KR102043244B1 - 수리취 추출물을 이용한 비만 개선용 및 항당뇨용 식품 조성물 - Google Patents
수리취 추출물을 이용한 비만 개선용 및 항당뇨용 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
수리취 추출물을 이용하여 부작용 위험이 낮으면서 항비만 및 항당뇨 효능이 우수한 식품 조성물이 제공된다. 이 비만 개선용 또는 항당뇨용 식품 조성물은 수리취 추출물을 유효성분으로 포함한다.
Description
본 발명은 식품 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수리취 추출물을 이용한 비만 개선용 및 항당뇨용 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 급속한 경제성장으로 인하여 생활수준이 향상되었고, 이와 더불어 매년 비만인구가 증가하고 있다. 전 세계 인구의 9.8%에 해당하는 4억 명 이상이 비만인 것으로 조사되었다(WHO, 2009). 우리나라의 경우, 성인 비만율은 30.8%(남자: 36.3%, 여자: 24.8%)에 달하며, 특히 19세 이상 남자의 비만율은 과거 10년 동안 꾸준히 증가하고 있다.
비만은 에너지 소모량 대비 에너지 섭취량이 높아 체내에 축적되는 과잉된 에너지가 지방으로 변하여 과다 축적된 상태를 말한다. 비만은 외모에 따른 자신감 하락 등으로 정신적인 문제를 야기할 뿐만 아니라 체중 증가로 활동성이 떨어져 운동성을 저하시키고 혈중 지질 및 콜레스테롤 수치를 높여 동맥경화와 심장병을 발생시키며, 인슐린 저항성에 따른 제2형 당뇨병, 고혈압, 뇌졸중 등을 유발할 우려가 높은 것으로 알려져 있다.
현재까지 이러한 비만 및 당뇨 문제를 해결하기 위해 개발된 의약품들은 그 효과에 비해 부작용(예컨대, 소화불량, 혈압상승 등)이 심각한 것으로 보고되고 있다. 따라서, 항비만 및 항당뇨 효과는 높으나 부작용이 적은 새로운 작용기전을 가진 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. 특히 치료용 약물보다는 부작용 위험이 더 적은 천연물을 이용한 식품 조성물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 부작용 위험이 낮으면서 항비만 및 항당뇨 효능이 우수한 식품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 비만 개선용 또는 항당뇨용 식품 조성물은 수리취 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 수리취 추출물은, 수리취 건조분말을 70% 주정용액으로 추출하여 얻어질 수 있다.
또한, 상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 유산균 과립 식품은 상기 식품 조성물과 유산균 분말을 혼합하여 제조된다.
또한, 상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 영양바 식품은 상기 식품 조성물을 포함한다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 수리취 추출물에 따르면 다음과 같이 비만을 개선하거나 당뇨를 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
첫째, 본 발명의 수리취 추출물은 천연물 재료로서 기존 호르몬 치료법에 의한 부작용을 동반하지 않는다.
둘째, 본 발명의 수리취 추출물 중 총 폴리페놀(total polyphenol) 함량이 125.44 mg/g으로 비교적 높게 측정되어 항산화력이 있는 것으로 파악되었다. 또한, ABTS radical 및 DPPH radical 소거활성에 있어서도 우수한 항산화 효능이 확인되었다.
셋째, 본 발명의 수리취 추출물은 소화효소인 α-amylase 및 α-glucosidase 활성을 저해시켜 전분 및 당의 저분자화를 억제시키고 이에 따라 체내 당 흡수를 저해하는 효능이 확인되었다.
넷째, 지방 세포의 분화유도 및 지방 축적 정도를 평가하는 지표로 사용되는 3T3-L1 전지방세포에 본 발명의 수리취 추출물을 처리한 결과, 지방분화 억제효능을 확인할 수 있었다. 수리취의 효능 지표물질로 알려진 스코폴레틴(scopoletin)에도 지방분화 억제효능을 확인할 수 있었다. 이와 같이 세포수준에서 수리취 추출물의 항비만 효능을 확인하였다.
다섯째, 본 발명의 수리취 추출물을 이용한 마우스 동물실험을 통해, 체중증가 억제 효과와, 부고환지방 및 신장지방 감소효과, 혈중/간중 중성지방 및 콜레스테롤 개선 효과, 혈당 감소 효과, 및 내당능 개선효과를 확인하였다.
여섯째, 본 발명의 수리취 추출물에 의하면, 간 조직의 비만관련 mRNA 및 단백질 발현이 저해되는 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수리취 추출물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3T3-L1 cell의 전구지방세포에서 지방세포로의 분화 유도 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 실험설계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다.
도 6은 스코폴레틴의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 체중변화를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 부고화 지방과 간을 광학 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 희생 전 4주간 꼬리정맥채혈하여 주당 1회 혈당 검사를 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 복강 내 당부하시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지방분화(Adipogenesis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지질생성(Lipogensis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3T3-L1 cell의 전구지방세포에서 지방세포로의 분화 유도 과정을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 실험설계를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다.
도 6은 스코폴레틴의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 체중변화를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 부고화 지방과 간을 광학 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 희생 전 4주간 꼬리정맥채혈하여 주당 1회 혈당 검사를 진행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 복강 내 당부하시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지방분화(Adipogenesis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지질생성(Lipogensis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 실시예 및 실험예에 사용된 수리취(Synurus deltoides Nakai)는 국화과에 속하는 여러해살이 식물로 전국 산지에 분포하며 동남아시아 지역에도 걸쳐 널리 자생하고 있는 식물이다.
실시예 1. 수리취 추출물의 제조
본 실시예 사용된 수리취는 강원도 평창군에서 2017년 봄에 수확된 건조산채를 이용하였으며, 건조된 수리취 시료를 건식분쇄기로 분쇄하여 60 mesh 체로 쳐서 사용하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 수리취 추출물의 제조방법을 순차적으로 나타낸 순서도이다. 도 1을 참조하면 수리취 주정추출물을 제조하기 위하여, 수리취 건조분말 1kg에 10배량(w/v)의 70% 주정용액을 첨가하여 실온(25℃?)에서 180 rpm으로 12시간 교반추출 하였다. 추출이 끝나면 8,000-12,000 rpm에 15-20분간 원심분리한 후, 여과지(Whatman No. 1, England)로 여과하고 동결 건조하여 실험에 사용하였다. 이하 수리취 추출물은 수리취로부터 70% 주정용액을 이용한 추출물을 의미한다. 본 실시예에서는 수리취 에탄올추출물을 예로 들어 설명하고 있으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며 수리취 열수추출물도 실질적으로 동일한 효과를 가질 수 있다. 다만, 바람직하게는 수리취 주정추출물이 더 좋다.
실시예 2. 항비만 효능 평가 (in vitro 및 in vivo)
<2-1> 소화효소 저해능 측정
a) *j아밀라제(α-amylase) 저해활성 측정
α-amylase 저해 활성은 수리취 추출물 각 농도별 50 μL에 1 U/mL의 α-amylase 효소를 50 μL씩 넣고, 1% starch 용액을 100 μL 넣은 뒤 혼합하여 20℃?에서 3분간 반응시켰다. DNS 발색시약을 100 μL 넣고 100℃?에서 15분간 가열시킨 후 10분간 냉각시켰다. 575 nm에서 흡광도를 측정하였으며 추출물을 처리하지 않은 대조구와 비교하여 효소활성을 계산하였다.
b) *j글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성 측정
α-glucosidase 저해 활성은 수리취 추출물 50 μL에 α-glucosidase 효소액 10 μL를 1 M potassium phosphate buffer (pH 6.0) 90 μL에 넣고 혼합한 후 5 mM p-nitrophenyl-α-glucopyranoside를 가하여 37℃?에서 20분간 반응시켰다. 1 M Na2CO3를 가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
<2-2> 전지방세포의 분화억제능 측정
a) 세포 배양
Mouse 유래 3T3-L1 전지방세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 세포배양은 10% BCS(bovine calf serum; abcam, UK)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Gibco, USA) 배지를 사용하여 37℃?, 5% CO2 조건 하에서 수행하였다. 세포는 T-75 cell culture flask 바닥에 세포가 성장하여 80% 정도 포화되었을 때 계대 배양하였다.
b) 세포 생존율 측정
시료가 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 MTT 분석을 수행 하였다. MTT 분석은 Hamid 방법(2002)을 변형하여 수행하였다. 세포 증식률(cell viability)은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값과 비교하여 아래 수학식 1로 산출하였다.
[수학식 1]
Cell viability (%) = { 1 - (시료첨가군의 흡광도)/(무첨가군의 흡광도) } × 100
c) 분화 유도, 시료 처리 및 oil red-O 염색
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 3T3-L1 cell의 전구지방세포에서 지방세포로의 분화 유도 과정을 나타낸 그림이다. 도 2를 참조하면, 3T3-L1 cell의 분화 정도를 알아보기 위해 oil red-O로 염색하여 측정하였다. 분화된 세포를 관찰하기 위해서는 배양된 세포를 10% formalin/PBS(phosphate-buffered saline)로 5분간 실온에서 고정한 후 이를 제거하고 60% isopropanol을 이용하여 1회 세척 후 말렸다. 그 후 oil red-O를 30분 동안 넣고 염색한 후 증류수로 4번 세척하였는데 이 때 증류수가 담긴 채로 fat droplets를 현미경으로 관찰하였다. 관찰 후 99% isopropanol을 넣고 180 rpm에서 10분간 녹인 뒤 520 nm에서 측정하였다.
d) Western blot을 이용한 비만 관련 단백질 발현 양상 측정
Western blot 분석을 위해 샘플 처리한 3T3-L1 세포로부터 30 μg의 단백질을 정량한 후 10% acrylamide가 함유된 SDS-PAGE에 의하여 분리하고 PVDF로 전이시켰다. 단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, 표 1에 나타난 ACC(Acetyl-CoA carboxylase), C/EBP-α(CCAAT-enhancer binding Protein-alpha), FAS(Fatty acid synthase), PPAR-γ(peroxisoe peroliferator activated receptor-gamma), SREBP-1(sterol regulatory element binding protein-1) 및 β-actin 단백질 항체를 4℃?에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다. Tween 20이 포함된 Tris Buffered Saline(TBST) 용액으로 세척한 후 2차 항체(antibody)를 첨가하여 90분 동안 상온에서 반응시킨 후, TBST로 10분 간격으로 3회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 반응시켜서 X-ray 필름으로 현상하였다.
[표 1]
e) 실시간(real-time) PCR(RT-PCR)을 이용한 mRNA 발현 양상 측정
샘플 처리한 3T3-L1 세포에 1mL trizol reagent (invitrogen, USA)를 넣고 total RNA 양을 정량하였다. 정량한 RNA를 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)를 이용하여 cDNA를 합성하고 유전자들의 발현을 측정하였다. 유전자 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green시약과 illumine ECOTM qPCR system (PhileKorea Technology, Daejeon, Korea)기기를 사용하였다. 아래 표 2는 RT-PCT에 사용된 프라이머(primer)의 세부사항을 나타낸 것이고, 표 3은 RT-PCT 사이클링 조건을 나타낸 것이다.
[표 2]
[표 3]
<2-3> 항비만 효능평가를 위한 동물 실험
a) 실험동물 및 실험설계
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 실험설계를 나타낸 그래프이다. 도 3을 참조하면, 실험에 사용된 마우스는 4주령의 C57BL/6N 수컷으로 오리엔트 바이오사(Orient Bio Co. Ltd., Seoul, Korea)로부터 구입하였다. 구입한 마우스는 7일 적응기간을 두었으며 적응기간 후 난괴법에 따라 각 실험군마다 8마리씩 배정하여 조제 식이를 8주간 급여하여 사육하였다. 사육장 온도는 21±2℃?, 습도 50±10%에서 12시간 주기로 명암 조절하였다.
b) 실험식이
표 4는 본 실험에 사용된 식이 조성을 나타낸 것인데, 전체적으로 AIN-76 diet 조성에 준하여 제조하였다. 고지방식이(high fat diet) 조성을 구성하는 corn starch 대신 각 샘플(수리취 분말 및 수리취 추출물)을 대신 첨가하여 식이를 만들었다. 이하, '수리취 분말 2.5%' 및 '수리취 분말 5%'는 전체 식이 조성에서 수리취 분말이 각각 2.5wt% 및 5wt% 함유된 식이 또는 이의 처리군을 의미한다. 또한, '수리취 추출 0.44%' 및 '수리취 추출 0.88%'는 전체 식이 조성에서 수리취 추출물이 각각 0.44wt% 및 0.88wt% 함유된 식이 또는 이의 처리군을 의미한다.
[표 4]
제조된 식이는 8주 동안 마우스에 공급되었으며, 마우스의 체중은 매주 1회 동일한 시간에 측정하였다. 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 공급하였으며 식이섭취량은 일주일에 2번 측정하였다. 일반식이 섭취군의 식이는 오리엔트사의 5L79 사료를 사용하였다. 식이효율(Food Efficiency Ratio, FER)은 8주간의 총 사료 섭취량에 대한 체중의 증가량의 비를 나타내며, 아래 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
FER (%) = [Body weight gain (g)] / [Food intake (g)]
c) 희생 및 조직 처리
8주간의 식이 공급이 끝난 실험동물은 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 에테르를 흡입시켜 마취시켰다. 마취 후 anterior facial vein으로부터 eye bleeding 방법을 통해 채혈한 다음 각 장기를 적출하였다. 혈액은 30분간 상온(37℃?)에 한 시간 방치한 뒤 원심 분리(3,000 rpm, 4℃?, 15 min)하여 혈청을 분리하였다. 실험동물의 장기조직은 채혈 후 즉시 적출하여 PBS (phosphate buffered saline)용액으로 수 차례 헹군 후 표면의 수분을 제거하여 칭량하였으며 즉시 액체질소로 급냉시켜 -70℃?에 보관하여 실험에 사용하였다.
d) 부고환지방 및 간 조직의 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색
실험동물에서 적출된 간 조직과 지방 조직을 4% formaldehyde 용액에 24시간 고정시킨 후 탈수 및 포매 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하였다. 제작한 파라핀 블록을 두께 4 μm의 관상 절편으로 제작한 후 xylene을 이용하여 파라핀을 제거시키고, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% alcohol로 친수화 시킨 후 H&E 염색을 하였다. 이후 봉입하여 광학 현미경(Zeizz, Germany)으로 관찰하였다.
e) 간 조직을 이용한 비만 관련 단백질 발현 양상 측정(Western blot)
Western blot 분석을 위해 희생 후 간 조직으로부터 40μg의 단백질을 정량한 후 10% acrylamide가 함유된 SDS-PAGE에 의하여 분리하고 PVDF로 전이시켰다. 단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, 표 1에 나타난 PPAR-γ, SREB-1, C/EBP-α, SREBP-1, FAS, ACC 및 β-actin 단백질 항체를 4℃?에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다. Tween 20이 포함된 Tris buffered saline(TBST) 용액으로 세척한 후 2차 항체(antibody)를 첨가하여 90분 동안 상온에서 반응시킨 후, TBST로 10분 간격으로 3회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 반응시켜서 X-ray 필름으로 현상하였다.
f) 간 조직을 이용한 mRNA 발현 양상 측정(RT-PCR)
희생 후 -70℃? 보관중인 간 조직을 멸균된 Potter-Elvehjem에 넣은 후 1mL trizol reagent(invitrogen, USA)를 넣고 균질화 후 total RNA 양을 정량하였다. 정량한 RNA을 cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)를 이용하여 cDNA를 합성하고 유전자들의 발현을 측정하였다. 유전자 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green시약과 illumine ECOTM qPCR system (PhileKorea Technology, Daejeon, Korea)기기를 사용하였다.
<2-4> 지질대사 개선 효능평가
a) 혈액 및 간 조직 지질 함량
혈청 및 간 조직 중의 중성지방(Triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(Total cholesterol, TC), 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C) 함량 측정은 각각 Bucolo (1973), Allain (1974), Finely (1978)의 분석방법을 이용한 아산제약 kit (Asanpharm Co., Hwasung, Korea)를 사용하였다.
b) 동맥경화지수(Atherogenic index, AI) 및 HTR(High density lipoprotein cholesterol and Total cholesterol Ratio)의 계산
심혈관질환의 위험도 판정에 사용되는 AI는 아래 수학식 3에 의해, HTR은 수학식 4에 의해 계산되었다(Haglund, 1991).
[수학식 3]
AI = [(Total Cholesterol) - (HDL-C)] / (HDL-C)
[수학식 4]
HTR = (HDL-C) / (Total cholesterol)
<2-5> 항당뇨 효능 평가
a) 혈당 측정
혈당은 일주일에 한번씩, 희생 4주 전부터 측정하였다. 6시간 절식 후 꼬리 채혈하여 혈당측정기(Accu-check, Roche, Berlin, Germany)로 측정하였다.
b) 복강 내 내당능 검사
내당능 검사는 복강 내 당부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)를 이용하였다. 희생 1일 전에 12시간 절식시킨 쥐의 꼬리로부터 채혈하여 공복 시 혈당수준을 측정한 후 2 g/kg의 포도당을 10 μL/g body weight 복강투여하고 30, 60, 120분에 꼬리의 정맥으로부터 혈액을 채혈하여 혈당측정기(Accu-check, Roche, Berlin, Germany)로 혈당을 측정하였다.
실시예 3. 총 폴리페놀 함량 및 항산화 활성 측정
<3-1> 총 폴리페놀(total polyphenol) 함량
총 폴리페놀의 함량은 분석방법으로 널리 사용되고 있는 Gutfiger (1981)의 방법을 변형하여 측정하였다. 희석액 100 μL에 Folin-Ciocalteau 용액 100 μL를 가하고 3분간 정치한 다음 1 mL의 0.7 M Na2CO3 용액을 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 반응시킨 후 분광광도계를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 tannic acid로 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
<3-2> DPPH radical 소거 활성 측정
DPPH radical 소거능은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 100 μL에 0.2 mM DPPH 용액 50 μL를 가하고 10분 반응시킨 후 흡광도의 변화를 517 nm에서 측정하였다. DPPH 항산화능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 계산하였고, DPPH 항산화 활성이 50% 감소하는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다.
<3-3> ABTS radical 소거 활성 측정
ABTS radical 소거 활성 측정은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate 용액을 혼합하여 하루 동안 암소에 방치하여 ABTS.+를 형성시킨 후 이 용액을 734 nm에서 0.7-0.9가 되도록 몰 흡광계수를 이용하여 증류수로 희석하였다. 추출물 50 μL에 희석된 ABTS.+ 용액을 100 μL 가해 흡광도의 변화를 정확히 5분 뒤에 측정하였다. ABTS의 항산화능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 계산하였고, ABTS 항산화 활성이 50% 감소하는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다.
실시예 4. 수리취를 활용한 건강증진 식품의 제조
<4-1> 수리취 유산균 과립
본 실시예의 수리취 유산균 과립 식품은 수리취 추출물에 통상의 유산균 분말, 식물성크림분말, 분말결정포도당, 혼합유당, 자일리톨, 프락토올리고당 등을 혼합하여 과립형태로 제조된 것이다. 수리취 유산균 과립 식품은 물이나 우유 등의 음료에 쉽게 용해되기 때문에 직접 섭취하는 목적 이외에도 음용의 편이성이 우수한 제품이다. 미세한 분말 상태의 건조식품을 알맞은 습도 중에 두면 흡습하며 분말성분이 점착성을 가지게 되어 분말은 응집하여 30~150배의 큰 입자를 형성하는데, 이것을 재건조한 과립화된 상태가 되는 과립의 제조원리를 이용하여 제조하였다. 과립화에 의해서 알맹이는 다공질구조가 되어 습윤성이 좋아지고, 동시에 수중에서의 분산, 침강속도가 증대하여 분말제품보다 흐름성이 좋으며 물리적, 화학적으로 안정한 특성을 가진다.
<4-2> 수리취 영양바(영양강정)
본 실시예의 수리취 영양바는 수리취 추출물에 통상의 영양바 재료, 예컨대 너트믹스(산과들에社)제품, 베리다이스(쿡앤베리社), 유당(삼양사), 글리세린(고제공성社). 해바라기유(해표), 검아라빅(MSC), 현미당(삼양사), 말토덱스트린(대상), 산탄검(MSC), 솔비톨(삼양사), 분리대두단백(삼양사), 백설탕(CJ), 식물성유지(대상), 콘푸레이크피(대영에프엔에스), 코코아프리퍼레이션(대영에프엔에스,프랑스産), 크랙비스킷(홈베이킹), 땅콩버터(리고社), 제삼인산칼슘(남영), 비타민C분말(DSM), 비타민B6염산염(남영), L-카르니틴(CP kelco), 코코아매스(홈베이커), 계피분말(두손애약초), 녹차분말(두손애약초), 비타민B2엽산(남영), 식물성크림분말((주)삼양사), 분말결정포도당(CJ), 혼합유당(대상), 자일리톨(CJ), 프락토올리고당(CJ) 등을 혼합하여 제조된 것이다.
수리취 영양바 제품은 중장년 및 노인층의 수요 및 기호도가 높은 제품으로 원료의 형태를 그대로 유지하여 원물의 이미지를 그대로 활용할 수 있는 장점이 있다. 또한 원료의 용해도 등 가공적성에 상관없이 제품화 할 수 있다. 수리취 영양바 제품의 경우 분말을 사용하여 녹색의 산채 이미지를 가질 수 있으며 풍미 측면에서도 너무 강하지 않고 산채 소재의 느낌을 유지 할 수 있다.
실험예 1. 추출 수율, 폴리페놀 화합물 함량 및 항산화 효과
아래 표 5는 수리취 추출물의 추출 수율, 총 폴리페놀 화합물 함량, ABTS 라디컬 소거능 및 DPPH 라디컬 소거능을 측정한 것이다.
[표 5]
표 5에 나타난 바와 같이, 수리취의 추출 수율은 17.50%로 측정되었다. 추출물 중 총 폴리페놀 화합물(total polyphenol compounds) 함량은 125.44 mg/g으로 비교적 높은 함량을 가지는 것으로 확인되었다. 일반적으로 식물에 포함된 polyphenol 화합물은 항산화력이 뛰어나므로, 수리취 추출물도 우수한 항산화력을 가지는 것을 알 수 있다. 항산화력 측정을 위해 ABTS radical 소거활성 및 DPPH radical 소거활성을 측정하였는데, 자유 라디컬을 50% 소거할 때 필요한 시료의 농도인 RC50 수치가 각각 295.64 μg/mL, 187.56 μg/mL로 측정되어 우수한 항산화 효과를 확인하였다.
이하, 실험예 2 내지 4에서 항비만, 항당뇨 및 지질대사 개선효과를 실험하였다.
실험예 2. 소화효소 저해능
<2-1> *j아밀라제(α-amylase) 저해능
α-amylase는 탄수화물의 소화에 관여하는 중요한 효소로서, 섭취된 다당류는 α-amylase에 의해서 이당류로 분해되고, 분해된 이당류는 α-glucosidase에 의해 단당류로 분해되어 흡수된다. 표 6은 수리취 추출물의 α-amylase 저해능을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 수리취 추출물을 이용하여 α-amylase 저해능을 확인한 결과, 소화효소의 50% 저해능을 나타내는 수치인 IC50은 13.65 mg/mL로 확인되었다. 양성대조군(Positive Control, PC)으로 사용된 경구용 혈당강화제인 아카보즈(Acarbose)의 IC50 수치(1mg/mL)보다 낮은 효과를 보였지만, 본 발명이 정제된 단일 물질이 아니라 추출물인 점을 감안하면 매우 우수한 α-amylase 저해능을 가지는 것을 알 수 있다.
[표 6]
<2-2> α-글루코시데이스(α-glucosidase) 저해능
α-glucosidase는 소장에 존재하는 이당류의 소화 효소로서, 섭취된 다당류는 α-amylase에 의해 이당류로 분해되고, 분해된 이당류는 α-glucosidase에 의해 단당류로 분해되어 흡수가 된다. 이때 α-glucosidase를 억제하여 이당류가 단당류로 분해되는 것을 막아 소장 융털에서의 흡수를 지연시켜 식후 혈당의 급격한 증가를 저해시켜 준다. 표 7은 수리취 추출물의 α-glucosidase 저해능을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 수리취 추출물을 이용하여 α-glucosidase 저해능을 측정한 결과, 소화효소의 50% 저해능을 나타내는 수치인 IC50은 5.88 mg/mL로 확인되었다. 양성대조군(Positive Control, PC)으로 사용된 경구용 혈당강화제인 아카보즈(Acarbose)의 IC50 수치(0.058 mg/mL)보다 낮은 효과를 보였지만, 본 발명이 정제된 단일 물질이 아니라 추출물인 점을 감안하면 우수한 α-glucosidase 저해능을 가지는 것을 알 수 있다.
[표 7]
실험예 3. 세포를 이용한 항비만 효능 검증(
in vitro
)
<3-1> 세포독성
수리취 추출물이 세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT 환원 방법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 살아있는 세포에 MTT를 처리하면 미토콘드리아에 있는 환원효소(reductase)에 의해 환원되어 적자색의 formazan crystal을 형성하며, 처리된 물질이 세포독성을 나타낼 경우 세포를 사멸하게 하고, 사멸한 세포의 미토콘드리아는 제 기능을 못하게 되므로, 형성되는 formazan의 양이 줄어들게 된다.
도 4는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 세포 생존율을 측정한 그래프이다. 즉, 수리취 추출물이 3T3-L1 세포에 미치는 독성을 확인하기 위해 최대 400 μg/mL의 농도로 세포에 처리하였을 때 나타나는 생존율을 나타낸 것이다. 실험결과, 소재를 처리하지 않은 무처리군(CON)과 비교하였을 때 실험에 사용한 모든 농도(100, 200, 300 및 400 μg/mL)에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내어 400 μg/mL 이하의 농도에서 실험을 수행하였다.
<3-2> 지방분화억제능
항비만 효능을 확인하기 위하여 Oil red O staining assay를 진행하였다. 3T3-L1 세포에 대하여 Oil red O staining assay를 통해 lipid accumulation 함량 측정함으로써, 지방세포 분화유도 및 지방 축적 정도를 평가하였다.
도 5는 본 발명의 수리취 추출물의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다. 본 실험을 통해, 수리취 추출물에 의한 지방세포의 지방세포 분화유도 억제 및 지방세포 축적 억제를 확인하였다. 구체적으로, 지방분화유도물질처리군(MDI)의 지방분화율을 100%로 하였을 때, 지방분화유도물질과 수리취 추출물을 100, 200, 300, 400 μg/mL의 농도로 함께 처리한 그룹에서 상대적 지방 축적량이 각각 90.77%, 62.75%, 46.00%, 30.24%로 감소하여 전체적으로 수리취 추출물에 의한 지방분화 억제효과를 확인할 수 있었다.
<3-3> 순물질(Scopoletin)의 지방분화억제능
수리취의 효능 지표물질으로 알려진 스코폴레틴(Scopoletin)이 세포 수준에서 항비만 효능을 나타내는지 확인하기 위하여 Oil red O staining assay를 진행하였다.
도 6은 스코폴레틴의 농도에 따른 3T3-L1 세포의 상대적 지방분화율을 측정한 그래프이다. 본 실험을 통해, 스코폴레틴에 의한 지방세포의 지방세포 분화유도 억제 및 지방세포 축적 억제를 확인하였다. 구체적으로, 지방분화유도물질처리군(MDI)에서 100% 지방분화가 유도되었다고 하였을 때, Scopoletin을 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 그룹에서 상대적 지방 축적량이 각각 99.59%, 98.23%, 93.65%, 73.32%, 51.58%로 감소하여 20 μg/mL 농도부터 지방 분화억제 효과가 확인되었다.
실험예 4. 마우스를 이용한 항비만 효능 검증(in vivo)
<4-1> 수리취 급여에 따른 체중변화
마우스모델을 이용한 고지방식이유도 동물실험을 진행한 결과 수리취 추출물 처리그룹에서는 체중 증가 억제 효과를 뚜렷하게 확인할 수 있었다. 도 7은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 체중변화를 측정한 그래프이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 8주차 마우수의 평균 무게를 기준으로 NC(Normal diet Control), HFC(Hight Fat diet Control), 수리취 추출 0.44%, 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 순서로 각각 25.87g, 34.93g, 32.49g, 31.12g으로 측정되었다. 특히 수리취 추출 0.88% 처리군의 경우, HFC 처리군에 비해 11% 낮은 몸무게를 나타내었으며 HFC 처리군 대비 몸무게 증가억제 수준은 약 22%에 달하여 우수한 체중증가 억제효과를 나타내었다.
<4-2> 체중 및 식이섭취량 및 식이효율
식이효율(Food Efficiency Ratio, FER)은 식이 섭취량 대비 몸무게 증가량을 의미하며, 표 8은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 8주차 몸무게 증가량 및 식이효율을 측정한 표이다. HFC 처리군에서 가장 높은 식이효율과 몸무게 증가량을 나타내었으며, 수리취 추출물 섭취군은 모두 PC(가르시니아 캄보지아 추출물 1%)의 식이효율(3.60%)에 비해 확실히 식이효율 저하효과를 나타내었다. 구체적으로, 수리취 추출 0.44 % 및 수리취 추출 0.88% 처리군은 각각 3.15%, 2.68%의 식이효율을 보였다.
[표 8]
<4-3> 장기 및 지방조직에 대한 영향
표 9는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 8주차 장기 및 지방조직의 무게를 측정한 표이다. HFC 처리군를 기준으로 하였을 때, 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 부고환지방(epididymal fat, EP)은 각각 23.18%, 44.92% 감소하였으며, 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 신장지방(retroperitoneal fat, RP)은 각각 25.34%, 36.40% 감소하였다.
[표 9]
<4-4> 지질대사에 대한 영향
a) 혈 중 중성지질 및 콜레스테롤 함량 측정결과
표 10은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 8주차 혈액에 함유된 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 것이다. HFC 처리군의 중성지질(TG) 및 콜레스테롤(TC)은 각각 150.26 mg/dL, 249.55 mg/dL로 매우 증가하였다. 이에 반해 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 중성지질(TG)는 각각 147.42 mg/dL, 133.14 mg/dL로 유의적으로 감소하는 경향을 보였으며, 콜레스테롤(TC)의 경우에도 각각 244.43 mg/dL, 221.58 mg/dL로 콜레스테롤 개선효과를 확인하였다. 또한 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 경우, 콜레스테롤 중 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 비율인 HTR(%)은 유의적으로 증가하고, 동맥경화지수(AI)는 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 수리취 추출물은 고혈압 및 심혈관계 질환 등에 도움을 줄 수 있다.
[표 10]
b) 간 조직의 중성지질 및 콜레스테롤 함량 측정결과
표 11은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대하여 8주차 간 조직에 함유된 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 것이다. 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 간에서도 우수한 중성지방 및 콜레스테롤 감소효과를 확인하였다.
[표 11]
<4-5> 부고환 지방 및 간의 형태학적인 관찰
도 8은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 부고화 지방과 간을 광학 현미경으로 촬영한 사진이다. 구체적으로, 부고환 조직과 간 조직 일부를 H&E 염색하여 형태학적인 관찰을 시행하였다.
부고환 조직의 경우, NC와 비교하여 HFC가 지방 droplet의 크기가 증가하는 것을 확인 되었으며 비만이 유도된 것을 확인하였다. 하지만 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 경우, 지방 droplet의 크기가 PC와 비슷하게 감소하여 전체적으로 지방 생성 억제 효과가 확인되었다.
간 조직의 경우, NC와 비교하여 HFC가 지방 droplet의 개수 및 크기가 확연히 증가하는 것을 확인하였다. 수리취 추출 0.44% 및 수리취 추출 0.88% 처리군의 경우, 지방 droplet의 개수가 현저히 감소한 것이 확인되었다. 이는 Adipogensis 관련 인자들이 저해되었기 때문이다.
<4-6> 주별 혈당 측정 결과
도 9는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 희생 전 4주간 꼬리정맥채혈하여 주당 1회 혈당 검사를 진행한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 9를 참조하면, HFC, PC(가르시니아캄보지아 1%) 처리군의 경우 대부분 200 mg/dL의 포도당 수치를 나타내어 당뇨 증상을 확인하였으나, 수리취 추출물 처리군의 경우 NC 처리군과 유사한 혈당 수치를 유지하여 혈당 감소 효과를 확인하였다.
<4-7> 내당능 결과
내당능이란 생체 내 glucose의 처리 능력을 뜻한다. 운동부족 및 비만 환자들에게서는 대게 인슐린에 대한 저항성이 증가하여 당뇨병을 야기하는 빈도가 높다. 도 10은 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스의 복강 내 당부하시험(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 결과를 나타낸 그래프이다. 본 실험에서 내당능 검사를 진행한 결과 HFC 처리군의 경우 혈당 주사 후 30분이 지난 시점에서 혈당이 급격히 상승하는 결과를 보여 인슐린 저항성 당뇨증상이 확인 되었으나, 수리취 추출물 처리군은 HFC 처리군에 비하여 혈당 상승 수치가 현저하게 감소하여 PC 처리군(242 mg/dL)와 비슷한 수준의 혈당 수치 보였다. 특히 수리취 추출 0.88% 처리군의 경우 60분 경과시에 PC보다 낮은 수치인 220mg/dL에 접어들어 우수한 내당능 개선 효과를 보였다.
<4-8> 간 조직의 비만관련 mRNA 발현율 확인
생체 내 에너지 대사 과정은 지방 조직 및 간 조직에서 발현되는 여러 가지 전사인자(transcription factor)의 활성에 의해 조절되며, 이들은 식후와 공복 시 대사과정에 의해 정교히 통제 된다. 그 중 지방분화(Adipogenesis)에 중추적인 역할을 하는 PPAR-γ, C/EBP-α, SREBP-1c(sterol regulatory element binding protein-1c)와, 지질생성(Lipogensis)에 중추적인 역할을 하는 FAS, ACC에 대하여 mRNA 발현을 확인하였다. 도 11a, 도 11b 및 도 11c는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지방분화(Adipogenesis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이고, 도 12a 및 도 12b는 본 발명의 수리취 추출물을 섭취한 마우스에 대해 지질생성(Lipogensis) 관련 인자의 mRNA 발현 저해능을 측정한 그래프이다. 도시된 바와 같이, 수리취 추출물은 Adipogensis 및 Lipogenesis 과정에 관여하는 중요 인자들을 mRNA 수준에서 저해하는 것이 확인되었으며, 실험 동물에서 체중 감소 및 콜레스테롤 감소는 이와 실질적으로 동일한 인과관계를 가진다. 특히 수리취 추출물 급여 처리군의 경우 모든 인자들에 대하여 매우 우수하게 mRNA 발현 수준을 억제하는 것으로 확인되었다.
이상의 실험결과로부터, 수리취 추출물은 체내에서 α-amylase, 및 α-glucosidase을 저해시켜 전분 및 당의 저분자화를 억제시키고 이에 따라 체내 당 흡수 저해 효과가 있음이 확이 되었다. 또한, 지방 세포의 분화유도 및 지방 축적 정도를 평가하는 지표로 사용되는 3T3-L1 전지방세포에 수리취 추출물을 100, 200, 300, 400 μg/mL의 농도로 함께 처리한 그룹에서 각각 90.77%, 62.75%, 46.00%, 30.24%로 감소시켜 지방분화 억제효과를 세포수준에서 확인하였다. 또한 수리취의 지표물질로 알려진 Scopoletin 역시 5, 10, 20, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리한 결과 각각 99.59%, 98.23%, 93.65%, 73.32%, 51.58%로 감소하여 20 μg/mL 농도부터 지방 분화억제 효과가 확인되었다.
수리취 추출물이 생체 중 효능을 보이는지 확인하기 위해 동물 실험을 통해 고지방식이로 비만유도를 진행한 결과, PC(가르시니아캄보지아추출물 1%)보다 뛰어난 체중증가 억제효과, 부고환지방 및 신장지방 감소효과를 보였으며 혈당 강하 효과 및 내당능 개선효과도 보였다. 또한 혈중 및 간 중 중성지질 및 콜레스테롤 개선 효과 역시 수리취 추출물에서 나타났다. 종합적인 결과를 바탕으로 작용기전을 연구한 결과 Adipogenesis, Lipogenesis 등 지방 생성 및 지방산 생성 경로에서 중요하게 작용하는 인자들의 발현을 mRNA 전사 수준에서 감소시켰으며 현재 고시형 소재 중 가장 인기 많은 PC(가르시니아캄보지아추출물 1%)에 상응하거나 더욱 좋은 효과를 확인할 수 있었다.
이와 같이 수리취 추출물을 유산균 과립 및 영양바로 제품화할 경우 건강기능식품으로서 가치가 기대되며 부작용 문제가 대두되는 합성제제를 대체할 수 있을 뿐만 아니라 지역농가소득 증대를 위한 대책으로도 활용가능성이 충분하다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (5)
- 수리취 건조분말로부터 주정용액을 용매로 사용하여 용매추출한 수리취 추출물을 유효성분으로 포함하되, 상기 수리취 추출물에는 식이섬유가 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 비만 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 수리취 추출물은, 수리취 건조분말을 70% 주정용액으로 추출하여 얻어진 것을 특징으로 하는 식품 조성물. - 제1항의 식품 조성물과 유산균 분말을 혼합하여 제조된 유산균 과립.
- 제1항의 식품 조성물을 포함하는 영양바.
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