KR20240081878A

KR20240081878A - 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20240081878A
Application number: KR1020220165578A
Authority: KR
Inventors: 남주옥; 이은비; 채종범
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2024-06-10

Abstract

본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 포함하는 비만 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명자들은 산사나무 뿌리 추출물이 세포 독성 없이 지방 전구 세포 분화를 효과적으로 억제하고, 지방세포 내 지질 축적을 감소시킬 뿐만 아니라, 지방 세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제함을 확인하였고, 고지방 식이 마우스에서 지방 생성 및 지질 축적을 억제함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 산사나무 뿌리는 비만 예방, 치료, 또는 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition comprising Crataegus pinnatifida root extract as an active ingredient for Preventing or Treating obesity}

본 발명은 산사나무(Crataegus pinnatifida) 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

비만은 일반적으로 체내에 지방조직이 과다한 상태인 것을 의미하며, 음식물로 섭취한 에너지가 신체활동 등으로 소비한 에너지와 균형을 이루지 못하여 잉여의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상이다. 비만은 유전적인 요인, 불규칙한 식습관이나 운동부족 또는 서구화되는 식생활에 의한 환경적인 영향, 우울감, 지루감, 과다한 스트레스에 의한 심리적인 영향, 갑상선이나 부신피질 호르몬 변화에 의한 병적인 요인 등 매우 다양한 원인에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다. 최근에는 경제성장과 생활방식의 변화에 따라 식습관에도 많은 변화가 생겨 바쁜 현대인들은 패스트푸드 등의 고열량 식이와 적은 운동량으로 인하여 과체중 및 비만이 증가하고 있는 추세이다.

또한, 비만은 지방세포의 비대에 의해 유발되므로, 지방세포 분화의 억제는 비만 치료에 도움이 될 수 있다. 종래에 지방세포 분화 및 지질 축적의 억제와 관련된 항비만 연구가 보고된 바 있으며, 이 때 3T3-L1 마우스 섬유아세포는 지방 전구세포의 분화를 위한 잘 특성화된 모델로 일반적으로 시험관 내 연구에 사용된다.

비만은 식이요법, 규칙적인 운동과 더불어 행동요법과 같은 생활습관의 개선, 및 식욕 억제제와 지방 흡수 억제제와 같은 약물을 통해 치료할 수 있다. 비만은 만성 질환이기 때문에 약물치료를 시도하는 경우 장기간의 사용이 필요하며, 현재 국내에서 3개월 이상 장기간 사용이 허가된 제품으로는 식욕억제제인 시부트라민(sibutramine)과 지방분해효소 억제제인 올리스타트(orlistat)가 있다. 그러나 이러한 비만 치료 약물들은 대부분 중추신경계에 작용하여 식욕을 조절하는 향정신성의약품들이므로 두통 및 구토 등의 부작용을 동반하며 남용 우려 등의 문제점이 있다. 따라서 상기 시판중인 항비만제의 부작용을 해결할 수 있는 안정성이 높고 항비만 효과가 우수한 소재를 개발하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

산사나무(Crataegus pinnatifida)는 장미목 장미과에 해당하는 낙엽 교목으로 국내에서는 전국 산지에서 자생하며 열매의 경우 예로부터 식용 및 약용으로 즐겨 사용되었으나, 산사나무 뿌리에 대해서는 생리활성 효과가 많이 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 산사나무 뿌리 추출물의 항비만 활성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

공개특허 제10-2022-0076653호

이에 본 발명자들은 종래 항비만제의 문제점을 해결할 수 있는 안정성이 높고 항비만 효과가 우수한 비만 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 산사나무 뿌리 추출물이 뛰어난 항비만 효과를 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이며, 또 다른 목적은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만의 예방, 개선, 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 비만의 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 비만의 예방, 개선, 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 산사나무 뿌리 추출물 또는 이를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 산사나무 뿌리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 디클로로메탄(dichloromethane), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 산사나무 뿌리 추출물은 하기 성질중 하나 이상을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

i) 지방세포의 분화를 억제;

ii) 세포 내 지질 축적을 감소; 및

iii) 지방 세포 분화중 유도되는 산화 스트레스를 감소.

본 발명의 일실시예에서, 상기 산사나무 뿌리 추출물은 지방세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 전사인자는 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ), 스테롤 조절인자 결합 단백질-1(SREBP-1) 또는 CCAAT-인핸서 결합 단백질 알파(C/EBPα)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 산사나무 뿌리 추출물이 세포 독성 없이 지방 전구 세포 분화를 효과적으로 억제하고, 지방세포 내 지질 축적을 감소시킬 뿐만 아니라, 지방 세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자의 발현을 억제함을 확인하였고, 고지방 식이 마우스에서 지방 생성의 억제를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 산사나무 뿌리 추출물은 비만 예방, 치료, 또는 개선용 약학적 조성물 및 건강기능식품 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 3T3-L1 지방 전구 세포를 595 nm 흡광도에서 MTT 분석으로 생존력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. CON은 CRE와 동일한 양의 DMSO를 처리하였다.
도 1b는 3T3-L1 지방 전구 세포에서 Oil Red O 용액 염색한 후 관찰한 이미지(왼쪽), 및 Oil Red O 용액의 함량을 450 nm 흡광도로 측정한 결과(오른쪽, *p <0.05)를 나타낸 것이다.
도 1c는 3T3-L1 지방 전구 세포내 트리글리세라이드 함량을 570 nm 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 것이다. *p <0.05
도 1d는 3T3-L1 지방 전구 세포에서 Adiponectin, C/EBPα, PPARγ 및 SREBP-1의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다. *p <0.05
도 1e는 3T3-L1 지방 전구 세포에서 C/EBPα 및 PPARγ의 단백질 발현 수준을 측정한 결과이다. *p<0.05
도 2a는 3T3-L1 지방 전구 세포내 활성 산소를 형광 현미경을 통해 관찰한 이미지이다.
도 2b는 3T3-L1 지방 전구 세포내 활성 산소를 유세포 분석기를 사용하여 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 각 마우스 그룹의 사료 섭취량 비율을 나타낸 것이다. **p <0.05
도 3b는 각 그룹별 마우스의 체중을 일주일 간격으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. *p <0.05
도 3c는 각 그룹별 지방 조직 및 장기의 무게를 측정한 결과(상단, *p <0.05 및 **p <0.01) 이에 따른 체중대비 비만도를 측정한 결과(하단)를 나타낸 것이다.
도 3d는 각 마우스 그룹의 TG 함량(좌측), 총 콜레스테롤 함량(우측)을 측정한 결과를 나타낸 것이다. *p <0.05
도 3e는 각 마우스 그룹의 (a) 복부 장기, (b) iWAT, (c) eWAT의 대표 이미지를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 안정성이 높고 항비만 효과가 우수한 비만 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 산사나무 뿌리 추출물이 뛰어난 항비만 효과를 가지는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 “산사나무(Crataegus pinnatifida for. pinnatifida)”는 장미과 산사나무속에 속하는 낙엽성 소교목으로 국내에서는 전국 산지에서 자생하고 산사나무의 잎과 꽃, 열매, 껍질, 뿌리는 예로부터 식용 또는 약용으로 사용되었다.

본 발명에서 “산사나무 뿌리 추출물”은 상기 산사나무 뿌리의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명의 상기 산사나무 뿌리 추출물에 있어서, 상기 산사나무 뿌리를 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 산사나무 뿌리를 추출하는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예를 들어, 물, 탄소수 1 내지 6개의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출될 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 6개의 유기용매는 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 디클로로메탄(dichloromethane), 시클로헥산(cyclohexane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 용매는 50% 내지 100%, 55% 내지 100%, 60% 내지 100%, 65% 내지 100%, 70% 내지 100%, 75% 내지 100%, 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100% 또는 100% 메탄올일 수 있으며 바람하게는 100% 메탄올 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출방법은 상기 용매를 사용하여 냉침, 온침, 가열 등 통상의 추출방법이 사용 가능하다.

본 발명의 상기 산사나무 뿌리 추출물은 지방세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 전사인자는 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ), 스테롤 조절인자 결합 단백질-1(SREBP-1) 또는 CCAAT-인핸서 결합 단백질 알파(C/EBPα)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 산사나무 뿌리 추출물은 지방세포의 분화를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 산사나무 뿌리 추출물은 세포 내 지질 축적을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 산사나무 뿌리 추출물이 세포 독성을 야기하지 않고 3T3-L1 지방 전구 세포 분화를 억제하여 지방 함량을 감소시킴을 확인하였다 (실시예 1 참조).

본 발명의 용어 "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO₂, ONOO^-와 같은 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포 들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다.

본 발명의 다른 일실시예에서는, 산사나무 뿌리 추출물이 3T3-L1 지방 전구 세포에서 활성산소의 함량을 감소시킴을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 산사나무 뿌리 추출물이 HFD 유도 비만 마우스의 지방 생성을 억제함을 확인하였다 (실시예 3 참조).

본 발명의 용어 "비만(obesity)"은, 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 고혈압, 당뇨, 및 이상지질혈증 등을 동반하는 대사 증후군을 포함하는 관련 합병증을 유발할 수 있다. 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다.

본 발명의 용어, "백색 지방세포"는 중성 지방으로 대량의 지방 에너지를 체내에 축적하는 기능을 갖는 세포로서, 임신말기, 유아기, 사춘기에 집중하여 증식하며, 15배까지 부풀어 올라 지방 비대화 현상의 원인이 되기도 하며, 일반적으로 "지방세포"라 함은 "백색 지방세포"를 의미한다.

본 발명의 용어, "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체 발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명의 조성물 내의 상기 산사나무 뿌리 추출물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃)이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃),질소가스(N₂),에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

아울러, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 산사나무 뿌리 추출물은 비만의 예방 또는 개선을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.

본 발명의 산사나무 뿌리 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 산사나무 뿌리 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 산사나무 뿌리 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 산사나무 뿌리 추출물은 중성지방의 축적을 억제하며, 셀룰라이트 감소 효과를 지니는 화장료 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 산사나무 뿌리 추출물을 첨가물로 사용할 경우, 산사나무 뿌리 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 화장료 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 비만의 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용 하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.

본 발명의 조성물을 의약외품 조성물로 사용할 경우, 상기 산사나무 뿌리 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 본 발명의 의약외품 조성물은 소독청결제, 치약, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제, 비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.

또한, 본 발명은 산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 시험관 내(in vitro) 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 산사나무 뿌리 추출물의 준비

산사나무(Crataegus pinnatifida) 뿌리 추출물은 한국 식물 추출물 은행 (충청북도 오창읍)에서 분양받았다. 추출물은 100% 메탄올로 추출되었으며, 추출 후 추출액을 여과하고 진공 증발 건조 시켰다. 시험관 실험에 사용하기 위하여 획득한 추출물을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, 이하 ‘DMSO’)에 50mg/ml로 용해시킨 후 희석하여 사용하였다. 전임상실험의 경우 획득한 추출물을 멸균수에 용해시켜 사용하였다.

실험예 2. 동물 및 산사나무 뿌리 추출물 ( CRE ) 투여

6 주령 수컷 C57BL/6 마우스는 효창 사이언스 (대한민국, 대구)에서 구입하였다. 마우스는 순응을 위해 25-30 ℃에서 12 시간의 명암 주기에서 2 주 동안 우리에서 사육하였다. 2 주일의 순응 후, 마우스를 식이에 따라 무작위로 5 개의 그룹 (n=7)으로 나누었다; (1) 정상적인 식단 (ND); (2) 고지방 식단(HFD); (3) HFD에 CRE를 1.25 mg/kg/일로 투여; (4) HFD에 CRE를 2.5 mg/kg/일로 투여 및 (5) HFD에 CRE를 5 mg/kg/일로 투여. 음식과 물은 12주동안 무제한으로 제공하였다. 체중과 식이섭취는 2일에 한 번 측정되었고, 추출물은 경구투여로 2일에 한 번 투여하였다. 동물 실험 마지막 날 장기와 혈액을 채취하여 분석에 이용하였다. 동물 실험은 대한민국 대구의 경북대학교 동물병원 동물보호위원회의 승인을 받았다 (승인번호 : KNU 2022-0125).

실험예 3. 항산화 분석

3T3-L1 지방 전구 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였으며 8일 분화 후 DCFDA/H2DCFDA-Celluar ROS Assay Kit (Abcam, US)를 이용해 형광 현미경 및 유세포 분석기를 사용하여 공급업체의 프로토콜을 참고하여 분석하였다.

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성 능력 측정은 CRE를 DMSO로 2, 4, 6, 8, 10μg/ml로 희석한 후 볼텍싱 하고, DPPH 10.0039g을 에탄올에 희석하여 DPPH 시약을 준비하였다. 이후 아스코르브산(Ascorbic acid)를 표준물질로 이용하고 시약에 볼텍싱한 CRE 또는 아스코르브산을 상기 농도에 맞게 주입한 후 30분 간 암반응 시켰다. 그 후, 517nm에서 흡광도를 3회 반복으로 측정하였다.

ABTS radical decolorization (2,2’-azinobis-3-ehtlbezothiazoline-6-sulfonic acid) 측정은 CRE를 DMSO로 2, 4, 6, 8, 10μg/ml로 희석한 후 볼텍싱 하고, ABTS에 과황산칼륨(potassium persulfate)를 첨가하여 증류수에 용해시켜 실온에 12 시간 방치하여 ABTS 시약을 준비하였다. 이 후 아스코르브산을 표준 물질로 이용하여 볼텍싱한 CRE 또는 아스코르브산을 상기 농도에 맞게 ABTS 시약에 주입한 후 30분간 암반응 시켰다. 그 후 734nm에서 흡광도를 3회 반복으로 측정하였다.

실험예 4. 혈액 생화학 분석

동물실험 12주 마지막 날 희생하였으며, 휙득한 혈액은 3,500rpm에서 15분간 원심분리하여 혈장을 분리해내었다. 혈장 내 AST (Aspartate aminotrasnferase), ALT (Alanine aminotransferase), ALP (Alkaline phosphatase), TP (Total protein), ALB (Albumin), T-BIL (total bilirubin), D-BIL(Direct bilirubin), BUN (Blood Urea Nitrogen), CREA (creatinine), TG (트리글리세라이드) 및 CHO (콜레스테롤) 수준은 Olympus AU 400 (Olympus Optical, Tokyo, Japan) 분석기를 사용하여 제조업체의 절차에 따라 측정하였다.

실험예 5. 지방 세포 분화

3T3-L1 지방 전구 세포는 10% Bovine calf serum(BCS)가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지되었다. 3T3-L1 지방 전구 세포를 100파이 실험접시에 컨플루언스가 80%가 되면 6-웰 플레이트에 시딩하고 2일 동안 컨플루언스에 도달하도록 성장시켰다. 컨플루언스 후 2 일째에, 지방 세포 분화를 시작하기 위해, 배지를 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX), 0.25 mM 덱사메타손 (DEX), 1 μg/mL 인슐린, 0.125 mM 인도메타신을 함유하는 분화 배지-I(Differentiaion medium I, DMI)로 변경하였다. 그 후, 분화 배지-II(Differentiaion medium II, DMII)로 6일간 지방세포의 성숙을 유도하여 총 8일간 분화 하였다.

실험예 6. 오일 레드 O 염색

3T3-L1 지방 전구 세포를 CRE의 존재 또는 부재 하에 분화하도록 유도하였다. 분화 8일 차의 지방 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 파라포름알데히드로 고정시킨 뒤 여과된 0.3% 오일 레드 O 용액으로 30분간 상온에서 염색하였다. 이어서, 반응 생성물을 이소프로필알코올에 용해시켰다. 반응의 흡광도는 450 nm에서 측정되었다.

실험예 7. 트리글리세라이드 (TG) 분석

3T3-L1 지방 전구 세포를 CRE의 존재 또는 부재 하에 분화하도록 유도하였다. 분화 8일 차의 지방 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하였고, 세포를 5% NP-40 용해 완충액에 용해시켰다. 이 후 Triglyceride assay kit를 사용하여 제조업체의 절차에 따라 측정하였다.

실험예 8. 세포 생존율 분석

3T3-L1 지방 전구 세포를 96-웰 플레이트에 시딩 하였다. 배양한 후, 세포를 48시간 동안 CRE 또는 DMSO로 처리하였다. MTT(3-(4,5)-디메틸티아조-2-일-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 용액을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션 하였다. 반응 생성물을 이소프로필알코올에 용해시켰다. 반응의 흡광도는 595 nm에서 측정되었다.

실험예 9. 웨스턴 블롯 분석

분화 8일차의 3T3-L1 지방 전구 세포를 포스파타제 억제제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 방사선 면역 침전 분석(RIPA) 용해 완충액으로 용해시켰다. 총 단백질(30 ㎍) 함량을 전기 영동을 통해 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 1시간 동안 PBS 중의 5% 탈지유로 차단하고, 관련 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 막을 TBS-T 완충액으로 10분동안 3회 세척하였다. 이어서 막을 HRP-접합된 이차 항체와 함께 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드를 ECL을 사용하여 가시화하고 퓨전 솔로 검출기(Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)에서 검출하였고, β-액틴에 대하여 표준화함으로써 평가되었다.

실험예 10. 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT- PCR )

3T3-L1 지방 전구 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하여 CRE의 존재 여부에 따라 그룹을 나누어 분화하였다. 분화 8일차의 3T3-L1 세포를 PBS로 세척한 후, 트리졸(Trizol) 시약을 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. cDNA 라이브러리는 PrimeScript^TM RT 시약 키트(TaKaRa Bio)로 합성하였다. mRNA 발현 수준은 SYBR Green(TOYOBO, Japan)을 사용하여 iCycler iQTM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, USA)에 의해 구현된 cDNA의 분석에 의해 정량화되었고, β-액틴에 대하여 표준화하였으며 상대적 수준의 유전자 발현을 배수로 표시하였다.

실험예 11. 통계 분석

모든 실험은 3회 반복으로 진행하였으며, 통계 분석 데이터는 평균±SEM 및 SD로 표시되고 일원 분산 분석을 사용하여 분석되었다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1. 산사나무 뿌리 추출물( CRE )의 3T3-L1 지방 전구세포에서 지방 세포 분화 억제 효과 확인

3T3-L1 지방 전구 세포에 CRE를 처리하였을 때 지방 세포 분화 억제 효과를 조사하였다. 먼저, 상기 실험예 8의 방법으로 세포 생존율을 분석한 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, CRE는 3T3-L1 세포에 세포 독성을 야기하지 않는 점을 확인하였다.

또한, 상기 실험예 6의 방법으로 오일 레드 O 염색을 통해 지방 함량을 분석한 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 3T3-L1 세포 성숙 과정에서 CRE를 투여한 그룹은 지방 함량이 감소하는 점을 확인하였고, 이는 CRE 농도 의존적으로 감소하는 점을 확인하였다.

또한, 상기 실험예 7을 통해 상기 현상이 3T3-L1 세포의 트리글리세라이드(TG) 함량에도 영향을 미치는지 확인해본 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, CRE 처리시 농도 의존적으로 세포내 TG 함량이 감소하는 점을 확인하였다.

또한, 상기 현상이 분자 수준에서도 재현이 되는지 확인해 보기 위해 상기 실험예 9 및 10의 방법으로 지방 세포 분화 관련 유전자의 발현을 확인해보았다.

도 1d에 나타난 바와 같이, CRE를 처리하였을 때 지방 세포 분화에 관여하는 유전자인 아디포넥틴, C/EBPα, PPARγ. SREBP-1의 mRNA발현이 농도 의존적으로 감소하는 점을 확인하였고, 도 1e에 나타난 바와 같이, CRE를 처리하였을 때 C/EBPα, PPARγ의 단백질 발현도 감소한 점을 확인하였다.

종합하면, 이러한 결과는 CRE는 세포 독성을 야기하지 않고 지방 전구 세포 분화 억제를 통한 항비만 효과를 나타내는바, 비만 개선 또는 치료에 이용될 수 있음을 시사한다.

실시예 2. CRE의 항산화 효과

지방 분해시, 세포내 TG를 분해하면 지방산 산화로 이어지며 지방산 산화가 알어나면 세포내 지방 함량이 감소하면서 생체내에 에너지를 공급하게 된다.

하지만 지방산 산화를 유도할 경우 단백질 손상, 지질 과산화, DNA 손상이 야기되며 세포내 산화 스트레스를 유도하여 생체 내 염증을 야기하는 바, 항비만 효과를 가지는 조성물의 항산화 효과는 매우 중요하다.

이에, CRE가 항산화 효과를 갖는지 확인해보고자 상기 실험예 3의 방법으로 3T3-L1 지방 전구 세포에 CRE 처리시 세포내 활성산소(ROS) 함량의 변화를 조사해보았다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 3T3-L1 세포의 분화 과정중 CRE를 처리하였을 때 세포내 ROS 함량이 유의적으로 감소하는 것을 형광 현미경을 통해 확인하였다.

또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, 유세포 분석을 통해 세포내 ROS의 감소를 정량적으로 확인하였고, 이를 통해 CRE 처리시 유도된 산화 스트레스가 감소한 것을 확인하였다.

또한, 표 1에 나타난 바와 같이 CRE의 라디칼 소거능을 IC50을 통해 평가해본 결과 ABTS assay에서는 에서는 23.674±1.452μg/mL, DPPH assay에서는 24.618±0.254μg/mL로 나타났으며, 이는 대조군인 Ascorbic acid와 비교했을 때, 약 4배 높은 수치이며 라디칼 소거능이 Ascorbic acid의 1/4로 매우 높은 수준임을 확인하였다.

종합하면, CRE는 지방 분해시 발생하는 산화 스트레스를 해소하여 산화 스트레스로 인한 세포 손상을 방지할 수 있음을 시사한다.

실시예 3. HFD 유도된 비만 마우스에서 CRE의 체중 감소 효과

In vitro 실험을 통해 CRE의 지방 세포 분화 억제를 통한 지방 생성 억제 효과를 확인한 바, 생체 내에서의 지방 생성 억제 효과를 확인하고자, 상기 실험예 2의 방법으로 HFD 유도된 비만 마우스로 in vivo에서의 실험을 진행하였다.

먼저, 도 3a에 나타난 바와 같이, CRE 투여는 HFD 유도된 비만 마우스의 사료 섭취량에 영향을 미치지 않은 점을 확인하였다.

또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 일주일 간격으로 체중 증가량을 확인했을 때도, CRE를 처리한 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 체중 증가량이 유의하게 감소한 점을 확인하였다.

또한, 각 그룹별 지방 조직 및 장기의 무게를 확인한 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, CRE 처리 그룹에서 서혜부 백색 지방 조직 (inguinal white adipose tissue 이하 ‘iWAT’) 및 부고환 백색 지방 조직 (epididymal white adipose tissue 이하 ‘eWAT’)의 무게가 감소함을 확인하였으며(상단), 백색 지방 조직(WAT)의 무게를 체중과 대비하여 각 그룹의 비만도를 확인해봤을 때, CRE 처리 그룹이 HFD 그룹 대비 비만도가 감소한 것을 확인하였으며(하단), 이는 상기 조직 및 장기 무게 감소 경향과 일치함을 보였다.

또한, CRE가 HFD 유도된 마우스 그룹의 대사 프로필(metabolic profile)을 개선할 수 있는지 상기 실험예 4의 방법으로 확인해본 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이, HFD 대비 CRE 처리 그룹에서 TG 및 총 콜레스테롤 함량이 감소함을 확인하였다.

또한, 도 3e에서 (a)에 나타난 바와 같이, HFD로 유도된 비만 마우스에서 CRE가 투여된 그룹이 HFD 그룹에 비해 감소된 내장 및 피하 지방 조직을 보이는 것을 확인하였으며, (b) 및 (c)에 나타난 바와 같이, iWAT, eWAT의 지방 조직 모두에서 HFD 그룹에 비해 CRE 처리 그룹이 지방 조직의 크기가 유의하게 감소함을 확인하였다.

상기 CRE의 항비만 효과가 생체 내 독성에 기인한 것인지 평가해보기 위하여 상기 실험예 4의 방법으로 혈장 내의 ALP, TP, ALB, T-BIL, D-BIL, BUN, CREA 등을 분석해 본 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, CRE를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹에서의 차이는 나타나지 않았으며 이러한 결과는 CRE는 생체 내 독성을 야기하지 않는 것을 시사한다.

상기 결과는 CRE가 HFD로 유도된 비만 마우스에서 비정상적인 지방 증가 및 지질함량을 조절하는데 도움이 됨을 시사한다.

이상의 실시예를 종합하여, 본 발명자들은 산사나무 뿌리 추출물이 세포 독성 없이 지방 전구 세포 분화를 효과적으로 억제하고, 항산화 효과를 가지며, 지방세포 내 지질 축적을 감소시킬 뿐만 아니라, 지방 세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제함을 확인하였고, 고지방 식이 마우스에서 지방 생성을 억제함을 확인하였는바, 이러한 결과는 산사나무 뿌리 추출물을 비만의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 약제 및 건강기능식품과 이들의 개발을 위한 물질에 이용할 수 있음을 보여준다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

산사나무(Crataegus pinnatifida) 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 디클로로메탄(dichloromethane), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 산사나무 뿌리 추출물은 하기 성질중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

i) 지방세포의 분화를 억제;
ii) 세포 내 지질 축적을 감소; 및
iii) 지방 세포 분화중 유도되는 산화 스트레스를 감소.
제1항에 있어서,
상기 산사나무 뿌리 추출물은 지방세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서,
상기 전사인자는 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ), 스테롤 조절인자 결합 단백질-1(SREBP-1) 또는 CCAAT-인핸서 결합 단백질 알파(C/EBPα)인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 조성물은 건강기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6개의 알코올(alcohol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether), 디클로로메탄(dichloromethane), 아임계 유체, 및 초임계 유체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제6항에 있어서,
상기 산사나무 뿌리 추출물은 하기 성질중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물:

i) 지방세포의 분화를 억제;
ii) 세포 내 지질 축적을 감소; 및
iii) 지방 세포 분화중 유도되는 산화 스트레스를 감소.
제6항에 있어서,
상기 산사나무 뿌리 추출물은 지방세포 분화 및 성숙에 관여하는 전사인자 또는 아디포넥틴의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제10항에 있어서,
상기 전사인자는 퍼옥시좀 증식제 활성화 수용체 감마(PPARγ), 스테롤 조절인자 결합 단백질-1(SREBP-1) 또는 CCAAT-인핸서 결합 단백질 알파(C/EBPα)인 것을 특징으로 하는, 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
산사나무 뿌리 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.