KR20180008352A

KR20180008352A - 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20180008352A
Application number: KR1020170090587A
Authority: KR
Inventors: 민진우; 김혜진; 주광식; 홍소영; 강희철
Original assignee: 강희철
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-17
Publication date: 2018-01-24

Abstract

본 발명은 인삼을 효소 처리한 다음 건조시키는 단계; 건조된 인삼을 팽화시키는 단계; 및 팽화된 인삼을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제조되는 인삼 추출물은 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환되어, 피부 항산화 및 주름개선 효과가 우수하다.

Description

진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법{Method for producing ginseng extract with enhanced ginsenoside Rg3, F1, C-K, Rh2 and PPT content}

본 발명은 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능은 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진 효능, 심혈관 장해 개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증 개선, 항스트레스 작용, 항피로 작용, 항산화 활성, 노화억제 등이 있다.

인삼에는 배당체 성분인 40여종 이상의 진세노사이드(Ginsenoside)를 비롯하여 비(非)사포닌계의 생리활성 물질로 폴리아세틸렌(Polyacetylene), 페놀성 화합물(Phenolic compounds), 산성 다당류(Acid polysaccharides), 펩타이드(Peptides), 알칼로이드(Alkaloids) 등 인체에 유용한 다양한 성분들이 함유되어 있다.

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼에 함유된 사포닌(Saponin)을 의미하며, 인삼에는 다양한 종류의 진세노사이드 성분이 함유되어 있다. 진세노사이드는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽, 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성이 다른 것으로 알려져 있다.

인삼의 진세노사이드는 인삼 건조량의 약 5％를 차지하며, 트리터페노이드(Triterpenoid) 계열의 다마란(Dammarane) 골격에 포도당(Glucose), 아라비노즈(Arabinose), 자일로즈(Xylose), 람노즈(Rhamnose) 등이 결합되어 있는 중성 배당체이다. 비당부분에 붙어있는 -OH의 수에 따라 2개인(3, 12번 위치) 경우 프로토파낙사디올(Protopanaxadiol; PPD) 계열 사포닌, 3개인(3, 6, 12번 위치) 경우 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol; PPT) 계열 사포닌이라 한다. PPD와 PPT의 R1, R2, R3 위치의 -OH에 글루코오스(Glucose), 아라비노오스(Arabinose), 자일로오스(Xylose), 람노오스(Rhamnose) 등이 결합된다. 30종 이상의 진세노사이드가 인삼으로부터 분리 보고되었으나, 실제 인삼을 추출하여 분석할 때 상당한 양이 검출되는 것은 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rg1의 6종이 전체 사포닌의 90％ 이상을 차지하고 있으며 나머지 사포닌 성분들은 그 함량이 낮다.

진세노사이드는 인체 내에서 그대로 흡수되는 것이 아니라 인체 장내에 존재하는 박테리오데스(Bacteriodes), 락토바실러스(Lactobacillus), 푸소박테륨(Fusobacterium), 유박테리움(Eubacterium), 프로베탈라균(Provetella) 종 등의 미생물에 의하여 분해되어 그 대사체가 흡수된다. 진세노사이드 Rb1의 경우 장내 미생물에 의해 진세노사이드 Rd, 컴파운드 케이(Compound K, 이하 C-K라로 약칭함)와 프로토파낙사디올로 순차적으로 전환된다. PPD계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc, Rd는 장내에서 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol(C-K)로 대사되어 흡수된다. PPT계 진세노사이드 Re, Rf, Rg1은 장내에서 Rh1, F1, Protopanaxatriol로 대사된다. PPD계 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등은 장내 미생물에 의하여 20(R)-/20(S)-ginsenoside Rg3로 전환되며, Rg3는 장내 미생물에 의하여 Rh2로 전환된다.

최근에는 이러한 인삼의 약효성분이 인체 내로 용이하게 흡수되도록 하며, 인삼에 극미량으로 존재하는 성분들을 강화시키는 방법으로서 인삼을 장내 미생물 또는 유산균을 이용하여 발효하거나 효소를 처리하는 방법 등이 사용되고 있다. 대한민국 등록특허공보 제10-1017378호는「발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브틸리스 신균주」에 관한 것으로서, 청국장에서 분리된 바실러스(Bacillus) 속 미생물을 이용하여 인삼 및 홍삼을 발효시켜 진세노사이드 Rd의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 발효인삼 및 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장 유래의 바실러스 서브스틸리스 신균주에 관한 기술이 개시되어 있다.

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1240192호는「락토바실러스 아시도필러스 Ｋ-59 균주, Ｋ-59 균주를 이용한 인슐린 분비 개선용 인삼 발효 추출물 및 이의 제조방법」에 관한 것으로서, 새롭게 분리 동정된 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus) K-59 (KFCC11467P) 균주를 이용하여 인삼의 생체이용률이 낮은 성분인 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg1 또는 Re을 진세노사이드 Rh1, Rg3, Rh2 또는 C-K로 전환시키는 방법이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼의 특정 부위를 최적으로 혼합하고, 이를 효소 및 팽화 처리하여 추출물을 제조할 경우, 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환되어, 피부 항산화 및 주름개선 효과를 부여할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1017378호 대한민국 등록특허공보 제10-1240192호

본 발명의 목적은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인삼 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼을 효소 처리한 다음 건조시키는 단계; 건조된 인삼을 팽화시키는 단계; 및 팽화된 인삼을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼은 잎, 열매 및 뿌리를 각각 0.5~1.0 : 0.5~1.0 : 0.5~5.0의 혼합비로 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 처리시 락토오스(Lactose)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 효소 처리는 인삼 100중량부에 대하여 펙티나아제(Pectinase) 0.1~1.0 중량부 및 셀룰라아제(Cellulase) 0.5~1.0 중량부를 첨가한 다음, 37 내지 50℃에서 3 내지 7일 동안 반응시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 팽화시키는 단계는 5.0~10.0 kgf/cm²의 압력으로 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출하는 단계는 팽화된 인삼을 에탄올(EtOH) 추출하여 추출물을 제조한 후 HP20 다공성수지와 에탄올(EtOH)을 이용하여 분획시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법을 통해 제조된 인삼 추출물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼 추출물은 피부 항산화 및 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법으로부터 제조되는 인삼 추출물은 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환되어, 피부 항산화 및 주름개선 효과가 우수하다.

도 1은 인삼을 효소 처리 시 진세노사이드의 생물전환 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 인삼을 효소 및 팽화 처리 시 진세노사이드의 생물전환 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1로부터 수득된 인삼 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1로부터 수득된 인삼 추출물의 MMP-1(Matrix Metallopeptidase-1) 억제 활성 결과를 나타낸 그래프이다.

이에, 본 발명자들은 인삼의 특정 부위를 최적으로 혼합하고, 이를 효소 및 팽화 처리하여 인삼 추출물을 제조할 경우, 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환될 수 있을 것으로 예측하였다.

본 실시예에서는 인삼의 잎, 열매 및 뿌리를 다양한 혼합비로 조절하였고, 이를 효소 및 팽화 처리를 순차적으로 수행한 다음 인삼 추출물을 제조하여 특정 진세노사이드의 생물전환능을 확인하였다. 그 결과, 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 인삼을 효소 처리한 다음 건조시키는 단계; 건조된 인삼을 팽화시키는 단계; 및 팽화된 인삼을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

더욱 상세한 인삼 추출물의 제조방법은 다음과 같다.

본 발명에서"인삼 추출물"이라 함은 인삼을 효소 및 팽화 처리를 순차적으로 수행한 후 추출하여 얻어진 생성물을 의미한다.

먼저, 인삼 추출물 제조에 사용되는 인삼은 품종이 특별히 한정되지 않으나, 금풍, 황숙종 및 자경종으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 인삼을 사용 시, 인삼 전초(잎, 뿌리, 줄기)를 한 번에 사용하는 것이 아닌 인삼의 잎, 열매 및 뿌리를 각각 개별적으로 사용하여 특정 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 이때, 인삼의 잎, 열매 및 뿌리는 각각 0.5~1.0 : 0.5~1.0 : 0.5~5.0의 혼합비로 혼합하여 사용하는 것이 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환시킬 수 있는 측면에서 바람직하다. 만일, 인삼의 잎, 열매 및 뿌리의 혼합비가 상기 함량을 벗어나게 될 경우에는 사포닌 계열이 구성비가 맞지 않게 되어 피부 항산화 및 주름개선 효능이 충분히 나타나지 않기 때문에 바람직하지 않다.

본 발명에 바람직한 양태에 따르면, 상기 인삼을 효소 처리할 경우, 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)를 사용하는 것이 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량을 증진시키는 측면에서 바람직하다. 또한, 효소 처리 시 생체이용률이 높은 진세노사이드로의 전환력을 더욱 증가시키기 위하여 락토오스(Lactose)를 추가적으로 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 효소 처리는 인삼 100중량부에 대하여 펙티나아제(Pectinase) 0.1~1.0 중량부 및 셀룰라아제(Cellulase) 0.5~1.0 중량부를 첨가한 다음, 37 내지 50℃에서 3 내지 7일 동안 반응시키는 것이 바람직하다. 만일, 인삼 100중량부에 대하여 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)를 각각 0.1중량부 및 0.5중량부 미만으로 첨가할 경우에는 효소의 함량이 상대적으로 낮아 효소의 기능을 구현하기에는 효과가 미미한 문제점이 있고, 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)의 첨가량이 각각 1.0 중량부 및 1.0중량부 초과할 경우에는 그 이상의 함량을 첨가하지 않아도 충분한 효능을 나타낼 수 있기 때문에 비경제적이다.

또한, 효소를 처리할 경우 37 내지 50℃에서 3 내지 7일 동안 반응시키는 것이 진세노사이드(Ginsenoside) Rd, Rg3 및 Rg2의 함량을 최대로 높일 수 있는 측면에서 바람직하다. 만일, 상기 온도 및 시간을 벗어날 경우에는 대부분의 사포닌이 단순 비배당체화 되기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같은 조건으로 인삼을 효소 처리하면 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2 및 Rc의 당을 가수분해 시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rd로 전환되며, 이는 다시한번 당을 가수분해시켜 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3로 전환되고, 진세노사이드(Ginsenoside) Re의 경우 Rg2로 추가적으로 전환되어진다.(도 1)

상기와 같이 인삼을 효소 처리한 다음 건조시키게 되는데, 효소처리된 인삼을 건조시킬 수 있는 방법이라면 특별히 제한하지 않으나, 55 내지 65℃에서 열풍건조로 48 내지 72시간 건조시키는 방법으로 수행하는 것이 부패를 막고 경제적인 측면에서 바람직하다.

다음으로, 건조된 인삼을 팽화시키게 되는데, 5.0~10.0 kgf/cm²의 압력으로 수행하는 것이 팽화시켜 조직을 다공성화하고 표면적을 확장시키는 측면에서 바람직하다. 만일, 인삼을 팽화시킬 경우 5.0 kgf/cm²의 압력 미만으로 팽화를 수행할 경우에는 조직이 충분히 팽화되지 못하여 조직의 표면적이 증대되지 못하는 문제점이 있고, 10.0 kgf/cm²의 압력을 초과할 경우에는 탄화되어 유해한 성분이 생성될 수 있기 때문에 바람직하지 않다.

상기와 같은 조건으로 인삼을 효소 처리 이후 팽화시킬 경우 진세노사이드(Ginsenoside) Rd는 F2로 전환되며, 이는 다시한번 C-K로 전환된다. 또한, 진세노사이드(Ginsenoside) Re의 경우 Rg1 및 Rg2로 전환되며, Rg1은 F1 및 (R,S)-Rh1으로 전환되고, 이는 다시한번 PPT로 추가적으로 전환되어진다. 또한, 진세노사이드(Ginsenoside) Rg2는 (R,S)-Rh1으로 전환되고, 이는 다시한번 PPT로 추가적으로 전환되어진다. 진세노사이드(Ginsenoside) Rh21의 경우에는 이 두 과정을 병행하였을 때 특이적으로 생성된다. 즉, 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re를 Rg2, Rg3 및 C-K로 효소 전환시켜 대량으로 생성시키고, 이를 팽화처리시킴으로써 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 생물전환 되는 것이다.(도 2)

상기 팽화된 인삼을 에탄올(EtOH) 추출하여 추출물을 제조한 후 HP20 다공성 수지와 에탄올(EtOH)을 이용하여 분획시켜 분획물을 수득함으로써 최종 인삼 추출물을 제조할 수 있다.

상기한 바와 같이, 인삼의 특정 부위를 최적으로 혼합하고, 이를 효소 및 팽화처리하여 추출물을 제조할 경우, 인삼에 함유되어 있는 생체 이용률이 낮은 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re가 생체이용률이 높은 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 전환되어, 피부 항산화 및 주름개선 효과를 부여할 수 있기 때문에, 상기 인삼 추출물을 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서 적용이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1 내지 3> 인삼 추출물 제조

실시예 1

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 품종 중에서 금풍인삼의 잎, 열매 및 뿌리를 각각 0.5:1:2의 혼합비로 혼합하여 100g을 준비한 다음, 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)를 각각 0.1g 및 0.5g 첨가하여 50℃에서 72시간 동안 반응시킨 후 60℃에서 72시간 동안 열풍 건조시켰다. 건조 처리된 인삼을 100g을 고온고압처리장치(Jisico, Korea)를 사용하여 10 kgf/cm²의 압력, 150℃조건으로 30분 동안 열처리하여 팽화시켰다. 팽화시킨 후 팽화된 인삼을 70% 에탄올(EtOH)을 이용하여 80℃에서 3시간동안 추출하여 추출액을 제조하였다. 제조된 추출액을 HP20이 충진된 컬럼(Column)에 로딩하고 에탄올(EtOH)을 농도별(40%, 50%, 65%)로 순차적으로 가하여 정제시킨 다음, 이중에서 65% 농도에서 용출되어진 액을 모아 농축 및 분말화하여 최종 인삼 추출물을 제조하였다.

실시예 2

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 품종 중에서 금풍인삼의 잎, 열매 및 뿌리를 각각 0.5:1:2의 혼합비로 혼합하여 100g을 준비한 다음, 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase), 락토오스(Lactose)를 각각 0.1g 및 0.5g, 0.5g 첨가하여 50℃에서 72시간 동안 반응시킨 후 60℃에서 72시간 동안 열풍 건조시켰다. 건조 처리된 인삼을 100g을 고온고압처리장치(Jisico, Korea)를 사용하여 10 kgf/cm²의 압력, 150℃ 조건으로 30분 동안 열처리하여 팽화시켰다. 팽화시킨 후 팽화된 인삼을 70% 에탄올(EtOH)을 이용하여 80℃에서 3시간동안 추출하여 추출액을 제조하였다. 제조된 추출액을 HP20이 충진된 컬럼(Column)에 로딩하고 에탄올(EtOH)을 농도별(40%, 50%, 65%)로 순차적으로 가하여 정제시킨 다음, 이중에서 65% 농도에서 용출되어진 액을 모아 농축 및 분말화하여 최종 인삼 추출물을 제조하였다.

실시예 3

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 품종 중에서 금풍인삼의 잎, 열매 및 뿌리를 각각 0.5:0.5:0.5의 혼합비로 혼합하여 100g을 준비한 다음, 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)를 각각 0.1g 및 0.5g 첨가하여 50℃에서 72시간 동안 반응시킨 후 60℃에서 72시간 동안 열풍 건조시켰다. 건조 처리된 인삼을 100g을 고온고압처리장치(Jisico, Korea)를 사용하여 10 kgf/cm²의 압력, 150℃조건으로 30분 동안 열처리하여 팽화시켰다. 팽화시킨 후 팽화된 인삼을 70% 에탄올(EtOH)을 이용하여 80℃에서 3시간동안 추출하여 추출액을 제조하였다. 제조된 추출액을 HP20이 충진된 컬럼(Column)에 로딩하고 에탄올(EtOH)을 농도별(40%, 50%, 65%)로 순차적으로 가하여 정제시킨 다음, 이중에서 65% 농도에서 용출되어진 액을 모아 농축 및 분말화하여 최종 인삼 추출물을 제조하였다.

<비교예 1 내지 2> 인삼 추출물 제조

비교예 1

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 품종 중에서 금풍인삼 100g을 고온고압처리장치(Jisico, Korea)를 사용하여 10 kgf/cm²의 압력, 150℃ 조건으로 30분 동안 열처리하여 팽화시킨 후 팽화된 인삼을 에탄올(EtOH)을 이용하여 80℃에서 3시간 동안 추출 농축하여 분말화시켜 인삼 추출물을 제조하였다.

비교예 2

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)의 품종 중에서 금풍인삼 100g에 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)를 각각 0.1중량% 및 0.5중량% 첨가하여 50℃에서 72시간 동안 반응시킨 후 60℃에서 72시간 동안 열풍 건조시켰다. 건조된 인삼을 에탄올(EtOH)을 이용하여 80℃에서 3시간동안 추출 농축하여 분말화시켜 인삼 추출물을 제조하였다.

<시험예 1> 진세노사이드 함량 분석 (HPLC; High Performance Liquid Chromatography)

실시예 1~3 및 비교예 1~2로부터 제조된 인삼 추출물 1g에 수포화 부탄올을 5g 첨가하여 혼합한 다음, 부탄올 혼합액의 상등액을 취하여 감압농축시켰다. 수득된 농축물을 Methanol(HPLC grade)에 용해시킨 후 0.2 ㎛ Membrane filter에 여과하여 HPLC 분석용 시료로 이용하였다. HPLC 분석에는 C₁₈column(3.0x50 m㎜, ID 5㎛)을 사용하여 UV 203㎚에서 검출하였다. 이동상은 Acetonitrile(solvent A)과 Water(solvent B)를 이용하여 Gradient를 주었고 1.6 ㎖/min 유속으로 분리하였으며, 이동상의 Gradient 조건은 표 1과 같다.

시간(min)	Mobile phase
시간(min)	Acetonitrile (solvent A)	Water (solvent B)
0.00	17	83
6.00	17	83
9.00	23	77
16.50	23.5	76.5
19.00	31	69
29.00	45	55
31.00	47	53
33.00	90	10
34.00	90	10
35.00	17	83
37.00	17	83

상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 진세노사이드(Ginsenoside) 성분 변화에 대한 결과는 표 2와 같다.

	실시예 1 (단위 : mg/g)	실시예 2 (단위 : mg/g)	실시예 3 (단위 : mg/g)	비교예 1 (단위 : mg/g)	비교예 2 (단위 : mg/g)
Rb1	1.43	0.58	0.99	5.4	1.51
Rb2	0.96	0.85	0.98	2.28	0.89
Rc	1.24	1.09	1.25	2.11	0.77
Rd	5.87	5.96	3.89	10.55	1.54
Re	15.54	14.99	5.15	2.14	3.34
Rf	0.18	0.19	0.12	0.11	0.81
Rg2	8.81	9.14	7.99	2.29	0.51
Rg3	3.34	2.95	5.56	1.49	1.21
Rh1	4.48	5.61	0.98	1.36	0.30
Rh2	0.99	1.41	0.32	0.02	0.85
F1	2.95	3.34	2.21	0.51	0.45
F2	0.98	0.85	0.92	1.5	0.84
C-K	1.15	1.54	1.05	0.01	1.35
PPT	1.41	1.09	0.54	0.22	0.15
Rh21	0.29	0.33	0.15	0	0

그 결과, 상기 표 2에서 확인할 수 있듯이 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 진세노사이드(Ginsenoside) 성분 변화를 분석한 결과, 실시예 1~3의 인삼 추출물은 비교예 1~2의 인삼 추출물보다 전체적으로 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

이는 인삼이 효소 및 팽화 처리에 의해 진세노사이드(Ginsenoside) Rb1, Rd 및 Re가 진세노사이드(Ginsenoside) Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT로 생물전환되는 것임을 확인하였다.

<시험예 2> 폴리사카라이드(Polysaccahride) 함량 분석

실시예 1~3 및 비교예 1~2로부터 수득된 인삼 추출물의 폴리사카라이드(Polysaccaride) 함량 분석을 진행하였다. 이때, Pectin 정량에 상용되는 Carbazole sulfuric acid 방법으로 측정하였으며 대조구는 Carbazole을 사용하였다. 실시예 1~3 및 비교예 1~2를 각각 5ml씩을 250ml flask에 정량하고 10배에 해당하는 증류수 5ml을 첨가하였다. 환류추출기에서 80℃로 6시간 추출한 후 원심분리(4℃, 9000rpm, 15분)하여 상등액을 2ml 취하고 여기에 95% 메탄올 8ml을 가한 뒤 10ml로 정량하였다. 이를 다시 9000rpm에 15분간 원심분리하였다. 침전액 200ul를 취하여 증류수 4.8ml 첨가하여 용해시킨 후, 0.5ml을 취하여 황산 3ml, carbazole 0.25ml을 85 Water bath에서 5분간 반응시켜주었다. 5분 뒤, Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 폴리사카라이드(Polysaccaride) 함량 변화에 대한 결과 표 3과 같다.

	실시예 1 (단위 : mg/g)	실시예 2 (단위 : mg/g)	실시예 3 (단위 : mg/g)	비교예 1 (단위 : mg/g)	비교예 2 (단위 : mg/g)
폴리사카라이드	9.97	11.54	7.84	4.45	2.58

그 결과, 표 3에서 확인할 수 있듯이 비교예 1~2 대비 실시예 1~3에서 폴리사카라이드(Polysaccaride) 함량이 증가된 것을 확인하였다.

<시험예 3> 총 페놀(Phenol) 함량 분석

실시예 1~3 및 비교예 1~2로부터 수득된 인삼 추출물의 총 페놀(Phenol) 함량을 분석하였다. 실시예 1~3 및 비교예 1~2로부터 수득된 인삼 추출물 각각 100ul에 2ml의 소듐 카보네이트를 첨가하여 혼합한 다음, 2N Folin & Ciocalteu phenol reagent(Sigma)첨가하여 상온에서 30분간 반응시킨다. 상온에서 30분 반응시킨 후 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 (+)-카테킨 수화물 ((+)-catechin hydrate ; Sigma)을 사용하였다.

상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 총 페놀 함량 변화에 대한 결과 하기 표 4 와 같다.

	실시예 1 (단위 : mg/g)	실시예 2 (단위 : mg/g)	실시예 3 (단위 : mg/g)	비교예 1 (단위 : mg/g)	비교예 2 (단위 : mg/g)
총 페놀	27.12	33.51	19.54	4.66	2.81

그 결과, 표 4에서 확인할 수 있듯이 비교예 1~2 대비 실시예 1~3에서 페놀 화합물의 함량이 증가된 것을 확인하였다.

<시험예 4> 세포 독성 시험

실시예 1~3 및 비교예 1~2로부터 수득된 인삼 추출물의 세포 독성을 측정하였다. 먼저, 인간 각질형성 세포 HaCat(ACTT, CLS 300493, USA)을 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 96well plate에 2.0 x 10⁴cell/well 씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양시켰다. 24시간 배양한 후 얻은 세포 배양액을 제거하고, 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 수득된 인삼 추출물을 0, 10, 25, 50, 100, 200ug/ml 농도로 조제하였다. 농도별로 1㎕를 취하여 DMEM 배지와 혼합한 뒤, 각 well에 농도별로 처리하였다. 이를 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 well당 MTT[3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 용액을 5 ㎎/㎖의 농도로 첨가하고 동일한 조건에서 4시간 동안 더 배양하였다. 4시간 뒤, MTT 용액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 200㎕씩 가하여 블루 포마잔(blue formazan)을 용해시킨 뒤 Multi-reader(Biotec, synergy)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로는 시료 대신 증류수(Distilled water)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 아래 수학식 1에 나타내었다.

[수학식 1]

세포 생존율(%) = (실험군의 흡광도 / 대조군의 흡광도) X 100

Cell viability (%)
	농도( ug /ml)	0	10	25	50	100
시료	비교예 1	100	100.67	98.30	93.03	91.50
	비교예 2	100	100.50	99.58	98.65	99.51
	실시예 1	100	99.30	96.30	94.90	93.67
	실시예 2	100	98.25	99.77	99.51	96.95
	실시예 3	100	99.68	99.21	96.57	98.51

그 결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 사용 농도가 최고 농도인 100ug/ml에서도 세포독성이 없는 것으로 나타난 것으로 보아, 독성이 없는 안전한 원료로 사용이 가능함을 확인하였다.

<시험예 5> 항산화 효능 검증 시험 : DPPH radical 소거 활성

실시예 1 및 비교예 1로부터 수득된 인삼 추출물의 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 소거 활성을 측정하였다. 자유라디칼은 일반적으로 외부자극에 대한 활성산소가 과잉 생산되어 피부 보습층을 파괴하여 피부를 건조하게 하고, 외부 자극에 민감한 면역 반응을 보이는 병리적 인자로 작용하게 된다. 본 발명에 따른 인삼 복합 추출물의 항산화능은 DPPH 실험을 통해 자유라디컬 소거능 확인이 가능하다. 먼저, 실시예 1 및 비교예 1에서 수득된 인삼 추출물을 각각 다양한 농도로 희석하여 시료를 준비한 후, 이들 시료와 100μM DPPH (1,1-diphenyl -2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합하고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 96well plate에 담아 DPPH 양을 520nm에서 측정하였다. 이때, 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하였다. DPPH 자유 라디칼 소거능(Free radical scavenging activity, %)측정법에 의한 항산화 정도는 아래 수학식 2에 나타내었다.

[수학식 2]

자유라디칼소거능(%)=100-(시료를 처리한 군의 흡광도/시료를 처리하지 않은 군의 흡광도 X 100)]

Free radical scavenging(%)
	농도( ug /ml)	0	10	25	50	100
시료	비교예 1	0.77	22.43	34.43	56.00	77.47
		0.78	20.54	29.51	30.64	30.82
		0.77	30.28	59.58	70.51	75.90
	실시예 1	0.80	38.10	63.53	90.93	92.87
	실시예 1	0.79	45.51	89.56	90.35	92.82

그 결과, 상기 표 6 및 도 3에 나타난 바와 같이 인삼 추출물을 농도별로 처리하였을 때 비교예 1 대비 실시예 1에서 유의성있는 DPPH 소거능을 나타내어 높은 항산화 활성을 나타내었다.

<시험예 6> 주름개선 효능 검증 시험 : MMP-1 억제 활성

실시예 1 및 비교예 1로부터 수득된 인삼 추출물의 MMP-1(Matrix Metallo peptidase-1) 억제 활성을 측정하였다. 이때, RT-PCR로 mRNA 발현량을 조사하였다. 인체섬유아세포를 6-well plate의 각 웰(well)에 2X10⁵ 개수의 세포가 되도록 접종한 후, 37 ℃, 5% CO₂ 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 약 80%의 confluency에 도달하였을 때, 인산염 완충액(Phosphate buffered saline, PBS)을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 피부노화를 유발하기 위하여 자외선을 조사하였다. 이때, 자외선은 자외선 A 램프(Sankyo Denki FL8BL lamp, Sankyo Denki Co., Japan)를 이용하여 총 6.5mJ/㎠를 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산염 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 실시예 1 및 비교예１에서 수득된 인삼 추출물을 0, 10, 25, 50, 100, 200ug/ml 농도로 첨가하여 24시간 더 배양하였다. 시료를 처리한 세포를 활용하여 RNA를 분리하였고, 이때, RNA 분리 kit(intron社)를 이용하여 분리하였다. 여기서 얻어진 RNA에 MuLV 역전사효소 (reverse transcriptase), 1 mM dNTP 0.5 ㎍을 넣어 cDNA를 만들었으며, 여기에 MMP-1 프라이머(서열번호 1: F 5'-AAAGGGAATAAGTACTGGGC-3'및 서열번호 2: R 5'-AATTCCAGGAAAGTCATGTG-3')를 넣고 실시간유전자증폭기(Realtime PCR) 이용하여 증폭시켜 발현양을 분석하였다.

MMP -1 inhibition(%)
	농도( ug /ml)	0	10	25	50	100
시료	비교예 1	0.50	20.27	25.27	29.27	33.07
		0.49	10.50	13.58	11.69	11.55
		0.49	19.51	20.21	25.98	56.23
	실시예 1	0.50	32.57	44.63	52.33	72.00
	실시예 1	0.51	40.68	62.39	80.54	82.35

그 결과, 상기 표 7 및 도 4에 나타난 바와 같이 실시예 1 및 비교예 1을 농도별로 처리하였을 때 비교예 1 대비 실시예 1에서 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현이 현저하게 감소되어 피부 주름개선 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KANG, hee cheol <120> Method for producing ginseng extract with enhanced ginsenoside Rg3, F1, C-K, Rh2 and PPT content <130> P16131 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP 1 primer F <400> 1 aaagggaata agtactgggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP 1 primer R <400> 2 aattccagga aagtcatgtg 20

Claims

인삼을 효소 처리한 다음 건조시키는 단계;
건조된 인삼을 팽화시키는 단계; 및
팽화된 인삼을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 인삼은 잎, 열매 및 뿌리를 각각 0.5~1.0 : 0.5~1.0 : 0.5~5.0의 혼합비로 혼합하여 이루어진 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소는 펙티나아제(Pectinase) 및 셀룰라아제(Cellulase)인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 효소 처리시 락토오스(Lactose)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 효소 처리는 인삼 100중량부에 대하여 펙티나아제(Pectinase) 0.1~1.0 중량부 및 셀룰라아제(Cellulase) 0.5~1.0 중량부를 첨가한 다음, 37 내지 50℃에서 3 내지 7일동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 팽화시키는 단계는 5.0~10.0 kgf/cm²의 압력으로 수행하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출하는 단계는 팽화된 인삼을 에탄올(EtOH) 추출하여 추출물을 제조한 후 HP20 다공성수지와 에탄올(EtOH)을 이용하여 분획시키는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3, F1, C-K, Rh21 및 PPT의 함량이 증진된 인삼 추출물의 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조방법을 통해 제조된 인삼 추출물.
제8항에 있어서, 상기 인삼 추출물은 피부 항산화 및 주름개선 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 인삼 추출물.
제8항의 인삼 추출물을 포함하는 화장료 조성물.