KR102278641B1 - 느타리와 팽이 유산균 발효물을 이용한 천연 조미료 개발 - Google Patents

느타리와 팽이 유산균 발효물을 이용한 천연 조미료 개발 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1) 다시마에 물을 첨가하고 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계; (2) 느타리버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계; (3) 팽이버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계; (4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 접종한 후 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계; (5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 접종한 후 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천연 조미료의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 천연 조미료에 관한 것이다.

Description

느타리와 팽이 유산균 발효물을 이용한 천연 조미료 개발{Development of natural seasoning using fermented oyster mushroom and winter mushroom product by lactic acid bacteria}
본 발명은 느타리 유산균 발효물, 팽이 유산균 발효물 및 다시마 추출물을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천연 조미료의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 천연 조미료에 관한 것이다.
과거의 조미료가 자연스러운 맛, 향을 내기 위해 첨가물을 소량 사용했다면 최근에는 원재료 함량을 늘려 맛, 영양 모두 강화한 다양한 제품이 출시되고 있다. 사조해표는 ‘천연 원물 티백 조미료’를 출시했다. 100% 국내산 원물을 통째로 건조해 친환경 티백에 담은 것이 특징인 제품이다.
액상 조미료는 다른 양념 없이 쉽고 간편하게 다양한 요리에 활용할 수 있는 점을 장점으로 내세워 소비자들의 큰 사랑을 받고 있다.
국내 조미료 시장이 4세대로 진입했다. 1세대와 2세대 조미료는 지난 수십년간 국민들의 입맛을 사로 잡았지만 MSG라 불리는 글루탐산나트륨이 건강에 좋지 않다는 부정적 이미지를 형성하면서 수요가 급격하게 줄었다.
이를 보완하여 출시된 것이 3세대 천연 조미료다. 천연 조미료는 쇠고기, 멸치 등의 원물을 갈아 만들어 건강에 좋지 않다는 이미지에서 벗어나는 데는 성공하였으나 기존 음식에 맛이 섞여 감칠맛이 부족하다는 한계가 있었다.
1세대 미원의 검색량이 상위권에 위치한 것은 식품의약품안전처에서 MSG의 안정성이 입증되었다는 사실을 국민들에게 알리기 시작했고 식품첨가물 분류에서 ‘화학적 합성첨가물’이라는 용어를 퇴출시키기로 결정하면서 MSG에 대한 소비자들의 인식에 변화가 생기기 시작했다. 또한 젊은층 사이에서 집밥·쿡방(요리방송)이 인기를 끌면서 간단한 요리시 사용되는 조미료 구매에 자연조미료보다 상대적으로 가격이 저렴한 일반조미료를 선호하는 트렌드가 반영된 것으로 해석된다.
4세대 연두(콩을 발효와 야채를 우려낸 순식물성 요리에센스)의 검색량이 상위권에 위치한 것은 건강 중시 트렌드와 구매 전 성분, 원재료 등을 꼼꼼히 따지는 이른바 ‘체크슈머’가 증가하면서 천연 원료로 맛을 살린 조미료가 성장세를 보이고 있다.
버섯은 단백질, 지질, 당질, 무기질, 아미노산 및 비타민을 비롯한 영양성분이 고르게 함유되어 있는 양질의 식품으로 독특한 맛과 향을 가지고 있어 전통적으로 식용되어 왔으며, 또한 항산화, 항균, 항종양 활성 및 항암효과 등이 규명되면서 이에 대한 관심이 높아지고 있다. 최근에는 식품학적 측면에서의 유용성분 뿐만 아니라 버섯 중에 함유되어 있는 각종 기능성 물질을 이용한 암, 순환계 질환, 당뇨병 등 각종 성인병의 예방에 크게 기여할 수 있는 새로운 식품소재를 개발할 필요성이 대두되고 있으며, 이에 따른 여러 기능성 물질을 함유한 식품 및 미생물 자원의 선발과 이용방법 등의 연구개발이 요구되고 있다.
1990년 이후 각종 매체를 통하여 약용버섯의 효능에 대한 소개가 활발하게 이루어짐과 더불어 소비자들의 관심이 급속히 증가하였다. 그러나 이에 따른 부작용으로 약용버섯에 대한 과대 과장광고가 심화되었으며, 2000년대 후반부터 소비자들의 신뢰도가 크게 떨어져 가고 있는 상황이다. 식용버섯은 약용버섯의 70% 정도의 약리효능이나 기능성을 가지고 있는 것으로 여러 연구에서 소개된 바 있다.
따라서 식용버섯 중에 함유되어 있는 각종 영양성분과 기능성 물질을 활용한 다양한 식품개발로 국내외적으로 경쟁력을 가질 수 있는 품목으로 발전 및 또한 농가 소득증대에 기여할 것으로 보인다.
한국공개특허 제2014-0002235호에는 천연 버섯 조미료의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2119227호에는 느타리버섯 발효 조미료의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 느타리와 팽이 유산균 발효물을 이용한 천연 조미료와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 느타리와 팽이 발효에 적합한 균주를 선정하고, 상기 발효한 느타리 및 팽이 발효물과 다시마 추출물을 적정량 배합하여 음식의 풍미와 감칠맛을 증진시킬 수 있는 천연 조미료의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 다시마에 물을 첨가하고 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계; (2) 느타리버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계; (3) 팽이버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계; (4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 접종한 후 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계; (5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 접종한 후 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천연 조미료의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 천연 조미료를 제공한다.
본 발명의 조미료에 첨가되는 느타리 유산균 발효물 및 팽이 유산균 발효물은 느타리 및 팽이버섯이 갖는 영양학적 효능을 최대로 증진시키면서 풍미 및 감칠맛도 향상시켜, 상기 재료들과 다시마 추출물을 적정량 배합한 조미료는 음식의 감칠맛과 풍미를 향상시켜 음식의 기호도를 향상시킬 수 있는 조미식품으로 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 균주 종류 및 발효시간에 따른 느타리버섯 발효물의 pH 변화를 비교한 그래프이다.
도 2는 균주 종류 및 발효시간에 따른 팽이버섯 발효물의 pH 변화를 비교한 그래프이다.
도 3은 균주 종류 및 발효시간에 따른 느타리버섯 발효물의 총산도 변화를 비교한 그래프이다.
도 4는 균주 종류 및 발효시간에 따른 팽이버섯 발효물의 총산도 변화를 비교한 그래프이다.
도 5는 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 6은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 하이드록시 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 7은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 α-아밀라아제 저해 활성을 비교한 그래프이다.
도 8은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 β-글루코시다아제 저해 활성을 비교한 그래프이다.
도 9는 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 리파아제 저해 활성을 비교한 그래프이다.
도 10은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 Raw264.7에 대한 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 11은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 RBL-2H3에 대한 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 12는 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 AGS에 대한 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 13은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
도 14는 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 IL-1β 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 15는 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 TNF-α 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 16은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 PGE2 억제 활성을 비교한 그래프이다.
도 17은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 활성을 비교한 그래프이다.
도 18은 느타리 추출물(느타리), 느타리 발효물(느타리P), 팽이 추출물(팽이), 팽이 발효물(팽이A) 및 천연 조미료(조미료)의 농도별 히스타민 억제 활성을 비교한 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 다시마에 물을 첨가하고 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계;
(2) 느타리버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계;
(3) 팽이버섯에 물을 첨가하고 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계;
(4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 접종한 후 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계;
(5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 접종한 후 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및
(6) 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물을 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천연 조미료의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주(KCTC18860P)이고, 상기 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주(KCTC18859P)이고, 상기 균주를 한국생명공학연구원에 2020년 10월 29일자로 기탁하였다. 상기 기탁된 특정 균주를 사용하여 느타리 유산균 발효물 및 팽이 유산균 발효물을 제조할 경우 감칠맛이 우수하면서, 에르고스테롤 및 β-글루칸 함량이 높고, 감칠맛을 내는 핵산관련물질과 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 아미노산 함량이 증진될 뿐만 아니라, 세포 독성을 나타내지 않으면서, 항산화 활성, α-아밀라아제(α-amylase) 저해활성 및 리파아제 저해활성이 증진되면서, 염증을 유발하는 NO, IL-1β, TNF-α 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 억제 활성이 증진되어 항염증 활성이 우수할 뿐만 아니라, β-헥소사미니다아제 및 히스타민 억제 효과가 우수하여 항알레르기 활성이 증진된 발효물로 제조할 수 있었다.
또한, 본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 (1)단계의 다시마 추출물은 바람직하게는 다시마에 물을 18~22배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 2~4시간 동안 열수 추출하고 건조하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 다시마에 물을 20배(v/w) 첨가하고 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하고 건조하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 (2)단계의 느타리 추출물은 바람직하게는 느타리버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 느타리버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 80℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 (3)단계의 팽이 추출물은 바람직하게는 팽이버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 85~95℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 팽이버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 90℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 제조할 수 있다.
상기 (1), (2) 및 (3)단계의 조건으로 다시마, 느타리 및 팽이를 추출하는 것이 고형분 함량이 높아 보다 효율적으로 추출할 수 있었다.
또한, 본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 (4) 및 (5)단계의 발효는 바람직하게는 34~40℃에서 2~4일 동안 발효할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 3일 동안 발효할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 발효하는 것이 버섯 특유의 이취는 제거되면서 풍미 및 감칠맛이 증진되도록 발효시킬 수 있었다.
또한, 본 발명의 천연 조미료의 제조방법에서, 상기 (6)단계의 혼합은 바람직하게는 천연 조미료 총 중량 기준으로, 느타리 유산균 발효물 45~55 중량%, 팽이 유산균 발효물 27~33 중량% 및 다시마 추출물 18~22 중량%를 혼합할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 천연 조미료 총 중량 기준으로, 느타리 유산균 발효물 50 중량%, 팽이 유산균 발효물 30 중량% 및 다시마 추출물 20 중량%를 혼합할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 혼합하는 것이 재료들의 맛과 풍미가 잘 어우러져 음식의 감칠맛을 향상시킬 수 있는 조미료로 제조할 수 있었다.
본 발명의 천연 조미료의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 다시마에 물을 18~22배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 2~4시간 동안 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계;
(2) 느타리버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계;
(3) 팽이버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 85~95℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계;
(4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주(KCTC18860P)를 접종하여 34~40℃에서 2~4일 동안 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계;
(5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주(KCTC18859P)를 접종하여 34~40℃에서 2~4일 동안 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및
(6) 천연 조미료 총 중량 기준으로, 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물 45~55 중량%, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 27~33 중량% 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물 18~22 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 다시마에 물을 10배(v/w) 첨가하고 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계;
(2) 느타리버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 80℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계;
(3) 팽이버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 90℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계;
(4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주(KCTC18860P)를 접종하여 37℃에서 3일 동안 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계;
(5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주(KCTC18859P)를 접종하여 37℃에서 3일 동안 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및
(6) 천연 조미료 총 중량 기준으로, 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물 50 중량%, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 30 중량% 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물 20 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 천연 조미료를 제공한다.
이하, 본 발명의 제조예 및 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 천연 조미료
(1) 건조다시마에 물을 20배(v/w) 첨가하고 80℃에서 3시간 동안 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하였다.
(2) 느타리버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 80℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하였다.
(3) 팽이버섯에 물을 10배(v/w) 첨가하고 90℃에서 4시간 동안 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하였다.
(4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 당과 물을 첨가하여 8 brix로 조정하고, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주(KCTC18860P)를 1% 접종하여 37℃에서 72시간 동안 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하였다.
(5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 당과 물을 첨가하여 8 brix로 조정하고, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주(KCTC18859P)를 1% 접종하여 37℃에서 72시간 동안 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하였다.
(6) 천연 조미료 총 중량 기준으로, 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물 50 중량%, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 30 중량% 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물 20 중량%를 혼합하였다.
1. 실험방법
(1) 일반성분 분석
일반성분은 AOAC방법에 따라 분석하였으며, 실험항목은 수분, 조회분, 조단백질, 조지방, 조섬유 및 가용성 무질소물이었다. 수분은 105℃ 직접건조법, 조회분은 550℃ 직접 회화법으로, 조단백질은 micro-Kjeldahl법에 따라 측정된 질소량에 질소 계수 6.25를 곱하여 산출하였으며, 조지방은 soxhlet 추출법으로, 조섬유의 함량은 Henneberg Stohamann 개량법으로 구하였다. 시료들의 가용성 무질소물의 함량은 총량에서 조회분, 조단백질, 조지방, 조섬유의 함량을 뺀 값으로 계산하여 구하였다.
(2) 유리당 분석
유리당 성분은 시료 5 g에 증류수를 가하고 균질기로 마쇄하여 교반후 침출시켜 100 mL로 정용한 다음 원심분리(3,000 rpm, 30분)하여 Sep-pak C18으로 정제시킨 다음 0.45 ㎛ 멤브레인 필터(Millipore Co., USA)로 여과한 여액을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표 1과 같으며 함량은 외부표준법으로 계산하였다.
유리당 분석 위한 HPLC 조건
항 목 분석조건
Instrument Agilent Technologies 1200 Series
ELSD detector
Column ZORBAX Carbohydrate
( 4.6 × 150 mm )
Solvent 85% Acetonitrile　
Column temp. 30℃
Flow rate 1.4 ml/min
Injection volume 20 ㎕
(3) 에르고스테롤 분석
에르고스테롤은 시료 5 g에 에탄올 100 mL를 넣어 80℃에서 1시간 동안 환류 추출시킨 후, 상등액을 취하고 잔사에 에탄올 100 mL를 넣고 80℃에서 1시간 환류 추출하였다. 추출물을 필터하여 20 mL 에탄올과 수산화칼륨 10 g을 넣고, 80℃에서 1시간 환류 추출시킨 후 검화된 용액에 증류수 50 mL를 첨가하였다. 그 후, 헥산으로 50 mL씩 3번 분획하여 헥산층을 취해서 완전 농축시킨 후 메탄올 2 mL로 녹여서 HPLC로 측정하였다. 함량은 외부표준법으로 계산하고, HPLC 조건은 표 2와 같다.
에르고스테롤 분석을 위한 HPLC 분석 조건
항목 분석조건
장치 Agilent Technologies 1200 Series
컬럼 Agilent XDB-C18 (Method Development Kit)
(4.6 × 150 mm, 5 ㎛)
용매 98% 메탄올
컬럼 온도 28.8℃
파장 UV 280 nm
유속 1.0 mL/min
주입 용량 20 ㎕
(4) 베타글루칸 분석
시료의 베타글루칸은 Megazyme kit(Mushroom and Yeast β-glucan Assay Procedure K-YBGL, Megazyme, Ireland)를 이용하여 측정하였다.
먼저 총 글루칸은 100 mesh 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣어 37% HCl 1.5 mL를 넣고 45분간 30℃ 항온 수조에 넣어 분해하였다. 그 후 증류수 10 mL를 넣어 볼텍스(vortex)하고, 100℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 그 후 실온에서 식히면서 2N KOH를 10 mL씩 넣고 200 mM 아세트산나트륨 버퍼로 100 mL로 정용한 후 충분히 혼합하였다. 그 후 상등액 0.1 mL에 200 mM 아세트산나트륨 버퍼(sodium acetate buffer)에 녹인 엑소-1,3-β-글루카나아제 플러스 β-글루코사다아제(exo-1,3-β-glucanase plus β-glucosidase) 0.1 mL를 넣고, reagent blank는 아세테이트 버퍼(acetate buffer) 0.2 mL를 넣고, D-글루코스 스텐다드는 D-글루코스 스텐다드(D-glucose standard) 0.1 mL와 아세테이트 버퍼 0.1 mL를 넣고 혼합한 후 40℃에서 60분 동안 배양하였다. 그 다음 GOPOD(Glucose oxidase/peroxidase mixture) 3 mL를 넣고 40℃에서 20분 동안 배양한 후, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.
α-글루칸(α-Glucan)은 100 mesh 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣고 2M KOH 2 mL씩 넣고 20분간 혼합하였다. 1.2M 아세트산나트륨 버퍼 8 mL를 넣고 섞은 후 아밀로글루코시다아제 플러스 인버테이스(amyloglucosidase plus invertase) 0.2 mL를 넣고, 잘 섞어서 40℃ 항온 수조에서 30분간 배양하였다. 상등액 0.1 mL에 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 0.1 mL, GOPOD 3 mL를 넣고 40℃에서 20분간 배양한 후, 510 nm 흡광도에서 측정하였다. 계산은 총 글루칸 함량에서 α-글루칸 함량을 빼서 β-글루칸의 함량을 정량하였다.
(5) 핵산관련물질의 측정
시료 약 2 g에 10%-HClO4 10 mL를 가하고 균질한 후 테스트 튜브에 25 mL로 채워서 30분간 방치 후 여과하였다. 상징액의 pH를 조정한 후 조정한 액에 10%-HClO4를 사용하여 50 mL로 정용하였다. 30분간 방치한 후 0.4 ㎛ 필터로 여과하여 HPLC로 분석하였고, 컬럼은 u-bondapak C18(4 mm × 30 cm), 검출기파장은 265 nm, 용매는 30% 메탄올로 용리하였으며 정량법은 외부표준법에 준하여 GMP(5'-guanosine cyclic monophosphate), IMP(5'-inosine mono phosphate), XMP(5'-xanthylic acids)를 정량하였다.
(6) 구성 아미노산
구성 아미노산 분석은 시료 0.5 g을 시험관에 넣고 6 N-HCl 10 mL를 넣은 후 시험관 끝을 불로 녹여 앰플로 만들어 밀봉한 후 오토클레이브 110℃에서 24시간 가수분해시킨 후 앰플을 깨고 여과지로 여과하면서 메탄올 50 mL로 정용하여 감압 농축하여 20 mM HCl 5 mL로 정용하였다. 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 얻은 여액을 일정량 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화시킨 후 HPLC로 분석하였다.
(7) 유리 아미노산
유리 아미노산 분석은 유리당 정량과 같은 방법으로 얻은 여액 10 mL에 설포살리실산(sulfosalicylic acid) 25 mg을 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 방치시킨 후 원심분리(50,000 rpm, 30분)하여 단백질 등을 제거하고, 상등액을 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 얻은 여액을 일정량 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화시킨 후 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 표 3과 같다.
아미노산 분석 조건
항목 분석조건
장비 Agilent Technologies 1200 Series
검출기 Agilent Technologies 1200 Series FLD
컬럼 AccQ-Tag™
(Waters Co., 150 mm L ×3.9 mm I.D.)
컬럼 온도 37℃
완충용액 A : AccQ-Tag Eluent A(acetate-phosphate buffer)
B : AccQ-Tag Eluent B(100% acetonitrile)
C : D.W
시간 A B C
0 100 0 0
0.5 99 1 0
18 95 5 0
19 91 9 0
26 86.7 13.3 0
30 84 16 0
32 83 17 0
36 0 60 40
39 100 0 0
48 100 0 0
유속 1.0 mL/min
주입 용량 5 ㎕
(8) 관능평가
관능검사는 식품공전에 의거한 패널 요건을 충족한 30명을 대상으로 수행하였으며, 연령별, 성별 구분을 충족하였다 기호도 평가 항목은 색(color), 향(flavor), 맛(taste) 및 전체 기호도(overall preference)를 7점 척도법으로 실시하였다. 채점 기준은 아주 좋다; 7점, 보통이다; 4점, 아주 나쁘다; 1점으로 하였고, 2시간 간격으로 시료의 번호를 바꾸어 같은 패널로 3회 반복하였으며 각 반복 시 가장 높은 점수와 가장 낮은 점수를 제외하고 평균 득점을 구하였다.
(9) α-아밀라아제 활성
다양한 농도의 시료에 타액 유래 α-아밀라아제 효소액(5 unit/mL, in 50 mM potassium phosphate buffer)와 혼합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후 기질 용액인 1% 전분을 넣어 교반한 후 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 3,5-DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 용액을 넣고 100℃에서 5분간 끓여 발색시킨 후 냉각하여 DW를 넣고 교반한 뒤 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 평가하였다.
(10) α-글루코시다아제(α-Glucosidase) 활성
쥐 장 아세톤 분말(Rat intestinal acetone powder) 30 mg을 4℃에서 미리 반응시킨 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer) 1 mL와 혼합하여 녹인 후 4℃ 및 4,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 중간층을 α-글루코시다아제의 효소액으로 사용하였다. 다양한 농도의 시료를 α-글루코시다아제 효소액 50 ㎕, 3 mM ρ-NPG(ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 100 ㎕와 혼합하여 37℃에서 60분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 평가하였다.
(11) 지방분해 활성 분석(Lipolytic activity assay)
p-NPB(p-Nitrophenyl butyrate)의 기질(10 mM)를 이용하여 분광광도법적 분석(spectrophotometric assay)을 수행하였다. 기질 용액에 다양한 농도의 시료를 60℃에서 15분 동안 반응시킨 후 405 nm에서 10분간 PNP(p-nitrophenol)를 측정하여 Vmax 값으로 분석하고, 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
(12) 위장 보호효과 분석
가) 세포배양
RAW264.7 세포, RBL-2H3 세포, AGS 세포는 10% FBS, 1X 항생물질-항진균제(antibiotic-antimycotic)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 플라스크에 70~80% 정도로 자라게 되면 트립신-EDTA를 이용하여 계대배양하였다.
나) 세포 독성 측정
세포의 생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 뒤 12시간 동안 배양한 후, 각 시료를 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 용액(최종농도: 0.5 mg/mL)을 가하고 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 포르마잔(formazan)이 배지에 떨어져나가지 않도록 배지를 제거하였다. DMSO를 100 ㎕ 분주하여 10분 동안 혼합한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(13) 항염증 및 항알레르기 효과 분석
가) NO 생성량 측정
세포를 24-웰 플레이트에 분주하여 12시간 배양한 후에 시료를 농도별로 처리한 다음, LPS(1 ㎍/mL)를 처리하여 20시간 배양하였다. 세포 배양액 100 ㎕와 그리스 시약 100 ㎕를 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, ELISA 리더를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였고 질산나트륨(sodium nitrate)으로 표준곡선을 작성하여 NO 함량을 산출하였다.
나) β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분비 저해 활성
0.5 ㎍/ml 농도의 DNP-IgE(dinitropheny-immunoglobulin E)를 함유한 DMEM 배지를 사용하여, 24-웰 플레이트에 세포를 2×105 cells/well의 밀도로 분주한 뒤, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하였다. 각 세포들을 Siraganian buffer(119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM PIPES, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척한 다음, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 동일 버퍼로 10분간 전배양한 후 시료를 농도별로 희석시켜 세포에 처리하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 동안 반응시켰다. 이 후 DNP-BSA(DNP-bovine serum albumin)을 최종 농도 100 ng/ml이 되도록 가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 반응시키고, 얼음 용기(ice bath)에서 10분간 배양한 후 반응을 종결시켰다. 상층액 40 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고 기질 버퍼(2 mM 4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.05M Sodium citrate, pH 4.5) 40 ㎕를 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양시킨 다음 각 웰 당 정지액(0.1M Na2CO3/ NaHCO3, pH 10.5) 200 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
다) 히스타민 분비 저해 활성
배양된 세포를 4℃에서 5분 동안 2000 rpm으로 원심분리하여 그 상층액을 시료로 사용하였다. 1.5 mL 튜브에 시료 25 ㎕를 넣고 0.1N HCl 22.5 ㎕, 60% HClO 42.5 ㎕를 넣고 혼합한 후 원심분리하여 그 상층액 40 ㎕를 5N NaOH 25 ㎕, n-부탄올 500 ㎕ 및 NaCl 0.06 g을 혼합한 튜브에 넣고 진탕 후 원심분리(2000 rpm, 10 min)하였다. 부탄올층 400 ㎕ 새 1.5 mL 튜브에 넣고 0.1N HCl 용액 150 ㎕, n-헵탄 0.5 mL를 가하여 진탕 후 원심분리하였다. 여기에서 얻어진 수층 100 ㎕에 1N NaOH 용액 200 ㎕와 0.1% ο-프탈알데히드(ο-phthaldialdehyde) 용액 5 ㎕를 넣고 혼합한 후 37℃에서 3분 동안 반응시킨 후 3N HCl 용액 10 ㎕를 넣고 혼합하여 2분 동안 방치한 후 360 nm(excitation)과 450 nm(emission)에서 흡광도를 측정하였다.
라) 프로스타글란딘(Prostaglandin) E2의 측정
AGS 세포의 농도를 1×104/well이 되도록 하고, 시료를 1시간 동안 전배양하여 실험하였다. 인도메타신(500μM)을 대조군으로 하였다. PGE2 assay kit를 사용하여 정량하였다.
마) 사이토카인 측정
미리 코팅되어 있는 96 웰 플레이트에 정량하고자 하는 사이토카인의 primary antibody를 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 다음날 0.5% tween 20 세척 용액으로 5분씩 3회 세척한 후 측정할 샘플과 standard 용액을 100 ㎕씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시킨다. 상기와 같이 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody를 각 100 ㎕씩 넣고 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후 다시 세척하고 아비딘/비오틴(avidin/biotin)을 첨가하여 발색시켜 흡광도를 측정하였다. Standard의 흡광도로부터 표준곡선을 구하고 이를 이용하여 각 샘플의 흡광도로부터 사이토카인의 양을 정량하였다.
(14) 통계처리
본 실험결과를 SPSS 통계분석 프로그램(SPSS, ver. 16.0, USA)을 이용해 각 실험군간 평균치와 표준편차를 계산하고 통계적 유의성은 유의성 p<0.05 수준으로 얻어진 결과는 one-way ANOVA 중 Duncans multiple range test로 검증하였다.
실시예 1. 추출 조건에 따른 다시마 수율
다시마 추출 용매와 추출온도에 따른 수율은 하기 표 4와 같다. 그 결과, 80℃ 열수 추출물에서 고형분 함량이 가장 높게 나타났다. 따라서 본 연구에서는 다시마 80℃ 열수 추출물을 건조하여 시료로 사용하였다.
건조다시마 추출 조건에 따른 수율(%)
고형분 함량(g)
물 60℃ 열수 70℃ 열수 80℃ 열수 90℃ 열수 에탄올
건조다시마 100 g 8.5 14.5 26.8 34.1 28.4 18.2
실시예 2. 추출 조건에 따른 느타리, 팽이 수율
추출 조건에 따른 느타리, 팽이 추출물 수율은 하기 표 5와 같다. 느타리는 80℃ 열수 추출물에서 고형분 함량이 가장 높게 나타났으며, 팽이는 90℃ 열수 추출물에서 고형분 함량이 가장 높게 나타났다. 따라서 본 연구에서는 80℃에서 열수 추출한 느타리 추출물과 90℃에서 열수 추출한 팽이 추출물을 식물성 유산균 발효 소재로 사용하였다.
추출 용매에 따른 느타리, 팽이 수율(%)
구분 고형분 함량(g)
물 60℃ 열수 70℃ 열수 80℃ 열수 90℃ 열수 에탄올
느타리 100 g 0.4 2.7 5.2 10.1 8.4 3.2
팽이 100 g 0.6 1.9 4.8 8.7 9.9 2.7
실시예 3. 느타리, 팽이 식물성 유산균 발효물 분석
1) 관능검사
느타리 및 팽이 유산균 발효물의 감칠맛에 대한 관능검사를 5점 척도법으로 실시한 결과는 하기 표 6과 같다. 그 결과, 느타리 및 팽이 모두 추출물에 비해 유산균 발효물에서 감칠맛이 더 향상됨을 확인하였다. 느타리의 경우 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주로 발효한 발효물, 팽이의 경우 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주를 발효한 발효물에서 감칠맛에 대한 기호도가 높게 나타났다.
느타리 추출물과 균주 종류에 따른 발효물의 감칠맛 평가
균주 종류 느타리 팽이
추출물 2.80 3.02
Lactobacillus plantarum 3.68 3.16
Leuconostoc lactis 3.34 3.90
Lactobacillus acidophilus JMIL001 3.50 4.50
Lactobacillus acidophilus 2 3.78 3.52
Lactobacillus sakei LI011 3.00 3.64
Lactobacillus sakei LI033 3.42 3.80
Lactobacillus sakei LGy039 3.00 3.82
Pediococcus pentosaceus ALI015 3.04 4.08
Pediococcus pentosaceus ALI024 3.82 3.78
Pediococcus pentosaceus JMIL002 4.44 4.00
2) pH 측정
느타리 추출물 및 팽이 추출물에 균주를 종류별로 접종한 후 pH를 측정하였다. 그 결과, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주를 접종한 느타리 추출물 유산균 발효물에서 pH가 5.525에서 4.794로 두드러지게 낮아짐을 확인하였다(도 1). 팽이 추출물 유산균 발효의 경우 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주를 접종한 팽이 추출물 유산균 발효물에서 pH가 6.425에서 5.732로 두드러지게 낮아짐을 확인하였다(도 2).
3) 총산도 측정
느타리 추출물 및 팽이 추출물에 균주를 종류별로 접종한 후 총산도를 측정하였다. 느타리 추출물 유산균 발효의 경우 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주를 접종한 느타리 추출물 유산균 발효물에서 총산도가 0.44에서 0.89로 두드러지게 높아짐을 확인하였다(도 3). 팽이 추출물 유산균 발효의 경우 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주를 접종한 팽이 추출물 유산균 발효물에서 총산도가 0.39에서 0.63으로 두드러지게 높아짐을 확인하였다(도 4).
따라서 본 연구에서 유산균 발효가 잘 진행되면서 감칠맛이 우수한 느타리 및 팽이 발효에 적합한 페디오코커스 펜토사세우스 JMIL002 균주와 락토바실러스 애시도필러스 JMIL001 균주를 각각 최종 발효균주로 선정하였다.
실시예 4. 천연 조미료 혼합비에 따른 관능평가
제조예 1에서 (6)단계의 재료 혼합비를 달리하여 제조한 천연 조미료를 이용하여 7점 척도법으로 관능검사 요원 30명을 대상으로 관능평가를 실시하였다.
천연 조미료 혼합비
실시예 첨가비율(중량%)
느타리 유산균 발효물 팽이 유산균 발효물 다시마 추출물
A 70 10 20
B 60 20 20
C 50 30 20
D 40 40 20
E 30 50 20
그 결과, 느타리 유산균 발효물 50 중량%, 팽이 유산균 발효물 30 중량% 및 다시마 추출물 20 중량%를 혼합하는 것이 가장 선호도가 높게 나타났다.
천연 조미료 혼합비에 따른 관능검사
천연 조미료 종류 향 맛 전반적 기호도
A 5.20 5.34 4.46
B 5.72 5.90 5.85
C 6.60 6.82 6.70
D 5.80 5.20 5.10
E 4.86 4.14 4.16
실시예 5. 일반성분 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 일반성분 분석 결과는 표 9와 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 수분과 회분, 조지방, 조섬유 함량에서는 유의한 차이가 없었으나, 조단백질의 함량은 느타리와 팽이 각각 17.34%와 14.48%로 느타리 버섯이 유의적으로 높았다. 유산균 발효물은 모두 대조군과 비교하였을 때 수분과 회분 그리고 조섬유가 감소하였고, 회분, 조단백질, 조지방이 소량 증가함을 보였다.
일반성분 분석 결과(%)
구 분 수분 회분 조단백질 조지방 조섬유 가용성 무질소물1)
천연 조미료 8.62 3.45 21.48 1.56 7.76 57.13
느타리 추출물 8.32 2.93 17.34 1.3 8.84 61.27
느타리 발효물 7.83 2.81 19.76 1.57 8.18 59.85
팽이 추출물 7.07 3.45 14.48 1.38 7.54 66.08
팽이 발효물 6.74 3.33 16.94 1.55 7.36 64.08
1) 100-(수분, 조단백질, 조지방 및 조회분 함량의 합)
실시예 5. 유리당 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 유리당 분석 결과는 표 10과 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 느타리와 팽이는 글루코스와 프락토스만 함유하고 있으며, 유산균 발효물에서 추가로 수크로스를 함유하고 있는 것으로 분석되었다. 대조군과 발효물을 비교하였을 때 발효물에서 글루코스와 프락토스는 유의적으로 감소하였으며, 수크로스가 검출되었다. 이는 미생물이 발효 중 환원당을 탄소원으로 이용하였기 때문인 것으로 사료된다.
유리당 분석결과(%)
구분 글루코스 프락토스 수크로스 합계
천연 조미료 4.85±0.48 1.54±0.22 3.55±0.39 6.39±0.75
느타리 추출물 2.54±0.27 0.27±0.05 - 2.81±0.18
느타리 발효물 1.05±0.36 0.11±0.09 1.48±0.25 2.64±0.33
팽이 추출물 1.73±0.31 0.21±0.04 - 1.94±0.49
팽이 발효물 0.64±0.24 0.08±0.05 1.27±0.44 1.99±0.53
실시예 6. 에르고스테롤(Ergosterol) 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 에르고스테롤 분석 결과는 표 11과 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 느타리와 팽이에서 에르고스테롤 함량은 각각 284.19 mg%와 232.45 mg%로 느타리가 유의적으로 높았다. 유산균 발효물을 대조군과 비교하였을 때 대조군에 비해 유의적인 차이로 증가함을 보였다. 에르고스테롤은 비타민 D2의 전구물질로 자외선을 조사하면 비타민 D2로 변환되고, 에르고스테롤의 양은 버섯의 종류에 따라 다르다고 하였다. 비타민 D2 전환 등 생리활성에 효과가 있는 것으로 알려진 에르고스테롤이 증가된 유산균 발효물의 면역 증진 효과가 기대된다.
에르고스테롤 분석결과(mg%)
구분 에르고스테롤
천연 조미료 297.06±49.2
느타리 추출물 284.19±19.96
느타리 발효물 334.85±36.85
팽이 추출물 232.45±34.27
팽이 발효물 267.19±54.6
실시예 7. β-글루칸 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 β-글루칸 분석 결과는 표 12와 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 느타리와 팽이에서 β-글루칸 함량은 각각 34.51%와 19.37%로 느타리가 유의적으로 높았다. 유산균 발효물을 대조군과 비교하였을 때 대조군에 비해 증가함을 보였다. β-글루칸은 버섯에 함유되어 있는 주요한 생리활성 물질 중 하나로, 다당류의 일종으로 인체의 면역시스템에 작용하고 항당뇨, 혈압조절 작용 등을 한다고 보고되었다.
β-글루칸 분석결과(%)
구분 함량
천연 조미료 28.74±1.43
느타리 추출물 34.51±0.76
느타리 발효물 35.94±1.51
팽이 추출물 19.37±0.68
팽이 발효물 21.26±1.09
실시예 8. 핵산물질 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 핵산 관련 물질 분석 결과는 표 13과 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 느타리와 팽이에서 핵산물질은 5'-GMP, 5'-IMP, 5'-XMP가 검출되었다. 핵산물질은 대체적으로 느타리에서 많이 함유되어 있었고, 느타리와 팽이 모두 5'-GMP가 각각 108.93 mg%와 95.26 mg%로 가장 높게 나타났다. 유산균 발효물은 대조군에 비해 검출된 핵산 관련 물질 모두 소량 증가를 나타내었다. 이러한 핵산관련 물질의 경우 5'-GMP가 가장 강한 맛을 나타내며 5'-XMP는 거의 맛이 나타나지 않는 것으로 알려져 있으며, 핵산물질의 함량은 건조방법과 건조 온도에 따라서 변한다고 보고된 바 있다.
핵산 관련 물질 분석결과(mg%)
구분 5'-GMP1) 5'-IMP2) 5'-XMP3) Total nucleic acid related compounds
천연 조미료 132.56±13.15 38.63±1.7 69.48±6.44 240.67±21.09
느타리 추출물 108.93±26.96 33.48±5.71 66.48±11.24 208.89±34.58
느타리 발효물 118.38±19.38 40.61±5.38 70.28±8.62 229.27±17.63
팽이 추출물 95.26±11.29 31.47±4.32 63.86±8.41 190.59±22.93
팽이 발효물 104.19±14.45 38.26±3.81 68.7±12.36 211.15±30.58
1) 5'-Guanosine cyclic monophosphate
2) 5'-inosine mono phosphate
3) 5'-Xanthylic acids
실시예 9. 구성 아미노산 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 구성 아미노산 분석 결과는 표 14와 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 아미노산은 생체를 구성하는 중요한 영양소이며, 이를 유지하기 위해 외부에서 섭취해야만 한다. 총 16종의 아미노산 중 주요 아미노산은 아르기닌(arginine), 글루탐산(glutaminc acid), 발린(valine)으로 나타났으며, 총 구성 아미노산 함량은 느타리 추출물과 팽이 추출물 각각 16830.58 mg%와 10825.19 mg%로 느타리가 유의적으로 높았다. 그 중 필수 아미노산인 트레오닌(threonine), 발린(valine), 메티오닌( methionine), 라이신(lysine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 히스티딘(histidine), 페닐알라닌(phenyalanine)의 8성분의 총 함량은 느타리 추출물과 팽이 추출물 각각 7112.05 mg%와 5207.09 mg%였다. 유산균 발효물은 추출물에 비해 느타리와 팽이에서 모두 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
구성 아미노산 분석결과(mg%)
Total amino acids 천연 조미료 느타리 추출물 느타리 발효물 팽이 추출물 팽이 발효물
Aspartic acid 454.05±16.51 526.84±50.23 635.74±19.65 321.17±27.24 382.69±36.85
Serine 984.64±28.96 1081.62±38.25 1165.97±85.22 841.65±63.64 904.37±27.23
Glutamic acid 1753.93±57.18 2154.47±83.48 2421.3±74.96 1233.39±67.43 1445.82±89.31
Glycine 764.41±11.28 1043.55±42.08 1255.68±14.28 445.26±45.87 505.89±62.14
Histidine 783.38±43.83 881.26±23.74 963.55±41.94 625.5±65.97 667.24±57.49
Arginine 2920.53±57.49 3764.13±132.81 3852.26±69.29 1956.93±71.93 2208.51±87.46
Threonine 912.78±21.68 1049.26±77.89 1144.16±56.66 732.29±77.9 798.21±85.08
Alanine 137.76±19.09 164.59±22.98 188.94±14.06 104.93±18.86 122.36±9.69
Proline 514.89±15.61 582.93±28.06 643.08±31.38 426.84±37.89 486.5±10.32
Tyrosine 354.17±27.17 400.4±13.15 467.79±28.75 287.93±5.95 345.19±27.94
Valine 1156.44±38.22 1332.22±82.36 1381.31±56.11 920.66±101.77 1057.53±55.55
Methionine 230.02±28.48 260.84±33.21 305.58±23.48 177.21±10.74 211.43±12.31
Lysine 460.43±57.6 522.74±15.94 597.23±20.84 388.11±13.8 439.85±33.07
Isoleucine 567.54±44.93 981.62±65.09 1086.34±28.2 717.46±119.67 766.88±13.84
Leucine 881.42±55.74 955.45±94.24 1063.91±35.57 755.38±55.65 834.07±46.03
Phenylalanine 1019.57±40.19 1128.66±76.39 1235.4±49.28 890.48±71.62 961.28±53.65
TAA1) 15361.46±106.93 16830.58±91.25 18408.24±102.91 10825.19±117.58 12137.82±121.27
EAA2) 6655.51±81.35 7112.05±56.16 7777.48±76.54 5207.09±113.54 5736.49±68.88
EAA/TAA(%)3) 43.33±1.15 42.26±2.15 42.25±1.43 48.1±1.28 47.26±0.76
1) TAA, total amino acid
2) EAA, essential amino acid(Thr+Val+Met+Ile+Leu+His+Lys)
3) EAA/TAA(%), essential amino acid/total amino acid
실시예 10. 유리 아미노산 함량
제조예 1의 천연 조미료와 느타리 추출물, 느타리 유산균 발효물, 팽이 추출물, 팽이 유산균 발효물의 유리 아미노산 분석 결과는 표 15와 같다. 유산균 발효물의 대조군은 각각의 버섯 추출물을 사용하였다. 총 16종의 아미노산 중 주요 아미노산은 아르기닌(arginine), 글루탐산(glutaminc acid), 세린(serine)으로 나타났으며, 총 유리 아미노산 함량은 느타리와 팽이 각각 3910.32 mg%와 2273.42 mg%로 느타리가 유의적으로 높았다. 그 중 필수 아미노산인 트레오닌(threonine), 발린(valine), 메티오닌(methionine), 라이신(lysine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 히스티딘(histidine), 페닐알라닌(phenyalanine)의 8 성분의 총 함량은 느타리와 팽이 각각 1994.98 mg%와 1145.34 mg%이였다. 유산균 발효물을 대조군의 유리 아미노산 함량을 비교한 결과 느타리와 팽이에서 모두 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 맛은 유리 아미노산에 의해 좌우되는데, 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)은 발효물의 감칠맛을 내는 성분으로 알려졌으며, 류신과 이소류신은 씁쓸한 맛에 영향을 줄 수 있다고 알려졌다. 본 결과에 따라 증가된 아미노산이 유산균 발효물의 풍미에 크게 영향을 줄 것으로 사료된다.
유리 아미노산 분석결과(mg%)
Free amino acids 천연 조미료 느타리 추출물 느타리 발효물 팽이 추출물 팽이 발효물
Aspartic acid 127.51±29.75 112.47±23.92 123.7±21.19 64.44±6.7 71.86±7.35
Serine 498.87±20.48 394.87±20.13 462.22±29.85 194.74±17.33 282.24±9.09
Glutamic acid 701.45±38.66 604.93±29 645.63±39.16 413.86±10.27 442.59±2.77
Glycine 221.33±13.73 193.41±68.5 203.57±23.17 107.32±10.12 115.89±10.18
Histidine 407.16±26.28 383.19±4.32 387.49±2.67 218.8±4.2 273.87±3.58
Arginine 413.14±13.29 360.29±13.57 400.69±7.11 159.03±10.18 178.01±9.33
Threonine 384.11±15.24 322.14±40.18 349.09±0.13 221.21±14.25 289.14±2.14
Alanine 121.74±11.57 91.26±29.18 119.62±4.02 64.44±14.94 86.56±13.18
Proline 94.93±6.9 71.42±6.48 84.7±6 59.42±8.56 62.66±9.32
Tyrosine 102.11±16.36 86.69±20.77 92.19±0.64 64.83±10.27 70.82±5.41
Valine 206.34±35.54 183.27±18.11 195.44±11.99 130.79±20.24 156.06±14.75
Methionine 122.01±4.79 103.03±10.8 117.43±21.03 56.41±3.35 74.3±12.72
Lysine 404.23±21.15 349.09±17.41 387.49±29.27 126.66±11 140.4±18.72
Isoleucine 213.95±26.59 172.28±12.47 193.38±13.7 93.65±16.73 101.18±8.81
Leucine 202.98±11.57 187.38±23.07 190.85±7.97 99.79±10.46 105.6±10.45
Phenylalanine 313.58±20.03 294.6±27.82 306.91±21.51 198.03±18.67 237.96±15.86
TAA1) 4535.44±131.86 3910.32±283.51 4260.4±169.92 2273.42±132.99 2689.14±82.76
EAA2) 2254.36±124.66 1994.98±109.57 2128.08±78.53 1145.34±143.57 1378.51±80.79
EAA/TAA(%)3) 49.71±1.46 51.02±2.14 49.95±2.28 50.38±1.98 51.26±1.73
1) TAA, total amino acid
2) EAA, essential amino acid(Thr+Val+Met+Ile+Leu+His+Lys)
3) EAA/TAA(%), essential amino acid/total amino acid
실시예 11. 생리활성 분석 결과
1) DPPH 라디칼 소거능 분석결과
DPPH 라디칼 소거 활성법은 화학적으로 유도되는 비교적 안정한 라디칼로서 시료의 자유 라디칼 소거능력이나 수소 공여능력을 평가하는 방법이다. 느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 DPPH 라디칼 소거능 분석 결과는 도 5와 같다. 400 ㎍/mL의 농도에서 발효물이 원물에 비해 전자공여능이 증가하는 것으로 확인되었으며, 느타리 발효물은 27.7%, 팽이 발효물은 38.2%, 천연 조미료는 43.3%의 전자공여능을 나타냈다.
2) 하이드록시 라디칼(Hydroxyl radical) 소거능 분석결과
하이드록시 라디칼(Hydroxyl radical)은 활성산소종 중에서 가장 반응성이 크고 인접한 생체 분자에 심각한 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다. 느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical) 소거능 분석 결과는 도 6과 같다. 전체 시료에서 발효물이 원물에 비해 하이드록시 라디칼(Hydroxyl radical) 소거능이 증가하는 것으로 확인되었으며, 400 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 17.8%, 느타리 발효물은 19.1%, 팽이 추출물은 18.5%, 팽이 발효물은 23.0%, 천연 조미료는 34.1%의 소거능을 나타내었다.
3) α-아밀라아제(α-amylase) 저해활성 분석결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 α-아밀라아제(α-amylase) 저해활성 분석결과는 도 7과 같다. 400 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 26.2%, 느타리 발효물은 28.2%, 팽이 추출물은 15.8%, 팽이 발효물은 24.4%, 천연 조미료는 38.3%의 소거능을 나타냈다.
4) α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해활성 분석결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해활성 분석결과는 도 8과 같다. 400 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 30.6%, 느타리 발효물은 30.6%, 팽이 추출물은 25.8%, 팽이 발효물은 29.4%, 천연 조미료는 37.6%의 소거능을 나타냈다.
5) 리파아제(lipase) 저해활성 분석결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 식물성 발효조미료의 리파아제(lipase) 저해활성 분석결과는 도 9와 같다. 400 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물 26.4%, 느타리 발효물은 33.6%, 팽이 추출물은 35.2%, 팽이 발효물은 38.7%, 천연 조미료는 44.8%의 소거능을 나타냈다.
실시예 12. 세포독성 분석 결과
1) Raw264.7에 대한 세포독성 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 raw264.7에 대한 세포독성 분석결과는 도 10과 같다. 모든 시료에서 raw264.7에 대한 세포독성은 나타나지 않았다.
2) RBL-2H3에 대한 세포독성 분석 결과
RBL-2H3는 비만세포(mast cell)로서 히스타민 등 염증 매개체가 가득한 과립을 가지고 있다. 비만세포가 활성화되고, 탈과립에 의해 과립 내부의 염증매개체가 유리하면 염증 반응이나 알레르기 반응이 일어난다. 느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 RBL-2H3에 대한 세포독성 분석결과는 도 11과 같다. 모든 시료에서 RBL-2H3에 대한 세포독성은 나타나지 않았다.
3) AGS에 대한 세포독성 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 AGS에 대한 세포독성 분석결과는 도 12와 같다. 모든 시료에서 AGS에 대한 세포독성은 나타나지 않았다.
실시예 13. 항염증 효과 분석 결과
1) NO(Nitric oxide) 억제 효과 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 NO(nitric oxide) 억제 효과 분석 결과는 도 13과 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리는 82.0 uM, 느타리 발효물은 60.5 uM, 팽이 추출물은 86.0 uM, 팽이 발효물은 64.9 uM, 천연 조미료는 60.1 uM의 NO(Nitric oxide) 생성률을 나타냈다. 모든 시료가 각각의 농도에서 원물에 비해 발효물이 NO(Nitric oxide)의 생성을 억제하였다.
2) IL-1β 억제 효과 분석 결과
사이토카인 유전자 발현에 미치는 영향을 살펴보기 위해 IL-1β 분석을 실시하였다. IL-1(Interleykin-1)의 주요기능은 감염이나 다른 자극에 대한 숙주의 염증반응 매개자로서의 역할이며 T세포, B세포, 대식세포 등에 주요한 역할을 담당하게 되며 특히 염증반응을 통한 면역반응이 큰 범위를 차지하고 있다. 느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 IL-1β 억제 효과 분석 결과는 도 14와 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 305.0 pg/mL, 느타리 발효물은 211.0 pg/mL, 팽이 추출물은 298.7 pg/mL, 팽이 발효물은 245.0 pg/mL, 천연 조미료는 201.9 pg/mL의 IL-1β 생성을 나타냈다.
3) TNF-α 억제 효과 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 TNF-α 억제 효과 분석 결과는 도 15와 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 720.0 pg/mL, 느타리 발효물은 624.0 pg/mL, 팽이 추출물은 781.0 pg/mL, 팽이 발효물은 698.0 pg/mL, 천연 조미료는 641.0 pg/mL의 TNF-α 생성을 나타냈다.
4) PGE2 억제 효과 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 PGE2 억제 효과 분석 결과는 도 16과 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 286.0 pg/mL, 느타리 발효물은 201.0 pg/mL, 팽이는 278.5 pg/mL, 팽이 발효물은 236.0 pg/mL, 천연 조미료는 192 pg/mL의 PGE2 생성을 나타냈다.
5) β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분석 결과
느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 β-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 분석 결과는 도 17과 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 160.0%, 느타리 발효물은 140.0%, 팽이 추출물은 169.0%, 팽이 발효물은 150.0%, 천연 조미료는 138.0%의 분비율을 나타냈다.
6) 히스타민(Histamine) 억제 효과 분석 결과
알레르기 즉시 반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 살펴보기 히스타민(histamine)의 분비를 측정하였다. 느타리 추출물, 느타리 발효물, 팽이 추출물, 팽이 발효물, 천연 조미료의 히스타민 억제 효과 분석 결과는 도 18과 같다. 500 ㎍/mL의 농도에서 느타리 추출물은 40.3 pg/mL, 느타리 발효물은 32.0 pg/mL, 팽이 추출물은 49.2 pg/mL, 팽이 발효물은 39.0 pg/mL, 천연 조미료는 29.5 pg/mL의 히스타민 생성을 나타냈다.
한국생명공학연구원 KCTC18859P 20201029 한국생명공학연구원 KCTC18860P 20201029

Claims (5)

  1. (1) 다시마에 물을 18~22배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 2~4시간 동안 열수 추출하고 건조하여 다시마 추출물을 제조하는 단계;
    (2) 느타리버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 75~85℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 느타리 추출물을 제조하는 단계;
    (3) 팽이버섯에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 85~95℃에서 3~5시간 동안 열수 추출하여 팽이 추출물을 제조하는 단계;
    (4) 상기 (2)단계의 제조한 느타리 추출물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) JMIL002 균주(KCTC18860P)를 접종하여 34~40℃에서 2~4일 동안 발효하여 느타리 유산균 발효물을 제조하는 단계;
    (5) 상기 (3)단계의 제조한 팽이 추출물에 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) JMIL001 균주(KCTC18859P)를 접종하여 34~40℃에서 2~4일 동안 발효하여 팽이 유산균 발효물을 제조하는 단계; 및
    (6) 천연 조미료 총 중량 기준으로, 상기 (4)단계의 제조한 느타리 유산균 발효물 45~55 중량%, 상기 (5)단계의 제조한 팽이 유산균 발효물 27~33 중량% 및 상기 (1)단계의 제조한 다시마 추출물 18~22 중량%를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 천연 조미료의 제조방법.
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