KR102642550B1 - 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명에 따른 강아지풀 추출물은 천연물을 이용하여 부작용이 없거나 적으며, 근육량 및 근력을 증가시키고, 근육조직의 섬유화를 억제하며, 항산화 대사를 개선하고, 근육 내 지질축적 억제를 통해 근육세포의 질을 증가시킬 수 있으므로 근력 약화 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약품 및 기능성 식품 개발 등에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, alleviating, or treating muscle weakness diseases comprising Setaria viridis extract as an active ingredient}

본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골격근은 인체에서 가장 큰 부분을 차지하는 기관으로 총 몸무게의 40 내지 50%를 차지하며 에너지 항상성 및 열 생성 등을 비롯한 체내 여러 대사 기능에서도 중요한 역할을 한다. 사람의 신체는 노화하면서 구성성분의 변화로써 체지방과 체단백질의 재분포가 일어나며, 약 50세가 되면 근세포 내 단백질의 합성속도가 분해속도보다 느려져 근육이 급격하게 퇴화를 시작하게 되므로, 근력 약화 관련 질환에 노출될 수 있다.

근력 약화 관련 질환의 하나인 근감소증은 평소 자기 체질량의 약 13~24%가 감소한 상태를 말하는 것으로, 단백질 함량, 섬유 직경, 근력 생산 및 피로 저항(fatigue resistance)의 감소를 나타낸다. 근감소증은 패혈증, 암, 신부전증, 글루코코르티코이드의 과다, 신경제거, 근육의 미사용, 비만 그리고 노화과정 등 다양한 원인에 의해 발생한다. 주로, 노화가 진행됨에 따라 일어나는 골격근의 양과 질의 점진적 감소를 원인으로 꼽을 수 있다.

이에, 일반적인 근력 약화 관련 질환으로 인한 근육 감소를 치료하거나 근육을 증가시키기 위한 연구와 노력이 집중되고 있으며, 여전히 근력 약화 관련 질환의 치료와 근육강화에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다.

한편, 강아지풀이 근력 약화 관련 질환의 예방, 치료, 또는 개선에 효과적인지는 알려진바 없다.

이에, 본 발명자들은 강아지풀 추출물이 근육량 및 근력을 증가시키는 효과가 우수한 것을 확인하여, 근력 약화 관련 질환의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물로 이용될 수 있도록 하였다.

대한민국 등록특허 제10-2092254호

본 발명자들은 근력 약화 관련 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 천연물 유래 활성물질을 개발하고자 노력한 결과, 강아지풀 추출물의 우수한 근육량 및 근력 증가 효과를 확인함으로써 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 강아지풀 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 근감소증은 노화성 근감소증 또는 비만성 근감소증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(a) 근육량 증가;

(b) 근육량 감소 억제;

(c) 근력 증가;

(d) 근육조직 지질함량 증가 억제; 및

(e) 근육조직 섬유화 억제.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 더 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(a) 체중 및 체지방 증가 억제;

(b) 간조직 또는 지방조직의 섬유화 억제;

(c) 혈장 지질농도 증가 억제;

(d) 간조직 지질함량 증가 억제;

(e) 혈장 간독성 지표 증가 억제;

(f) 지질과산화물 증가 억제;

(g) 항산화 대사 개선; 및

(h) 혈당 증가 억제 및 인슐린 저항성 개선.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물의 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 치료용 약제 제조를 위한 강아지풀 추출물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 대사질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 근력 강화 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물의 근력 강화 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 근력 강화용 약제를 제조하기 위한 강아지풀 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 강아지풀 추출물은 천연물을 이용하여 부작용이 없거나 적으며, 근육량 및 근력을 증가시키고, 근육조직의 섬유화를 억제하며, 항산화 대사를 개선하고, 근육 내 지질축적 억제를 통해 근육세포의 질을 증가시킬 수 있으므로 근력 약화 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약품 및 기능성 식품 개발 등에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 근력 약화 관련 질환에 대한 강아지풀 추출물의 효과를 평가하기 위한 비만성 근감소 마우스 모델을 이용한 실험 디자인을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 2a는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이 급여한 후, 비복근(gastrocnemius), 대퇴근(quadriceps), 및 앞정강이근(tibialis anterior)을 적출하고 중량을 측정하여 체중 100g 당 중량으로 나타낸 도면이다 (HFD vs. ND: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; HFD vs. SV: #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, 도 2b 내지 도 7 동일.).
도 2b는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 체중을 20주 동안 일주일 간격으로 측정하여 체중 변화(좌측) 및 체중 증가 억제(우측)를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 실험식이 급여 4주차 및 20주차 허벅지 두께 측정 결과(좌측) 및 19주차 인장력 측정 결과(우측)를 나타낸 도면이다.
도 4는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 근육조직의 지질함량 측정 결과를 나타낸 도면이다 (FA: 유리지방산, TG: 중성지방, CHOL: 콜레스테롤).
도 5는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이 급여한 후, 근육조직 내 단백질 함량을 측정한 결과(좌측)와 근육조직의 형태학적 변화(우측)를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다 (상단: H&E 염색/하단: sirius red).
도 6은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 근육세포 성장 관련 단백질의 발현 변화를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 7은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 적혈구 내 항산화 효소 활성도(SOD 및 CAT)의 변화를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 8은 근력 약화 관련 질환에 대한 강아지풀 추출물의 효과를 평가하기 위한 노화성 근감소 마우스 모델을 이용한 실험 디자인을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 9는 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 12주간 실험식이 급여한 후, 앞정강이근(tibialis anterior)을 적출하고 중량을 측정하여 체중 100g 당 중량으로 나타낸 도면이다 (NC vs. YC: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; NC vs. SV: #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, 도 10 내지 도 18 동일.).
도 10은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 12주차 허벅지두께 측정 결과(좌측) 및 12주차 인장력 측정 결과(우측)를 나타낸 도면이다.
도 11은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 근육조직의 지질함량 측정 결과를 나타낸 도면이다 (FA: 유리지방산, CHOL: 콜레스테롤).
도 12는 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 근육조직의 형태학적 변화를 관찰한 도면이다 (상단: H&E 염색/하단: sirius red).
도 13은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 간조직의 지질함량 측정 결과를 나타낸 도면이다 (FA: 유리지방산, TG: 중성지방, CHOL: 콜레스테롤).
도 14는 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 간조직의 형태학적 변화를 관찰한 도면이다 (상단: H&E 염색/하단: MT 염색).
도 15는 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 근육조직의 지질과산화물(TBARS) 함량 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 적혈구와 간조직의 과산화수소(H₂O₂) 함량 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 적혈구 내 항산화 효소 활성도(GSH, GR, SOD 및 CAT)의 변화를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 18은 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 간조직 내 항산화 효소 활성도(GPx 및 CAT)의 변화를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 19는 강아지풀 추출물의 항비만 효과를 평가하기 위한 식이성 비만 유도 마우스 모델을 이용한 실험 디자인을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 20a는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 체중을 20주 동안 일주일 간격으로 측정하여 사육기간에 따른 체중 변화(좌측) 및 체중 증가 억제 효능(우측)을 비교하여 나타낸 도면이다 (HFD vs. ND: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; HFD vs. SV: #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001, 도 20b 내지 도 29 동일.).
도 20b는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 사육기간 동안 1일 평균 식이 섭취량(좌측) 및 20주간 실험식이 급여한 후, 평균 에너지 섭취량(중간) 및 에너지 섭취량에 대한 체중증가량을 나타내는 식이효율(Food efficiency ratio, FER)(우측)을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 20c는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 부위별 백색 지방조직(White Adipose Tissue; WAT)을 적출하고 중량을 측정하여 체중 100g 당 중량으로 나타낸 도면이다 (Epididymal: 부고환, Perirenal: 신주위, Retroperitoneum: 후복막강, Mesenteric: 장간막, Visceral: 내장, Subcutaneous: 피하, interscapular WAT: 견갑골간 백색지방, interscapular BAT: 견갑골간 갈색지방).
도 21a는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 부고환 백색지방조직의 형태학적 변화를 관찰한 도면이다 (상단: H&E 염색/하단: Masson's trichrome 염색).
도 21b는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 간조직의 형태학적 변화를 관찰한 도면이다 (상단: H&E 염색/하단: Masson's trichrome 염색).
도 22는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들의 혈장 중성지질 및 총 콜레스테롤 농도를 20주 동안 4주 간격으로 측정하여 주차별 혈장 중성지질(좌측) 및 총 콜레스테롤(우측) 농도를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 23a는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 간조직의 중량과 지질함량(FA: 유리지방산, TG: 중성지질, CHOL: 콜레스테롤)을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 23b는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 간조직의 지질대사 효소 활성도(FAS: fatty acid synthase, ME: Malic enzyme, PAP: Phosphatidate phosphohydrolase, G6PD: Glucose-6-phosphate dehydrogenase)를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 24a는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 적혈구와 간조직의 지질과산화물(TBARS) 함량을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 24b는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 혈장과 간조직의 글루타티온(GSH) 함량, 적혈구와 간조직의 글루타티온 환원효소(GR) 및 글루타티온 탈수소효소(GPx)의 활성도를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 24c는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 적혈구와 간조직 과산화수소(H₂O₂) 함량을 비교하여 나타낸 도면이다.
도 25는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 혈장 간독성 지표를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 26은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 혈당, 혈장 인슐린, 및 인슐린저항성 지표(HOMA-IR)를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 27은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 간조직 당대사 효소 활성도(G6Pase: Glucose-6-phosphatase, PEPCK: Phosphoenolpyruvate carboxykinase)를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 28은 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 혈장 GIP 농도를 비교하여 나타낸 도면이다.
도 29는 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV) 마우스들에 20주간 실험식이를 급여한 후, 혈장 렙틴(Leptin) 농도를 비교하여 나타낸 도면이다.

본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 강아지풀(Setaria viridis)은 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로, 그 생김새가 강아지의 꼬리와 흡사하여 개꼬리풀이라고도 하며, 한자로 구미초라고 한다. 강아지풀은 갯강아지풀, 수강아지풀 등의 종류가 있으며, 전국적으로 분포하고, 들판의 풀밭이나 길가 황폐지 등에서 많이 자란다. 한방에서는 여름에 전초를 채취하여 말린 것을 약용으로 사용하며 쌀이나 보리와 섞어서 밥을 짓거나 죽을 끓여 먹기도 한다.

본 발명에서 "추출물"은, 상기 강아지풀의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 강아지풀 추출물에 있어서, 상기 강아지풀을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 강아지풀을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서 강아지풀 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 강아지풀 추출물은 바람직하게는 에탄올로 추출될 수 있다.

상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 강아지풀 추출물은 강아지풀을 분쇄한 시료 70 내지 130 g, 70 내지 110 g, 70 내지 100 g, 70 내지 80 g, 80 내지 130 g, 100 내지 130 g, 110 내지 130 g, 90 내지 110 g, 95 내지 105 g, 70 g, 80 g, 90 g, 또는 100 g에 40 내지 95%, 40 내지 85%, 40 내지 75%, 40 내지 65%, 40 내지 55%, 40 내지 50%, 40 내지 47%, 40 내지 45%, 40 내지 43%, 40 내지 41%, 50 내지 55%, 55 내지 65%, 65 내지 75%, 68 내지 75%, 70 내지 75%, 73 내지 75%, 65 내지 73%, 65 내지 70%, 65 내지 68%, 75 내지 85%, 85 내지 95%, 88 내지 95%, 90 내지 95%, 90 내지 92%, 90 내지 91%, 40%, 50%, 60%, 65%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 75%, 78%, 80%, 또는 90% 농도의 에탄올 700 mL 내지 1.3 L, 700 mL 내지 1.1 L, 700 mL 내지 1 L, 700 mL 내지 900 mL, 900 mL 내지 1 L, 1L 내지 1.1 L, 1 L 내지 1.3 L, 1.2 L 내지 1.3 L, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 또는 1 L를 추가하여 30 내지 90 ℃, 30 내지 70 ℃, 30 내지 50 ℃, 40 내지 50 ℃, 50 내지 70 ℃, 55 내지 75 ℃, 60 내지 70 ℃, 60 내지 65 ℃, 60 내지 63 ℃, 70 내지 90 ℃, 80 내지 90 ℃, 85 내지 90 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 55 ℃, 또는 60 ℃에서 1시간 30분 내지 3시간 30분, 1시간 30분 내지 3시간, 1시간 30분 내지 2시간, 2시간 내지 2시간 30분, 2시간 30분 내지 3시간, 3시간 내지 3시간 30분, 2시간, 2시간 30분, 2시간 50분, 또는 3시간 추출을 1 내지 5회, 1 내지 3회, 1 내지 2회, 2회 내지 4회, 4회 내지 5회, 1회, 2회, 또는 3회 반복한 후 추출된 액을 여과하여 감압ㆍ농축하고 동결건조한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 유효성분은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 강아지풀 추출물의 근력 약화 관련 질환에 대한 효과를 평가하기 위하여, 식이 유도 비만성 근감소 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 마우스들을 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV)으로 분류하여 20주간 사육 후 각 군의 마우스로부터 다양한 근육조직을 분리하여 중량을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근육량을 증가시키거나 근육량의 감소를 억제시키는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들을 20주 동안 사육하며 체중을 측정한 결과, 강아지풀 추출물 섭취에 의해 비만성 근감소 마우스의 체중 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 허벅지 두께 및 인장력을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근력을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 지질함량을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근조직의 지질함량 증가를 억제하는 것을 확인함으로써 증가된 근육량과 허벅지 두께가 지질축적에 의한 것이 아님을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 단백질 함량을 측정하고 형태학적 분석한 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 근조직의 단백질 함량이 증가하고, 근섬유의 섬유화가 억제된 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육세포 성장 관련 단백질들의 발현을 분석한 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 MyD88, 및 Traf6 단백질 발현이 증가하고, Akt 및 Pi3k 단백질이 활성화된 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 적혈구 내 항산화 효소 활성도를 측정한 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 SOD 및 CAT 활성도가 활성화된 것을 확인하였다 (실시예 Ⅰ 참고).

본 발명의 다른 실시예에서는 강아지풀 추출물의 근력 약화 관련 질환에 대한 효과를 평가하기 위하여, 노화성 근감소 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 마우스들을 어린마우스군(YC), 노화마우스군(NC), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV)으로 분류하여 12주간 사육 후 각 군의 마우스로부터 앞정강이근육조직을 분리하여 중량을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근육량을 증가시키거나 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 허벅지 두께 및 인장력을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근력을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 지질함량을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 근조직의 지질함량 증가를 억제하는 것을 확인함으로써 증가된 근육량과 허벅지 두께가 지질축적에 의한 것이 아님을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 형태학적 분석 결과, 강아지풀 추출물이 근섬유의 섬유화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 간조직의 지질함량을 측정한 결과, 강아지풀 추출물이 간조직의 지질함량 증가를 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 형태학적 분석 결과, 강아지풀 추출물이 간조직의 섬유화를 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 근육조직의 지질과산화물 함량 측정 결과, 강아지풀 추출물이 근육조직 내 지질과산화물의 축적을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 간조직 및 적혈구의 과산화수소 함량 측정 결과, 강아지풀 추출물이 적혈구 및 간조직의 과산화수소의 축적을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 적혈구의 글루타티온 함량 측정 결과, 강아지풀 추출물이 적혈구의 글루타티온 함량을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 적혈구의 글루타티온 환원효소 활성도 측정 결과, 강아지풀 추출물이 적혈구 내 글루타티온 환원효소의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 적혈구의 SOD 활성도 측정 결과, 강아지풀 추출물이 적혈구의 SOD 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 적혈구 및 간조직의 CAT 활성도 측정 결과, 강아지풀 추출물이 적혈구 및 간조직의 CAT 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 간조직의 글루타티온 탈수소효소 활성도 측정 결과, 강아지풀 추출물이 간조직의 글루타티온 탈수소효소 활성을 증가시키는 것을 확인하였다 (실시예 Ⅱ 참고).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 강아지풀 추출물의 항-비만 효과를 평가하기 위하여, 식이성 비만 유도 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, 마우스들을 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD), 및 강아지풀 추출물 첨가군(SV)으로 분류하여 20주 동안 사육하며 체중을 측정한 결과, 강아지풀 추출물 급여에 의해 고지방식이 비만 유도 마우스의 체중 증가를 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 20주간의 사육 후 각 군의 마우스로부터 다양한 백색 지방조직을 분리하여 중량을 측정한 후 비교한 결과, 강아지풀 추출물이 체지방량 증가를 억제시킬 수 있음을 확인함으로써 강아지풀 추출물이 체중 감량에 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 지방조직 및 간조직의 형태학적 분석 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 간조직 및 지방조직의 섬유화가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 희생 시점에 동일한 방법으로 혈액을 채취하여 혈장 지질농도를 분석한 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 혈장 지질농도 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 간조직을 적출하여 간조직의 중량, 지질대사 효소 활성도, 및 유리지방산, 중성지질, 및 콜레스테롤 농도를 비교하여 분석한 결과, SV군의 경우 HFD군에 비해 간조직 지질함량 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 희생시점에 수집한 적혈구와 간조직에서 항산화 관련 바이오마커인 지질과산화물(TBARS), 글루타티온(GSH), 글루타티온 환원효소(GR)/탈수소효소(GPx) 및 과산화수소(H₂O₂)를 분석한 결과, TBARS의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 TBARS 함량이 감소, GSH의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 GSH 함량이 증가, 글루타티온 환원효소(GR)/탈수소효소(GPx)의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 GR/GPX 함량이 증가, 과산화수소(H₂O₂)의 경우, HFD군과 비교하여 SV군에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 희생시점에 수집한 혈액에서 혈장 간독성 지표인 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase) 및 GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 분석한 결과, SV군에서 HFD군에 비해 현저하게 낮은 혈장 GOT 및 GPT를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 각 군의 마우스들의 희생시점에 수집한 혈액에서 혈장 glucose, insulin, GIP, Leptin 함량 및 간조직 당신생 관련 효소 활성도(G6Pase 및 PEPCK)를 분석한 결과, 혈장 glucose의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 glucose 농도가 감소하는 경향을 나타냈으며, 혈장 insulin 및 HOMA-IR의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 insulin 농도가 감소, 혈장 GIP의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 GIP 농도가 감소하는 것을 확인하였다. 혈장 Leptin의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 leptin 농도가 감소하는 경향을 나타냈다. 간조직 G6Pase 활성도의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 G6Pase 활성도가 감소하는 경향을 나타냈으며, 간조직 PEPCK의 경우, HFD군에 비해 SV군에서 PEPCK 활성도가 감소한 것을 확인하였다 (실시예 Ⅲ 참고).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 강아지풀 추출물은 식이 유도 비만 마우스 모델에서 체중 및 체지방 증가 억제 효과를 나타내며, 혈장 지질농도 증가를 억제시킴으로써 이상지질을 개선할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 간조직 지질함량 및 혈장 간독성 지표인 GOT 및 GPT의 증가를 억제시킴으로써 지방간 및 간독성 개선 효과를 가질 뿐만 아니라, 항산화 관련 바이오마커인 TBARS 증가를 억제시키고 GSH를 증가시킴으로써 지방세포에 의한 산화적 손상 개선 효과 및 섬유증 개선 효과를 가짐을 알 수 있었다. 또한, 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR의 증가를 억제시키고 당신생 관련 효소활성도를 감소시킴으로써, 혈장 및 간조직 내 당대사를 개선시켜 인슐린 저항성 개선 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

이에, 강아지풀 추출물은 다양한 근력 약화 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 근력 강화용 조성물 뿐만 아니라 대사질환 및 간질환 등의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(a) 근육량 증가;

(b) 근육량 감소 억제;

(c) 근력 증가;

(d) 근육조직 지질함량 증가 억제; 및

(e) 근육조직 섬유화 억제.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 더 만족할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

(a) 체중 및 체지방 증가 억제;

(b) 간조직 또는 지방조직의 섬유화 억제;

(c) 혈장 지질농도 증가 억제;

(d) 간조직 지질함량 증가 억제;

(e) 혈장 간독성 지표 증가 억제;

(f) 지질과산화물 증가 억제

(g) 항산화 대사 개선; 및

(h) 혈당 증가 억제 및 인슐린 저항성 개선.

상기 “항산화 대사 개선”이란 혈액, 간, 또는 근육 내에서 항산화 효소의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 의미하며, 산화적 스트레스와 밀접하게 관련된 활성산소의 축적은 근육조직 분해, 골격근 위축, 근육기능 감소, 및 섬유성 조직 증가 등을 유발할 수 있으므로 항산화 대사 개선을 통해 근력 약화 관련 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다. 본 발명에서 상기 항산화 효소는 Superoxide discmutase (SOD), Catalase (CAT), glutathione(GSH), Glutathion reductase (GR), 및 Glutathion peroxidase (GSH-Px)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 “인슐린 저항성”이란 비만을 포함한 다양한 원인에 의해 혈당을 낮추는 인슐린의 기능이 떨어져 세포 및 물질대사 측면에서 포도당 균형이 효과적으로 다루어지지 못하는 것을 의미한다. 인슐린 저항성이 높을 경우, 인체는 이미 포도당이 충분함에도 불구하고 계속해서 인슐린을 생성하여 고인슐린혈증이 야기되고, 그로 인해 인슐린을 만들어내는 췌장 베타세포에 과부하가 발생하여 기능에 이상이 나타나며, 이로 인해 고혈압이나 고지혈증은 물론 심장병·당뇨병 등 대사질환이 초래될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "근력 약화 관련 질환"이란, 근육조직 또는 근세포가 감소하거나 소실되는 모든 질환을 의미한다. 상기 근력 약화는 어느 한 근육이나, 몸의 한쪽, 상지나 하지 등에 국한될 수도 있고, 전신에 걸쳐 나타날 수도 있으며, 선천적 또는 후천적으로 나타날 수도 있다. 또한, 근피로나 근육통을 포함하는 주관적인 근력 약화 증상은 이학적 검진을 통해 객관적인 방법으로 정량화될 수 있다.

상기 근력 약화 관련 질환은 예를들어, 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) , 및 심위축증 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 근육조직 또는 근세포가 감소하거나 소실되어 발생하는 모든 질환을 포함한다.

본 발명에서 "근감소증"이란 노화, 비만 등 다양한 이유로 몸의 근육(근육량, 근력)이 비정상적으로 줄거나 약해져 신체활동이 원활치 않은 상태로, 증상이 심해지면 장애에 이르고, 사망 위험을 높인다. 근감소증은 근육 자체를 넘어 뼈와 혈관, 신경, 간, 심장, 췌장 등 신체 전반에 걸쳐 광범위한 영향을 미친다. 특히, 뼈는 근육에 의해 스트레스(자극)를 받아 밀도를 유지하기 때문에, 근감소증과 골다공증은 매우 밀접한 상관성을 지닌다. 또한, 근육이 감소되면 새로운 혈관과 신경이 생겨나는 것을 방해해 인지기능 저하, 지방간, 당뇨병의 발생 위험이 높을 것으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 근감소증은 노화성 근감소증 또는 비만성 근감소증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 “노화성 근감소증”은 노화에 따른 점진적인 근육량의 감소 또는 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되는 것을 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.

상기 “비만성 근감소증”은 비만으로 인하여 근육 내에 지방이 침착되어 근육량이 감소함과 더불어 비만세포 유래 염증인자가 증가하고, 근육 내 미토콘드리아의 기능이 저하됨으로써 근육의 기능이 약화되는 현상을 의미하는 것으로, 비만으로 인하여 인슐린 분비에 이상이 발생하는 경우, 세포에 에너지를 제대로 공급하지 못하므로 근육 발달 장애를 일으킬 수 있다.

상기 “근위축증”은 사지의 근육이 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.

상기 “근육 퇴행 위축(muscle dystrophy)”은 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다.

상기 “심위축증”은 심장이 외부적 또는 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠에 의하여 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 증상으로 나타난다.

본 발명에서 "비만"이란, 에너지의 섭취와 소모의 불균형으로 인하여 체내에 에너지가 과잉으로 축적되어 지방조직이 비정상적으로 증가된 상태를 말하며, 겉으로는 정상체중으로 보여도 체지방 비율이 높으면 비만이라고 할 수 있다. 비만은 한가지 원인보다는 여러 원인이 복합적으로 작용하여 발생하며, 서구화된 식습관을 포함하여 잘못된 식습관과 활동량 감소, 정서적 요인, 유전적 요인 등을 원인으로 들 수 있다. 본 발명에서 상기 비만은 근감소성 비만일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "근감소성 비만"이란 노화 또는 비만에 기인하여 근육량이나 근력의 감소와 더불어 체지방량이 증가한 상태 즉, 근육의 지방으로의 전환으로 인해 비만과 근감소증의 복합적인 형태를 갖는 것을 의미한다. 일례로, 비슷한 체질량지수를 가지고 있는 사람에서 체지방량이 증가되어 있고 근육량은 감소되어 있다면 체지방량과 근육량이 균형을 이루고 있는 사람에 비해 기능 장애(functional limitation)와 대사 질환의 발생 위험이 높을 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 "대사질환"이란 비만과 밀접하게 연관성이 있거나, 비만에 기인하는 상태 또는 질환을 의미하며, 예를 들어, 이상지질혈증; 약물성 간 손상, 바이러스성 간 손상, 간염, 간경화, 간암 또는 간성혼수를 포함하는 간독성 질환; 또는 지방간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 간질환은 비알콜성 지방간 질환 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명에서 “비알콜성 지방간 질환(Nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD)”은 과량의 알콜을 섭취하지 않은 환자에서 간에서 지방이 축적될 때 발생하는 지방간의 유형 중 하나로, 염증 반응을 동반하지 않는 단순 지방간, 및 이에 의해 진전되며, 간세포의 염증반응, 간섬유화 및 간경화를 포함하는 넓은 범위의 질환을 의미한다. 비알콜성 지방간 질환은 초기 단계에서 발견 시 좋은 결과를 얻을 수 있으나, 그렇지 않을 경우 다양한 이유로 인하여 비알코올성 지방간염(NASH)으로 진행될 수 있고, 더 나아가서 간경변증과 간암을 일으킬 수 있다.

비알콜성 지방간 질환은 원인에 따라 원발성과 속발성으로 나뉘는데 원발성은 대사증후군의 특징인 고지혈, 당뇨, 또는 비만 등에 의해 발생되며, 속발성은 영양적 원인(급격한 체중 감소, 기아, 장 우회술), 다양한 약물, 독성 물질(독버섯, 세균 독소), 대사성 원인 및 기타 요인에 의해 발생한다. 원발성 요인인 대사증후군의 중요한 특징인 당뇨 및 비만과 관련된 비알콜성 지방간 질환의 발생율은 당뇨 환자의 약 50%, 비만 환자의 약 76%로, 비만한 당뇨 환자에서 거의 대부분 비알콜성 지방간 질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

상기 비알콜성 지방간 질환은 단순성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염, 간섬유화, 간경화 및 간경변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 “약학적 조성물”은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨데, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화활 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산 나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 포함하는 조성물의 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 근력 약화 관련 질환; 대사질환; 또는 간질환 치료용 약제 제조를 위한 강아지풀 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 다른 양태로 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이 때 상기 건강기능식품 조성물은 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명의 강아지풀 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 강아지풀 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 강아지풀 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 명세서에 있어서, “건강기능식품”이란 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물을 제공한다. 상기 강아지풀 추출물은 상기 약학적 조성물이나 식품 조성물의 경우와 동일하게 준비될 수 있다.

상기 근력 강화용 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "근력 강화"란, 근육량을 증가시키거나, 근육 회복을 강화하거나, 근육 피로를 감소시키는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 근력 개선 또는 강화 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물의 근력 개선 또는 강화 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 사료 조성물을 제공한다. 상기 강아지풀 추출물은 상기 약학적 조성물이나 식품 조성물의 경우와 동일하게 준비될 수 있다.

본 발명의 강아지풀 추출물은 근육량 및 근력 증가, 항산화 대사 개선 효과를 나타내므로 동물이나 가축의 근력 개선 촉진제로서 사료 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료 조성물은 당업계에서 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 또는 특수사료가 포함될 수 있다.

농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자 열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.

조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산 발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다.

특수사료에는 패각, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이 보조제 등이 있다.

본 발명에 따른 사료 조성물은 다양한 사료 첨가제를 포함할 수 있다.

본 명세서에서, "사료 첨가제" 란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 라이신 등의 보호 아미노산 제제, 지방산 칼슘염 등의 보호 지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 사료 조성물은 근육 양의 감소, 근질의 저하 등에 의한 근력 저하 현상 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고 어떠한 것이든 적용 가능하다. 상기 개체는 동물, 예를 들어 비-영장류 (예를 들면, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 및 마우스) 및 영장류 (예를 들면, 원숭이, 예를 들어 사이노몰구스 (cynomolgous) 원숭이 및 침팬지)를 비롯한 포유동물을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 상기 개체는 축산용 동물 (예를 들면, 말, 소, 돼지 등) 또는 애완용 동물 (예를 들면, 개 또는 고양이)이다.

본 발명에 따른 사료 조성물의 복용량은 개체의 종(species), 크기(size), 무게(weight), 나이(age)와 같은 다수의 요인들에 좌우될 것이다. 원칙적으로, 전형적인 복용량은 개체/일 당 0.001 내지 10 g의 범위일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 Ⅰ. 비만성 근감소에 대한 강아지풀의 효과

실시예 1. 강아지풀 추출물 제조

실험에 사용된 강아지풀(setaria viridis)은 경상북도 경산 야산에서 8~9월경에 채취하여 추출에 사용하였다. 강아지풀을 분쇄한 시료 100g에 70% 에탄올(Ethanol) 1L를 추가하여 60℃에서 3시간 추출을 3회 반복한 후 추출된 액을 여과하여 감압ㆍ농축하고 동결건조하였다. 강아지풀 주정 추출물 파우더를 수득하여 냉동 보관한 후 식이 제조에 사용하였다. 추출 수율은 6.05%였다.

실시예 2. 실험동물 모델

2-1. 실험동물

강아지풀 추출물의 섭취가 비만성 근감소에 미치는 영향을 확인하기 위하여 식이성 비만 유도 근감소 마우스 모델을 이용하여 도 1에 나타낸 모식도와 같이 실험을 설계하여 진행하였다. 실험동물은 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스(JA BIO, Korea)를 중아바이오에서 구입하여 사용하였다. 1주간 펠렛(pellet) 형태의 식이를 제공하여 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 실험동물을 정상식이군(ND, normal diet), 고지방식이군(HFD, high-fat diet, 20% fat, 1% cholesterol) 및 고지방식이에 강아지풀 추출물 첨가군(SV, HFD+0.3% (w/w) setaria viridis ethanol extract)으로 나누어 하기 표 1에 나타낸 조성의 실험식이를 제공하며 20주간 사육하였다. 동물 사육실은 항온(24±2℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격(6:00~18:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였으며, 한 마리씩 개개의 케이지(cage) 안에서 사육하였고, 실험식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 제공하였다(ad libitum).

2-2. 실험식이 조성

ND군, HFD군 및 SV군의 실험식이 조성은 하기 표 1과 같다. ND군은 정상식이군으로 AIN-76 semisynthetic diet를 제조하여 급여하였으며, HFD군은 AIN-76 diet에 라드(lard)와 콜레스테롤(cholesterol)을 첨가시켜 20% 지방(fat) 및 1% 콜레스테롤(cholesterol)을 포함하는 고지방식이를 제조하여 급여하였다. 강아지풀 추출물 첨가군은 첨가하는 강아지풀 추출물을 고지방식이의 0.3% 용량으로 설정하여 식이를 급여하였다.

실시예 3. 강아지풀 추출물이 근육량 및 체중 변화에 미치는 영향 분석

3-1. 근육량 변화

상기 실시예 2에 나타낸 바와 같이 20주간 사육한 각 군의 마우스들을 12시간 동안 절식시키고 isofloran(5mg/kg body weight, Baxter, USA)을 이용하여 마취한 후 희생시켜 앞정강이근(tibialis anterior), 비복근(gastrocnemius), 및 대퇴근(quadriceps)의 근육조직을 적출하였다. 적출한 각 마우스의 근육조직을 식염수(0.9% saline solution)로 여러 번 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 중량을 측정한 후 체중 100g 당 중량으로 나타내어 비교하였다. 중량을 측정한 근육조직은 용도에 맞게 나누어 액체질소에 급냉시켜 -70℃에 보관하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 ND군에 비해 비복근(gastrocnemius), 대퇴근(quadriceps), 앞정강이근(tibialis anterior)의 중량이 감소하였다. SV군의 경우, 비복근 및 앞정강이근의 중량이 HFD군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 다만, 대퇴근의 중량은 HFD군과 SV군간 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근육량을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

3-2. 체중 변화

강아지풀 추출물에 의한 체중 변화를 확인하기 위하여 사육기간 동안 주 1회 체중을 측정하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 실험식이 급여 4주 차부터 HFD군의 경우 ND군에 비해 체중이 유의적으로 높게 나타났으며, 실험식이 급여 12주 차부터 HFD군에 비해 SV군의 체중이 유의적으로 낮게 나타났다.

또한, 총 체중 증가량(body weight gain)을 하루 동안의 체중 증가량으로 환산했을 때 HFD군에서 ND군에 비해 유의적으로 높게 나타났으며, SV군이 HFD군에 비해 유의적으로 낮게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 체중 증가를 직접적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 강아지풀 추출물이 허벅지 두께와 근력 증가에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 허벅지 두께와 근력의 증가에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험기간 동안 4주 간격으로 마우스의 허벅지 두께를 캘리퍼(caliper)를 이용하여 측정하였다. 실험식이 급여 19주차에 마우스의 인장력 측정을 위해 3일간 측정기기에서 적응시킨 후, 5일 동안 연속으로 측정하였다. 마우스를 측정기기 그리드(grid) 상단에 올려두어 네 발로 모두 그리드를 잡도록 하여 마우스의 몸통과 그리드가 평행하게 유지하면서 꼬리를 뒤쪽으로 부드럽고 천천히 당길 때, 마우스가 힘을 주어 그리드를 잡는 힘의 최대 근력값을 기록하였다.

그 결과, 도 3(좌측)에 나타낸 바와 같이, 실험식이 급여 4주차에 측정한 뒷다리 허벅지 두께는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군과 HFD군 간의 유의적 차이는 나타나지 않았다. 반면, 실험식이 급여 20주차에 측정한 허벅지 두께는 HFD군의 경우 ND군에 비해 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 실험 19주차에 실시한 인장력 측정 결과, 도 3(우측)에 나타낸 바와 같이, ND군과 HFD군 간의 유의미한 차이는 나타나지 않았으나, SV군의 경우, HFD군 보다 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근력을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 강아지풀 추출물이 근육조직의 지질함량에 미치는 영향 분석

근육조직의 지질함량 측정을 위하여 상기 실시예 3-1에서 냉동 보관한 근육조직의 지질을 Folch 등 (1957)의 방법을 따라 추출한 다음, 추출액을 37℃에서 질소가스로 휘발시켜 아이소프로판올(isopropanol)로 희석하였다. 정량을 위해 효소 시약에 유화제로 3mM 콜산(cholic acid)과 발색 시 일어나는 탁도를 제거하기 위해 0.5% Triton X-100을 혼합하여 지질 성분을 추출한 후 실험에 사용하였다. 중성지질 및 콜레스테롤 농도는 아산제약(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)의 효소 kit를 사용하여 측정하였다. 유리지방산 함량은 효소법을 이용한 발색법 원리를 이용한 유리지방산 측정용 시액(Non-Esterified fatty acid, NEFA kit, 신양화학)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우, 고지방식이에 의해 근육조직의 지질함량이 유의적으로 증가하였다. 반면, SV군의 경우, HFD군과 비교하여 근육조직의 유리지방산(FA) 및 중성지질(TG) 함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물에 의해 근육조직의 지질함량이 감소하므로, 증가된 근육량과 허벅지 두께가 지질 축적에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

실시예 6. 강아지풀 추출물이 근육조직에 미치는 영향 분석

6-1. 근육조직 내 단백질 함량

상기 실시예 3-1에서 적출한 근육조직 0.1g을 3mm beads와 lysis buffer(T-PER buffer, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 1ml를 추가하여 균질화(homogenize)시킨 후 14,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액만 모아 새로운 튜브에 옮겨 단백질을 추출하여 실험에 사용하였다. 단백질 정량은 Quick Start™ Bradford Reagent(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 595nm(VERSAmax, Molecular devices Co, USA)에서 측정하고, 표준용액은 BSA (bovine serum albumin) 용액을 사용하였다.

그 결과, 도 5(좌측)에 나타낸 바와 같이, 근육 조직 내 단백질 함량은 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 감소하였으며, SV군은 HFD군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

6-2. 근육조직의 형태학적 관찰

근육조직의 형태학적 관찰을 위해 상기 실시예 3-1에서 적출한 근육조직 일부를 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올(ethanol)로 탈수하여 파라핀(paraffin)에 포매과정을 거쳐, poly-L-lysine으로 처리된 5μm 두께의 조직 절편을 제작한 다음 hematoxylin eosin(H&E) 염색하여 광학현미경으로 200배 배율로 일반적인 세포의 형태를 관찰하였으며, sirius red로 염색된 슬라이드를 color-segmentation 방법으로 분석하여 같은 절편에서 콜라겐(빨간색)과 근섬유(노란색)로 염색된 조직을 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 5(우측 상단)에 나타낸 바와 같이, 근육세포의 형태와 구조가 ND군에 비해 HFD군에서 불규칙하게 나타났다. SV군의 경우, 고지방식이에도 불구하고 근육세포의 형태와 구조가 ND군과 유사하게 나타났다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 고지방식이로 불규칙해진 근육세포를 정상화할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 근육조직 내 콜라겐 섬유의 조직학적 시각화를 위하여 실시한 sirius red 염색 결과, 도 5(우측 하단)에 나타낸 바와 같이, HFD군은 근육조직에서 ND군에 비해 콜라겐이 많이 축적되어 있는 것으로 관찰되었으며, SV군은 ND군과 유사하게 나타났다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근섬유의 섬유화를 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 강아지풀 추출물이 근육세포 성장 관련 단백질 발현에 미치는 영향 분석

근육조직 세포의 성장 기전을 확인하기 위해 근육세포 분화를 촉진하고 근섬유 단백질 축적에 관여하는 Pi3k/Akt/mTOR 경로의 단백질 발현량을 측정하기 위해, 상기 실시예 3-1에서 냉동 보관한 근육조직 0.1g을 3mm beads와 lysis buffer(T-PER buffer, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 1ml를 추가하여 균질화(homogenize)시킨 후 14,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 상층액만 모아 새로운 튜브에 옮겨 단백질을 추출하여 실험에 사용하였다. 단백질 정량은 Quick Start™Bradford Reagent(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 전기영동(SDS-PAGE) 하였다. 전기영동을 통해 겔에 나눠진 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) membrane(Merck Millipore, New Jersey, USA)에 transfer한 후 5% skim milk/Tris-buffered saline with tween 20(TBST; 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)로 상온에서 1시간 동안 blocking하고 4℃에서 overnight으로 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체는 anti-Akt(1:1000, cell signaling, #9272), anti-phospho Akt(1:1000, cell signaling, #4058), anti-Pi3k(1:1000, cell signaling, #4292), anti-phospho Pi3k(1:1000, cell signaling, #4228), anti-mTOR(1:1000, cell signaling, #2983), anti-MyD88(1:1000, cell signaling, #4283), 및 anti-Traf6(1:1000, abcam, ab33915)를 5% BSA에 희석하여 사용하였고, loading control로 alpha- tubulin(1:1000, cell signaling, #2125)를 사용하였다. 2차 항체는 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG(1:5000; Cell Signaling, #7074S)를 5% skim milk에 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각각의 반응 후 TBST buffer로 10분간 3회씩 세척한 후 진행하였다. 세척한 membrane은 밴드를 현상시키는 Enhanced Chemiluminescent(ECL) kit(super-signal west pico plus, 34580, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 이용하여 시각화하였으며, G-box(50S; BI System Co.)를 이용해 정량화하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 근세포 분화 및 사멸 억제에 관여하는 Akt와 Pi3k 단백질의 경우, 활성화된 Akt와 Pi3k인 pAkt 및 pPi3k 단백질의 발현이 HFD군에 비해 SV군에서 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

한편, Pi3k/Akt/mTOR 경로의 상위인자인 MyD88과 Traf6 단백질의 경우, MyD88 단백질의 발현은 HFD군 대비 SV군에서 25.6%, Traf6 단백질의 발현은 HFD군 대비 SV군에서 58.7% 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀추출물이 근육 대사를 개선시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 강아지풀 추출물이 적혈구 항산화 효소 활성도 발현에 미치는 영향 분석

8-1. 적혈구의 SOD(Superoxide discmutase) 활성도 측정

SOD는 superoxide anion radical(O₂ ^-ㆍ)을 H₂O₂ 및 O₂로 분해시키는 반응을 촉매하는 효소로서 활성도 측정은 Marklund 등(1974)의 방법을 수정ㆍ보완하여 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색정도를 이용하여 측정하였다. 10mM EDTA를 포함한 50mM Tris-hydroxymethyl-aminomethane buffer(pH 8.5) 1.5mL에 적혈구 0.1mL와 7.2mM pyrogallol 용액 0.1mL를 넣고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 용액 50μL를 첨가하여 반응을 종결시키고 420nm(Beckman 650 spectrophotometer, USA)에서 흡광도 변화를 측정하여 pyrogallol의 자동산화를 방해하는데 필요한 cytosolic protein 및 적혈구 hemoglobin에 대한 SOD unit로 계산하였다.

그 결과, 도 7(좌측)에 나타난 바와 같이, 적혈구 SOD 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

8-2. 적혈구의 CAT(Catalase) 활성도 측정

CAT는 H₂O₂를 H₂O 및 O₂로 분해시키는 역할을 하며 활성도 측정은 Abei 등 (1974)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 50mM potassium phosphate buffer(KH₂PO₄:K₂HPO₄, pH 7.4) 2.89mL와 적혈구 10μL를 25℃에서 5분간 전반응 시킨 후 30mM H₂O₂ 용액 0.1mL를 첨가하고 25℃에서 5분간 240nm(Beckman 650 spectrophotometer, USA)에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성도는 1분당 적혈구 hemoglobin 1g이 분해시킨 H₂O₂의 μmole로 계산하였다.

그 결과, 도 7(우측)에 나타난 바와 같이, 적혈구 CAT 활성도는 HFD군의 경우 ND군과 유의적 차이가 나타나지 않았으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 통계분석

본 연구의 모든 실험 결과는 컴퓨터 통계 프로그램 중의 하나인 SPSS package program versuib 25.0(Statistical Paskage for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago)을 사용하여 산출하였다. 각 ND군과 HFD군간의 유의성 검정 및 HFD군과 물질군간의 유의성 검정을 위해 Student's t-test를 실시하였다. 모든 결과는 평균±S.E(standard error)로 표시하였다.

실시예 Ⅱ. 노화성 근감소에 대한 강아지풀의 효과

실시예 1. 강아지풀 추출물 제조

사용한 강아지풀(setaria viridis)은 경상북도 경산 야산에서 8~9월경에 채취하여 추출에 사용하였다. 강아지풀을 분쇄한 시료 100g에 70% 에탄올(Ethanol) 1L를 추가하여 60℃에서 3시간 추출을 3회 반복한 후 추출된 액을 여과하여 감압·농축하고 동결건조하였다. 강아지풀 주정 추출물 파우더를 수득하여 냉동 보관한 후 식이 제조에 사용하였다. 추출 수율은 6.05%였다.

실시예 2. 실험동물 모델

2-1. 실험동물

강아지풀 추출물의 섭취가 노화성 근감소에 미치는 영향을 확인하기 위하여 노화성 근감소 마우스 모델을 이용하여 도 8에 나타낸 모식도와 같이 실험을 설계하여 진행하였다. 실험동물은 8주령 수컷 C57BL/6J 마우스와 50주령 수컷 C57BL/6J 마우스(JA BIO, Korea)를 중아바이오에서 구입하여 사용하였다. 2주간 펠렛 형태의 식이를 제공하여 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 실험동물을 어린마우스군(YC, Young control, n=8), 노화마우스군(NC, Negative control, n=7) 및 강아지풀 추출물이 첨가된 식이가 제공되는 노화마우스군(SV, 0.3% (w/w) setaria viridis ethanol extract, n=7)으로 나누어 하기 표 2에 나타낸 조성의 실험식이를 제공하며 12주간 사육하였다. 동물 사육실은 항온(24±2℃항습(50±5%) 및 12시간 간격(6:00~18:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였으며, 한 마리씩 개개의 케이지(cage) 안에서 사육하였고, 실험식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 제공하였다(ad libitum).

2-2. 실험식이 조성

실험식이 조성은 하기 표 2와 같다. 모든 군에 식이는 AIN-93G diet를 제조하여 급여하였으며, 강아지풀 추출물이 첨가된 식이가 제공되는 노화마우스군은 강아지풀 추출물의 첨가 용량을 AIN-93G diet에 0.3% 용량으로 설정하여 식이를 급여하였다.

실시예 3. 강아지풀 주정 추출물이 근육량, 허벅지 두께, 및 근력 변화에 미치는 영향 분석

3-1. 근육량 변화

상기 실시예 2의 방법으로 12주간 사육한 각 군의 마우스들을 12시간 동안 절식시키고 isofloran(5mg/kg body weight, Baxter, USA)을 이용하여 마취한 후 희생시켜 앞정강이근(tibialis anterior)의 근육조직을 적출하였다. 적출한 각 마우스의 근육조직을 식염수(0.9% saline solution)로 여러 번 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 중량을 측정한 후 체중 100g 당 중량으로 나타내어 비교하였다. 중량을 측정한 근육조직은 용도에 맞게 나누어 액체질소에 급냉시켜 -70℃에 보관하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, NC군의 경우 YC군에 비해 앞정강이근의 중량이 유의적으로 감소하였다. SV군의 경우, 앞정강이근의 중량이 NC군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근육량을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

3-2. 허벅지 두께 및 근력의 변화

강아지풀 추출물이 허벅지 두께와 근력의 증가에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험식이 급여 12주차에 마우스의 허벅지 두께를 캘리퍼(caliper)를 이용하여 측정하였다. 실험식이 급여 12주차에 마우스의 인장력 측정을 위해 3일간 측정기기에서 적응시킨 후, 5일 동안 연속으로 측정하였다. 마우스를 측정기기 그리드(grid) 상단에 올려두어 네 발로 모두 그리드를 잡도록 하여 마우스의 몸통과 그리드가 평행하게 유지하면서 꼬리를 뒤쪽으로 부드럽고 천천히 당길 때, 마우스가 힘을 주어 그리드를 잡는 힘의 최대 근력값을 기록하였다.

그 결과, 도 10(좌측)에 나타낸 바와 같이, 오른쪽 허벅지 두께는 NC군의 경우 YC군에 비해 감소하였으나, SV군의 경우 오른쪽 및 왼쪽 허벅지 두께가 NC군에 비해 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 인장력 측정 결과, 도 10(우측)에 나타낸 바와 같이, NC군의 경우 YC군에 비해 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우, NC군 보다 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근력을 증가시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 강아지풀 추출물이 근육조직의 지질함량에 미치는 영향 분석

근육조직의 지질함량 측정을 위하여 상기 실시예 3-1에서 냉동 보관한 근육조직에서 지질을 Folch 등(1957)의 방법에 따라 추출한 다음, 추출액을 37℃에서 질소가스로 휘발시켜 아이소프로판올(isopropanol)로 희석하였다. 정량을 위해 효소 시약에 유화제로 3mM 콜산(cholic acid)과 발색 시 일어나는 탁도를 제거하기 위해 0.5% Triton X-100을 혼합하여 지질 성분을 추출한 후 실험에 사용하였다. 콜레스테롤 농도는 아산제약(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)의 효소 kit를 사용하여 측정하였다. 유리지방산 함량은 효소법을 이용한 발색법 원리를 이용한 유리지방산 측정용 시액(Non-Esterified fatty acid, NEFA kit, 신양화학)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 근육 내 콜레스테롤(Chol) 함량은 YC군과 NC군간의 유의적 차의가 없었으나, SV군의 경우, NC군에 비해 감소하는 경향을 나타냈다. 근육 내 유리지방산(FA) 함량은 YC군에 비해 NC군에서 유의적으로 증가하였으며, SV군은 NC군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물에 의해 근육조직의 지질함량이 감소하므로, 증가된 근육량과 허벅지 두께가 지질 축적에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

실시예 5. 강아지풀 추출물이 근육조직의 섬유화에 미치는 영향 분석

근육조직의 형태학적 관찰을 위해 상기 실시예 3-1에서 적출한 근육조직 일부를 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올(ethanol)로 탈수하여 파라핀(paraffin)에 포매과정을 거쳐, poly-L-lysine으로 처리된 5μm 두께의 조직 절편을 제작한 다음 hematoxylin eosin(H&E) 염색하여 광학현미경으로 200배 배율로 일반적인 세포의 형태를 관찰하였으며, sirius red로 염색된 슬라이드를 color-segmentation 방법으로 분석하여 같은 절편에서 콜라겐(빨간색)과 근섬유(노란색)로 염색된 조직을 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 12(상단)에 나타낸 바와 같이, 근육세포의 형태와 구조가 YC군에 비해 NC군에서 불규칙하게 나타났다. SV군의 경우, 강아지풀 추출물 첨가에 의해 근육세포의 형태와 구조가 YC군과 유사하게 나타났다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 노화에 의해 불규칙해진 근육세포를 정상화할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 근육조직 내 콜라겐 섬유의 조직학적 시각화를 위하여 실시한 sirius red 염색 결과, 도 12(하단)에 나타낸 바와 같이 YC군에 비해 NC군의 근육조직에서 콜라겐이 많이 축적되어 있는 것으로 관찰되었으며, SV군은 YC군과 유사하게 나타났다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 근섬유의 섬유화를 억제함을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 강아지풀 추출물이 간조직 지질 함량 및 섬유화에 미치는 영향 분석

6-1. 간조직 지질함량

간조직의 지질함량을 측정하기 위하여, 상기 실시예 3-1과 같이 간조직을 적출하여 상기 실시예 4와 같은 방법으로 근육 중성지질, 콜레스테롤 및 유리지방산을 정량하여 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, NC군의 경우 YC군에 비해 간조직 유리지방산(FA) 및 중성지질(TG) 함량이 유의적으로 증가한 반면, SV군의 경우에는 NC군에 비해 간조직 콜레스테롤(Chol) 함량이 유의적으로 감소하고, 유리지방산이 p-value 0.087 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 강아지풀 추출물이 지방간 개선 효과를 가짐을 알 수 있었다.

6-2. 간조직의 형태

강아지풀 추출물에 의한 간조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위해, 간조직 일부를 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올(ethanol)로 탈수하여 파라핀(paraffin)에 포매 과정을 거쳐, poly-L-lysine으로 처리된 5μm 두께의 조직 절편을 제작한 다음 hematoxylin eosin(H&E) 염색하여 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다. 또한, 콜라겐과 근섬유를 염색하기 위하여 Massons' trichrome 염색(결합조직: 파란색, 핵: 검붉은색, 세포질: 분홍색)을 시행하여 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다.

그 결과, 도 14(상단)에 나타낸 바와 같이, 간조직의 간문맥(portal vein)을 중심으로 YC군에 비해 NC군에서 다실의 지방구(lipid droplet)의 축적이 관찰된 반면, SV군은 NC군에 비해 지방구 수가 감소된 것으로 나타났다.

또한, 강아지풀 추출물이 간조직의 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해Masson's trichrome 염색을 실시한 결과, 도 14(하단)에 나타낸 바와 같이, NC군의 경우 간문맥 주변으로 결합조직이 많이 축적되어 있는 것이 관찰되었으나, SV군은 섬유화가 억제된 것으로 나타났다.

실시예 7. 강아지풀 추출물이 지질과산화물 축적에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 노화에 의한 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 근육, 간, 및 적혈구 지질과산화물 함량을 측정하여 비교하였다

7-1. 근육조직의 지질과산화물(TBARS; Thiobarbituricacid reactive substance)

근육조직의 지질과산화물 함량은 Tarladgis 등(1964) 및 Ohkawa 등(1979)의 방법을 이용하여 상기 실시예 3-1에서 냉동 보관한 근육조직 0.1g을 0.1M triethanolamine, 0.02M EDTA(pH 7.4), 0.002M DTT가 포함된 완충용액에 첨가하여 빙냉 상태에서 glass teflon homogenizer(Glascol, 099C K44, USA)로 균질화하였다. 균질액 0.04mL, 8.1% sodium dodecyl sulfate(SDS) 용액 0.04mL 및 증류수 0.12mL를 섞어 실온에서 5분간 방치한 후 20% acetate(pH 3.5) buffer 0.3mL과 0.8% TBA 0.3mL를 첨가하여 95℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 시료를 실온으로 냉각시켜 증류수 1mL와 n-butanol:pyridine(15:1) 용액 5mL를 첨가하였고 3,000rpm, 20℃에서 15분간 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 532nm에서 측정하였다. MDA 표준용액은 TMP을 가수분해하여 267nm에서 나온 TBA 반응물질의 양을 MDA 흡광계수로 산출하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 근육조직 내 지질과산화물 함량은 YC군에 비해 NC군에서 유의적으로 증가하였으며, SV군에서는 NC군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

7-2. 적혈구 및 간조직의 Hydrogen peroxide(H ₂ 0 ₂ ) 함량 측정

적혈구 및 간조직의 Hydrogen peroxide(H₂0₂) 함량은 Wolff, S. P. (1994)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 체내 과산화수소(H₂0₂)는 Fe²⁺이온이 Fe³⁺이온으로 산화되는 과정에 관여하며, 산화될 때 xylenol orange를 이용하여 과산화수소(H₂0₂)의 생성 정도를 측정하였다. ddH₂O 600μL에 0.25M H₂SO₄ 100μL, 1 M Sorbitol 100μL, 2.5 mM Ammonium Iron(Ⅱsulfatehexahydrate 100μL, 1 mM Xylenol orange 100μL를 첨가하여 만든 시약 950μL에 효소원인 세포질(cytosol), 미토콘드리아(mitochondria) 및 적혈구 50μL 첨가한 후 560nm(25℃)에서 30분 동안 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 간조직의 미토콘드리아 및 세포질과 적혈구의 과산화수소 함량은 NC군의 경우 YC군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 NC군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 강아지풀 추출물이 항산화 관련 바이오마커에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 노화에 의한 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 글루타티온, 과산화수소, 및 카탈라아제(Catalase) 함량을 측정하여 비교하였다

8-1. 적혈구의 글루타티온(GSH; glutathione)

글루타티온 함량은 산화형 GSH과 환원형 GSH 모두를 포함한다. 각 실험군의 적혈구를 동량의 증류수로 용혈시켜 Fiala 등(1976)의 방법을 수정·보완하여 측정하였다. 0.1M triethanolamine, 0.02 MEDTA(pH 7.4), 0.002M DTT가 포함된 완충용액을 첨가하여 빙냉 상태에서 glass teflon homogenizer(Glascol, 099C K44, USA)로 균질화하였다. 균질액 0.2mL에 증류수 0.3mL와 4% sulfosalicylic acid를 0.5mL를 첨가하여 25,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 0.3mL의 상층액에 0.1M disulfide reagent(5.5'-dithiobis + 0.1 M sodiumphosphate buffer, pH 8.0) 2.7mL를 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시킨 후, 412nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 적혈구의 글루타티온 함량은 NC군의 경우 YC군과 비교하여 감소하는 경향을 나타냈으나, SV군의 경우 NC군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

8-2. 적혈구의 Glutathion reductase(GR) 활성도 측정

GR 활성도는 산화형 글루타티온(GSSG)이 NADPH와 GR의 작용으로 GSH로 환원될 때 NADPH가 감소되는 정도를 Pinto 등(1969)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 1M potassium phosphate buffer(KH₂PO₄:K₂HPO₄, pH 7.4) 0.1 mL에 증류수 780 μL를 첨가한 후 0.1M EDTA 10μL, 10mM GSSG 100μL, 적혈구 10μL, 및 NADPH 10μL를 순서대로 첨가한 후 340nm(25℃)에서 2분 동안 흡광도 감소량을 측정하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 적혈구의 글루타티온 환원효소(GR) 활성도는 NC군의 경우 YC군과 비교하여 유의적으로 감소하였으며, SV군의 경우 NC군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

8-3. 적혈구의 Superoxide discmutase(SOD) 활성도 측정

SOD는 superoxide anion radical(O₂ ^-ㆍ)을 H₂O₂ 및 O₂로 분해시키는 반응을 촉매하는 효소로서 활성도 측정은 Marklund 등(1974)의 방법을 수정ㆍ보완하여 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색 정도를 이용하여 측정하였다. 10mM EDTA를 포함한 50mM Tris-hydroxymethyl-aminomethane buffer(pH 8.5) 1.5mL에 적혈구 0.1mL와 7.2mM pyrogallol 용액 0.1mL를 넣고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 용액 50μL를 첨가하여 반응을 종결시키고 420nm(Beckman 650 spectrophotometer, USA)에서 흡광도 변화를 측정하여 pyrogallol의 자동산화를 방해하는데 필요한 적혈구 hemoglobin에 대한 SOD unit로 계산하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 적혈구 SOD 활성도는 NC군의 경우 YC군에 비해 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 NC군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

8-4. 적혈구 및 간조직의 Catalase(CAT) 활성도 측정

CAT는 H₂O₂를 H₂O 및 O₂로 분해시키는 역할을 하며 활성도 측정은 Abei 등(1974)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 50mM potassium phosphate buffer(KH2PO4:K2HPO4, pH 7.4) 2.89mL와 효소원 mitochondria 분획 및 적혈구 10μL를 25℃에서 5분간 전반응 시킨 후 30mM H₂O₂ 용액 0.1mL를 첨가하고 25℃에서 5분간 240nm(Beckman 650 spectrophotometer, USA)에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성도는 1분당 mitocondrial protein 1mg 및 적혈구 hemoglobin 1g이 분해시킨 H₂O₂의 μmole로 계산하였다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 적혈구 CAT 활성도는 NC군의 경우 YC군과 비교했을 때 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 NC군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 18(우측)에 나타난 바와 같이, 간조직 CAT 활성도는 NC군의 경우 YC군과 비교했을 때 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 NC군에 비해 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

8-5. 간조직의 Glutathion peroxidase(GSH-Px) 활성도 측정

Glutathion peroxidase 활성도는 Paglia 와 Valentine (1967)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였고, GSSG가 GR와 NADPH에 의하여 환원될 때 NADPH의 흡광도 감소를 측정하였다. 0.1M Tris-HCl buffer(pH 7.2) 2.6mL에 30mM glutathione 용액 0.1mL, 6mM NADPH, 및 30mM H₂O₂를 첨가하여 25℃에서 5분간 흡광도 변화를 340nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 18(좌측)에 나타낸 바와 같이, 간조직의 글루타티온 탈수소효소 활성도는 NC군의 경우 YC군과 비교하여 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 NC군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 통계분석

모든 실험 결과는 컴퓨터 통계 프로그램 중의 하나인 SPSS package program versuib 25.0(Statistical Paskage for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago)을 사용하여 산출하였다. YC군과 NC군간의 유의성 검정 및 NC군과 SV군간의 유의성 검정을 위해 Student's t-test를 실시하였다. 모든 결과는 평균±S.E로 표시하였다.

실시예 Ⅲ. 비만 또는 비만 관련 합병증에 대한 강아지풀의 효과

실시예 1. 강아지풀 추출물의 제조

실험에 사용된 강아지풀(setaria viridis)은 경상북도 경산 야산에서 8~9월경에 채취하여 추출에 사용하였다. 강아지풀(전초)을 분쇄한 시료 100g에 70% 에탄올(Ethanol) 1L를 추가하여 60℃에서 3시간 추출을 3회 반복한 후 추출된 액을 여과하여 감압·농축하고 동결건조하였다. 강아지풀 추출물 파우더를 수득하여 냉동 보관한 후 식이제조에 사용하였다. 추출 수율은 6.05%였다.

실시예 2. 강아지풀 추출물에 의한 체중변화 및 지방조직 중량 변화

강아지풀 추출물의 섭취가 미치는 영향을 확인하기 위하여 식이성 비만 유도 마우스 모델을 이용하여, 도 19에 나타낸 모식도와 같이 실험을 설계하여 진행하였다.

2-1. 실험동물

실험동물은 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스(JA BIO, Korea)를 중아바이오에서 구입하여 사용하였다. 1주간 펠렛 형태의 식이를 제공하여 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)에 의해 실험동물을 정상식이군(ND, normal diet), 고지방식이군(HFD, high-fat diet, 20% fat, 1% cholesterol) 및 고지방식이에 강아지풀 추출물 첨가군(SV, HFD + 0.3%(w/w) setaria viridis ethanol extract)으로 나누어 하기 표 3의 실험식이를 제공하며 20주간 사육하였다. 동물 사육실은 항온(24±2℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격(AM 6:00 ~ PM 18:00)의 광주기로 일정한 조건을 유지하였으며, 한 마리씩 개개의 케이지(cage) 안에서 실험식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 제공하였다(ad libitum).

2-2. 실험식이

ND군, HFD군 및 SV군의 실험식이 조성은 하기 표 3과 같다. ND군은 정상식이군으로 AIN-76 semisynthetic diet를 제조하여 급여하였으며, HFD군은 AIN-76 diet에 라드(lard)와 콜레스테롤(cholesterol)을 첨가하여 20% 지방(fat) 및 1% 콜레스테롤(cholesterol)을 포함하는 고지방식이를 제조하여 급여하였다. 강아지풀 추출물 첨가군은 강아지풀 추출물을 고지방식이의 0.3%(w/w) 용량으로 설정하여 식이를 급여하였다.

실시예 3. 강아지풀 추출물에 의한 체중 및 지방조직의 중량 변화 분석

3-1. 체중 변화

비만 마우스 모델에서 강아지풀 추출물의 섭취가 체중 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 2에 나타난 바와 같이, ND군, HFD군 및 SV군으로 분류하여 20주 동안 사육하면서 일주일 간격으로 체중과 식이 섭취량을 측정하였다.

그 결과, 도 20a에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 ND군과 비교하여 체중이 급격하게 증가한 것에 반해 SV군의 경우 실험식이 급여 12주차 부터 HFD군보다 체중이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 20주 동안 체중 증가량(body weight gain)을 하루 동안의 체중 증가량(g/day)으로 환산했을 때도 HFD군에 비해 SV군의 체중 증가가 유의적으로 억제된 것을 확인할 수 있었다.

한편, 도 20b에 나타낸 바와 같이, 1일 평균 식이 섭취량(Food intake) 및 에너지 섭취량(Energy intake)은 SV군과 HFD군 간의 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, 에너지 섭취량에 대한 체중 증가량을 나타내는 식이효율(Food efficiency ratio; FER)은 에너지 밀도가 높은 HFD군의 경우 에너지 밀도가 낮은 ND군과 비교하여 유의적으로 증가한 것에 반해 SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 동일한 에너지를 섭취하는 환경에서 체중을 유의적으로 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.

3-2. 지방조직의 중량

강아지풀 추출물 섭취에 의한 지방조직의 중량 변화를 분석하기 위하여, 20주간 사육한 마우스들을 12시간 동안 절식시키고 isofloran(5mg/kg body weight, Baxter, USA)을 이용하여 마취한 후 간, 부고환 백색지방(Epididymal WAT), 신주위 백색지방(Perirenal WAT), 후복강 백색지방(Retroperitoneum WAT), 장간막 백색지방(Mesentric WAT), 피하 백색지방(Subcutaneous WAT), 내장지방(Visceral WAT), 견갑골간 백색지방(Interscapular WAT), 및 견갑골간 갈색지방(Interscapular BAT)을 적출하였다. 적출한 각 마우스의 지방조직을 식염수(0.9% saline solution) 용액에 여러 번 헹구고 물기를 제거하여 중량을 측정한 후 체중 100g 당 중량으로 나타내어 비교하였다. 나아가, 적출한 조직은 추가적인 분석을 위해 액체 질소에 급냉시켜 분석 시까지 -70℃에 보관하였다.

그 결과, 도 20c에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우, 모든 부위별 지방조직의 중량이 ND군에 비해 유의적으로 증가한 반면, SV군의 경우 HFD군보다 부고환 백색지방(Epididymal WAT), 신주위 백색지방(Perirenal WAT), 장간막 백색지방(Mesentric WAT), 내장지방(Visceral WAT), 및 총 백색지방(Total WAT)의 중량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 강아지풀 추출물이 지방량을 유의적으로 감소시킴으로써 체지방 감소 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 강아지풀 추출물이 간조직 및 지방조직의 형태학적 변화에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물에 의한 조직의 형태학적 변화를 관찰하기 위해, 상기 실시예 3-2에서 적출한 간조직 및 부고환 백색지방조직 일부를 10% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 24시간 고정한 다음, 같은 용액으로 2회 교환하고, 2배수 에탄올(ethanol)로 탈수하여 파라핀(paraffin)에 포매 과정을 거쳐, poly-L-lysine으로 처리된 5μm 두께의 조직 절편을 제작한 다음 hematoxylin eosin(H&E) 염색하여 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다. 또한, 콜라겐과 근섬유를 염색하기 위하여 Massons' trichrome 염색(결합조직: 파란색, 핵: 검붉은색, 세포질: 분홍색)을 시행하여 광학현미경으로 200배 배율로 관찰하였다.

4-1. 지방조직의 형태

부고환 백색지방조직을 관찰한 결과, 도 21a(상단)에 나타낸 바와 같이, ND군에 비해 HFD군의 지방세포 크기가 큰 것으로 관찰되었으며, SV군은 HFD군에 비해 지방세포의 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.

또한, 강아지풀 추출물이 지방조직의 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 Massons' trichrome 염색을 실시한 결과, 도 21a(하단)에 나타낸 바와 같이, HFD군의 지방세포에서 ND군에 비해 섬유화된 결합조직이 많이 축적되어 있는 것이 관찰되었으며, SV군은 고지방식이로 인한 지방조직의 섬유화가 억제된 것으로 나타났다.

4-2. 간조직의 형태

간조직을 관찰한 결과, 도 21b(상단)에 나타낸 바와 같이, 간조직의 간문맥(portal vein)을 중심으로 ND군에 비해 HFD군에서 다실의 지방구(lipid droplet)의 축적이 관찰된 반면, SV군은 HFD군에 비해 지방구 수가 감소된 것으로 나타났다.

또한, 강아지풀 추출물이 간조직의 섬유화에 미치는 영향을 알아보기 위해 Masson's trichrome 염색을 실시한 결과, 도 21b(하단)에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 간문맥 주변으로 결합조직이 많이 축적되어 있는 것이 관찰되었으며, SV군은 고지방식이로 인한 간조직의 섬유화가 억제된 것으로 나타났다.

실시예 5. 강아지풀 추출물이 혈장 지질농도에 미치는 영향 분석

5-1. 주차별 혈장 중성지질 및 총 콜레스테롤 농도

강아지풀 추출물 섭취가 혈장 지질농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 마우스 사육기간 동안 4주마다 12시간 동안 절식시킨 후 마취 없이 꼬리 채혈하여 혈장 중성지질 및 총 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, 혈장 중성지질 농도의 경우, 실험식이 급여 4주차에 ND군의 혈장 중성지질 농도가 HFD군에 비해 유의적으로 낮았으나, 이후 실험기간에서는 그룹간에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 한편, 혈장 총 콜레스테롤 농도의 경우, HFD군의 혈장 총 콜레스테롤 농도는 실험식이 급여 4주 차부터 ND군에 비해 유의적으로 높은 수준을 나타냈으며, SV군의 혈장 총 콜레스테롤 농도는 실험식이 급여 8주 차부터 HFD군에 비해 유의적으로 낮은 수준을 나타냈다.

5-2. 혈장 지질농도

상기 실시예 3-2에서 지방조직 적출 전 복부 하대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 3,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리한 후 혈장을 수집하였고 시료 분석 시까지 -70℃에 보관하였다. 보관한 혈장으로부터 혈장 중성지질(Triglyceride), 총 콜레스테롤(Total cholesterol), 유리지방산(Free fatty acid), apolipoprotein A-1(Apo A-1) 및 apolipoprotein B(Apo B) 농도를 비교하였다. 이 때, 혈장 중성지질, 총 콜레스테롤 농도는 아산제약(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)의 효소 kit을 사용하여 측정하였고, 유리지방산 함량은 효소법을 이용한 발색법 원리를 이용한 유리지방산 측정용 시액(Non-Esterified fatty acid, NEFA kit, 신양화학)을 사용하여 측정하였으며, 혈장 apolipoprotein A-1(Apo A-1) 및 apolipoprotein B(Apo B) 농도는 Apo A-1 및 Apo B 측정용 kit(日東紡績株式會社, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, SV군의 경우 HFD군에 비해 혈장 유리지방산, 중성지질 및 Apo B의 농도를 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과로부터 강아지풀 추출물이 혈장 지질성분을 감소시킴으로써 이상지질 개선 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실시예 6. 강아지풀 추출물이 간조직 중량 및 지질농도에 미치는 영향 분석

6-1. 간조직의 중량

상기 실시예 3-2의 방법으로 간조직의 중량을 측정한 후 체중 100g 당 중량으로 나타내어 비교한 결과, 도 23a에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 ND군과 비교하여 간조직의 중량이 급격하게 증가된 비대 현상이 관찰된 반면, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

6-2. 간조직 지질함량

간조직의 지질함량을 측정하기 위하여, 상기 실시예 3-2에서 냉동 보관한 간조직의 지질을 Folch 등(1957)의 방법을 따라 추출한 다음, 추출액을 37℃에서 질소가스로 휘발시켜 아이소프로판올(isopropanol)로 희석하였다. 정량을 위해 효소 시약에 유화제로 3mM 콜산(cholic acid)와 발색 시 일어나는 탁도를 제거하기 위해 0.5% Triton X-100을 혼합하여 지질 성분을 추출한 후 혈장 중성지질, 콜레스테롤 및 유리지방산 정량법과 동일하게 정량하였다.

그 결과, 도 23a에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 ND군에 비해 간조직 지질함량이 유의적으로 증가한 반면, SV군의 경우에는 HFD군에 비해 간조직 지질함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 결과로부터 강아지풀 추출물이 지방간 개선 효과를 가짐을 알 수 있었다.

6-3. 간조직의 지질대사 효소 활성도

간조직 내 효소원 분리를 위해 Hulcher 등(1973)이 실시한 분리 방법을 일부 수정하여 적용하였다. 상기 실시예 3-2에서 냉동 보관한 간조직 0.5g을 0.1M triethanolamine, 0.02M ethylenediamine tetracetate(EDTA, pH 7.4), 0.002M dithiothreitol(DTT)가 포함된 완충용액을 첨가하여 빙냉 상태에서 glass teflon homogenizer(Glascol, 099C K44, USA)로 균질화한 후, 3,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 상층액만 다시 13,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하였다. 이 중 상층액과 분리된 하층의 침전물은 mitochondria 분획으로 사용하였으며, 상층액은 32,500rpm, 4℃에서 1시간 동안 초원심분리기(Beckman, Optima TLX-120, USA)를 이용하여 상층액의 세포질(cytosol) 분획을 수득 하였다. microsome 분획은 상층액의 세포질 분획과 분리된 펠렛에 동일 완충용액을 첨가하여 33,000rpm, 4℃에서 40분간 다시 초 원심 분리한 후 펠렛을 1ml 완충용액에 녹여 -70℃에 보관하였다가 분석 및 단백질 정량에 사용하였다.

6-3-1. Fatty acid synthase(FAS) 활성도 측정

FAS 활성도는 Carl 등(1975)이 실시한 방법을 수정 · 보완하여 측정하였다. 625mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 200μL, 20mM EDTA 50μL, 20mM β50μL, 165μM acetyl-CoA 200μL, 500μM malonyl-CoA 200μL 및 500μM NADPH 200μL를 첨가하고 세포질 분획(50~100μg) 100μL를 섞어 30℃에서 2분간 반응시킨 후 흡광도 감소량을 측정하였다.

그 결과, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 간조직의 중성지질 합성 관련 효소인 FAS의 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

6-3-2. Malic enzyme(ME) 활성도 측정

ME(EC 1.1.1.40) 활성도 측정은 Ochoa(1955)의 방법에 준하여 측정하였다. 즉, 0.4M triethanolamine(pH 7.4) 500μL, 30mM malic acid 50μL, 0.12M MgCl₂ 10μL, 3.4mM NADP+ 200μL 및 효소원인 cytosol 150μL를 첨가한 후 26℃에서 1분 간 생성된 NADPH의 흡광도 변화를 340nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 간조직의 중성지질 합성 관련 효소인 ME의 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

6-3-3. Phosphatidate phosphohydrolase(PAP) 활성도 측정

Phosphatidate phosphohydrolase(PAP) 활성 측정은 Walton 등(1985)의 방법에 준하여 측정하였다. 구체적으로, 0.05 M Tris-HCl(pH 7.0), 1.25mM Na₂-EDTA, 1mM MgCl₂의 첨가와 무첨가 반응액 50uL에 0.9% NaCl 용액에 용해시켜 1 mM phosphatidate 및 phosphatidylcholine을 함유한 기질 50uL를 가한 다음 microsome 분획 0.1mL을 가하여 반응을 개시하였다. 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1.8M H₂SO₄ 0.1mL를 가하여 반응을 정지시킨 후, 0.13% sodium dodecyl sulfate 용액 0.1mL와 1.25% ascrobic acid, 0.32% ammonium molybdate를 각각 0.25mL 가하고, 45℃에서 20분간 반응·발색시킨 후 820nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 간조직의 중성지질 합성 관련 효소인 PAP의 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

6-3-4. Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 활성도 측정

G6PD 활성도는 NADP+가 NADPH로 환원되는 정도를 측정하였다(Pitkanen, 1997). 3.3mM MgCl₂를 함유하는 55mM Tris-HCl(pH 7.8) 900μL에 6mM NADP+ 40μL, 0.1M glucose-6-phosphate 40μL, 그리고 세포질 분획 20μL를 첨가한 후 340nm(25℃)에서 90초 동안 NADPH의 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 23b에 나타낸 바와 같이, 간조직의 중성지질 합성 관련 효소인 G6PD의 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 강아지풀 추출물이 항산화 관련 바이오마커에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 고지방식이에 의한 산화적 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여 지질과산화물, 글루타티온, 및 과산화수소 함량을 측정하여 비교하였다.

7-1. 적혈구 및 간조직의 지질과산화물(TBARS; Thiobarbituricacid reactive substance)

적혈구의 지질과산화물 함량 측정은 Tarladgis 등(1964)의 방법을 이용하였으며, 적혈구는 McCord와 Fridovich(1969)의 방법에 준하여 분리하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5에서 헤파린 처리된 혈액을 3,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 혈장과 buffy coat를 완전히 제거한 후 0.9% 생리식염수로 세 번 세척하여 적혈구를 수득하였다. 수득한 적혈구 50uL에 5% triochloroacetic acid(TCA) 3mL와 0.06M thiobarbituric acid(TBA) 1mL를 첨가하여 80℃에서 90분 동안 반응시켰다. 이것을 실온으로 냉각시켜 2,000rpm, 25℃에서 15분간 원심 분리한 후 상층액을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다. Lipid Peroxidation(MDA) 표준용액은 TMP 1mmol을 0.01N HCl 용액 100mL에 녹여 50℃에서 60분간 반응시킨 후 실온으로 냉각시켜 MDA로 TMP를 가수분해 시킨 후, 가수분해된 TMP 용액 1mL을 0.01M Na₃PO₄(pH 7.0) buffer 100mL에 희석시켜 MDA 표준용액(1×10^-4M)을 제조하였다. 267nm에서 MDA 표준용액의 흡수 스펙트럼을 얻어 extinction coefficient로부터 정확한 농도를 계산하여 보정한 후 TBA-MDA chromopore 표준곡선을 얻고, 이 곡선으로부터 TBA 반응물질의 양을 MDA 흡광계수로 산출하였다.

나아가, 간조직 지질과산화물 함량은 Ohkawa 등(1979)의 방법을 이용하여 상기 실시예 3-2에서 냉동 보관한 간조직 0.5g을 0.1M triethanolamine, 0.02M EDTA(pH 7.4), 0.002M DTT가 포함된 완충용액에 첨가하여 빙냉 상태에서 glass teflon homogenizer(Glascol, 099C K44, USA)로 균질화하였다. 균질액 0.2mL, 8.1% sodium dodecyl sulfate(SDS) 용액 0.2mL 및 증류수 0.6mL를 섞어 실온에서 5분간 방치한 후 20% acetate(pH 3.5) buffer 1.5mL과 0.8% TBA 1.5mL를 첨가하여 95℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 시료를 실온으로 냉각시켜 증류수 1mL와 n-butanol:pyridine(15:1) 용액 5mL를 첨가하였고 3,000rpm, 20℃에서 15분간 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 532nm에서 측정하였다. MDA 표준용액은 TMP을 가수분해하여 267nm에서 나온 TBA 반응물질의 양을 MDA 흡광계수로 산출하였다.

그 결과, 도 24a에 나타낸 바와 같이, 적혈구와 간조직의 지질과산화물 수준은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

7-2. 혈장 및 간조직의 글루타티온(GSH; glutathione)

글루타티온 함량은 산화형 GSH과 환원형 GSH 모두를 포함한다. 간조직 글루타티온 함량은 Fiala 등(1976)의 방법을 수정·보완하여 측정하였다. 상기 실시예 3-2에서 보관한 간조직 0.5g을 0.1M triethanolamine, 0.02M EDTA(pH 7.4), 0.002M DTT가 포함된 완충용액을 첨가하여 빙냉 상태에서 glass teflon homogenizer(Glascol, 099C K44, USA)로 균질화하였다. 균질액 0.2mL에 증류수 0.3mL와 4% sulfosalicylic acid 0.5mL를 첨가하여 25,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 0.3mL의 상층액에 0.1M disulfide reagent(5.5'-dithiobis + 0.1 M sodiumphosphate buffer, pH 8.0) 2.7mL를 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응시킨 후, 412nm에서 흡광도를 측정하였다.

나아가, 혈장 글루타티온 함량은 상기 실시예 7-1에서 수득한 적혈구를 동량의 증류수로 용혈시켜 측정하였다.

그 결과, 도 24b에 나타낸 바와 같이, 적혈구 및 간조직의 글루타티온 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

7-3. 적혈구 및 간조직의 Glutathion reductase (GR) 활성도 측정

글루타티온 환원효소(Glutathion reductase) 활성도는 GSSG가 NADPH와 GR의 작용으로 GSH로 환원될 때 NADPH가 감소되는 정도를 Pinto 등(1969)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 1M potassium phosphate buffer(KH₂PO₄:K₂HPO₄, pH 7.4) 0.1mL에 증류수 780μL를 첨가한 후 0.1M EDTA 10μL, 10mM GSSG 100μL, 효소원인 세포질(cytosol) 및 적혈구 10μL, 및 NADPH 10μL를 순서대로 첨가한 후 340nm(25℃)에서 2분 동안 흡광도 감소량을 측정하였다.

그 결과, 도 24b에 나타낸 바와 같이, 적혈구의 글루타티온 환원효소 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 증가하는 경향을 나타냈으며, 간조직의 글루타티온 환원효소 함량은 SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

7-4. 적혈구 및 간조직의 Glutathion peroxidase(GPx) 활성도 측정

글루타티온 탈수소효소(Glutathion peroxidase) 활성도는 Paglia와 Valentine(1967)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였고, 산화형 글루타티온(GSSG)이 glutathione reductase와 NADPH에 의하여 환원될 때 NADPH의 흡광도 감소를 측정하였다. 구체적으로, 0.1M Tris-HCl buffer(pH 7.2) 2.6mL에 30mM glutathione 용액 0.1mL, 6mM NADPH, 및 30mM H₂O₂를 첨가하여 25℃에서 5분 동안 흡광도 변화를 340nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 24b에 나타낸 바와 같이, 적혈구의 글루타티온 탈수소효소 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 증가하는 경향을 나타냈고, 간조직의 글루타티온 탈수소효소 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 감소하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

7-5. 적혈구 및 간조직의 Hydrogen peroxide(H ₂ 0 ₂ ) 함량 측정

Hydrogen peroxide(H₂0₂) 함량은 Wolff, S. P.(1994)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 체내 과산화수소(H₂0₂)는 Fe²⁺이온이 Fe³⁺이온으로 산화되는 과정에 관여하며, 산화될 때 xylenol orange를 이용하여 과산화수소(H₂0₂)의 생성 정도를 측정하였다. ddH₂O 600μL에 0.25M H₂SO₄ 100μL, 1M Sorbitol 100μL, 2.5mM Ammonium Iron(Ⅱ)sulfatehexahydrate 100μL, 1mM Xylenol orange 100μL를 첨가하여 만든 시약 950μL에 효소원인 세포질(cytosol), 미토콘드리아(mitochondria) 및 적혈구 50μL를 첨가한 후 560nm(25℃)에서 30분 동안 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 24c에 나타낸 바와 같이, 간조직의 미토콘드리아와 세포질 및 적혈구의 과산화수소 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 강아지풀 추출물이 간조직 독성에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 간세포 손상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 간세포 손상과 밀접한 관련이 있는 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase)와 GPT(glutamic pyruvic transaminase)를 측정하여 비교하였다. 구체적으로, GOT와 GPT의 활성도는 상기 실시예 5-2에서 수집한 혈액에서 혈장 GOT 및 GPT를 아산제약(Asan Pharm Co., Seoul, Korea)의 효소 kit을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가된 혈장 GOT 및 GPT 함량을 나타냈으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 혈장 GOT 및 GPT함량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 강아지풀 추출물이 간독성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 9. 강아지풀 추출물이 인슐린 저항성에 미치는 영향 분석

강아지풀 추출물이 인슐린 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 혈장 및 간조직 내 당신생 관련 효소 활성도를 측정하여 비교하였다.

9-1. 혈장 glucose 함량 측정

혈장 glucose 함량 측정을 위해 glucose 측정용 시액(Asan kit, Korea)을 사용하였다. Glucose는 Glucose oxidase의 작용에 의해 gluconic acid와 hydrogen peroxide가 되고 hydrogen peroxide는 peroxidase를 생성하고 phenol과 4-aminoantipyrine을 산화적으로 축합시켜 키논형 적색 색소를 생성한다. 이러한 원리를 이용하여 혈장 200μL에 효소시액 3mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 500nm(VERSAmax, Moleculardevices Co, USA)에서 생성된 키논형 적색 색소의 흡광도를 측정하여 glucose 표준용액과 비교하여 정량하였다.

그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 혈장 glucose 함량은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 감소하는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

9-2. 혈장 insulin 농도 측정

혈장 insulin은 Insulin ELISA kit(Shibayagi, Japan)를 사용하여 측정하였다. 또한, 인슐린 감수성 지표인 HOMA-IR(Homeostasis model assessment of insulin resistance)은 다음과 같은 식으로 산출하였다: [fasting insulin concentration(mU/L)] × [fasting glucose concentration(mg/dL) × 0.05551] / 22.5.

그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 혈중 insulin 함량 및 HOMA-IR은 HFD군의 경우 ND군과 비교하여 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

9-3. 간조직 Glucose-6-phosphatase(G6Pase) 활성도 측정

G6Pase 활성도 측정은 Alegre 등(1988)의 방법을 수정ㆍ적용하였다. 131.6mM Hepes(pH 6.5) 765μL에 18mM EDTA(pH 6.5) 100μL 및 265mM glucose-6-phosphate glucose dehydrogenase를 각각 0.6IU/mL와 6IU/mL가 되도록 첨가하여 37℃에서 4분간 전반응 시켰다. 여기에 microsome 분획(15μg) 5μL를 가하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 간조직의 당신생 합성 관련 효소인 G6Pase의 활성도는 SV군의 경우 HFD군에 비해 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.

9-4. 간조직 Phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) 활성도 측정

PEPCK 활성도는 Bentle과 Lardy(1976)의 방법을 수정ㆍ보완하여 측정하였다. 반응액으로는 76.92mM Hepes-NaOH(pH 6.5) 650μL에 10mM DTT(dithiothreitol) 100μL, 500mM NaHCO₃ 100μL, 10mM MnCl₂ 100μL, 25mM NADH 10μL를 첨가하고 L-malate dehydrogenase, IDP(inosine-5'-diphosphate) 및 PEP(phosphoenolpyruvate)를 각각 7.2 unit, 1mM 및 2mM 농도가 되도록 첨가한 후 효소원인 세포질 분획 10μL를 가하여 25℃, 340nm에서 2분 동안 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 간조직의 당신생 합성 관련 효소인 PEPCK의 활성도는 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

9-5. 혈장 GIP 함량 측정

혈장 GIP 함량 측정은 Multiplex detection kit(Bio-Rad, USA) 및 Luminex 200 Labmap system(Bio-Rad, USA)을 사용하였으며 데이터 분석은 Bio-Plex manager software version 5.0(Bio-rad)를 이용하여 수행하였다.

그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 혈장 GIP 함량은 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

9-6. 혈장 Leptin 함량 측정

혈장 Leptin 함량 측정은 Multiplex detection kit(Bio-Rad, USA) 및 Luminex 200 Labmap system(Bio-Rad, USA)을 사용하였으며 데이터 분석은 Bio-Plex manager software version 5.0(Bio-rad)를 이용하여 수행하였다.

그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 혈장 Leptin 함량은 HFD군의 경우 ND군에 비해 유의적으로 증가하였으나, SV군의 경우 HFD군에 비해 감소하는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 통계분석

모든 실험 결과는 컴퓨터 통계 프로그램 중의 하나인 SPSS package program versuib 25.0(Statistical Paskage for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago)을 사용하여 산출하였다. ND군과 HFD군간의 유의성 검정 및 HFD군과 SV군간의 유의성 검정을 위해 Student's t-test를 실시하였으며, 모든 결과는 평균±S.E로 표시하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

1. 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 강아지풀 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 근감소증은 노화성 근감소증 또는 비만성 근감소증인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
   (a) 근육량 증가;
   (b) 근육량 감소 억제;
   (c) 근력 증가;
   (d) 근육조직 지질함량 증가 억제; 및
   (e) 근육조직 섬유화 억제.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 더 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
   (a) 체중 및 체지방 증가 억제;
   (b) 간조직 또는 지방조직의 섬유화 억제;
   (c) 혈장 지질농도 증가 억제;
   (d) 간조직 지질함량 증가 억제;
   (e) 혈장 간독성 지표 증가 억제;
   (f) 지질과산화물 증가 억제;
   (g) 항산화 대사 개선; 및
   (h) 혈당 증가 억제 및 인슐린 저항성 개선.
   
7. 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
   상기 근력 약화 관련 질환은 근감소증, 근위축증, 근육 퇴행 위축(muscle dystrophy) 및 심위축증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 강아지풀 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
   
9. 삭제
10. 제7항에 있어서,
    상기 근감소증은 노화성 근감소증 또는 비만성 근감소증인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
    
11. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
    (a) 근육량 증가;
    (b) 근육량 감소 억제;
    (c) 근력 증가;
    (d) 근육조직 지질함량 증가 억제; 및
    (e) 근육조직 섬유화 억제.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 더 만족하는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물:
    (a) 체중 및 체지방 증가 억제;
    (b) 간조직 또는 지방조직의 섬유화 억제;
    (c) 혈장 지질농도 증가 억제;
    (d) 간조직 지질함량 증가 억제;
    (e) 혈장 간독성 지표 증가 억제;
    (f) 지질과산화물 증가 억제;
    (g) 항산화 대사 개선; 및
    (h) 혈당 증가 억제 및 인슐린 저항성 개선.
    
13. 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 조성물.
    
14. 강아지풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 근력 강화용 사료 조성물.