KR102071563B1 - 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물 - Google Patents
진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Rg2 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 제조하고, NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능, PGE2(Prostaglandin E2) 생성 억제 효능, 전구염증매개 효소 iNOS, COX-2 발현 억제 효능, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 억제 효능 및 NF-κB 발현 억제효능을 통해 항염증 효능을 보유한 인삼발효분말을 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 제조하고, NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능, PGE2(Prostaglandin E2) 생성 억제 효능, 전구염증매개 효소 iNOS, COX-2 발현 억제 효능, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 억제 효능 및 NF-κB 발현 억제효능을 통해 항염증 효능을 보유한 인삼발효분말을 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 제조하고, NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능, PGE2(Prostaglandin E2) 생성 억제 효능, 전구염증매개 효소 iNOS, COX-2 발현 억제 효능, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 억제 효능 및 NF-κB 발현 억제효능을 통해 항염증 효능을 보유한 인삼발효분말을 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.
인삼은 두릅나무과의 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로써, 이러한 인삼의 효능은 신진대사 촉진 작용, 혈당강하, 혈압강하, 면역력 향상, 암세포 억제, 피로 회복 및 노화 방지 효능을 보유하고 있다.
이는 인삼에 존재하는 활성성분인 진세노사이드(Ginsenoside)에 의한 효능으로써, 진세노사이드는 구조에 따라 프로토파낙사다이올계 진세노사이드 (Protopanaxadiol-type ginsenoside), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드 (Protopanaxatriol-type ginsenoside), 그리고 올레아난계 진세노사이드 (Oleanane-type ginsenoside)로 분류된다.
진세노사이드 흡수율을 측정한 식약처 자료에 따르면 실험대상자의 25%가 장내 미생물의 효소 비활성화로 인해 진세노사이드를 온전히 혈액으로 흡수하지 못했다. 또한, 진세노사이드를 흡수했다 하더라도 개인별로 효능에 대한 차이를 보였으며 성별 및 나이와는 관련이 없는 것으로 나타났다. 이는 인삼의 효능이 사람마다 다른 이유가 장내 미생물 때문이라는 결론을 도출하고 있다.
자연 상태의 진세노사이드는 장내 미생물에 의해 체내에서 흡수 가능한 물질로 전환되어야만 그 효능을 나타내는데 이 물질이 바로 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성물질인 컴파운드케이(Compound K)다.
즉, 여러 당분자로 결합되어 있는 자연 상태의 사포닌이 장내 미생물의 분해효소에 의하여 당분자 하나만 결합된 컴파운드케이(Compound K)로 전환되어야만 체내 흡수가 제대로 이루어지고 생리활성 효능도 얻을 수 있다.
프로토파낙사다이올계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rd, Rc, Rg3 및 Rh2는 compound K로 변환되어, 체내 사포닌의 흡수율을 증진된다. 이는 장내미생물에 의해 진세노사이드의 당이 제거되어 생성되는 물질로, 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성물질인 컴파운드 케이(Compound K)가 담즙과 함께 체내로 흡수되며, 항암효능을 보유하고 있다.
반면, 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드는 Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1로 구성되어 있으며, 특히 Rg2는 혈소판 응집억제에 항혈전효능, 부신피질의 catecholamine류의 스트레스성 호르몬의 분비를 억제하는 효능을 보유하고 있다.
이러한 진세노사이드를 함유하는 인삼은 수삼(fresh ginseng)을 그대로 사용하거나, 백삼, 홍삼, 흑삼과 같이 가공하여 함유량이 낮은 진세노사이드의 함량을 증진시켜 효능을 극대화 하는 것으로 알려져 있다.
따라서 최근 가공된 인삼에 존재하는 미량의 진세노사이드 함량을 증진시키기 위한 연구가 활발히 수행되고 있다.
대한민국 등록특허 10-0945586호는 상황버섯 균사체로 발효시켜 다양한 생리활성을 갖는 진세노사이드 대사체를 다량 함유하는 인삼발효분말 또는 발효홍삼의 제조방법을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 10-1787543호는 발효배양 산삼을 포함하는 항염증 조성물에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 특허는 프로바이오틱스 및 효소를 이용한 진세노사이드 Rg2 가 증진된 인삼발효분말 제조방법에 대해서는 개시하고 있지 않으며, 상기 인삼발효분말의 항염증 효능에 대해 개시하고 있지 아니하다.
이에 본 발명자는 인삼을 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 발효함으로써, Rg2가 증진된 인삼발효분말을 제조하고, 인삼발효분말의 항염증 효능을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 Rg2 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 제조하고, NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능, PGE2(Prostaglandin E2) 생성 억제 효능, 전구염증매개 효소 iNOS, COX-2 발현 억제 효능, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 억제 효능 및 염증성 NF-κB 발현 억제효능을 통해 항염증 효능을 보유한 인삼발효분말을 포함하는 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 상기 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말은, 인삼을 선정하고 세척하는 단계; 상기 세척된 인삼을 0.1~1cm로 절단하는 단계; 상기 절단된 인삼에 정제수를 혼합하고, 효소균주 혼합물을 접종하여 30~60℃에서 5일간 발효하는 단계; 및 상기 인삼 발효액을 농축, 건조, 분쇄하여 인삼발효분말을 제조하는 단계를 포함하여 제조되고, 진세노사이드 Rg2 50~60mg/g을 함유하는 인삼발효분말 인것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 상기 효소균주 혼합물은 사이톨라제 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피-플로(Pyr-Flo), 라피다아제 씨80맥스(Rapidase C80Max), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC)로 이루어진 군에서 선택된 1종의 효소와, 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 상기 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말은 RAW 264.7 대식세포 2 ×105 cells/㎖ 기준으로 39~156μg/ml 함유하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 상기 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말은 NO(Nitric oxide) 생성 억제 효능, PGE2(Prostaglandin E2) 생성 억제 효능, 전구염증매개 효소 iNOS, COX-2 발현 억제 효능, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-β, IL-6 발현 억제 효능, 염증성 NF-κB 발현 억제효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 항염증 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 유효성분으로 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명의 효과는 Rg2 강화된 인삼발효분말을 함유하는 항염증 조성물을 제공할 수 있다. 더욱 상세하게는 프로바이오틱스와 효소를 이용하여 인삼을 발효하여 Rg2가 강화된 인삼발효분말을 제조하고, 항염증 효능을 보유한 인삼발효분말을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 인삼을 프로바이오틱스와 효소로 발효함으로써, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 Rg2가 증진된 결과를 도시한 것이다.
도 2는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 NO 생성이 억제되는 결과를 도시한 것이다.
도 3은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 PGE2 생성이 감소한 결과를 도시한 것이다.
도 4은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 iNOS와 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 5는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 iNOS-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 6은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 7은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α 이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 8은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 9는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 10은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 11은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 12는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 13은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 처리하여 염증관련 NF-κB의 핵으로 이동을 관찰한 결과, 핵으로 이동하는 단백질 발현량이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 2는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 NO 생성이 억제되는 결과를 도시한 것이다.
도 3은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 PGE2 생성이 감소한 결과를 도시한 것이다.
도 4은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 iNOS와 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 5는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 iNOS-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 6은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 7은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α 이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 8은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 9는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 10은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 11은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 12는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 13은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 처리하여 염증관련 NF-κB의 핵으로 이동을 관찰한 결과, 핵으로 이동하는 단백질 발현량이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 1. 진세노사이드 Rg2 가 증진된 인삼발효분말 제조방법
본 발명의 인삼발효분말은 상기 방법에 따라 인삼발효분말을 제조하였다.
1) 인삼을 선정하고 세척하는 단계;
상기 인삼 발효에 사용되는 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginsneng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis) 중의 하나 이상을 포함하되, 산삼, 수삼, 홍삼, 백삼, 미삼, 인삼 잎, 인삼열매, 홍삼추출물, 산삼줄기세포, 산삼캘러스, 인삼줄기세포, 인삼캘러스, 산삼배양근, 부정근, 장뇌삼 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 인삼은 4~6년근 수삼을 선정하여 세척한다.
2) 상기 세척된 인삼을 0.1~1cm로 절단하는 단계;
상기 세척된 인삼을 0.1~1cm 로 절단하는 단계이다. 상기 절단을 통해 효소균주 혼합물을 접종하여 발효할 경우, 접촉면적이 증가하여 발효효율이 증진된다.
3) 상기 절단된 인삼에 정제수를 혼합하고, 효소균주 혼합물을 접종하여 30~60℃에서 5일간 발효하는 단계;
상기 절단된 인삼에 정세수를 혼합하여 반응액을 제조한다. 그리고, 펙티나아제(pectinase)계열에서 선택된 효소와, 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 균주를 포함하는 효소균주 혼합물을 상기 반응액에 접종하고, 배양하는 배양단계를 포함하여 발효 인삼을 제조한다.
상기 펙티나아제 계열의 효소는 사이톨라제 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피-플로(Pyr-Flo), 라피다아제 씨80맥스 (Rapidase C80Max), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC)로 이루어진 군에서 선택된 1종을 효소를 사용한다.
바람직하게는 사이톨라제 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피-플로(Pyr-Flo), 라피다아제 씨80맥스 (Rapidase C80Max), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC)로 이루어진 군에서 선택된 1종을 효소와, 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 균주 GB-07를 1:1로 혼합하여 제조한 효소균주를 제조한다.
상기 절단된 인삼에 정제수를 혼합하고, 효소균주 혼합물을 접종하여 30 ~ 60 ℃에서 5일 간 발효한다. 효소균주 혼합물을 10~20중량부 접종하여 발효한다.
4) 상기 인삼 발효액을 농축, 건조 및 분쇄하여 인삼발효분말분말을 제조하는 단계
상기 인삼 발효액 농축방법은 진공농축, 저온 진공농축의 방법으로 추출물을 농축하는 단계이다.
건조 방법은 저온진공건조는 건조기 내부의 압력을 진공으로 유지하고, 온도를 5~15℃ 정도로 조절하여 건조하는 방법으로, 추출성분의 변성이 없고, 맛과 향도 소실되지 않는다. 또한, 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 감압건조의 방법이 이용될 수도 있다.
분쇄방법은 일정크기로 분말화하여 인삼분말을 완성하는 단계로서, 상기 건조된 인삼 발효액을 커터밀 (cutter mill), 제트밀(jet mill), 하이제트밀(hi jet mill)을 이용하여 분말화하여 인삼발효분말을 완성하게 된다.
실험예 1. 발효된 인삼의 Rg2 분석
상기 펙티나아제 효소와 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 균주를 1:1로 혼합한 효소균주 혼합물을 이용하여 제조한 발효인삼의 진세노사이드 Rg2를 분석하였다.
HPLC 분석은 YL 9100 HPLC system이 사용되었고, YMC-Triart C18 컬럼(길이 250mm, 내경 4.6mm)이 사용되었다. 검출기의 검출파장은 UV 230nm, 컬럼온도는 35℃에서 분석되었고, 이동상(mobile phase)은 아세토니트릴과 물을 사용하여 유속(flow rate) 0.8mL/min으로 분석되었다.
|
|
시료 |
Area |
샘플량(g) |
Rg2 함량(mg/g) |
평균(mg/g) |
편차(mg/g) |
| 인삼 |
0.09 |
0.09 |
||||
| 인삼발효 분말 |
503.33 |
1.0162 |
1.0162 |
53.61 |
53.40 |
0.19 |
| 547.68 |
1.1103 |
1.1103 |
53.35 |
|||
| 502.14 |
1.0210 |
1.0210 |
53.23 |
상시 표 1의 결과에 따르면 인삼 대비하여 발효된 인삼의 Rg2 함량이 증가한 것을 확인 할 수 있다.
도 1은 인삼을 프로바이오틱스와 효소로 발효함으로써, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 Rg2가 증진된 결과를 도시한 것이다.
일반인삼은 0.09 mg/g의 낮은 함량의 Rg2를 보유하고 있으나, 발효된 인삼은 53.04 mg/g 로 측정되어 Rg2의 함량이 증진되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 인삼발효분말의 NO(Nitric oxide) 생성 억제 평가
인삼발효분말의 LPS에 의한 염증을 억제하는 효능을 알아보기 위해, NO(Nitric Oxide) 생성능을 RAW 264.7 대식세포를 이용하여 관찰하였다.
시료가 LPS가 유도한 NO 생성 억제 영향을 측정하기 위하여 ELISA 분석을 수행 하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 2.0 × 105 cell/ml로 조절한 후 24well plate에 분주 배양하고, LPS(500ng/ml)를 처리하고 1시간 후 추출물 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 하였다. 생성된 NO는 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide,0.1% (w/v) naphylethyleneduamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]를 사용하여 세포배양액에 녹아있는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양액 100ul와 Griess시약 100ul를 혼합하여 96 well plate에서 20분간 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 NO 생성이 억제되는 결과를 도시한 것이다. 도 2를 참조하면, LPS에 의해 과생성된 NO를 지칭개 추출물 39~156 μg/ml 의 농도에서 억제하는 것을 알 수 있다.
실험 결과, 인삼발효분말을 39~156 ug/mL 농도별로 처리하였을 때, NO 생성능은 감소하는 경향을 보였다. 따라서 인삼발효분말은 농도 의존적으로 NO 생성량을 감소시킨다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예 3. 인삼발효분말의 PGE
2
(Prostaglandin E
2
) 생성 억제 평가
시료가 LPS가 유도한 PGE2 생성 억제 영향을 측정하기 위하여 ELISA 분석을 수행 하였다. RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 2.0 × 105 cell/ml로 조절한 후 24well plate에 분주 배양하고, LPS(500ng/ml)를 처리하고 1시간 루 추출물 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 하였다. PGE2의 측정은 PGE2 ELISA kit(R&D Systems)를 이용하여 정량하였으며, standard에 대한 표준곡선의 R2 값은 0.99이상이었다.
도 3은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 PGE2 생성이 감소한 결과를 도시한 것이다.
도 3을 참조하면 LPS가 과도하게 생산한 PGE2의 생산을 인삼발효분말 39~125 ㎍/ml 의 농도에서 억제하는 결과를 확인 하였다.
실험예 4. 전구염증매개 효소 발현 측정
4-1. 실험 과정
염증을 유발하는 전구염증매개 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험과 리얼타임 PCR 실험으로 측정함으로써, 인삼발효분말의 LPS에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
인삼발효분말을 1시간 동안 전처리한 후에, LPS를 1 ug/mL 처리하여 염증이 유도된 Raw264.7 세포 1×106 개를 100 ㎜ 페트리디쉬에서 24시간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제(Proteaseinhibitor cocktail, Roche, USA)를 함유한 단백질 용출용액(CelLyticTM-MT Tissue Lysis Reagent, Sigma, USA)을 사용하여 균질화하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다.
분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료에서 40 ug 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였다.
상기 분리된 단백질을 겔 한 장당 50 mA의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지분유로 차단(blocking)시킨 다음, 1차 항체[항-iNOS 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-COX-2 항체(1:1 000, Santa Cruz Biotechnology, USA),또는 항-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)] 및 2차 항체(항토끼-IgG HRP; Amersham Biosciences, UK)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출 시켜 감광하였다.
4-2. 실험 결과
도 4은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 iNOS와 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 5는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 iNOS-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 6은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 mRNA인 COX-2 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
실험 결과, 인삼발효분말을 39~156 ug/mL 처리하였을시 농도가 증가함에 따라 iNOS 및 COX-2의 발현 정도가 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.
실험예 5. 인삼발효분말이 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성에 미치는 영향
5-1. 실험 과정
염증성 사이토카인의 염증매개물질은 세포 상층액에서 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법으로 정량하였다. ELISA는 BD pharmingen (CA, USA)에서 Mouse ELISA kit for TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 구입하여 시행하였다.
LPS로 유도한 대식세포에서 염증 발생 시, 인삼발효분말이 염증성 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 ELISA 방법을 이용해 전 염증성 사이토카인의 단백질 수준을 측정하였다. 인삼발효분말을 1시간 전 처리한 후 RAW 264.7 cell을 24시간 동안 LPS로 자극 하였다.
5-2. 실험 결과
도 7은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α 이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 9는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 11은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
전 염증성 사이토카인의 발현을 측정한 결과, 인삼발효분말 처리군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성을 유의성있게 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 인삼발효분말이 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 에서 미치는 영향
6-1. 실험 과정
세포를 획득한 후, Easy Blue (intron biotechnology, USA)용액을 1 ml 넣어서 세포를 용해시킨 후 100 ㎕의 chloroform 용액을 가하고 잘 섞어준 뒤 원심분리하여 상층액을 취한다. 그 후 2-propanol과 섞은 뒤 원심 분리하여 위에 상층액은 버리고 남은 침전물에 80% ethanol로 2회 씻고 침전물을 건조시켰다. 그리고 침전물에 DEPC 처리한 증류수를 넣어 RNA를 용해시키고 정량하였다.
RNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, Real time PCR master mix 4 ㎕ (ABI), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다. PCR 조건은 92℃에서 30초, 58℃에서 45초, 그 후에 72℃에서 30초를 35 cycle로 하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 customtaqmanprobe (Cat.#4331182) 및 TaqMan master mix는 ABI (CA, USA)에서 구입하였다.
6-2. 실험결과
인삼발효분말이 mRNA 수준에서도 전 염증성 cytokine의 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 인삼발효분말을 1시간 전 처리 한 후 RAW 264.7 cell을 24시간 동안 LPS로 자극 하여 IL-1β,IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 정량적 중합 효소 반응 방법으로 측정하였다.
그 결과 인삼발효분말을 전 처리한 군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
도 8은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 TNF-α mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 10은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-1β mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
도 12는 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 염증관련 사이토카인인 IL-6 mRNA 발현이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
실험예 7. 인삼발효분말이 NF-κB기전 활성 미치는 영향 :Western blot analysis
7-1. 실험 과정
RAW 264.7 세포를 획득하여 RIPA lysis buffer를넣어단백질을 lysis 하고, 원심분리 (15,000 rpm, 20 min)하여 pellet으로 단백질을 정량하였다. 동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼 (4X)를 같이 넣어 섞은 다음 샘플을 전기영동 한 후 membrane에 옮기고 나서 5% skim milk로 2 시간 blocking 하였다. Iκ-Bα와 β-actin은 ECL detection 용액 (Amersham) 으로 확인하였다.
4% paraformaldehyde로 세포를 고정 한 후, 0.1% Triton-100으로 permeabilization을 하고, 1% FBS로 2 시간 blocking 하였다. NF-κB의 p65항체를 overnight 반응 후, Alexa 488 goat anti-mouse 항체를 2시간 반응 시켰다. 세포의 핵은 DAPI (Sigma, MO, USA) (5 mg/ml) 사용하여 5분간 염색하고, prolong gold anti-fading mount solution (invitrogen, CA, USA)를 이용하여 mounting하였다. 그 후 Flourscence microscopy (Olympus X 70, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
7-2.실험결과
RAW 264.7 세포가 LPS에 의하여 염증이 일어나게 되면 다양한 신호 전달 기전에 의하여 염증성 매개물질들을 분비하게 되는데, 대표적인 경로로 NF-κB가 있다.
NF-κB는 염증에서 염증성 매개물질을 조절하는 중요 전사 인자이다. NF-κB는 일반적으로 염증 반응이 없을 시, inhibitory kappaB (Iκ-B)단백질과 결합 되어있는데, LPS에 의하여 염증이 발생하여 NF-κB가 활성화 되면, Iκ-Bα가 분해되고, NF-κB는 핵 내로 이동하여 여러 염증성 매개물질의 생성을 유도하게 된다.
인삼발효분말은 LPS에 의하여 염증이 활성화된 RAW 264.7 세포에서 Iκ-Bα의 분해를 억제하였고, NF-κB의 핵 내로의 이동을 억제하였다. 이는 NF-κB활성을 인삼발효분말이 억제하였고, 이를 통하여 염증성 매개물질을 억제하였음을 보여준다.
인삼발효분말이 LPS에 의한 염증이 발생하여 Iκ-Bα 분해를 억제하는 실험결과를 나타낸 도면이다. 또한, NF-κB의 활성화 지표인 NF-κB의 핵 내로의 이동을 인삼발효분말이 억제하였다.
도 13은 LPS로 인해 염증이 유발된 대식세포에서, (a)인삼, (b) 인삼발효분말에서 처리하여 염증관련 NF-κB의 핵으로 이동을 관찰한 결과, 핵으로 이동하는 단백질 발현량이 감소되는 결과를 도시한 것이다.
실험예에 따른 실험결과 분석
인삼발효분말의 항염증 효능을 확인하였다. 상기 실험예들을 진행하여 분석한 결과, 인삼발효분말은 39~156 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 nitrite의 생성을 억제, IL-1β, IL-6, TNF-α와 같은 염증성 cytokine의 생성을 억제, Iκ-Bα, p65의 분해 억제를 통해 NF-κB의 핵전이를 억제하는 것으로 나타났다.
인삼발효분말을 전 처리한 후 LPS로 대식세포를 자극하였을 때, 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개물질이 농도의존적으로 개선되었으며, 이는 인삼발효분말이 염증 반억제에 유효한 반응을 보였음을 보여준다.
NF-κB는 염증에서 염증성 매개물질을 조절하는 중요 전사 인자이다. NF-κB는 일반적으로 염증 반응이 없을 시, inhibitory kappaB (Iκ-B)단백질과 결합 하여 존재한다.
그러나 LPS에 의하여 염증이 발생하여 NF-κB가 활성화 되면, Iκ-Bα가 분해되고, NF-κB는 핵 내로 이동하여 여러 염증성 매개물질의 생성을 유도하게 된다. 상기 실험예에서 확인 된 바, 인삼발효분말이 Iκ-Bα 분해를 억제하였고, NF-κB의 핵 내로의 이동을 억제하였다. 이는 NF-κB활성을 인삼발효분말이 억제하였고, 이를 통하여 염증성 매개물질을 억제하였음을 보여준다.
따라서 인삼발효분말은 염증 반응에 있어서 가장 중요한 염증성 사이토카인 및 염증성 매개물질을 억제하여 항염증 조성물로서 응용할 수 있다.
Claims (6)
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- 인삼을 선정하고 세척하는 단계;
상기 세척된 인삼을 0.1~1cm로 절단하는 단계;
상기 절단된 인삼에 정제수를 혼합하고, 효소균주 혼합물을 접종하여 30~60℃에서 5일간 발효하는 단계; 및
상기 인삼 발효액을 농축, 건조 및 분쇄하여 인삼발효분말을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 효소균주 혼합물은 펙티나아제 효소와, 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 균주를 중량비 기준으로 1:1로 혼합하고,
상기 인삼발효분말은 진세노사이드 Rg2 50~60mg/g을 함유하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg2가 강화된 인삼발효분말의 제조방법.
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