KR20220009830A - 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 진세노사이드 컴파운드 K의 함량이 증가된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 조성물은, 세척된 인삼을 건조시키고, 분쇄시켜 분말화시키는 분말화단계; 상기 분말을 정제수와 혼합시킨 다음, 균주를 접종한 뒤에 발효시킨 다음 균주를 불활성화시키는 발효단계; 혼합물에 펙티네이즈 계열의 효소를 첨가한 뒤에 반응시키는 효소반응단계; 및 혼합물을 원심분리하여 고형분을 제거하는 고액분리단계를 통해 제조된다.
이에 따라, 마이너 진세노사이드인 컴파운드 케이 및 컴파운드 와이의 함량을 급격하게 상승시킬 수 있다. 또한, 면역세포인 NK 세포를 활성화시킴으로써 문제가 되는 타겟 세포의 세포사멸을 유도할 수 있고, 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 시 발생하는 NO를 감소시킬 수 있으며, splenocyte에서의 타겟 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 혈청 내의 immunoglobulin의 농도를 증가시킬 수 있고, Th1 세포를 활성화시키는 등 면역력을 증진시킬 수 있다.
이에 따라, 마이너 진세노사이드인 컴파운드 케이 및 컴파운드 와이의 함량을 급격하게 상승시킬 수 있다. 또한, 면역세포인 NK 세포를 활성화시킴으로써 문제가 되는 타겟 세포의 세포사멸을 유도할 수 있고, 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 시 발생하는 NO를 감소시킬 수 있으며, splenocyte에서의 타겟 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 혈청 내의 immunoglobulin의 농도를 증가시킬 수 있고, Th1 세포를 활성화시키는 등 면역력을 증진시킬 수 있다.
Description
본 발명은 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것으로, 인삼을 베타글루코시데이즈(β-glucosidase) 함량이 높은 균주를 이용하여 발효시킨 다음, 펙티네이즈 계열의 효소를 이용하여 반응시킴으로써 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량을 증가시키고, 이에 따라 면역에 관여하는 세포들의 활성을 증진시켜 면역을 증강시킬 수 있는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다
인삼은 두릅나무과의 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)으로써, 이러한 인삼의 효능은 신진대사 촉진 작용, 혈당강하, 혈압강하, 면역력 향상, 암세포 억제, 피로 회복 및 노화 방지 효능을 보유하고 있다.
이는 인삼에 존재하는 활성성분인 진세노사이드(Ginsenoside)에 의한 효능으로서 진세노사이드는 구조에 따라 프로토파낙사다이올계 진세노사이드 (Protopanaxadiol-type ginsenoside), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드 (Protopanaxatriol-type ginsenoside), 그리고 올레아난계 진세노사이드 (Oleanane-type ginsenoside)로 분류된다.
인삼의 특수한 사포닌은 면역력 증진 효능이 탁월한 것으로 알려져 있으나 체내 흡수율이 낮다. 일반적으로 자연계에 존재하는 많은 배당체 화합물들은 그 자체보다는 당이 분해되어 비당체가 되었을 때 생리활성이 증가되는 경향을 나타내는데, 인삼사포닌의 경우도 당이 3개 이상 결합된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rd, 및 Re보다 일부의 당이 가수분해되어 생성된 진세노사이드 Rg3, Rh1, Rh2, F2, CY 및 CK 등이 생체 내로의 흡수나 생리활성 등의 면에서 훨씬 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 당이 많이 결합되어 있는 인삼사포닌은 소장 내에서 우리 몸으로 흡수되는 양이 매우 적은 것으로 알려져 있는데 사람의 배설물에서 추출된 장내 미생물의 진세노사이드 Rb1의 가수분해능력을 실험한 결과, 장내 미생물의 21%는 분해능력이 없는 것으로 나타났으며, 분해능력이 있는 70%정도의 장내 미생물은 인삼사포닌을 분해하는 능력에 큰 차이가 있다는 것이 확인되었다. 또한, 진세노사이드 흡수율을 측정한 식약처 자료에 따르면 실험대상자의 25%가 장내 미생물의 효소 비활성화로 인해 진세노사이드를 온전히 혈액으로 흡수하지 못했다. 또한, 진세노사이드를 흡수했다 하더라도 개인별로 효능에 대한 차이를 보였으며 성별 및 나이와는 관련이 없는 것으로 나타났다. 이는 인삼의 효능이 사람마다 다른 이유가 장내 미생물 때문이라는 결론을 도출하고 있다.
결국, 자연 상태의 진세노사이드는 장내 미생물에 의해 체내에서 흡수 가능한 물질로 전환되어야만 그 효능을 나타내는데 이 물질이 바로 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성물질인 컴파운드케이(Compound K)다. 즉, 여러 당분자로 결합되어 있는 자연 상태의 사포닌이 장내 미생물의 분해효소에 의하여 당분자 하나만 결합된 컴파운드 케이로 전환되어야만 체내 흡수가 제대로 이루어지고 생리활성 효능도 얻을 수 있다.
프로토파낙사다이올계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rd, Rc, Rg3 및 Rh2는 컴파운드 케이로 변환되어, 체내 사포닌의 흡수율을 증진된다. 이는 장내미생물에 의해 진세노사이드의 당이 제거되어 생성되는 물질로, 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성물질인 컴파운드 케이가 담즙과 함께 체내로 흡수되며, 항암효능을 보유하고 있다.
반면, 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드는 Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1로 구성되어 있으며, 특히 Rg2는 혈소판 응집억제에 항혈전효능, 부신피질의 카테콜아민(catecholamine)류의 스트레스성 호르몬의 분비를 억제하는 효능을 보유하고 있다.
이러한 진세노사이드를 함유하는 인삼은 수삼(fresh ginseng)을 그대로 사용하거나, 백삼, 홍삼, 흑삼과 같이 가공하여 함유량이 낮은 진세노사이드의 함량을 증진시켜 효능을 극대화시키는 것으로 알려져 있다.
이에 따라 최근 ‘특허문헌 1’과 같이 가공된 인삼에 존재하는 미량의 진세노사이드 함량을 증진시키기 위한 연구가 활발히 수행되고 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 위와 같이 인삼에 포함된 진세노사이드 중 흡수가 용이한 컴파운드 케이 및 컴파운드 와이로 변환을 유도하여 양적인 측면 및 효율적인 측면에서 진세노사이드 컴파운드 케이 및 컴파운드 와이의 함량이 증가되는 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물을 제공하는데 있다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 K의 함량이 증가된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물에 있어서, 상기 조성물은, 세척된 인삼을 건조시키고, 분쇄시켜 분말화시키는 분말화단계; 상기 분말을 정제수와 혼합시킨 다음, 균주를 접종한 뒤에 발효시킨 다음 균주를 활성화시키는 발효단계; 혼합물에 펙티네이즈 계열의 효소를 첨가한 뒤에 반응시키는 효소반응단계; 및 혼합물을 원심분리하여 고형분을 제거하는 고액분리단계를 통해 제조된 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 상기 분말화단계는 수분함량이 15%이하가 되도록 건조시키는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 상기 발효단계는 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 또는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 접종하여 30-35℃에서 3-5일간 배양하는 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 상기 효소반응단계의 상기 효소는 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피플로(PyrFlo), 라피다아제 씨80맥스 (Rapidase C80Max), 라피다아제 피엘 (Radidase PL), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC) 중 적어도 어느 하나인 것을 기술적 특징으로 한다.
또한, 위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 상기 효소반응단계는 효소 첨가후 pH 4.5-5.5, 50-55℃에서 3일간 반응시키는 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물은 마이너 진세노사이드인 컴파운드 케이 및 컴파운드 와이의 함량을 급격하게 상승시킬 수 있다.
또한, 면역세포인 NK 세포를 활성화시킴으로써 문제가 되는 타겟 세포의 세포사멸을 유도할 수 있고, 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 염증 유발 시 발생하는 NO를 감소시킬 수 있으며, splenocyte에서의 타겟 세포의 사멸을 유도할 수 있으며, 혈청 내의 immunoglobulin의 농도를 증가시킬 수 있고, Th1 세포를 활성화시키는 등 면역력을 증진시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조성물의 제조과정을 도시한 블록도
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 HPLC 분석 결과
도 3은 NK 세포의 활성에 대한 유세포분석(flow cytometry) 결과
도 4는 대식세포 RAW264.7 세포에 대한 NO 발생 억제 결과를 나타내는 그래프
도 5는 splenocyte의 활성에 대한 유세포분석 결과(ex vivo)
도 6은 마우스 혈청 내의 IgG(가운데), IgM(오른쪽), IgA(왼쪽) 농도 측정 결과를 나타내는 그래프
도 7은 마우스의 splenocyte의 활성에 대한 유세포분석 결과(in vivo)
도 8은 도 7의 결과를 나타내는 그래프
도 9는 마우스의 splenocyte에서의 lymphocyte subpopulation 변화 측정 결과를 나타내는 그래프
도 10은 마우스의 splenocyte에서의 cytokine(TNF, IFN-γ) 생성 결과를 나타내는 그래프
도 11은 마우스의 splenocyte의 증식능력 평가 결과
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 HPLC 분석 결과
도 3은 NK 세포의 활성에 대한 유세포분석(flow cytometry) 결과
도 4는 대식세포 RAW264.7 세포에 대한 NO 발생 억제 결과를 나타내는 그래프
도 5는 splenocyte의 활성에 대한 유세포분석 결과(ex vivo)
도 6은 마우스 혈청 내의 IgG(가운데), IgM(오른쪽), IgA(왼쪽) 농도 측정 결과를 나타내는 그래프
도 7은 마우스의 splenocyte의 활성에 대한 유세포분석 결과(in vivo)
도 8은 도 7의 결과를 나타내는 그래프
도 9는 마우스의 splenocyte에서의 lymphocyte subpopulation 변화 측정 결과를 나타내는 그래프
도 10은 마우스의 splenocyte에서의 cytokine(TNF, IFN-γ) 생성 결과를 나타내는 그래프
도 11은 마우스의 splenocyte의 증식능력 평가 결과
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명에 따른 조성물은, 도 1에 도시된 바와 같이 세척된 인삼을 건조시키고, 분쇄시켜 분말화시키는 분말화단계(S10); 상기 분말을 정제수와 혼합시킨 다음, 균주를 접종한 뒤에 발효시킨 다음 균주를 불활성화시키는 발효단계(S20); 혼합물에 펙티네이즈 계열의 효소를 첨가한 뒤에 반응시키는 효소반응단계(S30); 및 혼합물을 원심분리하여 고형분을 제거하는 고액분리단계(S40)를 통해 제조된다.
실시예 1. 인삼발효추출액의 제조
1-1. 인삼 선정 및 세척
사용되는 인삼은 고려인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginsneng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng), 베트남삼(Panax vietnamensis) 중의 하나 이상을 포함하되, 산삼, 수삼, 홍삼, 백삼, 미삼, 인삼 잎, 인삼열매, 홍삼추출물, 산삼줄기세포, 산삼캘러스, 인삼줄기세포, 인삼캘러스, 산삼배양근, 부정근, 장뇌삼 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 인삼은 4-6년근 수삼을 선정하여 세척한다.
1-2. 건조 및 분쇄
세척된 인삼을 50℃ 열풍건조기에서 수분함량이 15%이하가 되도록 건조한 후 적당한 크기로 절단한다. 절단된 건조인삼을 분쇄기를 이용하여 분말화시킨다. 건조된 분말을 정제수를 넣고 멸균과정 후 효소 균주 혼합물을 접종하여 발효할 경우, 접촉면적이 증가하여 발효 효율이 증진된다.
1-3. 균주접종
인삼 건조분말에 정제수를 혼합하여 반응액을 제조한다. 그리고, 베타글루코시데이즈(β-glucosidase) 함량이 높은 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 접종한 후 30-35℃에서 3-5일간 배양 후 배양액을 불활성화시킨다.
1-4. 효소처리
폴리갈락튜로네이즈{polygalacturonase(pectinase 펙티네이즈)}계열에서 선택된 효소 혼합물을 첨가한 후 pH 4.5-5.5, 온도 70-55℃에서 3일간 반응시켜 제조한다.
펙티네이즈 계열의 효소는 사이톨레이즈 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피플로(PyrFlo), 라피다아제 씨80맥스(Rapidase C80Max), 라피다아제 피엘(Radidase PL), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC)로 이루어진 군에서 선택된 1-3종을 효소를 단독 또는 복합 사용한다.
1-5. 분말제조
인삼효소발효액과 발효분말을 분리하는 방법으로 원심분리방법을 통해 발효액과 고형분을 분리하였다.
인삼효소발효액은 농축방법은 진공농축, 저온 진공농축의 방법으로 추출물을 농축한다.
건조 방법은 저온진공건조는 건조기 내부의 압력을 진공으로 유지하고, 온도를 5-15℃ 정도로 조절하여 건조하는 방법으로, 추출 성분의 변성이 없고, 맛과 향도 소실되지 않는다. 또한, 냉풍건조, 열풍건조, 동결건조, 원적외선 건조, 감압건조 그리고 분무건조의 방법이 이용될 수도 있다.
건조된 발효액 분말과 고형분 분말의 분쇄방법은 일정크기로 분말화하여 완성하는 단계로서, 상기 건조된 인삼 발효액분말과 고형분 분말을 커터밀(cutter mill), 제트밀(jet mill), 하이제트밀(hi jet mill)을 이용하여 분말화하여 인삼효소발효액분말과 고형분 분말을 완성하였다.
실험예 1. 진세노사이드 함량 분석
고성능 액체크로마토그래프 (high performance liquid Chromatography HPLC)를 사용하여 인삼건조분말, 인삼효소발효액, 인삼효소고형분말의 마이너진세노사이드 함량을 분석하였다. 그 결과는 도 2에 도시되어 있고, 이를 표 2와 같이 정리하였다.
마이너 진세노사이드 중 컴파운드 케이와 와이의 함량이 효소발효를 했을 때 높은 함량을 나타내는 것으로 확인되었다.
HPLC를 이용한 마이너진세노사이드 함량을 측정한 결과, 컴파운드 와이와 케이의 함량이 매우 높게 나타났으며, 합으로는 대략 60mg/g이상으로 나타났다.
실험예 2. NK cell activity 측정(
in vitro
)
2-1. 실험방법
NK 세포의 자극을 위하여 NK-92MI cell에 용역 의뢰 받은 인삼효소발효분말을 다양한 농도(50, 100, 200 mg/ml)로 처리하여, NK-92MI의 target cell killing 능력을 증가시키는지 확인하였다.
본 실험은 인삼효소발효분말을 처리한 NK-92MI cell과 PHK26-labeled K562 cell을 5:1로 3시간 동안 co-culture하고 7-ADD와 Annexin-V로 염색하여 target cell apoptosis 유도 정도를 측정하였다.
2-2. 실험결과
도 3을 참조하면, NK-92MI cell에 다양한 농도 (50, 100, 200 mg/ml)의 인삼효소발효분말을 24시간 동안 처리하였을 때, 200 mg/ml에서만 NK-92MI cell viability가 낮아지는 것을 확인하였다.
인삼효소발효분말을 50 혹은 100 mg/ml을 처리하였을 때, 인삼효소처리 분말을 처리하지 않은 group에 비교하여 early apoptosis 및 late apoptosis가 유도된 cell이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, late apoptosis의 유도는 50 mg/ml (3.85 %)을 처리하였을 때 보다 100 mg/ml (5.44 %)을 처리하였을 때 더 강하게 유도되었다.
하지만 cell viability가 낮아지는 200 mg/ml에서는 인삼효소발효분말을 처리하지 않은 group과 비교하여 apoptosis가 감소하였다.
본 실험 결과 인삼효소처리 분말은 적정 농도에서 NK-92MI cell을 activation 시켜서 target cell killing을 활성시키는 것을 확인하였다.
실험예 3. 대식세포의 NO 생성 측정(
in vitro
)
3-1. 실험방법
RAW264.7 cell에 인삼효소발효분말을 농도별로 처리하고 1시간 배양 후, 1 mg/ml의 LPS를 첨가하여 24시간 동안 배양하여 세포 배양액 내의 nitric oxide의 농도를 측정하였다.
인삼효소발효분말을 처리된 RAW264.7 cell의 배양액의 NO 생성량을 확인하기 위하여 Griess 시약을 첨가하여 microplate reader를 이용해 흡광도를 측정하였다.
3-2. 실험결과
도 4를 참조하면, 인삼효소발효분말을 농도별로 RAW264.7 cell에 처리하였을 때, adhesion cell인 RAW265.7 cell이 40-120 mg/ml 농도에서 detach되었다.
40-120 mg/ml 농도에서 total nitiric oxide(NO)가 LPS만 처리한 group에 비교하여 유의적으로 감소했지만, 이러한 NO의 감소는 cell detachment에 의한 결과일 수도 있을 것으로 사료되었다.
20 mg/ml 농도에서 cell detachment가 일어나지 않았고, 동시에 LPS만 처리한 group과 비교하여 유의적으로 NO가 감소하는 것을 확인하였다.
본 실험 결과 인삼효소처리 분말을 RAW264.7 cell을 적은 농도에도 detachment 시킴에도 불구하고 적정 농도에서 NO 발생을 억제할 수 있는 것으로 판단되었다.
결론적으로 In vitro 실험을 통해서 인삼효소발효분말을 NK cell 활성 및 NO 억제 가능성을 확인하였다.
실험예 4. Splenocyte의 세포 독성 측정(
ex vivo
)
4-1. 실험방법
인삼효소발효분말을 splenocyte의 세포 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 splenocyte에 다양한 농도의 인삼효소발효분말을 처리하여 24시간 배양하고 target cell killing을 측정하였다.
인삼효소발효분말로 activation 시킨 splenocyte를 PKH26-labeled YAC-I cell과 20:1로 3시간 동안 co-culture하여 7-ADD와 Annexin-V로 염색해 target cell apoptosis 유도를 관측하였다.
4-2. 실험 결과
도 5를 참조하면, 본 실험에서 100 mg/ml 이상의 인삼효소발효분말을 처리하였을 때, splenocyte에 대한 50 mg/ml 처리 후 인삼효소발효분말을 처리하지 않은 cell과 live cell 수를 동일하게 하여 YAC-I cell과 co-culture하였다.
50 mg/ml 인삼효소발효분말을 처리한 경우 early apoptosis가 대략 2배 정도 증가하였다.
Late apoptosis는 인삼효소발효분말을 처리하지 않은 group과 비교하여 감소하였지만 전체적으로 apoptosis가 유도된 cell이 대략 5 %정도 증가하였다.
본 실험을 통해서 인삼효소발효분말이 적정 농도에서 splenocyte를 activation 하여 target cell killing을 유도한다고 판단되었다.
실험예 5. 혈청 immunoglobulin 농도 측정(
in vivo
)
5-1. 실험방법
Mouse에 6주 동안 농도별로 시료 분말이 배합된 사료로 식이하였다.
사료를 식이 하고 6주 후 mouse 혈청내의 IgG, IgM, IgA 농도를 측정하였다.
각각의 항체에 대한 항체를 plate에 coating한 후, serum을 처리해서 2 시간 동안 반응시켰으며, 이후에 alkaline phosphatase(AP)가 결합된 항체를 이용해서 detection하였다.
5-2. 실험 결과
도 6을 참조하면, 혈청의 IgM의 양이 NC와 비교하여 100 mg/kg/day로 식이한 mouse에서 증가하였지만 유의적이지 않았다.
혈청의 IgG와 IgA의 양이 NC와 비교하여 인삼효소처리 분말을 혼합된 사료를 식이한 group에서 모두 증가하였지만 유의적이지 않았다.
본 실험에서 유의적인 증가를 보이지 않았지만 인삼효소발효분말을 혼합된 사료를 식이한 mouse에서 전체적으로 항체의 양이 증가하는 것을 관측하였다.
실험예 6. Splenocyte의 NK 세포 활성 측정(
in vivo
)
6-1. 실험방법
인삼효소발효분말의 세포 독성 활성화 능력을 확인하기 위해서 6주간 인삼효소발효분말이 혼합된 사료를 마우스에 식이하였다.
인삼효소발효분말을 식이한 mouse의 spleen을 채취하여 cell을 분리한 후 YAC-I cell에 대한 killing activity를 7-ADD와 Annexin-V로 염색하여 확인하였다.
6-2. 실험 결과
도 7을 참조하면, 흥미롭게도 인삼효소발효분말을 125와 250 mg/kg/day로 식이한 mouse에서 높은 NK cell 활성을 보이는 것을 확인하였다.
도 8을 참조하면, 125 mg/kg/day로 식이한 mouse는 negative control과 비교하여 early와 late apoptosis 모두 유의적으로 증가하였다.
250 mg/kg/day로 식이한 mouse는 negative control과 비교하여 late apoptosis만 유의적으로 증가하였고 그 증가폭이 다른 농도에 비교하여 가장 높았다.
즉, 인삼효소발효분말을 식이한 mouse의 splenocyte의 NK cell 활성이 효과적으로 활성화되었다고 판단된다.
실험예 7. Lymphocyte subpopulation 변화 측정(
in vivo
)
7-1. 실험방법
인삼효소발효분말에 의한 lymphocyte subpopulation 변화를 관측하기 위해서 6주간 인삼효소발효분말이 혼합된 사료를 마우스에 식이하였다.
인삼효소발효분말을 식이한 mouse의 spleen을 채취하여 cell을 분리한 후 CD3 항체를 이용하여 T cell에서 CD4와 CD8 positive cell의 양을 비교하였다.
7-2. 실험 결과
도 9를 참조하면, 본 실험 결과 100과 125 mg/kg/day로 식이한 mouse에서 negative control과 비교하여 CD8 T cell의 양이 증가하였다.
250 mg/kg/day로 식이한 mouse는 개체간의 variation이 크며, negative cntrol과 비교하여 CD8 T cell의 증가를 보이지 않았다.
적정 농도에서 인삼효소발효분말이 lymphocyte subpopulation 변화에 영향을 줄 수 있다고 판단된다.
실험예 8. Splenocyte의 cytokine 생성 분석(
in vivo
)
8-1. 실험방법
인삼효소발효분말에 의한 splenocyte에서 cytokine의 변화를 관측하기 위해서 6주간 인삼효소발효분말이 혼합된 사료를 마우스에 식이하였다.
인삼효소발효분말을 식이한 mouse의 spleen을 채취하여 분리한 splenocyte에 CI/PMA를 처리하여 cytokine 분비 유도한 후, CBA kit를 이용해서 배양액에 포함된 cytokine 양을 측정하였다.
8-2. 실험결과
도 10을 참조하면, 본 실험 결과 TNF와 IFN-g 만 detection되었다.
인삼효소발효분말을 식이한 모든 마우스 group에서 splenocyte에서 TNF의 분비량이 증가하였다.
모든 mouse에서 IFN-g의 양이 증가하였으며, TNF와 IFN-g를 분비하는 splenocyte의 증가가 관측되었고 이는 type1 cytokine이다.
인삼효소발효분말에 의해 Th1 cell이 활성 되었다고 판단된다.
실험예 9. Splenocyte의 증식능력 측정(
in vivo
)
9-1. 실험방법
인삼효소발효분말에 의한 splenocyte의 증식능력을 관측하기 위해서 6주간 인삼효소처리 분말이 혼합된 사료를 마우스에 식이하였다.
인삼효소발효분말을 식이한 mouse의 spleen을 채취하여 분리한 splenocyte에 ConA 혹은 LPS를 처리하고 48시간 배양 후 세포의 증식 정도를 3H-thymidine의 DNA incorporation 정도를 cpm 값으로 측정하여 splenocyte 증식 능력을 분석하였다.
9-2. 실험 결과
도 11을 참조하면, Mitogen 및 IL-2를 처리하였을 때, 인삼효소발효분말을 식이한 모든 마우스 group에서 splenocyte의 증식 능력이 유의적으로 증가하는 것을 관측하였다.
125 mg/kg/day로 식이한 mouse가 다른 mouse group에 비교하여 가장 높은 증식 능력을 보였다.
본 실험 결과 인삼효소발효분말을 식이한 마우스의 splenocyte의 증식 능력이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 in vivo 실험을 통해서 본 발명에 따른 인삼효소발효분말을 식이한 마우스의 혈청에서 항체의 증가를 관측하였고 splenocyte에서 target cell killing 능력의 증가, CD8 T cell 유도, type1 cytokine 생산 및 증식능력의 증가를 확인하였다.
Claims (5)
- 진세노사이드 컴파운드 K의 함량이 증가된 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물에 있어서,
상기 조성물은,
세척된 인삼을 건조시키고, 분쇄시켜 분말화시키는 분말화단계;
상기 분말을 정제수와 혼합시킨 다음, 균주를 접종한 뒤에 발효시킨 다음 균주를 불활성화시키는 발효단계;
혼합물에 펙티네이즈 계열의 효소를 첨가한 뒤에 반응시키는 효소반응단계; 및
혼합물을 원심분리하여 고형분을 제거하는 고액분리단계를 통해 제조된 것을 특징으로 하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 삭품 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 분말화단계는 수분함량이 15%이하가 되도록 건조시키는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 발효단계는 사카로마이세스 세르바찌(Saccharomyces servazzii) 또는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 접종하여 30-35℃에서 3-5일간 배양하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 효소반응단계의 상기 효소는 피씨엘5(Cytolase PCL5), 피플로(PyrFlo), 라피다아제 씨80맥스 (Rapidase C80Max), 라피다아제 피엘 (Radidase PL), 옵티빈 매쉬(Optivin Mash) 및 스미자임 에이씨(Sumyzyme AC) 중 적어도 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물.
- 청구항 4에 있어서,
상기 효소반응단계는 효소 첨가후 pH 4.5-5.5, 50-55℃에서 3일간 반응시키는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 컴파운드 케이 및 와이의 함량이 증가된 인삼효소발효분말을 유효성분으로 함유하는 면역증강용 식품 조성물.
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