KR102590243B1

KR102590243B1 - 수면장애 개선을 위한 l-트립토판 및 키토산을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102590243B1
Application number: KR1020230032455A
Authority: KR
Inventors: 오석중; 시암 코까뚜니바르딜 우타만
Original assignee: 주식회사 에코월드팜
Priority date: 2023-03-13
Filing date: 2023-03-13
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2043-03-13
Also published as: WO2024190973A1; JP2025520143A

Abstract

본 발명에는 키토산을 유효성분으로 포함하는 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물 및 키토산과 트립토판을 유효성분으로 포함하는 수면장애 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물이 개시된다. 상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산이며, 상기 조성물은 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증가시켜 트립토판의 수면장애 개선 효과를 더욱 증진시켜 준다.

Description

수면장애 개선을 위한 L-트립토판 및 키토산을 포함하는 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING SLEEP DISTURBANCE COMPRISING L-TRYPTOPHAN AND CHITOSAN}

본 발명에는 키토산을 유효성분으로 포함하는 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물 및 키토산과 트립토판을 유효성분으로 포함하는 수면장애 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물이 개시된다.

수면 부족과 불안은 많은 사람들에게 흔히 발생하는 문제 중 하나이다. 수면 부족은 활동 감소, 스트레스 증가, 생산성 감소, 심리적 문제 등으로 이어진다. 이러한 수면 부족을 줄이고 수면 호르몬을 향상시키기 위해 사용되는 생리 활성 화합물 중 하나가 L-트립토판 (TRP)이다.

뇌에서 수면 유도 호르몬인 멜라토닌의 전구체인 TRP는 수면 촉진에 있어서 가장 유망한 아미노산 중 하나이다. 그러나, TRP가 뇌로 수송되는 동안 손실을 겪고 혈액-뇌 장벽 (Blood-Brain Barrier, BBB)의 밀착연접 (tight-junction)을 통과해야 하기 때문에 TRP의 식이 섭취와 뇌에서의 생체 이용률은 크게 다르다. TRP 수송을 위한 생리 활성 담체 분자의 부족으로 인해 TRP가 밀착연접을 가로질러 세로토닌-멜라토닌 생합성을 자극하는데 성공할 수 없었던 것이다. TRP의 낮은 생체 이용률, 그로 인한 멜라토닌 수치의 감소는 수면 감소, 불규칙한 수면을 유발하고, 수면의 질에 영향을 미친다. 따라서, TRP는 낮은 생체 이용률로 인해 실질적으로 수면장애를 해결하는데 어려움이 있는 실정이다.

KR

2009-0045721

A

TRP를 함유하는 건강 보조제는 생체 이용률이 낮다. 본 발명의 목적은 TRP의 생체 이용률을 증가시켜 활성 성분이 수면 장애 또는 수면 부족을 겪는 환자에서 수면을 향상시키거나 유도할 수 있도록 하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다른 측면에서, 본 발명은 키토산과 트립토판을 유효성분으로 포함하는 수면장애 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산이며, 상기 키토산 분말은 LCH (large molecular weight chitosan)와 SCH (small molecular weight chitosan)를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비로 포함하고, 상기 LCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 키토산 분말이고, SCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 키토산 분말이며, 상기 가용성 키토산은 LSCH (large molecular weight soluble chitosan), MSCH (medium molecular weight soluble chitosan) 및 SSCH (small molecular weight soluble chitosan)를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LSCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 가용성 키토산이고, MSCH는 평균 분자량이 10,000 내지 50,000 Da인 가용성 키토산이고, SSCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 가용성 키토산인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 트립토판과 병용되어 트립토판의 수면장애 개선 효과를 증진시키는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 트립토판과 병용되어 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증진시키는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 트립토판과 병용되어 Occludin, Claudin 5 및 ZO-1로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 밀착연접 단백질 발현을 감소시키는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산은 트립토판과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 병용되는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 트립토판과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 방법으로 병용되는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 투여 후 1시간 이내에 트립토판을 투여하는 방법으로 병용되는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인 것일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 키토산 및 트립토판을 유효성분으로 포함하는, 수면장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산 및 트립토판은 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증진시키는 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 키토산 및 트립토판을 유효성분으로 포함하는, 수면장애 개선용 식품 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 키토산을 유효성분으로 포함하는 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 키토산과 트립토판을 유효성분으로 포함하는 수면장애 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.

본 발명은 생리 활성 담체 화합물로 키토산을 사용하여 TRP 분자가 효율적으로 BBB를 통과하게 함으로써 세로토닌 및/또는 멜라토닌의 증폭된 생산을 위한 TRP의 생물학적 이용 가능성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 어떠한 부작용이나 추가적인 화학적 변형 없이 키토산을 이용하여 TRP의 혈액 뇌 장벽을 통과하는 능력을 증가시켜 TRP의 생체 이용률을 증가시키고, 세로토닌과 멜라토닌의 생성을 증가시켜 수면의 질을 향상시키거나 수면을 유도하는 효과가 우수하다.

도 1은 일 실험예에 따라 키토산 (200μg) 처리 시 hBEC-5i에서 주요 밀착연접 단백질 Occludin (OCLN)의 상대적 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타낸다. 모든 실험군은 3번 테스트되었다.
도 2는 일 실험예에 따라 키토산 (200μg) 처리 시 hBEC-5i에서 주요 밀착연접 단백질 Claudin 5 (CLDN5)의 상대적 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타낸다. 모든 실험군은 3번 테스트되었다.
도 3은 일 실험예에 따라 키토산 (200μg) 처리 시 hBEC-5i에서 주요 밀착연접 단백질 Zona Occludin-1 (ZO-1)의 상대적 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타낸다. 모든 실험군은 3번 테스트되었다.
도 4는 일 실험예에 따른 키토산 (Chit), 트립토판 (TRP), 키토산과 트립토판의 혼합물 (ChitTRP) 처리 설계를 보여주는 요약도를 나타낸 것이다.
도 5는 일 실험예에 따라 hBEC-5i에서 Occludin (OCLN)의 상대적인 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타내고, 컬럼 색상, 녹색, 갈색, 분홍색 및 빨간색은 각각 대조군, 키토산 처리, TRP 처리 및 ChitTRP 처리군을 나타낸다.
도 6은 일 실험예에 따라 hBEC-5i에서 Claudin 5 (CLDN5)의 상대적인 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타내고, 컬럼 색상, 녹색, 갈색, 분홍색 및 빨간색은 각각 대조군, 키토산 처리, TRP 처리 및 ChitTRP 처리군을 나타낸다.
도 7은 일 실험예에 따라 hBEC-5i에서 Zona Occludin-1 (ZO-1)의 상대적인 mRNA 전사 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다. X축의 컬럼은 각각 내부 대조군 유전자, GAPDH에 대한 유전자 mRNA 발현의 배수 변화 인자를 나타내고, 컬럼 색상, 녹색, 갈색, 분홍색 및 빨간색은 각각 대조군, 키토산 처리, TRP 처리 및 ChitTRP 처리군을 나타낸다.
도 8은 일 실험예에 따라 BAC (Bovine Articular Chondrocytes)에서 키토산과 TRP의 조성에 따른 Occludin (OCLN) mRNA의 상대적 발현 농도 평가 결과를 나타낸 것이다. 모든 실험군은 3회 실험되었다.
도 9는 일 실험예에 따라 키토산, TRP 및 ChitTRP으로 처리한 후 hBEC 단일층의 TEER 측정 결과를 나타낸 것이다 (n=2). TEER은 0, 1, 6, 24 및 96시간 간격으로 측정되었다. 1시간 동안 안정한 저항에 도달한 후 처리를 시작하였고, 모든 값은 대조군과 비교하였다.
도 10은 일 실험예에 따라 키토산, TRP 및 ChitTRP으로 처리한 후 hBEC 단일층의 TEER 측정 결과를 나타낸 것이다 (n=2). TEER은 0, 1, 24 및 48시간 간격으로 측정되었다. 1시간 동안 안정한 저항에 도달한 후 처리를 시작하였고, 모든 값은 대조군과 비교하였다.
도 11은 일 실험예에 따라 hBEC-5i 단일층에 대한 키토산, TRP 및 ChitTRP 처리 결과를 비교한 Occludin (내인성) 면역형광 이미지를 나타낸 것이다 (실험 1).
도 12는 일 실험예에 따라 hBEC-5i 단일층에 대한 키토산, TRP 및 ChitTRP 처리 결과를 비교한 Occludin (내인성) 면역형광 이미지를 나타낸 것이다 (실험 2).
도 13은 일 실험예에 따라 hBEC-5i 단일층에 대한 키토산, TRP 및 ChitTRP 처리 결과를 비교한 Claudin 5 (내인성) 면역형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 14는 일 실험예에 따라 hBEC-5i 단일층에 대한 키토산, TRP 및 ChitTRP 처리 결과를 비교한 ZO-1 (내인성) 면역형광 이미지를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 유효성분은 단독으로 목적으로 하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체 등과 함께 목적으로 하는 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서 생체 이용률은 투여한 약물 중에서 전신 순환에 도달한 약물의 비율을 의미하는 것으로, 트립토판의 생체 이용률 개선은 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증가시켜 뇌에 도달하는 트립토판의 양을 증가시킨 것을 의미한다.

본 발명에서 트립토판은 L-트립토판을 의미한다. 트립토판은 세로토닌, 멜라토닌 호르몬 및/또는 기분 전환 또는 수면 유도 작용을 하는 신경전달물질의 생합성을 위한 전구체로서, 정상적인 생리학적 과정을 위해 신체에 필요한 필수 중성 아미노산이다.

본 발명에서 수면장애 개선은 수면과 관련된 매개변수를 증가시키는 모든 작용 또는 세로토닌 및 멜라토닌의 생합성 경로를 증가시켜 양질의 수면 상태를 개시하는 것을 의미한다.

본 발명은 세로토닌, 멜라토닌 생합성 속도의 증가와 함께 TRP의 생체 이용률을 증가시켜 더 나은 수면을 유도하는 효과를 제공한다. 본 발명의 조성물은 수면 지속이 부족한 사람, 수면의 질이 낮은 사람, 간헐적인 수면-각성 주기를 갖는 수면 주기가 불규칙한 사람, 스트레스나 상황으로 인해 수면의 질이 낮은 사람, TRP 결핍증이 있는 사람, TRP 결핍 식단을 갖는 사람, 불면증, 하지불안 증후군, 기면증, 수면 무호흡증과 같은 수면 장애에 직면하거나 위협을 받을 것으로 예상되는 사람에게 유용하다. 본 발명의 조성물은 TRP의 생체 이용률 및 세로토닌, 멜라토닌의 수준을 증가시켜 수면을 유도하거나 기분을 긍정적으로 변화시키는 효과가 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산인 것일 수 있다. 상기 분말은 키토산이 입자상 탈수된 형태임을 의미하고, 가용성은 키토산이 아세트산 또는 pH가 감소된 물과 같은 적절한 용매에 용해된 형태임을 의미한다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산 분말은 LCH (large molecular weight chitosan)와 SCH (small molecular weight chitosan)를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비, 바람직하게는 0.6 내지 0.7 : 0.3 내지 0.4의 중량비, 더 바람직하게는 0.7 : 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 키토산 분말이고, SCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 키토산 분말인 것일 수 있다.

상기 키토산의 분말 형태에서 LCH 및 SCH를 원하는 비율로 얻으려면, 키토산을 HCl 또는 유기산으로 처리해야 한다. 예컨대, HCl 또는 유기산 : 키토산 = 0.2 내지 0.5 : 0.5 내지 0.8의 중량 비율로 처리할 수 있고, 최상의 혼합 중량 비율은 0.3 : 0.7일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 가용성 키토산은 LSCH (large molecular weight soluble chitosan), MSCH (medium molecular weight soluble chitosan) 및 SSCH (small molecular weight soluble chitosan)를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비, 바람직하게는 0.1 : 0.6 : 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LSCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 가용성 키토산이고, MSCH는 평균 분자량이 10,000 내지 50,000 Da인 가용성 키토산이고, SSCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 가용성 키토산인 것일 수 있다.

상기 키토산의 가용성 형태는 LSCH를 키토사나아제와 같은 키토산 분해효소로 처리하여 제조할 수 있다. 키토산의 시간 제어 처리는 LSCH, MSCH 및 SSCH 분자의 혼합물을 생성한다.

고분자량의 키토산을 단독으로 사용하는 것으로는 TRP의 BBB 내부로의 효율적인 수송에 충분하지 않다. 따라서, 본 발명은 다양한 분자량의 키토산을 통해 부작용이나 독성 없이 TRP의 BBB를 통과하는 능력을 높이고 생체 이용률을 증가시킬 수 있는 조성물을 제공한다.

상기와 같이, 다른 분자량 범위로 키토산의 분말 및 가용성 형태와 조합된 TRP는 뇌에서 수면을 향상시키거나 자극할 수 있는 세로토닌 및/또는 멜라토닌의 생합성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 조성물은, 특히 수면 시간이 적거나 불규칙하거나 간헐적인 수면-각성 주기를 갖는 사람들에게 유용하다.

상기 키토산 분말은 트립토판 분말과 혼합되며, 가용성 키토산은 가용성 트립토판과 혼합된다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 키토산은 트립토판과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비, 바람직하게는 0.6 내지 0.7 : 0.3 내지 0.4의 중량비, 더 바람직하게는 0.6 : 0.4의 중량비로 병용되는 것일 수 있다.

트립토판 히드록실라제 (TPH)는 테트라히드로바이오프테린 의존성 모노옥시게나제이며 세로토닌 생합성에서 속도 제한 효소이다. 이 효소는 송과선과 위장관을 포함한 말초 기관의 특정 뉴런 및 분비 세포에 위치한다. 세포 내 칼슘 모빌라이징 리에이전트 (intracellular calcium mobilizing reagent)는 트립토판 히드록실라제 (TPH) 생산을 자극할 수 있다 (Hasegawa et al., 1996). TPH의 전환 시간이 줄어 들면 (더 빠른 전환) 트립토판이 더 짧은 시간에 세로토닌으로 전환될 수 있다. Ca²⁺ 농도의 세포 내 상승은 동시에 관련 신호 전달 캐스케이드를 촉발하여 TPH 및 베지클 분비를 증가시킨다.

키토산은 ARHGAP6 단백질을 활성화하고 Ca²⁺ 신호 전달을 활성화하여 TPH 생성 및 전환 시간에 영향을 줄 수 있는 세포 내 칼슘 모빌라이징 물질로 추정된다. 이 효과는 키토산과 트립토판이 함께 전달되면 시너지 효과를 나타낸다. TPH의 빠른 효소 작용으로 높아져 세로토닌의 생합성을 향상시키고 시너지 효과를 제공할 수 있다.

따라서, TRP의 생체 이용률을 증가시키고 세로토닌, 멜라토닌 생성 증가를 위해, 상기 키토산은 트립토판과 동시에 투여하는 방법으로 병용되는 것이 우수한 효과를 나타낸다. 예컨대, 키토산은 담체 또는 캡슐로 사용된 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 수면장애 예방 또는 치료용 약학 조성물 및/또는 수면장애 개선용 식품 조성물에서 키토산은 아미노산을 캡슐화한 형태를 갖는 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물은 약학 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물은 식품 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물은 트립토판을 포함하는 조성물의 보조제 조성물인 것일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.

상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 계면 활성제, 희석제 (예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 상기 비경구 투여 형태로는 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 패취 등의 제형일 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여할 수 있으며, 약학 조성물의 유효성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.001 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 보다 구체적으로는 0.5 mg/kg/일 내지 50 mg/kg/일이 될 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 액상 또는 고체 상태의 제형일 수 있고, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 식품 조성물에 함유될 수 있는 액체 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올 등이 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제 (예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 개시된 조성물 100 중량부 당 일반적으로 약 0.01 내지 0.04 중량부, 바람직하게는 0.02 내지 0.03 중량부이다.

예시적인 일 구현예에서, 상기 식품 조성물은 일 측면에서 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그 염, 알긴산 및 그 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 다른 측면에서 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 다양할 수 있으나, 본 발명에 개시된 조성물 100 중량부 당 약 0.001 내지 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 키토산 제조

분말 형태의 키토산

분말 형태의 키토산은 LCH (평균 분자량 범위 50,000 Da 초과) 및 SCH (평균 분자량 범위 10,000 Da 미만)를 포함하였다. 분말 형태의 키토산 제제는 LCH : SCH = 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량 비율로 포함하였고, 0.7 : 0.3의 중량 비율로 사용할 때 최상의 결과를 얻었다.

가용성 형태의 키토산

키토산의 가용성 형태는 LSCH (평균 분자량 범위 50,000 Da 초과), MSCH (평균 분자량 범위 10,000-50,000 Da) 및 SSCH (평균 분자량 범위 10,000 Da 미만)를 포함하였다. LSCH : MSCH : SSCH의 중량비가 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3인 가용성 키토산을 사용하였다. 최상의 혼합 중량 비율은 0.1 : 0.6 : 0.3이었다.

- 다른 분자량 입자 (LSCH, MSCH 및 SSCH)를 포함하는 가용성 형태의 키토산은 공지된 Chang et al. (2015)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 효소 가수분해에 의해 생성되었다.

- 셀룰라아제 또는 키토사나아제 또는 기타 키토산 분해효소가 사용될 수 있다.

- 0.4% 아세트산 용액 내 1% 키토산 (300 kDa)을 준비하였다.

- 효소를 키토산 용액에 효율성에 따라 첨가하고 분해를 위해 55 ℃에서 보관하였다.

- 가수분해물의 상등액을 각 시점, 구체적으로 각각 1, 3, 6, 9, 18 및 24시간에 수집하였다.

- 수집된 상등액은 분자량 컷오프 값이 50 kDa (MWCO50), 30 kDa (MWCO30), 10 kDa (MWCO10) 및 3 kDa (MWCO3)인 초원심분리 멤브레인 필터를 사용하여 여과되었다.

- LSCH의 경우 MWCO50, MSCH의 경우 MWCO50과 MWCO10, 및 LSCH의 경우 MWCO10과 MWCO3을 사용하여 원하는 키토산 배치를 준비하였다.

실시예 2. 키토산 나노입자 제조

- 키토산 나노입자는 공지된 Calvo와 Remunan-Lopez, 1997에서 설명한 방법에 따라 Tri-polyphosphate (TPP) 가교를 이용한 이온 겔화에 의해 제조되었다.

- 10 mg의 키토산을 1 L의 증류수에 분산시키고, 사용된 키토산의 아미노기에 대해 5% 몰 초과의 아세트산으로 가용화하였다.

- 5 mg/mL 농축 TPP 스톡 용액을 2차 증류수로 준비하였다.

- 모든 용액은 각각 0.45 μm (키토산) 및 0.22 μm (TPP)의 기공 크기를 갖는 멤브레인 필터를 사용하여 여과 멸균되었다.

- TPP 용액을 실온 (25 ℃)에서 자기 교반 (75 rpm) 하에 키토산 용액에 적가하여 키토산 나노입자를 얻었다.

실시예 3. TRP (L-Tryptophan) 스톡 용액 제조

- TRP의 100x 스톡 용액을 준비하였다.

- 사용된 용매는 생리식염수였다.

- 5 g의 TRP 분말 (100%)을 실온 (25℃)에서 pH 7.4의 생리 식염수 1 L에 녹였다.

- 최종 농도는 5 g/L였다.

- 이후, 용액을 여과 멸균하였다.

- 멸균 용액을 멸균 생리식염수를 사용하여 1x로 희석하였다.

실시예 4. 키토산-TRP 혼합물 제조

LCH 및 SCH를 함유하는 키토산의 분말 형태는 TRP의 분말 형태와 혼합하였고, LSCH, MSCH 및 SSCH를 함유하는 가용성 형태의 키토산은 생리식염수 내 가용성 형태의 TRP와 혼합하였다. 키토산 : TRP = 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량 비율로 혼합하였고, 키토산 : TRP를 0.6 : 0.4의 중량 비율로 조합할 때 최상의 결과를 얻었다.

분말 형태의 키토산 및 TRP 혼합물

- 시중에서 구할 수 있는 분자량이 다른 키토산과 L-트립토판 (TRP)을 Shaanxi Pioneer Biotech Co., Ltd, China에서 입수하였다.

- 일례로, 분말 형태의 조성물 100 g의 경우, 키토산 분말 40 g, TRP 분말 40 g 및 시트르산 또는 말레산 (분말 형태)과 같은 임의의 유기산 20 g을 멸균 용기 또는 비닐 백에 넣고 기계적 백 믹서를 사용하거나 수동으로 혼합하였다.

- 생성물의 적절한 혼합은 혼합물 내 균일하게 착색된 분말 과립에 의해 확인될 수 있다.

- 모든 절차는 오염 문제를 피하기 위해 무균 상태에서 수행되었다.

액상 형태의 키토산 및 TRP 혼합물

- 일례로, 100 mL의 가용성 형태를 준비하기 위해, 60 mL의 키토산 가용성 형태 또는 나노입자를 유리 막대를 사용하여 수동으로 또는 낮은 rpm에서 기계적 교반기를 사용하여 실온에서 40 mL의 TRP 용액과 부드럽게 혼합하였다. 혼합물을 초기에 산성 조건에서 제조하고 완전히 용해된 후 pH를 중성으로 1회 조정하였다.

- 60 mL의 가용성 형태의 키토산에서 3가지 다른 분자량 (LSCH, MSCH 및 SSCH)은 각각 20 ml로 혼합되었다.

실험예 1. 키토산 처리 기간이 hBEC-5i 단일층의 BBB (Blood-Brain Barrier) 무결성에 미치는 영향 평가

키토산 분자가 BBB 밀착연접의 투과성을 증가시킬 수 있는 처리 시간을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 주요 밀착연접 단백질 (Occludin, Claudin-5, ZO-1)을 키토산 분자로 1시간, 18시간 및 24시간 동안 처리하고 mRNA 전사 수준을 측정하였다.

ATCC로부터 얻은 hBEC-5i (Human Brain Micro-Endothelial Cells)를 사용하여 실험을 수행하였다. 키토산 처리군 및 대조군을 무혈청 세포 배양 배지 (DMEM/F-12 50:50 + ECGS + 1% PSA)의 3개 플라스크로 나누었다. 시중에서 판매되는 키토산 분말을 0.1% 아세트산 (AA) 용액에 녹이고 하룻밤 동안 볼텍싱하여 키토산 용액 (1 mg/mL)을 제조하였다. 1 mg/mL 키토산 용액을 4 mL의 무혈청 세포 배양 배지와 결합하고 pH를 조정하여 200 μg의 키토산을 생성하였다. 세포에 도입하기 전에 모든 최종 용액은 0.22 μm 필터를 사용하여 시린지 여과하였다. 처리 용액을 추가하기 전에 세포 단일층을 무혈청 배지로 전처리하였다. 1x DPBS에서 2회 세척하고 전처리한 후, 처리 용액을 80%-90% 컨플루언트 hBEC-5i 단일층의 플라스크 3개에 적용하였다. 이후, 세포를 37 ℃, 5% CO₂에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군과 비교하여 각각의 플라스크는 1, 18 및 24시간에 샘플링하였다.

상기 처리 후 DPBS를 사용하여 단일 세척하고 모든 세포를 수집하였다. 총 RNA 함량은 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 방법으로 추출되었다. 밀착연접 단백질 (Occludin, Claudin 5 및 ZO-1) mRNA의 풍부도는 Rotor-Gene Q Real-Time 시스템 (Qiagen, Germany)에서 수행된 QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen, Germany)를 사용한 원스텝 역전사 실시간 정량적 PCR을 사용하여 정량화하였다. 유전자 프라이머는 공지된 Verma et al., 2009 (Claudin 5 & Occludin) 및 Jiang et al., 2017 (ZO-1 & GAPDH)에서 사용된 것을 이용하였다. 각 반응은 50 ng의 총 RNA, 0.5 pmol의 각 프라이머, 5 μL의 원스텝 반응 혼합물 및 0.1 μL의 Quantiscript 역전사효소로 구성되었고, 모두 10 μL 반응 시스템에 넣고 반응을 실시하였다. 반응은 50 ℃에서 30분, 95 ℃에서 15분 및 94 ℃에서 15초, 58 ℃에서 30초의 40주기로 수행하였다. 각 샘플 분석은 평균 역치 주기 (Ct) 값을 결정하기 위해 3회 수행되었다. 표적 유전자 발현은 GAPDH 유전자로 정규화하였고, 표적 유전자 mRNA의 상대적 양은 종래기술의 상대적인 비교 역치 주기 방법을 사용하여 2^-△△ct로 표현하였다 (Voge et al., 2004; Lagaly et al., 2008; Grado-Ahuir et al., 2011). 샘플 및 마스터 믹스에서 게놈 DNA 오염이 없음을 확인하기 위해 각 PCR 실행에서 비주형 대조군 및 비역전사효소 대조군을 사용하였다.

Occludin, Claudin-5, ZO-1, 세 가지 주요 밀착연접 단백질을 qPCR을 사용하여 mRNA 전사 수준을 정량화하였다. Occludin, Claudin-5 및 ZO-1 mRNA 수준은 처리 후 1시간에 해당 대조군 수준보다 각각 61%, 74% 및 51% 더 낮은 것으로 나타났다 (도 1 내지 3 참조). 그러나, Occludin 발현은 18시간 인큐베이션 후 대조군보다 27% 증가하였고, 24시간 후에는 10% 더 증가하였다. 대조적으로, ZO-1 발현은 18시간 후 정상 수준으로 돌아왔고, 1시간 동안 인큐베이션된 실험군에서 관찰된 것과 유사하게 감소하는 경향을 보였다. Claudin-5의 경우, 상대적으로 발현 수준이 낮았으며 키토산 처리 후 감소를 보였다. 또한, 처리 1시간 후에도 mRNA 수준 감소가 안정적으로 유지되었다. 이에 따라, 키토산 처리 1시간 후 BBB 밀착연접 개방 효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.

실험예 2. 뇌 내피세포의 밀착연접 (tight junction, TJ)으로부터 3개의 유전자 mRNA의 발현 프로파일 평가

키토산 (Chit)과 키토산 및 트립토판의 조합 (ChitTRP)이 뇌 미세혈관 내피세포에서 TJ 단백질 발현 수준에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 아래와 같이 실험을 수행하였다. TJ 단백질 발현 수준이 정상 수준에서 감소되거나 변경된 경우, 키토산, ChitTRP 분자가 TJ에 들어가 이들 단백질 발현의 변경을 야기한 것을 의미한다.

ATCC로부터 얻은 hBEC-5i (Human Brain Micro-Endothelial Cells)를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 3개의 처리군 (키토산 (Chit), 트립토판 (TRP), 키토산-트립토판 (ChitTRP)) 및 1개의 대조군 (무혈청 세포 배양 배지 (DMEM/F-12 50:50 + ECGS + 1% PSA))으로 구성하였다. 무혈청 세포 배양 배지에 물질을 처리하였고, 필요한 경우 pH를 조정하였다. 각 처리 용액은 도 4에 표시된 바와 같이 0.1% 아세트산 (AA)에 용해시킨 1 mg/mL의 키토산 용액, 완전한 배지에 직접 용해시킨 1 mg/mL의 TRP 용액, 그리고 이들을 혼합한 ChitTRP 용액을 제조하여 수득하였다. 모든 용액은 세포에 추가되기 전에 0.22 μm 필터를 사용하여 여과되었다. 처리 용액을 추가하기 전에 세포 단일층을 무혈청 배지로 전처리하였다. 1x DPBS로 2회 세척하고 전처리한 후, 처리 용액을 80%-90% 컨플루언트 hBEC-5i 단일층에 추가하였다. 이후, 세포를 37 ℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1시간 동안 인큐베이션하였다 (도 4 참조).

모든 세포는 1시간 처리 후 DPBS를 사용하여 단일 세척 후 수집되었다. 총 RNA 함량은 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 방법으로 추출되었다. 밀착연접 단백질 (Occludin, Claudin 5 및 ZO-1) mRNA의 풍부도는 Rotor-Gene Q Real-Time 시스템 (Qiagen, Germany)에서 수행된 QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen, Germany)를 사용한 원스텝 역전사 실시간 정량적 PCR을 사용하여 정량화하였다. 유전자 프라이머는 공지된 Verma et al., 2009 (Claudin 5 & Occludin) 및 Jiang et al., 2017 (ZO-1 & GAPDH)에서 사용된 것을 이용하였다. 각 반응은 50 ng의 총 RNA, 0.5 pmol의 각 프라이머, 5 μL의 원스텝 반응 혼합물 및 0.1 μL의 Quantiscript 역전사효소로 구성되었고, 모두 10 μL 반응 시스템에 넣고 반응을 실시하였다. 반응은 50 ℃에서 30분, 95 ℃에서 15분 및 94 ℃에서 15초, 58 ℃에서 30초의 40주기로 수행하였다. 각 샘플 분석은 평균 역치 주기 (Ct) 값을 결정하기 위해 3회 수행되었다. 표적 유전자 발현은 GAPDH 유전자로 정규화하였고, 표적 유전자 mRNA의 상대적 양은 종래기술의 상대적인 비교 역치 주기 방법을 사용하여 2^-△△ct로 표현하였다 (Voge et al., 2004; Lagaly et al., 2008; Grado-Ahuir et al., 2011). 샘플 및 마스터 믹스에서 게놈 DNA 오염이 없음을 확인하기 위해 각 PCR 실행에서 비주형 대조군 및 비역전사효소 대조군을 사용하였다.

밀착연접의 투과성을 결정하는 중요한 역할을 하는 밀착연접 단백질인 Occludin (OCLN)의 발현을 평가하였다. OCLN의 상승된 발현은 더 단단하고 불침투성 밀착연접을 초래하는 것으로 알려져 있다 (Hirase et al., 1997; Al-Sadi et al., 2011). 실험 결과는 대조군에 비해 모든 처리군에서 높은 발현 수준을 나타냈지만, 키토산 및 TRP 처리된 실험군에 비해 ChitTRP 처리된 실험군에서 Occludin 발현 감소가 나타났다 (도 5 참조). 밀착연접 투과성의 이러한 감소는 ChitTRP의 흡수 또는 통과를 용이하게 하며, TRP와 키토산을 결합할 경우 TRP를 세포의 밀착연접에 침투시켜 원형질막을 통한 가용성을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

Claudin 5 (CLDN5)는 투과성에 영향을 미치는 밀착연접의 중요한 구성 요소이다. CLDN5의 발현은 800 Da보다 큰 분자 질량으로 장벽을 통과할 수 있는 분자를 결정하기 때문에 혈뇌 장벽 (BBB)의 뇌 내피세포에서 특히 중요한 것으로 알려져 있다 (Lieu et al., 2012). ChitTRP 처리군에서 CLDN5의 발현은 키토산 및 TRP 단독 처리군에 비해 더 낮은 것으로 밝혀졌는데, 이는 BBB를 가로지르는 ChitTRP 분자의 투과성 및 능력의 증가를 나타낸다 (도 6 참조). TRP 단독 처리군에서 CLDN5의 높은 발현은 투과성 감소를 시사한다. 이러한 결과는 키토산과 TRP가 상호작용하여 hBEC 세포에서 CLDN5의 발현을 조절하고 ChitTRP의 투과성을 향상시킨다는 것을 의미한다. 또한, 키토산과 TRP의 조합이 단단한 밀착연접을 통과하여 원형질막을 가로지르는 TRP의 이용성을 향상시킨다는 것을 의미한다.

혈뇌 장벽 밀착연접의 주요 보조 단백질인 ZO-1의 발현은 Occludin 및 Claudin 5와 같은 주요 단백질의 발현에 의존한다. 이러한 단백질의 발현 변화는 ZO-1 발현에 영향을 미칠 수 있다. 본 실험예에서 hBEC-5i는 200 μg의 키토산, TRP 및 ChitTRP로 1시간 동안 처리되었다. 결과는 ZO-1의 발현 수준이 Claudin 5 발현의 변화에 따라 감소하였음을 나타낸다. 특히, ChitTRP 처리군은 키토산 또는 TRP 단독 처리군과 비교하여 ZO-1 mRNA 수준의 감소를 보였다 (도 7 참조). 그러나, 이 발현 패턴은 Occludin 발현에 영향받지 않은 것으로 나타났다.

ChitTRP 처리시 BBB의 투과성이 증가하였는데, 이는 대조군에 비해 주요 밀착연접 단백질인 Occludin, Claudin-5 및 ZO-1의 발현이 감소한 것으로 나타났다. ChitTRP 처리 후 밀착연접 저항의 일시적인 감소 및 후속 정상 수준으로의 복귀는 무결성에 영구적인 손상을 일으키지 않고 BBB에서 TRP의 최대 가능한 이용성을 보여준다. 상기와 같이, BBB가 TRP 단독에 비해 ChitTRP 분자에 의해 훨씬 더 효과적으로 침투되어 뇌에 대한 TRP의 생체 이용률을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, BAC (Bovine Articular Chondrocytes)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 도 8에 기재된 10가지 처리군에 대해 OCLN mRNA의 상대적 발현 농도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 키토산 및 TRP가 혼합되더라도 키토산의 분자량과 키토산 및 TRP의 혼합 중량비에 따라 OCLN mRNA의 발현량에 차이가 있음을 확인하였다. 구체적으로, 분말 형태의 키토산 및 TRP의 혼합물은 LCH와 SCH를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비로 함유하는 키토산 분말을 TRP 분말과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 혼합할 때 OCLN 발현 감소율이 가장 높은 것으로 나타났다. 또한, 가용성 형태의 키토산 및 TRP의 혼합물은 LSCH, MSCH, SSCH를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비로 함유하는 가용성 키토산을 가용성 TRP와 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 혼합할 때 OCLN 발현 감소율이 가장 높은 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명의 조성 범위에 따라 키토산-TRP 혼합물이 제조되었을 때 OCLN의 발현이 현저하게 감소하고 밀착연접에 대해 더 투과성을 가져 TRP의 생체 이용률을 더욱 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 인간 뇌 내피세포에 대한 in vitro TEER (transendothelial electrical resistance) 및 면역형광 평가

In vitro TEER 평가

In vitro BBB 모델은 트랜스웰 인서트 (PTFE, 0.4 μm)를 사용하여 확립되었다. hBEC-5i 세포를 필터 상단에 시딩하고 40 μM ECGS, 10% FBS 및 1% 항생제 용액이 함유된 700 μL의 신선한 DMEM/F-12 배지로 채워진 24-웰 플레이트에 넣었다. 추가적인 200-300 μL의 동일한 배지를 인서트 배양 영역에 추가하였다. 세포가 컨플루언스에 도달한 후 2-3일 동안 배양하였다. TEER (transendothelial electrical resistance)은 EVOM2 (ERS-2, Millipore, Burlington, MA, USA) 및 STX2 찹스틱 전극을 사용하여 측정하였다. 각 hBEC 단일층의 TEER 값은 테스트된 장벽 저항에서 대조 저항 (Ω, 세포가 없는 인서트)을 뺀 다음 24-웰 플레이트 (0.33 cm²)에 인서트의 식재 면적을 곱하여 계산하였다. TEER 값이 고조기 (plateau phase)에 도달했을 때 처리 실험을 수행하였다 (Wang et al. 2010; Wu et al. 2020).

hBEC 단일층 (BBB)의 투과성에 대한 ChitTRP 분자의 영향을 평가하기 위해, 인서트를 4개의 처리 그룹으로 나누고 각각 2회 복제하였다. 그룹은 다음과 같다: 대조군 그룹, 배지만 함유; 키토산 그룹, hBEC-5i가 200 ㎍의 키토산에 노출; TRP 그룹, hBEC-5i가 200 ㎍의 TRP에 노출; 및 ChitTRP 그룹, hBEC-5i가 200 μg의 ChitTRP에 노출. 처리는 5% CO₂ 환경에서 37 ℃에서 1시간, 6시간, 24시간, 48시간 및 96시간 동안 적용되었다. TEER 값은 hBEC 세포 투과성을 결정하기 위해 각 시점 이후에 기록되었다. 데이터는 Origin Pro 2022 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석되고 시각적으로 표현되었다.

BBB 모델로서 hBEC 세포에 대한 ChitTRP (CTRP)의 영향을 평가하기 위해 대조군과 비교하여 키토산, TRP 및 ChitTRP로 처리된 세포에서 TEER을 측정하였다. 실험은 hBEC 세포를 사용하여 다른 계대에서 2회 반복되었으며 약간 다른 TEER 값이 생성되었다. 세포가 무혈청 배지로 전처리된 후 22.11-22.44±0.23 Ω x cm²의 안정적인 TEER 값을 나타내면 각 제제로 처리하였다.

첫 번째 실험에서 대조군은 처음에 21.12-22.44±0.23Ω x cm²의 TEER 값 범위를 나타내었고, 처리 후 96시간까지 15.18-16.5±0.93으로 떨어졌다. 키토산과 CTRP를 처리하였을 때 저항성은 1시간 이내에 감소하였으며, 키토산은 12.87, 분말 형태의 CTRP는 14.52-16.5±1.4, 액체 형태의 CTRP는 13.86-16.17±1.63의 값을 보였다. 그러나, 밀착연접 무결성은 대조군과 유사한 15.51-18.81±1.07의 값으로 점차 회복되었다 (도 9 참조). 두 번째 실험에서도 동일한 경향이 관찰되었으며, 초기 TEER 값은 38.78-42.74±1.66Ω x cm²였다. TRP 단독 처리군은 대조군과 비교하여 TEER 값에서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (도 10 참조). 이러한 결과는 키토산이 일시적으로 BBB를 해체하고 투과성을 증가시켜 TRP의 흡수율을 향상시켜 주는 것을 보여준다. 상기 효과는 1시간을 정점으로 최대 6시간 동안 지속되며, 이는 본 발명에 따른 조성물이 BBB에 대해 안전하다는 것을 의미한다.

면역형광 평가

본 실험예는 1x 부착 인자 단백질 (ThermoFisher Scientific)로 코팅된 4-웰 챔버 슬라이드에 시딩된 hBEC-5i를 사용하여 실험을 진행하였다. hBEC-5i 세포를 10% FBS, ECGS 및 1% PSA가 보충된 1 mL DMEM/F-12 50:50으로 구성된 배지에서 배양하였고, 컨플루언스에 도달할 때까지 37 ℃, 5% CO₂의 습한 분위기 하에서 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 무혈청 배지로 전처리하고 배지 단독 (대조군), 200 μg의 키토산, 200 μg의 TRP 및 200 μg의 ChitTRP를 포함하는 다양한 물질로 1시간 동안 처리하였다.

처리 후, 배양물을 4℃에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 10분 동안 PBS 중의 0.1% Triton-X-100으로 투과시켰다. 이후, 세포를 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 30분 동안 차단하고, occludin, claudin-5 및 ZO-1에 대한 1차 항체로 인큐베이션한 다음, Alexa Fluor 488-접합 항-토끼 2차 항체로 1시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 정확성을 보장하기 위해 단계 사이에 엄격한 세척 프로토콜을 따랐고, 세포를 PBS 중의 1 μg/mL Hoechst 33342로 대비염색하고 형광 마운팅 배지 (Abcam)에 장착하였다. Olympus BX53 표면형광 현미경을 사용하여 관찰하였다.

hBEC-5i 세포에서 주요 밀착연접 단백질 (Occludin, Claudin-5 및 ZO-1)의 발현 패턴을 면역형광 이미징을 사용하여 분석하였다 (도 11 내지 14 참조). 도 11 및 12는 다른 계대 hBEC 세포에서 실험한 결과를 나타낸 것이다. Alexa Fluor-488 접합 2차 항체를 이용하여 1차 항체에 결합된 표적 단백질을 검출한 다음 녹색 형광으로 관찰되었다. 또한, 세포는 핵을 염색하는 Hoechst-33342로 염색되었고 청색 형광으로 관찰되었다. 결과는 BBB 구조가 키토산 또는 키토산 함유 TRP 제제로 처리될 때 파괴되는 반면, TRP만 처리된 세포는 대조군과 유사한 형광 패턴을 나타냄을 보여주었다. occludin과 claudin-5의 발현은 비슷하였고, 키토산 또는 키토산 함유 TRP (CTRP)로 처리할 때 신호 강도가 감소하여 키토산이 이러한 주요 밀착연접 단백질의 발현을 변경하여 BBB의 투과성을 증가시킬 수 있음을 보여주었다. ZO-1의 발현은 다른 단백질에 비해 대조군에서 더 높았으나, 키토산 함유 제제로 처리시 감소된 발현을 보였다. 이에 따라, 키토산 함유 TRP 제제가 BBB 밀착연접 투과성을 변경하여 TRP가 BBB를 가로질러 표적 부위로 향하게 하여 세로토닌-멜라토닌 합성을 위한 뇌에서 TRP의 생체 이용률을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

이상, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

키토산을 유효성분으로 포함하는, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물에 있어서,
상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산이며,
상기 키토산 분말은 LCH (large molecular weight chitosan)와 SCH (small molecular weight chitosan)를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비로 포함하고, 상기 LCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 키토산 분말이고, SCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 키토산 분말이며,
상기 가용성 키토산은 LSCH (large molecular weight soluble chitosan), MSCH (medium molecular weight soluble chitosan) 및 SSCH (small molecular weight soluble chitosan)를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LSCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 가용성 키토산이고, MSCH는 평균 분자량이 10,000 내지 50,000 Da인 가용성 키토산이고, SSCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 가용성 키토산인 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 트립토판과 병용되어 트립토판의 수면장애 개선 효과를 증진시키고,
상기 키토산은 트립토판과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 병용되는 것을 특징으로 하는, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 트립토판과 병용되어 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증진시키는 것인, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 트립토판과 병용되어 Occludin, Claudin 5 및 ZO-1로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 밀착연접 단백질 발현을 감소시키는 것인, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 조성물은 트립토판과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 방법으로 병용되는 것인, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 조성물은 투여 후 1시간 이내에 트립토판을 투여하는 방법으로 병용되는 것인, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물인, 트립토판의 생체 이용률 개선용 조성물.
키토산 및 트립토판을 유효성분으로 포함하는, 수면장애 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서,
상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산이며,
상기 키토산 분말은 LCH (large molecular weight chitosan)와 SCH (small molecular weight chitosan)를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비로 포함하고, 상기 LCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 키토산 분말이고, SCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 키토산 분말이며,
상기 가용성 키토산은 LSCH (large molecular weight soluble chitosan), MSCH (medium molecular weight soluble chitosan) 및 SSCH (small molecular weight soluble chitosan)를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LSCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 가용성 키토산이고, MSCH는 평균 분자량이 10,000 내지 50,000 Da인 가용성 키토산이고, SSCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 가용성 키토산인 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 상기 키토산 및 트립토판이 병용되어 트립토판의 수면장애 개선 효과를 증진시키고,
상기 키토산은 트립토판과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 병용되는 것을 특징으로 하는, 수면장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
삭제
제 10항에 있어서,
상기 조성물은 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증진시키는 것인, 수면장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
키토산 및 트립토판을 유효성분으로 포함하는, 수면장애 개선용 식품 조성물에 있어서,
상기 키토산은 키토산 분말 또는 가용성 키토산이며,
상기 키토산 분말은 LCH (large molecular weight chitosan)와 SCH (small molecular weight chitosan)를 0.5 내지 0.7 : 0.3 내지 0.5의 중량비로 포함하고, 상기 LCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 키토산 분말이고, SCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 키토산 분말이며,
상기 가용성 키토산은 LSCH (large molecular weight soluble chitosan), MSCH (medium molecular weight soluble chitosan) 및 SSCH (small molecular weight soluble chitosan)를 0.1 내지 0.3 : 0.5 내지 0.8 : 0.1 내지 0.3의 중량비로 포함하고, 상기 LSCH는 평균 분자량이 50,000 Da을 초과하는 가용성 키토산이고, MSCH는 평균 분자량이 10,000 내지 50,000 Da인 가용성 키토산이고, SSCH는 평균 분자량이 10,000 Da 미만인 가용성 키토산인 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 상기 키토산 및 트립토판이 병용되어 트립토판의 수면장애 개선 효과를 증진시키고,
상기 키토산은 트립토판과 0.3 내지 0.7 : 0.3 내지 0.7의 중량비로 병용되는 것을 특징으로 하는, 수면장애 개선용 식품 조성물.
삭제
삭제
제 14항에 있어서,
상기 조성물은 트립토판의 혈액-뇌 장벽의 밀착연접에 대한 투과성을 증진시키는 것인, 수면장애 개선용 식품 조성물.