KR102448592B1 - 발효아마인추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아마인추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부에 유발되는 염증을 효과적으로 개선 또는 완화할 수 있으며, 피부 보습효과가 우수한 화장료 조성물을 제공한다.

Description

발효아마인추출물을 포함하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition with fermented flax seed extract}

본 발명은 아마(Linum usitatissimum)의 씨앗인 아마인의 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 퍼콜레이션 추출법으로 추출함에 따라 향기 성분이 증진된 발효아마인추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 가장 중요한 기능 중 하나는 장벽으로서의 보호기능이다. 외부 환경에 직접 노출되는 피부는 체액의 손실을 막고 유해한 환경으로부터 신체를 보호하는 가장 중요한 일차 방어선이다. 또한, 독성 물질이나 미생물, 물리적인 자극이나 자외선에 대한 장벽기능을 수행하고 있다. 그러나 피부장벽은 피부 외, 내부의 다양한 자극에 의해 손상되어 피부가 건조해지거나 피부에 염증반응을 일으킬 수 있다.

피부에서의 염증반응(inflammatory response)은 물리적 자극이나 화학 물질, 세균 등에 의해 피부손상이 유발될 때 이를 방어하기 위한 작용으로서 시작되며, 다양한 면역세포와 염증 유도 사이토카인이 관여한다. TNF-α(tumor mecrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β), IL-6(interleukin-6) 등이 대표적인 염증 유도 사이토카인이다.

TNF-α는 그람음성세균 감염에 의해서 생산되며 세균의 세포막에 있는 내독소(endotoxin)인 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)에 의해 활성화된 림프구에 의해서 만들어지고, 백혈구나 혈관세포에 작용하여 국소적인 염증 반응을 일으켜 항원을 제거한다. IL-1β는 활성화된 단핵식균세포, 상피세포, 혈관내피세포에 의해 만들어져 염증반응을 매개하는 전형적인 사이토카인이다. IL-6는 T 세포 및 대식세포에 의해 분비되어 면역 반응을 자극하며 염증 촉진 및 항염증(pro-inflammatory and anti-inflammatory)사이토카인이다.

또한 활성화된 대식세포(macrophage)는 염증 유도 사이토카인뿐만 아니라 일산화질소(nitric oxide: NO)나 프로스타글란딘(prostaglandin) E2 (PGE2)를 과도하게 생성하여 염증 과정을 더욱 활성화시킨다.

대한민국 등록특허 제10-1987167호(2019.06.03.)에는 피부 보습 및 피부장벽 강화용 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1471818호(2014.12.05.)에는 피부자극완화 및 피부염증완화용 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 아마의 씨앗인 아마인을 이용하여 피부 염증을 유발하는 산화질소의 생성을 억제하고 염증성 사이토카인의 발현을 억제함에 따라 피부 염증을 개선 또는 완화하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 아마의 씨앗인 아마인을 이용하여 피부 보습 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 퍼콜레이션 추출방법을 이용함에 따라 향기성분이 증진된 발효아마인추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 발효아마인추출물을 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발효아마인추출물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 발효는, 아마인과 효모를 혼합하고, 25~35℃에서 18~36시간 발효한 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효아마인추출물은, 추출용매로 정제수를 이용한 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효아마인추출물은, 퍼콜레이션(percolation) 추출방법을 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

본 발명은 발효아마인추출물을 포함함에 따라 피부에 유발되는 염증을 효과적으로 개선 또는 완화하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 발효아마인추출물을 포함함에 따라 피부 보습효과가 우수한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 퍼콜레이션 추출 방법을 이용함에 따라 아마인의 향기 성분을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다.

도 1은 용매에 침지하여 추출한 발효아마인추출물의 향기 성분 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 퍼콜레이션 추출방법으로 추출한 발효아마인추출물의 향기 성분 분석 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 발효아마인추출물을 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 발효아마인추출물을 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

아마인은 아마(flax)의 씨앗으로, 납작하고 긴 타원 모양이며 노란빛이나 갈색을 띤다. 아마인은 향신료로도 사용하는데 노란색 아마인은 고소한 맛에 식감이 부드럽고, 갈색 아마인은 쌉쌀한 맛이 난다. 씨앗 자체를 볶아 견과류처럼 섭취하며, 쿠키, 샐러드 등에 첨가하거나, 가루로 제조하여 음료에 섞어 마시기도 한다. 아마인 오일은 샐러드 드레싱으로 활용하기도 한다. 아마인은 심혈관계 질환이나 심장질환을 예방할 수 있으며 항암효과가 있는 리그난이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효는, 바람직하게는 효모를 10⁷~10⁸ CFU/㎖ 농도가 되도록 첨가하고, 25~35℃에서 18~36시간 배양하는 것을 말한다. 본 발명의 발효아마인추출물은 발효과정을 통해 염증 관련 사이토카인의 발현을 더욱 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효아마인추출물은, 당업계에 공지된 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 일 예로 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매를 이용하여 제조할 수 있으나, 바람직하게는 정제수를 이용하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 발효아마인추출물은, 당업계에 공지된 통상적인 조건에서 추출될 수 있으나, 바람직하게는 퍼콜레이터를 이용하여 10~80℃에서 1~9시간 퍼콜레이션 추출하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 15~35℃에서 1~3시간 퍼콜레이션 추출하는 것이 좋다. 상기 범위 내에서 추출할 경우 발효아마인추출물의 유효성분을 가장 효과적으로 추출할 수 있다. 퍼콜레이션(percolation) 추출방법은 원료를 퍼콜레이터(percolator)에 넣고, 상부로부터 용매를 연속적으로 첨가하여, 하부에서 추출액(퍼콜레이터 액)을 얻은 후, 이를 다시 용매로 이용하여 반복적으로 추출을 수행하여 유효성분을 추출하는 방법을 말한다. 본 발명에서는 이 방법을 수행함으로써 유용한 효능성분의 파괴를 막을 수 있었고, 향기 성분이 잘 보존된 추출물을 수득할 수 있었다.

본 발명의 발효아마인추출물은 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

본 발명의 발효아마인추출물은 농도 의존적으로 NO 억제 효과가 증가하는 점을 확인하였으며, 또한 염증 관련 사이토카인 발현 저해 효과도 우수한 것으로 나타났다. 특히 본 발명의 발효아마인추출물은 발효 과정을 거침에 따라 염증성 사이토카인 발현 억제 효과가 더욱 높아지는 점을 확인하였다.

본 발명의 발효아마인추출물은 피부 보습인자의 발현을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 특히 HAS-2와 AQP-3 발현을 증가시키는 점을 확인하였다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 발효아마인추출물은, 바람직하게는 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30.0 중량%로 함유하는 것이 좋다. 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명에서 확인한 피부 자극 완화 또는 항염증 효과가 미미할 수 있으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 제형 안정성에 문제가 발생할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30.0 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실라카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실시예 1 : 발효아마인추출물 제조]

아마인을 정제수로 세척한 뒤 아마인과 동량의 정제수를 넣고, 효모를 10⁷~10⁸ CFU/㎖ 농도가 되도록 첨가한 후, 30℃ 온도에서 24시간 배양하였다. 80℃에서 10분간 열을 가하여 발효를 종료하여 아마인발효물을 제조하였다.

아마인발효물 200g을 정제수 4L에 넣고 퍼콜레이터(TK-CE-213, TAEBANG ENGINEERING & MANUFACTURING CO., LTD) 25℃에서 2시간 퍼콜레이션하여 1차 추출하였다. 1차 추출물을 100 메쉬의 여과포로 여과하여 1차 여과액을 얻고, 이렇게 얻은 1차 여과액을 용매로 사용하여 상기 잔사(1차 추출이 기 수행된 아마인발효물)를 2차 추출하였다. 이렇게 얻은 2차 추출물을 상온에서 와트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 동결건조하여 발효아마인 퍼콜레이션추출물을 제조하였다.

[비교예 1 : 아마인추출물 제조]

아마인 200g을 정제수 4L에 넣고 퍼콜레이터(TK-CE-213, TAEBANG ENGINEERING & MANUFACTURING CO., LTD) 25℃에서 2시간 퍼콜레이션하여 1차 추출하였다. 1차 추출물을 100 메쉬의 여과포로 여과하여 1차 여과액을 얻고, 이렇게 얻은 1차 여과액을 용매로 사용하여 상기 잔사(1차 추출이 기 수행된 아마인)를 2차 추출하였다. 이렇게 얻은 2차 추출물을 상온에서 와트만(Whatman) 2번 여과지로 여과하여 불용성 물질을 제거하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치에서 60℃로 감압농축한 후 동결건조하여 아마인 퍼콜레이션추출물을 제조하였다.

[실험예 1 : 발효아마인추출물의 세포독성 확인]

본 실험에서는 상기 실시예 1에서 제조한 발효아마인추출물의 세포독성을 확인하였다. 세포주는 human keratinocyte 인 HEKa 이며 사용된 배지는 Medium 154, 배양 조건은 37℃, 5% CO₂ 를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 발효아마인추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 96 well plate에 세포를 1×10⁴ cell/㎖로 분주한 다음 세포 배양조건에서 18시간 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, 발효아마인추출물을 10, 100, 500 ㎍/㎖ 농도로 처리하고, 새로운 배지를 넣어 18시간 동안 배양하였다. 18시간 이후, 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution(5mg/㎖)을 첨가 한 후 4시간 동안 형성된 fomazan을 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 로 녹이고 흡광도를 측정하였다.

시료	Concentration (㎍/㎖)	Cell viability (%)
Control	0	100
비교예 1	10	126.15±1.55
	100	106.24±0.23
	500	92.35±0.15
실시예 1	10	120.24±0.36
	100	101.22±1.24
	500	87.56±2.98

상기 표 1에서 보듯이, 발효아마인추출물은 100 ㎍/㎖ 내에서 세포 독성이 나타나지 않았다.

[실험예 2 : 발효아마인추출물의 NO 생성 저해능 확인]

본 실험에서는 발효아마인추출물의 NO 생성 저해능을 확인하였다. 염증반응은 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인 등에 의해 활성화 되어 염증성 사이토카인, nitric oxide (NO)와 prostaglandinE2 (PGE2)를 생성함으로써 염증반응을 유발한다. 이중 NO는 활성산소의 일종으로 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로서, 염증반응을 가속화시키기 때문에 NO와 같은 염증매개물을 효과적으로 억제시키는 것이 중요하다.

NO의 농도는 cell lysate 내의 nitrite 농도를 NO detection kit(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 측정하였다. HEKa 세포를 1×10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 18시간 배양하여 부착시킨 후 발효아마인추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 배양 후 200 mJ/cm₂ UVB(UVP Crosslinkers, UVP, UK)에 노출시킨 뒤 24시간 배양한 후 NO detection kit의 치침에 따라 수행하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다. 양성대조군으로는 하이드로코르티손(hydrocortison)을 사용하였다.

시료	Concentration (㎍/㎖)	UVB	Nitric oxide production(μM)
Control	0	-	10.42
	0	+	37.98±0.97
비교예 1	10	+	36.15±1.02
	25	+	31.21±0.02
	50	+	31.44±2.88
	100	+	27.10±4.12
실시예 1	10	+	36.51±1.20
	25	+	31.72±0.08
	50	+	27.82±4.36
	100	+	27.18±2.12
Hydrocortison	10μM	+	14.13±0.69

표 2에서 보듯이, 본 발명의 발효아마인추출물과 아마인추출물은 모두 농도 의존적으로 NO 억제능이 증가하는 점을 확인하였다.

[실험예 3 : 발효아마인추출물의 염증 관련 사이토카인 발현 저해능 확인]

본 실험에서는 발효아마인추출물의 염증 관련 사이토카인에 대한 발현 저해 효과를 확인하였다.

염증은 UVB, lipopolysacharide(LPS)와 같은 외부 자극에 의해 Interleukin (IL)및 Tumor necrosis factor(TNF)-α와 같은 염증 관련 사이토카인이 과도하게 생성되면서 유발된다. NF-κB 는 LPS, TNF, Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 자외선 등 각종 자극에 의해 활성화되며, 생체 세포 내 어디에서나 존재하여 다양한 경로로 염증 반응에 관여한다. 염증 매개 물질의 합성에 중심적인 역할을 하는 조절 효소 중 cyclooxygenase (COX)-2는 염증 반응을 비롯한 외부 자극에 대한 여러 생체 반응에서 초기에 발현되는 유전자로 밝혀졌다. 이러한 염증성 사이토카인들은 피부 각질 형성 세포로부터 분비되어 피부의 염증 반응을 시작하는데 관여하므로 본 시험에서는 피부각질형성세포에 UVB를 조사하여 염증을 유도한 후 시료 처리로 인해 염증 관련 인자들의 발현이 억제되는지를 확인하였다.

사람 각질 형성 세포주(human epidermal keratinocyte)인 HEKa세포를 5×10⁵ cells/well의 농도로 분주하고 37℃, 5%의 CO₂ 하에서 1X의 human keratinocyte growth supplement(HKGS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 100 units/mL의 streptomycin(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가한 basal medium(Medium 154, Gibco) 에서 2일간 배양하였다. 배양된 HEKa 를 PBS로 세척하고 발효아마인추출물을 농도 별로 준비 후 세포에 처리하여 37℃, 5%의 CO₂ 하에서 2일간 배양 하였다. 배양 후 200 mJ/cm² UVB(UVP Crosslinkers, UVP, UK)로 세포 손상 유도 후 배지를 교체하여 1일간 배양하였다.

항염 관련 유전자의 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 TRizol reagent를 사용하여 추출하였고 RNA 수득율은 260 nm에서 흡광도로 측정하여 정량한 후 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 실시하였다. cDNA합성은 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)를 이용하였고 PCR은 cDNA로부터 Taq polymerase Kit(TaKaRa)와 특정 primer로 증폭하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 image analyzer(KOREALABTECH, Bundang, Korea)로 확인하였다. 모든 primer는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 주문 제작하였고 각 primer의 서열은 아래 표 3에 나타내었다.

프라이머	서열
IL-1α	Forward: 5'-GGA AGG TTC TGA AGA AGA GAC G-3' Reverse: 5'-GAG GTT GGT CTC ACT ACC TGT GAT-3'
IL-6	Forward: 5'-ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GC-3' Reverse: 5'-GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G-3'
COX-2	Forward: 5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT-3' Reverse: 5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'
TNF-α	Forward: 5'-CAT TCT GGG AGG GGT CTT CC-3' Reverse: 5'-GGT TGA GGG TGT CTG AAG GA-3'
NF-κB	Forward: 5'-TCT CAG CAA TGT CAA CGA C-3' Reverse: 5'-TTT ATG CCT ACA GCC TCC T-3'

피부각질형성세포에 UVB를 조사하여 염증을 유도한 후 시료 처리로 인해 염증 관련 인자들의 발현량을 분석하여 아래 표 4에 나타내었다.

	UVB	Cont (㎍/㎖)	IL-1α 발현량(%)	IL-6 발현량(%)	COX-2 발현량(%)	TNF-α 발현량(%)	NF-κB 발현량(%)
Control	-	0	7.97±0.89	8.80±3.95	8.19±0.99	8.40±0.13	13.50±1.20
	+	0	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
비교예 1	+	10	72.68±4.15	95.11±2.44	59.14±3.74	53.28±0.08	92.74±6.15
	+	25	64.72±2.73	90.22±3.14	50.98±4.11	50.12±1.22	80.88±2.56
	+	50	62.11±4.11	81.94±1.26	45.12±1.36	48.72±1.44	58.26±1.56
실시예 1	+	10	45.13±5.13	88.95±1.56	42.15±9.21	46.19±3.14	88.66±0.23
	+	25	44.11±3.64	83.22±0.18	38.22±2.54	42.89±2.35	61.24±1.97
	+	50	42.56±2.18	79.21±2.43	35.14±1.45	42.03±2.74	53.98±1.68
Hydro cortisone	+	10μM	30.94±1.08	37.13±7.18	47.04±7.05	45.83±4.65	32.75±1.08

표 4에서 보듯이, UVB에 의해 유도된 염증 관련 사이토카인들이 발효아마인추출물 처리에 의해 감소되는 점을 확인하였으며, 특히 발효과정을 거치지 않은 비교예 1에 비해 사이토카인 발현 억제 효과가 높은 점을 확인하였다.

[실험예 4 : 발효아마인추출물의 보습 효능 확인]

본 실험에서는 발효아마인추출물의 보습 효과를 확인하고자 피부 보습인자들의 발현능을 확인하였다.

피부를 건강하게 유지하기 위해서는 각질층에 수분이 함유되어 있어야 하며 인체 피부조직에서 세포 외부 기질에 주로 분포하는 hyaluronic acid(HA)는 glycosaminoglycan(GAG)의 일종으로 수분과의 결합력이 탁월하여 피부의 수분유지에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. HA를 합성하는 효소인 hyaluronan shynthase(HAS) 2와 3은 피부 표피에서 발현되며, 자외선에 노출된 피부에서 유의적으로 감소한다. 각질층에서 수분을 유지하기 위해서는 피부 장벽 기능이 정상적으로 작동해야 하며 피부 장벽 단백질은 피부 구조를 이루고 있는 중요한 요소로 외부 항원이 체내로 유입되는 것을 차단하는 역할을 한다. 피부 장벽 단백질의 종류로는 필라그린(filaggrin) 등이 있는데, 필라그린(filaggrin, filament aggregating protein)은 각질형성세포 내에서 케라틴 필라멘트를 응집하여 피부 장벽에 중요한 역할을 담당한다. 아쿠아포린(aquaporins, AQPs)은 세포막에 존재하는 수분의 이동 통로로 피부 표피층에서 주로 발현된다. AQPs는 나이가 들면서 발현이 감소하는데, 이러한 발현량 감소가 피부의 건조함을 일으키는 요인 중 하나로 알려져 있다.

사람 각질 형성 세포주(human epidermal keratinocyte)인 HEKa세포는 5×10⁵ cells/well의 농도로 분주되어 37℃, 5%의 CO₂ 하에서 1X의 human keratinocyte growth supplement(HKGS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 100 units/mL의 streptomycin(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가한 basal medium(Medium 154, Gibco) 에서 2일간 배양하였다. 배양된 HEKa 를 PBS로 세척하고 아마인추출물과 바질씨앗추출물을 농도 별로 준비 후 세포에 처리하여 37℃, 5%의 CO₂ 하에서 2일간 배양 하였다. 보습 관련 유전자의 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 TRizol reagent(Invitrogen, USA) 를 사용하여 추출하였다. RNA 수득율은 260 nm에서 흡광도로 측정하여 정량한 후 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 실시하였다. cDNA합성은 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa, Japan)를 이용하였고 PCR은 cDNA로부터 Taq polymerase Kit(TaKaRa)와 특정 primer로 증폭하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 image analyzer(KOREALABTECH, Bundang, Korea)로 확인하였다. 모든 primer는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 주문 제작하였고 각 primer의 서열은 아래 표 5와 같다.

프라이머	서열	입수처
HAS-2	Forward: 5'-GCT ACC AGT TTA TCC AAA CG-3' Reverse: 5'-GTG ACT CAT CTG TCT CAC CG-3'	바이오니아
Aquaporin-3	Forward: 5'-ACC CTC ATC CTG GTG ATG TTT G-3' Reverse: 5'-TCT GCT CCT TGT GCT TCA CAT-3'	바이오니아
Filaggrin	Forward: 5'-AGT GCA CTC AGG GGG CTC ACA-3' Reverse: 5'-CCG GCT TGG CCG TAA TGT GT-3'	바이오니아

HAS-2, AQP-3, Filaggrin의 발현 여부를 확인한 결과를 아래 표 6에 나타내었다.

	Cont (㎍/㎖)	HAS-2 (%)	Aquaporin-3 (%)	Filaggrin (%)
Control	0	100.00	100.00	100.00
비교예 1	10	91.03±6.89	132.96±4.06	105.92±1.26
	25	143.51±5.80	132.31±2.40	102.54±3.18
	50	158.69±5.50	145.07	115.27±4.70
	100	162.71±5.35	145.80	248.72±7.16
실시예 1	10	143.67±5.36	151.64±1.61	108.18±6.77
	25	162.57	157.53±3.45	115.47±6.07
	50	162.70	152.33±3.53	114.28±4.34
	100	171.56	168.89	241.91±7.03
hyaluronic acid	50	215.06	148.67	-
CaCl2	3mM	-	-	225.99±2.63

표 6에서 보듯이, 본 발명의 발효아마인추출물은 HAS-2, AQP-3, Filaggrin의 발현을 증가시키는 점을 확인하였으며, 발효 과정을 거치지 않은 비교예 1에 비해 HAS-2과 AQP-3의 발현이 현저하게 우수한 점을 확인하였다.

[실험예 5 : 발효아마인추출물의 향기 성분 분석]

본 실험에서는 추출방법에 따른 발효아마인추출물의 향기 성분 포집 정도를 확인하고자, 용매에 침지하여 추출한 발효아마인추출물(대조군) 및 본 발명의 퍼콜레이션(percolation) 추출방법으로 추출한 실시예 1의 발효아마인추출물에 대한 향기 성분 분석 실험을 진행하였다.

분석기기는 가스 크로마토그래프 질량분석계 (GC/MS, 6890A GC/5975C MSD)를 이용하였고, DB-WAX Column (60 m × 0.25 um × 0.25 mm)으로 오븐(oven) 온도 50℃(5 min) ~ 230℃(3 ℃/min, 30 min hold)에서 직접분사(direct injection) 방법으로 측정하였다. 아래 표 7에 실험 결과를 정리하여 나타내었으며, 도 1은 용매에 침지하여 추출한 발효아마인추출물(대조군)의 향기 성분 분석 결과를, 도 2는 실시예 1의 향기 성분 분석 결과를 나타낸 것이다.

No.	R.T	Volatile compounds	대조군 Area (%)	실시예 1 Area (%)
1	34.13	linalyl acetate	-	0.16
2	41.44	geranyl acetate	-	0.11
3	45.99	phenyl ethyl alcohol	-	0.21

표 7에서 보듯이, 본 발명의 실시예 1의 발효아마인추출물은 linalyl acetate (리나릴 아세테이트), geranyl acetate (제라닐 아세테이트), phenyl ethyl alcohol (페닐에틸알코올)과 같은 향기 성분들이 검출되었다. 이들은 많은 꽃이나 동식물에서 발견되는데, linalyl acetate (리나릴 아세테이트)는 베르가못 및 라벤더 향을, geranyl acetate (제라닐 아세테이트)는 파인애플 향을, phenyl ethyl alcohol (페닐에틸알코올)은 장미향을 나타내는 성분으로 화장품에서 천연 향료로 이용되며 원료취를 제거하는 역할을 한다. 한편, 도 1 및 도 2는 시간(분)에 따라 대조군 및 실시예 1 각각의 발효아마인추출물에서 추출된 향기 성분을 나타낸 것이다. 상기 표 7 및, 도 1, 2에서 보듯이, 실시예 1의 발효아마인추출물은 linalyl acetate, geranyl acetate, phenyl ethyl alcohol 3종의 향기성분들이 효과적으로 포집된 점을 확인할 수 있는 반면, 용매에 침지하여 추출한 발효아마인추출물(대조군)에서는 3종의 향기 성분 중 검출된 성분이 없었다.

이와 같이, 퍼콜레이션 추출방법을 이용하여 추출한 발효아마인추출물은 향기 성분을 효과적으로 포집하여 용매에 침지하여 추출할 경우에 비해 월등히 증진된 향기성분을 함유하는 화장료 조성물을 제조할 수 있을 것으로 판단되었다.

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Claims (5)

1. 발효아마인추출물을 포함하며,
   상기 발효아마인추출물은 아마인효모발효물을 정제수를 이용하여 25℃에서 2시간 퍼콜레이션(percolation) 추출방법으로 제조되어 향기성분이 증진된 것으로, 상기 향기성분으로 리나릴 아세테이트(linalyl acetate), 제라닐 아세테이트(geranyl acetate) 및 페닐에틸알코올(phenyl ethyl alcohol)이 포집된 것을 특징으로 하는 향기성분을 가진 항염증용 화장료 조성물.
   
2. 발효아마인추출물을 포함하며,
   상기 발효아마인추출물은 아마인효모발효물을 정제수를 이용하여 25℃에서 2시간 퍼콜레이션(percolation) 추출방법으로 제조되어 향기성분이 증진된 것으로, 상기 향기성분으로 리나릴 아세테이트(linalyl acetate), 제라닐 아세테이트(geranyl acetate) 및 페닐에틸알코올(phenyl ethyl alcohol)이 포집된 것을 특징으로 하는 향기성분을 가진 피부 보습용 화장료 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 아마인효모발효물은,
   아마인과 효모를 혼합하고, 25~35℃에서 18~36시간 발효하여 제조한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
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