KR20160143938A - 개똥쑥 열수추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 식품조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개똥쑥 열수추출물의 제조방법, 이 방법으로 제조하는 개똥쑥 열수추출물을 포함하는 식품첨가제, 및 건강기능식품을 제공한다. 상기 개똥쑥 열수추출물은 경구 투여 시 고지방 고칼로리 식품으로 인한 지방생성을 억제한다는 점이 동물실험에서 확인되었으며, 고열량 식이에서 체중 감소를 감소시키고 지방세포 형성을 억제한다.

Description

개똥쑥 열수추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 식품조성물{PREPARATION METHOD OF Artemisia annua EXTRACT AND COMPOSITIONS CONTAINING OF THE SAME}

본 발명은 개똥쑥 열수추출물의 제조방법과 지방세포 생성 및 지방 축적을 억제하는 기능을 가진 개똥쑥 열수추출물을 함유하는 식품조성물에 관한 것이다.

지방 조직은 에너지 저장, 체온조절, 그리고 아디코파인과 사이토카인을 포함하는 다양한 호르몬원으로 역할을 한다. 지방조직은 지용성 비타민의 흡수에 필수적이고, 세포막의 구성성분이기도 하다. 그러나, 지속적인 고지방 식이는 체내에 과도한 지방생성에 의한 비만의 원인이 된다.

서방 국가들에서 특히, 대부분의 사람들이 규칙적인 운동 없이 고지방 고칼로리 음식을 섭취한다. 이런 고열량의 식사가 주를 이루는 식생활로의 변화나 운동 부족, 스트레스의 증가에 의해 인체의 항상성이 교란되고 있으며, 이에 따라 각종 비만 및 관련 대사성 질환이 급증하고 있다.

관련 대사성 질환은 2형 당뇨병 및 고혈압뿐 아니라, 뇌졸중, 동맥경화 등 심혈관 질환과 각종 암에 이르기까지 인류의 건강 및 생명을 위협하는 심각한 질환을 포함한다. 20세기 후반에 비하면 비만율은 5 내지 10배 증가하였다. 결과적으로 많은 제약회사들은 비만을 타겟으로 하는 약에 투자해왔다.

알려진 비만치료제로는 제니칼(Xenical, 로슈제약회사, 스위스), 리덕틸(Reductil, 에보트사, 미국), 엑소리제(Exolise, 아토파마, 프랑스) 등으로 크게 식욕억제제, 에너지소비 촉진제, 지방흡수억제제로 분류되며, 대부분의 비만치료제는 시상하부와 관련된 신경전달물질을 조절함으로써 식욕을 억제하는 식욕억제제이다.

그러나, 종래의 치료제들은 심장질환, 호흡기질환, 신경계질환 등의 부작용과 함께 그 효능의 지속성도 낮아 더욱 개선된 비만치료제 또는 치료보조제의 개발이 필요하다.

국내공개번호제10-2008-0055765호, 공개일: 2008.06.19 국내공개번호제10-2011-0121849호, 공개일: 2011.11.09

본 발명의 목적은 부작용이 적으면서도 효과적으로 지방축적 억제 및/또는 지방세포 분화 억제를 유도하여 비만을 억제할 수 있는 식품첨가제 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 개똥쑥 열수추출물의 제조방법은, 물 1000 중량부를 기준으로 개똥쑥을 15 내지 30 중량부로 포함하도록 추출원재료를 준비하는 준비단계; 상기 추출원재료를 추출장치에 넣고 1.0 내지 2.0 bar의 추출압력과 60 내지 90 ℃의 추출온도를 유지하면서 20 분 내지 1 시간의 추출시간 동안 유지하는 추출과정으로 추출원액을 제조하는 추출단계; 그리고 상기 추출원액에서 고형분을 제거하여 개똥쑥 열수추출물을 얻는 필터단계;를 포함한다.

상기 개똥쑥 열수추출물은 경구 투여 시 고지방 고칼로리 식품으로 인한 지방생성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 다른 식품조성물은, 개똥쑥 열수추출물을 유효성분으로 포함하여 식품 섭취로 인한 지방생성을 억제한다.

상기 개똥쑥 열수추출물은 위에서 설명한 방법으로 제조된 것이고, 상기 식품조성물은 고지방 고칼로리 식품에 첨가되는 식품첨가제 또는 체중증가를 감소시키고 지방분해를 촉진하는 건강기능식품일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

개똥쑥(Artemisia annua)은 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 한해살이풀로, 한국, 일본, 타이완, 몽골, 시베리아 등지의 길가, 빈터, 강가 등에서 자라는 식물이다. 풀 전체에 털이 없고 특이한 냄새가 나며, 줄기는 녹색으로 가지가 많이 갈라진다. 잎은 어긋나고 2 내지 3회 가늘게 깃꼴로 깊게 갈라지며, 길이 4 내지 7cm로 모양은 바소꼴이고 겉에 잔털과 선점이 있다. 잎 가운데가 빗살 모양으로 되어 있고 위쪽 잎이 작은 특징이 있다. 꽃은 6 내지 9월에 녹황색으로 피며, 작은 두상화가 이삭처럼 달려서 전체가 원추꽃차례를 이룬다. 한방에서는 발열감기·학질·소아경기·소화불량·이질 등의 치료에 사용하는 식물이다.

본 발명의 발명자들은 식이유도 비만 동물모델{diet-induced obesity(DIO) animal model}을 이용하여 경구 투여한 개똥쑥 열수추출물이 지방세포형성을 억제하고 고지방 고칼로리 식이에서 체중 증가를 감소시켜주며, 지방세포의 분화를 억제하여 항비만 기능성을 갖고, 특히 내장지방의 지표가 되는 부고환 지방조직(epididymal fat tissue)에서 지방형성 관련 mRNA 발현과 지방방울의 크기 감소를 가져온다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 개똥쑥 열수추출물의 제조방법은, 물 1,000 중량부를 기준으로 개똥쑥을 15 내지 30 중량부로 포함하도록 추출원재료를 준비하는 준비단계; 상기 추출원재료를 추출장치에 넣고 1.0 내지 2.0 bar의 추출압력과 60 내지 90 ℃의 추출온도를 유지하면서 20 분 내지 1 시간의 추출시간 동안 유지하여 추출원액을 제조하는 추출단계; 그리고 상기 추출원액에서 고형분을 제거하여 개똥쑥 열수추출물을 얻는 필터단계;를 포함한다.

상기 개똥쑥은, 개똥쑥을 채취하여 건조 및 파쇄한 것일 수 있고, 분말화한 것일 수 있다. 상기 건조 및 파쇄되는 개똥쑥은 개똥쑥의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 열매, 이들의 혼합, 또는 전초일 수 있으며, 건조는 채취한 개똥쑥의 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 상기 파쇄는 이후 추출과정에서 개똥쑥의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄하면 족하며 분말화하는 것도 좋다. 상기 건조와 파쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.

상기 개똥쑥 열수추출물은 개똥쑥의 유리한 성분들을 추출하기 위한 용매로 물을 적용한다. 상기 용매로 적용되는 물은, 물이라면 제한 없이 적용되나, 증류수를 적용하는 것이 좋다.

상기 물과 상기 개똥쑥의 혼합 비율은 물 1,000 중량부를 기준으로 개똥쑥 15 내지 30 중량부로 적용할 수 있고, 18 내지 25 중량부로 적용할 수 있다. 상기 개똥쑥을 상기 물 1,000 중량부를 기준으로 15 중량부 미만으로 추출하면 개똥쑥 열수추출물에 포함되는 유효성분이 함량이 미미할 수 있고, 30 중량부를 초과하여도 일정량 이상은 체내 흡수되지 않으므로 개똥쑥의 낭비가 있을 수 있다. 상기 물과 개똥숙의 혼합비율은 18 내지 25 중량부로 적용하는 것이 좋은데, 이 범위에서 효과적으로 항비만 기능성을 갖는 개똥쑥 열수추출물을 얻을 수 있다.

상기 추출장치는 개똥쑥 열수추출물을 효율적으로 제조할 수 있다는 면에서 압력장치인 것이 좋은데, 예를 들어 약탕기와 같은 장치도 사용할 수 있다.

상기 추출압력은 1.0 내지 2.0 bar일 수 있고, 1.3 내지 1.7 bar일 수 있다. 이 압력의 범위에서 추출단계를 진행하는 경우 열수추출물을 효율적으로 제조할 수 있다.

상기 추출온도는 60 내지 90 ℃일 수 있고, 70 내지 80 ℃일 수 있다. 상기 추출온도의 범위에서 추출이 이루어지는 경우 개똥쑥 열수추출물에 항비만의 기능성을 충분히 가지도록 추출할 수 있다.

상기 추출시간은 20 분 내지 1 시간일 수 있고, 30 분 내지 40 분일 수 있다. 위의 추출시간 동안 추출단계를 진행하는 경우 효율적으로 항비만 기능성의 가지는 개똥쑥 열수추출물을 얻을 수 있다.

상기 필터단계를 상기 추출원액에서 고형분을 제거하는 단계로, 상기 추출단계에서 얻어진 추출원액은 그대로 또는 필요에 따라 이후 농축단계를 거치거나 희석단계를 거쳐서 진행될 수 있다. 상기 필터단계는 종이필터, 날진 필터 등이 적용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 개똥쑥 열수추출물의 제조방법으로 얻어진 개똥숙 열수추출물은 항비만 기능성을 갖는다.

상기 개똥쑥 열수추출물을 식이유도 비만동물모델에서 경구 투여 시에, 식욕이나 음식 섭취량의 제한 없이 내장비만의 지표 중 하나인 부고환 지방조직에서 지방방울의 크기가 감소하고 지방형성 관련 mRNA 발현이 억제된다는 점이 확인됐다. 이러한 특징은 고열량 고지방 식이 군에서 더 뚜렷하게 나타났으며, 이는 고열량 고지방 식이를 하더라도 상기 개똥쑥 열수추출물을 함께 섭취하면 내장지방형성을 줄일 수 있는 기능성을 갖는다는 것을 의미한다.

상기 개똥쑥 열수추출물을 식이유도 비만동물모델에서 경구 투여 시에, 체중증가를 감소시키고 지방세포의 분화를 억제시키는 효과를 확인할 수 있었고, 이는 식욕이나 음식섭취량 제한 없이 고열량 고지방 식이를 하더라도 체중 증가를 줄일 수 있고 지방세포를 줄일 수 있다는 점을 의미한다.

특히, 상기 개똥쑥 열수추출물은 지상세포의 분화 및 성숙과 관련하여 C/EBP-β 발현을 억제하는 C/EBP-β 발현 억제제로써 기능한다. 상기 C/EBP-β는 지방세포의 분화의 마지막 단계에 관여하는데 상기 개똥쑥 열수추출물은 이의 발현을 억제하여 지방세포의 성숙을 억제할 수 있다. 또한, 상기 개똥쑥 열수추출물은 또한 지상세포의 분화 및 성숙과 관련하여 PPAR-γ의 발현을 억제하는 PPAR-γ 발현 억제제로도 기능하는데, 성숙 지방세포의 발달에 필요한 단백질 유전자의 발현을 조절하는 단백질의 핵 호르몬 수용체인 PPAR-γ의 발현을 억제하여 지방생성이 억제되고 지방세포의 형성이 억제할 수 있다.

즉, 상기 개똥쑥 열수추출물을 고열량 고지방 식이와 함께 또는 별도로 섭취하는 경우, 내장지방 형성을 줄일 수 있고, 체중 증가를 감소시키고 지방세포 형성을 줄일 수 있는 기능성을 갖는다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품조성물은 개똥쑥 열수추출물을 유효성분으로 포함하여 식품 섭취로 인한 지방생성을 억제하는 기능성을 갖는다. 상기 개똥쑥 열수출물의 제조방법 및 기능성에 대한 설명은 위와 중복되므로 그 기재를 생략한다.

상기 식품조성물은 건강기능식품, 영양보조제, 건강식품, 또는 식품첨가물의 형태로 식품조성물로 활용될 수 있다.

상기 식품조성물은 식품보조첨가제와 함께 적용될 수 있는데, 상기 식품보조첨가제는 이 기술분야에서 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 또한, 상기 식품조성물은 상기 개똥쑥 열수추출물을 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등; 과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용하는 것도 좋다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.5 내지 30 g이다.

상기 식품조성물은 다양한 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

상기 식품첨가물을 적용할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 상기 각종 식품류로는 구체적으로, 음료(알콜성 음료 포함), 과실과 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 이의 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.05 내지 30 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.05 내지 30 g 가할 수 있다.

상기 식품조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1㎏ 당 0.001 내지 5g의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 개인에 대한 투여용량 수준은 개인의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 흡수율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

특히, 상기 식품조성물은 고지방 고칼로리 식품에 첨가되는 식품첨가제 또는 체중증가를 감소시키고 지방분해를 촉진하는 건강기능식품으로 활용될 수 있다. 상기 식품조성물의 유효성분인 개똥쑥 열수추출물은 고지방 고칼로리 식품으로 인한 지방생성을 억제하여 고칼로리 식이 에도 체중증가를 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 식품조성물에 포함되는 유효성분인 개똥쑥 열수추출물은 천연물 유래 추출물로 화학물 비만치료제와 비교하여 부작용이나 지속적인 약물 적용에 대한 내성이 적은 장점을 가질 수 있다.

본 발명의 개똥쑥 열수추출물의 제조방법, 이 방법으로 제조하는 개똥쑥 열수추출물을 포함하는 식품첨가제, 및 건강기능식품은, 경구 투여시 고열량 식이에서도 체중 감소를 감소시키고 지방세포 형성을 억제는 효과가 있어서, 비만 억제용 식품첨가제 또는 건강기능식품으로 활용도가 높다.

도 1은 본 발명의 실시예 2의 동물실험에서 측정한 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2은 본 발명의 실시예 2의 동물실험에서 사료섭취량(위: 섭취한 사료무게, 아래: 섭취열량)을 측정한 결과이다.
도 3는 본 발명의 실시예 2의 동물실험에서 체중변화에 대한 표준오차(Standard error)를 나타낸 표이다{Bar: SE(standard error), *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, ****p<0.001}
도 4는 본 발명의 실시예 2의 4)에서 시행한 H&E 염색으로 지방세포를 관찰한 결과이다(스케일바: 200μm).
도 5는 본 발명의 실시예 2의 4)에서 시행한 H&E 염색으로 지방세포를 관찰한 결과를 통계적으로 비교한 결과이다(*p<0.05, ****p<0.001).
도 6은 본 발명의 실시예 2의 5)에서 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3의 2)에서 3T3-L1 세포주의 지방세포로의 분화를 위한 처리 과정을 나타낸 그림이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3의 3)에서 웨스턴 블롯 분석을 한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 실시예 3의 3)에서 웨스턴 블롯 분석의 밴드 강도를 광학밀도로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다(***p<0.005, ****p<0.001).
도 10는 본 발명의 실시예 3의 3)에서 세포배양 8일째에 오일 레드 오 염색으로 지방세포를 관찰한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1: AA 열수추출물의 제조

말린 개똥쑥 40 g을 증류수 1.8 L 와 함께 용기(압력장치)에 담고 30분 동안 1.5bar, 80℃에서 가열하여 추출원액을 제조하였다.

상기 추출원액을 종이 필터(Advantec® 185mm)를 이용하여 1차 필터링을 한 후, 2차 필터링(Disposable Nalgene, 0.2 um pore)하여 AA열수추출물을 제조하였다.

실시예 2: 동물실험

1) 실험동물의 준비

실험동물로 24 마리의 C57BL/6J 마우스(평균 23g, 21 내지 25g 체중의 7 주령)을 준비하여, 22 ℃, 습도 60%의 조건에서 낮밤 싸이클을 07:00 내지 19:00의 12시간으로 조절하여 사육하였다. 24마리의 마우스는 4 그룹으로 나누어 실험을 진행했고, 두 그룹에는 정상 식이를(2018S, Harlan, USA, ND로 표시), 다른 두 그룹에는 고지방식이(TD.06414, Harlan, USA, HF로 표시)를 제한 없이 제공했으며, 물도 제한 없이 제공했다.

2) AA 열수추출물의 제공

상기 1에서 제조한 AA 열수추출물(Artemisia annua extract)을 주입관을 이용해서 매일 10ml/1kg/day 용량으로 정상식이 실험군(ND/AA group)과 고지방 식이 실험군(HF/AA group)에 각각 경구투여 하였다. 대조군으로 각각 ND 그룹(ND/Veh group)과 HF 그룹(HF/Veh group)에도 증류수를 동량으로 투여했다.

위의 마우스는 실험 후 개복하여 지방세포(epididymal adipose tissues)를 채취한 후 희생하여 뇌, 간, 췌장, 및 신장을 채취하였다.

3) 생리학적 데이터 분석

실험은 4주(28일) 동안 수행되었고, 실험군과 대조군 마우스들의 체중, 사료섭취량 및 물섭취량을 매일 기록하여 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 각각 ▼, ▽, ○, 및 ●은 HF/Veh group, HF/AA group, ND/AA group 및 NA/Veh group을 의미한다. 또한, 도 3는 마우스들의 체중변화에 대한 대한 표준오차(Standard error)를 나타내었다.

상기 도 1 내지 3을 참조하면, 마우스들은 실험 초기에는 체중이 매우 유사했고, ND 그룹이 HF/Veh 그룹보다 덜 나가는 결과를 보여주었다. 마우스들의 체중의 차이는 실험 14일째에서 통계적으로 유의미한 차이점을 보여주었는데, HF/AA가 HF/Veh보다 체중 증가가 줄어든 것으로 나타났고 실험이 진행될수록 그 차이는 분명해졌다. 다만, ND/Veh과 ND/AA 사이에는 실험 초기부터 큰 차이가 없었다. 사료섭취량의 면에서도, 그룹들 사이에 큰 차이는 없으나, HF/AA가 미미하게 HF/Veh보다 음식섭취량이 적은 것으로 나타났다.

즉, Veh를 섭취한 군보다 AA를 섭취한 군에서 체중증가억제효과가 뚜렷하게 나타나며, 체중증가억제효과는 normal diet를 섭취한 군(ND/Veh, ND/AA)보다 high fat을 섭취한 군(HF/Veh, HF/AA) 사이에서 더 뚜렷하게 나타났다.

실험에서 마우스들의 혈당 농도도 측정했는데, 이들의 혈당 농도에는 차이가 나타나지 않았다.

4) Epididymal adipose tissue Hematoxylin and Eosin staining

위의 실시예 1의 2)에서 채취한 지방세포를 4% 파라포름알데히드(para formaldehyde, PFA)에 24시간 고정 후 파라핀 블록을 제작하고, 8um 두께로 박절하여 조직슬라이드를 준비하였다.

조직 슬라이스는 자이렌(xylene)을 이용하여 탈파라핀, 에탄올을 이용한 함수처리를 순차로 시행한 후, Harris hematoxylin과 Eosin Y으로 염색하고, 에탄올을 이용한 탈수, 자일렌을 이용한 투명화 처리 후 캐나다 발삼을 이용해 고정하여 관찰하였다. 이렇게 관찰한 지방조직은 도 4에 나타냈다.

또한, 지방 방울의 크기는 현미경에서 시험 면적을 기준으로 측정했다. 데이터는 지방방울 사이즈를 Image J를 이용하여 측정한 결과, ND/Veh, ND/AA, HF/Veh 및 HF/AA 그룹에서 각각 1981±160, 1177±94, 2594±258 및 1232±91으로 나타났고(*p<0.05, ****p<0.001), 그 통계분석 결과는 도 5에 나타냈다. mean ± SE(standard error)로 나타냈다. 상기 도 5를 참조하면, AA를 도입한 ND와 HF 그룹 모두에서 AA를 도입하지 않은 ND와 HF 그룹(Veh만 도입)과 비교하여 지방 방울 사이즈가 줄어들었다는 점을 보여준다.

즉, Veh를 섭취한 군과 비교하여 AA를 섭취한 군에서의 지방방울 크기가 훨씬 작은 것을 확인할 수 있었고, 이는 지방 조직 분화가 AA를 투여한 실험군들에서 Veh를 투여한 대조군들과 비교하여 억제되었음을 의미한다.

5) Adipose tissue real time-PCR

Ambion PureLink RNA Mini Kit(Ambion, Austin, TX, USA)의 권장설명에 따라서 채취한 마우스의 지방조직으로부터 총 RNA를 분리하고, ABI Step One Real Time PCR instrument(Applied Biosystems, Cheshire, U.K.)와 SYBR Green dye를 이용해서 정량적 실시간 PCT (Quantitative real time PCR) 분석을 수행했다.

상대적으로 정량적인 유전자 발현을 위해서, comparative Ct method (ΔΔCt)를 적용했다. 프라이머와 프로브의 서열은 아래 표 1과 같다.

지방형성 유전자 (Adipogenic gene)		서열(Sequence)	Accession no.
PPAR-γ	Forward	5‘-TTG CTG AAC GTG AAG CCC ATC GAG G-3‘	CG301269
	Reverse	5‘-GTC CTT GTA GAT CTC CTG GAG CAG-3‘
CEB/P-α	Forward	5‘-GAC ATC AGC GCC TAC ATC GA-3‘	NM_007678
	Reverse	5‘-TCG GCT GTG CTG GAA GAG-3‘
CEB/P-β	Forward	5‘-ATT TCT ATG AGA AAA GAG GCG TAT GT-3‘	NM_009883
	Reverse	5‘-AAA TGT CTT CAC TTT AAT GCT CGA A-3‘
CEB/P-δ	Forward	5‘-TTC CAA CCC CTT CCC TGA T-3‘	NM_007679
	Reverse	5‘-CTG GAG GGT TTG TGT TTT CTG T-3‘

ND/Veh, ND/AA, HF/Veh 및 HF/AA 각각에서, PPAR-γ, C/EBP-α, C/EBP-β 및 C/EBP-δ mRNA 발현을 RT-PCR로 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 상대적 mRNA 발현 수준은 real-time qPCR에 의하여 자동으로 측정되었다.

상기 도 6을 참조하면, AA 도입 그룹과 그렇지 않은 그룹 사이에 PPAR-γ, C/EBP-α 및 C/EBP-δ 발현에는 차이가 나타나지 않았으나, HF/Veh 그룹과 비교해 HF/AA 그룹에서 C/EBP-β 발현 억제 효과가 확연하게 나타났다. ND 도입 그룹들에서 C/EBP-β 발현의 감소는 Veh을 도입한 그룹에서 확인되었지만 그 차이가 유의미하지는 않았다 (***p<0.005).

실시예 3: 3T3-L1 세포주 실험

1) 세포 배양

3T3-L1 세포주를, 5% CO2 와 7 ℃ 조건의 배양기에서 10% 우아혈청(bovine calf serum, BCS, Hyclone, South Logan, UT, USA)과 항생제(페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100mg/ml)를 보충한 고-글루코오스(25mM) DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco-Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 confluent상태가 되도록 배양했다.

2) 지방세포로의 분화

지방세포로 분화를 위하여 추가로 이틀 동안 배양한 시점에서, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)와 함께 1 uM 덱사메타손(Sigma, St. Louis, MO, USA), 5mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX: Sigma, St. Louis, MO, USA) 그리고 4 mg/ml 인슐린(Ins: Sigma, St. Louis, MO, USA)이 포함된 DMEM를 함유하는 DIM(differentiation inducing media)로 처리하였다. 이틀 경과 후, 10% FBS과 인슐린을 함유하는 DMEM에서 세포를 배양했고, 배지는 이틀에 한번 교환했다.

실험시작 0일째에, 실험군에 DIM과 AA 열수추출물을 처리했고, 인슐린은 이틀 후에 처리하였으며, 10% FBS를 각각 실험시작 4일째와 6일째에 처리하였다(도 7 참고). AA 열수추출물은 5, 10, 15 부피%로 농도에 변화를 주어 처리하였다.

3) 웨스턴 블롯 분석

세포 추출물을 lysis buffer(Intron, Seongnamsi, Korea)에서 균질화하고, BCA kit (Intron, Seongnamsi, Korea)을 이용하여 단백질 농도를 확인했다. 용해물을 10% SDS-PAGE로 분리했고, PVDF 막(Bio Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 상기 막은 PPAR-γ FABP4, GAPDH (Cell Signaling Technologies, Denvers, Messachusetts, USA)과 C/EBPβ (Abcam, Cambridge, UK)의 1차 항체로 탐침하고, 하룻밤 유지하였다. 추가 세척 후, 막은 HRP 공액 2차항체(HRP-conjugated secondary antibody, Vector, Burlingame, CA, USA)로 처리되었다. 면역반응성 신호는 증가된 화학발광으로 측정되었고, MicroChemi 4.2 system으로 기록되었고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 또한, 웨스턴 블롯팅의 밴드 강도는 광학밀도를 기초로 평가되었고, 광학밀도는 NIH Image 1.59 software을 이용해서 mean gray levels으로 변환한 후 광학밀도식{optical density= log (256/mean gray level)}을 이용하여 평가하여 도 9에 나타내었다.

상기 도 8 및 도 9를 참조하면, AA로 처리한 군에서 PPAR-γ가 실험 3일째 이후로 유의미하게 억제되었다. C/EBP-β의 경우 실험 1일째와 2일째 억제되었다. FabP4도 AA 처리한지 3일, 5일 및 8일째에 억제되었다는 점을 확인할 수 있었다(***p<0.005, ****p<0.001).

즉, 웨스턴 블로팅 결과는 AA 처리군에서 PPAR-γ, C/EBP-β 및 FabP4의 발현이 줄어든다는 것을 보여준다. PPAR-γ은 기능적 성숙 지방세포의 발달을 위해 필요한 단백질의 유전자 발현을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하는 핵 호르몬 수용체이다. C/EBP-β는 마지막 지방세포 분화에 상조적 역할을 하고, FabP4는 성숙한 지방세포에서 발견된다. 이러한 인자들의 발현이 지방생성이 억제되었을 때에 역시 감소되고 지방세포가 증가하면 이러한 인자들도 역시 증가한다고 보고되고 있으므로, 위의 웨스턴 블롯 분석 결과는 AA가 지방생성 및/또는 지방세포 성숙을 위한 주요 단백질 발현을 억제한다는 점을 보여주는 결과이다.

4) Oil Red O Staining

오일 레드 오 염색(Oil Red O Staining)을 지방세포 유도 8일째에 진행했다. 배양된 세포는 PBS로 두 번 세척한 후 실온에서 1시간 동안 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, 60% 이소프포판올로 세척된 후 완전히 건조 처리 된 후에, 오일 레드 오 시약(오일레드오 분말을 0.5% 함유하는 이소프로판올 6 중량부와 물 4중량부의 혼합물)으로 10분 동안 염색되었고, PBS로 세척되었다.

이렇게 염색된 세포는 지방세포의 분화 정도를 현미경으로 관찰했고 그 결과를 도 10에 나타냈다. 상기 도 10을 참조하면, 대조군과 비교하여 AA 처리를 한 실험군에서 지방세포 분화가 눈에 띄게 감소하였음을 확인할 수 있었다.

위에서, 각 실험군들 사이의 차이점은 Duncan’s new multiple methods를 따라 일원 변량 분석(repeated one-way analysis of variance)을 반복해서 실시하여 나타냈다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (4)

1. 물 1000 중량부를 기준으로 개똥쑥을 15 내지 30 중량부로 포함하도록 추출원재료를 준비하는 준비단계;
   상기 추출원재료를 추출장치에 넣고 1.0 내지 2.0 bar의 추출압력과 60 내지 90 ℃의 추출온도를 유지하면서 20 분 내지 1 시간의 추출시간 동안 유지하는 추출과정으로 추출원액을 제조하는 추출단계; 그리고
   상기 추출원액에서 고형분을 제거하여 개똥쑥 열수추출물을 얻는 필터단계;를 포함하는, 개똥쑥 열수추출물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 개똥쑥 열수추출물은 경구 투여 시 고지방 고칼로리 식품으로 인한 지방생성을 억제하는 것인, 개똥쑥 열수추출물의 제조방법.
3. 개똥쑥 열수추출물을 유효성분으로 포함하여 식품 섭취로 인한 지방생성을 억제하는, 식품조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 개똥쑥 열수추출물은 제1항의 방법으로 제조된 것이고,
   상기 식품조성물은 고지방 고칼로리 식품에 첨가되는 식품첨가제 또는 체중증가를 감소시키고 지방분해를 촉진하는 건강기능식품인, 식품조성물.

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