KR102503051B1 - 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물 - Google Patents

무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부보호용 화장료, 또는 의약외품 조성물에 관한 것으로, 무궁화 추출물이 자외선에 의한 ER 스트레스를 억제하고, ROS 생성을 감소시켜 아폽토시스를 방지하는바, 자외선에 대한 세포 보호 효과를 가져 화장료, 의약외품 등에 활용 가능하다.

Description

무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 조성물{Compositions for protecting skin against ultraviolet ray comprising Hibiscus syriacus extracts or fraction thereof}
본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부보호용 화장료 또는 의약외품 조성물에 관한 것이다.
자외선(UV)은 콜레스테롤로부터 비타민 D를 자연적으로 합성하는 데 필수적이지만 자외선에 대한 과도한 노출은 피부 세포의 광노화, 발암 및 사망을 유발하는 인간 생활에서 가장 위험한 환경 요인 중 하나이다. 자외선(UV)는 파장에 따라 UVA(315 ~ 400nm), UVB(280 ~ 315nm) 및 UVC(100 ~ 280nm)와 같은 세 가지 하위 유형으로 나누어진다. 태양광의 자외선 중 95% UVA와 5% UVB는 지구 표면에 도달하지만 UVC는 도달하지 않는다.
UVA는 표피의 부작용에 영향을 미치는 UVB보다 진피 깊숙이 침투 할 수 있으며 두 방사선 모두 심각한 주름, 얼룩덜룩 한 변색, 표피 두꺼워 짐, 피부 세포 성장 둔화 및 피부 탄력 상실을 유발한다.
피부는 기본적인 신진대사 과정을 통하여 우리 몸의 항상성을 저해하는 다양한 외부 요인으로부터 위해를 막아주는 일차적인 기능을 담당하고 있다. 즉, 피부는 신체 가장 바깥쪽에 위치함으로써 물리적, 화학적, 생물학적 장벽기능을 통한 보호작용, 체온조절작용, 감각작용, 분비 및 배설작용, 흡수작용, 저장작용, 재생작용 등의 다양한 역할을 수행하고 있지만, 지속적인 외부 스트레스가 가해지는 경우 가장 손상을 받기 쉽다. 이러한 외부 스트레스의 주요 원인으로는 자외선 노출, 배기가스, 황사, 환경오염물, 중금속, 온도변화, 미생물을 대표적인 예로 들 수 있다. 이들은 주로 산화적 스트레스를 통하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써, 항산화 방어체계를 붕괴시켜 세포 손상 및 사멸을 야기하게 된다. 특히, 자외선 B가 DNA 손상, 광노화 및 피부암을 일으키는 주요 요인으로 보고되었다. 자외선 B는 히드록시 라디칼, 초산화물 음이온 등과 같은 활성산소종의 생성을 유도하여 산화적 스트레스 및 항산화 방어기전의 불균형을 초래하여 염증반응, 광노화 및 피부암 등의 질병을 심화시킬 수 있다.
따라서 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 보다 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1899345호
본 발명의 목적은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물 및 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 무궁화는 '불새'(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae') 품종일 수 있다.
상기 추출물은 무궁화의 꽃잎 추출물일 수 있다.
상기 추출물을 에탄올 용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 분획물은 무궁화 에탄올 추출물의 분획물이며, 상기 분획물은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 이루어진 군에서 선택되는 플라보노이드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 자외선은 자외선 B(ultraviolet-B, UV B)일 수 있다.
또한 본 발명은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 의한 피부 보호용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 무궁화 추출물 또는 이의 분획물이 자외선에 의한 ER 스트레스를 억제하고, ROS 생성을 감소시켜 아폽토시스를 방지하는바, 자외선에 대한 세포 보호 효과를 가져 화장료, 의약외품 개발에 유용하다.
도 1은 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리 농도에 따른 HaCaT 각질세포에 대한 세포 생존율 분석결과이다. (A) MTT 분석을 통한 상대적 세포 생존율 분석결과, (B) 24시간 후 세포의 위상차 현미경 (× 20) 이미지, 스케일바 = 20 ㎛. (C) 세포 생존율 (%), 총 세포 수 (세포/㎖) 및 세포사멸율 (%)를 유세포 분석한 결과이다. H2O2 (100μM)는 세포 사멸에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 UVB로 유도된 세포 사멸에 대해 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 전 처리군의 (A) MTT 분석, (C) 아넥신을 이용한 초기/후기 아폽토시스 분석 결과와 후 처리군의 (B) MTT 분석, (D) 아넥신을 이용한 초기/후기 아폽토시스 분석 결과이다.
도 3은 UVB로 유도된 세포 사멸에 관여하는 카스파제 신호 전달 경로 억제 효과를 분석한 것이다. (A) 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 전처리군의 caspase-3 및 PARP 발현을 웨스턴 분석(왼쪽)한 결과이다. 상대적 밀도는 ImageJ 소프트웨어 (오른쪽)를 사용하여 계산하였다. (B) 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 전처리한 후 UVB를 조사한 세포에서 Caspase-3/7+ 세포 사멸 세포 집단을 유세포 분석한 결과이다. (C) 팬-카스파제 억제제(pan-caspase inhibitor)인 z-VAD-FMK(10μM)로 전처리하고 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 전 처리한 후 UVB를 조사한 세포에서 Caspase-3/7+ 세포 사멸 세포 집단을 유세포 분석한 결과이다.
도 4는 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 UVB에 의한 제브라피쉬 유충 (A) 생존율 변화, (B) 형태학적 이상 관찰 사진, (C) 살아남은 유충의 형태 이상률, 및 제브라피쉬 배아의 (D) 부화율 변화를 분석한 것이다.
도 4 (B)에서 정상 (a), 심낭 부종 (b), 난황낭 부종 (c), 단축 꼬리 (d), 출혈성 병변 (e) 및 사망 (f)을 나타낸다. 도 4 (D)의 배아의 부화율(%)은 PS 미첨가(free) 배아 배지에서 5 dpf까지 관찰하였다.
도 5는 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 UVB 유도 ROS 억제 효과 및 세포 독성과 사망률을 감소 효과를 분석한 것이다. 구체적으로 (A-B)는 HaCaT 각질세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물의 자외선에 대한 세포 보호 효과를 분석한 것이다. (A) Muse® Oxidative Stress Kit를 사용하여 세포 내 ROS을 분석한 것으로, ROS- (M1; 파란색) 및 ROS+ (M2; 빨간색) 모집단이고 아래 그래프는 ROS+ 의 세포 비율을 나타낸다. (B) Muse® Annexin V & Dead Cell Kit를 사용하여 초기 / 후기 세포 사멸 집단을 측정한 결과로, 아래 그래프는 초기 / 후기 세포 사멸에서 세포의 비율을 나타낸다. (C-D) 제브라피쉬 유충에서 자외선에 대한 무궁화 안토시아닌 분획물의 보호효과를 분석한 결과이다. (C) 유충을 DCFDA (20 μM) 염색한 형광 이미지이다. (D) DCFDA 형광강도를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되고 처리되지 않은 유충의 것과 비교한 결과이다. (F) 자외선 B를 조사하나 제브라피쉬 유충에서 NAC 처리 유무에 따른 생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 6은 HaCaT 각질 세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 UVB에 의해 탈분극된 미토콘드리아 막 전위의 감소 및 mtROS 생성 변화를 분석한 결과이다. (A) Muse® MitoPotential Kit로 세포를 염색하고 탈분극된 미토콘드리아 막 전위를 유세포 분석한 결과이다. (B) 자외선에 의한 미토콘드리아 ROS(mtROS) 변화를 분석하고자 MitoTracker Green 및 MitoSOX Red로 염색한 세포의 형광 분석 이미지이다. (C) Muse® Annexin V & Dead Cell Kit(왼쪽)를 사용하여 초기/후기 아폽토시스(apoptotic populations)을 분석한 결과이다.
도 7은 UVB 처리한 제브라피시에 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)가 mtROS를 감소시켜 생존율을 증가시킴을 분석한 결과이다. (A)는 자외선에 의한 미토콘드리아 ROS(mtROS) 변화를 분석하고자 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 또는 mtROS 억제제를 처리한 제브라피시에 UVB를 처리한 후, MitoTracker Green 및 MitoSOX Red로 염색한 세포의 형광 분석 이미지이고 (B) 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 또는 mtROS 억제제를 처리한 제브라피시에 UVB를 처리한 후, 유충의 생존율을 분석한 결과이다.
도 8은 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 ER 스트레스 및 그에 따른 mtROS 생산 억제 효과를 분석한 것이다. (A) UVB 조사한 HaCaT 각질 세포에서 0 내지 24시간 동안 ER 스트레스 마커 단백질 GRP78, ATF4, p-eIF1α 및 CHOP의 발현을 웨스턴 분석한 결과이다. (B) 무궁화 안토시아닌 분획물을 전처리 한 후 UVB 조사한 세포에서 GRP78, ATF4, p-eIF1α 및 CHOP의 발현을 웨스턴 분석한 결과이다. (C) ER 스트레스 억제제 또는 무궁화 안토시아닌 분획물을 전처리한 제브라피쉬 유충(2 dpf)에서 UVB 처리에 의한 mtROS 생성 변화를 면역염색으로 분석한 것이다. (D) ER 스트레스 억제제 처리한 유충에서 UVB 처리에 의한 생존율 변화를 분석한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물은 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함한다.
본 발명에서 용어 "무궁화"는 쌍떡잎식물 아욱목 아욱과의 낙엽관목으로 학명은 Hibiscus syriacus로, 높이는 3-4m에 달하며, 어린 가지에는 털이 많으나 점차 없어진다. 무궁화는 정원에서 재배가 쉽고 씨로 번식이 가능하지만 꺽꽂이로 번식되므로 형질을 변형시키지 않고 유지하는 것이 쉽다. 잎은 어긋나며 달걀모양이고 대개 3개로 갈라지고 가장자리 에는 톱니가 있다.
본 발명에서 "추출물"은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 시료로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 진공상태에서 동결건조하는 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 시료의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명에서 무궁화 추출물은 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1)내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 알코올은 에탄올일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 무궁화 불새 품종의 꽃 일을 동결건조하여 분쇄한 후 48시간 추출하고 여과하여 무궁화 에탄올 추출물을 수득하였다.
따라서 본 발명의 무궁화는 구체적으로 불새'(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae') 품종일 수 있다.
본 발명의“불새'(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae')”는 홍단심계의 홀꽃인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 무궁화 추출물을 무궁화의 꽃잎 추출물일 수 있으며, 구체적으로 무궁화 불새 품종의 꽃잎을 추출한 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 무궁화 불새 품종의 꽃잎을 에탄올 용매로 추출한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 “분획물”은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 무궁화 추출물을 크로마토그래피하여 분리된 분획물일 수 있다.
또한, 상기 분획물은 무궁화 추출물을 증류수(물)에 현탁한 후, 탄소수 1(C1)내지 4(C4)의 알코올, 에틸아세테이트, n-헥산 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 수득되는 것 일수 있다.
본 발명의 실시예에서 무궁화 에탄올 추출물을 Diaion® HP-20 컬럼으로 분획하여 얻은 안토시아닌 함량이 높은 분획물을 분리하였다.
따라서 본 발명의 무궁화 추출물의 분획물은 무궁화 에탄올 추출물을 Diaion® HP-20 컬럼으로 분리하여 얻은 분획물일 수 있으며, 구체적으로 안토시아닌 함량이 높은 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 무궁화 에탄올 추출물의 분획물에서 플라보노이드 성분을 분석한 결과, 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside), 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))의 17종의 플라보노이드 화합물을 포함함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 무궁화 추출물의 분획물은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside), 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) 로 이루어진 군에서 선택되는 플라보노이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 자외선(UV)는 파장에 따라 자외선 A (315 ~ 400nm), 자외선 B (280 ~ 315nm) 및 자외선 C (100 ~ 280nm)으로 구분되며, 상기 자외선은 구체적으로 자외선 B(ultraviolet-B, UVB)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 무궁화 안토시아닌 분획물이 각질세포 또는 제브라피쉬에서 UVB에 의해 유도되는 아폽토시스를 억제함을 확인하였으며, 구체적으로 caspase-3/7 신호을 억제하고 세포내 ROS 생성을 감소시키며, 미토콘드리아 탈분극을 억제하여 mtROS 생성을 억제하여 세포 사멸을 억제하여 UVB에 보호효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 발명에서 무궁화 추출물 또는 이의 분획물은 자외선 B로 인해 발생된 caspase-3/7 신호를 억제하여 작용을 통해 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서 무궁화 추출물 또는 이의 분획물은 자외선 B로 인한 세포내 ROS 생성 억제 또는 미토콘드리아 탈분극을 억제하여 mtROS 생성을 억제하여 피부 보호 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 무궁화 안토시아닌 분획물을 800 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리시 각질세포에서 세포독성을 나타냄을 확인하였으며, 100 내지 400 ㎍/㎖으로 각질세포에서 전치리한 후, 자외선에 의한 세포 사멸 억제 효과를 분석한 결과 100 ㎍/㎖ 처리시 효과가 아폽토시스 억제 효과가 거의 나타나지 않았으나, 200 내지 400 ㎍/㎖에서 아폽토시스 억제 효과가 우수하였고, 400 ㎍/㎖으로 처리시 가장 우수하였다.
따라서 본 발명의 조성물은 무궁화 안토시아닌 분획물을 100 초과 800 ㎍/㎖ 미만의 농도로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 200 이상 400 ㎍/㎖ 이하의 농도로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 대한 피부 보호용 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 무궁화, 추출물, 분획물, 자외선, 피부 보호에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 “의약외품”은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다.
본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.
본 발명의 조성물을 자외선에 대한 피부 보호 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있으며, 본 발명에 의한 의약외품 조성물은 상기 무궁화 추출물 또는 이의 분획물을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20 중량%로 함유할 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<재료 및 방법>
1.1 무궁화 추출물의 제조 및 안토시아닌 분석
무궁화(Hibiscus syriacus)는 국립산립과학원(대한민국, 수원)의 무궁화 클론 아카이브((N 371505.56”, E 12657016.11”) 재배된 불새(Pulsae)을 사용하였다. 바우처 표본은 산림청에 기탁하였다(NF-H8-F; http://english.forest.go.kr/newkfsweb/eng/idx/Index.do?mn=ENG_01).
무궁화 불새의 꽃잎을 3일 동안 동결건조하여 추출 전까지 -20℃ 이하의 온도로 보관하였다. 꽃잎 1.5kg을 분쇄한 후, 상온(25℃)에서 48시간동안 40.0L 에탄올로 3회 추출한 후 여과하였다. 상기 여과액을 회전 증발기를 이용하여 30℃ 이하에서 용매를 제거 후 동결건조 하였다.
상기 추출물은 Diaion® HP-20 (일본 미츠비시 케미컬 컴퍼니)를 이용하여 흡착하고 알코올을 이용하여 용리시켜 풍부한 안토시아닌 분획물을 제조하였으며, 이중 안토시아닌이 풍부한 분획물을 동결건조하여 120g의 무궁화 안토시아닌 분획물(anthocyanin-rich fraction, PS)을 제조하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물은 0.2㎜ 폴리테트라 플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene, PTFE) 필터로 여과하였으며, UPLC-QTOF-MS 및 생물학적 활성 분석을 수행하였다. 추출용액은 EP 등급을 용액을 이용하였고, 크로마토그래피 용매는 LC-MS 등급을 이용하였다.
UPLC 시스템을 이용하여 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)에 포함된 안토시아닌을 분석결과 표 1과 같이 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside)) 화합물(17종)을 포함한다.
NO. I.D. Molecular
formula 		Retention time
(min) 		Calculated ion
(m/z) 		Fragments PubChem CID
1 Cyanidin-3-O-galactoside C12H21O11 + 4.34 449.1084 259, 287, 421 441699
2 Cyanidin-3-O-glucoside C21H21O11 + 4.43 449.1084 259,287. 421 44256715
3 Orientin-7-O-glucoside C27H30O16 4.61 609.1456 327, 357, 447 44257973
4 Cyanidin-3,5-O-diglucoside C27H31O16 + 4.87 611.1612 259, 287, 449 44256718
5 Isoorientinm-4'-O-glucoside C27H30O16 5.21 609.1456 193, 285, 299, 327, 357, 447 44257975
6 Isovitexin-4'-O-glucoside C27H30O15 5.32 593.1506 116, 447 154105
7 Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside* C33H40O19 5.43 739.2086 431, 447, 593 44257755
8 Isovitexin-7-O-glucoside (saponarin) C27H30O15 5.54 593.1506 283, 311, 431 441381
9 Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside (Vitexin) C21H20O10 6.02 431.0987 283, 311 5280441
10 Isovitexin-2"-O-rhamnoside C27H30O14 6.20 577.1557 293, 311, 431 44257672
11 Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside (Isovitexin) C21H20O10 6.28 431.0978 283, 311, 341 162350
12 Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside C29H32O16 6.50 635.1671 431 44257840
13 Kaempferol-O-glucoside derivative C31H34O18 6.94 693.1612 227, 255, 284, 300, 311 N.F.
14 Kaempferol-7-O-glucoside C21H20O11 7.23 447.0927 227, 255, 285 10095180
15 Kaempferol-3-O-glucoside C21H20O11 7.45 447.0927 151, 257, 285 44258798
16 Apigenin-7-O-glucoside C21H20O11 7.53 431.0978 268, 271 44257792
17 Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside) C23H22O12 7.85 489.1033 227,255, 284, 429 44258855
1.2. 세포배양 및 세포 생존율 분석
인간 HaCaT 각질 세포는 항생제 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였으며, 37℃ 온도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 유지 배양하였다.
무궁화 안토시아닌 분획물의 처리 농도에 따른 세포 생존율을 분석하고자, MTT 분석 및 유세포 분석을 수행하였다.
세포의 상대적 생존율을 분석하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. HaCaT 세포(1 × 104 세포/㎖)에 0 내지 800 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)로 24 시간 동안 처리했다. 이후 세포에 MTT 용액을 처리하고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 용액을 제거한 후 디메틸 설폭사이드를 첨가 한 다음 마이크로 플레이트 분광 광도계 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, CELENA® S 디지털 이미징 시스템 (LogosBiosystem, 경기도 안양시)을 이용하여 세포 형태를 분석하였다.
다음으로 세포 생존력, 사멸 세포 및 전체 세포의 수를 분석하고자, 유세포 분석을 수행하였다. HaCaT 각질 세포를 1 × 104 세포 /㎖의 밀도로 밤새 플레이팅하고 0 내지 800 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)로 24 시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 수득하고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 이후 Muse Cell Count & Viability Kit (Luminex Corp., Austin, TX, USA)로 5 분 동안 세포를 염색하고 Muse Cell Analyzer (Luminex Corp.)로 분석하였다.
1.3. 자외선(UVB) 조사
무궁화 안토시아닌 분획물의 피부 세포 보호 효과를 확인하고자, 2개의 실험 프로토콜을 이용하여 자외선 조사에 대한 세포 보호효과를 분석하였다. UVB 조사에는 Bio-Link BLX-E312 (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)가 사용하였다.
1) UVB 조사 전 처리
밀집도(confluent) 80%의 HaCaT 각질 세포에 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 2시간 동안 전 처리한 후, 새로운 배양액으로 교체한 후 UVB (30 mJ/㎠) 방사선에 노출시키고 18시간 동안 배양하였다.
2) UVB 조사 후 처리
밀집도(confluent) 80%의 HaCaT 각질 세포를 UVB (30nmJ/㎠) 방사선에 노출시킨 후, 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 처리하고 18시간 동안 배양하였다.
1.4. 아폽토시스 분석(사멸세포 분석: 아넥신 V 염색)
사멸세포 집단(Apoptotic cell populations)는 아넥신 V 염색을 이용하여 분석하였다. HaCaT 각질 세포는 1 × 104 세포/㎖의 밀도로 접종하고, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 전처리의 자외선에 대한 세포 보호 효과를 분석하고자 밀집도(confluent) 80%의 HaCaT 각질 세포에 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 2시간 동안 전 처리한 후, 새로운 배양액으로 교체한 후 UVB (30mJ/㎠) 방사선에 노출시키고 18시간 동안 배양하였다.
또한 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 후 처리 자외선에 대한 세포 보호 효과를 분석하고자 밀집도(confluent) 80%의 HaCaT 각질 세포를 UVB (30 mJ/㎠) 방사선에 노출시킨 후, 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 처리하고 18시간 동안 배양하였다.
이후 각 세포를 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Muse® Annexin V & Dead Cell Kit (MCH100105, EMD Millipore)로 30 분간 반응시킨 후, Muse® Cell Analyzer를 이용하여 사멸세포 집단을 분석하였다.
1.5. Caspase-3 / 7 활성 분석
HaCaT 각질 세포는 1 × 104 세포/㎖의 밀도로 접종하고 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 2시간 동안 전 처리한 후, 새로운 배양액으로 교체한 후 UVB (30 mJ/㎠) 방사선에 노출시키고 18시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 Muse® Caspase-3/7 키트(MCH100108, Luminex Corp.)로 염색 하였다. 간단히 말해서 세포를 37℃에서 30분 동안 형광성 Muse® Caspase-3/7 시약으로 인큐베이션 한 후 37℃에서 20 분 동안 7-AAD(아폽토시스 염료)로 염색하였다. Caspase-3/7 양성(+) 세포 집단은 Muse® Cell Analyzer로 측정하였다.
1.6. 세포내 ROS 분석
세포 내 ROS 양성(+) 세포 집단(populations)는 유세포 분석으로 측정하였다.
HaCaT 각질 세포는 1 × 104 세포/㎖)의 밀도로 접종하고 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 2시간 동안 전 처리한 후 UVB (30 mJ/㎠)에 노출시켰다. UVB를 3 시간 동안 노출시킨 후, 세포를 Muse® 산화 스트레스 키트(MCH100111, Luminex Corp.)를 처리한 후 30 분 동안 인큐베이션 하였다. ROS 양성(+) 세포수는 Muse® Cell Analyzer로 측정하였다.
1.7. 미토콘드리아 막 전위 및 ROS 변화 분석
HaCaT 각질 세포는 1 × 104 세포/㎖의 밀도로 접종하고 0 내지 400 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 2시간 동안 전 처리한 후 UVB (30 mJ/㎠)에 노출시켰다. UVB를 3시간 동안 노출시킨 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하였다.
무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 자외선에 의한 미토콘드리아 막 전위 변화에 미치는 영향을 분석하고자, 세포를 Muse® MitoPotential Kit (MCH100110, Luminex Corp.)를 처리하고 30분 동안 인큐베이션하고, Muse® Cell Analyzer을 이용하여 막 전위를 분석하였다.
또한, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 자외선에 의한 미토콘드리아 ROS(mtROS) 변화에 미치는 영향을 분석하고자 세포를 0.5 μM MitoTracker Green으로 30 분 동안 염색하고 MitoTEMP의 존재 및 부재하에 10분 동안 2 μM MitoSOX Red로 대조 염색하였다. 이미지는 CELENA® S 디지털 이미징 시스템을 이용하여 캡처하였다.
1.8. 웨스턴 블랏 분석
총 세포 단백질은 RIPA lysis buffer를 사용하여 준비하였다. 구체적으로 얼음에서 RIPA 용해 완충액으로 세포를 30분 동안 처리하고 용해물을 4℃에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 분석하고, -80℃에서 보관하였다.
단백질을 SDS 폴리아크릴 아미드 겔에서 분리하고 니트로 셀룰로오스 막으로 트랜스퍼한 후 1차 (200 ㎍/㎖, 1 : 1,000 희석) 및 2 차 항체 (400 ㎍/㎖, 1 : 10,000 희석)를 인큐베이션 하였다. 그후 강화된 화학 발광 플러스 키트를 사용하여 각 단백질의 발현을 수준을 분석하였다. 이미지는 ImageQuant LAS 500을 이용하여 캡처하였고, 단백질의 발현 값은 β- 액틴 수준으로 정규화하였다.
1.9. 제브라피쉬(Zebrafish)의 유지 관리
제브라피쉬(zebrafish)는 제주 대학교 축산 이용위원회의 표준 지침(2020-0018)에 따라 유지 관리하였다. 14/10 시간의 명암 주기로 28.5℃에서 자랐다. 자연 산란된 배아는 28℃에서 1% 메틸렌 블루가 첨가된 배아 배지(34.8g NaCl, 1.6g KCl, 5.8g CaCl2.2H2O 및 9.78g MgCl2.6H2O, 1L 증류수, pH 7.2)에서 배양하였다.
1.10. UVB 조사 Zebrafish 유충 및 배아의 생존율 및 부화성 평가
생존율 분석을 위해, 수정 후 2일(2 days postfertilization, 2 dpf)인 제브라피쉬 유충(n = 20)을 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 0 내지 200 ㎍/㎖에 2 시간 동안 침지시키고 UVB (150 mJ/㎠)에 노출시켰다. 생존율과 형태학적 이상은 수정 후 5일(5 dpf) 간 모니터링 하였다.
부화성 분석을 위해, 수정 후 1일(1 dpf)의 비부화 제브라피시 배아 (n = 20)를 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 0 내지 200 ㎍/㎖로 2 시간 동안 처리하고 UVB (150 mJ/㎠)에 노출시켰다. 제브라피시 배아의 부화율은 수정 후 5일(5 dpf) 간 모니터링 하였다.
1.11. Zebrafish 유충의 총 ROS 및 mito ROS 검출
DCFDA(형광 프로브)를 사용하여 UVB 조사 후 zebrafish 유충에서 세포 내 총 ROS 생성을 분석하였다. 수정 후 2일(2 dpf) 제브라피쉬 유충(n = 20)을 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)(0-200 ㎍/㎖)에 2 시간 동안 처리하고 UVB 방사선(150mJ / ㎠)에 노출시켰다. 세포 내 총 ROS 생산을 염색하기 위해 유충은 UVB 방사선에 노출 된 후 1 시간 동안 20 μM DCFDA로 염색하였다. mtROS 분석을 위해 유충은 μM MitoTEMP가 포함 된 배아 배지에 10 μM MitoSOX Red 및 5 μM MitoTracker Green을 30 분 동안 넣고 신선한 배지로 두 번 세척하였ㄷ. 그런 다음 0.04% 트리칸 메탄 설포네이트 용액에서 유충을 마취하고 CELENA® S 디지털 이미징 시스템으로 형광 이미지를 캡처하였다.
<결과>
2.1. 세포독성 분석
무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하고자, 0 내지 800 ㎍/㎖의 농도로 HaCaT 각질 세포에 24시간 처리한 후 MTT 분석 및 유세포 분석을 수행하였다.
HaCaT 각질 세포에서 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 세포독성을 평가하고자 0 내지 800 ㎍/㎖의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 24 시간 동안 세포를 처리하고 MTT 분석을 수행하였다. 800 ㎍/㎖ 농도는 비처리 대조군과 비교하여 상대 세포 생존율이 73.4 ± 3.4% 로 현저하게 감소했으며, 400 ㎍/㎖ 농도 미만에서는 세포 독성이 나타나지 않았다(도 1A). 또한 현미경 사진역시 MTT 결과와 동일하게 최고 농도 (800μ㎍/㎖)는 다른 농도 또는 비처리 군과 비교하여 세포 수가 약간 감소한 것을 확인하였다(도 1B).
다음으로 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)가 HaCaT 각질 세포의 세포 생존력, 사멸세포 및 총 세포 수에 미치는 영향을 추가적으로 확인하고자 동일한 실험 조건에서 유세포 분석을 수행하였다(도 1C).
비처리 세포에서 세포 생존율을 96.5 ± 1.3 %로 나타났으며 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 800 ㎍/㎖ 처리시 세포 생존력이 80.7 ± 1.6 % 로 크게 감소하였다(도 1D). 총 세포 수는 비처리한 경우 (18.8 ± 1.3) × 105 세포/㎖로 나타났으나 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 800 ㎍/㎖ 처리시 (6.4 ± 0.3) × 105 세포/㎖로 크게 감소하였다(도 1E). 또한 사멸세포 집단은 비처리 7.2 ± 1.3 %과 비교하여 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 800 ㎍/㎖ 처리시 19.3 ± 1.6 % 로 크게 증가하였다(도 1F). 이는 H2O2 처리 된 세포와 동일한 수준이었다.
그러나 400 ㎍/㎖ 농도 미만에서는 생존 세포 수, 생존력 및 사멸세포 집단이 비처리군과 유사한 수준으로 유지되었다. 즉 400 ㎍/㎖ 농도 미만에서 안토시아닌 분획물(PS)이 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 따라서 이후 실험에서는 400 ㎍/㎖ 농도 미만의 농도를 이용하였다.
2.2. 처리 조건(전처리/후처리)에 따른 UVB 보호효과 비교
다음으로 무궁화 안토시아닌 분획물의 피부 세포 보호 효과를 확인하였다. HaCaT 각질 세포에서 UVB 방사선(30 mJ/㎠) 노출 전 또는 노출 후의 무궁화 안토시아닌 분획물의 처리한 후, 아폽토시스에 대한 보호 효과를 비교 분석하였다.
HaCaT 각질 세포를 무궁화 안토시아닌 분획물(0-400 ㎍/㎖)을 2 시간 동안 전처리한 후 UVB 노출한 전처리 조건과, 세포를 UVB 방사선에 노출시킨 다음 무궁화 안토시아닌 분획물(0-400 ㎍/㎖)로 18 시간 동안 처리한 후 처리 조건에서 세포의 생존율을 분석하였다.
MTT 분석 결과, UVB에 노출되지 않은 세포와 비교하여 UVB 처리한 세포의 상대적 생존율을 68.8 ± 1.4 %로 현저하게 감소하여 UVB가 세포의 생존율을 감소하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물을 전 처리한 경우, 세포의 상대적 생존력은 무궁화 안토시아닌 분획물의 농도 의존적으로 회복 되였다(도 2A). 반면, 후 처리 조건에서는 UVB 노출에 의해 감소된 세포 생존력을 회복하지 못함을 확인하였다(도 2B).
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물의 전 처리가 UVB 유도 세포독성에 대해 세포보호 효과를 나타냄을 확인하였다.
다음으로 HaCaT 각질 세포에서 무궁화 안코시아닌 분획물의 UVB 유도 아폽토시스(apoptosis)에 대한 보호 효과를 확인하였다. 구체적으로 Muse® Annexin & Dead Cell Kit로 염색한 후, 유세포 분석을 수행하였다.
분석결과, UVB (30 mJ/㎠)가 현저한 아폽토시스(32.6 % ± 0.8 %)를 유도함을 확인하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물 전 처리시 아폽토시스 비율이 크게 감소하였다. 200 및 400 ㎍/㎖ 농도로 전 처리한 세포에서 UVB로 유도된 아폽토틱 세포(apoptotic cells)는 각각 25.8 ± 0.3% 및 16.1 ± 0.9%로 아폽토틱 세포(apoptotic cells) 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 2C). 반면, 무궁화 안토시아닌 분획물을 400 ㎍/㎖ 농도로 후 처리한 경우 UVB로 유도된 아폽토틱 세포(apoptotic cells)이 21.9 ± 0.2 %로 전 처리 조건과 비교하여 UVB에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 보호 효과가 낮음을 확인하였다.
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물의 전 처리가 후처리 조건과 비교하여 HaCaT 각질 세포에서 UVB로 유도 아폽토시스 억제하여 세포 보호에 효과적임을 확인하였다.
2.3. Caspase 3 / 7 의 발현 변화 분석
다음으로 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)가 PARP, caspase-3와 같은 세포 사멸 조절 핵심 분자를 ??억제하여 UVB 매개 세포 사멸을 예방하는지 조사 하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, UVB 노출은 active capase-3의 발현을 현저하게 증가시키고 그에 따른 PARP의 절단을 증가시킨다. 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 100 ㎍/㎖에서는 이를 억제하지 않으나, 200 내지 400 ㎍/㎖ 농도로 처리시 이들의 발현을 현저하게 억제되었다(도 3A).
또한 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 UVB 노출에 의해 유도되는 카스파제-3/7 신호 전달 경로 억제하여 아폽토시스 억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로 UVB 노출시 카스파제?3/7 양성(+)인 아폽토시스 HaCaT 각질 세포의 총 집단이 16.2 ± 0.4 %에서 33.1 ± 0.9 %로 크게 증가했으며, 이를 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 200 또는 400 ㎍/㎖ 처리시 각각 26.4 ± 1.2% , 19.6 ± 0.6 %로 현저히 감소하였다(도 3B).
다음으로 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 caspase-3/7 신호 전달 경로를 억제하여 UVB로 유도 된 apoptosis를 억제하는지 여부를 조사하였다. 구체적으로 pan-caspase 억제제 인 z-VAD-FMK를 전처리하고 유세포 분석을 이용하여 caspase-3/7 양성(+)인 아폽토시스 HaCaT 각질 세포 집단을 분석하였다. UVB 노출시 caspase-3/7+ 아폽토틱 세포(apoptotic cells)는 29.8 ± 0.4% 나타났다. 그러나 z-VAD-FMK를 사용한 전처리는 caspase-3/7+ 아폽토틱 세포(apoptotic cells)의 비율을 8.5 ± 0.4%로 크게 하향 조절하였다(도 3C).
상기 결과를 통해, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)가 카스파제-3/7 활성을 억제하여 HaCaT 각질 세포에서 UVB-유도 apoptosis를 감소시킴을 확인하였다.
2.4. 제브라피쉬 유충 및 배아에서 UVB 보호 효과 분석
제브라피쉬 유충의 UVB 유발 손상(사망, 형태학적 이상 등)에 대한 PS의 보호효과를 평가하고자, 수정 후 2일(2 dpf)의 제브라피쉬 유충을 0 내지 200 ㎍/㎖에 2 시간 동안 처리한 후 150 mJ/㎠ UVB에 노출시켰다(도 4A, 상단). UVB 노출 후 5 dpf에 제브라피시 유충의 약 30%가 사망하였다(도 4A). 남아있는 모든 유충(70%)은 심각한 형태학적 이상을 나타냈다(도 4B, 왼쪽). 이 중 25%는 심낭 부종(b), 25%는 난황낭 부종(c), 8.3%의 출혈성 병변(e)이 발생하였다. 또한 UVB에 노출된 일부 제브라피시 유충의 8.3 %는 심낭 부종(b) 및 난황낭 부종(c)을 동시에 나타냈으며 16.7 %는 난황낭 부종(c) + 짧은 꼬리(g)를 동시에 나타냈다(도 4B, 왼쪽 및 도 4C).
반면, 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우, 유충의 UVB 유도 사망과 형태학적 이상이 완전히 차단되었다(도 4A 및 도 4B). 100 ㎍/㎖의 PS 농도는 UVB 유발 사망률을 95%까지 억제하였다. 반면 50 ㎍/㎖의 저농도로 처리시 80%의 사망률로 중간정도의 억제효과를 나타냈으며 남아있는 제브라피시 유충은 어떠한 이상도 나타내지 않았다(도 4A 및 도 4B, 오른쪽). 즉 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 UVB 노출에 의해 유도되는 제브라피시의 형태학적 이상과 사망을 감소시켜 UVB에 대한 보호효과를 나타냄을 확인하였다.
다음으로 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 제브라피시 배아에서 UVB로 인한 부화성 감소를 회복할 수 있는지 확인하였다. 1 dpf 제브라피쉬 배아를 0 내지 200 ㎍/㎖ 무궁화 안토시아닌 분획물로 2 시간 동안 처리한 후 150mJ/㎠ UVB에 노출 시켰다(도 4D, 상단).
도 4D (아래)를 참조하면, UVB 조사된 경우 5 dpf에 제브라피시 배아의 10%만 부화되었다. 그러나 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 200 ㎍/㎖에 처리한 경우 점차적으로 부화성이 증가하고 4 dpf에서 90%에 도달하였다. 또한 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 농도를 처리한 경우 5dpf에서 각각 35 % 및 70 %로 부화성이 증가하였다.
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물이 UVB 노출에 의한 제브라피시 유충의 사망률과 형태학적 이상을 약화시키고 UVB 노출된 제브라피시 배아에서 부화성을 회복시킴을 확인하였다.
2.5. 세포내 ROS 생성 억제 효과
우리는 PS가 UVB 유도 세포 내 ROS 생산을 하향 조절하여 제브라피시(zebrafish) 유충의 생존율을 증가시키는지 확인하였다.
유세포 분석 결과, UVB 노출이 세포 내 ROS+ HaCaT 각질 세포를 68.8 ± 1.5%로 크게 증가하였다(도 5A). 그러나 PS 처리는 농도 의존적 ??적으로 UVB로 유도 된 ROS+ 세포 집단을 강력하게 감소하였다 (각각 200 및 400 ㎍/㎖ 농도 처리시 28.0 ± 0.9% 및 19.1 ± 0.1%). 400 ㎍/㎖ 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물을 처리한 경우, NAC 처리 된 세포 (19.0 ± 0.5%)만큼 UVB로 유도 된 ROS+ 세포 수를 감소 시켰으며, 이는 처리되지 않은 세포와 유사한 수준(19.0 ± 0.5%)이었다.
100 ㎍/㎖의 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 처리한 경우, ROS + 세포 수 (64.0 ± 2.9%)는 UVB 노출한 세포와 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않았다.
또한 NAC 처리는 UVB로 유도된 아폽토시스를 39.4 ± 0.5 %에서 14.3 ± 1.4%로 현저하게 감소시켰으며, 이는 400 ㎍/㎖ 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물을 처리한 세포와 거의 동일하였다(16.1 ±1.5 %, 도 5B).
UVB로 인한 산화 스트레스에 대한 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 생체 내 효과를 추가로 확인하기 위해 zebrafish 유충에서 세포 내 ROS 생성을 분석하였다(도 5C). UVB 노출 제브라피시 유충의 ROS는 현저하게 증가했으며, UVB 비노출 제브라피시(5.5 ± 1.3%)에 비해 100.0 ± 23.9%에 도달하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 처리한 경우, UVB 처리 된 제브라피시 유충과 비교하여 의존적으로 UVB 유도 ROS 수준이 농도 감소하였다(각각 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 에서 74.0 ± 6.1 %, 18.9 ± 4.6 % 및 13.5 ± 3.2 %)(도 5C 및 도 5D).
또한 UVB 조사 후 24 시간에 제브라피시 유충의 생존율을 약 65 %로 크게 감소하였으며 , NAC로 처리시 생존율이 거의 회복되었다(도 5E).
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 HaCaT 세포와 제브라피시 유충 모두에서 UVB로 유도 된 세포 내 ROS 생성을 하향 조절하여 산화 스트레스 매개 세포 사멸 및 사망을 억제시킴을 확인하였다.
2.6. 미토콘드리아 탈분극 및 mtROS 생성 억제 효과
다음으로, 우리는 UVB에 의한 미토콘드리아 탈분극 및 mtROS 생산에 대한 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)의 효과를 분석하였다.
유세포 분석결과, UVB 노출되지 않은 HaCaT 각질 세포에서 미토콘드리아 탈분극된 세포는 약 9.4 ± 0.8%로 측정되었으나, UVB 노출에 의해 미토콘드리아 탈분극이 59.8 ± 1.0%로 크게 증가하였다. 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리는 UVB로 유도된 미토콘드리아 탈분극을 농도 의존적으로 현저하게 감소시켰다. 구체적으로 100, 200 및 400 ㎍/㎖ 농도의 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리시 각 58.4 ± 1.6%, 26.7 ± 1.0% 및 16.7 ± 0.4%로 감소하였다(도 6A).
면역형광 염색은 또한 UVB가 미토콘드리아(MitoTracker Green)에서 mtROS(MitoSOX Red) 생산을 유의하게 증가시킴을 확인하였으며, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리는 UVB에 의한 mtROS 생성을 완전히 억제하였다(도 6B). 또한 mtROS 억제제인 MitoTEMP를 전처리시 UVB로 유도된 아폽토시스를 41.8 ± 0.7%에서 13.8 ± 1.4%로 크게 감소 시켰으며, 이는 UVB에 노출되지 않은 대조군 및 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리한 후 UV 노출한 세포의 수준과 유사하였다(도 6C).
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)이 UVB 노출에 의해 유도된 탈분극을 감소시켜 미토콘드리아 막 전위를 안정화시키고 결과적으로 과도한 mtROS 생산을 감소시킴을 확인하였다.
2.7. 제브라피쉬(Zebrafish)에서 mtROS 생성 억제 효과
무궁화 안토시아닌 분획물의 UVB 조사 제브라피시 유충의 mtROS 생성 억제 및 사멸 방지 효과를 추가 분석하고자, MitoSOX Red 및 MitoTracker Green로 면역형광 염색하였다.
UVB은 제브라피시 유충의 미토콘드리아에서 mtROS 생성을 현저하게 유도했다. 그러나 무궁화 안토시아닌 분획물(PS) 처리시 농도 의존적으로 UVB에 의한 mtROS 생성이 감소하였다. 또한 MitoTEMP(mtROS 억제제) 처리시 제브라피시 유충에서 UVB에 의한 mtROS 생성도 억제되었다. 또한 UVB 방사선은 제브라피시 유충의 생존율을 약 65%로 크게 감소 시켰고 MitoTEMP 처리는 생존율을 약 90%로 증가시켜 UVB에 대해 보호효과를 나타내었다(도 7B).
즉, 무궁화 안토시아닌 분획물이 제브라피시 유충에서 UVB로 유도 된 mtROS의 과도한 생산을 감소시켜 사망률을 감소시킴을 확인하였다.
2.8. UVB 유도 ER 스트레스 억제 및 mtROS 생산 억제 효과 분석
UVB이 ER 스트레스 유도에 미치는 영향을 평가하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하여 ER 스트레스 생성 단백질의 발현 분석하였다.
UVB 조사한 HaCaT 각질 세포에서 0 내지 24시간 동안 GRP78, ATF4, p-eIF1α 및 CHOP의 발현을 분석하였다. UVB는 HaCaT 세포에서 GRP78, ATF4, p-eIF1α 및 CHOP의 발현을 유의하게 증가 시켰으며, 총 p-eIF1α의 발현은 지속되었다. 구체적으로 GRP78, ATF4 및 p-eIF1α는 6 시간에서 18 시간까지 발현된 다음 24 시간에 점차 감소하였다. CHOP는 18시간에 발현되었고 24 시간에 부분적으로 감소하였다(도 8A).
따라서 HaCaT 각질 세포에 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)을 처리하고, UVB 조사 후 18 시간에 ER 스트레스 생성 단백질의 발현 변화를 분석하였다.
분석결과, 무궁화 안토시아닌 분획물(PS)은 농도 의존적으로 ER 스트레스 생성 단백질의 발현을 감소시켰다. 특히 400 ㎍/㎖에서 UVB에 의한 GRP78, ATF4, p-eIF1α 및 CHOP의 발현을 현저하게 억제되었다(도 8B).
다음으로, PS가 ER 스트레스의 감쇠를 통해 UVB 조사 mtROS 생산을 억제하는지 확인하고자, ER 스트레스 억제제인 salubrinal을 UVB 조사 2 시간 전에 2 dpf 제브라피시 유충에 처리한고, 무궁화 안토시아닌 분획물 처리 유충과 비교 분석하였다.
예상대로, UVB 미처리시 무궁화 안토시아닌 분획물 또는 salubrinal 전 처리한 유충에서 mtROS 생성에 변화가 나타나지 않았으며, UVB 조사 유충에서 현저하게 mtROS 생성이 증가하였다(도 8C). salubrinal을 전처리한 경우 무궁화 안토시아닌 분획물과 유사한 수준으로 UVB 유도 mtROS 생성을 현저히 감소하였다. 또한 UVB 조사는 zebrafish 유충의 생존율을 약 60%로 감소 시켰고 salubrinal을 전처리에 의해 생존율을 약 85%로 강력하게 증가하였다. 이는 무궁화 안토시아닌 분획물 전처리 유충과 유사한 수준이었다(도 8D, 도 4A).
즉, UVB 조사가 ER 스트레스와 그에 따른 mtROS 생산을 유도하여 사망률을 증가시키며, 무궁화 안토시아닌 분획물이 ER 스트레스를 억제하여 UVB에 대한 보호 효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 무궁화 꽃잎의 에탄올 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 화장료 조성물로서,
    상기 무궁화는 '불새'(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae') 품종인,
    자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에서 있어서,
    상기 분획물은 시아니딘-3-O-갈락토시드(Cyanidin-3-O-galactoside), 시아니딘-3-O-글루코시드(Cyanidin-3-O-glucoside), 오리엔틴-7-O-글루코시드(glucoside Orientin-7-O-glucoside), 시아니딘-3,5-O-디글루코시드(Cyanidin-3,5-O-diglucoside), 이소오리엔틴-4'-O-글루코시드(Isoorientin-4'-O-glucoside), 이소비텍신-4'-O-글루코시드(Isovitexin-4'-O-glucoside), 비텍신-4'-O-글루코시드-2''-O-람노시드(Vitexin-4'-O-glucoside-2''-O-rhamnoside), 이소비텍신-7-O-글루코시드(Isovitexin-7-O-glucoside), 아피게닌-8-C-β-D-글루코피노시드(Apigenin-8-C-β-D-glucopyranoside), 이소비텍신-2"-O-람노시드(Isovitexin-2"-O-rhamnoside), 아피게닌-6-C-β-D- 글루코피노시드(Apigenin-6-C-β-D-glucopyranoside), 아피게닌-6-C-글루코시드-7-(6"-O-아세틸)-글루코시드(Apigenin-6-C-glucoside-7-(6"-O-acetyl)-glucoside), 캠퍼롤-O-글루코시드 유도체(Kaempferol-O-glucoside derivative), 캠퍼롤-7-O-글루코시드(Kaempferol-7-O-glucoside), 캠퍼롤-3-O-글루코시드(Kaempferol-3-O-glucoside), 아피게닌-7-O-글루코시드(Apigenin-7-O-glucoside) 및 캠퍼롤-3-(6''-아세틸글루코시드)(Kaempferol-3-(6''-acetylglucoside))로 이루어진 군에서 선택되는 플라보노이드를 포함하는 것인,
    화장료 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 자외선은 자외선 B(ultraviolet-B, UV B)인 것인, 화장료 조성물.
  7. 무궁화 꽃잎의 에탄올 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 자외선에 의한 피부 보호용 의약외품 조성물로서,
    상기 무궁화는 '불새'(학명 : Hibiscus syriacus 'Pulsae') 품종인,
    자외선에 의한 피부 보호용 의약외품 조성물.
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