(1) und Nr 5(8) wurden ebenfalls getestet. Da Nr. 4(3) keinen sauren Niederschlag hatte und Nr. 5(4) nur eine winzige Menge an saurem Niederschlag (0,3 mg), wurden nur ihre Wasserextrakte (E) auf Anti-HIV-Aktivitäten getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 wiedergegeben.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Wasserextrakte (E) von Nr. 4(3) und Nr. 4(4) sehr aktiv bleiben: 97% Unterdrückung an Tag 3 und 89% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 4(3)E, und 100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 für Nr. 4(4)E bei 0,5 mg/mL. Die Aktivitäten von den Wasserextrakten (E) von Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4) und Nr. 5(8) waren jedoch überraschenderweise niedrig: 2 bis 62% Unterdrückung an Tag 3 und 0 bis 24% Unterdrückung an Tag 4 bei derselben Testkonzentration von 0,5 mg/mL. Im Vergleich dazu, besaßen die ursprünglichen Naturheilmittel-Pulver moderate bis sehr gute Aktivitäten: 73 bis 100% Unterdrückung an Tag 3 und 50 bis 100% Unterdrückung an Tag 4 bei 2,5 mg/mL.
  • Sogar noch überraschender war, dass alle sauren Niederschläge (AP) moderate bis gute Anti-HIV-Aktivitäten aufwiesen: 83% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 für Nr. 4(2)E-AP, 85% Unterdrückung an Tag 3 und 95% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 4(4)E-AP, 86% Unterdrückung an Tag 3 und 80% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 4(5)E-AP, 62% Unterdrückung an Tag 3 und 74% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(1)E-AP und 45% Unterdrückung an Tag 3 und 61% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(8)E-AP bei 0,1 bis 0,3 mg/mL. Der saue Überstand (AS) von Nr. 4(4)E war ziemlich aktiv, 91% Unterdrückung an Tag 3 und 82% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL. Die sauren Überstände (AS) von Nr. 4(2)E und Nr. 4(5)E waren gewissermaßen inaktiv: 0 bis 4% Unterdrückung an Tag 3 und 0 bis 1% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,25 mg/mL.
  • Da die Wasserextrakte (E) von Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4) und Nr. 5(8) sehr viel weniger aktiv sind als ihre Originalpulver und die sauren Niederschläge (AP) von Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1) und Nr. 5(8) ziemlich aktiv sind, ist daher die Hypothese aufgestellt worden, dass der überwiegende Teil der aktiven Komponenten von diesen Pulvern nicht wirkungsvoll genug in das Wasser (pH 4.0 bis 5,1) extrahiert worden ist. Von der Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf einen neutralen oder leicht alkalischen pH-Wert wird erwartet, dass es hilft, die Extraktion zu verbessern.
  • Es wird gefolgert, dass die aktiven Komponenten von Nr. 4(2) und Nr. 4(5) durch Säuren ausfällbar sind. Die aktive Komponente von Nr. 4(3) ist sowohl in Wasser als auch in Säure löslich. Nr. 4(4) enthält zwei aktive Komponenten, eine säurelösliche und eine mit Säure ausfällbare. Die Nr. 5(1) und die Nr. 5(8) enthalten mit Satire ausfällbare Komponenten.
  • 7. NR. 5(11)
  • Die Einzelkraut-Komponenten Nr. 5(10) und Nr. 5(11) wurden in die Kräutermischung HHT888-5 zur Behandlung von HBV-Trägern eingeschlossen (Siehe Beispiel 3). Sowohl Nr. 5(10) als auch Nr. 5(11) wurden nicht in die frühen Anti-EMuLV- und Anti-HIV-Screening-Tests eingeschlossen, um ihre potenzielle Interferenz mit den antiviralen Tests zu verhindern.
  • Die vorangehenden Entdeckungen haben gezeigt, dass alle mit Säure ausfällbaren Komponenten oder die sauren Niederschläge, die aus den Einzelkraut-Naturheilmitteln und Heilpflanzen Nr. 4(2), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8) und H isoliert wurden, gegen HIV aktiv sind. Es wird daher projiziert, dass mit Säure ausfällbare Komponenten oder saure Niederschläge, falls vorhanden, die aus anderen Naturheilmitteln oder Pflanzen isoliert wurden, ebenfalls gegen HIV aktiv sein werden.
  • Um diese Hypothese zu untersuchen, wurden die Einzelkraut-Naturheilmittel Nr. 5(10) und Nr. 5(11) mit Wasser extrahiert und ihre Wasserextrakte mit HCl angesäuert, um zu sehen, ob sich saure Niederschläge bilden werden. Eine 90,4 g wiegende Probe von Nr. 5(10) wurde zweimal mit der zwanzig-(20) fachen Menge an Wasser (1804 bis 1808 mL) bei Umgebungstemperatur extrahiert, gefolgt durch eine einmalige Extraktion mit 900 mL 0,1 N NH4HCO3. Eine 90,8 g wiegende Probe von Nr. 5(11) wurde zweimal mit der zehn-(10) fachen Menge an Wasser (908 mL) bei Umgebungstemperatur extrahiert, gefolgt durch eine einmalige Extraktion mit 870 mL 0,1 N NH4HCO3. Die Extraktionen wurden in einem 2.000-mL Erlenmeyerflasche aus Glas durchgeführt und magnetisch für eine (1) Stunde bis über Nacht gerührt. Der Extrakt wurde von dem unlöslichen Material durch Zentrifugation bei 8.000 U/min für 40 Minuten abgetrennt.
  • Wenn 1,0 mL Extrakt mit 1,5 mL 1%-iger HCl in Wasser angesäuert wurde, zeigten die zwei Wasserextrakte und der NH4HCO3-Extrakt von Nr. 5(10) keinen sichtbaren Niederschlag, sogar nicht nach Lagerung im Kühlschrank über Nacht. Der erste Wasserextrakt von Nr. 5(11) wurde braun und bildete einen Niederschlag fast unmittelbar. Der zweite Wasserextrakt von Nr. 5(11) wurde leicht gelblich und etwas trübe und bildete eine geringe Menge an Niederschlag nach Lagerung bei Umgebungstemperatur über Nacht. Der NH4HCO3-Extrakt von Nr. 5(11) wurde nahezu farblos mit einem weißen, kolloidalen Niederschlag. Es wurde prognostiziert, dass Nr. 5(11) und sein saurer Niederschlag wahrscheinlich gegen Hiv aktiv sind.
  • Ein 10,0 mL Aliquot von jedem Extrakt wurde gefriergetrocknet und gewogen. Der gesamte extrahierbare Anteil von Nr. 5(10) betrug 66,3%. Der von Nr. 5(11) betrug 53,8%. Das meiste der extrahierbaren Anteile von Nr. 5(10) wurde durch die beiden Wasserextrakte extrahiert, die 97,9% von dem gesamt extrahierbaren Anteil ausmachten. Das meiste von dem extrahierbaren Anteil von Nr. 5(11) wurde in dem ersten Wasserextrakt extrahiert (93,5%). Der zweite Wasserextrakt war nötig bei Nr. 5(10), da er 31,2% von dem gesamt extrahierbaren Anteil ausmachte. Bei Nr. 5(11) machten der zweite Wasserextrakt und die NH4HCO3-Extraktion nur 5,4%, beziehungsweise 1,1% aus.
  • Die verbleibenden 868 mL von dem ersten Wasserextrakt, 898 mL von dem zweiten Wasserextrakt und 828 mL von dem NH4HCO3-Extrakt von Nr. 5(11) wurden mit 14,6, 14,6, beziehungsweise 13,4 mL an konzentrierter HCl (37%) angesäuert. Der angesäuerte erste Wasserextrakt bildet fast unmittelbar einen Niederschlag. Der angesäuerte zweite Wasserextrakt und der NH4HCO3-Extrakt wurden trübe und bildeten bei Lagerung im Kühlschrank über Nacht einen Niederschlag. Der saure Niederschlag (AP) von jedem angesäuerten Extrakt wurde von seinem sauren Überstand (AS) durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 40 Minuten abgetrennt. Die sauren Überstände von dem ersten und dem zweiten Wasserextrakt wurden in einem 2.000-mL Erlenmeyerkolben aus Glas vereinigt. Eine 200-mL Probe von jedem der sauren Überstände von den angesäuerten Wasserextrakten und dem NH4HCO3-Extrakt wurden bei 8.000 U/min für 40 Minuten zentrifugiert und durch ein 0,22-μm Filter filtriert. Jeweils 20,0 mL von dem mikrofiltrierten sauren Überstand wurden unter Stickstoff getrocknet, wieder in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
  • Die sauren Niederschläge von Nr. 5(11)E aus den angesäuerten ersten und zweiten Wasserextrakten und dem angesäuerten NH4HCO3-Extrakt wurden zweimal mit etwa 20 bis 40 mL Wasser gespült. Die wässrigen Spüllösungen wurden durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 40 Minuten abgetrennt und verworfen. Die sauren Niederschläge wurde unter Stickstoff getrocknet und gewogen. Die prozentuale (%) Ausbeute von dem sauren Niederschlag betrug 4,36% von Nr. 5(11). Das meiste (96,3%) von dem sauren Niederschlag wurde aus dem Originalpulver durch die erste Wasserextraktion isoliert.
  • Die Nr. 5(10), Nr. 5(11), der Wasserextrakt von Nr. 5(10) oder Nr. 5(10)E, der erste Wasserextrakt von Nr. 5(11) oder Nr. 5(11)E, der saure Niederschlag von dem ersten angesäuerten Wasserextrakt von Nr. 5(11) oder Nr. 5(11)E-AP und der saure Überstand von den vereinigten angesäuerten ersten und zweiten Wasserextrakten von Nr. 5(11) oder Nr. 5(11)E-AS wurden auf Anti-HIV-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse (Tabelle 13) zeigen, dass Nr. 5(10) und sein Wasserextrakt Nr. 5(10)E im Wesentlichen nicht aktiv sind: 65% Unterdrückung an Tag 3 und 0% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(10) bei 2,5 mg/mL und 0% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 für Nr. 5(10)E bei 2,0 mg/mL. Nr. 5(11), ihr Wasserextrakt Nr. 5(11)E und der saure Überstand Nr. 5(11)E-AS besaßen eine moderate Aktivität: 92% Unterdrückung an Tag 3 und 74% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(11) bei 2,5 mg/mL; 87% Unterdrückung an Tag 3 und 73% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(11)E bei 2,0 mg/mL und 84% Unterdrückung an Tag 3 und 65% Unterdrückung an Tag 4 fair Nr. 5(10)E-AS bei 0,5 mg/mL. Der saue Niederschlag Nr. 5(11)E-AP ist wiederum ziemlich aktiv: 91% Unterdrückung an Tag 3 und 87% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,3 mg/mL.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Nr. 5(11) zwei aktive Komponenten enthält, eine ist in Saure löslich und eine ist durch Säure ausfällbar. Beide aktiven Komponenten sind aus Nr. 5(11) durch Wasser extrahierbar. Diese Ergebnisse unterstützen den zusätzlichen Aspekt der Erfindung, dass alle sauer ausfällbaren Komponenten oder saure Niederschläge von ausgewählten Pflanzen, wie sie in dieser Anmeldung aufgezählt sind, und möglicherweise von jeder Pflanze, wirksame pharmazeutische Mittel sind.
  • BEISPIEL 10
  • ISOLIERUNG VON AKTIVEN KOMPONENTEN
  • Aktive Komponenten wurden entweder von handelsüblichen Extraktpulvern oder den Pflanzen durch Extraktion mit Wasser isoliert. Vorzugsweise kann die Menge an Wasser zu getrocknetem Pflanzenmaterial von 5- bis 10-fach (w/v) reichen und es werden mindestens zwei Extraktionen durchgeführt. Der pH-Wert von der Extraktionslösung wird vorzugsweise mit einer alkalischen Lösung wie beispielsweise NaOH, auf neutral oder leicht alkalisch (7 bis 8) eingestellt, um die Extraktion zu unterstützen. Die Extraktion kann entweder bei Umgebungstemperatur (handelsübliche Pulver) oder mittels Kochen (geschnitzelte oder zerriebene Pflanzen) für eine Stunde oder länger durchgeführt werden.
  • Der lösliche Extrakt kann von dem unlöslichen Pflanzenmaterial durch Filtration (d. h. Nylonsieb und Filterpapier) oder durch Zentrifugation (2.000 bis 8.000 U/min für 40 Minuten oder länger) abgetrennt werden. Der Extrakt wird anschließend mit einer starken Säure, wie beispielsweise HCl (ungefähr 0,6% Endkonzentration oder pH-Wert der Lösung ≤ 2), angesäuert, um den aktiven sauren Niederschlag zu bilden. Der saure Niederschlag kann durch Zentrifugation, wie beispielsweise bei 8.000 U/min für 40 Minuten oder länger, abgetrennt werden. Der Niederschlag kann durch sich wiederholende Zyklen von Auflösung in neutraler oder alkalischer Lösung, wie beispielsweise 0,1 N NH4HCO3, und nachfolgender Ausfällung in Säure gereinigt werden. Die unlöslichen Anteile können durch Zentrifugation (wie beispielsweise bei 8.000 U/min für 40 Minuten oder länger) oder Mikrofiltration (wie beispielweise durch Filter von 0,2 bis 0,45 μm) entfernt werden.
  • Der gereinigte saure Niederschlag kann gefriergetrocknet, unter Stickstoff getrocknet oder luftgetrocknet werden. Er kann ebenfalls zu einem Ammoniumsalz durch Auflösung der Säure in einer Ammonium-Lösung, wie beispielsweise Ammoniumbicarbonat- oder Ammoniumhydroxid-Lösung, umgewandelt werden, das anschließend gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet werden kann. Der gereinigte saure Niederschlag kann ebenfalls in andere Salze umgewandelt werden, wie beispielsweise Natriumsalze, durch Auflösung der Säure in einer geeigneten Lösung wie beispielsweise NaHCO3. Der saure Niederschlag kann ebenfalls von der Matrix durch C18-Säulenchromatographie abgetrennt werden.
  • Chemisch verwandte, wasserextrahierbare und mit Säure ausfällbare, gegen HIV aktive Komponenten wurden aus sieben (7) von den gegen HIV aktiven Einzelkraut-Naturheilmitteln isoliert: Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11) und zwei (2) Heilpflanzen, Aeginetia indica (G) and Dichondra micrantha (H), die in den Beispielen 5 und 6 durch das vorangehend beschriebene Verfahren der Wasserextraktion und der Säurefällung identifiziert wurden.
  • Als spezifisches Beispiel wurden Nr. 4(2), Nr. 4(3), Nr. 4(4), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(4), Nr. 5(5), Nr. 5(8) und Nr. 5(11) gemäß Beispiel 2 hergestellt, zweifach mit Wasser bei Umgebungstemperatur (etwa 25°C) mit 8 bis 10 mL Wasser pro Gramm der Materialprobe extrahiert (z. B. 5 g Pulver mit 40 mL Wasser und 50 g Pulver mit 500 ml Wasser oder 100 g Pulver mit 1.000 mL Wasser). Die Wassersuspension wurde für das Extrahieren gemischt, entweder durch kräftiges Mischen für eine (1) Minute auf dem Vortexer, Stehenlassen für zehn (10) Minuten und erneutes kräftiges Mischen für eine (1) Minute auf dem Vortexer, oder durch magnetisches Rühren für fünfzehn (15) Minuten oder länger, abhängig von der Probengröße und dem Suspensionsvolumen. Beispielsweise wurde die Suspension, die 5 g Pulver in 40 mL Wasser enthält, für eine (1) Minute auf dem Vortexer kräftig gemischt, für zehn (10) Minuten stehen lassen und wiederum auf dem Vortexer für eine (1) Minute während der Extraktion kräftig gemischt. Die Suspension, die 50 bis 100 g Pulver in 500 bis 1.000 mL Wasser enthält, wurde magnetisch für fünfzehn (15) Minuten oder länger während der Extraktion gerührt. Der Wasserextrakt wurde von den unlöslichen Materialien durch Zentrifugieren bei 1.500 bis 8.000 U/min für zwanzig (20) bis vierzig (40) Minuten und Filtern durch ein Filter, wie beispielsweise ein Whatman Nr. 4-Filter, abgetrennt.
  • Die Heilpflanzen Aeginetia indica (G) and Dichondra micrantha (14), oder die Herkunftspflanzen der Naturheilmittel Nr. 5(5) und H, wurden mit kaltem Wasser gewaschen, getrocknet, zerkleinert und mit kochendem Wasser, wie vorangehend in Beispiel 2 beschrieben, extrahiert. Die Wasserextrakte wurden auf Umgebungstemperatur abgekühlt und von dem unlöslichen Pflanzenmaterial durch Dekantieren und Filtration über ein Nylonsieb (1,3 bis 1,5 mm Öffnungen), Zentrifugation bei 1.500 bis 8.000 U/min für zwanzig (20) bis vierzig (40) Minuten und erneuter Filtration durch ein Whatman Nr. 4 Filterpapier abgetrennt.
  • Die Wasserextrakte wurden anschließend angesäuert, um einen Niederschlag durch die Zugabe von Salzsäure auf einen pH-Wert von pH ≤ 2 zu bilden. Jeder saure Niederschlag wurde von der sauren Lösung durch Zentrifugation in Plastikzentrifugenröhrchen oder -flaschen abgetrennt. Jeder saure Niederschlag wurde mindestens drei mal mit Wasser oder 0,1%-iger oder 1%-iger Salzsäure gewaschen. Die Proben von dem Wasserextrakt, dem sauren Niederschlag (säureunlösliche Komponente) und dem sauren Überstand (säurelösliche Komponente) von jeder Probe wurde unter Stickstoff getrocknet, luftgetrocknet oder gefriergetrocknet. Diese Proben wurden anschließend weiteren Untersuchungen und Charakterisierungen unterworfen.
  • Die gereinigten sauren Niederschläge Nr. 5(5)E-AP1X, Nr. 5(5)E-AP6X, GE-AP1X, GE-AP2X, GE-AP6X, HE-AP1X, HE-AP6X, Nr. 4(2)E-AP1X, Nr. 5(8)E-AP1X, Nr. 5(11)E-AP1X und ihre Ammoniumsalze Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, GE-AP2X-NH4, HE-AP1X-NH4, Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 und Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 wurden dementsprechend wie vorangehend beschrieben hergestellt. Die hierin und in den Ansprüchen verwendete Nomenklatur kann in dem Folgenden veranschaulicht werden: Nr. 5(5)E-AP1X bedeutet Einzelkraut-Medizin Nr. 5(5), erhalten aus Aeginetia indica, die mit Wasser extrahiert wurde (E), säuregefällt (AP) und einmal gereinigt (1X) durch erneute Auflösung in neutraler oder alkalischer Lösung und Wiederholung der Ausfällung mit Säure, um in der endgültigen Chemikalie („chemical entity”) zu resultieren, die mit Nr. 5(5)E-AP1X bezeichnet wird.
  • Zum Beispiel wurde Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 hergestellt zunächst durch viermaliges Waschen von 4,0 bis 4,9 g Nr. 5(5)E-AP1X in 50-mL Röhrchen mit jeweils etwa 40 mL Wasser. Die wässrigen Waschlösungen wurden durch Zentrifugation bei 2.000 U/min für 40 Minuten abgetrennt und verworfen. Die mit Wasser gewaschenen AP1X wurden gefriergetrocknet (gesamt 11,4 g) und anschließend in etwa 600 mL 0,1 N bis 0.2 N NH4HCO3 aufgelöst. Die Lösung wurde bei 2.000 U/min für 40 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde durch ein 0,45-μm Filter unter Vakuum filtriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet und somit war Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 hergestellt.
  • GE-AP2X-NH4 wurde durch Auflösung von 690,8 mg GE-AP2X in 20,0 mL 0.2 N NH4HCO3 hergestellt. Die Lösung wurde bei 8.000 U/min für 40 Minuten zentrifugiert. Es wurde kein Niederschlag festgestellt. Der Überstand wurde durch ein 0,22-μm Filter filtriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet und somit war GE-AP2X-NH4 hergestellt.
  • Die anderen Proben wurden in einer ähnlichen Art und Weise hergestellt.
  • BEISPIEL 11
  • CHARAKTERISIERUNG VON AKTIVEN KOMPONENTEN
  • 1. AKTIVE KOMPONENTEN VON NR. 5(5)
  • Nr. 5(5)E-A-AP und Nr. 5(5)E-C-AP wurden vorher als die aktiven Komponenten von Nr. 5(5) identifiziert. Es scheint, dass die Verbindungen homologe polymere organische Säuren sind, basierend auf ihren Löslichkeiten, der HPSEC-, der C18-SPE-LC- und der Elementanalysen. Beide Säuren weisen ähnliche Eigenschaften auf, ausgenommen von der Molekulargewichtsverteilung und der Retention an der C18-Säule. Beide Säuren sind unlöslich in sauren wässrigen Lösungen, aber werden löslich als Salze in neutralen und basischen, wässrigen Lösungen. Sie sind stabil gegenüber Luft, Hitze, Säure, schwache Alkali und gebräuchliche organische Lösemittel.
  • Die Elementanalyse eines sechsfach gereinigten sauren Niederschlages, Nr 5(5)E-AP6X, wie in Tabelle 14 gezeigt, weist einen hohen Kohlenstoffanteil (50,98%) und einen niedrigen Aschegehalt (2,35%) auf. Dies weist darauf hin, dass Nr. 5(5)E-AP6X eine organische Säure ist. Die REM-(Raster-Elektronenmikroskopie) Röntgen-Elementanalyse der Oberfläche von Nr. 5(5)E-AP6X zeigte das Vorhandensein von Kohlenstoff, Sauerstoff, Phosphor, Chlor und Schwefel an: Es wurde kein Arsen, Blei, Quecksilber oder Eisen festgestellt. Nr. 5(5)E-AP6X und seine Komponenten Nr. 5(5)E-A-AP und Nr.
  • 5(5)E-C-AP sind jedoch alle in gebräuchlichen organischen Lösemitteln, einschließlich Ethanol, Isopropanol, Aceton, Acetonitril, Chloroform und Hexan unlöslich. Nr. 5(5)E-A-AP ist ebenfalls in Methanol unlöslich. Dies weist darauf hin, dass die aktiven sauren Niederschläge keine einfachen organischen Säuren sind. TABELLE 14 Elementanalyse und Aschegehalt von sechsfach gereinigten sauren Niederschlägen (AP6X) von Nr. 5(5)E, GE und HE
    Probe % C % H % N % S % Cl % P % Asche
    Nr. 5(5)E-AP6X 50,98 4,92 3,69 0,14 4,69 < 0,05 2,35
    GE-AP6X 46,47 5,32 5,19 1,21 4,80 0,98 0,60
    HE-AP6X 54,69 5,20 3,52 0,66 4,22 1,18 1,99
  • Alle untersuchten sauren Niederschläge (AP) sind mit einer langsamen Auflösungsgeschwindigkeit ein bisschen in Wasser löslich. Alle werden löslicher und mit schnelleren Geschwindigkeiten in einer Mischung aus Wasser und Ethanol, wie beispielsweise Wasser zu Ethanol bei einem Volumenverhältnis von 40 zu 60. Dies weist darauf hin, dass die sauren Niederschläge eine polymere Beschaffenheit besitzen, was durch die HPSEC-Analyse unterstützt wird.
  • 1 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von Nr. 5(5)E-A-AP1X und 2 zeigt das von Nr. 5(5)E-C-AP. Die Säule, die für die HPSEC-Analyse verwendet wurde war eine Varian MicroPak TSKgel-G3000 PWXL-Säule (7,8 mm ID × 30 cm L), in Serie geschaltet mit einer TSK PWXL-Vorsäule (Guard-Column)(6,0 mm ID × 4,0 cm L). Als mobile Phase wurde 0,1 N Ammoniumbicarbonat bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,8 mL/min verwendet. Die Proben wurden in der mobilen Phase bei einer Konzentration von 0,92 bis 0,93 mg/mL zubereitet. Das Injektionsvolumen betrug 100 μL. Die Ergebnisse zeigen, dass Nr. 5(5)E-A-AP1X zwei UV-Absorptionspeaks enthält, einer ist kleiner mit einer Retentionszeit von 7,55 Minuten und der andere ist größer und breit bei einer Retentionszeit vo 9,5 Minuten. Der kleinere Peak eluiert an der Vorderflanke von dem breiten Hauptpeak und enthält die größeren Moleküle. Es sind ebenfalls ein paar kleine Peaks vorhanden, die an der hinteren Flanke von dem breiten Hauptpeak laufen. Nr. 5(5)E-C-AP enthielt einen breiten UV-Hauptabsorptionspeak bei einer Retentionszeit von 9,93 Minuten, der ähnlich zu dem Hauptpeak von Nr. 5(5)E-A-AP1X ist. Nr. 5(5)E-C-AP enthielt jedoch nicht den Peak, der die großen Moleküle enthielt, wie derjenige an der Vorderflanke von dem Hauptpeak von Nr. 5(5)E-A-AP1X.
  • Nr. 5(5)E-A-AP1X und Nr. 5(5)E-C-AP wurden mittels HPSEC (Hochleistungs-Größenausschlusschromatographie) unter den Bedingungen, die vorangehend beschrieben wurden, unter Verwendung von 0,1 N NH4HCO3 als mobile Phase bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min fraktioniert. Jede Probe wurde in der mobilen Phase bei 6,1 bis 6,2 mg/mL hergestellt und bei 100 bis 200 μL pro Injektion aufgetragen. Vierundzwanzig Fraktionen wurden bei 1,25 Minuten pro Fraktion oder mit 1,00-mL Intervallen für jeden 30-Minuten-Lauf gesammelt. 3A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 3B zeigt das RI-Profil von Nr. 5(5)E-A-AP1X. 4A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 4B zeigt das RI-Profil von Nr. 5(5)E-C-AP.
  • Die HPSEC-Fraktionen von Nr. 5(5)E-A-AP1X enthalten braune Fraktionen, welche bei Fraktion 8 maximale Absorption aufweisen und stimmen mit dem breiten Hauptpeak mit der Retentionszeit von 9,55 Min auf dem UV-Profil (1) oder 9,66 Min auf dem RI-Profil (3B) überein. Die HPSEC-Fraktionen von Nr. 5(5)E-C-AP enthalten ebenfalls braune Fraktionen, welche bei Fraktion 8 und 9 maximale Absorption aufweisen und mit dem breiten Hauptpeak mit der Retentionszeit von 9,93 Min auf dem UV-Profil (2) oder 10,08 Min auf dem RI-Profil (4B) übereinstimmen. Ein 1-mL Aliquot von jeder der HPSE-Fraktionen 6 bis 14 wurde durch dasselbe HPSEC-System bei einem Injektionsvolumen von 100 μL analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass jede Fraktion eine unterschiedliche Spitzen-Retentionszeit aufweist und die Peakverbreiterung von Nr. 5(5)E-A-AP1X und Nr. 5(5)E-C-AP echt war. Nr. 5(5)E-A-AP1X und Nr. 5(5)E-C-AP waren demzufolge aus Polymeren oder Oligomeren mit einer relativ breiten Molekulargewichtsverteilung zusammengesetzt.
  • Ein 1,30-mL Aliquot von den HPSEC-Fraktionen 6 bis 16 von Nr. 5(5)E-A-AP1X wurde einzeln oder vereinigt unter Stickstoff in einem WISP-Fläschchen getrocknet. Ein 1,31-mL Aliquot von jeder der HPSEC-Fraktionen 7 bis 16 von Nr. 5(5)E-C-AP wurde ebenfalls unter Stickstoff auf dieselbe Art und Weise getrocknet. Die getrockneten Proben wurden auf ihre Anti-HIV-Aktivität bei einer Konzentration untersucht, die äquivalent zu 0,30 mg/mL von ihren entsprechenden Ausgangsmaterialien war. Nr. 5(5)E-A-AP IX wurde ebenfalls gleichzeitig bei 0,31 mg/mL untersucht. Tabelle 15 zeigt die Anti-HIV-Aktivitäten von den HPSEC-Fraktionen von Nr. 5(5)E-A-AP1X und Nr. 5(5)E-C-AP zusammen mit ihrer prozentualen (%-) Gewichtsverteilung. TABELLE 15 Anti-HIV-Aktivitäten und %-Gewichtsverteilung der HPSEC-Fraktionen von Nr. 5(5)E-A-AP1X und Nr. 5(5)E-C-AP
    HPSEC Fraktion % Gewicht Test-Konzentration Toxizität** Anti-HIV-Aktivität*
    (mg/mL)*** Tag 3 Tag 4
    Nr. 5(5)E-A-AP1X 100% 0,31 98% 75% 87%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F6 8,3% 0,03 100% 19% 11%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F7 24,8% 0,08 93% 79% 78%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F8 33,1% 0,1 94% 80% 83%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F9 24,8% 0,08 100% 73% 69%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F10 16,5% 0,05 100% 37% 14%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F11 bis F12 8,3% 0,03 100% 13% 21%
    Nr. 5(5)E-A-AP1X-F13 bis F16 8,3% 0,03 96% 9% 15%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F7 8,3% 0,03 100% 0% 0%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F8 16,7% 0,05 100% 95% 85%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F9 16,7% 0,05 100% 98% 92%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F10 25,0% 0,08 100% 80% 35%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F11 bis F12 16,7% 0,05 100% 59% 8%
    Nr. 5(5)E-C-AP-F13 bis F16 16,7% 0,05 100% 50% 0%
    • * Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration. Die Daten der Anti-HIV-Aktivität von Nr. 5(5)E-A-AP1X stammen von wiederholten Ergebnissen unter Verwendung von Lösungen, die für drei Monate gefroren gelagert waren.
    • ** Toxizität in % der Kontroll-Proliferation.
    • *** Die Testkonzentrationen für die HPLC-Fraktionen waren äquivalent zu 0,30 mg/mL des Ausgangsmaterials.
  • Die Ergebnisse weisen eindeutig darauf bin, dass die Hauptaktivität von Nr. 5(5)E-A-AP1X sich über drei Fraktionen, Fraktion 7 bis 9, erstreckt und sie scheint in dem Massepeak von Fraktion 8 den Höchststand zu erreichen (80% Unterdrückung an Tag 3 und 83% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL). Die Hauptaktivität von Nr. 5(5)E-C-AP erstreckt sich ebenfalls über drei Fraktionen, Fraktion 8 bis 10, und sie scheint in dem Massepeak der Fraktionen 8 und 9 den Höchststand zu erreichen (95 bis 98% Unterdrückung an Tag 3 und 85 bis 92% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,05 mg/mL). Es sollte beachtet werden, dass die Masse von Nr. 5(5)E-C-AP in Fraktion 10 ihren Höchststand hatte, welche jedoch nur geringfügig aktiv war, 80% Unterdrückung an Tag 3 und 35% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,08 mg/mL.
  • Für eine HPSEC-Fraktion, Fraktion 8, von Nr. 5(5)E-C-AP wurde mittels Ultrafiltration gefunden, dass sie oligomere Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 1.000 und 3.000 Dalton enthält. Für eine weitere HPSEC-Fraktion, Fraktion 9, wurde gefunden, dass sie polymere Moleküle mit einem Molekulargewicht größer als 3.000 Dalton enthält Fraktion 9 war lipophiler als Fraktion 8, da Fraktion 9 größere Moleküle enthielt, aber später als Fraktion 8 bei der HPSEC-Chromatographie unter Verwendung von 0,1 N NH4HCO3 als mobile Phase eluierte. Für beide wurde in den Untersuchungen eine vergleichbare Aktivität gefunden: 95% Unterdrückung an Tag 3 und 85% Unterdrückung an Tag 4 für Fraktion 8 und 91 bis 98% Unterdrückung an Tag 3 und 87 bis 92% Unterdrückung an Tag 4 für Fraktion 9 bei 0,05 bis 0,25 mg/mL. Darüber hinaus wies eine zweifach chromatographisch gereinigte HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP eine dosisabhängige Wirkung gegenüber der HIV-Proliferation auf und hatte einen IC50-Wert (50%-ige Hemmkonzentration) von 6 μg/mL an Tag 3 und 17 μg/mL an Tag 4. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Als Vergleich, die IC50-Werte von AZT waren 3 ng/mL an Tag 3 und 21 ng/mL an Tag 4 und diejenigen von d4T waren 32 nM an Tag 3 und 540 nM an Tag 4, wenn sie gleichzeitig untersucht wurden. TABELLE 16 Anti-HIV-Aktivitäten der HPSEC-Fraktionen 8 und 9 von Nr. 5(5)E-C-AP bei verschiedenen Konzentrationen
    HPSEC Fraktion Gew.-% Test-Konzentration Toxizität** Anti-HIV-Aktivität*
    (mg/mL) Tag 3 Tag 4
    Fraktion 8 (Lauf 1) 16,7% 0,05 100% 95% 85%
    Zweifach chromatographisch gereinigt 10,3% 1,0 100% 93% 85%
    Fraktion 8 (Lauf 2) 0,3 100% 85% 69%
    0,1 100% 87% 79%
    0,03 100% 89% 81%
    0,01 100% 74% 32%
    0,003 100% 19% 0%
    0,001 91% 3% 5%
    Fraktion 9 (Lauf 1) 16,7% 0,05 100% 98% 92%
    Fraktion 9 (Lauf 2) 23,6% 0,25 80–82% 91% 87%
    • * Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration.
    • ** Toxizität in % der Kontrollproliferation.
  • 5A zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm und 5B zeigt das RI-Profil von der zweifach chromatographisch gereinigten HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP. Die HPSEC-Fraktion 9 von Nr. 5(5)E-C-AP eluierte etwas später als Fraktion 8 und weist eine ähnliche, aber breitere Verteilung und sogenanntes Peak-Tailing auf, zurückzuführen auf unspezifische Interaktionen mit dem Säulenmaterial, die durch die Lipophilität verursacht wurden. Jede Fraktion wurde ferner mittels HPLC analysiert.
  • 6A zeigt das UV-Profil bei 214 nm der C18-HPLC-Chromatographie von der gereinigten HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP und 6B zeigt das Profil von Fraktion 9 unter Verwendung von 0,1 N NH4HCO3 mit 30% Ethanol als mobile Phase bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min. Als HPLC-Säule wurde eine Rainin Microsorb-MV C18-Säule (5 μm Partikel, 100 Å Porengröße, 4,6 mm ID × 25 cm L) verwendet, die Proben wurden in der mobilen Phase bei 1,0 mg/mL hergestellt und das Injektionsvolumen betrug 5 μL.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die gereinigte Fraktion 8 (6A) einen Hauptpeak mit einer Retentionszeit von 2,48 Minuten und einen weniger lipophilen Peak mit einer Retentionszeit von 2,24 Minuten enthält. Die Fraktion 9 (6B) enthält hauptsächlich nur einen Peak mit einer Retentionszeit von 2,56 Minuten. Die Hauptpeaks von den beiden Fraktionen 8 und 9 sind sehr ähnlich.
  • Die Schmelzpunkte, falls welche vorhanden sind, von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 und seiner gereinigten HPSEC-Fraktion 8 wurden mit höher als 400°C bestimmt. Dies ist äußerst ungewöhnlich, da die meisten organischen Verbindungen Schmelzpunkte von weniger als 300°C aufweisen.
  • 11 zeigt die IR-Spektren von der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren aktiven Komponente von Nr. 5(5) in ihrer Säureform (Nr. 5(5)E-AP6X) und 12 zeigt die Ammoniumsalz-Form (Nr. 5(5)E-AP6X-NH4). Die Proben wurden als KBr-Presslinge hergestellt und ein Perkin Elmer FT-IR-Spektrometer für die Messung verwendet. Die Absorptionen von der Säureform bei 1636, 1452 und 1402 cm–1 weisen auf C=C Doppelbindungen hin. Die Absorption bei 2362 cm–1 weist auf CO (Gas) hin, was eine Kontamination sein kann. Die Absorptionsbanden zwischen 2850–2975 cm–1 weisen auf H-C-H (asymmetrische Deformationsschwingung) hin. Keine Absorption unterhalb von 600–700 cm–1 weist auf die Abwesenheit von aromatischen Gruppen hin und der scharfe Peak bei 698 cm–1 stammt von einem Kalibrierungsstandard.
  • Der Befund, dass die wasserextrahierbare und mit Säure ausfällbare aktive Komponente von Nr. 5(5) lipophile Substanzen enthält, wird ferner durch die HPSEC-Analysen von Nr. 5(5)E-AP wie nahfolgend beschrieben, unterstützt.
  • 2. AKTIVE KOMPONENTEN VON G UND H
  • Die aktiven Komponenten von den Pflanzen G und H verhalten sich ähnlich zu denen von Nr. 5(5). Beides sind polymere organische Säuren, die in neutralen und leicht basischen wässrigen Lösungen löslich und mit Säure ausfällbar sind. Die Elementanalyse (Tabelle 14) von sechsfach gereinigten sauren Niederschlagen von GE und HE zeigt, dass beide einen hohen Kohlenstoffgehalt (46,47 bis 54,69%) und einen niedrigen Aschegehalt (0,60 bis 1,99%) aufweisen.
  • Die 7, 13 und 17 zeigen die UV-Profile der HPSEC-Chromatographie bei 214 nm von den wasserextrahierbaren und mit Säue ausfällbaren aktiven Komponenten von Nr. 5(5), G beziehungsweise H, unter Verwendung von 0,3 N NH4HCO3 mit 30% Acetonitril als die mobile Phase bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min. Die Säule war eine Varian MicroPak TSKgel-G3000 PWXL-Säule (7,8 mm ID × 30 cm L), in Serie geschaltet mit einer TSK PWXL-Vorsäule (Guard-Column)(6,0 mm ID × 4,0 cm L). Die Proben wurden in 0,3 N NH4HCO3 bei einer Konzentration von 0,65 bis 1,4 mg/mL zubereitet. Das Injektionsvolumen betrug 100 μL.
  • 8 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(5) in Ammoniumsalzform, oder Nr. 5(5)E-AP1X-NH4. 14 zeigt das Profil von G in Ammoniumsalzform oder GE-AP2X-NH4. 18 zeigt das Profil von H in Ammoniumsalzform oder HE-AP1X-NH4. Als mobile Phase wurde 0,1 N NH4HCO3 bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min verwendet. Die Säule war eine Varian MicroPak TSKgel-G3000 PWXL-Säule (7,8 mm ID × 30 cm L), in Serie geschaltet mit einer TSK PWXL-Vorsäule (Guard-Column)(6,0 mm ID × 4,0 cm L). Die Proben sind die Ammoniumsalze von den akiven Komponenten Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 (8), GE-AP2X-NH4 (14) und HE-AP1X-NH4 (18), welche in 0,1 N NH4HCO3 bei 1,0 mg/mL zubereitet wurden. Das Injektionsvolumen betrug 50 μL.
  • Mittels HPSEC-Analyse wurde abgeschätzt, dass die Molekulargewichte von den wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren aktiven Komponenten von Nr. 5(5), G und H überwiegend in einem Bereich zwischen 1.000 und 12.000 Dalton liegen, wobei einige jedoch auch unter 1.000 Dallton liegen.
  • 9 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, 15 dasjenige von GE-AP1X-NH4 und 19 zeigt dasjenige von HE-AP1X-NH4. Als Säule wurde eine PerSeptive Biosystems PORÖS R2/H-Säule (4,6 mm ID × 10 cm L) verwendet. Als mobile Phase wurde 0,1 N Ammoniumbicarbonat verwendet, das Ethanol von 2% bis 60% enthielt, gemäß dem in Tabelle 17 beschriebenen Gradienten und bei einer Flussgeschwindigkeit von 2,00 mL/min. Das Injektionsvolumen betrug 20 μL. TABELLE 17
    RP-HPLC-Gradient
    Zeit Lösung A/Lösung B (v/v)*
    0 bis 1 Minute 100/0
    1 bis 7 Minuten 100/0 bis 50/50, Waters konkave Kurve 7
    7 bis 13 Minuten 50/50 bis 0/100, Waters konvexe Kurve 5
    13 bis 20 Minuten 0/100
    20 bis 30 Minuten 100/0
  • * Lösung A = 0,1 N Ammoniumbicarbonat mit 2% Ethanol (v/v) * Lösung B = 0,1 N Ammoniumbicarbonat mit 60% Ethanol (v/v)
  • 10 zeigt das UV-Spektrum von Nr. 5(5)E-AP6X (10A), GE-AP6X (10B) und HE-AP6X (10C) in Ammoniumbicarbonat-Lösung ohne Lösungsmittel-Blindwert zur Korrektur. Die drei Spektren sind ähnlich und alle weisen ein Absorptionsmaximum bei 204 bis 206 nm auf.
  • 16 zeigt das IR-Spektrum von der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von G in Ammoniumsalzform (GE-AP2X-NH4), und 20 dasjenige von HE-AP1X-NH4. Die Proben wurden als KBr-Presslinge hergestellt und ein Perkin Elmer FT-IR-Spektrometer für die Messung verwendet.
  • 3. AKTIVE KOMPONENTEN VON NR. 4(2), NR. 4(3), NR. 4(4), NR. 4(5), NR. 5(1), NR. 5(8) UND NR. 5(11)
  • Die aktiven Komponenten von allen untersuchten Proben waren in dem neutralen Zellkulturmedium löslich. Die aktiven Komponenten von Nr. 4(2), Nr. 4(5), Nr. 5(1), Nr. 5(8) und Nr. 5(11) waren mit Saure ausfällbar, während diejenige von Nr. 4(3) es nicht war. Die aktive Komponente von Nr. 4(3) ist sowohl in Wasser als auch in Säure löslich. Die aktive Komponente von Nr. 4(4) ist ebenfalls in Wasser löslich. Ein Anteil der aktiven Komponente von Nr. 4(4) ist jedoch mit Säure ausfällbar und ein Anteil ist nicht ausfällbar.
  • 21 zeigt das UV-Profil der HPSEC-Chromatographie von der wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren, aktiven Komponente von Nr. 5(8) in Ammoniumsalzform, Nr. 5(8)E-AP1X-NH4. 24 zeigt dasjenige von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 und 27 zeigt dasjenige von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4. Als mobile Phase wurde 0,1 N NH4HCO3 bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,80 mL/min verwendet. Die Säule war eine Varian MicroPak TSKgel-G3000 PWXL-Säule (7,8 mm ID × 30 cm L), in Serie geschaltet mit einer TSK PWXL-Vorsäule (Guard-Column)(6,0 mm ID × 4,0 cm L). Die Proben wurden in 0,1 N NH4HCO3 bei einer Konzentration von 1,0 mg/mL zubereitet. Das Injektionsvolumen betrug 50 μL.
  • 22 zeigt das UV-Profil der RP-HPLC-Gradientenchromatographie von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, 25 dasjenige von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 und 28 zeigt dasjenige von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4. Als Säule wurde eine PerSeptive Biosystems PORÖS R2/H-Säule (4,6 mm ID × 10 cm L) verwendet. Als mobile Phase wurde 0,1 N Ammoniumbicarbonat verwendet, das Ethanol von 2% bis 60% enthielt, gemäß dem in Tabelle 17 beschriebenen Gradienten und bei einer Flussgeschwindigkeit von 2,00 mL/min. Das Injektionsvolumen betrug 20 μL.
  • 23 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4 und 26 zeigt dasjenige von Nr. 5(11)E-AP1X-NH4. 29 zeigt das IR-Spektrum von Nr. 4(2)E-AP1X-NH4. Die Proben wurden als KBr-Presslinge hergestellt und ein Perkin Elmer FT-IR-Spektrometer für die Messung verwendet.
  • Der Schmelzpunkt, falls einer vorhanden ist, von Nr. 5(8)E-AP1X-NH4 liegt höher als 400°C.
  • 4. ANTI-HIV-AKTIVITAT, DOSISWIRKUNG UND TOXIZITÄT
  • Wie vorangehend beschrieben, weist eine zweifach chromatographisch gereinigte HPSEC-Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP (wie ebenfalls durch die HPSEC-Profile in den 5A und B und dem C18-HPLC-Profil in 6A spezifiziert) eine Dosis-Wirkungs-Aktivität gegen die HIV-Proliferation auf, wie in Tabelle 16 gezeigt, und besitzt einen IC50-Wert von 6 μg/mL an Tag 3 und von 17 μg/mL an Tag 4. Tabelle 18 zeigt ebenfalls die Dosis-Wirkungs-Beziehung der Anti-HIV-Aktivität von den wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren aktiven Komponenten von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4, GE-AP2X-NH4, HE-AP1X-NH4, Nr. 5(8)E-AP1X-NH4, Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 und Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 in ihren Ammoniumsalzformen. Die Dosis-Wirkungs-Beziehungen von AZT aus zwei verschiedenen Läufen sind zum Vergleich aufgelistet.
  • GE-AP2X-NH4 wurde bei 0,5 mg/mL aufgrund seiner hohen Cytotoxizität (35% der Kontrollproliferation) bei dieser Konzentration nicht untersucht. Die Cytotoxizität bleib bei niedrigeren Konzentrationen bestehen: 34% der Kontrollproliferation bei 0,25 mg/mL und 41% bei 0,13 mg/mL. Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 zeigte ebenfalls eine hohe Cytotoxizität (44% der Kontrollproliferation) bei 0,5 mg/mL, wurde aber bei niedrigeren Konzentrationen bedeutend weniger cytotoxisch: 72% der Kontrollproliferation bei 0,25 mg/mL und 100% (nicht cytotoxisch) bei 0,13 mg/mL.
  • Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 ist gegenüber menschlichen PBL in vitro bei 1,0 mg/mL oder höher cytotoxisch: 55% der Kontrollproliferation bei 1 mg/mL, 46% bei 2 mg/mL, 11% bei 5 mg/mL und 0% bei 10 und 20 mg/mL. Nr. 5(5)E-AP6X weist eine leichte Cytotoxizität (63% der Kontrollproliferation) bei 0,5 mg/mL auf und ist nicht cytotoxisch bei 0,1 mg/mL und niedrigeren Konzentrationen (98% der Kontrollproliferation bei 0,1 mg/mL und 100% bei 0,02 mg/mL). Für eine Fraktion von den aktiven Komponenten von Nr. 5(5)E-AP, d. h. die chromatographisch gereinigte Fraktion 8 von Nr. 5(5)E-C-AP ist gezeigt worden, dass sie nicht cytotoxisch ist: 100% der Kontrollproliferation sogar bei 1,0 mg/mL (siehe Tabelle 16).
  • Die akute Toxizität von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 wurde untersucht. Zur Bestimmung der akuten Toxizität wurden Mäuse verwendet und für die Verbindung wurde gefunden, dass sie nicht toxisch war, selbst bei Konzentrationen von 5.000 mg von der Testsubstanz pro Kilogramm Körpergewicht (oral per Einmalverabreichung verfüttert). Vier Gruppen von zehn (10) männlichen ICR-Mäusen (Gewicht zwischen 18 bis 21 Gramm) pro Gruppe wurden für den akuten Toxizitätstest verwendet. Keine de vierzig Mäuse war zweiundsiebzig (72) Stunden nach der oralen Verabreichung tot. Die LD50 von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 ist demzufolge größer als 5.000 mg/kg (p. o., Mäuse, 72 Stunden). Des weiteren waren Tests auf Wirkungen von Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 bei 5.000 mg/kg auf das Zentralnervensystem wie beispielsweise Reflex-Depression, Verhaltens-Depression, Muskelrelaxation, motorische Stimulation und das autonome Nervensystem von den Testtieren alle negativ, wenn diese eine (1) und drei (3) Stunden nach der oralen Verabreichung beobachtet wurden. TABELLE 18 Dosis-Wirkungs-Beziehung der Anti-HIV-Aktivität von den wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren aktiven Komponenten von Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11), Nr. 4(2), G und H in ihren Ammoniumsalzformen
    Test-Konzentration Anti-HIV-Aktivität*
    Aktive Komponente (mg/mL) Toxizität** Tag 3 Tag 4 IC50
    Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 0,5 > 55% 98% 95% 4,2 mg/mL
    0,05 81% 75% (Tag 3)
    0,005 53% 13% 16 mg/mL
    0,0005 1% 0% (Tag 4)
    GE-AP2X-NH4 0,05 > 41% 100% 96% 7,2 mg/mL
    0,005 40% 8% (Tag 3)
    0,0005 6% 0% 20 mg/mL
    0,00005 3% 0% (Tag 4)
    HE-AP1X-NH4 0,5 100% 92% 95% 8,7 mg/mL
    0,05 > 89% 87% 95% (Tag 3)
    0,005 33% 23% 8,3 mg/mL
    0,0005 4% 0% (Tag 4)
    Nr. 5(8)E-AP1X-NH4 0,5 77% 99% 100% 9,5 mg/mL
    0,05 100% 91% 92% (Tag 3)
    0,005 30% 16% 10 mg/mL
    0,0005 0% 0% (Tag 4)
    Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 0,5 78% 98% 99% 11 mg/mL
    0,05 > 99% 91% 92% (Tag 3)
    0,005 26% 11% 13 mg/mL
    0,0005 12% 0% (Tag 4)
    Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 0,5 44% 100% 100% 14 mg/mL
    0,05 100% 88% 83% (Tag 3)
    0,005 20% 0% 19 mg/mL
    0,0005 2% 0% (Tag 4)
    AZT 0,1 μg/mL - 99–100% 98–100% 2,0 ng/mL
    0,01 μg/mL 87–93% 84% (Tag 3)
    Test-Konzentration Anti-HIV-Aktwität*
    Aktive Komponente (mg/mL) Toxizität** Tag 3 Tag 4 IC50
    0,001 μg/mL 23–53% 0–26% 4,2 ng/mL
    0,0001 μg/mL 3–19% 0% (Tag 4)
    • * Aktivität in %-Inhibierung der HIV-Proliferation, basierend auf der Protein p24-Konzentration.
    • ** Toxizität in % der Kontroll-Proliferation.
  • 5. STABILITÄT DER AKTIVEN KOMPONENTEN
  • Die wasserextrahierbaren und mit Säure ausfällbaren aktiven Komponenten von Nr. 5(5), Nr. 5(8), Nr. 5(11), Nr. 4(2), G und H sind stabil gegenüber Hitze, Luft, starken Säuren und schwachen Basen wie HCl und Ammoniumbicarbonat, Ammoniumhydroxid oder Natriumbicarbonat, und Alkoholen wie beispielsweise Ethanol. Sie sind entweder in ihrer Säureform oder den Salzformen wie beispielsweise Ammonium- oder Natriumsalz aktiv.
  • Nr. 5(5)E-AP1X-NH4 bleibt sehr aktiv (94% Unterdrückung an Tag 3 und 67% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL), wenn es nach 15,6 Monaten der Lagerung bei Umgebungstemperatur getestet wird. GE-AP2X-NH4 und HE-AP1X-NH4 behielten ihre Aktivitäten (100% Unterdrückung sowohl an Tag 3 als auch an Tag 4 für GE-AP2X-NH4 und 83% Unterdrückung an Tag 3 und 81% Unterdrückung an Tag 4 für HE-AP1X-NH4 bei 0,1 mg/mL), wenn sie nach 13 Monaten Lagerung bei Umgebungstemperatur getestet wurden. Nr. 5(8)E-AP1X-NH4 und Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 bleiben ziemlich aktiv (85% Unterdrückung an Tag 3 und 81% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 5(8)E-AP1X-NH4 und 92% Unterdrückung an Tag 3 und 88% Unterdrückung an Tag 4 für Nr. 4(2)E-AP1X-NH4 bei 0,1 mg/mL), wenn sie nach 12,5 Monaten Lagerung bei Umgebungstemperatur getestet wurden. Nr. 5(11)E-AP1X-NH4 blieb ebenfalls ziemlich aktiv (84% Unterdrückung an Tag 3 und 78% Unterdrückung an Tag 4 bei 0,1 mg/mL), wenn es nach 12 Monaten der Lagerung bei Umgebungstemperatur getestet wird.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Die vorliegende Erfindung ist zu einem Teil auf die Entdeckung gerichtet, dass spezifische Heilpflanzen oder Naturheilmittel oder ihre Mischungen überraschende antivirale Aktivitäten besitzen, ohne eine Schädigung der Wirtszelle zu verursachen. Ferne ist die Erfindung auf Verfahren zur Behandlung von Menschen und Säugetieren gerichtet, die mit Viren wie beispielsweise HBV, HCV oder HIV infiziert sind. Die in dieser Anmeldung vorgestellten Daten demonstrieren eindeutig, dass die identifizierten Zusammensetzungen eine antivirale Aktivität ohne Toxizität für die Wirtszelle besitzen.
  • Aus den vorangehenden Experimenten kann gefolgert werden, dass die Kräutermischung mit der Bezeichnung HHT888-4, welche nicht in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fällt, in der Behandlung von HBV-Trägern wirksam ist und dementsprechend verwendet werden kann, um Menschen zu behandeln, die mit HBV infiziert sind. Die Verringerung der Virusbelastung in HBV-Patienten und HBV-Trägern wir demzufolge in der Verhinderung von der HBV-Erkrankung beim Menschen resultieren und wird ebenfalls wirksam sein bei der Behandlung von Menschen, die eine HBV-Erkrankung aufweisen. Die klinischen Test haben ebenfalls gezeigt, dass die Kräutermischung HHT888-45 in der Behandlung von Hepatitis-C-Patienten wirksam ist und demzufolge erwartet wird, dass sie auch in der Behandlung von Hepatitis-B-Patienten wirksam sein wird, wenn sie alleine oder in Kombination mit HHT888-5 oder ihren antiviralen Einzelkraut-Komponenten verabreicht wird.
  • Zusätzlich haben HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54 und die individuellen Einzelkraut-Komponenten mit Anti-HIV-Aktivität eine Wirksamkeit bei der Unterdrückung der HIV-Proliferation in nativen menschlichen Zellen demonstriert. Darüber hinaus haben HHT888-5, HHT888-45 und HHT888-54 eine Wirksamkeit bei der Behandlung von Patienten gezeigt, die mit HBV und HCV infiziert sind. HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, Wasserextrakte und aktive Grundbestandteile sind ebenfalls wirksam in der Behandlung von Menschen, die mit HIV infiziert sind, einschließlich HIV-Träger und AIDS-Patienten.
  • Die therapeutischen Wirkungen, die hierin beschrieben werden, können durch die Verabreichung von den Naturheilmitteln „in der vorliegenden Form" oder als Tees, Dekokte, Erfrischungsgetränke, Bonbons oder in anderem Konfekt, enteralen flüssigen Ernährungsprodukten wie Säuglingsnahrung und Ernährungsprodukten für Erwachsene, in Medical Food, Nahrungsergänzungsmitteln oder in Neutraceutical-Produkten, die eines oder mehrere von den Naturheilmitteln oder ihren Extrakten oder von den aktiven Grundsubstanzen enthalten, erreicht werden. Für pharmazeutische Zubereitungen können eine oder mehrere von den antiviralen Naturheilmitteln oder ihren Extrakten oder von ihren aktiven Grundbestandteilen in Einheitsdosisform wie beispielweise Kapseln, Pulverpäckchen oder Tabletten mit oder ohne Beschichtung(en) zur kontrollierten Freisetzung verabreicht werden.
  • Die medizinische Gemeinschaft ist konstant auf der Suche nach Verfahren und Produkten, die wirksa virale Infektionen bekämpfen, insbesondere Verfahren und Produkte zur Behandlung von Menschen, die mit HBV, HCV und HIV infiziert sind. Die Kräutermischungen HHT888-4, HHT888-5, HHT888-45, HHT888-54, die Einzelkraut-Komponenten, ihre Extrakte, aktiven Grundbestandteile und Produkte, welche die Kräuterzusammensetzungen enthalten, werden sofort durch die medizinische Gemeinschaft als ein zusätzliches Mittel bei der Verhinderung und der Behandlung von diesen verheerenden Krankheiten akzeptiert.

Claims (6)

  1. Zusammensetzung zur Anwendung in der Behandlung von Virusinfektionen, wobei die Zusammensetzung Folgendes umfasst: a) HERBA AEGINETIAE, hergestellt aus der ganzen Pflanze von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Aeginetia indica, Dichondra micrantha und Dichondra repens; und b) mindestens ein Naturheilmittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: i) HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE, hergestellt aus der ganzen Pflanze von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Scutellaria barbata, Scutellaria rivularis und Scutellaria dependens; ii) FRUCTUS FORSYTHIAE, hergestellt aus der maturen Frucht von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Forsythia suspensa, Forsythia viridissima und Forsythia koreana; iii) FLOS LONICERAE, hergestellt aus der Blutenknospe von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lonicera japonica und Lonicera confusa; iv) SPICA PRUNELLAE, hergestellt aus der Ähre oder der ganzen Pflanze von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Prunella vulgaris und Prunella vulgaris subsp. asiatica; v) RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI, hergestellt aus dem Rhizom von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polygonum cuspidatum, Polygonum runcinatum und Polygonum reynoutria; vi) RHIZOMA BLECHNI, hergestellt aus mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Blechnom orientale, Osmunda japonica, Woodwardia orientalis, Woodwardia unigemmata, Athyrium acrostichoides, Sphaeropteris lepifera, Cyrtomium falcatum und Cyrtomium fortunei; vii) RHIZOMA DRYOPTERIS CRASSIRHIZOMAE, hergestellt aus der Pflanze Dryopteris crassirhizoma; viii) FRUCTUS LIGUSTRI, hergestellt aus mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Ligustrum lucidum und Ligustrum japonicum; ix) HERBA SOLANI, hergestellt aus der ganzen Pflanze von Solanum nigrum; und x) HERBA LESPEDEZAE, hergestellt aus mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Lespedeza cuneata und Senecio scanden, worin das Gewichtsverhältnis von a) zu b) von 1:10 bis 10:1 beträgt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend: a) HERBA AEGINETIAE; b) RHIZOMA BLECHNI; c) HERBA LESPEDEZAE; d) RHIZOMA POLYGONI CUSPIDATI; e) FRUCTUS FORSYTHIAE; und f) FRUCTUS LIGUSTRI.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, die zusätzlich mindestens ein Mitglied umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a) RHIZOMA ET RADIX CIRSII hergestellt aus dem getrockneten Rhizom oder der Wurzel der ganzen Pflanze von mindestens einer Pflanze, die ausgewählt ist aus: Cirsium japonicum, Cirsium albescens und Cirsium japonicum var. australe; b) RADIX BREEAE, hergestellt aus der getrockneten Wurzel von mindestens einer Pflanze, die aus Breea segetum und Breea setosum ausgewählt ist; c) RHIZOMA ET RADIX BAPHICACANTHIS, hergestellt aus dem getrockneten Rhizom und der Wurzel von mindestens einer Pflanze, die ausgewählt ist aus: Baphicacanthes casia, Strobilanthes cusia, Isatis tinctoria, Isatis indigotica und Polygonum tinctorium; d) CORTEX PHELLODENDRI, hergestellt aus der Rinde von mindestens einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Phellodendron amurense, Phellodendron chinense, Phellodendron amurense var. sachalinense und Phellodendron wilsonii; und e) TUBER BLETILLAE, hergestellt aus der Knolle von Bletilla striata.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend: a) HERBA AEGINETIAE; b) FLOS LONICERAE; c) SPICA PRUNELLAE; und d) HERBA LESPEDEZAE.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, zusätzlich umfassend mindestens ein Mitglied, das aus der Gruppe ausgewählt ist, umfassend: a) HERBA SCUTELLARIAE BARBATAE; und b) FRUCTUS FORSYTHIAE.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, worin die Zusammensetzung in der Form eines Getränks, einer Kapsel, einer Tablette, eines Pulvers, eines Bonbons, eines Gels, eines Ernährungsprodukts oder eines pharmazeutischen Produkts vorliegt.
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