KR102276804B1

KR102276804B1 - 방사성 약물 컨쥬게이트

Info

Publication number: KR102276804B1
Application number: KR1020177011386A
Authority: KR
Inventors: 캐드린 헬레나 스탠포드 드라이버; 잔 리진 제바르트; 모하메드 이크발 파커; 로저 헌터
Original assignee: 더 싸우쓰 아프리칸 뉴클리어 에너지 코포레이션 리미티드; 유니버시티 오브 케이프 타운
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2021-07-15
Also published as: JP2017530131A; EP3197504A2; CN107106709B; RU2017114360A; AU2015323328A1; WO2016046793A3; JP6821558B2; US10874753B2; WO2016046793A2; ZA201702638B; CN107106709A; CA2962525C; US20170296684A1; MX2017003886A; KR20170095810A; AR102105A1; CA2962525A1; AU2015323328B2; GB201417067D0; RU2017114360A3

Abstract

본 발명은 암의 개선된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 신규한 방사성약물 컨쥬게이트에 관한 것이다. 방사성약물 컨쥬게이트는 순차적으로; 시험관내 또는 생체내 EPR 제제와 결합할 수 있는 링커에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질; 또는 시험관내 또는 생체내 EPR 제제와 결합할 수 있는 링커에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제를 포함한다. 본 발명의 방사성약물 컨쥬게이트는 암의 진단 및 치료법을 위해 이용되는 방사성약물의 생체분포 및 약리학적 독성의 개선을 도울 수 있는 능동 및 수동 표적화 방사선핵종 전달 시스템을 제공한다.

Description

방사성 약물 컨쥬게이트{RADIOPHARMACEUTICAL CONJUGATE}

본 발명은 암의 개선된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 신규한 방사성약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.

암은 종양으로 공지된 세포성 물질의 형성을 일으키는 비정상적 세포의 제어되지 않는 성장이 존재하는 신생물(신규 성장) 질환으로 정의된다. 대부분의 경우, 치료하지 않고 방치되면, 종양의 성장은 궁극적으로 개체의 사망으로 이어진다. 암 세포는 종종 신체의 다른 부분에서 종양 성장을 일으키는 림프계 및 혈관계를 통한 변형 세포의 파종을 일으키는 악성이다.

일단 암이 진단되면, 일반적인 치료 형태에는 수술, 화학치료법 또는 방사선 치료법이 포함된다. 3가지의 조합이 가장 자주 적용된다.

수술은 환자 신체 내로의 절단에 의해 조직에 대한 물리적 개입이 수행되는 침습적 절차이다. 이후 수술에는 화학치료법 또는 방사선이 뒤따른다.

화학치료법은 암성 세포를 사멸시키기 위한 환자에 대한 합성 항암 약물의 투여이다. 일반적으로 DNA 합성 및 복제의 저해 또는 세포 유사분열의 저해를 일으킨 후 세포 아폽토시스의 유도로 이어지는 다양한 작용 기전을 갖는 다수의 화학치료 약물이 존재한다. 이러한 화학치료 약물은 여러 상이한 유형의 암 치료에서 비교적 효과적이지만, 더욱 일관적으로 더 장기간 동안 이들을 이용하는 데 있어서 주요 난제는 치료 동안 일어나는 다수의 부작용이다. 부작용은 오심, 구토, 탈모, 식욕 부진, 구강 궤양, 혈구수 감소 및 여러 다른 보다 심각한 효과에 이른다. 이러한 효과는 투여되는 약물이 암 세포에 영향을 미치는 것뿐만 아니라 신체에 걸쳐 확산되고 또한 정상의, 건강한 세포를 손상시키거나 사멸시키는 결과이다.

통상적인 방사선 치료법은 종양 세포를 사멸시키기 위한 고에너지 방사선, 예컨대 X-선, 감마선 및 하전 입자의 이용이다. 방사선이 직접 또는 하전 입자, 예컨대 반응성 산소종을 생성함으로써 비가역적으로 DNA를 손상시키는 경우, 세포가 파괴된다. 종양 부위의 조사는 외부-빔 방사선 치료법을 위한 기계에 의해 또는 내부 방사선 치료법을 위한 종양 내 배치된 방사활성 물질 씨드에 의해 수행된다. 방사선 치료법은 특히 수술 및 화학치료법과 조합되어, 실행 가능한 암 치료의 원천이지만, 역시 그 난제가 없는 것은 아니다. 방사선이 또한 주변의 건강한 조직을 손상시킨다는 사실 외에도, 또 다른 난제는 방사선이 고형 종양 환경에서 확인되는 저산소(저산소증) 조건에서 크게 효과적이 아니라는 것이다. 이어서 감소된 방사선감수성은 종양의 국소 재발 및 더 낮은 전반적 환자 생존율로 이어질 것이다.

암을 위한 현재의 치료 전략은 상당 백분율의 환자가 차도를 보이도록 하는데 성공하였다. 그러나 불행하게도, 암으로 진단된 상당 백분율의 환자는 생존하지 못하며, 치료는 받는 모든 환자는 다양한 정도의 매우 불쾌한, 유해 부작용을 갖는다.

WO 2011/0059076 ("McDonagh). KR10-2019-7011110 KR10-2015-7037184 KR10-2016-7011208

MULLER, C. et al. "DOTA Conjugate with an Albumin-Binding Entity Enables the First Folic Acid-Targeted 177Lu-Radionuclide Tumor Therapy in Mice", The Journal of Nuclear Medicine, Vol. 54, No. 1, January 2013, pp. 124-131.

본 발명의 목적은 암의 개선된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 신규한 방사성약물 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 바이오컨쥬게이트는 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제, 및 EPR 제제를 포함하며, 여기서 EPR 제제는 절단 가능한 링커에 의해 바이오컨쥬게이트에 결합된다.

본 발명은 또한 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제, 및 시험관내 또는 생체내 EPR 제제와 결합할 수 있는 절단 가능한 링커를 포함하는 프로컨쥬게이트를 포괄한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오컨쥬게이트는 순차적으로:

EPR 제제에 결합되는, 링커, 바람직하게는 절단 가능한 링커에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질을 포함하는 선형 분자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로컨쥬게이트는 순차적으로:

시험관내 또는 생체내 EPR 제제와 결합할 수 있는 링커, 바람직하게는 절단 가능한 링커에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질을 포함하는 선형 분자이다.

"링커"는 킬레이트화제를 EPR 제제에 연결하는 적합한 길이(4개 내지 20개, 전형적으로 8개 내지 15개 탄소 원자)의 탄소쇄를 포함한다. 링커는 절단 불가능할 수 있지만, 바람직하게는 절단 가능한 링커이다. 절단 가능한 링커는 종양 환경 내에서, 예를 들어 산성 pH(7 미만, 전형적으로 약 4 내지 6의 pH)에 의해, 글루타치온(종양 환경에서 고수준으로 존재함)에 의해, 또는 효소, 예컨대 기질 프로테아제의 상향-조절이 존재하는 경우, 생체내 절단되는 절단 가능한 결합을 함유하며; EPR 제제로부터 대사물질 및 킬레이트화제를 방출하여 대사물질 및 킬레이트화제의 세포내 내재화를 허용한다. 절단 불가능한 링커의 예는 아마이드, 티오우레아, 티오에테르 또는 트리아졸 결합을 통해 연결되는 링커이다. 절단 가능한 링커의 예는 하이드라진, 또는 디설파이드 결합, 또는 효소적으로 절단 가능한 펩타이드 서열을 함유하는 링커이다.

"EPR 제제"란, 증강된 투과성 및 보유(EPR) 효과로 인해 종양 내 축적되는 40 kDa 초과 크기를 갖는 분자, 예컨대 중합체성 나노입자, 중합체성 마이셀, 덴드리머, 리포좀, 바이러스 나노입자, 탄소 나노입자 및 단백질, 예컨대 알부민 또는 헤파린을 의미한다.

EPR 제제는 생분해성인 합성 중합체, 예컨대 폴리글루타메이트(PG), 폴리락티드(PLA) 및 폴리(D,L-락티드-코-글리콜라이드)(PLGA), 생체적합성이지만 생분해성이 아닌 합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 N-(2-하이드록시프로필)메틸아크릴아마이드(HMPA), 또는 천연 중합체, 예컨대 알부민, 키토산 및 헤파린일 수 있다.

"종양 세포를 표적으로 하는 대사물질"이란 암-세포 표면 상의 상향-조절된 수용체, 항원 또는 다른 단백질에 의해 생체내 인식되는 모노클로날 항체, 단백질 및 펩타이드와 같은 분자 및 저분자(즉, 1000 Da 크기 미만(일반적으로 100 Da 내지 700 Da)인 분자)를 의미한다. 대사물질은 작동제 또는 길항제일 수 있다.

적합한 모노클로날 항체(mAb)의 예는 2C5, 젬투주맙(Gemtuzumab), 리툭시맙(Rituximab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 퍼투주맙(Pertuzumab) 및 PSMA Ab 항체이다.

단백질 및 펩타이드의 예는 트랜스페린(Transferrin), RGD 펩타이드, 옥트레오타이드(Octreotide), 봄베신(Bombesin), 및 VIP이다.

저분자의 예는 폴레이트, 만노오스, 글루코오스 및 갈락토오스이다.

"킬레이트화제"란 방사선동위원소와 착화될 수 있는 다양한 수의 헤테로원자, 일반적으로 O, N 또는 S로 구성되는 화합물인 2작용성 킬레이트화제(BFCA)를 의미한다. 킬레이트화제는 고리형 또는 비고리형, 바람직하게는 고리형일 수 있다.

고리형 킬레이터의 예는 1,4,7-트리아자사이클로노난(TACN); 1,4,7-트리아자사이클로노난-트리아세트산(NOTA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N-숙신산-N',N"-디아세트산(NOTASA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N-글루탐산-N',N"-디아세트산(NODAGA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리스(메틸렌포스폰산)(NOTP); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸([12]안N4)(사이클렌); 1,4,7,10-테트라아자사이클로트리데칸([13]안N4); 1,4,7,11-테트라아자사이클로테트라데칸(이소-사이클람); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA); 2-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일)아세테이트(DO1A); 2,2'-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,7-디일) 디아세트산(DO2A); 2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일) 트리아세트산(DO3A); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산)(DOTP); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,7-디(메탄포스폰산)(DO2P); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리(메탄포스폰산)(DO3P); 1,4,7,10-테트라아자사이클로-데칸-1-글루탐산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA); 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸-1-숙신산-4,7,10-트리아세트산(DOTASA); 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸([14]안N4)(사이클람); 1,4,8,12-테트라아자사이클로펜타데칸([15]안N4); 1,5,9,13-테트라아자사이클로헥사데칸([16]안N4); 1,4-에타노-1,4,8,11-테트라아자사이클로-테트라데칸(에트-사이클람); 1,4,8,11-15-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA); 2-(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-일) 아세트산(TE1A); 2,2'-(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-디일) 디아세트산(TE2A); 4,11-비스(카복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]-헥사데칸(CB-TE2A); 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]아이코산(Sar); 프탈로시아닌 및 이들의 유도체; 포르피린 및 이들의 유도체이다.

비고리형 킬레이터의 예는 에틸렌-디아민-테트라아세트산(EDTA); 및 디에틸렌-트리아민-펜타-아세트산(DTPA). S-아세틸머캅토숙신산 무수물(SAMSA); (2-머캅토에틸)(2-((2-머캅토에틸)아미노)에틸)-카르밤산(N2S2-DADT); 1,1'-(에탄-1,2-디일비스(아잔디일))비스(2-메틸프로판-2-티올)(N2S2 BAT-TM), (2-(2-머캅토아세트아마이도)에틸)-시스테인(N2S2-MAMA); 2,3-비스(2-머캅토아세트아마이도)-프로판산(N2S2 DADS); 에틸렌디시스테인(EC); 2,2',2"-니트릴로트리에탄티올(NS3); 2-에틸티오-N,N-비스(피리딘-2-일)메틸-에탄아민(N3S); ((2-머캅토아세틸)글리실글리실)카르밤산(MAG3) 및 4-(2-(2-(2-머캅토아세트아마이도)아세트아마이도)-아세트아마이도)부탄산(MAG2-GABA); (1,2-비스{[[6-(카복시)피리딘-2-일]메틸]-아미노}-에탄)(H2dedpa); 니트릴로트리스(메틸렌포스폰산)(NTMP); 에틸렌디아민테트라메틸렌-포스폰산(EDTMP), 디에틸렌트리아민펜타-메틸렌 포스폰산(DTPMP); 하이드라지노니코틴산(HYNIC); N'-{5-[아세틸(하이드록시)아미노]-펜틸}-N-[5-({4-[(5-아미노펜틸)-(하이드록시)아미노]-4-옥소부타노일}아미노)펜틸]-N-하이드록시숙신-아마이드(데페록사민)이다.

조영(진단)을 위해 이용될 수 있는 방사선핵종의 예에는 ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ⁵⁹Fe, ⁶³Zn, ⁵²Fe, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ⁶²Cu, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ^195mPt, ^191mPt, ^193mPt, ^117mSn, ⁸⁹Zr, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ¹²³I가 포함된다.

치료 목적을 위해 이용될 수 있는 방사선핵종의 예에는 ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹¹¹In, ¹⁵³Gd, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ⁶²Cu, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ^195mPt, ^193mPt, ¹⁹⁷Pt, ^117mSn, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ¹⁷⁷Lu, ²²³Ra, ²²⁴Ra, ²²⁷Th, ³²P, ¹⁶¹Tb　 ³³P, ¹²⁵I, ²⁰³Pb, ²⁰¹Tl, ¹¹⁹Sb, ^58mCo, ¹⁶¹Ho가 포함된다.

바람직한 방사선핵종은 오제 전자 방출 방사선핵종이다. 이들은 전자 포획 또는 내부 전자 전환 과정으로 인한 전자 껍질의 재배열 동안 붕괴 원자의 바깥쪽 껍질로부터 방출되는 매우 짧은 나노미터 범위의 매우 낮은 에너지(500 eV 미만)의 전자인 오제 전자를 방출하는 방사선핵종이다. 이러한 방사선핵종에는 ¹¹¹In, ²⁰³Pb, ²⁰¹Tl, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ¹¹⁹Sb, ^58mCo, ¹⁶¹Ho, ¹⁶¹Tb, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ^195mPt, ^193mPt, ^117mSn이 포함된다.

본 발명은 또한 방사선핵종을 함유하는 킬레이트화제를 포함하는, 상기 정의된 바이오컨쥬게이트 또는 프로컨쥬게이트를 포괄한다.

본 발명의 추가 양태에는 링커에 대한 부착을 위한 EPR 제제의 개질 및 킬레이트화제에 대한 부착을 위한 대사물질의 개질뿐만 아니라 링커 및 킬레이트화제의 개질이 포함된다.

본 발명의 구현예에 따른 방사성약물 바이오컨쥬게이트는 하기 3가지 합성 성분:

1) 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 바람직하게는 알킬화 또는 아실화를 통해 킬레이트화제에 대한 연결을 위해 작용화되는 글루코오스 함유 링커;

2) 킬레이트화제, 바람직하게는 방사선동위원소 킬레이트화를 위해 N-결합을 통해 작용화되는 사이클람; 및

3) 링커, 바람직하게는 EPR 제제에 대한 부착을 위해 말레이미드로 작용화되는 링커

의 연결에 의해 프로-컨쥬게이트를 형성한 뒤,

4) 생체분자/EPR 제제, 바람직하게는 알부민에 결합된다.

바람직한 방사선핵종은 103Pd이다.

프로컨쥬게이트의 합성 방법을 위한 조건:

대사물질의 작용화는 대사물질 내의 반응기에 대한 적합한 보호 전략이 수행될 것을 필요로 한다. 이어서 대사물질이 알킬 할라이드쇄와 반응하여, 적합한 말단 작용기를 갖는 탄소쇄에 연결된 대사물질을 형성한 뒤 할라이드 또는 산 클로라이드로 전환된다;

절단 불가능한 링커의 작용화는 치환을 위해 적합한 작용기를 갖는 적합한 길이의 알킬쇄가 킬레이트화제에 대한 부착을 위해 하나의 말단에 알킬 할라이드를 갖고 다른 말단에 보호 아민을 갖는 링커로 전환될 것을 필요로 한다. 절단 가능한 링커의 작용화는 적합한 말단 작용기를 갖는 2개의 적합한 단편이 절단될 수 있는 결합; 예로서, 디설파이드 결합을 통해 연결되고; 제1 단편은 킬레이트화제에 대한 부착을 위해 하나의 말단에 알킬 할라이드를, 그리고 다른 말단에 티오토실레이트를 함유하고, 제2 단편은 킬레이트화제에 대한 원위 말단에 보호 아민을, 그리고 근위 말단에 티올기를 함유할 것을 필요로 한다;

킬레이터의 작용화는 킬레이터가 먼저 SN2 반응을 통해 링커로 단일-알킬화된 후, SN2 또는 SNAc 반응을 통해 대사물질로 두 번째로 알킬화될 것을 필요로 한다. 이어서 매크로사이클의 나머지 아민이 금속 착화를 보조할 적합한 아세테이트기와 반응한다. 그 뒤, 모든 보호 작용기의 탈보호 전략이 수행된다. 이어서 말단 아민이 EPR 제제에 결합하기 위한 작용기, 예컨대 말레이미드로 전환된다.

방사선표지화는 수중 프로-컨쥬게이트를 용해시켜 수행된다. 프로-컨쥬게이트에 방사선표지화를 실시하기 위한 방사선동위원소 수용액이 첨가된다.

상술된 바이오컨쥬게이트 및 프로컨쥬게이트를 함유하는 제형물은 수용액 중 이미 방사선표지되었거나 되지 않은 바이오컨쥬게이트 또는 프로컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 특정한 프로-컨쥬게이트가 수용성이 아닌 경우, 소량의 에탄올 또는 디메틸설폭사이드가 세포에 독성이 아닌 수준으로 이용될 수 있다. 방사선동위원소에 대한 착화는 소정량의 프로-컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트뿐만 아니라 필요한 경우 수용액 중 방사선동위원소가 첨가되는 표지화를 위해 환원성 제제를 포함하는 밀봉 용기가 포함되는 키트 형태로 수행될 수 있다. 키트는 또한 약제학적 보조 물질, 예컨대 삼투압을 위한 약제학적 등급의 염, 완충제, 보존제, 항산화제 등을 함유할 수 있다. 키트 성분은 액체, 냉동 또는 건조 형태일 수 있다.

진단 및 치료적 처치 방법은 멸균 식염수 또는 혈장 중 정맥내 또는 복강내 선량으로서의 방사선표지된 컨쥬게이트의 투여를 필요로 한다. 투여될 단위 선량은 약 0.01 mCi 내지 300 mCi의 방사활성을 가지며, 상기 선량으로 주사되는 용액은 0.1 mL 내지 10 mL이다.

본 발명은 약물의 약동학 및 생체적합성을 개선함으로써 약물 부작용을 감소시켜 암 약물의 유효성을 증가시키기 위한 보다 효율적이고 정확한 전달 시스템에 의해 표적화된 암 치료법을 위한 신규한 방사성약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.

수동 표적화는 종양 혈관계의 독특한 해부학적 및 병태생리학적 비정상성으로 인한 종양 내 특정한 치료 거대분자의 선택적 축적이다. 이러한 비정상성에는 결손 혈관 구조 및 불량한 림프 유출을 포함하는 과혈관계가 포함되며, 이들은 함께 EPR 효과로 알려지게 되었다.

능동 표적화는 능동 표적화제의 효율이 표적화되는 수용체에 의존하게 되는 암 세포 상 세포-표면 분자 및 수용체의 부위-특이적 표적화이다. 이상적으로, 표적화되는 세포 수용체 또는 표면 항원은 암 세포 상에서 배타적으로 그리고 균일하게 발현되고 혈류 내로는 방출되지 않을 것이다. 또한, 선택된 표적화제는 일단 표면에 결합되면, 일반적으로 수용체-매개 세포내이입을 통해 세포 내로 내재화될 것임이 보장되어야 한다.

따라서, 종양 내에 축적되기 위해 종양 미세환경 및 EPR 효과를 이용하도록 설계되는 약물의 개발 및 이용은 수동 표적화로 알려져 있는 반면, 상향조절된 세포 수용체 중 하나에 대해 높은 친화도를 가지며 이에 따라 종양 세포 내에서 이들의 축적을 증가시키도록 개발되는 약물은 능동 표적화로 알려져 있다.

방사성약물은 핵 의약 분류에 속한다. 진단 방사성약물은 편재 부위를 조영하기 위해 외부적으로 기록되는 방사선 방출을 일으킨다. 따라서 치료를 위한 방사성약물의 이용은 이들이 이환 조직 부위에 내부적으로 방사선 선량을 전달하고 방출이 주변 세포를 파괴함에 따라 내부방사선치료법의 형태로 분류될 수 있다. 종양 조영제는 10 nm 내지 1000 nm 범위로 이용되며 임의의 약리학적 효과를 갖지 않아야 하는 반면, 치료제는 이온화 방사선에 의해 수행되는 손상에 근거하여 효과를 가지며, 이에 따라 조영제보다는 약간 더 높은 농도로 그러나 여전히 화학치료제보다는 훨씬 더 소량으로 이용된다.

방사성약물은 일반적으로 방사선핵종 및 담체의 2가지 성분으로 제조되며, 조영 또는 치료법을 위한 방사성약물의 기능 및 효율을 결정하는 것은 이들 두 양태이다. 방사성약물의 목표는 건강한 조직에 대해 임의의 방사선 손상 없이 종양 부위로 방사선핵종을 정량적으로 전달하는 것이다. 이와 같이, 방사성약물의 설계는 이용되는 방사선동위원소의 물리적 붕괴 특성, 종양의 구체적인 생체내 표적화 및 다른 조직으로부터의 화합물 제거에 대한 주의 깊은 고려를 필요로 한다. 앞서 논의된 바와 같이, 수용체 결합을 통한 방사성약물 편재는 능동 표적화로 기재되는 반면, 종양 내재적 특성 및 EPR-효과를 통한 편재는 수동 표적화로 기재된다. 능동 및 수동 표적화 방사선핵종 전달 시스템은 암의 진단 및 치료법을 위해 이용되는 방사성약물의 생체분포 및 약리학적 독성의 개선을 도울 수 있다.

본 발명의 방사성약물 컨쥬게이트는 "수동" 표적화 및 증강된 투과성 및 보유(EPR), 및 "능동"(수용체-매개) 표적화를 이용하여 표적화 암 치료법을 달성하도록 구축된다.

본 발명에 따른 방사성약물 바이오컨쥬게이트는 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제, 및 EPR 제제를 포함하며, 여기서 EPR 제제는 링커에 의해 바이오컨쥬게이트에 결합된다.

본 발명은 또한 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제, 및 시험관내 또는 생체내 EPR 제제와 결합할 수 있는 절단 가능한 링커를 포함하는 방사성약물 프로컨쥬게이트를 포괄한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 바이오컨쥬게이트는 순차적으로, EPR 제제에 결합되는, 링커, 바람직하게는 절단 가능한 링커에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질을 포함하는 선형 분자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로컨쥬게이트는 순차적으로, 시험관내 또는 생체내 EPR 제제에 결합할 수 있는 링커에 결합되는, 방사선핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질을 포함하는 선형 분자이다.

"EPR 제제"에는 중합체 나노입자, 중합체성 마이셀, 덴드리머, 리포좀, 바이러스 나노입자, 탄소 나노입자 및 일부 단백질과 같은 분자가 포함된다.

중합체는 생체적합성이고 합성이거나 천연일 수 있는 반복 단량체 서브유닛으로부터 합성되는 생분해성 거대분자이다. 중합체-약물 컨쥬게이트는 중합체 골격에 약물을 공유 결합시키거나 중합체 나노입자 내에 수성상 약물을 캡슐화하여 형성된다. 효율적인 중합체-약물 전달 시스템을 수득하기 위해, 중합체는 무독성이고, 우수한 약물 로딩능을 가지며, 신체를 통한 이동에 있어서 안정하지만 원하는 위치에서 약물을 방출할 수 있어야 한다. 생분해성인 합성 중합체의 예에는 폴리글루타메이트(PG), 폴리락티드(PLA) 및 폴리(D,L-락티드-코-글리콜라이드)(PLGA)가 포함된다. 생체적합성이지만 생분해성이 아닌 합성 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 N-(2-하이드록시프로필)메틸아크릴아마이드(HMPA)가 포함된다. 이용될 수 있는 천연 중합체성 단백질은 알부민, 키토산 및 헤파린이다. 알부민은 혈청 중에 자연 발생하는 66.5 kDa 단백질이며, 약물에 공유 접합될 뿐만 아니라 약물을 캡슐화하는 나노입자 내로 제형화되었다.

중합체성 마이셀은 양쪽성 블록 공중합체에 의해 형성되며, 약물을 캡슐화하는 소수성 코어 및 마이셀을 수용성으로 만드는 친수성 껍질을 생성한다.

덴드리머는 중심 코어로부터 방사해 나오는 분기형 단량체로부터 형성되는 중합체이며, 여러 상이한 분자 또는 약물을 동시에 접합할 수 있다.

리포좀은 수성 환경 중 인지질의 이중층으로의 자가-연합에 의해 자발적으로 형성되는 약 400 nm의 구형 인지질 이중층이다. 약물은 약물 포화 수성 환경 중 리포좀의 조립을 포함하는 다양한 방식으로 또는 유기 용매 교환 기전에 의해 리포좀 내에 로딩된다.

단백질 케이지를 형성하는 바이러스 나노입자 및 용해도를 개선하고 약물에 결합하기 위해 표면 개질을 갖는 탄소 나노입자는 수동 표적화 및 약물 전달을 위해 이용된 다른 나노입자들이다. 하나의 예는 카우피 모자이크 바이러스(CPMV)이다.

EPR 효과는 혈관으로부터 종양 환경 내로의 화합물 삼출에 기반하므로, 상기 효과에 영향을 미칠 수 있고 따라서 약물의 종양 부위로의 흡수 또는 표적화를 증강시키기 위한 하나의 방식으로 또는 다른 방식으로 이용될 수 있는 여러 혈관 매개체가 존재한다. 이들 혈관 매개체에는 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 브래디키닌, 산화 질소 및 퍼옥시니트라이트, 프로스타글란딘, 기질 메탈로프로티나아제 및 안지오텐신 전환 효소(ACE) 저해제가 포함된다. VEGF는 혈관 형성 및 종양 성장에 관여되는 상향조절된 혈관신생 인자이며, VEGF의 여러 저해제가 개발되었다. 브래디키닌(혈관 확장 펩타이드), 산화 질소, 퍼옥시니트라이트 및 프로스타글라딘은 모두 혈관 투과성 및 삼출에서 중요한 역할을 담당하며, 염료/알부민 복합체의 투여 시 이들 매개체의 첨가가 종양 내 염료의 섭취를 증가시킴이 주지되었다. 기질 메탈로프로티나아제는 종양 침습, 전이 및 혈관신생에 관여되는 효소이며, 퍼옥시니트라이트에 의한 이들의 활성화는 세포외 기질의 분해에 의해 EPR 효과를 촉진할 뿐만 아니라 브래디키닌의 생산으로 이어진다. ACE(안지오텐신 전환 효소) 저해제는 안지오텐신(AT)-I의 AT-II로의 전환을 방지하고, 이어서 브래디키닌의 분해를 저해하여 증가된 혈관 투과성으로 이어진다.

"종양 세포를 표적으로 하는 대사물질"은 암-세포 표면 상의 상향-조절된 수용체, 항원 또는 다른 단백질에 의해 인식되는 모노클로날 항체, 단백질 및 펩타이드와 같은 분자 및 저분자(즉, 1000 Da 미만 크기(일반적으로 100 Da 내지 700 Da)인 분자)이다. 대사물질은 작동제 또는 길항제일 수 있다.

항체는 세포 상의 외래 표적에 결합하고 세포사를 일으키는 경로를 저해하는 고분자량의 Y-형 당단백질이다. 적합한 모노클로날 항체(mAb)의 예는 2C5, 젬투주맙, 리툭시맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 퍼투주맙 및 PSMA AntibodyAb이다. 트라스투주맙은 유방암 환자의 상당수에서 과발현되는 것으로 나타난 HER-2/neu 수용체에 대한 mAb이다. VEGF 및 표피 성장 인자(EGF)는 둘 다 종양 성장 및 혈관신생에 관여되며, 이들의 수용체(VEGFR 및 EGFR)는 여러 mAb 치료법이 초점을 맞추고 있다. 세툭시맙은 EGFR에 대해 작용하는 반면, 베바시주맙은 VEGFR에 결합한다. mAb의 다양성에도 불구하고, 불량한 종양 축적(0.01% 미만), 교차 반응성 및 생체내의 느린 혈중 제거로 인해 실제로 이들의 이용은 제한되었다. 초기에 mAb에 대한 약물의 직접적 접합은 제한된 수의 약물 분자만 mAb에 동시 부착될 수 있기 때문에 제한된 성공을 거두었다. 그 뒤 이러한 난제는 나노입자 표면으로의 mAb 부착 및 나노입자 내로의 약물 로딩에 의해 해결되었다.

단백질 및 펩타이드는 대안적인 표적화 전략을 제공한다. 단백질 및 펩타이드의 예는 트랜스페린, RGD 펩타이드, 옥트레오타이드, 봄베신, 및 VIP이다. 트랜스페린(Tf)은 혈중 철에 결합하고 트랜스페린-수용체에 대한 부착에 의해 이를 세포 내로 수송하는 자연 발생 단백질이다. 펩타이드는 이들의 더 작은 분자 크기로 인해 개선된 안정성 및 분해에 대한 내성을 갖는 아미노산 서열이다.

펩타이드의 예는 과발현되는, 친-혈관신생 수용체 αvβ3 인테그린에 결합하는 아르기닌(R), 글리신(G), 아스파르트산(D)(RGD) 서열이다. 이용된 다른 펩타이드에는 자연 발생 신경펩타이드인 소마토스타틴(SST)의 합성 유사체이고 SST 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 옥트레오타이드가 포함된다. 봄베신은 여러 암 상의 GRP 수용체에 결합하는 가스트린-분비 호르몬 펩타이드(GRP)의 펩타이드 유사체인 반면, 혈관작용성 창자 펩타이드(VIP)는 유방암 상에서 과발현되는 VIP 수용체에 결합한다.

저분자(즉, 1000 Da 미만 크기인 분자)는 이들의 입수 가능성, 개선된 안정성, 및 더 용이한 합성 및 접합을 허용하는 작은 크기로 인해 표적화 리간드로서 더 유리한 것으로 증명되고 있다. 능동 표적화를 위해 화학치료 약물에 부착되는 가장 일반적인 저분자는 폴레이트이다. 폴레이트는 매우 높은 친화도(KD 약 1 nm)로 표면 폴레이트 수용체(FR)에 결합하며 수용체-매개 세포내이입을 통해 쉽게 내재화된다. 표적화 리간드로서의 엽산의 다른 장점은 이것이 안정하고, 비-면역원성이고, 저렴하고, 합성을 위해 이용되는 유기 용매 중에서 가용성이라는 것이다. 표적화를 위해 이용되는 다른 저분자는 렉틴으로 불리는 막 단백질에 의해 인식되는 탄수화물, 예컨대 만노오스, 글루코오스 및 갈락토오스이다. 그 한 예는 독소루비신 결합 중합체에 접합된 갈락토사민의 암세포에 대한 표적화였다.

킬레이터로도 불리는 "킬레이트화제"는 방사선동위원소와 착화할 수 있는 다양한 수의 헤테로원자, 일반적으로 O, N 또는 S로 구성되는 화합물인 2작용성 킬레이트화제(BFCA)이다. 킬레이터의 선택은 킬레이터의 배위 화학 및 공여능이 방사선동위원소 특성과 매치되어 가장 안정한 불활성 금속 착물을 형성하도록 방사선동위원소의 성질 및 산화 상태에 의해 결정된다.

BFCA로 이용되는 킬레이터는 산소, 질소 및 황 공여체 리간드를 통해 안정한 착물을 형성한다. BFCA의 안정성 및 약동학은 또한 금속과 더 잘 배위하기 위해 다양한 작용기를 갖는 기본 알킬 골격의 개질에 의해 개선될 수 있다.

BFCA는 비고리형 킬레이터 및 고리형 킬레이터의 두 그룹으로 분류될 수 있다. 비고리형(개환쇄) 킬레이터는 일반적으로 이들의 고리형 대응물에 비해 더 빠른 금속-착화 운동속도를 갖지만, 일반적으로는 동적으로 더 불안정하다. 그러나 소수의 비고리형 킬레이터는 특정한 방사선동위원소와 함께 시험관내에서 높은 열역학적 안정성 및 동적 불활성을 나타낸다.

비고리형 킬레이터의 일례는 N-디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 및 그 유사체이다. N₂S₂ 킬레이터는 ^99mTc 및 ¹⁸⁶Re를 이용한 단백질, 펩타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 표지화에 이용되었다. 이러한 킬레이터 중 가장 단순한 것은 N,N'-에탄-비스(아미노에탄티올)(DADT)로, 이는 추가 N₂S₂ 킬레이터, 예컨대 N,N'-에탄-비스(1,1-디메틸아미노에탄티올)(BAT-TM), 모노아마이드-모노아민디티올(MAMA) 및 N,N'-에탄-비스(머캅토-아세트아마이드)(DADS)의 개발을 위한 구성 블록으로 이용된다. 가장 최근 개발된 N₂S₂ 킬레이터는 ^99mTc를 효율적으로 그리고 안정적으로 킬레이트화하기 위해 에틸렌디시스테인(EC)을 이용한다(96). N₃S BFCA, 예컨대 트리아마이드티올(TAT)은 ¹⁸⁶Re 및 ¹⁸⁸Re를 착화하기 위해 이용된다. N₃S 시리즈에서 일반적으로 이용되는 BFCA는 머캅토아세틸-글리실글리실글리신(MAG₃) 및 머캅토아세틸-글리실글리실-γ-부티르산(MAG₂-GABA)이다. 가장 구체적으로 Ga(III)에 결합하기 위한 또 다른 비고리형 킬레이터는 (1,2-비스{[[6-(카복시)피리딘-2-일]메틸]-아미노}-에탄)(H₂dedpa)이다. H₂dedpa는 28.1의 안정성 상수로 Ga에 결합하는 N₄O₂킬레이터이다.

뼈암은 많은 통증을 유발하며 확정된 치료법이 없는 공격성 유형의 종양이다. 뼈암의 유일한 '치료'는 종양 결과로 경험하게 되는 통증에 대한 완화이다. 뼈암 환자에 대한 완화 케어는 ¹⁵³Sm 및 ^117mSn으로 방사선표지된 비고리형 킬레이터를 통해 달성된다. 최초의 이러한 킬레이터는 질소-함유 구조를 포함하지만, 돌출형 팔인 카복실산 대신에 포스폰산 치환체를 갖는다. 상기 유형의 FDA-승인 방사성약물은 ¹⁵³Sm-EDTMP(에틸렌디아민테트라메틸렌포스폰산)(Quadramet)이다. ¹⁵³Sm-EDTMP는 매우 우수한 약동학 및 생체내 제거를 나타내며, 1997년에 고통스러운 뼈 전이의 치료를 위해 승인되었다. 두 번째 가능한 뼈 치료제는 ^117mSn-DTPA이다. ^117mSn은 더 짧은 침투 범위를 가져서 골수 독성이 더 적은 127 keV 및 129 keV의 2가지 전환 전자 방출을 갖는다.

고리형 킬레이트화제는 열역학적으로 훨씬 더 안정하고 동적으로 불활성인 금속 착물을 형성한다. 매크로사이클 내 동위원소의 입체화학 및 배위는 생성되는 착물 안정성과 함께 하기 여러 요인에 의존한다: 1) 고리의 크기; 2) N-원자에서 발생하는 치환체의 수; 3) N-원자 상 치환체의 특성; 4) 방사선동위원소의 배위 수; 5) 착화 동안 이용되는 금속 대 리간드 비 및 이용되는 짝이온의 성질; 및 6) 자유 매크로고리형 킬레이터의 양성자 부가 상태에 영향을 미칠 착화 반응의 pH. 방사선 조영 및 치료법을 위한 BFCA의 예는 이후 2작용성을 위해 그리고 착물의 안정성을 증가시키기 위해 카복실 돌출형 팔 및 다른 모이어티로 유도체화되는 트리아자-계 및 테트라아자-계 아미노 매크로사이클이다. 이러한 매크로고리형 BFCA 중 가장 유명한 것은 NOTA((1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산), DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산) 및 TETA(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), 및 이들의 유사체이다.

NOTA의 유사체는 NOTASA(1,4,7-트리아자사이클로노난-N-숙신산-N',N"-디아세트산) 및 NODAGA(1,4,7-트리아자사이클로노난-N-글루탐산-N',N"-디아세트산뿐만 아니라 별도의 접합 모이어티, 예컨대 파라-이소티오시아네이토 벤질기를 이용한 NOTA의 작용화(p-NCS-NOTA)이다. NOTA는 또한 일부 포스포네이트 유사체, 예컨대 NOTP(1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"'-트리스(메틸렌포스폰산))으로 변경되었다.

매크로고리형 킬레이터 DOTA 및 TETA는 각각 매크로사이클 사이클렌 및 사이클람에 기반한다. 이들 킬레이터는 둘 다 여러 상이한 방사선동위원소와 안정한 착물을 형성하기 위해 이용되었고, 금속 배위를 개선하기 위해 다양한 방식으로 유도체화되었다. 그러나 이들 킬레이터의 유일한 난제는 착화가 종종 매우 천천히 일어나며 우수한 표지 화합물 수율을 달성하기 위해 승온이 요구된다는 것이다.

DOTA의 유사체인 PA-DOTA(R-[2-(4-아미노페닐)-에틸]-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산), DOTASA(1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸-1-숙신산-4,7,10-트리아세트산) 및 DOTAGA(1,4,7,10-테트라아자사이클로-데칸-1-글루탐산-4,7,10-트리아세트산)은 변형된 카복실레이트 돌출형 팔을 갖는다. DO3A 및 DO2A는 질소 원자에 다른 작용기를 부착하기 위해 카복실산기 중 1개 또는 2개가 제거된 유사체이다. CB-DO2A에는 2개의 대항 질소 간에 에틸렌 교차 가교가 포함된다. 치환체가 알킬 골격에 부착되는 DOTA의 유도체에는 p-NCS-Bz-DOTA(2-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7,10-테트라아자사이클로-도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산) 및 유도체 1B4M-DOTA(2-메틸-6-(p-이소티오시아네이토-벤질)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산) 및 p-NCS-Bz-DOTA 고리 상에 추가 치환체가 포함되는 CHX-DOTA(2-(p-이소티오시아네이토벤질)-5,6-사이클로-헥사노-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라-아세테이트)가 포함된다.

TETA는 사이클람 매크로고리형 고리이며 DOTA와 유사하게 각각 이들에 부착된 아세테이트기를 갖는 4개의 질소 원자를 갖지만, TETA는 DOTA의 12-원 고리와 배치되게 14-원 고리이다. TETA 사이클람 고리 내의 추가 2개 탄소는 일부 금속 배위의 안정성에 약간의 증가를 제공할 수 있는 약간 더 큰 내강을 만든다. 방사선핵종 착물의 높은 안정성 및 질소 원자에서 일어나는 치환의 용이성으로 인해, 사이클람은 2작용성 킬레이터 형성에서 가장 자주 이용되는 매크로사이클 중 하나이다. TETA의 유사체는 브로모아세트아마이도벤질-1,4,8,11-테트라아자-사이클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(BAT), 3-(4-이소티오시아네이토-벤질)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라-데칸-N,N',N"',N"'-테트라아세트산(p-NCS-Bz-TETA), 4-[(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라-데칸-1-일)메틸]벤조산(CPTA), 4,11-비스(카복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]-헥사데칸(CB-TE2A), 3,6,10,13,16,19-헥사아자-바이사이클로[6.6.6]아이코산(Sar), 테트라-(아미노 메틸포스포네이트) 사이클람(TEPA)이다.

아래는 고리형 킬레이터에 대한 구조들이다.

"링커"는 킬레이트화제를 EPR 제제로 연결하는 적합한 길이(4개 내지 20개, 전형적으로 8개 내지 15개 탄소 원자)의 탄소쇄이다. 바이오컨쥬게이트 내의 링커는 방사선핵종 및 BFCA를 EPR 효과를 통해 세포를 표적으로 하는 방사성약물 부분과 분리한다. 이처럼, 링커는 킬레이터가 방사선동위원소를 착화하는 능력 또는 그 특이적 수용체에 대한 표적화 생체분자의 친화도 및 결합을 방해해서는 안 된다. 링커는 바이오컨쥬게이트의 친유성 또는 친수성을 증가시킴으로써 그리고 종양 내에서 절단될 수 있는 대사 가능한 결합을 함유함으로써 방사성약물의 약동학적 특성을 개선하기 위해 이용될 수 있다. 이는 킬레이트화제 및 방사선핵종이 세포 내로 내재화되어 치사 선량의 방사선을 전달할 수 있도록 한다. 바이오컨쥬게이트의 합성에서, 가능한 경우, 열적으로 민감한 생체분자의 임의의 분해를 방지하기 위해 신속하게 그리고 온화한 온도에서 절단 가능한 링커를 부착하는 것이 또한 필요하다.

절단 가능한 링커의 특성은 이들이 세포 내에서 또는 세포와 매우 가까운 인근에서 분해되도록 설계될 수 있도록 한다. 절단 후, 세포독성 방사선핵종 킬레이터가 다루기 힘들 수 있는 생체분자로부터 방출되어 방사선원이 가장 손상을 입힐 수 있는 세포 내에 편재되도록 할 수 있다.

절단 불가능한 링커는 주로 4가지 유형으로 이루어진다: 펩타이드, 티오우레아, 티오에테르 및 클릭 화학 트리아졸 결합. 생체분자의 내재 작용기에는 일반적으로 아민기 또는 티올기가 포함되며, 이후 링커 및 킬레이터 상의 적절한 모이어티에 커플링하기 위해 이용될 수 있다.

펩타이드 또는 아마이드 결합은 가장 흔하게는 킬레이터의 돌출형 팔로서, 카복실산 및 일차 아민 간에 형성된다. 효율적인 커플링은 커플링 시약의 보조로 더 우수한 친전자제에 대한 카복실산의 활성화에 의해 촉진된다. 이들 커플링 시약은 일반적으로 EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드), DCC(디사이클로헥실카보디이미드), HOBt(하이드록실-벤조트리아졸) 및 HATU(O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N0,N0-테트라메틸우로늄-헥사플루오로-포스페이트)이지만, 또한 혼합-무수물 활성화 방법이 포함될 수 있다. 가장 자주 이용되는 아마이드 결합 형성 기법 중 하나는 임의의 추가 커플링 시약 없이 아민과 반응할 수 있는 숙신이미딜 에스테르를 형성하기 위한 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 이용한 카복실산의 활성화이다. NHS-활성화 산은 지방족 아민에 대해 높은 선택성을 가지며, 수성 환경 중 pH 8 내지 9에서 최적으로 반응한다. 펩타이드 결합 형성은 매우 선호되는 커플링 기법이지만, 킬레이터는 종종 여러 카복실산기를 그리고 생체분자는 여러 아민을 가질 것이므로, 생체분자 상에서 일어나는 커플링의 양을 제한하기 위해 보호/탈보호 전략 또는 몰 비의 제어가 요구된다.

또 다른 유형의 링커 접합 전략은 일차 아민과 이소티오시아네이트 작용기의 반응으로 티오우레아 결합을 형성하는 것이다. 탈보호 아민이 친핵성 부가 반응을 위해 요구되므로, 이소티오시아네이트는 pH 8.0 내지 9.5의 약염기성 조건 하에 킬레이터 및 표적화제를 결합시키기 위해 이용된다. 이소티오시아네이트는 NHS 에스테르보다 수성 조건 중에 더 안정하고, 이소티오시아네이트 방향족 유도체는 종종 생체분자를 DTPA 및 DOTA에 커플링하기 위해 이용된다.

티오에테르 결합은 친전자성 Michael 수신체, 예컨대 아크릴레이트, 아크릴아마이드, 비닐 설폰 및 말레이미드에 대한 친핵성 티올기의 Michael 부가에 의해 형성된다. 티올기의 높은 친핵성은 상기 티올-엔 커플링이 촉매 또는 가열의 필요성 없이 온화한 생리적 조건 하에 일어나도록 한다. 형성되는 티오에테르 결합은 강한 염기성, 산성 또는 환원성 조건 하에서도 매우 안정하지만 산화성 제제와 반응할 수 있다. 아크릴레이트 및 아크릴아마이드가 더 반응성이 높고 중합을 거치는 경향이 있으므로, 말레이미드 Michael 수신체가 방사성약물의 형성에서 가장 자주 이용된다. 말레이미드는 pH 7.0 내지 7.4에서 티올과 가장 잘 반응한다. 비반응성 말레아미드산으로의 말레이미드기의 가수분해 가능성이 증가되므로, pH 8 초과의 반응에는 주의를 기울여야 한다. 생체분자의 표지화는 일반적으로, 구조 내에 풍부한 라이신 잔기의 아미노기에 대한 것이다. 이는 표지화 기회를 증가시키지만 또한 표지화 백분율의 제어를 감소시킨다. 자유 티올기는 여러 생체분자에서 확인되지 않는 시스테인 잔기에서 기인하며 이에 따라 종종 상기 작용기를 디설파이드 결합의 환원에 의해 도입하는 것이 요구된다. 접합을 위한 제한된 양의 티올기의 이용은 반응하는 화합물의 몰 비의 더 크게 제어함으로써 더 특이적이고 균일한 표지화를 수득할 수 있도록 한다. 소수의 단백질 및 항체 중 티올기를 함유하는 생체분자가 중요하다. 이에 관해 가장 많이 연구되고 유망한 단백질은 시스테인-34 위치에 자유 티올기를 갖는 인간 혈청 알부민(HSA)이다. 항체 내의 티올기는 디설파이드 결합으로서 존재하며, 이에 따라 먼저 환원되어야 한다.

'클릭' 반응은 1960년대에 Rolf Huisgen이 개척한 페리고리형 1,3-이극성 고리부가 협동반응에 대한 영감에 기인하는 비-협동 반응이다. 그 매우 빠른 반응 속도로 이렇게 명명되며, 위치선택적 방식으로 1,4-치환 트리아졸을 형성하는 알킨 및 아자이드 간 반응이 관여된다. 알킨 및 아자이드는 둘 다 킬레이터 또는 생체분자 내로 쉽게 도입될 수 있어서 우수한 수율로 결합 착물의 선택적이고 신속한 형성으로 이어진다. 상기 반응의 난제는 킬레이터에 착화될 수 있는 구리 촉매를 제거하기 위한 정제이며, 이에 따라 비-구리 촉매 클릭-화학 반응이 개발되었다.

절단 가능한 링커는 화학치료 약물에서 가장 자주 이용되지만, 여전히 방사성약물에서 적용이 가능하다. 이들 링커는 종양 세포 내에서 또는 이들과 가까운 인근에서 세포독성 페이로드의 효율적 방출을 위해 설계된다. 작은 소수성 약물은 수동 확산을 통해 세포의 원형질막을 쉽게 통과할 수 있지만, 큰 매크로분자는 세포질 공간 내로 쉽게 투과할 수 없다. 따라서 이러한 큰 바이오컨쥬게이트는 세포내이입되고, 막 장벽을 통과할 수 있는 더 작은 성분으로 분해되어야 한다. 따라서 킬레이터 착물은 세포 내 방사선동위원소의 증가된 편재를 허용하기 위해 부피가 큰 표적화제로부터 절단된다. 링커의 절단은 혈액 및 혈장 그리고 내부 세포 구획 간 특성 차이에 기반한다.

일부 유형의 링커는 화학적 수단에 의해 절단되며, 이들에는 pH 변화에 민감한 산-불안정형 하이드라존 결합, 및 글루타치온 환원에 민감한 디설파이드 결합이 포함된다. 하이드라존 결합은 pH 7.4 내지 7.6에서 혈류 및 정상 간질 조직 내에서 안정하지만, 컨쥬게이트가 엔도좀(pH 5.0 내지 6.5) 및 라이소좀(pH 4.5 내지 5.0) 내로의 세포내이입을 통해 세포 내로 내재화되면 가수분해될 것이다. 종양 세포 주변의 종양 미세환경은 또한 6.5 내지 6.9의 약산성 pH를 가지며, 하이드라존 결합을 절단하는 것으로 나타났다. 연구들은 세포외 절단이 여전히 킬레이터-방사선동위원소 착물이 세포 내로 섭취되도록 허용하지만 더 적은 특이성을 가질 것임을 나타내었다.

디설파이드 결합은 쉽게 가역성을 가지며, 단백질 및 항체에서 확인되는 2개의 시스테인 티올기의 산화에 의해 형성되는 안정한 공유 결합이다. 디설파이드는 고수준의 세포내 글루타치온, 티올 함유 트리-펩타이드에 의해 절단된다. 링커 전략에서 이용되는 디설파이드 결합은 생체분자 내에서, 설프하이드릴 함유 BFCA 또는 화학치료 약물을 이용한 자유 티올기의 산화에 의해 형성된다. 종양 세포는 종양에 대한 불량한 혈류의 결과로 저산소성, 감소된 산소 환경을 유도하고, 이어서 글루타치온 및 환원성 효소의 증가로 이어진다. 글루타치온은 높은 밀리몰 수준의 세포내 농도로 그러나 혈중에서는 마이크로몰 양으로만 확인된다. 이에 따라 환원성 세포내 공간은 화합물이 내재화되면 링커의 신속한 절단을 일으킨다.

화학적 수단에 의해 분해되는 링커는 종종 제한된 혈장 안정성을 갖는다. 혈액 내 안정성을 개선하기 위해, 펩타이드에 기반하고 효소적 수단에 의해 절단되는 링커가 구축되었다. 이들 링커는 사슬 내에서 이용되는 아미노산에 따라 상이한 효소에 취약하다. 세포내 및 세포외에서 모두, 프로테아제의 상향조절이 여러 유형의 암에서 확인되었고, 종양 진행, 침습 및 전이에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 나타났다. 세포내 시스테인 카텝신 효소 B 및 S는 단백질 분해와 연관되는 라이소좀의 프로테아제이다. 이들 프로테아제는 라이소좀에 특이적이며, 전이성 종양을 제외하고는 일반적으로 세포외 환경에서 확인되지 않고, 특정한 펩타이드 서열의 절단에 고도로 특이적이다. 따라서 바이오컨쥬게이트가 혈청 내에서 고도로 안정하지만 라이소좀 내에서는 신속히 절단되므로, 카텝신 불안정형 링커가 방사선동위원소 및 약물-전달 전략을 위해 선호된다. 카텝신 B 및 S에 대한 여러 절단 가능한 펩타이드 서열이 연구되었다. 카텝신 B는 디펩타이드 링커 Phe-Lys 및 Phe-Arg 그리고 보다 친수성인 Val-Lys, Val-시트룰린(Cit) 및 Phe-Cit을 절단할 것이다. 시트룰린은 Arg과 등비체적 및 등전성이지만 그처럼 염기성은 아니다. 카텝신 B에 의한 절단을 위해 이용된 일부 테트라펩타이드 링커는 Gly-Gly-Gly-Phe, Gly-Phe-Leu-Gly 및 Ala-Leu-Ala-Leu이다. 카텝신 S는 서열 Pro-Met-Gly-Leu-Pro을 절단한다. 여러 다른 프로테아제가 또한 세포 및 그 환경 내에서 확인되며 절단을 위해 이들 효소를 표적으로 하는 펩타이드 링커가 개발되었다. 써모라이신은 Ala-Val 디펩타이드를 절단하기 위해 이용되는 반면, 프롤린엔도펩티다아제는 Ala-Pro 또는 Gly-Pro와 결합된 세포독성 모이어티를 방출한다. 이들 링커는 중합체 HMPA 및 PEG 그리고 암 치료법을 위한 모노클로날 항체에 연결된 약물, 예컨대 독소루비신 및 방사선동위원소 킬레이터, 예컨대 ¹⁷⁷Lu-DOTA 및 ⁹⁰Y-DOTA를 갖는다.

기질 금속프로테아제(MMP)는 세포외 기질 및 기저막의 분해를 위해 중요한 엔도펩티다아제이다. 종양 세포 내에서, MMP의 증가는 종양 진행 및 종양 전이로 이어지는 세포 침습에서 중추적 역할을 담당한다. MMP는 펩타이드 서열을 절단할 수 있고, 옥타펩타이드 링커, Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln이 개발되었으며, 이는 특정 암 유형에서 과발현된 MMP-2 및 MMP-9에 의해 표적화된다. 상기 펩타이드는 종양 세포 내 약물 방출 및 축적을 위해 알부민 매크로분자에 독소루비신을 결합하기 위해 이용되었다.

방사성약물은 다중-성분이므로, 치료 방사성약물의 설계에서, 모든 특성이 평가되어야 한다. 방사선핵종은 치료 목적을 위해 선호되는 반감기 및 붕괴 특성을 가져야 하며, 가능한 경우, 수득 및 입수가 용이해야 한다. 킬레이터는 반감기의 관점에서 방사선동위원소와 매칭되고 열역학적으로 안정하고 선택된 방사선핵종과 동적으로 불활성인 착물을 형성해야 한다. 방사선핵종은 임의의 금속 결합 혈장 단백질과 금속의 트랜스킬레이트화가 일어나지 않도록 킬레이터에 충분히 단단히 결합되어야 한다. 이상적으로는, 킬레이터의 방사선표지화는 존재하는 임의의 생물학적 분자를 보존하기 위해 최소 시간으로 최소 온도에서 낮은 농도 하에 일어나야 한다. 방사성약물에서 이용되는 표적화제는 링커를 통해 킬레이터에 부착되며, 그 특이적 수용체에 대한 제제의 친화도가 킬레이터에 의해 영향받지 않아야 한다. 표적화제는 이상적으로는 종양 부위에서만 방사성약물을 축적시켜야 하며, 임의의 다른 자유 방사선바이오컨쥬게이트는 건강한 세포에 대한 손상을 감소시키기 위해 전신으로부터 신속히 배출되어야 한다.

고려해야 하는 핵종 특성에는 감마 및 미립자 방출 및 반감기가 포함된다. 미립자 방출은 α- 또는 β-방출(대략 100 keV 내지 10,000 keV 범위) 및 오제 전자 방출(1 keV 내지 100 keV)로 구성된다. α- 및 β-방출체는 주변의 건강한 조직을 또한 손상시키는 더 큰 조직 침투를 갖는 반면, 오제 전자는 핵종이 종양 세포로 전달될 수 있는 경우 건강한 조직 손상을 최소화할 수 있는 단지 최대 500 nm의 침투 범위를 갖는다. 오제 전자를 이용하는 복잡성은 이들이 최대 효과를 갖기 위해 DNA에 가까운 인근에 전달되어야 한다는 것이다. 치료제에 대한 이상적인 반감기는 1일 내지 14일일 것이다. 방사선치료법에 있어서 현재 적용에는 ⁴⁷Sc, ⁹⁰Y, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁸Re를 이용한 대 종양; ^117mSn 및 다른 단범위 오제 방출체를 이용한 마이크로전이물; ⁴⁷Sc, ^117mSn, ⁶⁷Cu 및 ¹³¹I를 이용한 백혈병 및 림프종의 치료; 및 ¹¹¹In을 이용한 일부 신경내분비 종양의 치료가 포함된다. 뼈 전이는 큰 백분율의 전립선암 환자에서 일어나며, 중증 통증으로 인해 이환율의 유의미한 증가를 일으키고 치료는 단지 완화적일 뿐이다. 상기 치료를 위해 이용되는 핵종은 ⁸⁹Sr, ¹⁵³Sm, ^117mSn, ³²P 및 ¹⁸⁶Re이다. 방사선치료법에 더하여, 많은 이러한 방사선핵종이 또한 종양의 방사선 조영에서 적용된다.

치료 목적을 위해 이용될 수 있는 방사선핵종의 예에는

바람직한 (베타)β 방출체이며 γ(감마) 방사선을 또한 방출할 수 있는 ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹¹¹In, ¹⁵³Gd, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁷⁷Lu, ³²P, ¹⁶¹Tb 및 ³³P;

바람직한 α(알파)-방출체이며 γ(감마) 방사선을 또한 방출할 수 있는 ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²³Ra, ²²⁴Ra, ²²⁷Th;

바람직한 오제/전환 전자 방출체이며 γ(감마) 방사선을 또한 방출할 수 있는 ^58mCo, ⁶¹Cu, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ¹¹¹In, ^117mSn, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^193mPt, ^195mPt, ¹⁹⁷Pt, ²⁰¹Tl, ²⁰³Pb, ¹⁶¹Tb가 포함된다.

바람직한 방사선핵종은 오제 전자 방출 방사선핵종이다. 이들은 전자 포획 또는 내부 전자 전환 공정으로 인한 전자 껍질의 재배열 동안 붕괴 원자의 바깥쪽 껍질로부터 방출되는 매우 짧은 나노미터 범위의 매우 낮은 에너지(500 eV 미만)의 전자인 오제 전자를 방출하는 방사선핵종이다. 이러한 방사선핵종에는 ¹¹¹In, ²⁰³Pb, ²⁰¹Tl, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ¹¹⁹Sb, ^58mCo, ¹⁶¹Ho, ¹⁶¹Tb, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ^195mPt, ^193mPt, ^117mSn이 포함된다.

본 발명의 추가 양태에는 링커에 대한 부착을 위한 EPR 제제의 개질 및 킬레이터 및/또는 링커에 대한 부착을 위한 대사물질의 개질; 뿐만 아니라 링커 및 킬레이터의 개질이 포함된다.

3) 절단 가능한 링커, 바람직하게는 EPR 제제에 대한 부착을 위해 말레이미드로 작용화되는 링커

의 연결에 의해 프로-컨쥬게이트를 형성한 뒤,

4) 생체분자/EPR 제제, 바람직하게는 알부민에 결합된다.

알부민은 66.5 kDa 크기를 가지며, 가용성이 높고, 안정하고, 쉽게 이용 가능하며 생분해성일 뿐만 아니라 독성 및 면역원성이 없다.

종양 세포를 표적으로 하는 대사물질은 글루코오스이다. 종양 세포는 매우 높은 턴오버 및 성장을 가지며, 이에 따라 세포 표면 상에서 과발현된 글루코오스 트랜스포터를 통해 섭취되는 다량의 글루코오스를 필요로 한다.

킬레이트화제는 다수의 방사선핵종에 대한 킬레이트화를 허용할 TETA 유도체이며, 글루코오스 표적 및 알부민 담체를 결합시키기 위해 개질될 수 있다.

방사선핵종은 그 17일 반감기 및 ^103mRh를 통해 ¹⁰³Rh로 붕괴됨에 따라 선호되는 단범위의 21 keV x-선 및 오제 전자 방출로 인해 ¹⁰³Pd이다. 그러나 다른 핵종이 생체내 매크로분자의 조영을 위해, 화합물의 편재 및 생체분포에 대한 평가를 위해 이용될 수 있다.

EPR 제제의 부착은 방사성약물 바이오컨쥬게이트를 제조하기 위해 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 바이오컨쥬게이트는 아래에 예시된다:

프로-컨쥬게이트(알부민 EPR 제제가 없는 글루코오스-사이클람-절단 가능한 링커)의 합성은 모든 요구되는 성분을 연결하기 위해 다양하고 상이한 작용기의 주의 깊은 조작을 필요로 한다:

글루코오스 대사물질의 작용화는 하이드록실기에 대한 적합한 보호 전략이 수행될 것을 필요로 한다. 이어서 글루코오스 대사물질이 말단 브로마이드 또는 하이드록실기를 갖는 적합한 길이 사슬의 말단 하이드록실기와 반응하여, 말단 브로마이드기 또는 산 클로라이드로 산화될 수 있는 하이드록실기를 갖는 탄소쇄에 연결되는 글루코오스 대사물질을 형성한다;

링커의 작용화는 치환을 위해 적합한 작용기를 갖는 적합한 길이의 알킬쇄가 킬레이트화제에 대한 부착을 위해 하나의 말단에 알킬 할라이드를 갖는 제1 단편 및 다른 말단에 보호 아민을 갖는 제2 단편인 두 적합한 단편의 연결에 의해 링커로 전환될 것을 필요로 한다;

사이클람 킬레이터의 작용화는 사이클람이 먼저 S_N2 반응을 통해 링커로 단일-알킬화된 후, S_N2 또는 S_NAc 반응을 통해 대사물질로 두 번째로 알킬화될 것을 필요로 한다. 이어서 매크로사이클의 나머지 아민이 금속 착화를 보조할 tert-부틸 브로모아테세이트기와 반응한다. 그 뒤, 모든 하이드록실, 카복실산 및 아민 보호 작용기의 탈보호 전략이 수행된다. 이어서 말단 아민이 EPR 제제에 결합하기 위해 말레이미드로 전환된다.

방사선표지화는 수중 프로-컨쥬게이트를 용해시켜 수행된다. 프로-컨쥬게이트에는 방사선표지화를 실시하기 위해 방사선동위원소 수용액이 첨가된다.

상술된 바이오컨쥬게이트 및 프로컨쥬게이트를 함유하는 제형물은 수용액 중 이미 방사선표지되었거나 되지 않은 이러한 바이오컨쥬게이트 또는 프로컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 특정한 프로-컨쥬게이트가 수용성이 아닌 경우, 소량의 에탄올 또는 디메틸설폭사이드는 세포에 독성이 아닌 수준으로 이용될 수 있다. 방사선동위원소에 대한 착화는 소정량의 프로-컨쥬게이트 또는 바이오컨쥬게이트뿐만 아니라 필요한 경우 수용액 중 방사선동위원소에 첨가되는 표지화를 위한 환원성 제제를 포함하는 밀봉 용기가 포함되는 키트 형태로 수행될 수 있다. 키트는 또한 약제학적 보조 물질, 예컨대 삼투압을 위한 약제학적 등급의 염, 완충제, 보존제, 항산화제 등을 함유할 수 있다. 키트 성분은 액체, 냉동 또는 건조 형태일 수 있다.

본 발명의 프로컨쥬게이트 및 바이오컨쥬게이트는 암; 일차 또는 이차, 양성 또는 악성 종양의 진단 및 치료(완화적 케어 포함)에서 이용될 수 있다. 종양 영역 및 세포에서의 선택적 섭취는 다른 민감한 주변 조직, 예컨대 골수에 대한 방사선을 최소화할 방사선핵종의 표적화 전달을 허용할 것이다. 본 발명은 빠르게 성장하는 고형 종양, 예컨대 골육종에서 더 잘 작용할 것인 반면, 전이성 암에 있어서는 일차 목표가 (이차) 뼈 전이일 것이다. 하기 일반 암도 훨씬 더 높은 백분율의 글루코오스 트랜스포터, GLUT1을 갖는 것으로 나타났으며, 또한 예시된 방사성약물 컨쥬게이트에 의해 표적화될 수 있다:

결장직장암

신장 세포 암종

유방암

위암

두경부 암종

육종.

진단 및 치료적 처치 방법은 멸균 식염수 또는 혈장에서 정맥내 또는 복강내 선량으로서 방사선표지된 컨쥬게이트의 투여를 필요로 한다. 투여될 단위 선량은 약 0.01 mCi 내지 300 mCi의 방사활성을 가지며, 상기 선량이 주사되는 용액은 0.1 mL 내지 10 mL이다.

동반 진단은 치료제의 진단 등가물(진단 방사선핵종으로 방사선표지된 분자)이 특정 환자가 치료제를 수여받을 선량을 개별화하기 위해 치료법 전에 이용되는 경우 쓰이는 용어이다. 이는 환자 선량의 개별화를 가능케 한다. 치료제는 방사선표지되지 않은 분자뿐만 아니라 치료적 방사선핵종으로 방사선표지된 분자일 수 있다. 후자는 방사선핵종의 페어링이 동일한 제제/분자를 이용한 진단 및 치료법을 모두 달성하기 위해 이용되는 테라노스틱(Teranostic 또는 Theranostic) 제제로도 불린다. 이는 2개의 개별 선량으로(바람직함) 또는 단일 투여로 투여될 수 있다. 일부 기재된 방사선핵종은 동일한 또는 별도 투여에서 진단 및 치료 방사선핵종으로서 또는 둘 다로서 이용될 수 있다.

실시예

실시예 1 - EPR 제제에 대한 부착을 위한 방사선표지된 대사물질- 킬레이터 -링커 프로- 컨쥬게이트 및 방사성약물 바이오컨쥬게이트의 형성

A) ¹⁰³Pd로 방사선표지되는 다양한 링커 대안물을 이용한 2가지 제안된 합성 글루코오스-사이클람-말레이미드 프로-컨쥬게이트. B) 방사성약물 바이오컨쥬게이트를 형성하기 위한 프로-컨쥬게이트의 말레이미드에 대한 알부민 중 자유 티올의 Michael 부가.

실시예 2 - 대사물질 - 글루코오스 링커의 합성

10-( tert - 부틸디페닐실릴옥시 )데칸-1-올(1)

이미다졸(3.50 g, 51.7 mmol)에 이어 TBDPSCI(8.70 g, 31.5 mmol)를 N_2(g) 하에 건조 THF(60 mL) 중 1,10-데칸디올(5.00 g, 28.7 mmol)의 용액에 천천히 첨가하고, 24 hr 동안 실온에서 교반하며 방치하였다. 반응을 진공 중 THF의 증발에 이어 물(60 mL) 및 CH₂Cl₂(60 mL)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기상을 분리하고 물(2 x 50 mL)로 추출하고 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 산물을 칼럼을 거쳐[헥산:EtOAc(9:1)] 순수한 알코올을 오일로 수득하였다(6.59 g, 56%). R _f = 0.42(헥산:EtOAc 8:2).

2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코피라노실 벤조에이트 (2)

벤조일 클로라이드(4.68 g, 33.3 mmol)를 0℃에서 피리딘(30 mL) 중 α-D-글루코오스(1.0 g, 5.6 mmol)의 용액에 적가하였다. 0℃에서 10분 후, 용액을 실온에서 2 hr 동안 교반하였다. 반응을 냉수(50 mL) 첨가에 의해 켄칭하고 산물을 EtOAc(3 x 50 ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 1N HCl(3 x 50 mL)에 이어 염수(50 mL)로 세척한 뒤 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 산물을 고온 헥산:EtOAc 2:1로 재결정화에 의해 정제하여 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(3.48 g, 89%). R _f = 0.28(Hex:EtOAc 8:2).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 8.16(2H, d, J = 8.0 Hz, H-Ar), 8.02(2H, d, J = 8.0 Hz, H-Ar), 7.94(2H, d, J = 8.0 Hz, H-Ar), 7.88(4H, d, J = 8.0 Hz, H-Ar), 7.66(1H, t, J = 8.0 Hz, H-Ar), 7.53-7.28(14H, m, H-Ar), 6.85(1H, d, J = 4.0 Hz, H-1), 6.32(1H, t, J = 8.0 Hz, H-3), 5.85(1H, t, J = 8.0 Hz, H-4), 5.68(1H, dd, J = 4.0, 8.0 Hz, H-2), 4.62(2H, m, H-6a/H-5), 4.59(1H, dd, J = 4.0 Hz, J = 12.0 Hz, H-6b)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 166.1, 165.9, 165.3, 165.1, 164.4(C=O), [133.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1 130.0, 129.9(x2), 129.8(x2), 129.6, 129.0, 128.9, 128.8, 128.6, 128.4(x3), 128.37 ArC)], 90.0(C-1), 76.6(C-3), 70.5(C-2), 70.5(C-5), 68.9(C-4), 62.5(C-6)

1- 요오도 -2,3,4,6- 테트라 - O - 벤조일 -α-D- 글루코피라노사이드 (3)

CH₂Cl₂(10 mL) 중 헥사메틸디실란(0.531 g, 3.63 mmol)을 CH₂Cl₂(60 mL) 중 α-D-글루코오스-펜타벤조에이트(2)(4.10 g, 5.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 상기 용액에 ZnI₂(0.467 g, 1.46 mmol)에 이어 I₂(0.921 g, 3.63 mmol)를 첨가하고 16 hr 동안 교반하였다. 반응을 CH₂Cl₂(40 mL) 그리고 NaHCO₃(1.68 g) 및 Na₂S₂O₃(1.12 g)의 수용액(120 mL) 첨가에 의해 켄칭한 뒤 분홍색의 우윳빛 용액이 투명해질 때까지 10분 동안 교반하였다. 유기상을 분리하고 염수(50 mL)로 세척하고 합한 수성상을 CH₂Cl₂(2 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 진공 중에 농축하여 표제 화합물의 조정제 오일을 산출하고, 다음 반응에서 직접 이용하였다.

10- 브로모데실 - 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노사이드 (4)

앞서 제조된 요오다이드 3(1.81 g, 2.57 mmol)을 N_2(g) 하에 CH₂Cl₂(40 mL) 중에 용해시키고 ZnCl₂(0.525 g, 3.85 mmol)와 함께 4Å 분자체(4.00 g), 및 CH₂Cl₂(5 mL) 중 10-브로모데칸올(0.914 g, 3.85 mmol)을 용액에 첨가하였다. 반응을 17 hr 동안 교반한 뒤 용액 색상이 밝은 분홍색으로 변했다. EtOAc(60 mL)를 첨가하고 반응을 NaHCO₃ _(s)(1.80 g) 및 Na₂S₂O_5(s)(2.40 g)의 수용액(80 mL) 첨가로 켄칭하였다. 10분 동안 교반 후 노란-오렌지색에서 우윳빛 흰색으로 색상이 변했다. 용액을 셀라이트 층을 통해 여과하고 상을 분리하였다. 유기상을 염수로 세척하고 합한 수성상을 EtOAc(2 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조하고 여과하고 농축하여 조정제 오일을 산출하고(2.99 g), 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(헥산:EtOAc 8:2). 표제 산물을 투명 오일로 수득하였다(1.23 g, 2단계에 걸쳐 59%). R _f = 0.48(Hex:EtOAc 8:2).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 8.0-7.80(8H, m, ArH), 7.53-7.24(12H, m, ArH), 5.89(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.65(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.49(1H, dd, J = 7.8, 9.7 Hz, H-2'), 4.81(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.61(1H, dd, J = 3.3, 12.0 Hz, H-6a'), 4.49(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6b'), 4.13(1H, m, H-5'), 3.89(1H, dt, J = 6.3, 9.6 Hz, H-1a), 3.52(1H, dt, J = 6.7, 9.6 Hz, H-1b), 3.37(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 1.80(2H, qn, J = 9.6 Hz, H-9), 1.55-1.45(2H, m, H-2), 1.41-1.30(2H, m, Alk-H), 1.19-1.05(10H, m, Alk-H).

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): [166.2, 165.8, 165.2, 165.1(C=O)], [133.4, 133.2, 133.1, 133.0, 129.8(x2), 129.7(x2), 129.6, 129.5, 128.9, 128.8, 128.4, 128.3, 128.3, 128.2(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.2(C-5'), 72.0(C-2'), 70.3(C-1), 69.9(C-4'), 63.3(C-6'), 33.9(C-10), 32.8, 29.4, 29.3, 29.2, 29.1, 28.7, 28.1, 25.7(C-Alk).

10-( tert - 부틸디페닐실릴옥시 )데실- 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노사이드 (5)

CH₂Cl₂(15 mL) 중 분자체(7.00 g), ZnCl₂(1.43 g, 10.5 mmol) 및 알코올 1(2.17 g, 5.25 mmol)을 CH₂Cl₂(60 mL) 중 새로 제조된 요오다이드 3(3.71 g, 5.25 mmol)에 첨가하고 반응을 8 hr 동안 교반하였다. CH₂Cl₂(40 mL)를 용액에 첨가하고 분자체를 셀라이트 층을 통해 여과 제거한 뒤 NaHCO₃(0.960 g) 및 Na₂S₂O₃(1.44 g)의 수용액(100 mL)을 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고 수성상을 CH₂Cl₂(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고 수성상을 CH₂Cl₂(50 mL)로 1회 더 추출하였다. 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 진공 중에 농축하여 조정제 오일 산물을 산출하고, 사전 패킹된 칼럼 상으로 건조-로딩하고 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(Hex:EtOAc 9:1, 8:2, 7:3) 표제 화합물을 오일 산물로 산출하였다(3.55 g, 68%). R _f = 0.51(Hex:EtOAc 8:2)

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 8.05-7.83(8H, m, ArH), 7.68(4H, m, ArH), 7.55-7.26(18H, m, ArH), 5.91(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.68(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.53(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 4.85(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.65(1H, dd, J = 3.3, 12.0 Hz, H-6a'), 4.52(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6b'), 4.17(1H, m, H-5'), 3.92(1H, dt, J = 6.3, 9.6 Hz, H-1a), 3.66(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.55(1H, dt, J = 6.7, 9.6 Hz, H-1b), 1.59-1.50(4H, m, H-2/9), 1.29(2H, m, H-8), 1.22-1.00(10H, m, AlkCH ₂), 1.04(9H, s, H-2").

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], [135.6(x4), 134.2(x2), 133.4, 133.2, 133.1, 133.0, 129.8(x2), 129.7(x6), 129.5(x2), 128.9(x2), 128.4(x2), 128.3(x4), 128.3(x2), 128.3(x2), 127.5(x4)(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.2(C-2'), 72.0(C-5'), 70.3(C-1), 70.0(C-4'), 64.0(C-10), 63.3(C-6'), 32.6, 29.5, 29.4, 29.4, 29.3, 29.2, 26.9(C-2"), 25.8, 25.7, 19.2(C-1").

10- 하이드록시데실 - 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노사이드 (6)

아세트산(0.245 g, 4.09 mmol) 및 N-테트라 부틸 암모늄 플루오라이드(6.80 mL, THF 중 1.0 M, 6.80 mmol)를 THF(100 mL) 중 TBDPSO-C10-글루코피라노사이드 5(3.38 g, 3.40 mmol)의 용액에 첨가하고 36 hr 동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 잔류물을 산출하고 여기에 H₂O(50 mL)를 첨가한 뒤 EtOAc로 추출하였다(3 x 50 mL). 합한 유기 추출물을 염수(50 mL)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 물질을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(Hex:EtOAc 2:1) 표제 알코올을 투명 오일로 산출하였다(2.30 g, 90%). R _f = 0.16(Hex:EtOAc 2:1),

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 8.02-7.81(8H, m, ArH), 7.56-7.25(12H, m, ArH), 5.90(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.67(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.51(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 4.83(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.63(1H, dd, J = 3.3, 12.0 Hz, H-6a'), 4.51(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6b'), 4.18-4.12(1H, m, H-5'), 3.90(1H, dt, J = 6.3, 9.6 Hz, H-1a), 3.62(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.53(1H, dt, J = 6.7, 9.6 Hz, H-1b), 1.63-1.46(4H, m, AlkCH₂), 1.35-1.05(12H, m, AlkCH₂).

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): [166.1, 165.8, 165.2, 165.1(C=O)], [133.4, 133.2, 133.1, 133.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 128.9, 128.4, 128.3, 128.2(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.2(C-2'), 72.0(C-5'), 70.3(C-1), 69.9(C-4'), 63.3(C-6'), 63.1(C-10), 32.8, 29.4, 29.4, 29.3, 29.3, 29.1, 25.7, 25.6.

10-( 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노스 -1-일)- 데칸알 (7)

데스-마틴(Dess-Martin) 퍼요오디난(0.59 g, 1.4 mmol)을 무수 CH₂Cl₂(60 mL) 중 알코올 6(0.870 g, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하고 1.5 hr 동안 교반하였다. 반응을 포화 수성 NaHCO₃ 용액(60 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고 15분 동안 교반하였다. 수성상을 CH₂Cl₂(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수(50 mL)로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 물질을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(Hex:EtOAc 6:4) 표제 화합물을 투명 오일로 산출하였다(0.693 g, 79%), R _f = 0.75(Hex:EtOAc 1:1).

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 9.75(1H, t, J = 1.5 Hz, H-1), 8.02-7.82(8H, m, ArH), 7.56-7.23(12H, m, ArH), 5.90(1H, t, J = 7.2 Hz, H-3'), 5.67(1H, t, J = 7.2 Hz, H-4'), 5.51(1H, dd, J = 7.5, 6.0 Hz, H-2'), 4.83(1H, d, J = 6.0 Hz, H-1'), 4.63(1H, dd, J = 2.4, 9.0 Hz, H-6a'), 4.51(1H, dd, J = 4.2, 9.0 Hz, H-6b'), 4.14(1H, m, H-5'), 3.91(1H, dt, J = 4.8, 7.2 Hz, H-10a), 3.54(1H, dt, J = 4.8, 7.2 Hz, H-10b), 2.38(2H, dt, J = 1.2, 5.4 Hz, H-2), 1.60-1.47(4H, m, AlkCH ₂), 1.27-1.05(10H, m, AlkCH ₂).

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 202.7(C-1), [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], [133.3, 133.1, 133.1, 133.0, 129.8(x2), 129.7(x2), 129.4, 128.9, 128.4(x2), 128.3(x2), 128.2(x2)(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.2(C-2'), 72.0(C-5'), 70.2(C-10), 69.9(C-4'), 63.3(C-6'), 43.8(C-2), 29.3, 29.1, 29.1, 29.1, 29.0, 25.7, 22.0(C-Alk).

10-(테트라- O -벤조일-β-D-글루코피라노스-1-일)데칸산(8)

NaClO₂(0.157 g, 1.7 mmol) 및 NaH₂PO₄(0.208 g, 1.30 mmol)의 수용액(4.0 mL)을 t-부탄올(40 mL) 중 알데하이드 7(1.00 g, 1.30 mmol) 및 2-메틸-2-부텐(0.626 g, 8.90 mmol)의 용액에 첨가하고 용액을 노란색이 모두 사라질 때까지 2.5 hr 동안 교반하였다. 용매를 증발시켜 조정제 오일을 산출하고 CH₂Cl₂(50 mL) 및 H₂O(100 mL) 중에 재용해시켰다. 용액을 1 M HCl(10 mL)로 산성화하고 수성상을 CH₂Cl₂(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 물질을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(Hex:EtOAc 1:1) 표제 화합물을 투명 오일로 산출하였다(0.90 g, 89%). R _f = 0.39(Hex:EtOAc 1:1)

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 8.03-7.81(8H, m, ArH), 7.53-7.26(12H, m, ArH), 5.91(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.67(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.52(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 4.83(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.64(1H, dd, J = 3.4, 12.1 Hz, H-6a'), 4.51(1H, dd, J = 5.2, 12.1 Hz, H-6b'), 4.19-4.13(1H, m, H-5'), 3.91(1H, dt, J = 6.2, 9.7 Hz, H-10a), 3.54(1H, dt, J = 6.2, 9.7 Hz, H-10b), 2.32(2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 1.62-1.46(4H, m, AlkCH ₂), 1.27-1.02(10H, m, AlkCH ₂).

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 179.1(C=O), [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], [133.4, 133.2, 133.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 128.9, 128.4, 128.3, 128.2(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.2(C-2'), 72.0(C-5'), 70.3(C-10), 69.9(C-4'), 63.3(C-6'), 33.9(C-2), 29.3, 29.1, 29.1, 29.0, 28.9, 25.7, 24.6(C-Alk)

10-( 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노스 -1일) 데카노일 클로라이드(9)

몇 방울의 DMF를 N_2(g) 하에 무수 CH₂Cl₂(30 mL) 중 데칸산 8(0.900 g, 1.17 mmol)의 용액에 첨가하였다. 플라스크를 0℃에 두고 옥살릴 클로라이드(0.11 mL, 1.29 mmol)를 용액에 적가하였다. 반응을 1 hr 동안 교반하며 방치한 후 용매를 진공 하에 제거하였다. 소량의 톨루엔(5 mL)을 첨가하고 다시 진공 중에 증발시킨 뒤 잔류물을 10분 동안 진공 펌프 하에 건조하여 임의의 잔여 옥살릴-Cl을 제거하였다. 조정제 오일 산물은 특성규명하지 않고 다음 아실화 반응에 바로 이용하였다.

실시예 3 - 링커 - 절단 불가능한 링커의 합성

10- 하이드록시데실 - 프탈이미드 (10)

칼륨 프탈이미드(3.50 g, 18.9 mmol)를 DMF(50 mL) 중 10-브로모데칸올(4.48 g, 18.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 20 hr 동안 100℃에서 가열한 후 대부분의 DMF를 증류 제거하였다. 잔여 산물을 CH₂Cl₂ 중에 재용해시킨 후 H₂O(2 x 50 mL)로 세척하였다. 합한 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 진공 중에 농축하여 조정제 고체를 산출하고 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다(Hex:EtOAc 6:4). 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다(4.92 g, 97%). R_f = 0.45(Hex:EtOAc 1:1). δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 7.84-7.81(2H, m, ArH), 7.70-7.68(2H, m, ArH), 3.66(2H, t, J = 7.2 Hz, H-1), 3.62(2H, t, J = 6.8 Hz, H-10), 1.66(2H, qn, J = 8.0 Hz, H-2), 1.55(2H, qn, J = 8.0 Hz, H-9), 1.42(1H, s, -OH), 1.32-1.25(12H, m, Alk-CH₂)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 168.4(C=O), 133.8(Ar-3'), 132.2(ArC-2'), 123.1(ArC-4'), 63.0(C-10), 38.0(C-1), 32.8(C-9), [29.4, 29.3, 29.3, 29.0, 28.5, 26.8, 25.6(Alk-CH₂)]

10- 아미노데칸 -1-올(11)

하이드라진 하이드레이트(0.81 g, 0.78 mL, 25.3 mmol)를 EtOH(180 mL) 중 10-하이드록시데실-프탈이미드(10)(4.50 g, 14.8 mmol)의 용액에 첨가하고 하룻밤 동안 환류시켰다. 원료 물질이 남아있었으므로 추가 하이드라진(0.4 ml)을 첨가하고 용액을 하룻밤 동안 다시 환류시켰다. 용매를 증발시키고 조정제 고체 산물을 CH₂Cl₂(100 mL) 중에 재용해시키고 모든 고체가 용해될 때까지 2M NaOH로 염기성화하였다. 유기층을 분리해내고 수성상을 CH₂Cl₂(2 x 80 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 진공 중에 농축하였다. 수득된 조정제 흰색 고체를 재결정화하여(CH₂Cl₂:헥산) 표제 화합물을 흰색 고체로 산출하였다(2.22 g, 88%). R _f = 0.07(CH₂Cl₂:MeOH 9:1) δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 3.60(2H, t, J = 6.6 Hz, H-1), 2.66(2H, t, J = 6.9 Hz, H-10), 1.54(2H, qn, J = 7.0 Hz, H-9), 1.41(2H, qn, J = 6.9 Hz, H-2), 1.35-1.24(12H, m, H-3-8)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 63.0(C-1), 42.3(C-10), 33.9(C-9), 32.9(C-2), [29.5, 29.5, 29.4, 29.4, 26.9, 25.8(Alk-CH₂)]

O - 벤질 - N -(10- 하이드록시데실 ) 카바메이트 (12)

Na₂CO₃(2.96 g, 27.9 mmol) 및 벤질 클로로포르메이트(2.07 mL, 2.47 g, 14.5 mmol)를 CH₂Cl₂:H₂O(1:1, 100 mL) 중 10-아미노-1-데칸올(11)(1.93 g, 11.1 mmol)의 용액에 첨가하고, 20 hr 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 CH₂Cl₂(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조하고 여과하고 진공 중에 농축하여 조정제 고체를 산출하고 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여(Hex:EtOAc 6:4, 5:5) 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(3.13 g, 91%). R _f = 0.35(Hex:EtOAc 1:1),

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 7.36-7.26(5H, m, ArH), 5.10(2H, s, H-2'), 4.70(1H, b.s, -NH), 3.63(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.18(2H, m, H-1), 1.58-1.47(4H, m, H-2/9), 1.30-1.20(12H, m, H-3-8)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 156.4(C=O), [136.7, 128.5, 128.0(ArC)], 66.6(C-2'), 63.0(C-10), 41.1(C-1), 32.8(C-9), 29.9(C-2), [29.4, 29.4, 29.3, 29.2, 26.7, 25.7(AlkCH₂)]

O - tert - 부틸- N -(10- 하이드록시데실 ) 카바메이트 (13)

CH₂Cl₂(5 mL) 중 용해시킨 디-tert-부틸 디카보네이트(1.05 g, 4.8 mmol)를 CH₂Cl₂:MeOH(4:1, 20 mL) 중 10-아미노-1-데칸올(11)(0.70 g, 4.0 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하고 0℃ 내지 5℃에서 2.5 hr 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공 하에 제거하고 흰색 고체 잔류물을 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(Hex:EtOAc 5:5; 4:6; 3:7) 표제 화합물을 흰색 고체로 얻었다(0.84 g, 76%). R _f = 0.60(Hex:EtOAc 4:6),

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 4.51(1H, b.s, -NH), 3.62(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.08(2H, m, H-1), 1.55(2H, m, H-2), 1.46(2H, m, H-9), 1.43(9H, s, H-3'), 1.35-1.25(12H, m, H-3-8)

O - 벤질 - N -(10- 브로모데실 ) 카바메이트 (14)

트리페닐포스핀(3.45 g, 13.15 mmol) 및 카본 테트라브로마이드(4.38 g, 13.15 mmol)를 N_2(g) 하에 건조 CH₂Cl₂(160 mL) 중 카바메이트 12(2.70 g, 8.77 mmol)의 용액에 첨가하고, 3 hr 동안 교반하였다. 실리카를 용액에 첨가한 뒤 조정제 물질을 사전 패킹된 칼럼 상에 건식 로딩하고 자동화 플래시 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다(헥산:EtOAc 9:1, 8.2). 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다(2.99 g, 92%). R _f = 0.68(Hex:EtOAc 1:1);

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 7.35-7.28(5H, m, ArH), 5.09(2H, s, H-2'), 4.75(1H, b.s, -NH), 3.40(2H, t, J = 6.8 Hz, H-10), 3.18(2H, m, H-1), 1.84(2H, qn, J = 6.8 Hz, H-9), 1.50-1.36(4H, m, H-2, H-8), 1.33-1.20(10H, m, Alk-CH₂)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 156.4(C=O), [136.7, 128.5, 128.3, 128.0(Ar-C)], 66.5(C-2'), 41.1(C-1), 33.9(C-10), 32.8(C-9), 29.9(C-2), [29.3, 29.3, 29.1, 28.7, 28.1, 26.7(AlkC)]

O - tert -부틸- N - (10-브로모데실)카바메이트(15)

트리페닐포스핀(0.623 g, 2.37 mmol) 및 카본 테트라브로마이드(0.787 g, 2.37 mmol)를 N_2(g) 하에 건조 CH₂Cl₂(20 mL) 중 카바메이트 13(0.500 g, 1.82 mmol)의 용액에 첨가하고, 2.5 hr 동안 교반하였다. 실리카를 용액에 첨가한 뒤 조정제 물질을 칼럼 상에 건식 로딩하고 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다(헥산:EtOAc 9:1, 8.2). 표제 화합물을 흰색 고체로 수득하였다(0.56 g, 91%). R _f = 0.65(Hex:EtOAc 8:2);

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 4.49(1H, b.s, -NH), 3.40(2H, t, J = 6.6 Hz, H-10), 3.09(2H, m, H-1), 1.85(2H, m, H-9), 1.46-1.38(13H, m, H-2/8/3'), 1.33-1.25(10H, m, H-3-7)

실시예 4 - 링커 - 절단 가능한 링커를 위한 성분의 합성

S-(10-(( tert - 부톡시카보닐 )아미노)데실) 에탄티오에이트 (16)

티오아세트산(0.078 g, 1.03 mmol)을 무수 THF(5 mL) 중 NaH(미네랄 오일 중 60%)(0.034 mg, 0.86 mmol)의 현탁액에 첨가하고 10분 동안 교반하였다. 상기 용액을 0℃에서 N_2(g) 하에 무수 THF(5.0 mL) 중 카바메이트 15(0.290 mg, 0.86 mmol)의 용액에 적가하고 RT에서 하룻밤 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공 하에 증발시키고 잔류물을 EtOAc(10 mL) 중에 재용해시킨 후 포화 NH₄Cl_(aq)(2 x 15 mL)로 추출하였다. 이어서 유기상을 NaHCO₃(15.0 mL) 및 염수(15.0 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하고 조정제 오일을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(Hex:EtOAc 9.5:0.5) 표제 화합물을 흰색 고체로 산출하였다(0.178 mg, 62%), R _f = 0.40(Hex:EtOAc 9:1)

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 4.49(1H, b.s, -NH), 3.09(2H, qt, J = 6.0 Hz, H-1), 2.85(2H, t, J = 7.2 Hz, H-10), 2.31(3H, s, H-2"), 1.56(2H, qn, J = 7.6 Hz, H-9), 1.46-1.40(11H, m, H-2/3'),1.35-1.26(12H, m, H-3-8)

O - tert -부틸 N - (10-머캅토데실)카바메이트(17)

NaOMe(MeOH 중 25%)(0.05 mL)를 MeOH(2.0 mL) 중 티오아세테이트 16(0.160 g, 0.48 mmol)의 용액에 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 원료 물질이 남아있지 않았으므로 모든 용매를 증발시키고 잔류물을 EtOAc 중에 재용해시킨 뒤 NH₄Cl_(aq)로 세척하였다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(Hex:EtOAc 9:1) 표제 화합물을 흰색 고체로 산출하였다(0.135 g, 98%). R _f = 0.37(Hex:EtOAc 9:1).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 4.49(1H, b.s, -NH), 3.09(2H, qt, J = 6.4 Hz, H-1), 2.51(2H, qt, J = 7.2 Hz, H-10), 1.59(2H, qn, J = 7.2 Hz, H-9), 1.46-1.40(11H, m, H-2/3'), 1.36(2H, m, H-8), 1.31(1H, t, J = 7.6 Hz), 1.27(10H, m, H-3-7)

3- 브로모프로필 - 티오토실레이트 (18)

1,3-디브로모프로판(3.56 g, 17.64 mmol)을 N_2(g) 하에 MeCN(30.0 mL) 중 칼륨 티오토실레이트(1.00 g, 4.41 mmol)의 용액에 첨가하고 2 hr 동안 환류시켰다. 이어서 반응을 열에서 제거하여 냉각되도록 두고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 CH₂Cl₂(25.0 mL) 중에 재용해시키고 물(3 x 20 mL) 및 염수(1 x 20 mL)로 세척하였다. 이어서 유기상을 건조하고 여과하고 농축한 뒤 조정제 물질을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(Hex:EtOAc 9:1). 표제 화합물을 투명 오일로 수득하였다(1.02 g, 75%). R _f = 0.35(Hex:EtOAc 8:2).

실시예 5 - 프로- 컨쥬게이트 - 사이클람에 대한 글루코오스 링커 및 절단 불가능한 링커의 부착에 의한 합성

1,4,8,11- 테트라아자트리사이클로[9.3.1.1]헥사데칸 (19)

포름알데하이드(H₂O 중 37%)(0.75 mL, 10.0 mmol)를 물(20 mL)에 용해시킨 사이클람(1.00 g, 5.0 mmol)의 용액에 첨가하고 얼음조에서 0℃ 내지 5℃까지 냉각하였다. 용액을 그 온도에서 5분 동안 교반한 뒤 이를 실온까지 가온되도록 두고 2.5 hr 동안 교반하였다. 반응을 다시 0℃ 내지 5℃까지 냉각하고 5분 동안 교반하여 형성된 흰색 고체의 침전을 최대화한 뒤 여과 제거하고 빙수(3 x 20 mL)로 세척하였다. 고체를 CH₂Cl₂(25 mL) 및 MeOH(5 mL) 중에 용해시키고 용액을 MgSO₄ 상에서 건조하였다. MgSO₄를 여과 제거하고 용매를 진공 중에 제거하여 표제 산물을 흰색 고체로 산출하였다(1.05 g, 94%).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 5.40(2H, dt, J = 3.0 Hz, 13.5 Hz, H-1'a), 3.14(4H, m, H-2/3/9/10), 2.90(2H, d, J = 13.5 Hz, H-1'b), 2.85-2.80(4H, m, H-5/7/12/14), 2.62(4H, td, J = 4.5 Hz, 15.5 Hz, H-5/7/12/14), 2.38(4H, m, H-2/3/9/10), 2.28-2.18(2H, m, H-6/13), 1.21-1.16(2H, dqn, J = 2 Hz, J = 16.5 Hz, H-6/13),

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 68.9(C-1'), 53.6(C-2/3/9/10), 49.3(C-5/7/12/14), 20.3(C-6/13)

1-[10-( 벤질옥시카보닐아미노 )데실]-1,4,8,11- 테트라아자 -4,8- 메타노 - 사이클 로펜타데칸 암모늄 브로마이드(20)

브로마이드 15(1.06 g, 2.88 mmol)를 무수 CH₃CN(80 mL) 중 가교 사이클람 19(0.773 g, 3.45 mmol)의 용액에 N_2(g) 하에 첨가하고 포일로 랩핑한 플라스크에서 72 hr 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 조정제 오일을 CH₂Cl₂(50 mL) 중에 재용해시키고 H₂O(50 mL)로 세척하였다. 수성층을 CH₂Cl₂(2 x 50 mL)로 추출하고 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 농축하였다. 수득된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9:1, 몇 방울의 NH₄OH 포함) 오일을 산출하였다(1.02 g, 69%), R _f = 0.56(CH₂Cl₂:MeOH 9:1)

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 12.70(1H, bs, NH), 9.10(1H, bs, NH), 7.31-7.24(5H, m, ArH), 5.05(2H, s, H-2'), 4.77(1H, bs, NH), 4.05(1H, d, J = 12.0 Hz, H-15a), 3.68(1H, m, CH₂N), 3.34(1H, d, J = 12.0 Hz, H-15b), 3.20-3.10(4H, m, CH₂N, H-25), 3.05-2.83(8H, m, CH₂N), 2.73(1H, dt, J = 5.0, 12.0 Hz, CH₂N), 2.43(1H, m, H-16a), 2.35-2.25(3H, m, H-16b, CH₂N), 2.20(1H, m, CH₂N), 2.11(2H, m, CH₂N, H-6a), 1.87(1H, m, H-6b), 1.65(1H, m, H-13a), 1.55(1H, m, H-13b), 1.50-1.30(4H, m, H-17/24), 1.28-1.20(12H, m, CH₂Alk)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 156.4(C-1'), [136.6, 128.4, 128.0, 128.0(ArC)], 72.8(C-15), 66.5(C-2'), 53.7(C-16), [52.9, 49.3, 48.5, 48.1, 48.0, 48.0, 46.0, 45.1(C-N)], 41.0(C-25), 29.9(C-17), 29.5, 29.5, 29.4, 29.1, 27.7, 26.6, 26.3, 25.1(C-13), 22.4(C-6)

1-[10-(2,3,4,6- O - 테트라벤조일 - β,D - 글루코피라노스 -1-일)-1- 옥소데실 ]-11-[10-(벤질옥시카보닐아미노)데실] -1,4,8,11- 테트라아자 -4,8- 메타노 - 사이클로펜타데 칸(21)

DMAP(0.046 g, 0.37 mmol) 및 Et₃N(0.190 g, 1.88 mmol)을 무수 THF(35 mL) 중 용해시킨 사이클람 유도체 20(0.460 g, 0.93 mmol)의 용액에 첨가하였다. 무수 THF(7.8 mL) 중 용해시킨 산 클로라이드 9(0.775 g, 1.0 mmol)를 용액에 첨가하고 1.5 hr 동안 교반하였다. 용액을 셀라이트를 통해 여과하여 트리에틸암모늄 염을 제거한 뒤 진공 중에 THF를 제거하였다. 조정제 오일을 CH₂Cl₂(20 mL) 중에 재용해시키고 H₂O(2 x 20 mL)로 추출하였다. 유기층을 2M NaOH(20 mL)로 세척하고 분리하고 수성층을 CH₂Cl₂(2 x 20 mL)로 추출하였다. 모든 유기상을 합하여 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 오일을 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9:1) 표제 화합물을 오일로 산출하였다(0.76 g, 65%). R _f = 0.45(CH₂Cl₂:MeOH 9:1). HPLC 분석은 하나의 스팟이 2개의 분리 불가능한 화합물을 함유함을 시사하였고, 이는 나타낸 표제 화합물 및 비스아미날 가교를 갖지 않는 동일 화합물이었다.

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 8.01-7.81(8H, m, ArH), 7.52-7.25(17H, m, ArH), 5.89(1H, t, J = 9.6 Hz, 3'), 5.65(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.50(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 5.08(2H, s, H-2"), 4.83(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.80(1H, bs, NH), 4.62(1H, dd, J = 3.2, 12 Hz, H-6'a), 4.50(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6'b), 4.15(1H, m, H-5'), 3.90(1H, dt, J = 6.4, 9.6 Hz, H-25a), 3.85-3.55(3H, bm, -NCH₂), 3.53(1H, dt, J = 6.8, 9.6 Hz, H-25b), 3.41(2H, bs, -NCH₂), 3.17(2H, t, J = 6.8 Hz, H-35), 2.78-2.45(10H, bm, -NCH₂), 2.39-2.30(5H, m, H-26/-NCH₂), 2.26(2H, m, H-17), 1.70-1.38(12H, m, H-18/24/27/34/6/13), 1.35-1.00(22H, m, CH₂-alk),

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 172.9(C=O), [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], 156.4(C=O), 136.7(ArC), [133.4, 133.2, 133.2, 133.1(ArC)], [129.8, 129.8, 129.7, 129.5, 128.9, 128.9, 128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 128.3, 128.3, 128.1(ArC)], 101.3(C-1'), 73.0(C-3'), 72.1(C-2'), 71.9(C-5'), 70.7(C-15), 70.3(C-25), 69.9(C-4'), 66.5(C-2"), 63.3(C-6'), 56.0(C-26), [55.4, 55.0, 54.7, 54.4, 54.1, 53.9, 52.7, 52.4, 51.9, 51.1, 50.2, 46.5, 45.1, 43.7(NCH₂)], 41.1(C-35), 33.4/ 33.1(C-17), 29.9(C-34), 29.5, 29.5, 29.4, 29.4, 29.3, 29.2, 27.8, 27.6, 27.5, 26.9, 26.8, 25.7, 25.5, 21.6

1-[10-(2,3,4,6- O - 테트라벤조일 - β,D - 글루코피라노스 -1-일)-1- 옥소데실 ]-4,8-비스( tert -부톡시카보닐메틸)-11-[10-(벤질옥시카보닐아미노)데실]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(22)

칼륨 카보네이트(0.033 g, 0.24 mmol)를 N_2(g) 하에 무수 CH₃CN(15 mL) 중 사이클람 21(0.100 g, 0.08 mmol)의 용액에 첨가하였다. t-부틸브로모아세테이트(0.047 g, 0.24 mmol)를 무수 CH₃CN(1 mL) 중에 용해시키고 용액에 첨가한 뒤 16 hr 동안 교반하였다. 용매를 회전 증발기 상에서 제거하고 잔류물을 H₂O(20 mL) 중에 재용해시키고 CH₂Cl₂(4 x 20 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 건조하고 여과하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 유성 잔류물을 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9.5:0.5) 표제 화합물을 오일로 산출하였다(0.086 g, 73%).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 8.02-7.81(8H, m, ArH), 7.53-7.25(17H, m, ArH), 5.89(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.66(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.50(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 5.09(2H, s, H-2"), 4.83(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.78(1H, bs, NH), 4.63(1H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-6'a), 4.50(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6'b), 4.15(1H, m, H-5'), 3.90(1H, dt, J = 6.4, 9.6 Hz, H-25a), 3.53(1H, dt, J = 6.8, 9.6 Hz, H-25b), 3.45(4H, m, NCH₂), 3.25(2H, m, H-1"'), 3.22(2H, s, H-1"'), 3.17(2H, t, J = 6.8 Hz, H-35), 2.82-2.62(8H, m, H-26/NCH₂), 2.46(2H, m, NCH₂), 2.37(4H, m, NCH₂), 2.25(2H, t, J = 6.8 Hz, H-17), 1.67(1H, bm, CH₂), 1.57(5H, m, CH₂), 1.50(4H, m, CH₂), 1.45(9H, s, H-4"'), 1.43(9H, s, H-4"'), 1.32-1.02(24H, m, CH₂Alk)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 172.9(C-16), 170.8(C-2"'), [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], 156.4(C-1"), 136.7(ArC), [133.3, 133.1, 133.1, 133.0, 129.8, 129.7(x4), 129.4, 128.9(x2), 128.5, 128.4, 128.3(x3), 128.2, 128.0(ArC)], 101.3(C-1'), 80.6(x2)(C-3"'), 73.0(C-3'), 72.2(C-2'), 72.0(C-5'), 70.3(C-25), 70.0(C-4'), 66.5(C-2"), 63.3(C-6'), 57.2(C-1"'), 55.9,(C-1"'), [55.0, 53.9, 52.3, 52.0, 51.3, 51.2(x2), 47.0, 44.9(NCH₂)], 41.1(C-35), 33.1/33.0(C-17), [30.0, 29.5, 29.4(x3), 29.3, 29.2(x2), 28.2(x2), 28.0, 27.6, 26.7(x2), 26.5, 25.8, 25.5(x3)(CH₂Alk, C-6/13, C-4"')]

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)-1- 옥소데실 ]-11-[10-( 벤질옥시카보닐아미 노)데실]-1,4,8,11-테트라아자-4,8-메타노-사이클로펜타데칸(23)

나트륨 금속(0.119 g, 5.17 mmol)을 무수 MeOH(5 mL)과 반응시킨 뒤 N_2(g) 하에 무수 MeOH(30 mL) 중 글루코오스-사이클람 21(0.640 g, 0.512 mmol)의 용액에 첨가하고 1 hr 동안 교반하였다. MeOH을 진공 중에 증발시키고 산물을 CH₂Cl₂(20 mL) 중에 재용해시켰다. 추출을 위해 물(20 mL)을 첨가하자, 에멀젼이 형성되었다. 에멀젼이 분리되도록 방치하고 유기층을 제거한 뒤 수성상을 DCM(3 x 40 mL)과 약간의 MeOH(5 mL)로 추가 추출하였다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 농축하였다. 조정제 오일을 건식 로딩하고 자동화 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH, 8:1.8:0.2) 표제 화합물을 오일로 산출하였다(0.374 g, 92%). R _f = 0.55(CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH, 8:1.8:0.2)

δ_H(CD₃OD, 400 MHz): 7.34-7.23(5H, m, ArH), 5.06(2H, s, H-2"), 4.25(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 3.91-3.84(2H, m, H-6'a/25a), 3.80-3.55(2H, bm, 3.67(1H, m, H-6'b) 포함 -NCH₂), 3.60-3.40(2H, bs, 3.53(1H, dt, J = 6.9, 9.6 Hz, H-25b) 포함 -NCH₂), 3.37-3.23(5H, m, H-3'/4'/5'/NCH₂), 3.17(1H, t, J = 7.8 Hz, H-2'), 3.10(2H, t, J = 7.2 Hz, H-35), 2.80-2.50(10H, bm, -NCH₂), 2.50-2.40(4H, m, H-26/NCH₂), 2.37(2H, t, J = 7.2 Hz, H-17), 1.74(2H, m), 1.61(4H, m), 1.48(4H, m), 1.40-1.20(24H, m, CH₂-alk)

δ_C(CD₃OD, 100 MHz): 175.6(C=O), 158.8(C=O), 138.5(ArC), [129.4, 128.9, 128.7(ArC)], 104.4(C-1'), 78.1(C-3'), 77.9(C-2'), 75.1(C-5'), 71.7(C-25), 71.1(C-15), 70.9(C-4'), 67.2(C-2'), 62.8(C-6'), 56.9(C-26), [56.2, 55.4, 55.2, 55.2, 54.6, 54.5, 54.5, 53.8, 53.1, 52.5, 51.1, 51.1, 47.9, 46.0, 45.1, 42.3(NCH₂)], 41.8(C-35), 34.2/34.0(C-17), [30.9, 30.8, 30.6, 30.6, 30.5, 30.5, 30.4, 30.4, 28.7, 28.6, 28.1, 28.0, 27.8, 27.0, 26.8, 26.7, 22.4(C-6/13 포함 C-alk)]

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)-1- 옥소데실 ]-11-[10- 아미노데실 ]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(24)

Pd/C(0.037 g, 10% w/w)를 무수 MeOH(10 mL) 중 글루코오스 사이클람 23(0.374 g, 0.45 mmol)의 용액에 첨가하였다. 플라스크를 H_2(g)로 플러싱하고 수소-충전 풍선을 이용해서 H_2(g) 환경 하에 하룻밤 동안 교반하였다. 용액을 셀라이트 층을 통해 여과하고 MeOH로 세척한 뒤 MeOH을 진공 하에 제거하였다. 이어서 조정제 오일을 MeOH(5 mL) 중에 재용해시키고 2M NaOH(5 mL)을 첨가하여 산물을 그 자유 염기 형태로 수득하였다. 물 및 MeOH을 진공 하에 제거하고 MeOH(10 mL)을 다시 플라스크에 첨가하였다. 흰색 고체가 침전되어 나온 뒤 셀라이트를 통해 여과 제거하였다. 용매를 증발시키고 조정제 산물을 건식 로딩하고 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다(CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH, 7:2.5:0.5). 2개의 주요 이성질체가 수득되었으며, 이는 완전히 분리할 수 없었다(상부 이성질체 0.040 g, 혼합 이성질체 0.153 g, 하부 이성질체 0.084 g, 총 수율 = 89%). NMR 분석은 상부 이성질체가 여전히 비스-아미날 가교를 함유함을 시사한 반면, 하부 이성질체는 표제 화합물인 것으로 분석되었다.

δ_H(CD₃OD, 400 MHz): 4.25(1H, d, J = 8.0 Hz, H-1'), 3.89(1H, dt, J = 6.8, 9.6 Hz, H-25a), 3.86(1H, dd, J = 2.0, 12.0 Hz, H-6'a), 3.68(1H, dd, J = 5.6, 12.0 Hz, H-6'b), 3.62-3.44(5H, m, H-2/14/25b), 3.37(1H, t, J = 8.8 Hz, H-3'), 3.32-3.24(2H, m, H-4'/5'), 3.17(1H, t, J = 8.0 Hz, H-2'), 2.96(2H, m, -NCH₂), 2.86-2.76(8H, m, H-35/-NCH₂(x3)), 2.66(2H, m, -NCH₂), 2.55-2.33(6H, m, H-17/26/NCH₂), 1.85(2H, m, H-6), 1.80-1.55(8H, m, H-13/18/24/34), 1.49(2H, m, H-27), 1.42-1.28(22H, m, CH₂-alk)

δ_C(CD₃OD, 100 MHz): 175.6(C-16), 104.4(C-1'), 78.2(C-3'), 77.9(C-2'), 75.2(C-5'), 71.8(C-25), 70.9(C-4'), 62.9(C-6'), 56.0(C-26), [53.5, 53.4, 52.8, 52.6, 51.3(x2), 50.5(x2), 49.7(x2), 48.6(x2), 48.0(x2), 46.4(x2)(NCH₂ 및 로타머)], 41.4(C-35), 34.2/33.9(C-17 및 로타머), [30.8, 30.6(x2), 30.4(x2), 30.4, 30.3, 28.7, 28.5, 28.2, 27.8, 27.6, 27.4, 27.0, 26.7(C-6/13 및 로타머 포함 CH₂Alk)]

1-[10-(2,3,4,6- O - 테트라벤조일 - β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert -부톡시카보닐메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(25)

브로마이드 4(0.126 g, 0.16 mmol)를 CH₃CN(5 mL) 중에 용해시키고 무수 CH₃CN(5 mL) 중 1,8-비스(t-부톡시카보닐메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(0.095 g, 0.22 mmol)의 용액에 K₂CO₃(0.061 g, 0.44 mmol)와 함께 N_2(g)하에 첨가하고 60℃에서 72 hr 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 조정제 오일을 1 M HCl(10 mL) 중에 재용해시키고 EtOAc(2 x 20 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 농축하고 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9.6:0.4; 9.4:0.6; 9.2:0.8; 9:1) 오일을 산출하였다(0.05 g, 28%), R _f = 0.45(CH₂Cl₂:MeOH 9:1).

δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 8.00-7.81(8H, m, ArH), 7.53-7.25(17H, m, ArH), 5.88(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3'), 5.65(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4'), 5.50(1H, dd, J = 7.8, 9.6 Hz, H-2'), 4.82(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.61(1H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-6'a), 4.50(1H, dd, J = 5.2, 12.0 Hz, H-6'b), 4.15(1H, m, H-5'), 3.89(1H, dt, J = 6.4, 9.6 Hz, H-25a), 3.63(2H, m, NCH₂), 3.52(1H, dt, J = 6.8, 9.6 Hz, H-25b), 3.46(2H, m, NCH₂), 3.32(2H, m, NCH₂), 3.24-3.17(2H, m, NCH₂), 3.16-3.08(4H, m, NCH₂), 3.01(2H, m, NCH₂), 2.92(2H, m, NCH₂), 2.83(2H, m, NCH₂), 2.74(2H, m, NCH₂), 2.63(2H, t, J = 6.8 Hz, H-16), 2.05(2H, m, H-6), 1.85(2H, m, H-13), 1.53(2H, m, CH₂), 1.47(9H, s, H-4"'), 1.43(9H, s, H-4"'), 1.32-1.02(12H, m, CH₂Alk)

1-[10-(2,3,4,6- O - 테트라벤조일 - β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert -부톡시카보닐메틸)-8-[10-( t -부톡시카보닐아미노)데실]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(26)

브로마이드 15(0.029 g, 0.08 mmol)를 무수 CH₃CN(2 mL) 중 사이클람 25(0.050 g, 0.04 mmol)의 용액에 K₂CO₃(0.018 g, 0.12 mmol)와 함께 N_2(g)하에 첨가하고 60℃에서 24 hr 동안 교반하였다. 반응이 매우 천천히 진행되었으므로 추가 브로마이드 15(0.019 g) 및 K₂CO₃(0.012 g)를 첨가하고 반응을 다시 60℃에서 24 hr 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 조정제 오일을 1 M HCl(10 mL) 중에 재용해시키고 EtOAc(3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 농축하고 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9.5:0.5와 몇 방울의 AcOH) 오일을 산출하였다(0.03 g, 50%), R _f = 0.59(CH₂Cl₂:MeOH 9.5:0.5).

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 디아세트산 -8-[10- 아미노데실 ]-1,4,8,11-테트라아자사이클로 테트라데칸 (27)

TFA(1.0 mL)를 무수 MeOH(4 mL) 중 사이클람 26(0.030 g, 0.02 mmol)의 용액에 첨가하여 20% TFA의 최종 용액을 만들었다. 반응을 실온에서 24 hr 동안 교반하였다. 용매 및 TFA를 진공 하에 증발시켜 잔류물을 산출하고 다음 반응에 바로 이용하였다. 잔류물을 MeOH(2 mL) 중에 용해시키고 NaOMe(MeOH 중 24%)(0.5 mL)의 첨가 후 5분 동안 교반하였다. 반응을 Dowex H⁺(0.5 g) 첨가로 켄칭하고 5분 동안 교반한 후 Dowex를 셀라이트 층을 통해 여과 제거하였다. 여액을 농축하여 고체 잔류물을 산출하고, 여기에 MeOH(1 mL)을 첨가하여 산물을 TFA 염으로부터 추출하였다. MeOH을 증발시켜 여전히 일부 TFA 염을 함유하는 유리질 고체(0.021 g)를 산출하였다.

LRMS: C₄₀H₇₉N₅O₁₀에 대한 m/z 산출치 = 789.58; 실측치(M+H⁺) = 790.6

실시예 6 - 프로- 컨쥬게이트 - 사이클람에 대한 글루코오스 링커 및 절단 가능한 링커의 부착에 의한 합성

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert - 부톡시카보닐메틸 )-1,4,8,11-테트라아자사이클로-테트라데칸(28)

나트륨 메톡사이드(0.20 mL, 25% 용액)를 무수 MeOH(2.0 mL) 중 사이클람 25(0.05 g, 0.04 mmol)의 용액에 첨가하고 30분 동안 교반한다. 용매를 증발시키고 잔류물을 EtOAc(5 mL) 중에 재용해시키고 0.25 M HCl(2 x 5 mL)로 세척한다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 8.5:1.5) 표제 화합물을 오일로 산출한다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert - 부톡시카보닐메틸 )-8-[3-(토실티오)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(29)

브로마이드 18(0.019 g, 0.06 mmol)을 무수 CH₃CN(2 mL) 중 사이클람 28(0.020 g, 0.03 mmol)의 용액에 K₂CO₃(0.012 g, 0.09 mmol)과 함께 N_2(g) 하에 첨가하고 60℃에서 24 hr 동안 교반한다. 반응을 켄칭하지 않고 다음 단계로 바로 진행하였다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert - 부톡시카보닐메틸 )-8-[3-(펜트-4-인-1-일디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(30)

4-펜틴-1-티올(0.004 g, 0.04 mmol)을 이전 반응 용액에 첨가한 뒤 추가 2 hr 동안 환류시킨다. 용매를 진공 하에 증발시키고 조정제 잔류물을 EtOAc(5 mL) 중에 재용해시키고 포화 수성 NH₄Cl(5 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9:1) 표제 화합물을 오일로 산출한다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11- 비스 ( tert - 부톡시카보닐메틸 )-8-[3-(((( tert -부톡시카보닐)아미노)데실)디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(31)

티올 17(0.011 g, 0.04 mmol)을 반응 29로부터의 용액에 첨가한 뒤 추가 2 hr 동안 환류시킨다. 용매를 진공 하에 증발시키고, 조정제 잔류물을 EtOAc(5 mL) 중에 재용해시키고 포화 수성 NH₄Cl(5 mL)로 세척한다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH 9:1) 표제 화합물을 오일로 산출한다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11-( 디아세트산 )-8-[3-(( 아미노데실 )디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(32)

6 M HCl/EtOAc(0.50 mL) 용액을 EtOAc(4.5 mL) 중 용해시킨 사이클람 31(0.020 g, 0.02 mmol)에 첨가하고 2 hr 동안 교반한다. 산물은 흰색 HCl 염으로서 침전되어 나왔고, 이후 여과 제거하고 EtOAc(5 mL)로 1회 세척하여 건조한다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11-( 디아세트산 )-8-[3-( 펜트 -4-인-1-일디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(33)

6 M HCl/EtOAc(0.50 mL)의 용액을 EtOAc(4.5 mL) 중에 용해시킨 사이클람 30(0.020 g, 0.02 mmol)에 첨가하고 2 hr 동안 교반한다. 모든 용매를 진공 하에 증발 제거하고 고체 산물을 EtOH로부터 재결정화하였다.

실시예 7 - 방사선표지화 - ¹⁰³ Pd 배위 원리의 증명을 위한 글루코오스- 사이클람 중간체의 합성 및 방사선표지화

1,4,8- 트리스 -( tert - 부톡시카보닐메틸 )-1,4,8,11- 테트라아자사이클로테트라 데칸(34)

CH₃CN(25 mL) 중에 용해시킨 t-부틸브로모아세테이트(0.205 g, 1.05 mmol)를 CH₃CN(70 mL) 중 사이클람(0.100 g, 0.50 mmol) 및 NaHCO₃(0.088 g, 1.05 mmol)의 용액에 첨가하고 15 hr 동안 환류시켰다. 형성된 흰색 침전물을 여과 제거하고 용매를 진공 중에 제거하였다. 이어서 잔류물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(CH₂Cl₂:MeOH:NH₄OH 10:1:0.1) 표제 화합물을 결정화되는 약간 노란색의 오일로 산출하였다. 고체를 톨루엔으로 재결정화하여 투명 결정을 산출하였다(0.126 g, 46%). δ_H(CDCl₃, 400 MHz): 9.01(2 H, bs, -NH), 3.42(2H, s, H-1'), 3.38(2H, s, H-1'), 3.29(2H, m, H-12), 3.17(2H, m, H-9), 3.11(2H, s, H-1'), 3.03(2H, m, H-10), 2.74(2H, t, J = 5.6 Hz, CH₂N), 2.70(2H, m, CH₂N), 2.63(2H, t, J = 5.6 Hz, CH₂N), 2.59(4H, m, CH₂N), 2.03(2H, bm, H-13), 1.66(2H, m, H-6), 1.46(9H, s, H-4'), 1.45(9H, s, H-4'), 1.43(9H, s, H-4')

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 171.1(C=O), 170.8(C=O), 170.5(C=O), 82.3(C-3'), 81.6(C-3'), 81.2(C-3'), 55.8(C-1'), 55.7(C-1'), 55.3(C-1'), 53.8(CH₂N), 52.0(C-12), 51.2(C-9), 50.5(CH₂N), 49.2(CH₂N), 48.5(C-10), 47.6(CH₂N), 46.7(CH₂N), 28.2(C-4'), 23.3(C-6), 22.5(C-13)

1-(10-( 테트라 - O - 벤조일 -β-D- 글루코피라노스 -1-일)데실)-4,8,11- 트리스 -( tert -부톡시카보닐메틸)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(35)

브로마이드 4(0.590 g, 0.72 mmol)를 무수 MeCN(10 mL) 중에 용해시키고 MeCN(50 mL) 중 사이클람 34(0.327 g, 0.60 mmol) 및 NaHCO₃(0.152 g, 1.80 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응을 48 hr 동안 80℃에서 환류시킨 후 H₂O(1 mL)를 첨가하고 반응을 48 hr 동안 다시 환류시켰다. 용매를 진공 하에 증발시키고 조정제 물질을 DCM(20 mL) 및 물(20 mL) 중에 재용해시켰다. 수성상을 DCM(3 x 20 mL)로 추출하고 유기상을 건조하고 여과하고 농축하여 조정제 오일을 산출하고 DCM:MeOH(9.5:0.5)을 이동상으로 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 표제 산물을 투명 오일로 수득하였다(0.370g, 48%). δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 8.02-7.81(8H, m, ArH), 7.55-7.25(12H, m, ArH), 5.89(1H, t, J = 9.6 Hz, H-3"), 5.66(1H, t, J = 9.6 Hz, H-4"), 5.51(1H, dd, J = 7.8, 9.7 Hz, H-2"), 4.83(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1"), 4.63(1H, dd, J = 3.4, 12.1 Hz, H-6a"), 4.50(1H, dd, J = 5.2, 12.1 Hz, H-6b"), 4.15(1H, m, H-5"), 3.90(1H, dt, J = 6.2, 9.7 Hz, H-24a), 3.53(1H, dt, J = 6.2, 9.7 Hz, H-24b), 3.53(2H, m, CH₂N), 3.32-3.22(8H, m, CH₂N, 3 x H-1'), 3.12-3.06(4H, m, H-15, CH₂N), 2.72-2.60(10H, m, 5 x CH₂N), 1.99(2H, m, H-13), 1.78(2H, m, H-16), 1.61(2H, m, H-6), 1.52(2H, m, H-23), 1.45(27H, s, H-4'), 1.30-1.05(12H, m, CH₂-alk)

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 170.7(C-2'), 170.5(C-2'), 170.7(C-2'), [166.1, 165.8, 165.2, 165.0(C=O)], [133.3, 133.1, 133.1, 133.0, 129.8(x2), 129.7(x4), 129.6(x2), 129.4(x2), 128.9(x2), 128.4(x4), 128.3(x2), 128.2(x2)(ArC)], 101.3(C-1"), 81.4(C-3'), 81.4(C-3'), 81.0(C-3'), 73.0(C-3"), 72.1(C-2"), 72.0(C-5"), 70.3(C-24), 69.9(C-4"), 63.3(C-6"), 55.7(C-1'), 55.7(C-1'), 55.2(C-1'), 53.2(C-15), [52.1, 51.9, 51.8, 51.0, 50.7, 50.2, 50.0, 49.6(CH₂N)], [29.3, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0(CH₂)], 28.2(x3)(C-4'), 26.9(C-22), 25.7(C-17), 25.4(C-6), 23.4(C-16), 22.5(C-13)

1-(10-(β-D- 글루코피라노스 -1-일)데실)-4,8,11- 트리스 -(아세트산)-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라-데칸 트리플루오로아세테이트 염(36)

나트륨 메톡사이드(0.20 mL, 25% 용액)를 무수 MeOH(4.0 mL) 중 사이클람 35(0.110 g, 0.09 mmol)의 용액에 첨가하고 1 hr 동안 교반하였다. 반응을 0.25 M HCl(10 mL)로 켄칭하고 DCM(3 x 10 mL)으로 추출하였다. 수성상을 2 M NaOH로 pH 10 내지 11까지 염기성화하고 다시 DCM(3 x 10 mL)으로 추출하였다. 유기상을 건조하고 여과하고 농축하여 조정제 오일을 산출하였다. 이어서 오일을 DCM(2 mL) 중에 용해시키고 트리플루오로아세트산(2.0 mL)을 용액에 첨가한 뒤 하룻밤 동안 교반하였다. 그 뒤 모든 용매를 증발시키고 나머지 오일을 물(5 mL) 중에 재용해시키고 CHCl₃(3 x 3 mL)로 추출하였다. 수성상을 농축하고 고진공 하에 추가 건조하여 표제 화합물의 TFA-염을 유리질 고체로 산출하였다(0.032 g, 36%).

δ_H(D₂O, 400 MHz): 4.32(1H, d, J = 7.8 Hz, H-1"), 3.93(2H, s, H-1'), 3.79(2H, m, H-6"a/24a), 3.61-3.51(6H, m, H-6"b/24b/1"(x2)), 3.40-3.25(11H, m, H-3"/4"/5"/NCH₂(x4)), 3.16-3.08(7H, H-2"/15/ NCH₂(x2)), 2.90(4H, bm, -NCH₂(x2)), 1.93(4H, m, H-6/13), 1.59(2H, m, H-16), 1.50(2H, m, H-23), 1.25-1.15(12H, m, CH₂-alk(x6))

δ_C(D₂O, 100 MHz): 173.8(C-2'), 173.7(C-2'), 169.6(C-2'), 102.1(C-1"), 75.8(C-3"), 75.8(C-5"), 73.1(C-2"), 70.6(C-24), 69.9(C-4"), 60.8(C-6"), 54.7(C-1'), 54.5(C-1'), 54.4(C-1'), 53.9(C-15), [52.9, 52.5, 51.6, 51.5, 50.6, 50.0, 49.6, 48.9(CH₂N)], [28.7, 28.4, 28.3, 28.3, 28.0, 25.6, 24.9(CH₂)], 22.5(C-16), [21.6, 21.0(C-6/13)]

¹⁰³ Pd를 이용한 사이클람 X의 표지화 절차

¹⁰³Pd(NH₃)₄Cl₂를 물(150 uL)(대략 pH 5) 중에 용해시키고 5 M NaOH(4 uL)로 pH 10 내지 11까지 조정하였다. 사이클람 36(50 uL 0.450 mg)을 ¹⁰³Pd(NH₃)₄Cl₂ 용액에 첨가하고 혼합물을 30분 동안 80℃에서 가열하였다. 이어서 반응 용액(20 uL)을 Agilent Zorbax Extend C-18 5 um, 4.6 x 250 mm 칼럼 및 Raytest Gabi Star Gamma 검출기가 장착된 HPLC 내로 주입하여 분석하고, A: 0.01 M 암모늄 아세테이트 pH 9.5, B: 메탄올의 이동상 시스템을 구배 용출 하에 실행하여(0분 A:B = 95:5; 2분 A:B = 80:20; 4분 A:B = 50:50; 10분 A:B = 0:100) 0.8 mL/분의 유속으로 분석하였다. 자유 금속은 체류 시간 1.35분에서 용출된 반면, 표지된 산물은 6.6분의 체류 시간을 가졌다.

실시예 8 : 방사선표지화 - ¹⁰³ Pd 배위 원리의 증명을 위한 사이클람 프로- 컨쥬게이트 27의 방사선표지화

음이온 교환 칼럼 상의 ¹⁰³Pd 정제로부터 수득된 ¹⁰³Pd(NH₃)₄Cl₂ 분획(32 MBq)을 milliQ-물(200 uL)(대략 pH 4) 중에 용해시켰다. 사이클람 27(100 uL, 1.0 mg)을 바이알 내의 ¹⁰³Pd(NH₃)₄Cl₂ 용액(100 uL)에 첨가하고 혼합물을 30분 동안 85℃에서 가열하였다. 이어서 반응 용액(20 uL)을 Agilent Zorbax Extend C-18 5 um, 4.6 x 250 mm 칼럼 및 Raytest Gabi Star Gamma 검출기가 장착된 HPLC 내로 주입하여 분석하고, A: 0.01 M 암모늄 아세테이트 pH 9.5, B: 메탄올의 이동상 시스템을 구배 용출 하에 실행하여(0분 A:B = 95:5; 2분 A:B = 80:20; 4분 A:B = 50:50; 10분 A:B = 0:100) 0.8 mL/분의 유속으로 분석하였다. 자유 금속은 체류 시간 1.35분에서 용출된 반면, 표지된 산물은 7.9분의 체류 시간을 가졌다.

실시예 9 : 아민의 말레이미드 모이어티로의 전환

N - (메톡시카보닐)말레이미드(37)

메틸 클로로포르메이트(0.87 mL, 11.3 mmol)를 0℃에서 EtOAc(80 mL) 중 말레이미드(1.00 g, 10.3 mmol) 및 N-메틸 모르폴린(1.24 mL, 11.3 mmol)의 용액으로 천천히 첨가하고 1 hr 동안 교반하였다. 침전물을 셀라이트 층을 통한 여과를 통해 분리해내고, 여액을 진공 중에 농축하였다. 조정제 오일을 헥산:CH₂Cl₂로 재결정화하려 노력했으나, 결정화가 일어나지 않았다. 조정제 산물을 EtOAc(100 mL) 중에 재용해시키고 실리카 상에 흡착시키고 칼럼 크로마토그래피를 이용해서 정제하여(Hex:EtOAc 6:4) 흰색 고체(1.07 g, 67%)를 산출하였다.

δ_H(CDCl₃, 300 MHz): 6.83(2H, s, CH-3/4), 3.94(3H, s, CH₃-2')

δ_C(CDCl₃, 100 MHz): 165.6(C-2/5), 148.1(C-1'), 132.3(C-3/4), 54.2(C-2')

N -10-(β-D- 글루코피라노스 -1-일)데실- 말레이미드 (38)

N-(메톡시카보닐) 말레이미드(37)(0.014 g, 0.09 mmol)를 디옥산(0.75 mL) 및 포화 NaHCO₃ _(aq)(1.5 mL) 중 (10-아미노데실) β-D-글루코피라노사이드(0.015 g, 0.04 mmol)의 교반 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응을 1 hr 동안 교반한 후 반응을 EtOAc(10 mL) 및 물(10 mL)로 켄칭하였다. 유기상을 분리해내고 수성상을 EtOAc(3 x 10 mL)로 추출하였다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 상에 흡착시키고 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(CH₂Cl₂:MeOH 9:1). 표제 화합물을 투명 오일로 수득하였다(0.011 g, 60%). Rf = 0.15(CH₂Cl₂:MeOH 9:1)

δ_H(CD₃OD, 300 MHz): 6.79(2H, s, 3'/4'), 4.24(1H, d, J = 7.5 Hz, H-1"), 3.93-3.84(2H, m, H-6"a/H-10a), 3.69-3.64(1H, m, H-6"b), 3.57-3.50(1H, dt, J = 6.6, 9.6 Hz, H-10b), 3.48(2H, t, J = 6.9 Hz, H-1), 3.38-3.22(3H, m, H-3"/4"/5"), 3.19-3.13(1H, m, H-2"), 1.64-1.54(4H, m, H-2/9), 1.42-1.28(12H, m, AlkCH₂). δ_C(CD₃OD, 100 MHz): 172.6(C-2'/5'), 135.3(C-3'/4'), 104.4(C-1"), 78.2(C-3"), 77.9(C-2"), 75.1(C-5"), 71.7(C-10), 70.9(C-4"), 62.8(C-6"), 38.5(C-1), 30.8(C-2), 30.5(x3), 30.1, 29.4, 27.7, 27.0(CH₂Alk)

실시예 10: 알부민 담체에 대한 연결을 위한 말레이미드 모이어티의 프로- 컨쥬게이트 내로의 삽입

말레이미드 모이어티를 포함하는 절단 불가능한 링커 프로- 컨쥬게이트의 합성

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11-( 디아세트산 )-8-[10- 말레이미도데 실]-1,4,8,11-테트라아자 사이클로테트라데칸 (39)

N-(메톡시카보닐) 말레이미드(37)(0.008 g, 0.05 mmol)를 디옥산(0.75 mL) 및 포화 NaHCO₃ _(aq)(1.5 mL) 중 사이클람 27(0.015 g, 0.02 mmol)의 교반 용액에 RT에서 첨가한다. 반응을 1 hr 동안 교반한 후, 반응을 0.25 M HCl(5 mL)로 켄칭한다. 수성상을 EtOH:CHCl₃(2:1)(5 x 5 mL)로 추출한다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 용매를 진공 하에 증발시켜서 산물을 오일로 산출한다.

말레이미드 모이어티를 포함하는 절단 가능한 링커 프로-컨쥬게이트의 합성

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11-( 디아세트산 )-8-[3-(( 말레이미도데 실)디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(40)

N-(메톡시카보닐) 말레이미드(37)(0.008 g, 0.05 mmol)를 디옥산(0.75 mL) 및 포화 NaHCO₃ _(aq)(1.5 mL) 중 사이클람 32(0.015 g, 0.02 mmol)의 교반 용액에 RT에서 첨가한다. 반응을 1 hr 동안 교반한 후 반응을 0.25 M HCl(5 mL)로 켄칭한다. 수성상을 EtOH:CHCl₃(2:1)(5 x 5 mL)로 추출한다. 유기층을 합하여 건조하고 여과하고 용매를 진공 하에 증발시켜 산물을 오일로 산출한다.

1-[10-( β,D - 글루코피라노스 -1-일)]-4,11-( 디아세트산 )-8-[3-((말레이미도프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)프로필))디설파닐)프로필]-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸(41)

3-아지도프로필-1-말레이미드(0.002 g, 0.02 mmol)를 DMF(1.0 mL) 중 디이소프로필에틸아민(0.0013 g, 0.01 mmol), 사이클람 33(0.015 g, 0.02 mmol) 및 촉매성 구리 요오다이드(0.2 eq)의 교반 용액으로 RT에서 첨가한다. 반응을 2 hr 동안 교반한 후 반응을 0.25 M HCl(1 mL)로 켄칭하였다. 모든 용매를 진공 하에 증발시키고 잔류물을 0.25 M HCl(2 ml) 중에 재용해시킨 후 산물을 EtOH:CHCl₃(2:1)(5 x 3 mL)로 추출한다. 유기 추출물을 합하여 건조하고 여과하고 농축하여 표제 화합물을 산출하였다.

실시예 11: 알부민에 대한 말레이미도 - 작용화 화합물의 부착

알부민과 말레이미도 -글리코사이드 38의 반응

1 x PBS(1 mL) 중에 BSA(0.016 g, 0.24 umols) 및 38(0.001 g, 2.4 umols)을 각각 용해시켜 BSA 및 38의 대조군 용액을 제조하였다. 20 uL의 각각의 대조군 용액을 A: CH₃CN(0.1% TFA) 및 B: H₂O(0.1% TFA), 0% 내지 60% A의 30분에 걸친 구배 용출 하에 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC 분석을 Agilent Zorbax Eclipse Plus C-18(4.6 x 150 mm 5 um) 칼럼을 이용해서 Agilent 1220 Infinity LC 상에서 수행하였다. 이어서 대조군 용액을 24 hr 동안 37℃에서 가열하고 동일한 방법을 이용해서 HPLC에 의해 재분석하였다.

BSA 및 38의 신선 용액을 상기와 같이 제조하고, 37℃에서의 가열에 의해 에펜도르프 튜브에서 함께 반응시켰다. 5분 후, 용액 샘플을 상기와 동일한 방법을 이용해서 HPLC에 의해 분석하였다.

알부민과 말레이미도 -프로- 컨쥬게이트 39의 반응

1 x PBS(1 mL) 중에 BSA(0.007 g, 0.11 umols) 및 39(0.001 g, 1.1 umols)을 각각 용해시켜 BSA 및 39의 대조군 용액을 제조하였다. 20 uL의 각각의 대조군 용액을 A: CH₃CN(0.1% TFA) 및 B: H₂O(0.1% TFA), 0% 내지 60% A의 30분에 걸친 구배 용출 하에 HPLC에 의해 분석하였다. HPLC 분석을 Agilent Zorbax Eclipse Plus C-18(4.6 x 150 mm 5 um) 칼럼을 이용해서 Agilent 1220 Infinity LC 상에서 수행한다. 이어서 대조군 용액을 24 hr 동안 37℃에서 가열하고 동일한 방법을 이용해서 HPLC에 의해 재분석한다.

BSA 및 39의 신선 용액을 상기와 같이 제조하고, 37℃에서의 가열에 의해 에펜도르프 튜브에서 함께 반응시킨다. 5분 후, 용액 샘플을 상기와 동일한 방법을 이용해서 HPLC에 의해 분석하였다.

<110> THE SOUTH AFRICAN NUCLEAR ENERGY CORPORATION, LTD. UNIVERSITY OF CAPE TOWN <120> RADIOPHARMACEUTICAL CONJUGATE <130> 23229 <150> WO 2015/057378 <151> 2015-09-25 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Gly Gly Phe 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Met Gly Leu Pro 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln 1 5

Claims

종양 세포를 표적으로 하는 대사물질, 방사선 핵종을 함유할 수 있는 킬레이트화제, 및 EPR 제제와 결합할 수 있는 절단 가능한 링커 또는 EPR 제제에 결합된 절단 가능한 링커를 포함하는 분자로서,
상기 분자는
a) 크기가 40kDa를 초과하는 EPR 제제와 결합할 수 있는 절단 가능한 링커, 또는
b) 크기가 40kDa를 초과하는 EPR 제제에 결합된 절단 가능한 링커에 결합되는, 방사성 핵종을 포함할 수 있는 킬레이트화제에 결합되는, 크기가 1000 Da 미만이고 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질을 포함하는 선형 분자이고,
상기 절단 가능한 링커는 종양 환경 내에서, 생체 내 절단되는 절단 가능한 결합을 포함하는 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 절단 가능한 결합은 7 미만의 pH에 의해, 글루타치온에 의해, 또는 효소의 상향-조절(up-regulation)이 있는 경우에 종양 환경 내에서, 생체 내에서 절단되는 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 EPR 제제에 결합되는 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 4 내지 20개 탄소 원자의 탄소사슬을 포함하는 것인, 분자.
제4항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 8 내지 15개 탄소 원자의 탄소사슬을 포함하는 것인, 분자.
제2항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 하이드라존 결합, 디설파이드 결합, 또는 효소적으로 절단 가능한 펩타이드 서열을 포함하는 것인, 분자.
제3항에 있어서, 상기 EPR 제제는 증강된 투과성 및 보유(EPR) 효과로 인해 생체 내 종양에서 축적되는 중합체성 나노입자, 중합체성 마이셀, 덴드리머, 리포좀, 바이러스 나노입자, 탄소 나노입자 및 단백질로부터 선택되는 것인, 분자.
제7항에 있어서, 상기 EPR 제제는 생분해성 합성 중합체, 생체적합성이지만 생분해성이 아닌 합성 중합체, 또는 천연 중합체인 것인, 분자.
제8항에 있어서, 상기 생분해성 합성 중합체는 폴리글루타메이트(PG), 폴리락티드(PLA) 또는 폴리(D,L-락티드-코-글리콜라이드)(PLGA)인 것인, 분자.
제8항에 있어서, 상기 생체적합성이지만 생분해성이 아닌 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 N-(2-하이드록시프로필)메틸아크릴아마이드(HMPA)인 것인, 분자.
제8항에 있어서, 상기 천연 중합체는 알부민, 키토산 또는 헤파린인 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질은 100 Da 내지 700 Da 크기인 것인, 분자.
제12항에 있어서, 상기 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질은 저분자는 폴레이트, 만노오스, 글루코오스 또는 갈락토오스인 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 방사선동위원소와 착화될 수 있는 고리형 또는 비고리형 2작용성 킬레이트화제(BFCA)인 것인, 분자.
제14항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 1,4,7-트리아자사이클로노난(TACN); 1,4,7-트리아자사이클로노난-트리아세트산(NOTA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N-숙신산-N',N"-디아세트산(NOTASA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N-글루탐산-N',N"-디아세트산(NODAGA); 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리스(메틸렌포스포닉)(NOTP); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸([12]안N4)(사이클렌); 1,4,7,10-테트라아자사이클로트리데칸([13]안N4); 1,4,7,11-테트라아자사이클로테트라데칸(이소-사이클람); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA); 2-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일)아세테이트(DO1A); 2,2'-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,7-디일) 디아세트산(DO2A); 2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일) 트리아세트산(DO3A); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산)(DOTP); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,7-디(메탄포스폰산)(DO2P); 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리(메탄포스폰산)(DO3P); 1,4,7,10-테트라아자사이클로-데칸-1-글루탐산-4,7,10-트리아세트산(DOTAGA); 1,4,7,10-테트라아자사이클로데칸-1-숙신산-4,7,10-트리아세트산(DOTASA); 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸([14]안N4)(사이클람); 1,4,8,12-테트라아자사이클로펜타데칸([15]안N4); 1,5,9,13-테트라아자사이클로헥사데칸([16]안N4); 1,4-에타노-1,4,8,11-테트라아자사이클로-테트라데칸(에트-사이클람); 1,4,8,11-15-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA); 2-(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1-일) 아세트산(TE1A); 2,2'-(1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,8-디일) 디아세트산(TE2A); 4,11-비스(카복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]-헥사데칸(CB-TE2A); 3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]아이코산(Sar); 프탈로시아닌; 포르피린으로부터 선택되는 고리형 킬레이터인 것인, 분자.
제14항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 에틸렌-디아민-테트라아세트산(EDTA); 및 디에틸렌-트리아민-펜타-아세트산(DTPA). S-아세틸머캅토숙신산 무수물(SAMSA); (2-머캅토에틸)(2-((2-머캅토에틸)아미노)에틸)-카르밤산(N2S2-DADT); 1,1'-(에탄-1,2-디일비스(아잔디일))비스(2-메틸프로판-2-티올)(N2S2 BAT-TM), (2-(2-머캅토아세트아마이도)에틸)-시스테인(N2S2-MAMA); 2,3-비스(2-머캅토아세트아마이도)-프로판산(N2S2 DADS); 에틸렌디시스테인(EC); 2,2',2"-니트릴로트리에탄티올(NS3); 2-에틸티오-N,N-비스(피리딘-2-일)메틸-에탄아민(N3S); ((2-머캅토아세틸)글리실글리실)카르밤산(MAG3) 및 4-(2-(2-(2-머캅토아세트아마이도)아세트아마이도)-아세트아마이도)부탄산(MAG2-GABA); (1,2-비스{[[6-(카복시)피리딘-2-일]메틸]-아미노}-에탄)(H2dedpa); 니트릴로트리스(메틸렌포스핀산)(NTMP); 에틸렌디아민테트라메틸렌-포스폰산(EDTMP), 디에틸렌트리아민펜타-메틸렌 포스폰산(DTPMP); 하이드라지노니코틴산(HYNIC); N'-{5-[아세틸(하이드록시)아미노]-펜틸}-N-[5-({4-[(5-아미노펜틸)-(하이드록시)아미노]-4-옥소부타노일}아미노)펜틸]-N-하이드록시숙신-아마이드(데페록사민)로부터 선택되는 비고리형 킬레이터인 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 방사선핵종은 ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ⁵⁹Fe, ⁶³Zn, ⁵²Fe, ⁴⁵Ti, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ⁶²Cu, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ^195mPt, ^191mPt, ^193mPt, ^117mSn, ⁸⁹Zr, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F, ¹²³I로부터 선택되는 조영을 위해 이용될 수 있는 방사선핵종인 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 방사선핵종은 ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹¹¹In, ¹⁵³Gd, ²²⁵Ac, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹¹At, ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁴Cu, ⁶²Cu, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ^195mPt, ^193mPt, ¹⁹⁷Pt, ^117mSn, ¹⁰³Pd, ^103mRh, ¹⁷⁷Lu, ²²³Ra, ²²⁴Ra, ²²⁷Th, ³²P, ¹⁶¹Tb　 및 ³³P, ¹²⁵I, ²⁰³Pb, ²⁰¹Tl, ¹¹⁹Sb, ^58mCo, ¹⁶¹Ho로부터 선택되는 치료 목적을 위해 이용될 수 있는 방사선핵종인 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 방사선핵종은 오제(Auger) 전자 방출 방사선핵종인 것인, 분자.
제19항에 있어서, 상기 오제 전자 방출 방사선핵종은 ¹¹¹In, ²⁰³Pb, ²⁰¹Tl, ¹⁰³Pd, ^103mRh,¹¹⁹Sb, ^58mCo, ¹⁶¹Ho, ¹⁶¹Tb, ⁶¹Cu, ⁶⁷Cu, ^195mPt, ^193mPt, ^117mSn으로부터 선택되는 것인, 분자.
제1항에 있어서, 상기 킬레이트화제는 방사선핵종을 함유하는 것인, 분자.
제1항에 있어서,
상기 종양 세포를 표적으로 하는 대사물질은 알킬화 또는 아실화를 통해 킬레이트화제에 대한 연결을 위해 작용화되는 글루코오스 함유 링커이고;
킬레이트화제는 방사선동위원소 킬레이트화를 위해 N-결합을 통해 작용화되는 사이클람(cyclam)이고;
링커는 말레이미드(maleimide)로 작용화되며;
EPR 제제는 알부민인 것인, 분자.
제22항에 있어서, ¹⁰³Pd를 더 포함하는 것인, 분자.
제1항에 따른 분자의 합성 방법으로,
종양 세포를 표적화하는 대사물질의 작용화 단계로서, 상기 대사물질이 알킬 할라이드쇄와 반응하여, 이후 할라이드 또는 산 클로라이드로 전환되는 말단 작용기를 갖는 탄소 사슬에 연결되는 대사물질을 형성하는, 단계;
절단 가능한 링커의 작용화 단계로서, 말단 작용기를 갖는 2개의 단편이 절단될 수 있는 결합을 통해 연결되고, 제1 단편은 킬레이트화제에 대한 부착을 위해 하나의 말단에 알킬 할라이드를 함유하고, 제2 단편은 다른 말단에 보호 아민을 가지는, 단계;
킬레이트화제의 작용화 단계로서, 킬레이트화제가 먼저 링커로 단일-알킬화된 후, 대사물질로 두 번째로 알킬화되며, 매크로사이클의 나머지 아민이 금속 착화를 보조하는 아세테이트기와 반응하고, 이어서 말단 아민이 EPR 제제에 결합하기 위한 작용기로 전환되는, 단계를 포함하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제