EA026305B1 - Альфа-излучающие комплексы - Google Patents

Abstract

В изобретении предложен комплекс, обеспечивающий направленную доставку тория-227 к ткани, содержащий обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку, октадентатный гидроксипиридинон-содержащий лиганд и 4+ ион альфа-излучающего радионуклида тория-227. Кроме того, в изобретении предложено применение такого комплекса в лечении гиперпластического или неопластического заболевания, а также набор и фармацевтическая композиция, содержащая такой комплекс.

Description

Настоящее изобретение относится к комплексам ториевых изотопов и, в частности, к комплексам тория-227 с некоторыми октадентатными лигандами. Изобретение также относится к лечению заболевания, в частности неопластических заболеваний, включающего введение таких комплексов.

Предшествующий уровень техники

Специфический киллинг клеток может быть весьма важным для успешного лечения множества заболеваний у млекопитающих. Типичные примеры этого заключаются в лечении злокачественных заболеваний, таких как саркомы и карциномы. Однако селективное устранение некоторых типов клеток также может играть ключевую роль в лечении других заболеваний, особенно гиперпластических и неопластических заболеваний.

Наиболее распространенные способы селективного лечения в настоящее время представляют собой хирургию, химиотерапию и внешнее облучение. Однако нацеленная радионуклидная терапия является перспективной и развивающейся областью с возможностью доставки излучения с высоким цитотоксическим эффектом к нежелательным типам клеток. В настоящее время в наиболее распространенных формах радиофармацевтических средств, разрешенных для применения к людям, используют бетаизлучающие и/или гамма-излучающие радионуклиды. Существовал, однако, некоторый интерес к применению альфа-излучающих радионуклидов в терапии вследствие их потенциала в отношении более специфического киллинга клеток.

Диапазон излучения типичных альфа-излучателей в физиологической среде обычно составляет менее 100 мкм, что эквивалентно только лишь нескольким клеточным диаметрам. Это делает такие источники вполне подходящими для лечения опухолей, включая микрометастазы, поскольку, если их хорошо нацелить, то вне клеток-мишеней пройдет небольшое количество излученной энергии. Таким образом, можно минимизировать повреждение окружающей здоровой ткани (смотри Решепйедеп е! а1., КаФа! Кек 148: 195-201 (1997)). Наоборот, бета-частица имеет диапазон 1 мм или более в воде (смотри АПЬиг, ΑηΐίЬойу 1ттипосоп КайюрЬагт 4: 85-96 (1991)).

Энергия излучения альфа-частицы является высокой по сравнению с энергией, переносимой бетачастицами, гамма-лучами и рентгеновскими лучами, и обычно составляет 5-8 МэВ, или в 5-10 раз выше энергии бета-частицы и в 20 или более раз выше энергии гамма-луча. Таким образом, такое выделение большого количества энергии на очень коротком расстоянии дает α-излучению исключительно высокую линейную передачу энергии (ЬЕТ), высокую относительную биологическую эффективность (КВЕ) и низкий коэффициент кислородного усиления (ОЕК) по сравнению с гамма- и бета-излучением (см. На11, КайюЬю1оду Гот !йе гайю1од15!, ΡίΠΙι еййюп, Ырртсой Аййатк & ΑίΙΚίηδ, Рййайе1рЫа РА, И8А, 2000). Это объясняет исключительную цитотоксичность альфа-излучающих радионуклидов, а также налагает строгие требования на биологическое нацеливание таких изотопов и на уровень контроля за распределением альфа-излучающего радионуклида и его изучения, которое является необходимым, чтобы избежать неприемлемых побочных эффектов.

В табл. 1 ниже показаны физические свойства альфа-излучателей в отношении распада, до настоящего времени в общих чертах предлагаемых в литературе в качестве возможно обладающих терапевтической эффективностью.

Таблица 1

Кандидатный нуклид	Τι/2*	Клинически протестирован в отношении
225Ас	10,0 суток	лейкемии
211А1	7,2 часов	глиобластомы
213Βί	46 минут	лейкемии
223Ра	11,4 суток	скелетных метастазов
^Ра	3,66 суток	анкилозирующего спондилоартрита

* Период полураспада.

До настоящего времени основное внимание в отношении применения в радиоиммунотерапии было

211 213 225 сосредоточено на Α!, Βί и Ас, и эти три нуклида были проанализированы в клинических иммунотерапевтических исследованиях.

Некоторые из радионуклидов, которые были предложены, являются короткоживущими, то есть имеют периоды полураспада менее 12 ч. Такие короткие периоды полураспада делают трудным производство и распределение радиофармацевтических средств на основе этих радионуклидов в коммерческом смысле. Введение короткоживущего нуклида также увеличивает величину дозы излучения, которая будет выпущена в организме до достижения участка-мишени.

Энергия отдачи от альфа-излучения во многих случаях вызывает высвобождение дочерних нуклидов из места распада источника. Эта энергия отдачи является достаточной для отрыва многих дочерних

- 1 026305 ядер от химической среды, которая могла удержать источник, например, когда источник был в комплексе с лигандом, таким как хелатирующий агент. Это происходит даже в тех случаях, когда дочерний продукт является химически совместимым с тем же самым лигандом, то есть, когда способен быть в комплексе с ним. В равной степени, в тех случаях, когда дочерний нуклид представляет собой газ, в частности благородный газ, такой как радон, или является химически несовместимым с лигандом, этот эффект высвобождения будет еще больше. Когда дочерние нуклиды имеют периоды полураспада более нескольких секунд, они могут далеко распространяться в кровеносной системе, не удержанные комплексантом, который удерживает источник. Эти свободные радиоактивные дочерние продукты позже могут вызывать нежелательную системную токсичность.

Несколько лет назад предлагали применять торий-227 (Т_1/2 = 18,7 суток) в условиях, когда контролируют дочерний изотоп ²²³Ка (смотри №0 01/60417 и №0 02/05859). Это происходило в ситуациях, в которых используют систему с носителем, позволяющую дочерним нуклидам удерживаться замкнутой средой. В одном случае радионуклид помещают в липосому, и существенный размер липосомы (по сравнению с расстоянием отдачи) способствует удерживанию дочерних нуклидов в липосоме. Во втором случае используют остеотропные комплексы радионуклида, которые включают в костный матрикс и, таким образом, ограничивают высвобождение дочерних нуклидов. Это представляет собой потенциально исключительно выгодные способы, однако введение липосом является нежелательным в некоторых обстоятельствах, и существует много заболеваний мягкой ткани, в которой радионуклиды не могут быть окружены минерализованным матриксом, для того чтобы удерживать дочерние изотопы.

В последнее время было установлено, что токсичность дочерних ядер ²²³Ка, высвобождающихся при распаде ²²⁷Тй, могла бы быть допустимой в организме млекопитающего в гораздо большей степени, чем можно было бы предсказать из прежних испытаний на сравнимых ядрах. В отсутствие специфических средств удерживания радиевых дочерних продуктов тория-227, обсуждаемых выше, публично доступная информация, касающаяся токсичности радия, дала ясно понять, что невозможно применять торий-227 в качестве терапевтического агента, так как дозировки, требующиеся для достижения терапевтического эффекта от распада тория-227, могли приводить к очень токсичной и, возможно, летальной дозировке излучения вследствие распада радиевых дочерних продуктов, то есть отсутствует терапевтическое окно.

В №004/091668 сделано неожиданное открытие, что все-таки существует окно терапевтического лечения, в которое субъекту (обычно млекопитающему) можно ввести терапевтически эффективное количество нацеленного радионуклида тория-227 без генерирования количества радия-223, достаточного, чтобы вызывать неприемлемую миелотоксичность. Следовательно, его можно применять для лечения и профилактики всех типов заболеваний как в костях, так и в участках мягкой ткани.

На основании вышеизложенных разработок в настоящее время является возможным использование альфа-излучающих ядер тория-227 в эндорадионуклидной терапии без летальной миелотоксичности, получаемой от генерированного ²²³Ка. Несмотря на это, терапевтическое окно остается относительно узким, и во всех случаях является желательным введение субъекту альфа-излучающего радиоизотопа не больше, чем это абсолютно необходимо. Поэтому полезное использование этого нового терапевтического окна можно было бы значительно улучшить, если бы альфа-излучающие ядра тория-227 можно было бы поместить в комплекс и нацелить с высокой степенью надежности.

Поскольку радионуклиды постоянно распадаются, время, которое тратится на работу с веществом от выделения до введения субъекту, имеет большое значение. Также имело бы большое значение, если бы альфа-излучающие ядра тория можно было бы поместить в комплекс, нацелить и/или вводить в форме, которая была бы быстрой и удобной в приготовлении, предпочтительно требующей нескольких стадий, коротких периодов инкубации и/или температур, не влияющих необратимо на свойства обеспечивающего направленную доставку (нацеливающего) объекта.

Авторы настоящего изобретения неожиданно установили, что применение 4+ иона тория-227 в комплексе с октадентатным лигандом гидроксипиридинонового (НОРО) типа, связанным с обеспечивающей направленную доставку группировкой, обеспечивает замечательную степень контроля над ионом тория-227. Кроме того, такие комплексы можно получать относительно быстро и/или легко, используя способы, описанные в данном описании изобретения.

- 2 026305

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте изобретения предложен комплекс, обеспечивающий направленную доставку тория-227 к ткани, содержащий обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку, выбранную из антител, конструкций антител, фрагментов антител, конструкций фрагментов или их смеси, пептида, аминокислоты, стероидного или нестероидного гормона, фолата, эстрогена, тестостерона или биотина;

октадентатный гидроксипиридинон-содержащий лиганд формулы VI или VII

связывающую группировку, посредством которой указанный октадентатный гидроксипиридинонсодержащий лиганд соединен с указанной группировкой, обеспечивающей направленную доставку к ткани, которая выбрана из

и 4+ ион альфа-излучающего радионуклида тория-227.

В другом аспекте изобретения предложено применение указанного выше комплекса в изготовлении лекарственного средства для лечения гиперпластического или неопластического заболевания. Предпочтительно указанное заболевание представляет собой карциному, саркому, миелому, лейкемию, лимфому или раковое заболевание смешанного типа.

В еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанный комплекс вместе по меньшей мере с одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.

В еще одном аспекте изобретения предложен набор для использования в способе лечения организма человека или животного, не являющегося человеком, который содержит обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку, выбранную из антител, конструкций антител, фрагментов антител, конструкций фрагментов или их смеси, пептида, аминокислоты, стероидного или нестероидного гормона, фолата, эстрогена, тестостерона или биотина, конъюгированную при помощи связывающей группировки с октадентатным гидроксипиридинон-содержащим лигандом формулы VI или VII

- 3 026305 где связывающая группировка выбрана из

и 4+ ион альфа-излучающего радионуклид тория-227.

В еще одном аспекте изобретения предложено применение указанного комплекса, обеспечивающего направленную доставку тория-227 к ткани в лечении гиперпластического или неопластического заболевания. Предпочтительно указанное заболевание представляет собой карциному, саркому, миелому, лейкемию, лимфому или раковое заболевание смешанного типа.

Для того чтобы отличить от ториевых комплексов наиболее распространенного в природе изотопа тория, то есть тория-232 (период полураспада 10¹⁰ лет и фактически нерадиоактивен), следует понимать, что ториевые комплексы и их композиции, заявленные в данном изобретении, содержат альфаизлучающий ториевый радиоизотоп (то есть по меньшей мере один изотоп тория с периодом полураспада менее 10³ лет, например торий-227) с большей относительной распространенностью, чем у природного, например по меньшей мере на 20% больше. Это не должно касаться определения способа по изобретению, где однозначно требуется терапевтически эффективное количество радиоактивного тория, такого как торий-227, но предпочтительно будет иметь место во всех аспектах.

Подробное описание изобретения

В контексте настоящего изобретения термин обеспечивающий(ая) направленную доставку к ткани используют в данном описании изобретения для указания на то, что вещество, о котором идет речь (в частности, в форме конъюгата с ториевым комплексом), служит для локализации самого себя (и особенно для локализации любого конъюгированного ториевого комплекса) предпочтительно по меньшей мере на одном участке ткани, на котором его присутствие является желательным (например, для доставки радиоактивного распада). Обеспечивающую направленную доставку группировку можно, например, связать с маркерами клеточной поверхности (например, рецепторами, транспортными белками, молекулами клеточной адгезии и так далее), присутствующими на пораженных заболеванием клетках или на клетках, расположенных вблизи от пораженных заболеванием клеток. Такие маркеры клеточной поверхности включают белки, более интенсивно экспрессируемые на поверхностях заболевших клеток, чем на поверхностях здоровых клеток, или белки, более интенсивно экспрессируемые на поверхностях клеток во время периодов роста или репликации, чем в фазах покоя. Компоненты, присутствующие вблизи от клеток-мишеней или тканей-мишеней, или ассоциированные с ними, также можно использовать в мишени для терапии в соответствии с любым аспектом изобретения. Например, компоненты, присутствующие в матриксе вокруг клеток-мишеней или тканей-мишеней или высвобождающиеся в него, можно использовать для нацеливания, если присутствие, форма или концентрация позволяют области отличаться от здоровой ткани. Примерами этого являются матриксные антигены, такие как тенасцин, который ассоциирован с опухолями головного мозга, но экспрессируется в матриксе между клетками. На такие матриксные антигены можно нацелить с помощью одиночной или составной обеспечивающей направленную доставку группировки, как обсуждается в данном описании изобретения.

Обеспечивающая направленную доставку к ткани группировка также может содержать два или более компонентов, коллективно обладающих эффектом обеспечения доставки ториевого комплекса к желаемой(ым) ткани(ям). Это может быть, например, когда один компонент вводят первым и связывают с конкретной тканью, опухолью или типом клеток (связывающийся с тканью агент), а второй и/или дополнительный компонент (связывающий агент) вводят одновременно или предпочтительно последовательно, который связывается ιη νίνο со связывающимся с тканью агентом. Связывающий агент можно конъюгировать непосредственно или опосредованно с комплексным альфа-излучающим торием и, таким образом, связывающийся с тканью и связывающий агенты коллективно могут образовать обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку. Подходящие конкретные связывающие пары, подходящие для обеспечения связывающегося с тканью агента и связывающего агента с взаимным сродством, хорошо известны в данной области техники (например, биотин с авидином или стрептавидином).

Различные аспекты изобретения, как описано в данном описании изобретения, относятся к лечению заболевания, в частности для избирательного нацеливания на заболевшую ткань, а также к комплексам, конъюгатам, лекарственным средствам, композиции, наборам и так далее, полезным в таких способах. Заболевшая ткань во всех аспектах может находиться в одном участке организма (например, в случае локализованной солидной опухоли) или может находиться во множестве участков (например, когда не- 4 026305 сколько суставов поражено артритом или в случае распространившегося или метастазированного ракового заболевания).

Заболевшая ткань, подлежащая нацеливанию, может находиться в участке мягкой ткани, в участке кальцифицированной ткани или во множестве участков, которые могут находиться все в мягкой ткани, все в кальцифицированной ткани или могут включать по меньшей мере один участок мягкой ткани и/или по меньшей мере один участок кальцифицированной ткани. В одном воплощении нацеливают по меньшей мере один участок мягкой ткани. Участки нацеливания и участки происхождения заболевания могут быть одними и теми же, но альтернативно могут быть разными. Когда вовлечено более одного участка, он может включать участок происхождения или может представлять собой множество вторичных участков.

Термин мягкая ткань используют в данном описании изобретения для указания тканей, которые не имеют твердого минерализованного матрикса. В частности, мягкие ткани при использовании в данном описании изобретения могут представлять собой любые ткани, которые не являются скелетными тканями. Соответственно заболевание мягкой ткани при использовании в данном описании изобретения означает заболевание, имеющее место в мягкой ткани, используемой в данном описании изобретения. В частности, изобретение является подходящим для лечения раковых заболеваний, и заболевание мягкой ткани, таким образом, охватывает карциномы, саркомы, миеломы, лейкемии, лимфомы и раковые заболевания смешанного типа, имеющее место в любой мягкой (то есть неминерализованной) ткани, а также другие нераковые заболевания такой ткани. Раковое заболевание мягкой ткани включает солидные опухоли, имеющее место в мягких тканях, а также метастатические и микрометастатические опухоли. Конечно же, заболевание мягкой ткани может включать первичную солидную опухоль мягкой ткани и по меньшей мере одну метастатическую опухоль мягкой ткани у одного и того же пациента. Альтернативно, заболевание мягкой ткани может состоять только из солидной опухоли или только метастазов с первичной опухолью, представляющей собой скелетное заболевание.

Новые ключевые данные заключаются в том, что некоторые альфа-радиоактивные изотопы тория (например, ²²⁷ТЬ) можно вводить в количестве, которое является терапевтически эффективным и не порождает недопустимую миелотоксичность. При использовании в данном описании изобретения термин приемлемо немиелотоксичный используют для указания на то, что, наиболее важно, количество радия223, генерированного вследствие распада введенного радиоизотопа тория-227, обычно является недостаточным, чтобы стать непосредственно летальным для субъекта. Однако специалисту в данной области техники будет ясно, что степень повреждения костного мозга (и вероятность летальной реакции), которая будет являться допустимым побочным эффектом такого лечения, значительно варьируется в зависимости от типа заболевания, подлежащего лечению, целей схемы лечения и прогноза для субъекта. Хотя предпочтительными субъектами по настоящему изобретению являются люди, другие млекопитающие, в частности собаки, будут получать пользу от применения изобретения, и уровень приемлемого повреждения костного мозга также может отражать виды субъекта. Приемлемый уровень повреждения костного мозга обычно больше при лечении злокачественного заболевания, чем для незлокачественного заболевания. Одним хорошо известным способом измерения уровня миелотоксичности является подсчет нейтрофильных клеток, и приемлемо немиелотоксичное количество ²²³Ка в настоящем изобретении обычно представляет собой количество, контролируемое таким образом, чтобы нейтрофильная фракция в своей самой низкой точке (надир) составляла не менее 10% подсчета перед лечением. Предпочтительно приемлемо немиелотоксичное количество ²²³Ка представляет собой такое количество, чтобы фракция нейтрофильных клеток составляла по меньшей мере 20% в надире и более предпочтительно по меньшей мере 30%. Надирная фракция нейтрофильных клеток по меньшей мере 40% является наиболее предпочтительной.

Кроме того, содержащие радиоактивный торий (например, ²²⁷ТЬ) соединения можно использовать в схемах с высокой дозировкой, где миелотоксичность генерированного радия (например, ²²³Ка) обычно будет недопустимой, когда включают поддержку стволовыми клетками или сопоставимый способ извлечения. В таких случаях число нейтрофильных клеток можно уменьшить до ниже 10% в надире, а в особых случаях можно понизить до 5% или, если необходимо, ниже 5%, при условии, что выполнены подходящие меры предосторожности и сделана последующая поддержка стволовыми клетками. Такие методики хорошо известны в данной области техники.

Особенно интересный изотоп тория в настоящем изобретении представляет собой торий-227, и торий-227 является предпочтительным изотопом для всех ссылок на торий в данном описании изобретения, где допускает контекст. Торий-227 является относительно легким в производстве и может быть получен непосредственно из облученного нейтронами ²²⁶Ка, который будет содержать материнский нуклид ²²⁷ТЬ, то есть ²²⁷Ас (Т_1/2 = 22 года). Актиний-227 можно довольно легко отделить от ²²⁶Ка-мишени и использовать в качестве генератора для ²²⁷ТК Этот способ, если необходимо, можно масштабировать до промышленного масштаба; поэтому можно избежать проблем с поставкой, испытываемых с большей частью других альфа-излучателей, рассматриваемых в качестве кандидатов для молекулярной нацеленной радиотерапии.

Торий-227 распадается через радий-223. В этом случае первичный дочерний продукт имеет период

- 5 026305 полураспада 11,4 суток. Из источника чистого ²²⁷ТЪ в течение первых нескольких суток получается только умеренное количество радия. Однако, потенциальная токсичность Ка выше, чем ТЪ, так как эмиссия альфа-частицы из ²²³Ка сопровождается в течение минут тремя дополнительными альфа-частицами от короткоживущих дочерних продуктов (смотри табл. 2 ниже, в которой представлены последовательности распада для тория-227).

Таблица 2

Нуклид	Тип распада	Средняя энергия частицы (МэВ)	Период полураспада
227Τή	а	6,02	18,72 суток
222Ра	а	5,78	11,43 суток
219Кп	а	6,88	3,96 секунд
216р0	а	7,53	1,78 миллисекунд
211РЬ	β	0,45	36,1 минуты
211Βί	а	6,67	2,17 минуты
207ΤΙ	β	1,42	4,77 минуты
2°7РЬ			стабильный

Отчасти потому, что он порождает потенциально опасные продукты распада, торий-227 (Т_1/2 = 18,7 суток) не был широко обсуждаемым для терапии альфа-частицами.

Торий-227 можно вводить в количествах, достаточных для обеспечения желаемых терапевтических эффектов без генерирования радия-223 в такой степени, которая вызывает недопустимое подавление костного мозга. Является желательным сохранение дочерних изотопов в нацеленной области для того, чтобы от их распада можно было получить дополнительные терапевтические эффекты. Однако сохранение контроля над продуктами распада тория с целью получения полезного терапевтического эффекта без индуцирования неприемлемой миелотоксичности не является необходимым.

Полагая, что эффект киллинга опухолевых клеток обусловлен, главным образом, торием-227, а не его дочерними продуктами, подходящую терапевтическую дозу этого изотопа можно установить путем сравнения с другими альфа-излучателями. Например, для астата-211 терапевтические дозы для животных обычно составляли 2-10 МБк на 1 кг. С корректировкой на период полураспада и энергию, соответствующая доза для тория-227 могла бы составить по меньшей мере 36-200 кБк на 1 кг массы тела. Ее можно бы присвоить нижнему пределу для количества ²²⁷ТЪ, которое можно с пользой ввести в ожидании терапевтического эффекта. Это вычисление допускает сравнимое сохранение астата и тория. Однако понятно, что 18,7-суточный период полураспада тория наиболее вероятно приведет к большему устранению этого изотопа до его распада. Поэтому эту рассчитанную дозировку обычно следует считать как представляющую минимально эффективное количество. Терапевтическая доза, выраженная, исходя из полностью сохранившегося ²²⁷ТЪ (то есть ²²⁷ТЪ, который не выводится из организма), обычно составляет по меньшей мере 18 или 25 кБк/кг, предпочтительно по меньшей мере 36 кБк/кг и более предпочтительно по меньшей мере 75 кБк/кг, например 100 кБк/кг или более. Следует ожидать, что большие количества тория будут иметь больший терапевтический эффект, но не смогут быть введены, если будут иметь результатом недопустимые побочные эффекты. В равной степени, если торий вводят в форме, имеющей короткий биологический период полураспада (то есть период полураспада до устранения из организма, по-прежнему содержащего торий), то большие количества радиоизотопа потребуются для терапевтического эффекта, так как большая часть тория будет выводиться до его распада. Однако будет иметь место соответствующее уменьшение количества генерированного радия-223. Указанные выше количества тория-227, подлежащего введению, когда изотоп полностью сохраняется, можно легко соотнести с эквивалентными дозами с более короткими биологическими периодами полураспада. Такие вычисления хорошо известны в данной области техники и представлены в \УО 04/091668 (например, в тексте в примерах 1 и 2).

Если меченное радиоактивным изотопом соединение приводит к высвобождению дочерних нуклидов, важно знать о судьбе, если применимо, любого(ых) радиоактивного(ых) дочернего(их) нуклида(ов).

227 223

По отношению к ТЪ, главный дочерний продукт представляет собой Ка, который находится под клинической оценкой вследствие его остеотропных свойств. Радий-223 очень быстро выводится из крови и либо концентрируется в костной системе, либо экскретируется посредством кишечных и почечных путей (смотри Башей, 1 Ыис1 Меб 43 (5, §ирр1етей): 160Р (2002)). По этой причине радий-223, высвобожденный ίη νίνο из ²²⁷ТЪ, может не оказывать воздействия на здоровую мягкую ткань в большой степени. В исследовании распределения ²²⁷ТЪ в виде растворенной цитратной соли (Ми11ет, Ιηΐ. 1. КаШаТ Βίο1. 20: 233-243 (1971)), было обнаружено, что Ка, генерированный из ТЪ в мягких тканях, быстро перераспространялся в кость или экскретировался. Таким образом, известная токсичность альфа-излучающего

- 6 026305 радия, в частности, в костном мозге является проблемой при определении дозировок тория.

В ^004/091668 впервые было установлено, что фактически людям можно вводить дозу по меньшей мере 200 кБк/кг ²²³Ка, и она будет переносима ими. Эти данные представлены в той публикации. Следовательно, можно увидеть, что, довольно неожиданно, все-таки существует терапевтическое окно, в которое млекопитающему можно ввести терапевтически эффективное количество ²²⁷ТЬ (такое как более 36 кБк/кг) без ожидания, что такой субъект будет страдать от неприемлемого риска серьезной или даже летальной миелотоксичности. Несмотря на это, чрезвычайно важно найти лучшее применение этому терапевтическому окну; поэтому является важным, что радиоактивный торий быстро и эффективно закомплексовывают и сохраняют с очень высоким сродством для того, чтобы доставить к целевому участку наибольшую возможную часть дозы.

223 227

Количество Ка, генерированного из фармацевтического ТЬ, будет зависеть от биологического периода полураспада меченного радиоактивным изотопом соединения. Идеальной ситуацией следует считать применение комплекса с быстрым поглощением опухолью, включая интернализацию в опухолевой клетке, значительное сохранение опухолью и короткий биологический период полураспада в нормальных тканях. Однако комплексы с менее идеальным биологическим периодом полураспада могут быть полезны до тех пор, пока доза ²²³Ка сохраняется на допустимом уровне. Количество радия-223, генерированного ίη νίνο, представляет собой фактор количества вводимого тория и времени биологического сохранения ториевого комплекса. Количество генерированного радия-223 в любом конкретном случае может легко рассчитать специалист. Максимальное вводимое количество ²²⁷ТЬ определяется количеством радия, генерированного ίη νίνο, и должно быть меньше количества, которое приводит к недопустимому уровню побочных эффектов, в частности миелотоксичности. Это количество обычно составляет меньше 300 кБк/кг, в частности меньше 200 кБк/кг и более предпочтительно меньше 170 кБк/кг (например, меньше 130 кБк/кг). Минимально эффективная доза определяется цитотоксичностью тория, чувствительностью заболевшей ткани к генерированному альфа-облучению и степенью, с которой торий эффективно комбинируют, сохраняют и доставляют обеспечивающим направленную доставку комплексом (представляющим собой в этом случае комбинацию лиганда и обеспечивающей направленную доставку группировки).

В соответствии с желанием ториевый комплекс в способе по изобретению вводят с дозой тория-227 от 18 до 400 кБк/кг массы тела, предпочтительно от 36 до 200 кБк/кг (такой как от 50 до 200 кБк/кг), более предпочтительно от 75 до 170 кБк/кг, в частности от 100 до 130 кБк/кг. Соответственно одиночная доза может содержать приблизительно любой из этих диапазонов, умноженных на подходящую массу тела, такую как от 30 до 150 кг, предпочтительно от 40 до 100 кг (например, диапазон от 540 до 4000 кБк на дозу и так далее). Кроме того, в соответствии с желанием доза тория, комплексообразующий агент и путь введения будут такими, чтобы доза радия-223, генерированного ίη νίνο, составила менее 300 кБк/кг, более предпочтительно менее 200 кБк/кг, еще более предпочтительно менее 150 кБк/кг, особенно менее 100 кБк/кг. Это также приведет к воздействию ²²³Ка, показанному путем умножения этих диапазонов на любую из указанных масс тела. Указанные выше уровни доз предпочтительно представляют собой полностью сохранившуюся дозу ²²⁷ТЬ, но могут представлять собой вводимую дозу, принимая во внимание, что некоторая часть ²²⁷ТЬ будет выведена из организма до его распада.

В тех случаях, когда биологический период полураспада комплекса ^227ТЬ является коротким по сравнению с физическим периодом полураспада (например, меньше 7 суток, особенно меньше 3 суток), могут потребоваться значительно большие вводимые дозы для получения эквивалентной сохранившейся дозы. Таким образом, например, полностью сохранившаяся доза 150 кБк/кг является эквивалентной комплексу с периодом полураспада 5 суток, вводимому с дозой 711 кБк/кг. Эквивалентную вводимую дозу для любых соответствующих сохранившихся доз можно рассчитать из скорости биологического клиренса комплекса с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.

Так как распад одного ядра ²²⁷ТЬ дает один атом ²²³Ка, сохранение и терапевтическая активность

227 223

ТЬ будут непосредственно связаны с дозой Ка, полученной пациентом. Количество генерированного ²²³Ка в любой конкретной ситуации можно рассчитать с использованием хорошо известных способов.

По этой причине в предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания у млекопитающего (как описано в данном описании изобретения), включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата, содержащего обеспечивающую направленную доставку группировку, октадентатный лиганд (особенно любой из описанных в данном описании изобретения) и радиоактивный изотоп тория (например, торий-227).

Очевидно, что желательно минимизировать воздействие на субъекта Ка дочернего изотопа, если его свойства не используются с пользой. В частности, количество радия-223, генерированного ίη νίνο, обычно составляет более 40 кБк/кг, например более 60 кБк/кг. В некоторых случаях будет необходимо количество ²²³Ка, генерированного ίη νίνο, более 80 кБк/кг, например более 100 или 115 кБк/кг.

Конъюгаты, меченные торием-227, в подходящих растворах носителя можно вводить внутривенно, внутриполостным путем (например, внутрибрюшинно), подкожно, перорально или местно в виде одного применения или в режиме фракционированного применения. Предпочтительно комплексы, конъюгированные с обеспечивающей направленную доставку группировкой, вводят в виде растворов парентераль- 7 026305 ным (например, чрескожным) путем, особенно внутривенным или внутриполостным путем. Предпочтительно композиции по настоящему изобретению приготавливают в стерильном растворе для парентерального введения.

Торий-227 в способах и продуктах по настоящему изобретению можно применять в отдельности или в комбинации с другими способами лечения, включая хирургию, лечение внешним облучением, химиотерапию, другие радионуклиды или регулирование температуры ткани и так далее. Это образует еще одно предпочтительное воплощение способа по изобретению, и композиции/лекарственные средства могут соответственно содержать по меньшей мере один дополнительный терапевтически активный агент, такой как другой радиоактивный агент или химиотерапевтический агент.

В одном особенно предпочтительном воплощении субъект также подвергают лечению стволовыми клетками и/или другой поддерживающей терапии для ослабления последствий миелотоксичности, индуцированной радием-223.

Согласно данному изобретению ²²⁷Тй может быть комплексным посредством комплексообразующих агентов, обеспечивающих направленную доставку. Обычно обеспечивающие направленную доставку группировки имеют молекулярную массу от 100 г/моль до нескольких миллионов г/моль (в частности, от 100 г/моль до 1 млн г/моль) и предпочтительно имеют сродство к любому рецептору, непосредственно связанному с заболеванием, и/или содержат подходящее предварительно введенное связующее (например, биотин или авидин), связанное с молекулой, которая была нацелена на заболевание до введения ²²⁷Тй. Подходящие обеспечивающие направленную доставку группировки включают поли- и олигопептиды, белки, фрагменты ДНК и РНК, аптамеры и так далее, предпочтительно белок, например авидин, стрептавидин, поликлональное или моноклональное антитело (включая 1дС и 1дМ-типа антитела) или смесь белков либо фрагментов, либо конструкций белка. Антитела, конструкции антител, фрагменты антител (например, РАВ (участок связывания антигена)-фрагменты или любой фрагмент, содержащий по меньшей мере одну антиген-связывающую(ие) область(и)), конструкции фрагментов (например, одноцепочечные антитела) или их смесь являются особенно предпочтительными.

Также подходящими для использования в настоящем изобретении являются терапевтические конъюгаты комплексного ²²⁷Тй с пептидом, аминокислотой, стероидным или нестероидным гормоном, фолатом, эстрогеном, тестостероном, биотином или другими соединениями специфического связывания с молекулярной массой обычно ниже 10000 г/моль.

Обычно октадентатный лиганд конъюгируют непосредственно или опосредованно (например, посредством линкерной группировки) с обеспечивающей направленную доставку группировкой. Обычные конструкции этого типа, то есть активный (например, терапевтически или диагностически активный) металл - комплексообразующая группировка - возможная линкерная группировка - обеспечивающая направленную доставку группировка, хорошо известны в областях радиофармацевтических средств, обеспечивающих направленную доставку, и визуализирующих агентов, обеспечивающих направленную доставку. Однако работы, оценивающие пригодность различных лигандов для специфического использования с ионами тория 4+, отсутствуют или их мало. В этом отношении можно сделать ссылку, например, на НапбЪоок о£ Татде1еб Эсйусгу о£ Ппащпд Адспй. Еб. ТотсЫНи, СКС Рте88, 1995.

Ранее известные хелаторы для тория включают полиаминополикислотные хелаторы, которые содержат линейный, циклический или разветвленный полиазаалкановый каркас с кислотными (например, карбоксиалкильными) группами, присоединенными к атомам азота в каркасе. Примеры таких хелаторов включают производные ЭОТА (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты), такие как пара-изотиоцианатобензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (п-8СЫВ/-ЭОТА) и производные ЭТРА (диэтилентриаминпентауксусной кислоты), такие как параизотиоцианатобензил-диэтилентриаминпентауксусная кислота (п-§СП-В7-0ТРА), где первые являются циклическими хелаторами, а последние - линейными хелаторами.

Производные 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты ранее приводили в качестве примеров, однако в отношении хелатирования тория производными ЭОТА стандартные способы легко применить нельзя. Нагревание производного ЭОТА с металлом фактически приводит к хелату, но часто с низкими выходами. По меньшей мере для части лиганда имеет место тенденция необратимо денатурировать во время осуществления процесса. Кроме того, обычно необходимо избегать присоединения обеспечивающей направленную доставку группировки до завершения всех стадий нагрева вследствие ее относительно высокой чувствительности к необратимой денатурации. Это приводит к дополнительной химической стадии (вместе со всей необходимой обработкой и разделением), которую необходимо проводить во время распада альфа-излучающего изотопа тория. Очевидно, что предпочтительно не обрабатывать альфа-излучающий материал этим способом, либо не образовывать соответствующие отходы в большей степени, чем это необходимо. Кроме того, во время проведения получения конъюгата тратится часть тория, который будет распадаться в течение этого подготовительного периода.

Предпочтительно, чтобы комплексы альфа-излучающего тория и октадентатного лиганда во всех аспектах настоящего изобретения образовывались или были способны к образованию без нагревания выше 60°С (например, без нагревания выше 50°С), предпочтительно без нагревания выше 38°С, и наиболее предпочтительно без нагревания выше 25°С.

- 8 026305

Кроме того, предпочтительно получать конъюгат обеспечивающей направленную доставку группировки и октадентатного лиганда перед добавлением альфа-излучающего изотопа тория (например, иона ²²⁷ТИ⁴⁺). Таким образом, предпочтительно, чтобы продукты по изобретению образовывались или были способны к образованию вследствие комплексообразования альфа-излучающего изотопа тория (например, иона ²²⁷ТИ⁴⁺) конъюгатом октадентатного лиганда и обеспечивающей направленную доставку к ткани группировки.

Хелаторы могут представлять собой нефосфонатные молекулы, и в одном воплощении настоящего изобретения ²²⁷ТИ не присоединяют ни к какой фосфонатной или другой обеспечивающей направленную доставку к кости группе, и его не вводят с такими веществами.

Типы обеспечивающих направленную доставку соединений, которые можно связать с торием (например, торием-227) посредством октадентатного хелатора (содержащего связывающую группировку, как описано в данном описании изобретения). Обеспечивающую направленную доставку группировку можно выбрать из известных обеспечивающих направленную доставку групп, которые включают моноклональные или поликлональные антитела, факторы роста, пептиды, гормоны и аналоги гормонов, фолат и производные фолата, биотин, авидин и стрептавидин или их аналоги. Другие возможные носители могут представлять собой РНК, ДНК или их фрагменты, олигонуклеотиды, углеводы, липиды или соединения, полученные путем объединения таких групп с белками или без белков, и так далее.

Обеспечивающая направленную доставку к ткани группировка может, в одном воплощении, исключать остеотропные вещества, липосомы и конъюгированные с фолатом антитела или фрагменты антител. Альтернативно, такие группировки могут быть включены.

Меченные торием (например, торием-227) молекулы по изобретению можно применять для лечения раковых или нераковых заболеваний путем нацеливания связанных с заболеванием рецепторов. Обычно

227 227 такое медицинское применение Ти представляется радиоиммунотерапией на основе связывания Ти хелатором с антителом, фрагментом антитела или конструкцией антитела или фрагментов антител для лечения раковых или нераковых заболеваний. Применение ²²⁷ТИ в способах и фармацевтических средствах согласно настоящему изобретению является особенно подходящим для лечения любой формы рака, включая карциномы, саркомы, лимфомы и лейкемии, особенно рака легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, почки, желудка, поджелудочной железы, пищевода, головного мозга, яичника, матки, рака полости рта, колоректального рака, меланомы, множественной миеломы и неходжкинской лимфомы.

223 227

Количество высвобожденного Ка можно уменьшить, если ТИ-несущая молекула будет иметь короткий период биологического полусохранения ίη νίνο, так как радионуклид будет, главным образом,

227 223 227 устраняться до распада большей части ТИ до Ка. Количество ТИ, однако, будет нуждаться в увеличении для того, чтобы сохраняться терапевтически эффективным в соответствии с настоящим изобретением. Если комплексообразующий агент выбран таким образом, чтобы доставлять ²²⁷ТИ во внутреннюю часть нацеленных клеток, то это, кроме того, приведет к увеличению специфической цитотоксичности и уменьшению системного токсического эффекта радиоактивных дочерних продуктов вследствие, по меньшей мере, частичного сохранения дочерних изотопов на участке опухоли. Оба эти свойства расширяют терапевтическое окно ²²⁷ТИ и, таким образом, образуют предпочтительные воплощения изобретения.

В еще одном воплощении изобретения пациенты как с заболеванием мягкой ткани, так и со скелет227 223 ным заболеванием можно лечить как ТИ, так и Ка, генерированным ίη νίνο путем введения тория. В этом особенно предпочтительном аспекте дополнительный терапевтический компонент лечения получают из приемлемо немиелотоксичного количества ²²³Ка путем нацеливания скелетного заболевания. В этом терапевтическом способе ²²⁷ТИ обычно используют для лечения первичного и/или метастатического ракового заболевания мягкой ткани путем подходящего нацеливания, а ²²³Ка, генерированный вследствие распада ²²⁷ТИ, используют для лечения родственного скелетного заболевания у того же субъекта. Это скелетное заболевание может представлять собой метастазы в костную систему, полученные в результате первичного рака мягкой ткани, или может представлять собой первичное заболевание, где лечение мягкой ткани должно противодействовать метастатическому раку. Иногда заболевания мягкой ткани и скелетные заболевания могут быть неродственными (например, дополнительное лечение скелетного заболевания у пациента с ревматологическим заболеванием мягкой ткани).

- 9 026305

Ключевым аспектом настоящего изобретения во всех отношениях является применение октадентатного лиганда, в частности октадентатного гидроксипиридинон-содержащего лиганда формулы VI или VII

Подходящие хелатирующие группировки могут быть образованы способами, известными в данной области техники, включая способы, описанные в И8 5624901 (например, в примерах 1 и 2) и ΑΘ2008/063721 (которые включены в данное описание изобретения посредством сылки).

При использовании в данном описании изобретения термин линкерная группировка (К_ъ в формуле II) применяют для краткого обозначения химической структуры, которая служит для присоединения по меньшей мере двух хелатирующих групп в октадентатных лигандах, которые образуют ключевой компонент в разных аспектах изобретения. Обычно каждая хелатирующая группа является бидентатной, поэтому в лиганде обычно присутствует четыре хелатирующие группы. Такие хелатирующие группы соединены друг с другом посредством их линкерных группировок. Таким образом, линкерная группировка (например, группа К_ъ ниже) может быть общей для более чем одной хелатирующей группы. Линкерные группировки также могут служить в качестве точки прикрепления между комплексообразующей частью октадентатного лиганда и обеспечивающей направленную доставку группировкой. В этом случае по меньшей мере одна линкерная группировка соединена со связывающей группировкой (К_с). Подходящие линкерные группировки включают короткие гидрокарбильные группы, такие как С1-С12гидрокарбил, включая С1-С12 алкильную, алкенильную или алкинильную группу, в том числе метильную, этильную, пропильные, бутильные, пентильные и/или гексильные группы всех конфигураций.

Линкерные группировки также могут представлять собой или содержать любые другие подходящие устойчивые химические звенья, в том числе сложноэфирные, простые эфирные, аминные и/или амидные группы. Чтобы удержать хелатирующие группировки в расположении, подходящем для образования комплекса, общее количество атомов, соединяющих две хелатирующих группировки (подсчет по самому короткому пути, если существует более одного пути) обычно ограничено. Поэтому линкерные группировки обычно выбраны таким образом, чтобы получить не более 15 атомов между хелатирующими группировками, предпочтительно от 1 до 12 атомов и более предпочтительно от 1 до 10 атомов между хелатирующими группировками. Когда линкерная группировка непосредственно соединяет две хелатирующие группировки, тогда линкер обычно имеет от 1 до 12 атомов в длину, предпочтительно от 2 до 10 (например, этил, пропил, н-бутил и так далее). Когда линкерная группировка соединена с центральным темплатом (смотри ниже), тогда каждый линкер может короче с двумя отдельными линкерами, соединяющими хелатирующие группировки. В этом случае предпочтительной может быть длина линкера от 1 до 8 атомов, предпочтительно от 1 до 6 атомов (где метил, этил и пропил являются подходящими, так как представляют собой группы, такие как те, которые имеют сложноэфирное, простое эфирное или амидное звено на одном конце или на обоих).

Кроме линкерной группировки, которая в основном служит для связывания разных хелатирующих групп октадентатного лиганда друг с другом и/или с центральным темплатом, октадентат предпочтительно дополнительно содержит связывающую группировку (К_с). Функция связывающей группировки заключается в связывании октадентатного лиганда с обеспечивающей направленную доставку группировкой. Этого можно достичь путем или ковалентного, или нековалентного присоединения (например, с помощью пары для специфического связывания, такой как биотин/авидин (стрептавидин)). Предпочтительно связывающие группировки ковалентно связаны с хелатирующими группами или путем непосредственного ковалентного присоединения к одной из хелатирующих групп или, более типично, путем присоединения к линкерной группировке или темплату. Следует использовать две или более связывающие группировки, где каждую можно присоединить к любому из доступных участков, например, на любом темплате, линкере или хелатирующей группе.

- 10 026305

В одном воплощении связывающая группировка может иметь структуру, выбранную из

Связывающая группировка предпочтительно присоединена для того, чтобы полученный связанный октадентатный лиганд можно было подвергнуть образованию стабильных комплексов иона металла. Таким образом, связывающая группировка предпочтительно связана с линкером, темплатом или хелатирующей группировкой в участке, который в значительной степени не препятствует комплексообразованию. Такой участок предпочтительно находится на линкере или темплате, более предпочтительно в положении, отдаленном от поверхности связывания с мишенью.

Предпочтительные хелатирующие группы включают группы формулы II

В приведенной выше формуле II группировка =0 представляет собой кето-группу, присоединенную к любому углероду пиридинового кольца, -ОН представляет собой гидроксильную группировку, присоединенную к любому атому пиридинового кольца, и -К_ъ представляет собой линкерную группировку, которая присоединяет гидроксипиридиноновую группировку к другим комплексообразующим группировкам для образования конечного октадентатного лиганда. Любая линкерная группировка, описанная в данном описании изобретения, является подходящей в качестве К_ъ, включая короткие гидрокарбильные группы, такие как С1-С8-гидрокарбил, включая С1-С8 алкильную, алкенильную или алкинильную группу, в том числе метильную, этильную, пропильные, бутильные, пентильные и/или гексильные группы всех конфигураций. К_ъ может присоединять кольцо формулы II по любому атому пиридинового кольца, такому как атом углерода или азота. Группы К_ъ, в свою очередь, могут связываться непосредственно с другой хелатирующей группировкой, с другой линкерной группой и/или с центральным атомом или группой, такой как кольцо или другой темплат (как описано в данном описании изобретения). Линкеры, хелатирующие группы и возможные темплатные группировки выбраны таким образом, чтобы образовать подходящий октадентатный лиганд.

В одном предпочтительном воплощении группировки -ОН и =0 в формуле II находятся на соседних атомах пиридинового кольца, так что очень подходящими являются все из 1,2-; 2,3-; 3,2-; 4,3- и 3,4гидроксипиридиноновых производных.

В тех случаях, когда группа ОН или линкерная группировка К_ъ находятся на азоте пиридинового кольца, группа Κ_Ν обычно отсутствует. Однако в тех случаях, когда Κ_Ν присутствует, она может представлять собой любую подходящую группировку, включая замещенные или незамещенные гидрокарбильные группы, в частности короткие гидрокарбильные группы, указанные в данном описании изобретения.

В одном предпочтительном воплощении по меньшей мере одна 3,2-гидроксипиридиноновая группировка присутствует в структуре октадентатного лиганда. Очевидно, что она может быть замещена любой из разных группировок-заместителей, указанных в данном описании изобретения.

Так как каждая из группировок формулы II имеет два потенциально комплексообразующих кислорода, в одном воплощении настоящего изобретения предложен октадентатный лиганд, содержащий по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3 и наиболее предпочтительно 4 независимо выбранные группировки формулы I. Каждая группировка формулы II может иметь независимую картину замещения, но в одном предпочтительном воплощении по меньшей мере одна группировка представляет собой 3,2-гидроксипиридиноновую группировку. Лиганд может содержать 2, 3 или 4 3,2гидроксипиридиноновые группировки (замещенные в соответствующих случаях, как описано в данном описании изобретения).

Каждую группировку формулы I или II в октадентатном лиганде можно присоединить к оставшейся части лиганда с помощью любой подходящей линкерной группы, как обсуждалось в данном описании изобретения, и в любой подходящей конфигурации. Например, четыре группы формулы I можно присоединить с помощью их линкерных групп к каркасу так, чтобы образовать линейный лиганд, или их можно присоединить с помощью линкерных групп по мостиковой схеме с образованием структуры олигомер- 11 026305 ного типа, которая может быть линейной или циклической. Альтернативно, лигандные группировки формул I и/или II можно присоединить к центральному атому или группе в конфигурации крест или звезда, каждую с помощью линкера (например, группировки К_ъ)-. Группировки линкера (К_ъ) можно присоединять самостоятельно посредством углерод-углеродных связей, или их можно присоединять друг к другу, к другим хелатирующим группам, к каркасу, темплату, связывающей группировке или другому линкеру с помощью любой надлежащим образом устойчивой функциональности, включая аминную, амидную, сложноэфирную, простую эфирную, тио-эфирную или дисульфидную связь.

Звездообразное расположение показано в формуле III ниже

_ Н’Т’Н где все группы и положения являются такими, как указано выше, и I , дополнительно, представляет собой центральный атом или темплатную группу, например атом углерода, гидрокарбильную цепь (такую как любая из описанных выше в данном описании изобретения), алифатическое или ароматическое кольцо (включая гетероциклические кольца) или конденсированную кольцевую систему. Наиболее существенный темплат представляет собой одиночный углерод, который затем присоединяют к каждой из хелатирующих группировок с помощью их связывающих групп. Более длинные цепи, такие как этильная или пропильная, являются в равной степени приемлемыми с двумя хелатирующими группировками, присоединяющимися к каждому концу темплата. Очевидно, что любую подходящую устойчивую связь можно использовать для присоединения темплата и линкерных группировок, включая углеродуглеродные связи, сложноэфирные, простые эфирные, аминные, амидные, тио-эфирные или дисульфидные связи.

В структуре формулы III группы Κ_Ν и могут представлять собой одну и ту же группу, так что хелатирующие группировки присоединяются к темплату Т посредством атома азота пиридинового кольца. Это приводит к структурам типа ШЬ ниже

Очевидно, что в структурах формул II, III, ШЬ, IV и !УЬ те положения пиридинового(ых) кольца(колец), которые не замещены по-другому (например, линкером или связывающей группировкой), могут, в соответствующих случаях, иметь заместители, описанные для Г₁-Г₅ в формуле I. В частности, небольшие алкильные заместители, такие как метильные, этильные или пропильные группы, могут присутствовать в любом положении.

Октадентатный лиганд обычно дополнительно содержит по меньшей мере одну связывающую группировку, как описано выше. Она может представлять собой любую подходящую структуру, включая любую из указанных в данном описании изобретения, и будет заканчиваться обеспечивающей направленную доставку группировкой, специфическим связующим агентом или функциональной группой, способной к связыванию с такой обеспечивающей направленную доставку группировкой или таким специфическим связующим агентом.

Связывающую группировку можно присоединить к любой подходящей точке линкера, темплата или хелатирующей группировки, такой как положения а), Ь) и/или с), как указано в формуле III. Присое- 12 026305 динение связывающей группировки можно осуществлять посредством любой подходящей устойчивой связи, такой как углерод-углеродные связи, сложноэфирные, простые эфирные, аминные, амидные, тиоэфирные или дисульфидные связи. Аналогично, группы, способные к образованию любых таких связей с обеспечивающей направленную доставку группировкой, являются подходящими для функционального конца связывающей группировки, и эта группировка будет заканчиваться такими группами при присоединении к обеспечивающей направленную доставку части.

В качестве альтернативы в формуле IV ниже показана структура каркасного типа

. *в *в-- ’

I

- .......-«е-........ IV, где все группы и положения являются такими, как указано выше, и К_в, дополнительно, представляет собой каркасную группировку, которая обычно имеет структуру и функцию, аналогичные любой из линкерных группировок, указанных в данном описании изобретения, и, таким образом, любое определение линкерной группировки может быть взято для распространения на каркасную группировку, когда позволяет контекст. Подходящие каркасные группировки образуют остов, к которому присоединяют хелатирующие группировки посредством их линкерных групп. Обычно требуется три или четыре каркасные группировки. Типично, их бывает три для линейного каркаса или четыре, если каркас является циклизированным. Особенно предпочтительные каркасные группировки включают короткие углеводородные цепи (такие как цепи, описанные в данном описании изобретения), возможно имеющие гетероатом или функциональную группировку на одном или обоих концах. Аминные и амидные группы являются особенно подходящими в этом отношении.

Связывающую группировку можно присоединить к любой подходящей точке линкера, каркаса или хелатирующей группировки, такой как положения а), Ь) и/или с'), как указано в формуле IV. Присоединение связывающей группировки можно осуществлять посредством любой подходящей устойчивой связи, такой как углерод-углеродные связи, сложноэфирные, простые эфирные, аминные, амидные, тиоэфирные или дисульфидные связи. Аналогично, группы, способные к образованию любых таких связей с обеспечивающей направленную доставку группировкой, являются подходящими для функционального конца связывающей группировки, и эта группировка будет заканчиваться такими группами при присоединении к обеспечивающей направленную доставку части.

Как и в формуле III, в структуре формулы IV группы Κ_Ν и К_ъ могут представлять собой одну и ту же группу, так что хелатирующие группировки присоединяются к каркасу К_в посредством атома азота пиридинового кольца. Это приводит к структурам типа IVЬ ниже

Пример октадентатного лиганда каркасного типа, имеющего две 1,2- и две 3,2-НОРО хелатирующих группировки, присоединенные к каркасу с помощью амидных линкерных групп, будет иметь формулу V, как указано ниже

Типичные темплатированные октадентатные лиганды, где каждый имеет четыре 3,2-НОРО хелатирующие группировки, связанные с помощью этиламидных групп с этил- и пропилдиамином соответ- 13 026305 ственно, будут иметь формулы VI и VII, как указано ниже

Следует отметить, что в указанных выше формулах свободные азоты группировок 3,2-НОРО замещены метильными группами, и небольшие гидрокарбильные группы, такие как метил или этил, являются предпочтительными в этом положении (Κι в формуле I или Κ_Ν в формуле II).

Типичные темплатированные октадентатные лиганды, имеющие четыре 3,2-НОРО хелатирующие группировки, связанные с помощью азота в кольце НОРО с аминоцикланом, будут иметь формулу VIII, как указано ниже пп. ~

И ^нол ^Ο*~^Ν оХ)

ЛЛ .Ν сс α° °^Η VIII.

Как указано выше, октадентатный лиганд обычно включает связывающую группировку, которую можно присоединить к оставшейся части лиганда в любой точке. Типичное соединение с функционализированной группировкой, заканчивающейся связывающей группировкой, согласно этому воплощению представляет собой структуру IX ниже

Все документы, упомянутые в данном описании изобретения, включены в него посредством ссылки, включая Оогйоп ΑΕν е! а1., Кайопа1 йе51дп оГ кесщеЧеппд адеп!к Гог р1и!отит апй о!Ьег асйтйек. СЬет. Кеу. 2003, 103, 4207-4282, РСТ Ра!еп! Αрр1^са!^оη АО 2008/063721 Α2 апй Τ.Ν. ЬатЬей е! а1., Те!гайейгоп Ьейегк 43 (2002) 7379-7383.

Кроме того, изобретение проиллюстрировано прилагаемыми графическими материалами, где: на фиг. 1 показана хроматограмма реакционной смеси ²³²ΤΕ⁴⁺(ΗΝΟ₃) и 1 мг/мл Α^Ο-^^-NСδ в

ΌΜδΟ (диметилсульфоксид) (теоретическое соотношение 2:3) через 15 мин при КТ (комнатная температура). Наблюдаются значительные количества комплекса ³³³Τ1ι-ΑΡΟ-ΌΌ-Νί.’δ (!_К = 5,74 мин; т/ζ 1328,5) и отсутствие следов свободного лиганда ΑΡΟ-ΌΌ-Νί'.'δ (!_К = 5,36);

на фиг. 2 показан масс-спектр комплекса ³³³Τ1ι-ΑΡΟ-ΌΌ-Νί.’δ (т/ζ 1328,3949);

на фиг. 3 показана хроматограмма реакционной смеси Ρе³⁺(ΗNΟ₃) и 1 мг/мл Α^Ο-^^-NСδ в ΌΜδΟ (теоретическое соотношение 2:3) через 15 мин при КТ. Наблюдаются значительные количества комплекса Ρο-ΑΡΟ-ΌΌ-Νί',’δ (!_К = 5,81 мин; т/ζ 1153,5) и отсутствие следов свободного лиганда Α^Ο-^^-NСδ (!_К = 5,36 мин);

на фиг. 4 показан масс-спектр комплекса Ρο-ΑΡΟ-ΌΌ-Νί',’δ (т/ζ 1153,3002);

на фиг. 5 показана хроматограмма реакционной смеси Ш^НСГ) и 1 мг/мл Α^Ο-^^-NСδ в ΌΜδΟ (теоретическое соотношение 2:3) через 15 мин при КТ. Наблюдаются значительные количества комплекса Iη-Α^Ο-^^-NСδ (!_К = 5,95 мин; т/ζ 1212,5) и отсутствие следов свободного лиганда ΑΡΟ-ΌΌ-Νί',’δ (!_К = 5,36 мин);

на фиг. 6 показан масс-спектр комплекса Iη-Α^Ο-^^-NСδ (т/ζ 1212,2666);

- 14 026305 на фиг. 7 показана хроматограмма реакционной смеси ²³²ΤΗ⁴⁺(ΗΝΟ₃) и 1 мг/мл АЬС1005-38 в ацетатном буфере (рН 5,5) через 10 мин при КТ (теоретическое соотношение 1:3). Наблюдаются значительные количества комплекса ²³²ТЬ-АЬС1005-38 (Ц = 3,56; т/ζ 1184,5) и остатки свободного лиганда

АЬС1005-38 (1_К = 3,20);

на фиг. 8 показан масс-спектр комплекса ²³²ТЬ-АЬС1005-38 (т/ζ 1184,4662);

на фиг. 9 показана хроматограмма реакционной смеси Ρе³⁺(ΗNΟ₃) и 1 мг/мл ЛЬС1005-38 в ацетатном буфере (рН 5,5) через 10 мин при КТ (теоретическое соотношение 1:3). Наблюдаются значительные количества комплекса Ре-ЛЬС1005-38 (Ц = 3,70; т/ζ 1009,5) и остатки свободного лиганда АЬС100538(1,, = 3,22);

на фиг. 10 показан масс-спектр Ре-ЛЬС1005-38 комплекса (т/ζ 1009,3727);

на фиг. 11 показана хроматограмма реакционной смеси 1п³⁺(НС1) и 1 мг/мл ЛЬС1005-38 в ацетатном буфере (рН 5,5) через 10 мин при КТ (теоретическое соотношение 1:3). Наблюдаются значительные количества комплекса 1п-ЛЬС1005-38 (Ц = 3,72; т/ζ 1068,5) и только следы свободного лиганда АЬС1005-38 (1_К = 3,21);

на фиг. 12 показан масс-спектр комплекса 1п-ЛЬС1005-38 (т/ζ 1068,3485);

На фиг. 13 показана хроматограмма реакционной смеси Са³⁺(НС1) и 1 мг/мл ЛЬС1005-38 в ацетатном буфере (рН 5,5) через 10 мин при КТ (теоретическое соотношение 1:3). Наблюдатся значительные количества комплекса Са-ЛЬС1005-38 (Ц = 3,65; т/ζ 1022,5) и остатки свободного лиганда АЬС100538(1., = 3,21);

на фиг. 14 показан масс-спектр комплекса Са-ЛЬС1005-38 (т/ζ 1022,3571);

на фиг. 15 показана хроматограмма реакционной смеси ²³²ТЬ⁴+ (НС1) и 1 мг/мл Βϋ-1-ΗΟΡΟ-1-ΌΕΒΝ (теоретическое соотношение 2:3) через 15 мин при КТ. Наблюдаются значительные количества комплекса ²³²ΤΕ-Βϋ-1-ΗΟΡΟ-1-ΌΕΒΝ (ΐ_Γ = 3,52). Верхняя кривая: масс-хроматограмма с т/ζ 1222,5. Нижняя кривая: υν (ультрафиолет) при 330 нм;

на фиг. 16 показан масс-спектр комплекса ²³²ΤΕ-Βϋ-1-ΗΟΡΟ-1-ΌΕΒΝ (т/ζ 1222,5);

на фиг. 17 показано рассчитанное количество ТЬ-АЬС-ОП-НСЗ-трастузумаб и свободного ТЬ, связанного с осадками клеток §Κ-Ον-3 в сутки 0-7, показано в виде распад-скорректированной ²²⁷ТЬактивности (число импульсов в 1 мин);

на фиг. 18 показаны нормализованные значения люминесценции для клеток §Κ-Ον-3, обработанных (1) обычной средой (контроль); (2) 20 мкг/мл трастузумаба; (3) 20 кБк/мл ^2ГТЬ-АЬС-ОО-ХС.’5>трастузумаб (10166 Бк/мкг) и (4) 20 кБк/мл свободного ^227ТЬ;

на фиг. 19 показан клоногенный анализ 1000 одиночных клеток §Κ-Ον-3, обработанных (1) обычной средой (контроль); (2) трастузумабом; (3) свободным ТЬ и (4) ТЬ-АЕС-ОП-ЫСЗ-трастузумаб (10166 Бк/мкг). (Среднее значение ± 8Ό (стандартное отклонение); п = 3);

на фиг. 20 показан клоногенный анализ 3000 одиночных клеток §Κ-Ον-3, обработанных (1) обычной средой (контроль); (2) трастузумабом; (3) свободным ТЬ и (4) ТЬ-АЬС-ОО-Ж.’5>-трастузумаб (10166 Бк/мкг). (Среднее значение ± 8Ό; п = 3);

на фиг. 21 показано распределение ²²⁷ТЬ-АЕС-ЭП-НС8-трастузумаб (2700 Бк/мкг) в органах голых мышей Ба1Ь/с с ксенотрансплантатами §Κ-Ον-3 после биораспределения в течение 24 ч и 4 суток. (Среднее значение ± 8Ό; п = 5).

Далее изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами. Все приведенные в примерах соединения образуют предпочтительные воплощения изобретения (включая предпочтительные промежуточные соединения и предшественники), и их можно использовать по отдельности или в любой комбинации в любом аспекте, где позволяет контекст. Таким образом, например, каждое и все соединения от 2 до 4 примера 2, соединение 10 примера 3 и соединение 7 примера 4 образуют предпочтительные воплощения разных типов.

Пример 1. Выделение чистого тория-227.

Торий-227 выделяют из актиниевого-227 источника (соте). Актиний-227 получали путем облучения радия-226 тепловыми нейтронами с последующим распадом радия-227 (Н/2 = 42,2 мин) до актиния-227. Торий-227 селективно извлекали из актиниевой-227 смеси распада в 8 М растворе ΗΝΟ₃ посредством анионообменной хроматографии. Использовали колонку с внутренним диаметром 2 мм, длиной 30 мм, содержащую 70 мг смолы АС®1-Х8 (200-400 меш, нитратная форма). После того, как из колонки элюировали актиний-227, радий-223 и дочерние продукты, торий-227 экстрагировали из колонки с помощью 12 М ЖТ Элюат, содержащий торий-227, упаривали досуха и остаток ресуспендировали в 0,01 М ЖТ

- 15 026305

Пример 2. Синтез ΆΣΟ-ΟΌ-ΝΟδ.

-Бензилокси-1 -метил-4-(2-тиоксотиазолидин-1-ил)карбонил-2(1Н)-пиридинон (синтезированный согласно Каутопб, К.; Хи, ί., υδ 5624901) (2,22 ммоль, 0,8 г), триэтиламин (0,31 мл, 2,22 ммоль) и ΌΜΆΡ (4-диметиламинопиридин) (5 мг) добавляли к раствору трет-бутилового эфира [5-амино-6-((2аминоэтил)-{2-[бис-(2-аминоэтил)амино]этил}амино)гексил]карбаминовой кислоты (ВоеЬу8-Н(2,2)амин) (синтезированного согласно Каутопб, К.; СогпсППс. Т.М.; Хи, ί., ЖО 2008/063721 А2) (0,204 г, 0,505 ммоль) в дихлорметане (80 мл). Эту смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, а затем упаривали досуха. Остаток растворяли в дихлорметане и загружали в флэш-колонку с силикагелем

- 16 026305 и элюировали градиентом метанола (2-8%) в дихлорметане. Подходящие фракции собирали и упаривали досуха с получением АЬО-001 (1) (примерно 0,4 г) в виде бледно-бежевого густого масла.

М§ (масс-спектрометрия) (ΕδΣ (ионизация электрораспылением), положит.): т/ζ 1369 [М+Н]+, т/ζ

1391 [М+Ыа]+.

АЬО-001 (1) (280 мг, 0,205 ммоль) растворяли в ледяной уксусной кислоте (20 мл), добавляли катализатор (60 мг), представляющий собой 20% Ρά(0Η)₂ на древесном угле, и смесь гидрировали при 40-45 фунт на кв.дюйм (примерно 0,28-0,31 МПа) при комнатной температуре в течение ночи. После фильтрования с последующим роторным упариванием получали АЬО-ΌΕΒΝ (2) (примерно 260 мг, со следами уксусной кислоты) в виде густого масла, окрашенного в винно-красный цвет.

М8 (Ε8Σ, положит.): т/ζ 1007 [М+Н]+, т/ζ 1029 [М+№]+.

АЬО-ΌΕΒΝ (2) (70 мг) растворяли в смеси МеОН/дихлорметан (2:1,15 мл) при температуре окружающей среды. Затем добавляли 0,5 г очищенной смолы АтЬсг1у51-15 и смесь осторожно перемешивали в течение ночи. Затем смолу отделяли фильтрованием и последовательно промывали гексаном (10 мл), тетрагидрофураном (10 мл) и метанолом (10 мл). Эту связанную с амином смолу переносили в 4 М метанольный раствор аммиака (20 мл) и осторожно перемешивали в течение 50 мин. Добавляли тетрагидрофуран (10 мл) для растворения всего незащищенного продукта. Затем смолу удаляли фильтрованием, и раствор упаривали, получая ΑΕΟ-ΌΕΒΝ-ΌΕΒ00 (3) (37 мг).

М8 (Ε8Σ, положит.): т/ζ 909 [М+Н]+, т/ζ 931 [М+№]+.

Суспензию 40 мг ΑΕΟ-ΌΕΒΝ-ΌΕΒ00 (3) в смеси изопропиловый спирт-вода (6:1 об./об., 7 мл) подвергали взаимодействию с раствором 1,4-фенилендиизотиоцианата (4,1 экв.) в хлороформе (2,5 мл). Реагенты перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего отбирали образец для масс-спектрометрического анализа. Наблюдали пики, соответствующие ожидаемой массе (1100). После удаления летучих веществ под вакуумом выделяли примерно 95 мг светло-коричневого твердого вещества. Светло-коричневое твердое вещество суспендировали в ацетонитриле и смесь нагревали с обратным холодильником в течение 15 мин. Смесь охлаждали до комнатной температуры с последующим выделением фильтрованием 26 мг ΑΕΟ-ΌΌ-ΝΟδ (4) в виде коричневого твердого вещества.

Пример 3. Синтез симметричного хелатора, содержащего 3,2-НОРО

В колбу загружали гидрид натрия (60,1 г в виде 60%-ной дисперсии в минеральном масле, 1,5 моль, 5 экв.) и добавляли тетрагидрофуран (1 л). По каплям в течение 1,5 ч добавляли диметилмалонат (172 мл, 1,5 моль, 5 экв.); температуру реакционной смеси поддерживали ниже 10°С. Затем реакционную смесь

- 17 026305 разбавляли тетрагидрофураном (400 мл). К приготовленной вышеуказанной смеси медленно в течение 30 мин при энергичном взбалтывании добавляли раствор 4-нитробензилбромида (65,0 г, 0,3 моль, 1 экв.) в тетрагидрофуране (170 мл). После 30 мин перемешивания при 0°С реакционную смесь вливали в рассол (1 л насыщенного раствора ЫаС1) и оставляли перемешиваться в течение ночи при температуре окружающей среды, получая белый осадок. Затем смесь разбавляли метил-трет-бутиловым эфиром и осадок отфильтровывали и растворяли в горячем этаноле. Этанольную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали до небольшого объема, из которого осаждалось 24,8 г (31%) диметил-(4нитробензил)пропандиоата (1) в виде белого кристаллического твердого вещества.

ЬС (жидкостная хроматография), чистота: >90% (254 нм).

Μδ (ΛΡί'Ί (химическая ионизация при атмосферном давлении), положит.) т/ζ 285,1 [Μ+ΝΗ₄]+.

Соединение 1 (24,8 г, 92,7 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (230 мл) и добавляли борандиметилсульфидный комплекс (28,5 мл, 301 ммоль, 3,3 экв.). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 24 ч и затем оставляли стоять при температуре окружающей среды в течение ночи. Добавляли метанол (250 мл) при 0°С, вливали в рассол (600 мл) и экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические экстракты сушили над Ν;·ι₂δΟ₄ и концентрировали в вакууме. Остаток упаривали совместно с метанолом. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией, получая 14,5 г (74%) 2-(4-нитробензил)пропан-1,3-диола (2) в виде желтого масла.

ЬС, чистота: >92% (254 нм).

Соединение 2 (10,0 г, 47,3 ммоль) растворяли в дихлорметане (100 мл) и добавляли триэтиламин (14,5 мл, 104 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь охлаждали в ледяной бане и порциями добавляли метансульфонилхлорид (8,0 мл, 104 ммоль, 2 экв.). Конечную смесь оставляли достигать температуры окружающей среды в течение ночи. Затем добавляли дополнительные количества триэтиламина (1,5 мл) и метансульфонилхлорида (0,8 мл) и перемешивание продолжали в течение 30 мин. Потом реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и отфильтровывали образовавшийся осадок. Дихлорметановый фильтрат промывали насыщенным водным раствором NаΗСΟз, 0,5 М водн. НС1 и рассолом, сушили над Ν;·ι₂δΟ₄ и концентрировали в вакууме, получая 14,5 г (83%) 2-(4-нитробензил)пропан-1,3-диилдиметансульфоната (3) в виде оранжевого масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

ЬС, чистота: >87% (254 нм).

Μδ (АРСД положит.) т/ζ 385,3 [Μ+ΝΗ₄]+.

Соединение 3 (14,5 г, 39,5 ммоль) растворяли в метилэтилкетоне (100 мл), добавляли йодид натрия (16,0 г, 107 ммоль, 2,7 экв.) и смесь нагревали при 95°С в течение 1 ч. Полученный белый осадок отфильтровывали и промывали метилэтилкетоном и фильтрат концентрировали в вакууме.

Неочищенный продукт растирали с метил-трет-бутиловым эфиром и очищали флэшхроматографией, получая 10,6 г (63%) 1-[3-йод-2-(йодметил)пропил]-4-нитробензола (4) в виде желтого твердого вещества.

ЬС, чистота: >90% (254 нм).

Μδ (АРСф положит.) т/ζ 431,1 [М+Н]+.

Диэтилентриамин (10,8 мл, 100 ммоль) и триэтиламин (42 мл, 300 ммоль, 3 экв.) растворяли в тетрагидрофуране (500 мл) и охлаждали в ледяной бане. Затем по каплям в течение 2,5 ч добавляли раствор Вос-ΟΝ (49,5 г, 200 ммоль, 2 экв.) в тетрагидрофуране (190 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение еще 1 ч, после чего ее оставляли достигать температуры окружающей среды в течение ночи. Затем реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в дихлорметане и промывали 1 М водн. ΝαΟΗ. Органическую фазу сушили над Ν;·ι₂δΟ₄ и концентрировали в вакууме. Неочищенное вещество очищали флэш-хроматографией, получая 20,0 г (66%) ди-трет-бутил-(иминодиэтан-2,1диил)бискарбамата (5) в виде желтого вязкого масла.

Μδ (АРСф положит.) т/ζ 304,3 [М+Н]+.

Соединение 5 (26,0 г, 86 ммоль, 4 экв.) растворяли в сухом толуоле (40 мл) и добавляли Νэтилморфолин (5,4 мл, 42 ммоль, 2 экв.). Соединение 4 (9,2 г, 21 ммоль) растворяли в сухом толуоле (35 мл) и добавляли к реакционной смеси. Смесь инкубировали в реакторе для работы под давлением при 105°С в течение 5 суток. Затем реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, разбавляли этилацетатом и промывали насыщенным водным раствором Ν;·ιΗί'Ό₃,. Объединенные органические экстракты промывали водой и рассолом, сушили над Ν;·ι₂δΟ₄ и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией, получая 11,4 г (70%) соединения 6 в виде желтой твердой пены.

ЬС, чистота: >96% (210 нм).

Μδ (АРСД положит.) т/ζ 782,8 [М+Н]+; 682,7 [М+Н-Вос]+; 582,6 [М+Н-2Вос]+; 382,1 [М+Н-4Вос]+.

Соединение 6 (2,0 г, 2,6 ммоль) растворяли в диоксане (16 мл) и добавляли 9 М раствор НС1 в диоксане (22 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение ночи и затем концентрировали досуха в вакууме, получая 1,9 г НС1 соли соединения 7 в виде бежевого твердого вещества.

Μδ (АРСД положит.) т/ζ 382,5 [М+Н]+.

- 18 026305

К соединению 7 (1,9 г, 2,6 ммоль) добавляли ΌΜΡυ (1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)пиримидинон) (9,5 мл) и 3-(бензилокси)-1-метил-4[(2-тиоксо-1,3-тиазолидин-3-ил)карбонил]пиридин-2(1Н)-он (3,7 г, 10,3 ммоль, 4 экв.). Затем медленно в течение 40 мин добавляли раствор ΌΒυ (2,3 мл, 15,5 ммоль, 6 экв.) в ΌΜΡυ (4,7 мл). Перемешивание продолжали в течение ночи при температуре окружающей среды. Затем реакционную смесь разбавляли дихлорметаном и промывали насыщенным водным раствором ЫаНСО₃. Объединенные органические экстракты промывали водой и полунасыщенным рассолом, затем сушили над Ыа₂8О₄ и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали флэшхроматографией с получением 4,0 г соединения 8 в виде желтого масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

Μδ (АРС1, положит.) т/ζ 1347,7 [М+Н]+.

Соединение 8 (4,0 г, 2,6 ммоль) растворяли в уксусной кислоте (200 мл) и добавляли Рй(ОН)₂ (20% мас./мас. на С, влажный на 50%) (800 мг, 10% мас./мас.). Реакционную смесь перемешивали в реакторе Парра для работы под давлением при давлении водорода 30 бар (3,0 МПа) и температуре окружающей среды в течение ночи. Затем реакционную смесь фильтровали через слой Сс1Пс® и фильтрат концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией, получая соединение 9 в виде бежевого вспененного твердого вещества.

Соединение 9 (996 мг) растворяли в уксусной кислоте (5,5 мл) с последующим добавлением 6 Μ водной НС1 (2,5 мл) и 5% Рй/С (99 мг, 10% мас./мас.). Реакционную смесь перемешивали в реакторе для работы под давлением при давлении водорода 8 бар (0,8 МПа) в течение ночи и затем фильтровали через слой СеШе®. Фильтрат концентрировали в вакууме и упаривали совместно с толуолом и метанолом. Остаток растворяли в метаноле и осаждали путем добавления диэтилового эфира. Образовавшийся бежевый осадок отфильтровывали и сушили в вакууме в течение ночи, получая 700 мг НС1 соли соединения 10, ΑΌ01005-38.

Μδ (АРС1, положит.) т/ζ 956,7 [М+Н]+.

Пример 4. Синтез альтернативного симметричного хелатора, содержащего 3,2-НОРО

- 19 026305

Вос-ангидрид (24,4 г, 119 ммоль) порциями добавляли к раствору имидазола (8,0 г, 117 ммоль) в 50 мл дихлорметана при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч. Реакционную смесь промывали дважды 50 мл воды, сушили над №3804, фильтровали и уменьшали объем смеси под вакуумом. Остаток растворяли в 25 мл толуола и добавляли трис-(2-аминоэтил)амин (8,19 г, 56 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 60°С и уменьшали объем смеси под вакуумом. Остаток растворяли в 125 мл дихлорметана и промывали водой (4 раза по 50 мл), сушили над №2804, фильтровали и уменьшали объем под вакуумом. После сухой флэш-хроматографии (0-15% метанола в дихлорметане с 1% триэтиламина) получали ди-трет-бутил-(((2-аминоэтил)азандиил)-бис(этан-2,1-диил))дикарбамат (1) (13,51 г, 39,0 ммоль, 70%) в виде густого бесцветного масла.

Спектроскопические данные соответствовали данным, приведенным в ТгиИаио е! а1. (Сйет. Еиг. I., 2004, 10, 5205-17).

К-СЬ7-в-аланин (8,04 г, 36 ммоль), 4-(диметиламино)пиридин (4,40 г, 36 ммоль) и ЕБСНС1 (6,90 г, 36 ммоль) растворяли в 25 мл тетрагидрофурана и перемешивали в течение 10 мин, после чего добавляли Соединение 1 (10,4 г, 30 ммоль), растворенное в 75 мл тетрагидрофурана. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч и уменьшали объем смеси под вакуумом. После очистки посредством сухой флэш-хроматографии (0-40% тетрагидрофурана в дихлорметане) получали ди-трет-бутил-(((2-(3-(СЬ/амино)пропанамидо)этил)азандиил)-бис-(этан-2,1-диил)дикарбамат (2) (15,11 г, 27,4 ммоль, 91%) в виде очень вязкого слегка желтого масла.

Ή-ЯМР (300 МГц, СБС1₃): 1.43 (з, 18Н), 2.42-2.56 (т, 8Н), 3.04-3.17 (т, 4Н), 3.19-3.32 (т, 2Н), 3.413.57 (т, 2Н), 5.08 (з, 2Н), 5.22 (Ьз, 2Н), 5.83 (Ьз, 1Н), 7.23 (Ьз, 1Н), 7.26-7.43 (т, 5Н).

М8 (Ε8Σ, положит.): т/ζ 574,3 [М+№]+.

Ди-трет-бутил-(((2-(3-(СЬ7-амино)пропанамидо)этил)азандиил)-бис-(этан-2,1-диил)дикарбамат (10,30 г, 18,7 ммоль) растворяли в 100 мл метанола и по каплям добавляли ацетилхлорид (25 мл, 0,35 моль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при температуре окружающей среды. Объем реакционной смеси уменьшали в вакууме до приблизительно после чего добавляли 100 мл эфира, что приводило к осаждению бесцветного твердого вещества. Твердые вещества фильтровали, промывали эфиром и сушили в вакууме, получая три-гидрохлорид бензил-(3-((2-(бис-(2-аминоэтил)амино)этил)амино)-3-оксипропил)карбамата (3) (8,70 г, 18,7 ммоль, примерно 100%) в виде бесцветного твердого вещества.

Ή-ЯМР (300 МГц, МеОБ): 3.19-3.28 (т, 2Н), 3.38-3.62 (т, 14Н), 5.10 (з, 2Н), 7.26-7.39 (т, 5Н).

М8 (Е8Т, положит.): т/ζ 352,2 [М+Н]+.

- 20 026305

Триэтиламин (6,75 мл, 48,4 ммоль) добавляли к суспензии соединения 3 (10,56 г, 11,4 ммоль) в 320 мл тетрагидрофурана и 320 мл Ν,Ν-диметилформамида при комнатной температуре. Добавляли ЖЬос-2аминоацетальдегид (16,0 г, 100,5 ммоль) и триацетоксиборгидрид натрия (32,00 г, 151 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч. Добавляли 200 мл рассола и 500 мл хлороформа, фазы разделяли и водную фазу экстрагировали хлороформом 3x100 мл. Объединенные органические фазы промывали 100 мл рассола, сушили над Ν;·ι₂δΟ₄. фильтровали и уменьшали объем под вакуумом. После флэшхроматографии (0-10% метанола в дихлорметане) получали тетра-трет-бутил-(((((2-3-СЬ/аминопропанамидо)этил)азандиил)-бис-(этан-2,1-диил))-бис-(азантриил)тетракис(этан-2,1-диил)тетракарбамат (4) (3,40 г, 3,7 ммоль, 32%) в виде желтого твердого вещества.

Μδ (ΕδΙ, положит.): т/ζ 946,7 |Μ+Να| +

Соединение 4 (3,40 г, 3,7 ммоль) растворяли в 60 мл метанола и по каплям добавляли ацетилхлорид (12 мл, 0,17 моль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 1 ч. Объем реакционной смеси уменьшали в вакууме до приблизительно 10 мл и добавляли 50 мл ацетонитрила, что приводило к осаждению. Твердое вещество фильтровали, промывали ацетонитрилом и сушили в вакууме, получая гепта-гидрохлорид бензил-(3-((2-(бис-(2-аминоэтил)амино)этил)амино)этил)амино)3-оксопропил)карбамата (5) (2,88 г, 3,7 ммоль, примерно 100%) в виде бесцветного твердого вещества.

Ή-ЯМР (300 МГц, ΜβΟΌ): 2.44-2.61 (т, 2Н), 2.68-3.00 (т, 4Н), 3.08-3.40 (т, 16Н), 3.44-3.52 (т, 4Н), 3.54-3.77 (т, 6Н), 5.12 (5, 2Н), 7.30-7.47 (т, 5Н).

Μδ (ΕδΙ, положит.): т/ζ 524,5 [М+Н]+.

Триэтиламин (2,52 мл, 18,1 ммоль) и 4-(диметиламино)пиридин (12 мг, кат.) добавляли к суспензии соединения 5 (0,81 г, 1,04 ммоль) и 3-(бензилокси)-1-метил-4-(2-тиоксотиазолидин-3-карбонил)пиридин2(1Н)-она (1,50 г, 4,16 ммоль) в 180 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и уменьшали объем смеси под вакуумом. После флэш-хроматографии (0-10% метанола в дихлорметане) получали бензил-( 1 -(3 -(бензилокси)-1-метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-ил)-5 -(2-(3 -(бензилокси)-1метил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-карбоксамидо)этил)-8-(2-(бис-(2-(3-(бензилокси)-1-метил-2-оксо1,2-дигидропиридин-4-карбоксамидо)этил)амино)этил)-1,12-диоксо-2,5,8,11-тетраазатетрадекан-14ил)карбамат (6) (673 мг, 0,45 ммоль, 43%) в виде светло-коричневого твердого вещества.

Ή-ЯМР (300 МГц, СОС1₃): 2.10-2.40 (т, 20Н), 3.02-3.21 (т, 10Н), 3.32-3.46 (т, 2Н), 3.50 (5, 12Н), 4.99 (5, 2Н), 5.25 (5, 8Н), 5.95 (Ь5, 1Н), 6.62 (б, 7,17 Гц, 4Н), 7.01 (б, 7,17 Гц, 4Н), 7.15-7.40 (т, 25Н), 7.89 (Ь5, 4Н).

¹³С-ЯМР (75 МГц, СЭС1₃): 11.48, 35.71, 37.18, 37.35, 37.50, 37.66, 46.18, 51.55, 52.15, 52.82, 53.28, 66.34, 74.64, 74.75, 77.43, 104.63, 127.90, 127.94, 128.40, 128.65, 128.75, 128.94, 130.81, 132.32, 136.27, 136.76, 146.19, 156.45, 159.51, 163.30, 171.31.

Μδ (ΕδΙ, положит.): т/ζ 766,9 [М+2№]²+.

Соединение 6 растворяли и дебензилировали, по существу, как описано в примере 2, с получением ВЫ-НОРО-1-ΌΕΒΝ (7).

Пример 5. Эксперименты по хелатообразованию с АЕС-ОЭ-Ж®.

Реакционный раствор получали путем растворения твердого АЕС-ОЭ-Ж® (4 в примере 2) в ΌΜδΟ (растворитель Вю1есИ, категория 99,8%) до 1 мг/мл. Реакции хелатообразования с различными металлами проводили путем смешивания 1 мг/мл реакционного раствора с растворами выбранных металлов, используя отношение лиганда к металлу 3:2. Ионы металла для тестирования брали из следующих веществ: ²³²ТИ-раствор в 2%-ной НNΟ3 (Регкш Е1тег Риге Р1и5), Ре³+-раствор в 2%-ной НNΟ3 (Регкш Е1тег Риге Р1и5), и 1пС1₃ (безводный порошок, 99,999+%, А1бпсИ), который растворяли в 0,01 М НС1. Реагенты оставляли взаимодействовать в течение 15 мин при комнатной температуре с последующим впрыском 5 мкл реакционной смеси для анализа методом ЬС-Μδ (жидкостная хроматография/масс-спектрометрия).

232 4+ 3+ 3+

Результаты показали, что для металлов ТИ , Ре и Ιη было количественное образование комплексов металл-АЕС-ЭО-Ж®. ЬС-Μδ хроматограммы и спектры комплексов ²³²ТИ-А^С-^^-NСδ, РеΑΕΠ-ΌΌ-Νί.’δ и Ιη-ΑΕΠ-ΌΌ-Νί.’δ показаны на фиг. 1-6.

Условия ЬС-Μδ были следующими: разделение осуществляли на колонке Асс|ибу ИРЬС ВЕН С18, 1,7 мкм, 2,1x50 мм, при 50°С, используя 0,05% муравьиной кислоты в Н₂О в качестве подвижной фазы А и 0,05% муравьиной кислоты в ацетонитриле в качестве подвижной фазы В. Градиентный состав и поток указаны в табл. 3.

- 21 026305

Таблица 3

Время (мин)	Поток (мл/мин)	% А	% В
0,0	0,6	95	5
2,0	0,6	95	5
9,0	0,8	40	60
9,1	0,8	10	90
10,0	0,8	10	90
10,1	0,8	95	5
11,4	0,8	95	5
11,5	0,6	95	5
12,0	0,6	95	5

Масс-спектроскопический анализ осуществляли на приборе Хеуо-ТоР-1, используя диапазон обнаружения масс примерно 450-1950 Да, молярность Εδ+, напряжение на капилляре 3,0 кВ, сканирование в течение 1.000 с при напряжении на конусе 20 В.

Пример 6. Эксперименты по хелатообразованию с ЛЬ01005-38.

Исходный раствор получали путем растворения ЛЬ01005-38 (10 в примере 3) в МеОН (категория ЬС-Μδ) до 10 мг/мл. 10 мг/мл исходного раствора разбавляли МеОН и 0,5 М ИаОАс-буфером (рН 5,5) в соотношениях 1:8:1 с получением 1 мг/мл реакционного раствора АИ01005-38. Реакции хелатообразования с различными металлами проводили путем смешивания 1 мг/мл реакционного раствора с выбранными металлами, как указано в примере 5, а также с СаСЬ (безводные гранулы 99,99%, А16г1сН), который растворяли в 0,01 М НС1, получая соотношения лиганда к металлу от 3:1 до 1:2. Реагенты оставляли взаимодействовать в течение 10 мин при комнатной температуре. Наконец, реакционные смеси разбавляли в 10 раз муравьиной кислотой (0,1%) с последующим впрыском 5 мкл для анализа методом ЬС-Μδ. ЬСΜδ разделение и анализ осуществляли, как описано в примере 5, за исключением того, что напряжение на конусе составляло 35 В.

Результаты показали, что для металлов, подобных ТН , Ре , Ση и Са , комплексы металАЬС1005-38 были образованы в значительных количествах. ЬС-Μδ хроматограммы и спектры комплексов ²³²ТН-АЬС1005-38, Ре-АЬС1005-38, Ы-АЬС1005-38 и Са-АЬС1005-38 показаны на фиг. 7-14.

Пример 7. Эксперимент по хелатообразованию с Βϋ-1-ΗΟΡΟ-1-ΌΕΒΝ.

Исходный раствор получали путем растворения Βϋ-1-ΗΟΡΟ-1-ΌΕΒΝ (полученного в примере 4) в ΌΜδΟ (растворитель ЕюЮск, категория 99,8%) до 1 мг/мл. Эксперимент по хелатообразованию проводили путем смешивания 1 мг/мл раствора с ²³²Тк 0,01 М НС1 (Реткш Е1тег), как указано в примере 5. ЬСΜδ разделение и анализ осуществляли, как описано в примере 6. Результаты показали, что ожидаемый комплекс ²³²Тк-ΒЬ-1-ΗΟΡΟ-1-^ΕΒN образовался быстро, фиг. 15 и 16.

Пример 8. Конъюгация АкС-ЭЭ-Ж'Ъ с трастузумабом, мечение конъюгата торием-227 и подтверждение сохраненного целевого связывания.

Конъюгация.

Использовали моноклональное антитело трастузумаб фармацевтической марки (Нетсер1ш®, Коске). Буфер для антитела заменяли на 0,9% Ν;·ιΟ до концентрации 6,3 мг/мл. Получали исходный раствор АкС-ОЭ-Ж.Ъ в ΌΜδΟ, содержащем 1 мг/мл (пренебрегая примесями). К раствору антитела добавляли исходный раствор в ΌΜδΟ в соответствии с молярным отношением хелатора к антителу, составляющим 6,5:1 или менее. К реакционному раствору добавляли 0,07 М раствор буры до получения рН 9 после инкубации при 37°С в течение ночи. Полученный конъюгат очищали, и буфер заменяли в центробежном фильтровальном элементе Аписом Икта-4 (30к Μ\νίΌ (номинальное отсечение по молекулярной массе)). Аликвоты 1 мг в 100 мкл 0,9% Ν;·ιί'Ί замораживали и хранили при -18°С до применения.

Мечение.

100 мкл 0,5 М буфера NаΟАс (рН 5,5) добавляли в один флакон с 1 мг конъюгата ΛΕΏ-ΌΌ-Νί’δтрастузумаб для получения рН, подходящего для мечения. Этот раствор смешивали с 4,2-16,4 МБк ²²⁷Тк в 0,01 М НС1, и рН проверяли рН-бумагой. Крышку пробирки Эппендорфа заворачивали в алюминиевую фольгу, и пробирку помещали в термомиксер при комнатной температуре на 15 мин при осторожном перемешивании.

Затем пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин после добавления 10 мкл насыщенной ЭТРА в ΜΡ-Η₂Ο, предназначенной для поглощения остающегося свободного тория227. Конечный продукт очищали на колонке NΛΡ-5, используя ΡΒδ (фосфатно-солевой буферный раствор) для элюирования меченого конъюгата Λ^С-^^-NСδ-трастузумаб, оставляя большую часть свободных радионуклидов (торий-227 и дочерние нуклиды) и хелат ЭТРА-торий в колонке.

Колонку и элюированные фракции замеряли на НРСе-детекторе СΕΜ (15) для определения выходов реакции и удельной активности продукта. Фракцию продукта стерильно фильтровали и хранили при

- 22 026305

4°С в течение ночи.

Вторую очистку фракции продукта на колонке ΝΑΡ-5 выполняли перед применением.

Определение иммунореакционно-способной фракции.

Клетки 8К-ОУ-3 (АТСС) культивировали в стандартных условиях. Фиксированные клетки 8К-ОУ3 готовили и изучали проточной цитометрией перед применением для подтверждения присутствия НЕК2 на поверхности (данные не показаны). Обычную среду получали с помощью среды МсСоу'8 5Α (О1ВСО), добавленных 10% РВ8 (РАА) и 1% Реи/§1гер (ВюСНгот). Инкубацию клеток выполняли в СО₂инкубаторе при 37°С и 5% СО₂, используя колбы для клеток Т25 (25 см^{1 2}) и Т75 (75 см²).

Каждый эксперимент выполняли в двух повторах. Фиксированные 8К-ОУ-3 клетки суспендировали в РВ§ и переносили в пробирки Эппендорфа (10 млн клеток/пробирка). Неконъюгированный трастузумаб (Негсерйи®, 10 мкл из исходного раствора) добавляли в две упомянутые пробирки и реакцию блокирования проводили при 37°С в течение 30 мин. Эквивалентные количества ²²⁷ТЬ-АЕО-ОО^С8трастузумаб (приблизительно 500 импульсов в 1 мин) добавляли в каждую пробирку с последующей инкубацией при 37°С в течение 2,5 ч. Образцы разбавляли РВ§ с последующим центрифугированием и переносом половины надосадочной жидкости в новые пробирки Эппендорфа. Все пробирки измеряли в течение 5 мин на счетчике гамма-частиц νί/агй и количество тория-227 определяли, используя ²²⁷ТНпротокол.

Связывание в % рассчитывали так: 100·[(Ρ+¹/2δ)-(¹/2δ)]/[(Ρ+¹/2δ)+(¹/2δ)], где Р и δ представляют собой радиоактивности, измеренные в клеточном осадке и в надосадочной жидкости соответственно. Вычисление выполняют на неблокированных образцах для получения общего связывания (%) и на блокированных образцах для получения неспецифического связывания (%), и ΙΚΕ рассчитывают так: ΙΚΕ (%) = общее связывание (%) - неспецифическое связывание (%).

Данные из этого контроля качества, суммированные в табл. 4, показывают, что ²²⁷ТЬ-АЕО-ОО^С8трастузумаб связывает клетки-мишени.

Таблица 4

Результаты для контроля качества, выполненного на партиях А и В ²²⁷ТЬ-АЕО-ЭО^С8-трастузумаб, использованных потом в примерах 9 и 10 соответственно

	Выход (%)’	Извлечение (%)2	Удельная активность (Бк/мкг)3	Среднее ΙΡΡ (%)“	Среднее общее связывание (%)4	Среднее неспецифическое связывание (%)4
Партия А	60	95	10166	65	84	20
Партия В	64	92	2700	60	74	15

1. Выход (%) рассчитывают после очистки реакционной смеси на ΝΑΡ-5.

2. Извлечение (%) рассчитывают после новой очистки фракции продукта на ΝΑΡ-5.

3. Удельную активность (Бк/мкг) рассчитывают, применяя количество ²²⁷ТН (Бк), обнаруженного во фракции продукта, разделенное на количество Α^О-^^-NС8-трастузумаб (мкг), используемого в реакционной смеси.

4. ΙΚΡ оценивают согласно стандартным протоколам.

Пример 9. Исследования стабильности и эффективности ίη νίίτο Α^О-^^-NСδ-трастузумаб, меченного торием-227.

Оценивание связывания в динамике по времени.

Стабильность связывания с клетками 8К-ОУ-3 оценивали для конструкции ²²⁷ТЬ-Α^О-^^-NСδтрастузумаб измерением количества ²²⁷ТН-активности, ассоциированной с осадками клеток 8К-ОУ-3 в течение 7 суток. Результаты сравнивали с данными, полученными после инкубации со свободным ²²⁷ТН.

Клетки 8К-ОУ-3. культивированные, как описано в примере 8, в начальной стадии обрабатывали ТЬ-Α^О-^^-NСδ-трастузумабом 700 кБк или свободным ТН 700 кБк, получая в результате ТНактивность в клеточном осадке после 1 ч инкубации, соответственно 77 кБк (11%) и 7 кБк (1%) (ОТОедетектор ОЕМ(50)). ²²⁷ТН-Активность на клетках 8К-ОУ-3 измеряли ежедневно, применяя счетчик гамма-частиц νί/агй (²²⁷ТН-протокол). Измеренную радиоактивность корректировали с учетом распада. Результаты, представленные на фиг. 17, показывают, что только 20% активности, остающейся с осадком через 1 ч, теряется в течение следующих 7 суток. Напротив, клетки, обработанные свободным ²²⁷ТН, связывали только небольшую фракцию добавленного радиоактивного вещества и теряли большую его часть (приблизительно 95%) во время следующих 24 ч. Таким образом, отсутствует специфическое связывание свободного ТН с клетками 8К-ОУ-3, тогда как ТЬ-Α^О-^^-NСδ-трастузумаб эффективно сохраняется.

Оценивание цитотоксичности.

Воздействие на рост опухолевой клетки изучали в двух дополнительных анализах. В первом эксперименте метаболическую активность в клетках измеряли, используя люминесцентный реагент, связывающийся с молекулами АТФ. Таким образом, пониженный сигнал люминесценции показывает потерю метаболической активности. Во втором эксперименте подсчитывали число образовавшихся колоний.

- 23 026305

Люминесценцию измеряли ежедневно в течение 9 суток и результаты от воздействия ²²⁷ТЬ-АЬОПП-ЫС8-трастузумаб сравнивали с люминесценцией клеток §Κ-ОV-3, подвергнутых воздействию трастузумаба и свободного ²²⁷ТЬ соответственно. Клетки §Κ-ОV-3, растущие в обычной среде, использовали в качестве контроля.

В сутки 0 35 мл 500000 клеток §Κ-ОV-3/мл в обычной среде переносили в 4 колбы для клеток Т75. Эти колбы для клеток использовали для приготовления следующих анализируемых растворов: (1) Обычная среда, (2) 20 мкг/мл трастузумаба, (3) 20 кБк/мл ²²⁷ТЬ-АЬО-ЭП-МС8-трастузумаб (10166 Бк/мкг), (4) 20 кБк/мл свободного ²²⁷ТЬ. Колбы инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение 1 ч. Надосадочные жидкости отбрасывали и клетки трипсинизировали 0,25% раствором Трипсин-ЕЭТА. промывали обычной средой и центрифугировали. Клеточные осадки суспендировали в свежей стандартной среде и замеряли на счетчике гамма-частиц ΧνίζαΓύ (²²⁷ТЬ- протокол). Каждый раствор для инкубации распределяли в 7 новых колбах для клеток Т25 и инкубировали в СО2-инкубаторе.

В 1 и 2 сутки надосадочные жидкости из одной колбы каждого из четырех анализируемых растворов отбрасывали. Клеточные осадки получали как в 0 сутки и радиоактивность замеряли на счетчике гамма-частиц νίζαΓύ (²²⁷ТЬ-протокол) и на НРОе-детекторе ОЕМ(50). Все образцы разбавляли в 4 раза в обычной среде и 5x100 мкл каждой клеточной суспензии переносили в 5 лунок 96-луночного плашета У1е\у. В пять лунок добавляли 100 мкл обычной среды (без клеток) для измерения фоновой люминесценции. В заключение добавляли в каждую лунку 100 мкл реагента Се11 ТЬет-О1о и растворы перемешивали на орбитальном встряхивателе для индуцирования лизиса. Сигнал люминесценции оставляли стабилизироваться при комнатной температуре в течение 10 мин, затем люминесценцию измеряли три раза на планшетном ридере Εηνίδίοη ти1Бр1е, используя программу ЬиМ-8т§1е.

В 3 сутки готовили клетки и выполянли измерения на гамма-счетчике νίζατά и планшетном ридере Εηνίδίοη тиШр1е, как описано для 1-2 суток. Затем каждую клеточную суспензию разбавляли из-за компактного клеточного роста; ³/₄ клеточной суспензии переносили в новую колбу для клеток Т75, добавляли обычную среду и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение ночи.

В каждые из 4-9 суток четыре колбы для клеток Т75 трипсинизировали 0,25% раствором ТрипсинЕЭТА, промывали обычной средой и центрифугировали. Клеточные осадки разбавляли 4-кратно в обычной среде и отбирали порции по 100 мкл и измерения выполняли, как указано выше. Затем ³/₄ клеточных суспензий разбавляли в обычной среде, переносили в новые колбы для клеток Т75 и инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение ночи.

На фиг. 18 показаны измерения люминесценции клеток §Κ-ОV-3, обработанных ²²⁷ТЬ-АЬО-ОПЫС8-трастузумабом (10166 Бк/мкг), трастузумабом и свободным ²²⁷ТЬ, нормированные по отношению к величинам люминесценции, полученным для клеток §Κ-ОV-3, растущих в обычной среде (контроль). Сигналы люминесценции для клеток §Κ-ОV-3, обработанных ²²⁷ТЬ-АЬО-ОП-НС8-трастузумаб, постепенно уменьшались с 1 суток по 9 сутки, в то время как другие обработки показывали почти постоянные сигналы люминесценции и рост в течение этого периода. Метаболическая активность клеток §Κ-ОV-3, обработанных ²²⁷ТЬ-АЬО-ОП-НС8-трастузумабом, понижалась в динамике по времени, и на девятые сутки почти все клетки умирали. Этот результат показывает значительный и продолжительный цитотоксический эффект ²²⁷ТЬ-АЬО-ЭП-МС8-трастузумаб.

Клоногенный анализ выполняли для оценивания роста клеточных колоний после подвергания одних клеток потенциально цитотоксическим условиям. Клетки §Κ-ОV-3 инкубировали при разных концентрациях ТЬ-АБО-ОП-ЫСЗ-трастузумаб, трастузумаба или свободного ТЬ в течение 1 ч, с последующей инкубацией в течение 12 суток для индуцирования роста колоний.

Препараты клеток делали, как указано выше и в каждом образце 12000 клеток в 5 мл обычной среды переносили в колбу Т25. Изучали воздействие 3 количеств каждого реагента для ²²⁷ТЬ-АЬО-ОП-НС8трастузумаб и ²²⁷ТЬ, 5, 10 и 20 кБк/мл, и для трастузумаба 5, 10 и 20 мкг/мл (конечные концентрации) соответственно. Готовили одну контрольную колбу. Все 10 колб для клеток Т25 инкубировали в СО₂инкубаторе в течение 1 ч. Надосадочные жидкости отбрасывали, и клетки промывали обычной средой, трипсинизировали 0,25%-ным раствором Трипсин-ЕИТА, промывали обычной средой и центрифугировали. Клеточные осадки суспендировали в обычной среде и каждую из десяти клеточных суспензий разделяли на 6 новых колб для клеток Т25; 3 колбы для клеток по 1000 клеток и 3 колбы для клеток по 3000 клеток. Полученные 60 колб для клеток Т25 инкубировали в СО₂-инкубаторе до тех пор, пока колонии не достигали видимого размера (приблизительно 50 клеток/колония). После инкубации в течение 12 суток среду удаляли. Клетки промывали РВ§, фиксировали этанолом, окрашивали 0,25% трипановым синим в РВ§, промывали водопроводной водой и в заключение сушили при 45°С в течение ночи. Колонии подсчитывали вручную и среднее количество колоний в каждом инкубированном растворе отображали графически.

Результаты, представленные на фиг. 19 и 20, показывают что 1-часовая инкубация с ²²⁷ТЬ-АЬО-ОПЫС8-трастузумаб приводила к эффективному умерщвлению клеток §Κ-ОV-3. Инкубация со свободным ²²⁷ТЬ могла иметь некоторый эффект в умерщвлении клеток, не очевидный в первом анализе на цитотоксичность, где используют большее количество клеток. Инкубация с трастузумабом не имела негативного воздействия на клеточный рост.

- 24 026305

Пример 10. Нацеливание на опухоль ίη νίνο Α^Ο-^^-NСδ-трастузумаба, меченного торием-227.

100 мкл (15 кБк) стерильно фильтрованного ^2ГТ11-ЛЕО-ОО-Ж.Ъ-трастузумаба (2700 Бк/мкг) инъецировали в латеральную хвостовую вену десяти голых мышей Ва1Ь/е с ксенотрансплантатами δΚ-ОУ3. Пять мышей умертвляли через 24 ч и других пять через 4 суток и интересующие органы вырезали и взвешивали. Все образцы и 3 стандартных раствора, содержащих 10% ИД/г, замеряли в течение 5 мин на гамма-счетчике νί/агб (²²⁷ТЬ-протокол). Результаты выражали в виде % инъецированной дозы (ИД) на грамм ткани (% ИД/г).

Результаты, показанные на фиг. 21, подтверждают, что ²²⁷ТЬ-Α^Ο-^^-NСδ-трастузумаб связывается конкретно с опухолью. Величины поглощения были умеренными, но накопление слегка увеличивались от 24 ч до 4 суток (от 8,7% ИД/г до 11,3% ИД/г), в то время как концентрация в крови понижалась до примерно 1 % ИД/г.

Накопление в черепе и бедре также слегка увеличивались от 24 ч до 4 суток, но эти величины были обычно низкими (2,8-3,2%, 24 ч), показывая очень мало свободного ²²⁷ТЬ, циркулирующего в системе, означая таким образом высокую степень стабильности комплекса ²²⁷ТЬ-Α^Ο-^^-NСδ-трастузумаб. Дополнительное подтверждение для этого вывода оказывается высокой вероятностью, что фракция радиоактивного вещества, измеренного в черепе и бедре, вызывается накоплением дочернего нуклида ²²³Ка. Некоторое количество этого ²²³Ка может быть обнаружено в окне выше порогового значения, специфического для ²²⁷ТЬ-измерения на гамма-счетчике Ж1/аг6, поэтому рассчитанные величины % ИД/г для черепа и бедра могут быть завышенными количеством ²²⁷ТЬ-Α^Ο-^^-NСδ-трастузумаба, накопленного в этих тканях.

Пример 11. Получение хелатирующей группировки.

Получение 3 -бензилокси-1 -метил-4-(2-тиоксотиазолидин-1-ил)карбонил-2(1Н)-пиридинона (структуры А).

Стадия 1. 1-Метил-3-гидрокси-2(1Н)-пиридинон.

3- Гидрокси-2(1Н)-пиридинон (34,44 г, 0,31 моль) и йодметан (75 г, 0,53 моль) помещают в 80 мл тефлоновый контейнер с крышкой и нагревают до 150°С в течение примерно 48-60 ч в бомбе Парра. Охлажденную бомбу открывают и избыток йодметана декантируют. Полученное густое темное масло смешивают с сульфитом натрия (64 г, 0,5 моль) и растворяют в 300 мл воды с образованием бледнокоричневого раствора. Раствор нейтрализуют до рН 7-8 и фильтруют для удаления нерастворимых примесей. Затем фильтрат экстрагируют метиленхлоридом (4x100 мл). Потом объединенные экстракты сушат, наносят на флэш-силикагелевую пробку (6x8 см) и элюируют 4% метанола в метиленхлориде. Растворитель удаляют с получением указанного в заголовке соединения (24,3 г, 62,6%) в виде бесцветных кристаллов.

Стадия 2. 4-Карбокси-1-метил-3-гидрокси-2(1Н)-пиридинон.

1-Метил-3-гидрокси-2(1Н)-пиридинон (1) (6,25 г, 50 ммоль) смешивают с безводным карбонатом калия (36 г, 0,26 моль) и сушат в вакууме. Затем смесь нагревают до 175-185°С в течение 3 суток в бомбе Парра в атмосфере сухого газообразного диоксида углерода (850 фунт на кв.дюйм (примерно 5,86 МПа)). Охлажденную бомбу открывают, и полученное бледно-желтое твердое вещество растворяют в ледяной воде и подкисляют 6 н. НС1 с получением бежевого кристаллического продукта.

Стадия 3. 3-Бензилокси-4-карбокси-1-метил-2(1Н)-пиридинон.

4- Карбокси-1-метил-3-гидрокси-2(1Н)-пиридинон (6,8 г, 0,04 моль) смешивают с бензилхлоридом (12,1 г, 0,088 моль) и безводным карбонатом калия (13,8 г, 0,1 моль) в безводном диметилформамиде (ΌΜΡ) (120 мл). Смесь нагревают в темноте в атмосфере азота до 75-80°С в течение 16 ч. Затем полученную смесь фильтруют, и растворитель выпаривают с получением темного масла. Масло очищают путем нанесения на силикагелевую пробку (6x8 см) и элюирования 4% метанола в метиленхлориде, получая 3бензилокси-4-бензилоксикарбонил-1-метил-2(1Н)-пиридинон в виде бледно-желтого густого масла. Его переносят в метанол (50 мл) и 6 М раствор №ОН (10 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч с последующим упариванием досуха. Остаток растворяют в воде (100 мл) и подкисляют 6 М раствором НС1 до рН 2 с получением указанного в заголовке соединения (9,3 г, 88,7%) в виде белого кристаллического продукта.

Стадия 4. 3-Бензилокси-1-метил-4-(2-тиоксотиазолидин-1-ил)карбонил-2(1Н)-пиридинон.

К раствору 3-бензилокси-4-карбокси-1-метил-2(1Н)-пиридинона (1,05 г, 4 ммоль), 2меркаптотиазолина (0,50 г, 4,2 ммоль) и каталитического количества 4-диметиламинопиридина (ΌΜΛΡ) в сухом дихлорметане (50 мл) добавляют Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ИСС) (0,86 г, 4,2 ммоль). После перемешивания в течение 4 ч твердые частицы дициклогексилмочевины (ИСи) удаляют фильтрованием. Затем желтый фильтрат упаривают на роторном испарителе с получением желтого твердого вещества. После кристаллизации из смеси изопропиловый спирт-метиленхлорид получают указанное в заголовке соединение (структура А, 1,16 г, 80,4%) в виде ярко-желтых кристаллических пластинок.

- 25 026305

Структура А

Пример 12. Получение 3,2-НОРО предшественника для формулы VIII.

Получение циклической соли (структуры 5) осуществляют согласно следующей схеме:

1. РМСНгВг, К₂СОз,

ОН

I

ΌΕΐ

С$Р, ΟΗ^ΟΝ, нагревание с обратным холодильником, 74%

1. (СНзЗОаЬО, Ε1₃Ν, ΟΗ^ΟΙΐ, от 0^йС до КТ 2. СНС1₃, КТ, 92%

О О ^Η0'τΛν·^^ΛΟΕΙ

СНзС1Ч, нагревание с обратным холодильником

2. ВНз'ТНР, КТ, *

90% (обе стадии)

ВпО о->

Βθχψ

Фторид цезия (10 мол.%), способствующий реакции Михаэля 2,3-дигидроксипиридина (2,3-ΌΗΡ) 1 с этилакрилатом в ацетонитриле при нагревании с обратным холодильником, дал соответствующий сложный эфир 2 с хорошими выходами. Последующее О-бензилирование 2 в стандартных условиях (К₂С0₃/ацетонитрил/нагревание с обратным холодильником) с дальнейшим восстановлением сложноэфирной группировки (ВН3-ТНР (ВН3-тетрагидрофуран), КТ) привели, после хроматографии, к спирту 3 с 90%-ным выходом. Обработка спирта 3 метансульфоновым ангидридом в дихлорметане в присутствии триэтиламина привела непосредственно к образованию желаемой циклической соли 5 (примерно 8590%) вместе с некоторым количеством промежуточного мезилата 4 (примерно 10-15%), как определено 'Н ЯМР спектральным анализом. Полного превращения в циклическую соль 5 можно было достичь путем перемешивания смеси неочищенных продуктов реакции мезилирования в хлороформе при комнатной температуре. После растирания с горячим этилацетатом соль 5 выделяли в виде бледно-белого твердого вещества с 92%-ным выходом и высокой чистотой.

Пример 13. Получение соединения формулы VIII.

Соль 5 (0,2 г) добавляют к 1,2 экв. циклена (1,4,7,10-тетраазациклододекан) в присутствии триэтиламина в ацетонитриле (3 мл) и нагревают при 60°С в течение 2 суток в атмосфере азота. Затем реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (50 мл) и промывают насыщенным ЫаНС0₃ (50 мл). Водный слой еще раз экстрагируют дихлорметаном (25 мл). Объединенные органические экстракты сушат сульфатом натрия, растворитель удаляют в вакууме и избыток Ν-метилбензиламина удаляют с помощью вакуумной перегонки с получением VIII.

Пример 14. Получение соединения формулы IX.

К раствору 3-бензилокси-1-метил-4-(2-тиоксотиазолидин-1-ил)карбонил-2(1Н)-пиридинона в метиленхлориде добавляют соответствующий функционализированный ЦЦ№,№-тетракис(2аминоэтил)этилендиамин (структуру В, причем Ζ представляет собой защитную группу). После перемешивания в течение 4 ч смесь фильтруют досуха.

Подходящий бензил-защищенный продукт-предшественник выделяют из реакционной смеси на флэш-колонке с диоксидом кремния с использованием пропанола в метиленхлориде. Конечный продукт со структурой IX будет доступен после кислотного снятия защиты с гидроксильных групп.

Пример 15.

Используя стандартные способы, специалисты в данной области техники конъюгируют структуру

VIII с молекулой, обеспечивающей направленную доставку. Например, применяя стандартные условия,

Ν-гидроксисукцинимидный (ΝΗδ) эфир получают и конъюгируют с белками и пептидами, и полученный конъюгированный белок выделяют с использованием гель-фильтрации.

- 26 026305

Пример 16. Мечение конъюгированного белка торием-227.

мг/мл раствор конъюгированного белка (имеющего октадентатный лиганд, присоединенный посредством связывающей группировки) готовят в подходящем буферном растворе, например 0,5 М буфере ЫаОЛс (рН 5,5), и метят очищенным торием-227 при 25°С в течение 1 ч с последующей стадией очистки на гель-фильтрационной колонке.

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Комплекс, обеспечивающий направленную доставку тория-227 к ткани, содержащий обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку, выбранную из антител, конструкций антител, фрагментов антител, конструкций фрагментов или их смеси, пептида, аминокислоты, стероидного или нестероидного гормона, фолата, эстрогена, тестостерона или биотина;

   октадентатный гидроксипиридинон-содержащий лиганд формулы VI или VII связывающую группировку, посредством которой октадентатный гидроксипиридинон-содержащий
2. 2. Применение комплекса по п.1 в изготовлении лекарственного средства для лечения гиперпластического или неопластического заболевания.
3. 3. Применение по п.2, где указанное заболевание представляет собой карциному, саркому, миелому, лейкемию, лимфому или раковое заболевание смешанного типа.
4. 4. Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс по п.1 вместе по меньшей мере с одним фармацевтическим носителем или эксципиентом.
5. 5. Набор для использования в способе лечения организма человека или животного, не являющегося человеком, который содержит обеспечивающую направленную доставку к ткани группировку, выбранную из антител, конструкций антител, фрагментов антител, конструкций фрагментов или их смеси, пептида, аминокислоты, стероидного или нестероидного гормона, фолата, эстрогена, тестостерона или биотина, конъюгированную при помощи связывающей группировки с октадентатным гидроксипиридинон-содержащим лигандом формулы VI или VII где связывающая группировка выбрана из

   - 27 026305 и 4+ ион альфа-излучающего радионуклида тория-227.
6. 6. Применение комплекса, обеспечивающего направленную доставку тория-227 к ткани, по п.1 в лечении гиперпластического или неопластического заболевания.
7. 7. Применение по п.6, где указанное заболевание представляет собой карциному, саркому, миелому, лейкемию, лимфому или раковое заболевание смешанного типа.