KR102708889B1 - siRNA, 및 NRARP 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물에서의 이의 용도 - Google Patents

siRNA, 및 NRARP 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물에서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 siRNA 분자 및 NRARP 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물에서의 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 NRARP 유전자의 발현 및/또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 신혈관 형성과 관련된 질병 또는 질환의 치료 및/또는 예방하는 상기 siRNAs 분자의 용도에 관한 것이고, 상기 안 질환은 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia, DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema, DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization) 및 미숙아 망막병증(ROP) 및 이들의 조합에서 선택된다.

Description

siRNA, 및 NRARP 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물에서의 이의 용도
본 발명은 siRNA 제품, 및 신혈관 형성과 관련된 망막 질환의 치료 및/또는 예방을 위한, 특히 NRARP 유전자의 고레벨의 발현 및/또는 활성과 관련된 신혈관 형성과 관련된 망막 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에서의 이의 용도에 관한 것이다.
우수한 시력을 위해 건강한 망막은 필수적이다. 망막 장애는 시력의 부분 또는 전체 상실을 야기할 수 있다. 다양한 망막 질환은 공통적인 증상 및 처치를 공유하지만, 각각은 특이한 특성을 갖는다. 망막 질환 치료의 목표는 질환의 진행을 멈추거나 늦추는 것, 낮은 시력을 보존하거나 회복하는 것이다.
신경 망막은, 시신경을 통해 뇌로 보내지고, 해석되는 전기 기계적 정보로 가시광선을 변형시키는 8개의 상호 연결된 세포층의 네트워크로 이루어진 복잡한 신경 조직이다. 망막 내의 신경 세포의 배열은, 망막의 뒷 부분에 위치한 광수용체로 대부분의 세포층을 통해 빛이 이동하는 것을 필요로 한다; 그 후 광수용체는 시각 정보의 국소 처리 및 시각 피질로 전달을 위해 망막 뉴런으로 정보를 전달한다. 광수용체에는 간상체(rod)와 추상체(cone)의 두가지 형태가 존재한다. 광수용체의 두 형태는 망막 전체에 존재하지만, 간상체는 주변에 우세한 반면 추상체는 망막의 중앙에 가장 밀집해있다. 또한, 황반으로도 알려진 망막의 중앙은, 시력이 가장 예민한 고농도의 색소 및 빽빽히 패킹된 추상체를 갖는 망막의 전문 영역이다. 망막의 주요한 특징 중 하나는 그의 투명도이다. 투명도는, 광수용체가 위치하는 망막의 최외곽층으로 빛을 도달시킨다. 이러한 투명도의 요건은, 맥관 구조(vasculature)가 망막이 극도로 전문화되는 것을 제공 및 지지하는데 필요하다는 것을 암시한다. 망막으로의 혈액 공급은 주요 소스인 망막의 맥관 구조 및 맥락막(choroid)에 의해 제공된다. 맥락막은 망막과 공막 사이에 놓인 매우 혈관이 많은 색소 조직이다. 맥락막은 맥락막-모세혈관(chorio-capillaries)을 통한 확산에 의해 망막으로 영양분, 대사물질 및 가스의 교환을 제공한다. RPE(retinal pigment epithelium)는 신경망막과 맥락막 사이에 위치하는 색소 세포의 단분자층이다. RPE 세포는 빛에 민감한 망막을 보호, 지지 및 공급한다. 신경망막의 특정 환경은 혈액-망막 장벽(hemato-retinal barrier)이라고도 하는 혈액 망막 장벽(blood-retinal barrier, BRB)에 의해 유지된다. BRB는 내부 혈액 망막 장벽 및 외부 혈액 망막 장벽으로 구성된다. 내부 혈액 망막 장벽은 망막 맥관 구조의 모세 내피 세포들 사이에 타이트한 접합으로 형성된다. 외부 혈액 망막 장벽은 RPE 세포의 타이트한 접합으로 구성된다. RPE 세포들 사이의 타이트한 접합은 독성 물질이 망막으로 침입하는 것을 방지하고, BRB를 통해 액체 및 가용성 화합물의 전달을 억제하는데 필수적이다.
혈관은 두가지 주요 과정, 혈관 형성(vascularization) 및 혈관 신생(angiogenesis)에 의해 망막에 형성된다. 혈관 형성은 이미 조직에 존재하는 전구 세포가 혈관 형성에 기여하는 내피 세포로 분화된 결과로서 발생한다. 혈관 신생은 새로운 혈관이 기존 혈관계에서 돋아 난다는 점에서 다르다. 혈관 신생은 내피 세포의 증식, 이주, 분화 및 새롭게 형성된 혈관의 성숙을 필요로한다. 내피 세포의 수는 일반적으로 성인 유기체에서 안정하다; 내피의 안정성은 혈관 신생 인자 및 항-혈관 신생 인자의 농도의 균형에 의해 조절된다. 요인 균형의 변화는 혈관 신생의 유도 또는 억제로 이어진다. 혈관 형성 및 혈관 신생은 발달 및 치유와 같은 다른 사건 동안 발생하는 자연적인 과정이지만, 또한 이러한 과정은 소정의 질병의 발병 기전에 역할을 한다. 병리학적 신혈관 형성은 일반적으로 혈관 신생과 혈관 형성의 조합을 의미한다. 망막에서 발생하는 신혈관 형성에는 두 가지 유형이 있고, 이들 모두는 시력 상실을 야기할 수 있다: 신생 혈관이 망막 모세 혈관에서 나와 유리체 및 신경 망막층을 침범하는 망막 신혈관 형성 (retinal neovascularization, RNV), 새로운 혈관이 맥락막 맥락 구조에서 나와 망막 아래 공간을 침범하는 맥락막 신혈관 형성(choroidal neovascularization, CNV). RNV와 CNV가 다른 혈관 네트워크에서 유래하고 망막의 다른층을 침범하지만, 공유된 분자 메카니즘은 이 둘의 진행을 촉진한다. RNV와 CNV는 선진국에서의 심각한 시력 상실의 가장 흔한 원인이며, 새로운 치료법이 필요하다.
혈관 신생의 가장 중요한 매개체 중 하나인 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 RNV 및 CNV 동안 상향 조절된다. 지난 10년 동안, 과학자들은 몇 가지 새로운 "항-VEGF" 약물을 개발해왔다. 이들은 비정상적인 혈관을 억제하고, 누출을 느리게하며, 시력 상실을 돕는다. 항-VEGF 약물을 이용한 치료는 유리체 강내 주사에 의해 수행된다.
IVT (Intravitreal) 주사는 안구 뒤쪽으로 약물을 전달하는 가장 일반적인 방법이며, 베르테포르핀(verteporfin)을 제외하고 망막 질환 치료를 위해 현재 승인된 모든 약물에 사용된다. 베르테포르핀은 정맥 주사 후 레이저 치료에 의해 투여되지만, 현대 항-VEGF 치료제의 판매로 인해 사용이 현저히 감소되었다. 과거 IVT 주사제의 연장 사용의 이유는 약물 전달 효율, 망막 의사의 친숙도, 의사의 치료 순응도 조절 능력 때문이다 (Rowe-Rendleman 외 2014). 그러나, 이 방법은 환자의 불편함, 내안구염의 위험, 백내장 형성 및 망막 박리뿐 아니라 사무실-기반 관리에 기인한 높은 관련 비용을 포함하는 매우 구체적인 단점을 가지고 있다. 다른 투여 방법에는 눈 주위 주사, 맥락막 상 주사, 서브-테논(sub-tenon) 주사 및 점안제를 포함한다. 그러나, 활성 부위가 각막에서 망막의 작용 부위로 전달되어야하기 때문에, 점안제로 망막 질환을 치료하기 위해 충분한 효능이 달성될 수 있는지에 대해 소정의 회의론이 있다. 눈 뒤쪽으로 약물을 전달하는 것을 방해하는 커다란 장벽과 제거 경로가 있다. 우선, 투여된 약물의 단지 1-7%가 눈으로 흡수된다; 점안제로 투여된 대부분의 약물은 눈에서 배출되거나 비루관을 통해 전신 순환계로 흡수된다. 게다가, 약물은 유리액으로부터 빠르게 제거된다. 뒤쪽 구멍으로부터, 전방과 후방의 2가지의 제거 경로가 있다. 전자는 안방수(AH) 흐름에 의해, 그 후 전방 관 각(chamber angle)을 통해 전방 관으로의 제거가 수반된다. 후자는 혈액-망막 장벽을 통한 제거를 의미한다. 따라서, 혈액-망막 장벽을 통해 쉽게 침투할 수 있는 약물은 유리액에서 매우 짧은 반감기를 가질 것이다.
신혈관 혈성과 관련된 망막 질환의 치료를 위한 항-VEGF 약물의 대안은 RNA 간섭 (RNAi) 기반 약물이다.
RNAi는 작은 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자를 사용하여 상동성-의존성 유전자 사일런싱을 유도하는 대부분의 진핵 세포에서 자연적으로 발생하는 전사후 조절 메카니즘(post-transcriptional regulatory mechanism)이다. worm C. elegans의 Fire 및 Mello에 의한 발견(Fire 외 1998)은 2006년에 노벨상을 수상했다. 최초의 설명이 있은 직후, RNAi는 포유류 세포에서 21개의 뉴클레오티드 길이의, 이중 가닥 작은 간섭 RNA (siRNAs)에 의해 발생하는 것으로 나타났다{Elbashir 외 2001}.
RNA 간섭 과정은 외래 유전자의 발현을 막는데 사용되는 진화론적으로 보존된 세포 방어 메카니즘으로 생각되며, 일반적으로 다양한 종족이나 식물군에 의해 공유되며, 이를 전사 후 유전자 사일런싱(post-transcriptional gene silencing)이라고 한다. RNAi 메카니즘의 발견 이래로, 소분자 또는 단백질을 포함하는 전통적인 약리학적 접근법으로는 "약물 개발이 불가능한(undruggable)" 표적을 다룸으로써 인간 질병을 치료하는 새로운 방법으로서 유전자 발현을 선택적으로 변경할 수 있는 새로운 화합물을 밝혀내기 위한 연구가 폭발적이었다.
현재의 지식에 따르면, RNAi의 메카니즘은 긴 이중 가닥 RNA가 다이서 (Dicer)로 알려진 RNase III 유사 단백질에 의해 처리될 때 시작된다. 단백질 다이서는 일반적으로 N-말단 RNA 헬리케이즈 도메인(helicase domain), 이른바 Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) 도메인, 2개의 RNase III 도메인 및 이중 가닥 RNA 결합 도메인 (dsRBD)으로 불리는 RNA 결합을 포함하고 {Collins 외 2005}, 그 활성은 2 염기 3 '오버행(overhangs) 및 5' 포스페이트 및 3 '히드록실기를 갖는 21-24개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 siRNA로 긴 이중 가닥 RNA를 가공시킨다. 그 후, 생성된 siRNA 이중 가닥은, RNA 헬리케이즈 활성을 통한 이중 가닥으로 된 siRNA 분자의 아데노신-트리포스페이트(ATP) 의존성 풀림 시에 (Nykanen 외 2001), siRNA의 안티센스 또는 가이드 가닥이 표적 mRNA 서열을 인식 및 절단하도록 RISC를 가이드 하는 {Elbashir 외 2001} RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)로 알려진 이펙터 복합체로 통합된다. mRNA 분해를 일으키는 RISC의 촉매 활성은 AGO2(endonuclease Argonaute 2)에 의해 매개된다 (Liu 외 2004; 송 외. 2004}. AGO2는 고도로 보존된 아고너트(Argonaute) 단백질 군에 속한다. 아고너트 단백질은 ~100 KDa의 고도의 염기성 단백질로 두 개의 공통 도메인, 즉 PIWI와 PAZ 도메인을 포함한다 {Cerutti 외 2000}. PIWI 도메인은 다이서와의 상호 작용에 결정적이며, mRNA의 절단을 담당하는 핵산 분해 효소 활성을 포함한다. AGO2는 siRNA 이중 가닥 중 한 가닥을 가이드로 사용하여 상보적인 서열을 포함하는 패신저 RNA를 찾고, 가이드 가닥의 5 '말단에 상대적인 염기 10 및 11 사이의 포스포디에스테르 백본을 절단한다 {Elbashir 외 2001}. RISC의 활성화 동안 중요한 단계는 AGO2에 의한 센스 또는 패신저 가닥의 절단으로, 복합체로부터 이 가닥을 제거하는 것이다 (Rand 외 2005). siRNA 가이드 가닥과 PIWI 도메인 사이의 상호 작용을 분석한 결정학 연구는, RISC에 의한 표적 mRNA 인식을 지시하는 것이 오직 "시드 서열"을 구성하는 뉴클레오티드 2개 내지 8개이며, 이 서열에서 단일 뉴클레오티드의 불일치가 분자의 사일런싱 능력에 급격한 영향을 미칠 수 있다는 것을 밝혀냈다 {Ma 외 2005; Doench 외 2004; Lewis 외 2003}. 일단 mRNA가 절단되면, 단편 내에 비보호된 RNA 말단의 존재에 기인하여, mRNA는 세포 내 뉴클레아제에 의해 더 분해 및 쪼개지고, 더 이상 단백질로 변환되지 않지만 {Orban 외 2005}, RISC는 후속 라운드를 위해 재활용될 것이다 {Hutvagner 외 2002}. 이것은 특정 mRNA 분자 및 상응하는 단백질의 선택적 환원을 유도하는 촉매 과정을 구성한다. RISC를 활성화시키고 표적 mRNA의 강력하고 특이적인 사일런싱을 일으키는 세포 또는 조직으로 siRNA 이펙터를 직접 전달함으로써 임의의 유전자(들)를 조절할 목적으로 유전자 사일런싱을 위한 본래의 메커니즘을 이용할 수 있다. RNAi는 HIV, 바이러스성 간염, 심혈관 및 뇌혈관 질환, 대사성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 암 치료와 같은 생물학 연구에 적용되었다 {Angaji SA 외 2010}.
siRNA가 길이, 구조, 화학적 조성 및 서열과 관련하여 최대 효과를 얻어야 하는 이상적인 특성을 설명하는 다수의 연구가 발표되었다. siRNA 디자인을 위한 초기 파라미터는 이후의 많은 연구, 알고리즘 및/또는 개선이 그 이후에 공개되었지만, WO 02/44321의 Tuschl 및 동료에 의해 제시되었다. siRNA 디자인의 초기 파라미터는 이후의 많은 연구, 알고리즘 및/또는 개선이 그 이후에 공개되었지만 WO 02/44321의 Tuschl 및 동료에 의해 제시되었다. 기계적 세부 사항이 등장함에 따라 siRNA 선택 접근법이 더욱 정교해졌고, 기존 및 새로운 데이터의 추가 분석을 통해 이러한 접근법을 더 상세하게 분석 할수 있는 추가 통찰력을 얻을 수 있다 {Walton SP 외 2010}. 또는, 최근의 몇몇 연구는, 고전적인 19+2 siRNA 구조와 구별되며, 오버행, 길이 또는 대칭 측면에서 고전적인 siRNA의 주요 특징을 따르지 않으며, 포유 동물 세포의 RNAi 기계 장치의 이그지빌리티(exibility)를 논하는 새로운 RNAi 유발 구조의 고안 및 분석을 발표했다 (Chang CI 외 2011).
또한, siRNA를 기반으로 하는 치료의 주요 장애물 중 하나로서, 체액에서 RNAses의 유비쿼터스 특성을 감안할 때 siRNA의 안정성을 향상시키기 위한 많은 노력을 기울여 왔다. siRNA 분자의 다른 고유한 문제점은, siRNA가 본래의 면역 체계의 비특이적 활성화를 유도하는 것으로 밝혀진 면역원성이다. 의도하지 않은 유전자 (mRNAs)의 녹다운은 siRNA-매개된 유전자 사일런싱의 잘 알려진 부작용이다. 이것은 의도된 표적 이외의 siRNA와 mRNA 사이의 부분적인 상보성의 결과로 야기되며, 각각의 siRNA 가닥에 상보적인 서열을 갖는 유전자로부터의 오프-표적 효과 (OTE)를 야기한다. 안정성 강화 및 OTE 감소에 대한 이어지는 주요 전략 중 하나는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-아미노 뉴클레오티드 또는 2'-O 또는 4'-C 메틸렌 브릿지를 함유하는 뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 것이다. 또한, 인접한 뉴클레오티드를 연결하는 리보뉴클레오티드 백본의 변형은 주로 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드의 도입으로 기술된다. 향상된 면역원성 및/또는 면역 원성의 감소는 종종 효능에 반비례하며{Parrish, 2000}, 오직 변형된 뉴클레오티드의 특정 수, 위치 및/또는 조합이 안정하고 비면역원성인 사일런싱 화합물을 생성할 수 있는 것으로 보인다. 이것이 siRNA-기반 치료를 위한 중요한 장애물이기 때문에, 우수한 결과를 보여주는 소정의 변형 패턴을 기술하는 다양한 연구가 공개되었고, 그 예는 더 많은 문헌에서 발견될 수 있지만 EP1527176, WO2008/050329, WO2008/104978 또는 WO2009/044392를 포함한다 [Sanghvi YS. 2011; Deleavey 외. 2012}.
눈은 상대적으로 분리된(isolated) 조직 구획이며, 이는 신혈관 형성과 관련된 망막 질환 치료를 위한 siRNA-기반 약제의 활용에 이점을 제공한다. CNV 치료를 위한 siRNA의 사용 가능성은 VEGF 또는 VEGF 수용체 1 (VEGFR1)에 대해 지시된 유리체 내 주사에 의해 투여된 siRNA를 사용하여 증명되었다 {Campochiaro PA. 2006}. 뒷부분으로 국소 점적에 의한 siRNA의 전달은, siRNA가 망막에 도달하기 전에 유리체를 통과해야 하는 비교적 큰 거리 때문에 어렵다 {Guzman-Aranguez A. 외 2013}. 또한, 눈의 후방 부분에 영향을 미치는 망막 질환의 약제학적 치료는, 안구를 전신 순환으로부터 분리시키는 혈액 수성 장벽 (BAB) 및 BRB와 같은 제한적인 혈액 안구 장벽에 의해 도전을 받게 된다. 또한, 눈의 구획화된 구조는 전방에서 눈의 후방 부분으로의 siRNA의 통과를 제한한다 {Duvvuri S 외 2003}. 마지막으로, 일단 siRNA가 성공적으로 눈의 뒤쪽으로 들어가면, 효과적인 제거 메커니즘이 전달된 분자를 빠르게 제거하는 작용을 한다 {Del Amo EM 외 2008}. 따라서, 유리체 강내로의 직접 주사는 siRNA-기반 치료제를 눈의 후방 부분으로 전달하는 가장 효율적인 수단이 되었다 {Edelhauser HF 외 2010}. siRNAs의 유리체내 주사는 전신 노출을 제한하는 동안 망막 조직에 국부적으로 이용 가능한 고농도의 siRNAs를 달성한다. 그러나, 유리질 엔도뉴클레아제에 의한 분해 및/또는 BRB를 가로지르는 투과를 통해 및 유리체를 통한 전방으로의 확산에 의해 siRNA의 농도는 뒷 부분으로부터 급속히 고갈된다. 따라서, 눈의 후방 부분 내에 최적의 siRNA 농도를 유지하도록 다수의 유리체 강내 주사가 필요하다. 이 투여 방식의 주요 단점은, 다수의 유리체 강내 주사가 안구 내 압력 증가, 유리체 강내 또는 망막 출혈, 망막 박리, 망막 눈물, 안내염, 백내장, 부종 및 일과성 흐릿한 시력(transient blurry vision)과 관련되어 있다는 점이다 {Edelhauser HF 외 2010}. 따라서, 유리체 강내 주사는 망막에 고농도의 siRNA를 전달하는 것을 보증하지만, 이 투여 방법은 특정한 위험도를 가지고 있다. 결과적으로, siRNA의 국소 투여는 위험을 감소시키고, 보다 환자 친화적인 투여 방법을 수반할 수 있다.
노출된 siRNA는 국소 적용 후 특정 영역에 도달하는 것으로 보이지만, 망막의 가장 안쪽 층과 효과적인 세포 흡수와 같은 더 깊은 영역에 대한 접근은, 표적 영역에 위치한 세포의 세포질에 도달하는 화합물의 충분한 농도를 보증하고, 소망하는 생리적 또는 치료적 반응을 일으키는 전략의 개발을 필요로 한다. 각질층 장벽을 가로지르는 siRNA를 전달하기 위한 물리적 접근에는, 미세 바늘 (Chong, Gonzalez-Gonzalez 외, 2013), 피내 주사 (Leachman, Hickerson 외, 2010), 전기 천공법 (Nakai, Kishida 등, 2007) 이온 삼투압 (Kigasawa, Kajimoto 외, 2010) 등이 있다. 또한, 분자 및/또는 제제의 변형은 분자가 필요한 영역 내로 침투하여 세포 흡수를 개선시킬 수 있게 한다.
망막 질환의 치료를 위한 siRNA-기반 치료제의 국소 투여가 기술되어 있다: 예컨대, US20130123330은 VEGF 또는 VEGFR2를 인코딩하는 mRNA 분자에 적어도 siRNA 이중 결합을 또는 VEGF 및 VEGFR2 유전자 모두를 표적하는 siRNA 이중 가닥을 결합하는 칵테일을 투여함으로써 당뇨병성 망막증 및 다른 안구의 신혈관 형성 질병의 치료를 개시한다. 이 특허 출원은 siRNA 이중 가닥을 안구 국소, 결막 또는 유리체 내로 투여할 수 있다고 기재하였다. 그러나, 명세서에는 오직 유리체 내 또는 결막에 투여된 화합물의 예를 포함한다. WO 20010048352 (Quark Pharmaceuticals)는, 망막 신경절 세포 (retinitis pigmentosa (RP)), 당뇨병성 망막증 (DR), 당뇨병성 황반샘 부종 (diabetic macular edema, DME) 및 연령 관련 황반변성 (AMD)을 포함하는 망막 신경절 세포의 퇴행 또는 사망과 관련된 안 질환, 장애 및 상해의 치료를 위한 화학적으로 변형된 siRNA 화합물의 용도를 개시한다. 망막 조직으로의 국소 전달이 CASP2, RTP801, TIGASEII 및 p53 유전자와 같은 세포의 손실과 관련된 표적 유전자의 발현을 하향 조절하는 siRNA 화합물에 대해 입증되었지만, Caspase 2를 표적하는 siRNA 화합물 만이 망막 신경절 세포의 생존을 증가시킴으로써 안구 신경 보호 효과를 제공하는 것이 밝혀졌다.
표적 유전자의 선택은, siRNA-기반 치료법으로 신혈관 형성과 관련된 망막 질환을 치료 및/또는 예방할 때 핵심적인 역할을 한다. NRARP(Notch-regulated ankyrin repeat protein)는 Notch 및 Wnt 신호 활성을 다르게 조절하여 Stalk 증식과 혈관 안정성을 균형있게 조절하는 새로 형성된 분기점에서 Notch에 의해 유도된다. HUVEC에서의 NRARP의 siRNA 매개 하향 조절은 Notch의 증가와 상호 연관이 있는데, 이는 줄기 세포에서 혈관 회귀로 전환되는 반면 증가된 Notch가 새로운 팁 세포의 형성을 유도한다 {Phng LK, Potente M, 외. 2009}. 따라서, NRARP가 망막 조직의 혈관 신생 및/또는 혈관 형성 과정의 조절에 중요한 역할을 하는 것 같다.
siRNA-기반 치료법은 망막 질환에서 RNV와 CNV의 진행을 늦추거나 막을 수 있지만, 비효율적인 siRNA 전달과 제한된 siRNA 생체 이용률에 의해 치료 효과가 감소될 수 있으며, 이는 반복적인 유리체 강내 주사의 장기 치료를 필요로 한다. 따라서, 새롭고 독창적인 표적 유전자를 표적하는 개선되고 비침습적인 siRNA-기반 치료제는 신혈관 형성과 관련된 망막 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 고안되어야 한다.
본 발명은 NRARP 발현 및 결과적으로 신혈관 형성과 관련된 망막 질환의 감소를 위한 개선된 제품을 제공한다. 종래의 항 혈관 신생 치료제에 비해 siRNA 제품을 이용한 신혈관 형성과 관련된 안 질환을 치료하는 이점 중 하나는 siRNA에 기반한 치료의 효과가 더 장기 지속된다는 점이다. 이러한 특징은 siRNA가 표적 단백질의 합성을 차단한다는 사실에 기인한다. 치료가 중단되는 경우, 세포는 상처로부터 새로운 표적 단백질을 합성해야 할 것이고; 반면에 종래의 치료법은 표적 단백질을 온전히 둘 것이고, 다시 한번 활성화될 준비를 하며, 억제제는 더 이상 존재하지 않게 된다. 다른 이점은 질환을 치료하기 위해 다양한 siRNA의 조합을 이용함으로써 효능을 증가시킬 수 있다; 이는 NRARP를 표적하는 siRNA와 NRARP의 다른 모듈레이터 및/또는 VEGF 또는 VEGFR2와 같은 신혈관 형성의 다른 분자 매개체를 조합함으로써 활성화될 수 있다. siRNA의 활성 메카니즘은, 한번 활성 분자가 세포질에 도달되면, 동일한 분자가 다수의 mRNA 분자의 열화를 중재하는데 이용될 수 있고, 이는 1:1 화학양론을 필요로 하는 항체에서의 경우가 아니게 되는 것을 수반한다. 따라서, 동일한 임상 효과를 얻기 위해 더 적은 양의 화합물이 필요하게 되어 잠재적으로 부작용을 줄이는 것이 예상된다.
도 1은 본 발명의 siRNA의 표적 서열로 선택된 NRARP의 표적 유전자 서열의 짧은 단편을 도시한다.
도 2는 본 발명에 포함되는 NRARP를 표적하는 본 발명의 siRNA 분자의 올리고뉴클레오티드 서열을 도시한다. 이 도면에 제공되는 SEQ ID 번호는 센스 (5' -> 3') 가닥을 말한다; 일반적으로 siRNA는 dsRNA로 부여될 것이고, 그래서 siRNA는 센스 가닥 및 그와 상보적인 안티센스 가닥 모두를 포함할 것이다. SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18은 각각 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9를 표적하는 siRNA이다. 일반적으로, siRNA는 센스 및 안티센스 가닥을 포함할 것이고, 3' 디뉴클레오티드 오버행(예컨대, dTdT)을 포함할 수 있다. 그러나 필수적인 것은 아니다.
도 3은 NRARP를 표적하는 변형된 siRNA이다. SEQ ID NO 19 내지 SEQ ID NO 40은 siRNA SEQ ID NO 10의 변형된 센스 (5' -> 3') 가닥 및 변형된 안티센스 가닥 (5' -> 3')을 말하고, 이는 NRARP 유전자의 서열 SEQ ID NO 1을 표적한다. 범례: 센스 가닥 (S), 안티센스 가닥 (AS), 낮은 케이스(2'OMe 리보뉴클레오티드), * (PS 또는 포스포티오에이트 결합), 낮은 케이스(4'티오리보오스 또는 4'S), pU 또는 5pU (5-프로피닐우라실 3'), 높은 케이스 (2'F 리보뉴클레오티드), 낮은 케이스 (5'-메틸유리딘 또는 5mU), dT (데옥시티민 또는 2'H 티민).
도 4는 NRARP를 표적하는 다음 siRNA 중 하나의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다: 인간 HeLa 세포에서 SEQ ID NO. 10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO. 12 (SYL136003) 및 SEQ ID NO. 13 (SYL136004).
도 5는 NRARP를 표적하는 다음 siRNA 중 하나의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다: 인간 HeLa 세포에서 SEQ ID NO. 10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO. 12 (SYL136003) 및 SEQ ID NO. 13 (SYL136004).
도 6은 NRARP 및 이의 변형된 대응자를 표적하는 다음 siRNA 중 하나의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다: 인간 HeLa 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 7은 NRARP 및 이의 변형된 대응자를 표적하는 siRNA SEQ ID NO. 10의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다: 인간 HeLa 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 8은 SEQ ID NO. 10 및 이의 변형된 대응자의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다: 뮤린 C2C12 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 9는 래트 ARL6 세포에서 SEQ ID NO. 10 또는 SEQ ID NO. 37의 형질 주입 후 생체 외 NRARP 유전자 발현 레벨이다.
도 10은 SEQ ID NO. 10 및 이의 변형된 대응자의 형질 주입 후 생체 외 세포 생존율이다: 인간 HeLa 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 11은 SEQ ID NO. 10 및 이의 변형된 대응자의 형질 주입 후 생체 외 세포 생존율이다: 인간 BEAS-2B 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 12는 SEQ ID NO. 10 및 이의 변형된 대응자의 형질 주입 후 생체 외 세포 생존율이다: 뮤린 C2C12 세포에서 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39.
도 13은 래트 ARL6 세포에서 SEQ ID NO. 10 또는 SEQ ID NO. 37의 형질 주입 후 생체 외 세포 생존율이다.
도 14는 레이저에 의한 CNV의 주입 후 망막에서 NRARP mRNA의 레벨이다. 데이터는 시점 당 3마리 동물(6개의 안구)의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다.
도 15는 레이저에 의한 CNV의 주입 후 choroid/RPE에서 NRARP mRNA의 레벨이다. 데이터는 시점 당 2마리 동물(4개의 안구)의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다.
도 16은 국소적으로 투여된 운반체 또는 SEQ ID NO.37 (5 mg/mL)으로, 또는 항-VEGF (5 ㎍/eye)의 유리체 내 주사로 레이저 치료 3주 후에 병변 측정의 바 그래프이다. 병변의 면적은 병변의 중앙에서 무혈화(avascularization)를 제외한 컴퓨터화된 이미지-분석 소프트웨어를 이용하여 정량화된(픽셀2로) 플루오로세인 혈관 조영술에 의해 측정된다. 데이터는 시점 당 6마리 동물(12개의 안구)의 평균 ± s.e.m 를 나타낸다.
도 17은 구조를 평가하는데 연구된 변수; 1.-마스터 접합의 수; 2.-마스터 단편의 수; 3.-총 마스터 단편의 길이; 4.-메쉬의 수; 5.-총 메쉬 면적.
도 18은 완전 배지에 대응하여 연구된 다양한 파라미터의 변화이다. 다음 파라미터를 나타낸다; 마스터 접합의 수; 마스터 단편의 수; 마스터 단편의 총수; 메쉬의 수; 메쉬의 총 면적. 결과는 음성 대조군으로서 보충물 없는 EBM 배지 (기본) 또는 보충물 및 10% FCS를 갖는 완전 배지(양성 대조군)를 이용하여 매트리젤로 피복된 배양 접시 상에 플레이팅된 세포로부터 얻어진다.
도 19는 SEQ ID NO. 37 또는 KDR siRNA에 대해 연구된 다양한 파라미터의 분석이다.
도 20은 다양한 조건에 대해 형성된 구조의 그림이다.
도 21은 A. 다양한 농도의 VEGF에 대한 HUVEC 세포의 증식, B. bevabizumab에 의해 VEGF 유도된 증식의 억제이다.
도 22는 HUVEC 세포에서 완전 배지 (10% FCS 및 100 ng/ml VEGF)에 의해 유도된 확산에 대한 항-KDR siRNA 또는 siRNA SEQ ID No. 37의 효과이다.
도 23은 VEGF의 증가량에 대한 HUVEC 세포의 이주이다.
도 24는 완전 배지 (10% FCS + 100 ng/ml VEGF) 및 보충물 없는 배지에 의해 유도된 HUVEC 세포의 이주에 대한 항-KDR siRNA 또는 siRNA SEQ ID NO. 37의 효과이다.
도 25는 다양한 조건에 대한 상위 부분(이주하는)에서 세포의 그림이다.
도 26은 A. 10 ng/ml VEGF에 대한, 기본 조건에서 상처 치유의 정량화, B. 유도 후 시간 0 및 24시간에 병변의 그림이다.
도 27은 완전 배지(10% FCS 및 100 ng/ml VEGF)에 대한 및 기본 조건에서 상처 치료의 정량화이다.
도 28은 분석된 다양한 조건에서 유도 후 시간 0 및 16시간에 상처를 나타내는 그림이다.
도 29는 HUVEC 세포에서 NRARP의 mRNA 레벨이다.
일 양태에서, 본 발명은 NRARP의 발현 및/또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환(eye condition)의 치료 및/또는 예방에 약으로 이용하기 위한 siRNA 분자의 제공에 관한 것이고, 상기 분자는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어지거나 이를 포함하는 군에서 선택되는 서열을 특이적으로 표적하고, 세포에 도입될 때 NRARP 유전자의 발현을 감소시킨다. 바람직하게 표적 서열은 SEQ ID NO. 1로 이루어지거나 이를 포함한다.
유전자는, 예컨대 siRNA 분자가 유전자의 발현을 선택적으로 감소 또는 억제할 때, 본 발명에 따른 siRNA에 의해 "표적된다(targeted)". 여기서 사용되는 구절인 "선택적으로 감소 또는 억제"는 이러한 NRARP의 경우에 하나의 유전자의 발현에 영향을 미치는 siRNA를 포함한다. 또는, siRNA는, siRNA (중 하나의 가닥)이 유전자 전사체, 즉 mRNA로 엄중한 조건 하에서(under stringent conditions) 하이브리드될 때 유전자를 표적으로 한다. "엄중한 조건 하에서" 하이브리드는, 표준 조건, 예를 들어 하이브리드화를 불리하게하는 경향이 있는 고온 및/또는 저염 함량 하에서 표적 mRNA 영역에 어닐링하는 것을 의미한다. 적합한 프로토콜(2시간 동안 68 ℃, 0.1ХSSC를 포함함)은 Maniatis, T., 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, on pages 387-389에 기재되어 있다.
여기에 인용된 핵산 서열은 달리 언급하지 않으면 5'에서 3' 방향으로 기재된다. "핵산"의 용어는 DNA (아데닌 "A", 사이토신 "C", 구아닌 "G", 티민 "T")에 또는 RNA (아데닌 "A", 사이토신 "C", 구아닌 "G", 우라실 "U")에 존재하는 푸린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 또는 그 변형된 형태를 말한다. 여기에 제공되는 RNA 간섭은 "T" 염기가 RNA에서 자연적으로 일어나지 않지만, 예컨대 3' 말단에서 "T" 염기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들 염기는 리보뉴클리오티드의 쇄에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드를 분화하도록 "dT"로 나타낼 수 있다.
상기 정의된 표적 서열은 siRNA를 고안하는 것을 목적으로 이용되는 데이터베이스에서 전사물 변이체의 정의에 이용되는 표적 DNA 서열로 기재되지만, 사용될 특정 화합물은 이런 정의된 RNA 서열일 것이다.
당업자는 공공 데이터 베이스를 통해 임의의 표적 유전자 서열을 접근할 수 있다. 예컨대, 인간 NRARP mRNA에 대응하는 GenBank Accession Number는 NP_001004354.1 및 NM_001004354.2 (유전자 ID: 441478)이다. 또한, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)은 다음 NRARP 인간 Accession Number: ENSG00000198435를 갖는다. 이 정보 전체는 프리-엑세스 Ensembl 데이터 베이스에 있다.
본 발명에서 확인되는 상기 바람직한 표적 영역은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 바람직한 표적은 SEQ ID NO. 1로 이루어지거나 이를 포함한다.
이들 서열은 다음 종들 사이에 100% 상동성이 존재한다: 호모 사피엔스, 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 시궁쥐(Rattus norvegicus), 회색 늑대(Canis lupus familiaris), 및 돼지(Sus scrofa domestica).
RNAi 분야에서, 인간 siRNA가 동물 모델 유전자의 녹다운을 유도할 수 없는 것을 생체 외 연구가 입증할 때, 대리 화합물(동물-활성 유사체)은 적합한 동물 모델에서 siRNA의 효능을 분석하기 위해 합성된다. 이 대리물은 인간 siRNA와 동일한 영역에 대해 고안되고, 따라서 2개의 siRNA는 인간과 동물 표적 유전자 사이에 상동성에 따라 달라지는 몇개의 뉴클레오티드를 제외한 동일한 서열을 갖는다. 이러한 접근법은 다른 올리고뉴클레오티드, 특히 독성 및 효능 연구의 발전에 널리 이용되어 왔다.
더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 바람직한 표적 영역은 SEQ ID NO. 1 (5'- CACCAGGACATCGTGCTCT -3')로 이루어지거나 이를 포함한다.
결과적으로, 본 발명의 양태에 따른 siRNA는 바람직하게는 이중 가닥의 RNA 분자를 포함하고, 이들의 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어지는 적어도 하나의 서열에 실질적으로 상보적인 RNA를 포함하고, 이들의 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보적인 RNA 서열을 포함할 것이고, 이들 가닥 모두는 뉴클레오티드 사이에 짝을 이루는 표준 염기로 하이브리드화 된다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 양태에 따른 siRNA는 바람직하게는 이중 가닥 RNA 분자를 포함하고, 이들 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9에 실질적으로 상보적인 RNA 서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 1에 실질적으로 상보적인 RNA 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
본 발명의 의미 내에서, 표적 MRAN 서열에 "실질적으로 상보적인"은 상기 표적 서열에 "실질적으로 동일한"으로 이해될 수도 있다. 당업자에게 알려진 "상동성(Identity)"은 서열 사이에 뉴클레오티드의 순서 및 상동성을 매칭함으로써 결정되는 뉴클레오티드 서열 사이에 서열 관련 정도이다. 일 실시형태에서, 표적 mRNA 서열에 5%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥은 실질적으로 상보적인 것으로 간주되고, 본 발명에 이용될 수 있다. 상보성의 퍼센트는 2차 핵산 분자에 인접한 뉴클레오티드 세트를 갖는 왓슨-크릭 센스에 염기쌍일 수 있는 제1 핵산 분자에 인접한 뉴클레오티드의 퍼센트를 기재한다. 바람직한 실시형태에서, 안티센스 siRNA 가닥은 표적 mRNA 서열에 100% 상보적이고, 센스 가닥은 siRNA의 이중 가닥 부분에 걸쳐 안티센스 가닥에 100% 상보적이다. 또한, siRNA는 짝 지어지지 않은 오버행, 예컨대 3' 디뉴클레오티드 오버행, 바람직하게 dTdT를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 정의된 상기 안 질환(바람직하게는 망막적 안 질환)은 신혈관 형성과 관련된 질환 또는 질병이다. 더욱 바람직하게, 상기 안 질환은 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia, DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema, DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization) 및 미숙아 망막병증(ROP) 및 이들의 조합에서 선택된다.
최신 기술에 알려진 바와 같이, RNA 간섭을 달성하기 위해 다수의 다양한 구조가 제안되었다. 일반적으로 이들 이중 가닥 분자는 길이에서 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드로 되어있고, 블런트-말단인 구조 및 오버행을 갖는 것을 포함한다. 오버행은 유리한 것으로 기재되고, RNAses에 의한 인식을 줄이고, 다이서의 본래 기질을 모방함에 따라 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 존재할 수 있다. 일부 저자는 분자의 3' 말단 상에 오버행을 포함하는 것을 추천하지만, 다른 사람들은 하나의 오버행을 충분한 것으로 여긴다. 다른 사람들은 특정 변형 패턴을 갖는 블런트-말단인 구조를 이용하는 것을 기재한다(EP1527176, WO2005062937, WO2008104978, EP2322617, EP2348133, US20130130377, 및 다수의 다른 것들).
오버행은 1 및 5개의 뉴클레오티드 사이에 포함될 수 있다; 일반적으로 오버행은 디뉴클레오티드로 구성된다. 이 분야에 이용되는 고전적인 분자는 바람직하게는 Tuschl (WO0244321)에 의한 최초 연구에 지시된 데옥시뉴클레오티드를 포함하는 3' 디뉴클레오티드 오버행을 더 포함하는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 분자를 포함한다. 이들 오버행은 뉴클레아제 (RNase) 열화에 내성이 더욱 향상된다고 한다. 그 후, Kim 외 2005는 21-mer 제품(디뉴클레오티드 오버행을 함유함)이 RISC 상에 로딩을 위해 필요한 것이 기재되었다. 또한, Bramsen 외 2009는 오버행에 가능한 불안정하게 하는 변형을 도입하여 사일런싱 효율을 증가시키는 것이 기재되었다.
본 발명의 다양한 양태 중 바람직한 실시형태는 적어도 하나의 오버행, 바람직하게는 센스 및/또는 안티센스 가닥에 3' 오버행을 포함하는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 서열을 표적하는 siRNA 분자를 말한다. 더욱 바람직하게, 상기 siRNA 분자는 SEQ ID NO. 1을 표적한다. 본 발명이 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 siRNA 분자를 말하고, siRNA는 표적에 동등한 길이 및 상보적인 안티센스 가닥, 및 상기 안티센스 가닥과 동등한 길이 및 상보적인 센스 가닥을 포함할 것이다. 안티센스 및 센스 가닥은 다른 가닥 또는 표적에 상보적이지 않고, 및/또는 siRNA의 이중 가닥 부분에 쌍이 되지 않은 추가적인 염기를 더 포함할 것이다. 예컨대, SEQ ID NO 1은 19개의 뉴클레오티드로 된 서열이다; siRNA는 서열 상동성 및 추가적인 디뉴클레오티드 오버행 부분에 걸친 19 bp 이중 가닥 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태 중 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 siRNA 분자를 말하고, 이중 가닥 siRNA 분자의 각각의 가닥은 길이에서 약 18 내지 약 28개 이상의(예컨대 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28 이상) 뉴클레오티드이다.
본 발명의 다양한 양태 중 다른 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 구성되는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 길ㅇ이에서 18-28개의 뉴클레오티드 이상의 siRNA 분자를 말한다. 더욱 바람직하게, 이중-가닥 siRNA 분자는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 구성되는 군에서 선택되고, 적어도 길이에서 19개의 뉴클레오티드로 되어있다.
본 발명의 다양한 양태 중 다른 실시형태는 블런트-말단인 분자를 제공한다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시형태는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 구조로 이루어지거나 이를 포함하는 siRNA를 말한다. 더욱 바람직하게, SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 구조로 이루어지거나 이를 포함하는 siRNA, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO. 1을 표적하는 것.
본 발명의 특정 실시형태는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 블런트-말단인 siRNA를 말한다. 더욱 바람직하게, siRNA는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하고, 더욱 바람직하게 siRNA는 SEQ ID NO. 1을 표적으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 이 화합물은 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 이러한 siRNA의 안티센스 가닥은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열에 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 상보적이다.
바람직한 실시형태에서, 이 화합물은 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 이러한 화합물은 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 구성되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥, 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥으로 이루어지거나 이를 포함한다.
더욱 바람직한 실시형태에서, 이러한 화합물은 SYL136001로 명명된 참조 화합물에 대응하여 SEQ ID NO. 10 (5'- CACCAGGACAUCGUGCUCU -3' 센스 가닥 및 5'- AGAGCACGAUGUCCUGGUG -3' 안티센스 가닥)으로 이루어지거나 이를 포함한다.
또한, 본 발명의 배경이라 하는 부분에 기재되는 바와 같이, siRNA 분자가 갖는 중요한 문제는 RNAses의 유비쿼터스 특성에 기인한 생체액에서의 불안정성이다. 결과적으로, 뉴클레오티드에 대한 다수의 다양한 화학적 변형의 이용은 향상된 화합물 안정성을 목적으로 기재된다.
siRNA 분자의 다른 고유의 문제는 면역원성이고, siRNAs는 소정의 사이토킨의 상향 조절, 예컨대 타입 I 및/또는 타입 II 인터페론 및 IL-12, IL-6 및/또는 TNF-알파 제조를 포함하는 본래의 면역 시스템의 비특이적인 활성을 유도하는 것이 발견되었다. 이들 효과의 기원은 siRNA에 의해 TLR7, TLR8 및/또는 TLR3과 같은 톨 유사 수용체(Toll-like receptors)의 활성으로 생각된다.
RNases 및 면역원성에 의한 인식, 이들 효과 모두 서열-의존적인 것으로 기재된다.
또한, RNAses에 민감성을 감소시킴으로써 화합물 안정성을 향상시키는 일부 화학적 변형은 면역 인식의 유도를 감소시키고, 결과적으로 이어지는 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 그러나, siRNA에 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 삽입은 이전 부분에 기재된 바와 같이 사일런싱 효능을 감소시킬 수 있어, 조심스럽게 접근해야 한다.
결과적으로, 본 발명의 다양한 양태의 바람직한 실시형태에서, siRNA는 화학적 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 더 포함한다.
안정성을 향상시키고, 면역 효과를 감소시키는 바람직한 화학적 변형은 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-아미노 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 또는 2'-O 또는 4'-C를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 엑소뉴클레아제 보호를 위한 다른 바람직한 화학적 변형은 EEL(ExoEndoLight pattern of modification)을 포함한다: 센스 가닥에서 전체 피리미딘의 2'-O-메틸 잔기로의 변형, 및 안티센스 가닥에서 5'-UA-3' 또는 5'-CA-3' 모티프 중 전체 피리미딘의 2'-O-메틸 잔기로의 변형. 또한, 센스 가닥의 위치 1은 센스 가닥의 5'-포스포릴레이션을 방지하도록 2'-O-메틸로 변화되어, siRNA의 가닥-특이성을 증가시킬 수 있다. 또한, 위치 14에서 2'-O-Me 잔기가 센스 가닥을 불활성화 하여, siRNAs의 가닥 특이성을 증가시키기 때문에, 센스 가닥은 위치 14에서 2'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레아제 보호를 위한 다른 바람직한 화학적 변형은 MEF(Methyl-Fluoro modification pattern)를 포함한다: 센스 가닥의 2'-F로 시작하는(5'-말단), 안티센스 가닥의 2'-O-Me로 시작하는 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변경(alternating). 또한, 센스 가닥의 위치 1은 2'-O-Me로 변경되고, 안티센스 가닥의 위치 1은 2'-F로 변경될 수 있다(2'F 잔기는 5'-포스포릴레이션과 양립될 수 있지만, 2'O-Me 잔기는 벌키하고 일반적으로 포스포릴레이션을 손상시키기 때문에). 이러한 변형 패턴은 분자를 안정화시킬 뿐 아니라 센스를 사용하기 위한 RISC의 능력을 무력화해 가닥-특이성을 증진한다. 또한, 리보뉴클레오티드 백본의 변형은 포스포디에스테르 결합 대신에 포스포티오에이트 결합을 이용하여 뉴클레오티드를 결합함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 의미 내에서 더욱 바람직한 화학적 변형은 4'티오리보오스, 5-프로피닐우라실 3', 5'-메틸유리딘 또는 우라실 리보뉴클레오티드의 데옥시티미딘으로의 치환(데옥시리보뉴클레오티드)을 말한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 리보뉴클레오티드 백본의 적어도 하나의 화학적 변형 및/또는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 siRNA의 센스 가닥 상에, 안티센스 가닥 상에 또는 이들 모두에서 이루어진다.
따라서, 일 실시형태에서, siRNA는 SEQ ID NO. 19 내지 SEQ ID NO. 66으로 구성된 군에서 선택된 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥을 갖는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, siRNA는 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 63 및 SEQ ID NO. 65로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥, 및 각각 SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 64 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 상기 센스 가닥에 상보적인 안티센스 가닥으로 이루어지거나 이를 포함한다.
상기 기재된 siRNA 분자는 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 본래의 구조에서 세포 내부로 전달될 수 있다. 예컨대, 생체 외 유전자 사일런싱을 연구하면서, 이들 화합물은 표준 형질 주입 시약을 이용하여 투여된다. 또한, 생체 내에서 효과를 얻기 위해, 다수의 다양한 대체물이 기술분야에 알려져 있고, 신체 내에 바람직한 표적 부위에 따라 다르게 이용될 수 있지만, 이들 화합물이 그 자체로(naked) 또는 특정 부위 등과 연결, 예컨대 리포좀과 같은 제제를 향상시키는 전달을 이용하여 투여될 수 있다.
또는, 본 발명의 다양한 양태의 siRNA 분자는 진핵 프로모터로부터 세포 내로 발현될 수 있다. siRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 표적 세포에 전달 및 지속될 수 있다. 또는, 핵산 분자의 일시적인 발현을 위해 제공되는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 필요에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면, siRNA 분자는 표적 mRNA와 상호 작용하고, RNA 간섭 반응을 생성한다. 이들의 센스 및 안티센스 가닥은 뉴클레오티드의 작은 루프에 의해 연결되기 때문에, 이 방법에서 제조된 siRNA 분자는 종종 shRNA(짧은 헤어핀 RNA)로 일컬어진다. 벡터를 발현하는 siRNA 분자의 전달은, 예컨대 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 환자로부터 외식된(ex-planted) 표적 세포를 투여한 후 환자에 재주입함으로써, 또는 바람직한 표적 세포로 도입시키는 임의의 다른 방법에 의해 침투적(systemic)일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 NRARP의 발현 및/또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환의 치료 방법에 이용되는 약의 제조 시에 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 siRNA의 용도를 말한다. 더욱 바람직하게, 상기 서열은 SEQ ID NO. 1이다. 상기 방법은 환자에 NRARP의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 억제란 용어는 발현 또는 활성의 하향 조절 또는 감소를 지시하는 것으로 이용된다. 바람직하게, 안 질환은 신혈관 형성과 관련된 질환 또는 질병이다. 일 실시형태에서, 안 질환은 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia, DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema, DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization)(일반적으로 망막 밑 신혈관 형성, 푹스점(Fuchs' spot) 또는 포스터-푹스 망막 점(Forster-Fuchs' retinal spot) 및 병리적 근시의 원반상 열화로도 하는) 및 미숙아 망막병증(ROP) 및 이들의 조합을 포함하는 군에서 선택된다.
또한, NRARP의 발현 및/또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환의 치료 방법이 제공된다. 방법은 환자에 NRARP의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 방법은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 siRNA를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 서열은 SEQ ID NO. 1이다.
NRARP mRNA에 대해 지시된 siRNAs로의 치료는, 이들이 뉴클레오티드 서열만 다르기 때문에 이들 또는 다른 유전자 표적을 표적하는 다른 siRNA 제제를 갖는 균일한 화학적 특징 및 활성의 본래의 메카니즘, 강도, 안정성, 특이성에 기인하여 종래의 항-혈관 형성 치료제보다 유리한 것으로 전망된다. siRNAs에 기반한 치료는 유리체 내 주사의 결과를 억제할 수 있는 지속적 효과 및 NRARP 유전자 발현의 지속된 감소를 유발하는 표적 단백질의 합성을 차단한다. 이것은, 그 치료 동안 다수의 유리체 내 주사를 필요로 하는 만성적 질환이기 때문에, 한정되지 않지만 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia, DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema, DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization) 및 미숙아 망막병증(ROP)을 포함하는 신혈관 형성과 관련된 질병 또는 질환과 같은 경우에 특히 중요하다. 반복적인 안구 내 주사는 특히 안구의 증가된 압력, 염증, 출혈, 감염, 망막 또는 주변 신경 또는 구조의 손상, 시력 상실을 포함하는 해로운 부작용뿐 아니라, 동공을 확장시키는 약물 또는 항생제의 이용으로부터 유도되는 것과 같이, 처치 동안 이용되는 약물로부터의 부작용의 위험을 증가시킨다. 게다가, siRNAs는 단일 뉴클레오티드 만큼 작음으로써 야생형 대립 형질과 다른 변이 유전자 대립 형질의 발현을 사일런싱 하도록 엔지니어링될 수 있다. 따라서, siRNA에 기반한 치료는 유리하게도 야생형 단백질의 발현을 지속시키면서 선택적으로 질병 변이 대립 형질을 불활성화시킴으로써, 질병을 늦추거나 억제하기 위해 점 변이를 갖는 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
이러한 약의 제조임을 유념하여, 본 발명의 다양한 양태의 siRNA는 약제학적조성물로 제제될 수 있다. 바람직하게, 상기 siRNAs의 조성물 및 제제은 관심을 갖는 기관에 국소적으로 투여될 수 있다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 이들은 안구에, 바람직하게는 안구의 각막 표면에 국소적 투여를 위해 제제될 수 있다. 각막 표면에의 적용은, 예컨대 점안액, 젤, 로션, 크림 또는 안구 삽입물의 형태일 수 있다. 안구에 다른 투여 형태는 눈으로의 주사를 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 양태의 더욱 바람직한 실시형태는, NRARP의 발현 및/또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환의 치료용 약에 이용되는, 앞선 단락에 기재된 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특히 표적하는 siRNA를 말한다. 더욱 바람직하게, 상기 서열은 SEQ ID NO. 1이다. 상기 기재된 바와 같이, SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 구조로 이루어지거나 이를 포함하는 siRNA일 수 있다. 이 siRNA는 블런트-말단이 될 수 있다. 바람직하게, siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함한다. 본 발명에 따른 용도를 위한 다른 siRNA는 센스 가닥을 갖는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는, 및/또는 SEQ ID NO. 19 내지 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 안티센스 가닥으로 이루어지거나 이를 포함한다.
본 발명의 맥락 내에서, 본 발명의 siRNA의 "특이적으로 표적하는"은 바람직하게는 적어도 동일한 시드(seed) 서열을 포함한다. 따라서, SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특이적으로 표적하는 본 발명에 따른 임의의 서열은 바람직하게는 안티센스 가닥의 2-8 위치에서 동일하다. 더욱 바람직하게, 특이적으로 표적된 상기 선택된 서열은 SEQ ID NO. 1이다.
상기에도 불구하고, 본 발명의 다양한 양태는 눈 이외의 조직에 NRARP 발현을 사일런싱하도록 사용될 수 있고, 따라서 상기 siRNAs는 제제되어야 한다.
예컨대, siRNA 분자는 환자에 투여하기 위해 리포좀을 포함하는 전달 운반체를 포함할 수 있다. 캐리어 및 희석액 및 이들의 염은 약제학적으로 허용되는 제제에 제공될 수 있다. 핵산 분자는 그에 제한되지 않지만, 리포좀으로 캡슐화, 이온도입법에 의해, 또는 생분해성 폴리머, 하이드로젤, 시클로덱스트린 폴리(락틱-코-글리콜릭)산 (PLGA) 및 PLCA 미세구, 생분해성 나노캡슐, 및 생접착성 미세구와 같은 다른 운반체로의 도입에 의해, 또는 단백질 벡터에 의해 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 세포에 투여될 수 있다. 또한, 세포 내 전달 성분은, 그것에 한정되지 않지만, 핵산의 리소좀 열화를 억제시키고, 바이러스 단백질(예컨대 인테그라아제, LTR 요소, rep 단백질, oriP 및 EBNA-1 단백질) 또는 세포 표면 단백질과 상호 작용하는 바이러스 성분)의 발현을 유지시키고, 엔도솜(endosome)을 방해하기 위한 융합 생성 바이러스성 펩티드를 포함하는 바이러스성 성분일 수 있다. 적합한 바이러스성 세포내 전달 성분은, 그것에 한정되지 않지만, RNA 종양 바이러스(retroviruses), 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. 일 실시형태에서, siRNA 분자는 바이러스 및 리포좀의 성분을 조합하는 세포-특이 siRNA 캐리어를 통해 전달된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 폴리에틸렌이민 및 그 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸알락토사민(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL) 유도체로 제제 또는 이들과 혼합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물은 pH 범위 약 7.0 내지 약 7.4, 바람직하게 pH 7.2 + 0.5를 갖는 포스페이트-완충액(PBS)와 같은 수용액, 특히 식염수이다.
본 발명의 siRNA 분자는 막 억제제(membrane disruptive agents) 및/또는 양이온성 액체 또는 헬퍼(helper) 액상 분자와 혼합될 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 전달 시스템은, 예컨대 수성 및 비수성 젤, 크림, 다중 에멀젼, 마이크로에멀젼, 리포좀, 연고, 수성 및 비수성 용액, 로션, 에어로졸, 하이드로카본 베이스 및 파우더를 포함하고, 가용화제, 투과 향상제(예컨대, 지방산, 지방산 에스테르, 지방 알콜 및 아미노산), 및 친수성 폴리머(예컨대 폴리카르보필 및 폴리비닐피롤리돈)과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 캐리어는 리포좀 또는 경피성 향상제이다.
본 발명의 약제학적 제제는 투여, 예컨대 세포 또는 예컨대 인간을 포함하는 환자에게 동시 또는 국부적 투여에 적합한 형태이다. 적합한 형태는 부분적으로 용도 또는 들어가는 루트, 예컨대 경구, 경피, 또는 주사에 따라 달라진다. 다른 요소가 기술분야에 알려져 있고, 조성물 또는 제제가 그 효과를 발휘하지 못하도록 하는 형태 및 독성과 같은 고려 사항이 포함된다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 희석액에 바람직한 화합물의 약제학적 유효량을 포함하는 저장 또는 투여를 위해 제조된 조성물을 포함한다. 치료적 용도의 허용되는 캐리어 또는 희석액은 약제학적 기술에 잘 알려져 있다. 예컨대, 보존제, 안정화제, 염료 및 향미료가 제공될 수 있다. 이들은 소듐 벤조에이트, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한, 항산화제 및 서스펜딩제가 사용될 수 있다.
약제학적 유효량은 질병 상태를 치료(증상을 일부 완화, 바람직하게는 증상 전체) 또는 발생을 방지, 억제하는데 필요한 양이다. 약제학적 유효량은 일반적으로 질병의 유형, 사용되는 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려 중인 특정 포유류의 물리적 특성, 동시에 발생하는 약, 의학 기술의 당업자가 인식하는 다른 요소들에 따라 달라진다.
또한, 치료학적 유효량은 바람직하게는 맥락막 또는 망막의 신혈관 형성과 관련된 안 질환의 시작을 지연 또는 최소화 하기에 충분한 siRNA의 양이라 할 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 바람직하게는 맥락막 또는 망막의 신혈관 형성과 관련된 안 질환의 치료 또는 관리에 치료학적 이점을 제공하는 치료제의 양이라 할 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA에 대한 치료학적 유효량은, 바람직하게는 맥락막 또는 망막의 신혈관 형성과 관련된 안 질환의 치료 또는 관리에 치료학적 이점을 제공하는, 단독으로 또는 다른 치료법과 조합하는 치료제의 양을 의미한다. 본 발명의 siRNA의 양과 관련하여 사용되는, 이 용어는 전체 요법을 개선하고, 원치 않는 효과를 제거 또는 억제하고, 또는 다른 치료제와 시너지화 또는 치료학적 효능을 향상시키는 양을 포함할 수 있다.
신혈관 형성과 관련된 안 질환의 치료 또는 관리에서 치료적 이점은, 신혈관 형성의 지속적 감소이다. siRNA이 세포 내에서 NRARP의 레벨을 감소시킨다면, 일단 치료가 중단되면, 세포는 새로운 단백질을 재합성해야 한다. siRNA 치료에 기반한 요법은 신혈관형성과 관련된 VEGF 수용체 또는 다른 단백질의 기능을 차단 또는 NRARP를 억제하도록 고안된 소분자를 이용하여 기대되는 것보다 더 지연된 효과를 가질 수 있다. 이는 치료학적 효능의 상당한 향상이 고려된다.
siRNA를 이용하는 추가 이점은 종종 몇가지 점안-기반의 치료와 연관되는 체순환에서 그 존재로부터 유도되는 독성 또는 역효과의 최소 가능성이다. 이는, 화합물이 혈류에 들어갈 때, 혈액에 존재하는 RNAses에 의해 빠르게 열화될 수 있다는 사실에 기인한다.
한편, siRNA 분자가 1회용 유리병에 시판될 수 있다는 사실은, 제제에 향균 보존제의 첨가가 억제될 수 있는 것을 의미한다. 이들 보존제는 일부 환자에게 잘 순응되지 않음(intolerance)을 제공하여, 치료를 중단할 필요가 있게 한다.
바람직한 투여 경로 중 하나는, 안구에 직접 점적 주입함으로써, 바람직하게는 점안제를 이용하는 국소적인 것이다. 망막 질병의 치료를 위한 현재 승인된 약물 중 방대한 다수가 유리체 내 주사에 의해 전달된다는 것을 고려하면, 점안제는 유리체 내 주사보다 역효과가 덜하고, 더 적은 불편함을 야기하기 때문에, 환자의 삶의 질이 개선되는 것으로 예측된다.
그러나, 상기 설명된 바와 같이, 안구에 직접 이외로 투여 경로가 이용될 수 있다. 또한, 제제에 적용되는 정확한 양 및 투여 스케줄은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 또한, 당업자는 적용될 투여 스케줄 및 정확한 양은 장애의 중증도에 따라 달라지고, 각각의 환자의 환경 및 의사의 판단에 따라 결정되어야 하는 것을 이해할 것이다. 또한, 임의의 특정 환자에 대한 특정양 레벨은 적용되는 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강, 성, 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 배설률, 약물 조합 및 요법을 겪는 특정 질병의 심각도를 포함하는 다양한 요소에 따라 달라진다는 것으로 이해된다.
여기에 기재되고, 본 발명의 siRNA 또는 제제는 종래의 비독성 약제학적으로 허용되는 캐리어, 보조제 및/또는 운반체를 함유하는 유닛 복용 제제로 투여될 수 있다. 제제는 경구용, 예컨대 타블렛, 정제, 캔디(lozenges), 수성 또는 유성 서스펜션, 분산 가능한 파우더 또는 과립, 에멀전, 하드 또는 소프트 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)에 적합한 형태일 수 있다. 경구용 조성물은 약제학적으로 우아하거나 맛있는 제제를 제공하기 위해 하나 이상의 감미제, 향미료, 착색제 또는 보존제를 함유할 수 있다. 타블렛은 타블렛의 제조에 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 첨가제와 혼합한 활성 성분을 함유한다.
이들 첨가제는, 예컨대 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 소듐 카보네이트(sodium carbonate), 락토오스(lactose), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 또는 소듐 포스페이트(sodium phosphate)와 같은 비활성 희석제; 과립화된, 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 타블렛은 코팅되지 않을 수 있거나 공지 기술로 코팅될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 코팅은 위장관에서 흡수 및 분해를 지연시켜, 장기간 동안 지속된 활성을 제공하기 위한 공지 기술에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 적용될 수 있다.
또한, 경구용 제제는 활성 요소가 불활성 고체 희석제, 예컨대 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 혼합되는 하드 젤라틴 캡슐로, 또는 활성 요소가 물 또는 기름 매체와 혼합된, 예컨대 피넛 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 소프트 젤라틴 캡슐과 혼합되는 소프트 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있다.
수성 서스펜션은 수성 서스펜션의 제조에 적합한 첨가제를 갖는 혼합물에 활성 물질을 함유한다. 이러한 첨가제는 서스펜션화제, 예컨대 소듐 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 히드로프로필-메틸셀룰로오스(hydropropyl- methylcellulose), 소듐 알기네이트(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone) 검 트라가칸트 및 검 아카시아이고; 분산제 또는 습윤제는 자연적으로 발생되는 포스파타이드, 예컨대 레시틴, 또는 지방산과의 알킬렌 산화물의 축합물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과의 에틸렌 산화물의 축합물, 예컨대 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르와의 에틸렌 산화물의 축합물, 또는 헥시톨 무수물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비톨 모노올레이트 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르와의 에틸렌 산화물의 축합물일 수 있다. 또한, 수성 서스펜션은 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미료, 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 슈크로오즈 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 서스펜션은 식물유에서, 예컨대 땅콩 기름, 올리브유, 참기름 또는 코코넛 오일, 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄유에서 활성 요소를 서스펜션화 함으로써 제제될 수 있다. 유성 서스펜션은 증점 안정제, 예컨대 밀랍, 하드 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미료는 맛있는 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
수첨가에 의한 수성 서스펜션의 제조에 적합한 분산 가능한 파우더 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 서스펜션화제 및 하나 이상의 보존제와 혼합하여 활성 요소를 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 또는 서스펜션화제는 상기 이미 언급된 것들로 예시화된다. 또한, 추가적인 첨가제, 예컨대 감미제, 향미료 및 착색제도 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 유상은 식물유 또는 미네랄유 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 에멀젼화제는 자연적으로 발생하는 검, 예컨대 검 아카시아 또는 검 트라가칸트, 자연적으로 발생하는 포스파타이드, 예컨대 콩, 레시틴 및 지방산으로부터 유래된 부분 에스테르 또는 에스테르 및 헥시톨, 무수물, 예컨대 소르비탄 모노올레이트, 및 에틸렌 산화물을 갖는 상기 부분 에스테르의 축합물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 또한, 에멀젼은 감미제 및 향미료를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르제는 감미제, 예컨대 슬리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨, 글루코오스 또는 슈크로오스로 제제될 수 있다. 또한, 이러한 제제는 완화제, 보존제 및 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 본 발명 및 여기에 기재된 siRNA의 약제학적 조성물은 살균한 주사 가능한 수성 또는 기름이 많이 든 서스펜션의 형태일 수 있다.
이러한 서스펜션은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 서스펜션화제를 이용하여 공지 기술에 따라 제제될 수 있다.
또한, 살균한 주사 가능한 제제는 비독성 모성(parentally) 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 1,3-부탄디올 중 용액 중 살균한 주사 가능한 용액 또는 서스펜션일 수 있다. 적용될 수 있는 허용 가능한 운반체 및 용매는 물, 링거 용액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이다. 또한, 살균한, 고정유는 관례적으로 용매 또는 서스펜션화된 매체로 적용된다. 이 목적을 위해, 임의의 단조로운 고정유는 합성적 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하여 적용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사 가능한 제제용으로 확인된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 바람직하게는 예컨대 점안제의 형태로 PBS와 같은 완충 생리 식염수 또는 안구에 국소 투여를 위한 젤의 용액으로 제제된다. 이러한 실시형태에서, 제제는 양이온성 에멀젼이고, 및/또는 그것에 한정되지 않지만 폴리(락타이드-코-글리코라이드), 카르보폴, 히아루론산 및 폴리아크릴산을 포함하는 바이오폴리머를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는, 예컨대 약물의 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은, 실온에서 고체이지만 직장의 온도에서 액체이어서, 약물을 분해하기 위해 직장에서 용융될 수 있는 적합한 거슬리지 않는 첨가제와 약물을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 이러한 재료는 코코아 버터 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 살균 배지에 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용된 운반체 및 농도에 따라 달라지는 약물은 운반체에 서스펜션화 또는 용해될 수 있다. 유리하게, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 보조제는 운반체에 용해될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 조성물은 상기 단락에 기재된 바와 같이 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 표적하는 적어도 siRNA를 포함한다. 더욱 바람직하게, 상기 서열은 SEQ ID NO. 1이다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 전체 치료 효과를 증가시키기 위해 다른 치료적 화합물과 혼합하여 환자에 투여될 수 있다. 조짐(indication)을 치료하기 위한 다중 화합물의 용도는 부작용의 존재를 감소시키면서 유리한 효과를 증가시킬 수 있다.
다음 정의는 본 발명의 이해가 용이하도록 포함된다.
"치료(treat)"에 대해, 출원인은 의학적으로 처리하는 것을 의미한다. 이 용어는 질환에 동반되는 비정상적 혈관 성장과 같이 질병과 관련된 생리학적 변화를 다루기 위해, 또한 황반 변성을 동반하는 시력의 감소와 같이 망막 질환의 증상을 완화하도록 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
"망막 질환(retinal disease)"은 망막이 다중 및 변수 병인론에 기인하여 영향받는 임의의 질병을 의미한다.
"신혈관 형성(vascularization)"은 적혈구 관류와의 기능적 미세혈관의 네트워크의 형성 과정을 말한다.
"혈관 신생(angiogenesis)"은 이미 존재하는 혈관으로부터 생기고, 모세혈관 싹의 생장 및 돌출을 말한다.
"망막 혈관 신생(retinal neovascularization, RNV)"은 망막에서 새로운 혈관의 싹을 말한다.
"맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization, CNV)"은 맥락막 맥관 구조로부터 새로운 혈관의 싹을 말한다.
"신혈관 형성과 관련된 질병 또는 질환(disease or disorder related to neovascularization)"은 상기 언급된 병리학적 새로운 혈관을 생성하는 임의의 질병 또는 질환을 말한다. 이러한 질병 또는 질환에 대해서, 그것에 한정되지 않지만, 그 중에서도 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia, DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema, DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization), 중심성 망막 정맥 폐색(central retinal vein occlusion, CRVO) 및 미숙아 망막병증(ROP)이 언급될 수 있다. 신혈관 형성과 관련된 다른 안구 질병 또는 질환은, 예컨대 홍채 신혈관 형성(iris neovascularization)(홍채 신생혈관(Rubeosis iridis)) 및 각막 혈관신생(corneal neovascularization, CN)을 포함한다. 홍채 신혈관 형성은 종종 당뇨병, 망막아세포종(retinoblastoma), 중심성 망막 정맥 폐색, 안허혈 증후군(ocular ischemic syndrome) 또는 만성 망막 분리(chronic retinal detachment)와 연관된다. 각막 혈관신생은, 트라우마 또는 상해의 결과로, 또한 안검염(blepharitis), 포도막염(uveitis) 또는 각막염(keratitis), 각막 궤양(corneal ulcers), 녹내장(glaucoma) 및 주사 또는 루푸스와 같은 다른 안구 표면 질환으로부터의 염증과 관련되지만, 컨택트 렌즈를 착용함으로써 종종 야기된다.
노인 황반 변성(AMD)이라고도 하는 황반변성은 50 이상의 나이에 미국에서 시력 상실의 가장 일반적인 원인이고, 이의 유병률은 나이들수록 증가한다. AMD의 근본적인 원인은 망막 색소 상피(retinal pigment epithelium, RPE)에서 망막의 광수용체의 외부의 리뉴얼 과정에 의해 생성되는 잔여 물질의 축적으로 보인다. RPE에서 드루젠(drusen)으로 알려진 비분해성 물질의 축적은 중심 망막, 또는 황반에서 광수용체 열화를 야기하는 염증 매개체를 생성시킨다(Bird AC, 2010). 중심와(fovea)라고도 하는 황반의 중심은 놓은 예리한 시력을 조절한다; 그 결과 그 열화는 심각한 시력 상실을 야기한다. 질병의 초기 단계에서, 드루젠의 축적은 적고, 종종 RPE의 저색소침착 또는 과색소침착와 함께 관측된다. 질병이 진행됨에 따라, 드루젠의 크기 및 양이 증가한다. AMD는 습성(황반 변성(neovascular)) 또는 건성(황반 변성(non-neovascular))으로 분류된다. 질병의 건성 형태가 가장 일반적이다. 중앙 망막이 왜곡되고, 침착되고, 가장 일반적으로 얇아질 때, 망막 색소 상피의 위축 및 반점 광수용체의 상실과 관련된 과정이 일어난다. 결과는 중앙 지도 모양 위축이다. 질병의 습성 형태는 건성 형태보다 더욱 심각하고 심각한 시력 상실을 야기한다. 습성 형태는 일반적으로 나이와 연관되고, 습성 반점의 열화를 야기할 수 있는 다른 질병은 AIDS에 걸린 개인에게 악화될 수 있는 히스토플라스마증과 같은 일부 눈 내 전염 및 심각한 근시를 포함한다. 습성 형태는, 출혈, 삼출, 흉터, 또는 망막 박리를 야기하는, 망막 색소 상피를 통해 자라는 비정상적인 혈관을 특징으로 한다.
허혈성 망막병증은 CNV 및 RNV의 발병의 일반적인 요소이다. 국소빈혈은, 혈관 표피 성장 인자(VEGF)와 같은 혈관 형성 자극제의 발현을 상향 조절하도록 세포 신호 경로를 활성화 하는 세포 저산소혈(cellular hypoxia)을 야기한다. VEGF는 강력한 혈관 신생 촉진 활성을 갖는 분비된 당단백질이다. VEGF는 세포 증식 및 이동을 자극하기 위해 내피세포 상의 VEGF 수용체 (VEGFR)와 결합된다. VEGF가 CNV 및 RNV의 발병 동안 상향 조절되고, VEGF가 CNV 및 RNV 발명의 주요 매개체인 것이 다수의 연구에서 발견되었다.
당뇨 망막병증(DR)은 선진국의 생산 연령 개인 사이에 실명의 중요한 원인을 유지한다. 증식 당뇨 망막병증(PDR)이 타입 1 당뇨병의 가장 일반적인 시력-위협 병변이지만, 당뇨병성 황반 부종(DME)은 타입 2 당뇨병의 시력 둔화의 주된 이유이다. 타입 2 당뇨병의 높은 유행 때문에, DME는 당뇨병 황자에 시력 장애의 주된 이유이다. 다수의 인구-기반 연구에서, 10년의 기간에 걸쳐 DME의 발생률은 타입 1 당뇨병을 겪는 환자가 20%지만, 타입 2 당뇨병을 겪는 환자가 거의 40%였다. 또한, DME는 PDR가 타입 2 당뇨병 환자에게 검출될 때 거의 변함 없이 존재한다. 심각한 저산소증에 기인한 신혈관 형성은 PDR의 특징이지만, BRB의 고장에 기인한 혈관 누수(vascular leakage)는 DME의 발명과 관련된 주요 사건이다.
미숙아 망막병증(ROP)은 망막 성장의 혈관 형성 단계가 완료되기 전에 상대적 저산소증에 노출되는 미성숙된 유아에게 발생된다. 망막 성장의 혈관 형성 단계가 보통 자궁 내의 저산소증으로 진행되기 때문에, 이는 문제가 된다. 따라서, 정상적인 혈관 생성의 망막 성장은 ROP를 방해하고, 널리 무혈관 망막의 형성 및 맥관 소멸을 야기한다. 적절한 혈액 공급 없이, 무혈관 망막은 파괴적인 RNV을 증진하고, 상처 조직의 형성 및 망막 분리를 야기할 수 있어, 영구적인 시력 상실을 초래하는, 허혈성이다.
여기에 사용되는 "환자(patient)"는 포유류, 바람직하게는 인간을 포함하는 동물을 말한다.
본 발명은 다음 제한되지 않는 실시예에 더 기재된다.
실시예
1. 생체 외 분석
1.1 SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO.11 SEQ ID NO. 12 및 SEQ ID NO. 13의 형질 주입 후 NRARP의 유전자 발현 레벨
인간 HeLa 세포는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 형질 주입제(transfecting agent)를 이용하여 상보적 안티센스 가닥과 함께 다음 서열 SEQ ID NO. 10 (SYL136001), SEQ ID NO. 11 (SYL136005), SEQ ID NO. 12 (SYL136003), 및 SEQ ID NO. 13 (SYL136004) 중 하나로 이루어진 센스 가닥으로 이루어진 100 nM의 19 bp 블런트-말단인 dsRNA 중 하나로 형질 주입된다. 각각의 SEQ ID 번호 후 SYL 리퍼런스는 dsRNA 화합물의 리퍼런스를 말한다. 이들 실시예에서(문맥에 분명히 밝혀지지 않는 한), 특정 SEQ ID 번호의 투여 또는 형질 주입이 언급되면, 이는 도 2 및 3에 지시된 상보적인 안티센스 가닥 및 SEQ ID 번호로 이루어진 센스 가닥으로 이루어진 19 bp dsRNA가 투여 또는 형질 주입되는 것을 나타낸다는 것을 유의해야 한다. 전체 형질 주입은 표준 제조자의 지침에 따라 수행된다. 동일한 실험에서, 간섭의 특이성의 대조군으로서 스크램블된 siRNA 서열이 이용된다. 세포 펠릿은 siRNA 활성 메카니즘의 결과로서 mRNA 레벨의 가능한 변이를 평가하도록 수집 및 진행된다. RNA 레벨은 상대적 정량법, 비교적 한계점 2-ΔΔCT법을 이용하여 실시간 PCR로 정량화된다{Livak and Schmittgen, 2001}. 전체 실시간 정량적 PCR 실험은 3번 수행되고, 3번의 독립적인 실험이 반복된다. 평균 및 SEM이 산출되고, 도에 표시된다. 도 3에 도시되는 바와 같이, NRARP mRNA의 레벨은 연구된 3개의 시점에서 SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, 및 SEQ ID NO. 13의 형질 주입에 대응으로 인간 HeLa 세포에서 상당히(50-60%) 감소된다. 기대되는 바와 같이, 스크램블된 siRNA 서열은 임의의 연구된 시점에서 NRARP 발현을 조절하지 못한다.
1.2 본 발명의 siRNAs로 형질 주입 후 인간 세포주의 세포 생존율
본 발명의 siRNAs의 형질 주입 후 세포 생존율을 분석하기 위해, 인간 HeLa 세포에서 형질 주입제로서 리포펙타민 2000을 이용하여 생체 외 독성은 100 nM의 이하 서열 중 하나의 형질 주입 후 연구되었다: SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, 및 SEQ ID NO. 13. 전체 형질 주입은 표준 제조자의 지침을 따라 수행된다. 동일한 시험에서, 스크램블된 siRNA 서열은 간섭의 특이성의 대조군으로 사용되었다. 세포 펠릿은 형질 주입 및 세포 생존율에서 가능한 변이를 평가가 진행된 후 24, 48, 및 72 시간에 수집되었다. 세포 생존율은 Promega의 CellTiter 96® 수성 비방사성 세포 증식 분석법(CellTiter 96® Aqueous Non-Radiactive Cell Proliferation Assay)을 이용하여 측정된다. 이 방법은 MTS 테트라졸륨을 포르마잔으로 감소시키는 살아있는 세포의 양에 기초한다. 포르마잔의 양은 490 nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화된다. 평균 및 SEM은 산출되어 도 5에 플로팅된다. 도 5는 이하 서열 중 임의의 형질 주입에 대응한 세포 생존율에 변화가 없다는 것을 도시한다: SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, 및 SEQ ID NO. 13. 요약하면, 본 발명의 siRNAs는 비독성이고 잘 순응되는 것이 발견된다.
1.3 다양한 세포주에서 본 발명의 변형되지 않는 및 화학적으로 변형된 siRNA의 형질 주입 후 NRARP 발현 레벨
본 발명의 siRNAs의 안정성을 개선하고, 비면역 활성을 보증하기 위해, 다양한 siRNA-최적화된 화학적 변형은 정규 SEQ ID NO. 10 서열 (SYL136001)로 도입되어; 다음 새로운 화학적으로 변형된 개체가 얻어진다: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39. 새로운 화학적으로 변형된 서열은 NRARP mRNA 레벨을 감소시키는 능력을 분석하기 위해 인간, 뮤린 및 래트 세포로 각각 형질 주입되었다. 화학적 변형은 도 3에 설명되었다. 이들 세포가 상당한 레벨의 NRARP를 발현하고, NRARP 발현에 대한 siRNAs의 효과를 연구하기 위한 우수한 모델로 여겨지기 때문에 인간 HeLa, 인간 BEAS-2B 및 뮤린 C2C12 세포가 선택된다. 세포는 형질 주입제로서 리포펙타민 (HeLa cells), Mirus Transit-X2 (BEAS-2B), Dharmarfect 3 (C2C12) 및 siPORT NeoFX (ARL6)를 이용하여 100 nM의 다음 서열 중 하나로 각각 형질 주입된다: SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39. 유전자 발현은 형질 주입 후 3개의 시점(24, 48 및 72시간)에 분석되었다. 전체 형질 주입은 표준 제조자의 지침에 따라 수행된다. 동일한 실험에서, 스크램블된 siRNA 서열은 간섭의 특이성의 대조군으로 이용된다. RNA 레벨은 상대적 정량법, 비교적 한계점 2-ΔΔCT법을 이용하여 실시간 PCR로 정량화된다{Livak and Schmittgen, 2001}. 전체 실시간 정량적 PCR 실험은 3번 수행되고, 3번의 독립적인 실험이 반복된다. 평균 및 SEM이 산출되고, 도 6-9에 도시된 그래프에 플로팅된다. 도 6은 HeLa 세포에서 얻어진 결과를 도시한다. 이 세포주에서, SEQ ID NO. 10 (SYL136001)은 형질 주입 24시간 후 NRARP mRNA 레벨이 60%, 형질 주입 48 및 72시간 후 50% 감소된다. 화학적으로 변형된 SEQ ID NO. 19는 형질 주입 24시간 후 NRARP mRNA 레벨이 60%, 형질 주입 48시간 후 40% 감소되고; 형질 주입 72시간 후 기본 레벨은 완전히 회복되었다. SEQ ID NO. 23은 형질 주입 24-48시간 후 NRARP mRNA 레벨이 40%, 형질 주입 72시간 후 10% 감소되었다. SEQ ID NO. 25는 형질 주입 24-48시간 후 NRARP mRNA 레벨이 50-60%, 형질 주입 72시간 후 20% 감소되었다. SEQ ID NO. 27은 형질 주입 24-48시간 후 NRARP mRNA 레벨이 30% 감소되고, 72시간 후 기본 레벨은 회복되었다. SEQ ID NO. 29는 NRARP mRNA 레벨이 매우 효과적으로 감소된다. 이 서열에 대한 형질 주입 24-48시간 후 약 80%의 감소가 관측되었다; 그 후 증가된 mRNA 레벨은 형질 주입 72시간 후 기본 레벨 아래로 40%였다. SEQ ID NO. 31은 NRARP 레벨이 효율적으로 감소, 60% 감소되고, 기본 레벨은 연구된 3개의 시점에서 관측되었다. SEQ ID NO. 35는 형질 주입 24-48시간 후 NRARP mRNA 레벨이 60% 감소되었고; 형질 주입 72시간 후 mRNA 레벨의 샤프한 회복이 확인되어, NRARP mRNA 레벨은 기본 레벨 이하 10%이다. SEQ ID NO. 37은 NRARP mRNA의 레벨의 가장 큰 감소를 야기하는 화합물이다. 이 화합물의 형질 주입 24, 48 및 72시간 후 90%, 80% and 70%의 감소가 관측되었다. SEQ ID NO. 39는 형질 주입 24시간 후 NRARP mRNA 레벨이 70%, 형질 주입 48시간 후 50% 감소되었고, 그 후 mRNA 레벨이 급격히 증가되었지만, 기본 레벨은 형질 주입 72시간 후 완전히 회복되지 않았다. 도 7은 인간 BEAS-2B 세포에서 얻어진 결과를 도시한다. 이러한 세포주에서, SEQ ID NO. 10 (SYL136001) 및 SEQ ID NO. 19는 형질 주입 24시간 후 NRARP 레벨이 70% 감소되었고, 그 후 mRNA 레벨은 천천히 증가되었지만, 기본 레벨은 연구의 시간 프레임 내에서 완전히 회복되지 않았고, 형질 주입 48시간 후 NRARP mRNA 레벨은 여전히 기본 레벨 이하 50%, 형질 주입 72시간 후 40-50%였다. SEQ ID NO. 23 및 SEQ ID NO. 27은 인간 SEQ ID NO. 23 및 SEQ ID NO. 27 세포에서 NRARP mRNA 레벨이 약하게 감소되었고, 감소는 연구된 3개의 시점에서 약 20-30%였다; 기본 레벨은 형질 주입 72시간 후 완전히 회복되지 않았다. SEQ ID NO. 25 및 SEQ ID NO. 39는 형질 주입 72시간 후 NRARP mRNA 레벨의 최대 감소가 50%-60%에 다다르도록 점진적으로 및 시간-의존적으로 감소되었다. SEQ ID NO. 31 및 SEQ ID NO. 35는 NRARP mRNA 레벨이 효과적으로 감소되고; 연구된 3개의 시점에서 화합물에 대해 mRNA 레벨은 기본 레벨 이하 약 60-70%이다. SEQ ID NO. 29 및 SEQ ID NO. 37은 연구되는 3개의 시점에서 각각 약 80% 및 90%의 샤프하게 및 지속된 감소를 야기하는, 이러한 세포주에서 NRARP mRNA 레벨을 감소시키는 가장 효과적인 생성물이다. 스크램블된 siRNA 서열은 연구된 임의의 시점에 NRARP 발현 레벨을 감소시키지 않는다. 도 8은 뮤린 C2C12 세포에 얻어지는 결과를 도시한다. SEQ ID NO. 10 (SYL136001)은 형질 주입 24시간 후 NRARP 레벨이 60% 감소되고, 그 후 mRNA 레벨은 천천히 증가되지만, 기본 레벨은 형질 주입 72시간 후; NARP mRNA 레벨이 여전히 기본 레벨 이하 40%인 시점에 완전히 회복되지 않았다. SEQ ID NO. 19는 형질 주입 24시간 후 mRNA NRARP 레벨의 약 30%, 형질 주입 48시간 후 80% 극적으로 감소되었고, 그 후 형질 전환 72시간 후 레벨은 증가되고, NARP mRNA 레벨은 여전히 기본 레벨 이하 40%였다. SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25 및 SEQ ID NO. 27은 mRNA NRARP 레벨이 살짝 감소되고, 이들 서열 각각의 형질 주입에 대해 관측된 감소는 연구된 시점에 약 20-40%였다. SEQ ID NO. 29 및 SEQ ID NO. 39는 형질 주입 24 및 48시간 후 mRNA NRARP 레벨을 효과적으로 감소시키고, 이들 시점에서의 레벨은 각각 기본 레벨 이하 50% 및 60%였다. 형질 주입 72시간 후 서열에 대한 반응은 기본 레벨이 이 시점에 여전히 회복되지 않지만, 시점 전에 증가된다. SEQ ID NO. 31은 형질 주입 24시간 후 mRNA NRARP 레벨이 약 40% 감소되고, 형질 주입 48시간 후 70%의 큰 감소가 확인되고, 그 후 레벨은 증가되지만, 형질 전환 72시간 후 NRARP mRNA 레벨은 여전히 기본 레벨 이하 40%였다. SEQ ID NO. 35 및 SEQ ID NO. 37은 세포주에서 NRARP mRNA 레벨의 가장 큰 감소를 야기하는 화합물이고, SEQ ID NO. 35 및 SEQ ID NO. 37은 형질 주입 24시간 후 60%, 형질 주입 48시간 후 약 80%의 NRARP mRNA 레벨이 감소된다. 기본 레벨의 부분적 회복은 형질 주입 72시간 후에 일어난다. 다시, 예측되는 바와 같이, 스크램블된 siRNA 서열은 C2C12 세포에 연구되는 임의의 시점에서 NRARP mRNA의 레벨이 감소되지 않는다. 도 9는 ARL6 래트 세포에서 얻어진 결과를 도시한다. SEQ ID NO. 10 (SYL136001)은 형질 주입 24-48시간 후 50%, 형질 주입 72시간 후 60%의 NRARP mRNA 레벨이 감소된다. SEQ ID NO. 37은 형질 주입 24시간 후 50%, 형질 주입 48시간 후 60%, 형질 주입 72시간 후 70%의 NRARP 레벨이 감소된다.
1.4 다양한 세포주에서 본 발명의 변형되지 않은 siRNA 및 화학적으로 변형된 siRNA로 형질 전환된 후 인간 세포주의 세포 생존율
본 발명의 siRNAs의 형질 주입 후 세포의 생존율을 분석하기 위해, 각각 형질 주입제로서 리포펙타민 2000, Mirus Transit-X2, Dharmafect 3을 이용하여 100 nM의 다음 서열 중 하나의 형질 주입 후 생체 외 독성 연구가 수행되었다: 인간 HeLa 및 BEAS-2B 세포 및 뮤린 C2C12 세포에서 SEQ ID NO. 10 (SYL13600), SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39. 전체 형질 주입은 표준 제조자의 지침에 따라 수행되었다. 동일한 실험에서, 스크램블된 siRNA 서열은 간섭의 특이성의 대조군으로 이용되었다. 세포 펠릿은 siRNA 형질 주입의 결과로 세포 생존율의 가능한 변수를 평가하기 위해 형질 주입 및 가공 24, 48, 및 72시간 후 수집되었다. 세포 생존율은 Promega의 CellTiter 96® 수성 비방사성 세포 증식 분석법을 이용하여 측정되었다. 이 방법은 MTS 테트라졸륨 화합물을 포르마잔으로 감소시키는 살아있는 세포의 양에 기초하고, 490 nm에서 흡광도로 측정된다. 평균 및 SEM은 각각의 실험에 대해 산출되어, 도 10-12에 플로팅된다. 도 10. 11 및 12는, 다음 서열 중 임의의 형질 주입에 대한 세포 생존율은 변화가 없는 것을 보여준다: 사용되는 임의의 세포주 중 SEQ ID NO. 10 (SYL13600), SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37 및 SEQ ID NO. 39. 또한, 세포 생존율 레벨은, 형질 전환제로서 siPORT NeoFX를 이용하여 다음 서열 중 하나에 형질 주입에 대해서 ARL6 래트 세포에서 평가된다: SEQ ID NO. 10 (SYL136001) 및 SEQ ID NO. 37. 도 13은 시험된 서열에 대한 ARL6 세포의 세포 생존율의 유의미한 변화가 없는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 siRNAs 전체는 비독성 및 잘 순응되는 것으로 결론지을 수 있다.
1.5 HUVEC 세포의 생체 외 모델에서 혈관 신생에 대한 본 발명의 siRNAs의 효능
혈관 신생에 대한 본 발명의 siRNAs의 효과를 연구하기 위해, 이들 세포에서 NRARP 발현의 분석 및 HUVEC 세포를 이용한 실험을 수행하였다.
특히, 이러한 연구 세트의 목적은 HUVEC 세포의 생체 외 모델에서 변형된 NRARP siRNA SEQ ID NO. 37 (서열 SEQ ID NO. 37로 이루어진 센스 가닥을 갖는 화학적으로 변형된 19 bp 블런트-말단인 dsRNA 및 서열 SEQ ID NO. 38로 이루어진 상보적 안티센스 가닥)의 혈관 형성 억제 효과를 연구하는 것이다.
1.5.1 도입
혈관 신생은 이미 존재하는 것으로부터 새로운 정맥의 형성이다. 몇가지 다른 생리적 과정 및 성장 동안 필수적인 이러한 공정은 안구의 제 기능을 못하도록 하여 노인 황반 변성(AMD) 및 당뇨 망막병증(DR)과 같은 다양한 형태의 망막 질환을 야기할 수 있다. HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells)는 최초 원료 물질로부터 1-3 경화 후 보존되는 최초 세포이다. 이들 세포는 VEGF와 같은 혈관 형성제에 대한 관형 구조를 형성하도록 유도될 수 있다.
1.5.2 재료
멀티스크라이브 역전사효소(Multiscribe Reverse Transcriptase) 50U/ml (바이오시스템 P/N 4311235에 적용된).
RNAse 억제제 20U/㎕ (바이오시스템 P/N N8080119에 적용된).
TaqMan 2X 유니버셜 마스터 믹스(Universal Master Mix).
Qiagen" RNeasy ®Microkit 74004.
인간 Nrarp 프로브: Taqman 유전자 발현 분석(Taqman Gene Expression Assay) Hs01104102_s1.
GAPDH 내생 대조군(Endogenous control): Taqman 유전자 발현 분석 Hs00266705_g1.
래트 Nrarp 프로브: Taqman 유전자 발현 분석 Rn 03810258_s1
18S 내생 대조군: Taqman 유전자 발현 분석 Hs99999901_s1.
1.5.3 방법.
i) 세포
HUVEC 세포 (Ref: CC-2519 / 배치 넘버: 000191772)는 Lonza에서 입수되었다. 모든 실험은 세포 밀도 75-85%에서 배양물과 함께 통로(passage) 6-9에서 세포의 동일한 배치로 수행된다. 형질 주입은 표준 절차에 따라 siPORT NeoFX™을 이용하여 수행된다. 전기 천공에 대해서, "Hernandez JL et al. 2004. Angiogenesis. 7:235-241"에 공개된 절차에 따르고, 간단히 말해서, cell manipulator® 600 (BTX)을 이용하여 1200 μF에서 20 ms 펄스를 적용함으로써 전기 천공된다. 각각의 전기 천공은 2 ㎍의 유전 물질을 이용하여 수행된다.
효능 연구에 있어서, 세포는 전기 천공 프로토콜을 이용하여 형질 주입되고, 24시간의 기간 동안 회복을 위해 남겨진다; 그 후 세포는 30.000 세포/웰의 밀도에서 96-웰 플레이트에서 플레이팅되고, 상기 언급된 파라미터는 플레이팅 6시간 후 분석된다. 다음 구조 분석 세포, 배지 및 마트리겔은 RNase 없는 튜브로 전달되고, 600μL의 완충액 RLT+β-메르캅토에탄올이 첨가된다.
ii) 표적 유전자 발현 분석
(1) RNA 분리 및 역전사(retrotranscription)
총 RNA는 RNeasy RNA 추출 키트(Invitrogen, CA, USA))를 이용하는 세포 배양액으로부터 분리된다. 4 ㎍의 총 RNA는 고용량 cDNA 아카이브 키트(미국 캘리포니아 포스터 시티 Biosystems, Inc.에서 지원됨)를 이용하여 역전사된다.
(2) qPCR
qPCR은 스탭원 플러스 검출 시스템을 이용하여 수행된다(Biosystems에서 지원됨). 50 나노그램의 각각의 샘플은 이하 조건 하에서 TaqMan 2X Universal Master Mix로 증폭된다: 10분 동안 95 ℃, 그 후 15초 동안 95 ℃에서 40 사이클 및 1분 동안 60 ℃.
1.5.4 결과.
HUVEC 세포로 siRNA를 도입하기 위해 전기 천공의 성공적인 결과를 감한하면, 이 방법은 변형된 NRARP siRNA SEQ ID NO. 37의 역할이 마트리겔 상에서 모세 구조의 형성, 이주, 상처 치유 및 증식 분석으로 분석되는 이후 연구에 이용된다.
i) 모세 구조의 형성
(1) 분석의 셋업
4시간에 걸쳐 빼앗긴 15.000 cells/well은 마트리겔로 커버된 96-웰 플레이트 상에 플레이팅되었다. 보충물 없는 EBM(Endothelial cell basal medium)은 음성 대조군(구조가 형성되지 않음)으로 사용된 반면 보충물(hEGF, 하이드로코티손(hidrocortisone), 소의 뇌 추출물, 젠타마이신, 헤파린) 있는 완전 배지 및 10% FCS는 관상 구조의 최대 수를 유도하는 양성 대조군으로 이용된다. 분석은 3-6 독립된 실험에서 3번 수행되었다. 배양은 플레이팅 24시간 후 분석되었다.
또한, 구조를 분석하는 새로운 방법이 셋업되었다. 이 방법은 NIH ImageJ를 위해 Gilles Carpentier에 의해 개발된 혈관 신생 분석기를 이용하여 5개의 변수의 정량화에 기초되었다. 이 소프트웨어는 혈관 신생 공정에서 글로벌한 뷰를 제공한다. 연구된 변수는 도 17에 도시되었다.
도 18은 완전 배지(보충물 +10% FCS)에 대해 연구된 변수의 변화를 도시한다. 도에 도시된 바와 같이, 완전 배지는 구조의 총 면적을 변경하지 않고 형성된 구조물의 수를 증가시킨다.
(2) siRNA SEQ ID NO. 37의 효능
세포가 전기 천공에 의해 형질 주입되고, 24시간의 기간에 걸쳐 완전 배지에서 회복하고, 추가 2시간 동안 혈청에서 빼앗겨진다; 그 후 세포는 구조물을 형성시키기 위해 96-웰 마트리겔-커버된 플레이트 상에서 30.000 cells/well의 세포 밀도로 플레이팅된다. 형성된 구조는 시딩 후 6시간 및 24시간 분석된다. 하기 조건은 SEQ ID NO. 37의 효능을 시험하도록 분석된다:
- 비-형질 주입된 세포
- 가짜의 전기 천공된 세포(Sham electroporated cells)
- 1μM siRNA 항-KDR로 형질 주입된 세포(Life Technologies, Ref: 145034)
- 1μM siRNA SEQ ID NO: 37로 형질 주입된 세포.
모든 조건은 보충물 없는 배지 및 10%FCS와 100ng/ml VEGF를 갖는 배지로 분석되었다.
제1 분석은 마트리겔 상에 세포를 시딩하기 전에 2시간 동안 무혈청 배지에서 빼앗긴 세포로 수행된다. 이러한 절차는 구조를 약간 불안정하게 하고, 따라서 박탈 단계 없이 반복된다. 이후 연구 결과는 도 19 및 20에 도시되었다.
요약하면, 전기 천공은 세포 구조에 심각하게 영향을 미친다; 따라서 가짜의 전기 천공 조건과 실험 조건 사이에서 비교가 이루어진다. 보충물 없이, siRNA-KDR 및 siRNA-NRARP SEQ ID NO. 37은 신혈관 형성의 구조물의 형성을 감소시킨다; siRNA-KDR의 효과는 siRNA SEQ ID NO. 37보다 더 크다. 신혈관 형성 구조의 형성에 대한 siRNA의 억제 효과는, 6시간 시점에서 보충물을 갖는 완전 배지의 존재 하에 더 명확해진다; 이는 혈청 및 보충물의 세포를 빼앗기는 것은 세포 생존율을 감소시킬 수 있다는 사실에 기인될 수 있다. 구조물은 이미 분해하기 시작했기 때문에, 분석은 마트리겔 상에 세포를 시딩한 24시간 후 수행되는 분석은 확실하지 않다.
ii) 증식에 대한 효과
(1) 셋업 분석
24시간-빼앗긴 세포는 3000 cells/well의 밀도에서 96-웰 플레이트에 플레이팅되고, 다양한 조건 하에서 배양되었다. 5일 후 증식은 MTT 분석을 이용하여 분석되었다. 사용된 조건은 다음과 같다: 2% FCS 및 다양한 농도의 VEGF (20-30-50 ng/ml). 2% FCS는 세포가 기본 증식률을 유지하고, 배양액이 세포 차단(cell arrest)으로 진입하는 것을 억제하도록 요구된다. 도 21a는 시험된 농도에 상관 없이 VEGF에 대한 세포 증식의 3배 유도를 보인다. 항-VEGF제의 억제 효과를 분석하기 위해, 세포를 30 ng/ml VEGF의 존재 하에 배양하였고, IC50을 측정하기 위해 Bevabizumab (Avastin)의 농도(12 nM에서 시작하는 1:2 희석액)를 감소시켰다. 도 21b에 나타내는 바와 같이, bevacizumab의 IC50은 0.85 nm가 되는 것으로 확인되었다.
(2) siRNA SEQ ID NO. 37의 효능
세포는 전기 천공되고, 1%의 젤라틴으로 코팅된 96-웰 플레이트에서 5000 cells/well의 밀도로 플레이팅되었다; 그 후 세포는 24시간 동안 회복되었다. 회복 세포가 10% FCS 및 100 ng/ml VEGF로 보충된 기본 배지에서 배양되었다. 플레이팅 3일 후, 세포 증식은 MTT로 분석되었다. 시험된 조건은 다음과 같다:
-비형질 주입된 세포
-가짜의 전기 천공된 세포
-1μM siRNA 항-KDR로 형질 주입된 세포(Life Technologies, Ref: 145034)
- 1μM siRNA SEQ ID NO: 37로 형질 주입된 세포.
도 22에 도시된 결과는, siRNA 항-KDR 및 siRNA SEQ ID No. 37은 가짜의 전기 천공된 세포와 비교하여 약 40% VEGF로 유도된 증식률을 감소시키는 것을 나타낸다.
iii) 이주의 효과
(1) 셋업 분석
이들 연구는 8 ㎛의 불투명한 멤브레인 필터를 갖는 24-트랜스웰 시스템 플레이트에서 수행되었다(Transwell HTS FluroBlok?? Multiwell Insert System de Becton Dickinson). 멤브레인의 표면은 세포 흡수를 용이하게 하기 위해 37 ℃에서 2시간 동안 15 ㎍/ml의 농도에서 타입 I 콜라겐으로 커버되었다. 세포는 4시간의 기간에 걸쳐 빼앗긴 혈청 및 50.000 cells/well 밀도로 플레이팅되었고, 그 후 이주 자극제가 첨가되었다. 트랜스웰의 내부에 자극제를 첨가한 24시간 후, 우수한 구획으로 이주되는 세포의 수는 Calcein-AM으로 염색 후 분석되었다.
완전 배지(10% FCS 및 보충물)에서 이주하는 세포의 수는 세포 이주의 양성 대조군으로 이용되었고, 이러한 반응은 VEGF (1-10-100 ng/ml)의 농도를 증가시킴으로써 생성되는 것과 비교되었다.
도 23에 도시되는 바와 같이, VEGF는 우수한 구획으로 이주하는 세포의 수가 양 의존적으로 증가하는 것을 유도한다. VEGF에 대한 최대 증가는 VEGF (100 ng/ml)의 가장 큰 농도에 대해 관측되었고, 반응의 규모는 기본 조건에서 약 5-6배였다.
(2) siRNA SEQ ID NO. 37의 효능
세포는 전기 천공되고, 24시간 동안 회복되었다; 그 후 세포는 15㎍/ml 콜라겐으로 코팅된 8 ㎛ 불투명한 멤브레인 필터를 갖는 96-트랜스웰 플레이트에서 10.000 cells/well의 밀도로 플레이팅되었다. 시험된 조건 전체는 기본 배지 및 완전 배지(10% FCS 및 100 ng/ml VEGF로 보충된)의 존재 하에 분석되었다. 시험된 조건은 다음과 같고, 플레이팅 및 calcein-AM으로 세포 염색한 후 24시간 분석되었다:
-비형질 주입된 세포
-가짜의 전기 천공된 세포
-1μM siRNA 항-KDR로 형질 주입된 세포(Life Technologies, Ref: 145034)
- 1μM siRNA SEQ ID NO: 37로 형질 주입된 세포.
얻어진 결과는, 전기 천공이 세포의 이주 용량에 대한 해로운 효과를 갖는다는 것을 나타낸다; 따라서 처리된 세포는 전기 천공의 효과를 버리기 위해 가짜의 전기 천공된 조건과 비교되었다. 기본 배지에서 세포는 이주되지 않았지만, 10% FCS 및 100 ng/ml VEGF의 존재는 트랜스웰 시스템에서 반대 웰로 세포가 이동하는 것을 야기한다. 10% FCS 및 100 ng/ml VEGF의 효과는 siRNA SEQ ID NO. 37 또는 항-KDR siRNA의 전기 천공에 의해 부분적으로 차단되었다(30%)(도 24 및 25).
iv) 상처 치유 연구
(1) 셋업 분석
세포는 1%의 젤라틴으로 코팅된 96-웰 플레이트에 50.000 cells/well의 밀도로 플레이팅되었고, 24시간 동안 기본 배지에서 배양되었다. 그 후, 병변은 배양액의 좁은 면적을 스크래핑함으로써 수행되고, 10 ng/ml VEGF가 배양액에 첨가되었다. 수행 직후 및 24시간 후 병변의 면적이 측정되고, NIH ImageJ 소프트웨어를 이용하여 비교되었다. 치유된 면적의 퍼센트는 다음과 같이 정량화된다.
상처 치료(%)=최종 면적/최초 면적 × 100
도 26에 도시되는 바와 같이, 10 ng/ml VEGF는 비처리된 조건과 비교하여 상처 치유율이 2.5배 증가되는 것이 유도되었다.
(2) siRNA SEQ ID NO. 37의 효능
세포는 전기 천공되고, 24시간 동안 회복되었다; 그 후 세포는 1%의 젤라틴으로 코팅된 96-웰 플레이트에서 70.000 cells/well의 밀도로 플레이팅되었다. 플레이팅 24시간 후, 병변은 세포의 좁은 면적을 스크래핑함으로써 유도되고, 배양물은 병변의 유도 후 16시간 분석되었다. 분석은 10 μM calceine-AM으로 세포를 염색하고, 스크래핑된 면먹 및 다시 세포로 커버된 면적의 퍼센트를 분석함으로써 수행되었다. 시험된 조건 전체는 기본 배지 및 완전 배지(10% FCS 및 100 ng/ml VEGF로 보충된)의 존재 하에 분석되었다. 시험된 조건은 다음과 같고, 이주는 플레이팅 후 24시간 분석되었다.
-비형질 주입된 세포
-가짜의 전기 천공된 세포
-1μM siRNA 항-KDR로 형질 주입된 세포(Life Technologies, Ref: 145034)
- 1μM siRNA SEQ ID NO: 37로 형질 주입된 세포.
이전 실험에서와 같이, 결과는, 전체 조건이 가짜의 전기 천공된 세포와 비교되는 이유를 위해, 상처 치유에 대한 전기 천공의 해로운 영향을 보여준다. 도 27 및 28에 도시되는 바와 같이, siRNA SEQ ID NO. 37은 기본 배지에서 상처 치유율을 효과적으로 감소시킨다. siRNA SEQ ID NO. 37의 효과는 양성 대조군 항-KDR siRNA보다 더 크다. 그러나, 상처 치유에 대한 이러한 효과는, 세포가 완전 배지에서 배양될 때, 대부분이 세포 이주에 대한 FCS의 강력한 효과에 기인하여 가려진다.
v) 상기 언급된 실험으로부터 세포의 NRARP mRNA 레벨
상기 언급된 연구에서 HUVEC 세포가 수집되고, NRARP 표적 유전자의 레벨을 qPCR에 의해 분석되도록 총 RNA가 추출된다. 도 29는 siRNA SEQ ID NO. 37의 전기 천공에 대한 NRARP mRNA 레벨의 감소를 보여준다.
본 연구에 제공되는 결과를 종합하면, siRNA SEQ ID NO. 37은 모세 구조물의 증식, 이주 및 형성의 감소에 의해 도시되는 바와 같이 HUVEC 세포에서 혈관 신생 효과를 보이는 것으로 결론 낼 수 있다.
2. 생체 내 분석
2.1 레이저에 의해 유발된 맥락막혈관신생의 래트 모델에서 망막 및 맥락막 내 NRARP의 발현
2.1.1 목적
본 연구의 목적은 CNV가 레이저에 의해 유발된 노르웨이 브라운 래트(Norway Brown Rat)의 망막 및 맥락막 내 상이한 시점에서 발현을 평가하기 위함이었다. 이러한 표적 유전자의 발현의 분석은 다음의 2가지 목적에서 도움이 되었다: i) 표적이 신혈관 형서과 관계된 안과 질환의 치료를 위한 새로운 화합물의 개발에 도움이 되는 침묵된 후보인지를 연구하기 위해서 NRARP가 CNV에 반응하여 상향 조절되는지 아닌지를 평가하기 위함 ii) NRARP의 일시적인 발현을 연구하여 표적 유전자를 침묵시키기 위해 동물을 치료하는 최적기를 결정하기 위함.
2.1. 2 개요
CNV는 몇몇 맥락망막 질병에 흔한 비-특이적인 병변이다. 이러한 병변은 브런치의 멤브레인(Brunch's membrane)의 중단(break) 또는 파열(disruption), 맥락모세혈관 내피 세포(choriocapillary endothelial cell), 페리사이트 (perycites) 및 염증 세포의 망막밑공간(subretinal space) 및/또는 망막밑 색소(subretinal pigment) 상피로의 침입의 염증 및 혈관형성의 도입을 수반하는 일련의 이벤트로 특징지어진다 {Grossniklaus HE 외 2010}. 망막밑공간으로의 맥락모세혈관의 침투는 몇몇 안과 질환의 공통적인 특징이다. 이러한 질병의 일부 예시는 AMD, PDR 또는 DRE을 포함한다.
CNV는 브런치의 멤브레인 내 병변을 유발시킴으로써 동물 모델 내에서 유도될 수 있다; 이러한 병변은 분자성 이벤트를 개시하여 증가된 혈관형성 인자 및 염증성 매개자로 특징지어지는 완전히 진행된 CNV로 이어진다.
본 발명자들은 아이크로(EyeCRO)에서 평가된 브라운 노르웨이 래트 내에서 레이저-유도된 CNV 모델을 사용하여 병변의 유발 후 상이한 시점에서 선택된 표적의 발현을 평가했다. 이러한 목적을 위해 3가지 병변을 18마리 동물의 각 눈에 유발시켰고 이어서 상기 동물들을 희생시키고 눈을 수집해서 추가적인 분석을 위해 실렌티스(Sylentis)에 보냈다. 분석된 표적은 NRARP였다. NRARP는 혈관내피세포의 활성화에 관계된 당단백질이다. 유전자는 전체 범위의 암 내에서 과발현되고 이의 과발현은 전이 및 짧은 생존률에 연관된다. 또한, 인간 유방암 내 이러한 유전자의 발현 수준은 혈관 형성에 연관되고 이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질이 내피 세포 이주 및 VEGF 독립적인 맥관구조 생성에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다 {Faibish MR 등. 2011}.
2.1.3 방법
i) 동물
Figure 112018034699688-pct00001
ii) 실험군
Figure 112018034699688-pct00002
iii) 제외 기준
레이저 적용 후 즉시 3개 중 ≥2 개의 레이저 병변 내에서 출혈이 눈에서 보였다.
모든 조직 샘플을 적절하게 확인된 크리오튜브(criotube) 내에 위치시켰고, 즉시 액체 질소 중에서 냉동시켰다. 크리오튜브를 실험 조건에서 확인했고 실렌티스로 드라이 아이스 상에서 보내졌다.
iV) 표적 유전자 발현의 분석
(1) RNA 분리 및 역전사 ( retrotranscription )
RNeasy RNA 추출 키트(Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 망막 및 맥락막으로부터 전체 RNA를 분리했다. 제조사의 지시에 따라 대용량 cRNA 아카이브 키트 (High-Capacity cDNA Archive kit) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) 를 이용하여 4 ㎍의 전체 RNA를 역전사했다.
(2) qPCR
Stepone 플러스 검출 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 qPCR을 수행했다. 500 나노그램의 각 샘플을 다음의 조건 하에서 TaqMan 2X Universal Master Mix 내에서 증폭시켰다: 10분 동안 95 ℃, 이어서 15초 동안 95 ℃의 40번 사이클 및 1분동안 60 ℃. 모든 qPCR 증폭을 트리플리케이트(triplicate) 내에서 수행했고 역 전사 대조군 및 템플레이트 없는 대조군을 항상 포함하여, 적어도 2개의 독립적인 실험 내에서 반복했다.
2.1.4 결과 - NRARP의 발현
레이저에 의한 CNV의 유발 후 상이한 시점에서 망막 내 및 RPE/맥락막 내 NRARP의 발현을 분석했다. 수득된 결과는 레이저 병변의 유발 후 24시간의 망막 내에서 NRARP mRNA 수준에서 약간의 감소를 나타낸다. 병변의 유발 후 72시간에서 NRARP mRNA 수준은 약간 증가한다 (시간=0보다 1.5배). 연구의 끝에서(t= 504 시간) NRARP의 수준은 병변의 유발 전에 관찰된 것과 같다 (도 14).
NRARP의 mRNA 수준은 DNV 유발 후 6시간에서 맥락막/RPE 내에서 급격하게 상향 조절되었고 (~2.7 배) 그 후에 천천히 감소하기 시작했다. 기저 수준은 연구의 기간 내에서 발견되지 않았다 (도 15).
2.1.5 결론
본 연구의 결과를 종합하면 NRARP가 망막 내 혈관형성을 조절하기 위한 치료가 개발될 수 있는 것에 대한 효과적인 표적이라는 것이 도출될 수 있다. 망막 및 맥락막 모두에서 발편의 패턴은 이것이 본 연구 내에서 사용된 모델에서 이의 발현의 주어진 중대한 유발을 침묵하게 하는 좋은 후보일 수 있음을 나타낸다.
2.2 레이저-유도된 맥락막 혈관 형성의 래트 모델 내 병변 크기 및 누설(leakage)의 감소에 대한 NRARP를 표적하는 siRNA의 평가.
2.2.1 목표
레이저-유도된 맥락막혈관형성 (레이저 CNV)의 래트 모델 내 국소 투여 후 하나의 시험 제제(siRNA SEQ ID NO.37)의 항-혈관형성의/혈관의 중단 효과를 판단하기 위함이다.
2.2.2 연구의 요약
암컷 브라운 노르웨이 래트로 26일 연구를 수행하여 맥락막혈관형성의 레이저 유도된 모델 내 SEQ ID NO: 37의 국소적 점적 주입(instillation)의 항-혈관형성의/혈관의 중단 효과를 판단했다.
전체 18마리의 래트를 그룹당 6마리의 래트의 3 그룹으로 나눴다. 1-26일에서, 그룹 1 및 3에 하루에 한 번의 운반체(그룹 1), 또는 5 mg/ml SEQ ID NO: 37 (그룹 3)의 국소 점적 주입을 줬다. 7일에, 그룹 3에 5 ㎍/눈 항-VEGF의 양쪽의 유리체 내 주사를 줬다 (양성 대조군).
3일에, 520 nm 열 레이저를 이용하여 레이저 처리를 수행하여 눈 당 전체 3개의 병변을 생성했다.
26일에 (3-주 후-레이저 처리), 플루오레세인 혈관 조영법 (fluorescein angiography)을 수행했고 병변 크기 면적을 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)를 이용하여 결정했다. 5 ㎍/눈 항-VEGF Ab, 또는 5 mg/ml SEQ ID NO: 37의 국소 점적 주입을 받은 래트는 이들의 각각의 운반체 대조군에 비해 병변 크기에서 현저한 감소가 나타났다.
2.2.3 물질 및 방법
2.2.3.1 래트 내 레이저-유도된 혈관맥관형성 (CNV)
1-26일: 운반체 또는 시험 제제의 국소 점적 주입 (팔(Arm) 1, 2)
5일: 양쪽 레이저 처리로 안구 당 3개의 병변을 생성
7일: 양성 대조군의 양쪽 유리체 내 주사 (팔 3)
26일: 생체 내 플루오레세인 혈관 조영법
26일: 눈의 적출 및 망막 및 RPE/맥락막 연구 팔의 개별적인 수집
2.2.3.2 연구 팔(study arms)
Figure 112018034699688-pct00003
2.2.3.3 동물
계통: 브라운 노르웨이
성별: 암컷
나이 범위: 6-8 주
무게 범위: 120-150g
공급원: Charles River Laboratories
연구 동물의 숫자: 18
2.2.3.4 하우징 요건
모든 동물은 표준 동물 케어 조건 하에서 칸으로 환기되게 유지된 큰 케이지 내에 3개의 군으로 하우징된다.
2.2.3.5 제제 제조 및 저장
시험 재료의 이하 부분 표본을 이용하여 모든 제제에 USP (U.S. Pharmacopoeia) 재료 및 살균된 유리병이 이용되었다:
국소 운반체-26 부분 표본/130 ㎕ 각각 + 2 추가.
siRNA SEQ ID NO.37 5 mg/ml- 26 부분 표본/130 ㎕ 각각 + 2 추가.
전체 제제는 4 ± 3 ℃에 저장되었다.
2.2.3.6 마취
케타민 (100 mg/ml) 및 100 유닐의 자일라진 (20mg/ml)의 20 유닛을 이용하여 U-100 실린지를 이용해 케타민 및 자일라진이 혼합되었다. 마취 혼합물은 1 ㎕/g로 복강 내(IP) 주사를 통해 적용되었다.
2.2.3.7 CNV 병변을 생성하기 위한 레이저 적용
동물의 안구는 1% 사이클로질 용액으로 확장되고, 빛으로부터 보호된다. 관측 가능한 확장 후, 동물은 케타민/자일라진으로 차분해졌다. 차분해진 동물의 안저(fundus)가 관측되고, Micron III 작은 동물 검사경(small animal funduscope) (Phoenix Research)을 이용하여 기록되었다. 미크론 III 커스텀 레이저 부착을 통해 연결된 열 레이저를 이용하여 레이저 처리가 수행되었다. 안구 당 총 3개의 병변을 520 nm의 파장을 이용하여 안구 당 위치시켰다. 얻어진 안저 이미지가 기록되고, 레이저가 브루후의 멤브레인을 통해 성공적으로 버블을 생성하는 것을 확인하도록 평가된다.
2.2.3.8 유리체 내 투여
동물은 케타민/자일라진으로 마취되고, 눈동자는 사이클로질 및/또는 트로피카미드의 국소 투여로 확대된다. 진정 및 확대 후, 안구 당 총 5 ㎕의 체적이 해밀턴 실린저 및 33 가우지 니들을 이용하여 편평부(pars plana)에서 유리질로 주사되었다.
2.2.3.9 제외
레이저 적용 또는 유리체 내 주사 후 출혈의 조짐을 보이는 임의의 안구는 분석에서 배제되었다.
2.2.3.10 플루오로세인 형광 조영법
동물은 케타민/자일라진으로 마취되고, 그 후 체중의 1 ㎕ / gram으로 10% 플루오로세인 소듐의 IP 주사가 주어진다. 안저 이미지는 488 nm의 표적 파장에 대해 자극제(exciter)/선택 필터 및 미크론 III을 이용하여 8-bit TIFF 파일로 캡쳐된다.
2.2.3.11 이미징 및 병변 정량화
전체 TIFF 이미지는 컴퓨터화된 이미지-분석 소프트웨어를 이용하여 정량화된다(ImageJ, NIH, USA). 픽셀로 면적을 정량화 하기 위해 병변은 자유롭게 개별적으로 추적되고, 색 안저 사진이 병변 위치에 대한 참조로 사용된다. 병변의 중앙에서 신혈관 형성의 면적은 면적 산출로부터 배제된다. 출혈 또는 2개의 병변 오버랩이 있으며느 이들 병변은 분석에서 제외된다.
2.2.3.12 조직 수집
동물은 케타민/자일라진(80/10 mg/kg)으로 마취되고, 그 후 200 mg/kg으로 유타솔(펜토바르비탈)의 IP 투여에 의해 안락사된다. 안락사 후, 안구는 적출되고, 각각 4% 파라포름알데히드로 고정된다. 고정 후, 전체 안구는 각각 2 mL 스크류 캡 폴리프로필렌 튜브에 저장된다.
2.2.3.13 통계학적 분석
통계학적 분석은 양측 검정 만-위트니 t-시험(two-tailed Mann-Whitney t-test)을 이용하여 그래프화 된 프리즘 소프트웨어 (버전 4.0)으로 수행된다. 오직 < 0.05인 p-값의 변화가 통계학적으로 유의미한 것으로 여겨진다.
2.2.4 결과
SEQ ID NO: 37의 국소 점적 주입의 효과는 레이저-유도된 CNV의 래트 모델에서 평가되었다. 레이저 처치 3주 후에, 래트 안구에서 CNV 병변의 사이즈(픽셀의 면적)를 정량화 하기 위해, 플루오로세인 혈관 조영 검사가 수행되었다.
5 mg/ml의 SEQ ID NO: 37의 국소 적용은 운반체 단독 점적 주입에 비해 래트 안구의 병변 크기가 감소되었다. 운반체 군에 대한 평균 병변 크기의 차는 유의미하다(도 16; *, p = 0.05, 양쪽 검증 만-위트니 포스트-시험을 이용한 짝 지어지지 않은 t-시험).
양성 대조군, 항-VEGF의 쌍방의 유리체 내 주사는 대조군에 비해 병변 크기가 상당히 감소되었다(도 16; **, p = 0.01, 양쪽 검증 만-위트니 포스트-시험을 이용한 짝 지어지지 않은 t-시험).
2.2.5 결론
맥락막의 신혈관 형성의 래트 모델에서, 5 mg/ml SEQ ID NO.37의 국소 점적 주입하는 운반체 단독의 국소 점적 주입에 비해 병변의 크기가 감소되었다.
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<110> Sylentis SAU <120> siRNA and their use in methods and compositions for inhibiting the expression of the NRARP gene <130> PC927801WO <150> EP15382440.4 <151> 2015-09-08 <160> 66 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 1 caccaggaca tcgtgctct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 2 acatcgtgct ctatctcat 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 3 aggacatcgt gctctatct 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 4 gacatcgtgc tctatctca 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 5 tgctctatct catcaccaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 6 ccaggacatc gtgctctat 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 7 atcgtgctct atctcatca 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 8 gtgctctatc tcatcacca 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA <400> 9 accaggacat cgtgctcta 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 10 caccaggaca ucgugcucu 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 11 acaucgugcu cuaucucau 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sense strand <400> 12 aggacaucgu gcucuaucu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 gacaucgugc ucuaucuca 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 ugcucuaucu caucaccaa 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 ccaggacauc gugcucuau 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 aucgugcucu aucucauca 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 gugcucuauc 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Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> /mod_base="OTHER" /note="deoxithymine (2'H thymine)" <400> 61 acaucgugcu cuaucucaun n 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> /mod_base="OTHER" /note="deoxithymine (2'H thymine)" <400> 62 augagauaga gcacgaugun n 21 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (2)..(5) <223> /mod_base="cm" <220> <221> modified_base <222> (4)..(7) <223> /mod_base="um" <400> 63 ananngngnn nnannnnan 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (7) <223> /mod_base="um" <220> <221> modified_base <222> (12) <223> /mod_base="cm" <400> 64 augaganaga gnacgaugu 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(18) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'-o-methyladenosine" <220> <221> modified_base <222> (2) <223> /mod_base="cm" <220> <221> modified_base <222> (3)..(13) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Adenosine" <220> <221> modified_base <222> (4)..(10) <223> /mod_base="um" <220> <221> modified_base <222> (5)..(9) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Cytidine" <220> <221> modified_base <222> (6)..(8) <223> /mod_base="gm" <220> <221> modified_base <222> (7)..(19) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Uridine" <400> 65 nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Adenosine" <220> <221> modified_base <222> (2) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Uridine" <220> <221> modified_base <222> (3)..(5) <223> /mod_base="gm" <220> <221> modified_base <222> (7)..(17) <223> /mod_base="um" <220> <221> modified_base <222> (12) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Cytidine" <220> <221> modified_base <222> (18) <223> /mod_base="OTHER" /note="2'F Guanosine" <400> 66 nnnnnnnnnn nnacnnnnn 19

Claims (27)

  1. NRARP의 발현 또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환(eye condition)의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 siRNA 분자로서,
    상기 분자는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특이적으로 표적하고,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것인, siRNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 안 질환은 신혈관 형성(neovascularization)과 관련된 것인, siRNA 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 안 질환은 노인 황반 변성(age-related macular degeneration; AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(diabetic macular edema; DME), 증식당뇨망막병(proliferative diabetic retinopathy; PDR), 당뇨병성 망막 허혈(diabetic retina ischemia; DRI), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema; DRE), 근시성 신혈관 형성(myopic neovascularization) 및 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity; ROP) 및 이들의 조합에서 선택되는 것인, siRNA 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 siRNA는 19개의 뉴클레오티드로 된 이중 가닥 영역을 포함하는, siRNA 분자.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 siRNA는 블런트-말단인(blunt-ended), siRNA 분자.
  6. NRARP의 발현 또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환(eye condition)의 치료 또는 예방에 이용하기 위한 siRNA 분자로서,
    상기 분자는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특이적으로 표적하고,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥; 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥;으로 이루어지거나 이들을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  7. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 화학적 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형, 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드의 도입, 우라실의 5-프로피닐우라실로의 치환, 우라실의 5'-메틸우리딘으로의 치환, 우라실 리보오스 뉴클레오티드의 4'-티오리보오스로의 치환 및 우라실 리보오스 뉴클레오티드의 데옥시티미딘 뉴클레오티드로의 치환 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, siRNA 분자.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 센스 가닥 상에, 안티센스 가닥 상에 또는 이들 모두의 가닥들 상에서 이루어진 것인, siRNA 분자.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 19 내지 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 63 및 SEQ ID NO. 65로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥; 및 SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 64 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥;으로 이루어지거나 이들을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  12. siRNA 분자로서, 상기 siRNA 분자는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특이적으로 표적하고, 세포로 도입될 때 NRARP 유전자의 발현을 감소시키고, 19개 뉴클레오티드로 된 블런트-말단의 이중 가닥 구조를 포함하며,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것인, siRNA 분자.
  13. siRNA 분자로서, 상기 분자는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 9로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 특이적으로 표적하고, 상기 siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군, 또는 SEQ ID NO. 19 내지 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 것인, siRNA 분자.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 10 내지 SEQ ID NO. 18로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥; 및 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥;으로 이루어지거나 이들을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  15. 제12항에 있어서,
    적어도 하나의 뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드의 화학적 변형은 2'-O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형, 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드의 도입, 우라실의 5-프로피닐우라실로의 치환, 우라실의 5'-메틸우리딘으로의 치환, 우라실 리보오스 뉴클레오티드의 4'-티오리보오스로의 치환 및 우라실 리보오스 뉴클레오티드의 데옥시티미딘 뉴클레오티드로의 치환 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, siRNA 분자.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 화학적 변형은 센스 가닥 상에, 안티센스 가닥 상에 또는 이들 모두의 가닥들 상에서 이루어진 것인, siRNA 분자.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 19 내지 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  19. 제15항에 있어서,
    상기 siRNA는 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 63 및 SEQ ID NO. 65로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 센스 가닥; 및 SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 64 및 SEQ ID NO. 66으로 이루어진 군에서 선택되는 상기 센스 가닥과 상보적인 안티센스 가닥;으로 이루어지거나 이들을 포함하는 것인, siRNA 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 siRNA 분자를 포함하는, NRARP의 발현 또는 활성이 증가된 것을 특징으로 하는 안 질환의 치료용 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 안 질환은 신혈관 형성과 관련된 것인, 약제학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 안 질환은 노인 황반 변성(AMD), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 당뇨병성 황반부종(DME), 증식당뇨망막병(PDR), 당뇨병성 망막 허혈(DRI), 당뇨병성 망막 부종(DRE), 근시성 신혈관 형성 및 미숙아 망막병증(ROP) 및 이들의 조합에서 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
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