KR101576269B1 - 개꼬시래기 추출물을 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 유효성분인 개꼬시래기 아임계수 추출물은 지방전구세포(3T3-L1)의 분화를 저해하고, 지방세포의 증식을 억제하며, 지방대사물질의 축적을 억제할 수 있으므로, 비만의 치료, 개선 및 예방 효과가 우수할 뿐만 아니라, 세포 독성이 없고, 천연물질로부터 유래된 것이므로 부작용도 문제되지 아니하여 비만의 치료, 개선 또는 예방을 위해 널리 사용할 수 있다.

Description

개꼬시래기 추출물을 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING OBESITY CONTAINING GRACILARIA CHORDA}

본 발명은 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물, 구체적으로 천연물 유래 성분을 유효성분으로 하는 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

경제수준 향상에 의한 영양과잉, 환경오염, 운동부족, 스트레스 증가 등에 따른 각종 생활습관병 및 만성퇴행성질환의 만연이 우리 사회의 큰 문제로 대두되고 있다. 이 중, 최근에 가장 관심이 집중되고 있는 질병이 비만이다.

비만은 일반적으로 음식물로 섭취한 에너지(energy intake)가 신체활동 등으로 소비한 에너지(energy expenditure)와 균형을 이루지 못하여, 잉여의 에너지가 체내에 지방세포(adipocyte)의 양적, 수적 증가를 일으켜 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 유전적 요인, 환경적 요인, 정신적 요인 또는 식사습관 및 운동부족 등의 생활습관 등에 의하여 인체 내 에너지 밸런스가 무너져 생기는 질환을 의미한다.

세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 벌써 비만을 치료해야 할 질병으로 인식하여 세계적인 영양문제로 다루어 왔다(World Health Organization(1998)). 현재, 비만 환자 수는 지속적으로 증가하고 있는 추세이고, 최근 세계보건기구는 전 세계 성인 가운데 10억 명 이상이 과체중이고, 이들 가운데 최소한 3억 명이 비만에 속한 것으로 보고한 바 있다. 또한, 보건복지부에서 발표한 우리나라 2007년 국민 건강 영양 조사 자료에 따르면, 체질량지수(body mass index, BMI)가 25 이상인 비만 인구가 꾸준히 증가하여 국민 건강이 매우 심각하게 위협받고 있다(보건복지부(2007)).

상기 비만은 특히 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높으며, 다양한 성인병의 합병증과 관련이 있는 것으로 밝혀지고 있다. 예를 들어, 비만환자는 정상체중인 사람에 비하여, 간병경증의 질환의 경우 2배, 뇌혈관질환의 경우 1.6배 및 관상동맥질환의 경우 1.8배 정도 사망률이 높은 것으로 보고되어 있다. 현재, 식이요법, 운동요법 및 이뇨제, 설사제 등을 포함한 약물요법이 다양하게 시도되고 있으나, 영양불균형, 면역력 저하 및 우울증 등 부작용의 발생에 의해 일시적이고 한정적으로 사용이 제한되고 있는 실정이다.

상기 비만과 관련하여, 지방화(Adipogensis)에 대한 연구가 진행되고 있다. 상기 지방화란 지방전구세포로부터 지방세포가 분화되어 지방을 축적하게 되는 과정을 말하며, 상기 지방화는 비만, 당뇨병, 지방간 및 관상 심장질환 등 대사성질환의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상기 지방세포는 단순히 에너지 저장고 역할 뿐만 아니라 내분비 기관으로서 adipocytokine이라는 단백질성 호르몬을 분비하여 체내 에너지 항상성 유지를 위한 다양한 기능을 수행하고 있다.

그러나, 과다한 지방세포의 분화와 불균형적인 에너지 대사는 지방세포의 비정상적인 유전자 발현과 신호전달 체계 이상을 초래하여 adipocytokine의 분비 이상을 야기시킬 수 있다.

상기 adipocytekine의 종류로 leptin, adiponectin, tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6), resistin 등이 보고되어 있다. 일 예로, 식욕 조절 단백질인 leptin은 식욕을 감소시키고 에너지 소비를 증가시키고, 상기 adiponectin은 지방세포의 분화 과정 중 발현이 증가되어 간과 근육조직의 인슐린 민감도를 높이고 지방산 산화를 증가시키며, 상기 leptin이 생성이 되지 않거나 제 기능을 하지 못할 경우 비만이 유발될 수 있고, 상기 adiponectin의 발현양 감소와 비만 유발이 관련이 있는 것으로 보고되어 있다.

또한, 지방세포에서는 지방분해(lipolysis)와 합성(adipogenesis)을 통하여 지질대사가 일어나고, 상기 지방 합성 시, 상기 지방전구세포(preadipocyte)가 증식과 분화과정을 거쳐 성숙한 지방세포로 분화되어 궁극적으로 세포 내에 지방 방울(lipid droplet)을 형성하게 된다.

상기 지방세포의 분화과정을 유도하는 전사인자(transcription factors)로는 ADD1/SREBP1c(adipocyte determination and differentiation dependent factor 1/sterol response element binding protein 1c), PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ) 및 C/EBP(CCAAT enhancer binding protein)가 보고되어 있다.

상기 전사인자는 지방세포 분화과정 중 각기 다른 시점에서 발현이 유도되며, 서로 상호작용을 통하여 지방세포 특이 유전자들의 발현을 조절하고 지방대사의 활성화와 지방세포 분화를 점진적으로 유도해 나간다.

우선, PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)는 핵수용체에 속하며, 지방세포 특이적인 fatty acid binding protein인 aP2뿐 만 아니라 다른 많은 유전자들의 발현을 유도한다. 이와 관련하여, 기존 연구에서는 레트로바이러스를 이용하여 지방전구세포가 아닌 섬유아세포에 PPARγ를 과발현시킨 경우, 일반적인 섬유아세포에서도 지방세포 분화가 일어난다는 것이 보고되어 있다.

또한, C/EBP(CCAAT enhancer binding protein)는 basic-leucine zipper motif를 가진 전사인자 가운데 하나로, 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 지방전구세포의 지방세포로의 분화 초기에는 C/EBPβ 또는 C/EBPδ의 발현이 증가하고, 분화 후기 부분에는 C/EBPα의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉, C/EBPα는 지방세포의 end-product gene의 대부분이 유도되기 바로 직전에 발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 C/EBPα를 3T3-L1 지방전구세포에 과발현시킨 경우, 지방세포 분화가 촉진되었고, C/EBPα의 antisense mRNA를 처리하게 되면 분화가 억제되는 것으로 알려져 있고, C/EBPα가 homozygous하게 결손된 쥐의 경우, 백색지방과 갈색지방의 지방(lipid) 축적이 감소하는 것으로 알려져 있다.

또한, ADD1/SREBP1c(adipocyte determination and differentiation dependent factor 1/sterol response element binding protein 1c)는 bHLH(basic helix-loop-helix) family의 전사인자 중 하나이다. ADD1/SREBP1c는 갈색지방에서 가장 많이 발현되며, 간, 백색지방, 신장의 순서로 많이 발현된다. ADD1/SREBP1c의 mRNA 발현 양은 다른 지방세포화인자(adipogenic marker)인 PPARγ와 같이 지방세포 분화가 진행됨에 따라 증가한다. 일 예로, 3T3-L1 지방전구세포에 ADD1/SREBP1c를 과발현시키는 경우, 대조군에 비해 지방(lipid)의 축적과 지방세포화인자의 발현이 증가되는 것으로 보고되어 있다.

상기 전사인자들에 의해 유도되는 지방세포의 분화는 confluence, hormonal induction, clonal expansion, growth arrest 및 terminal differentiation의 단계로 진행된다.

먼저, 지방전구세포는 confluence 상태가 되면 세포주기가 G0/G1 시기가 되어 growth arrest가 일어난다. 이후, 적당한 분화 자극과 C/EBPβ와 C/EBPδ의 발현에 의해 한 번 혹은 두 번의 세포분열이 일어나는 clonal expansion 단계에 들어간다. 이어 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 통하여 지방전구세포는 완전한 분화의 형태를 보이기 직전의 단계인 growth arrest의 시기로 접어들게 된다. 마지막 단계인 terminal differentiation은 수 일에서 수 주의 시간이 걸리고, 지속적인 growth arrest가 일어나면 성숙된 지방세포의 특징이 점차 나타나게 된다.

구체적으로, 분화 초기에 섬유아세포와 유사했던 지방전구세포는 형태적으로 둥글게(morphological rounding-up)되고, lipoprotein lipase 등의 mRNA가 발현되기 시작하며, 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPδ의 transient induction이 일어난다. 이후, PPARγ와 C/EBPα가 발현되어 실제로 지방세포의 표현형을 결정짓는 대부분의 유전자들을 조절하거나 그 발현을 활성화 시킨다. 이러한 과정을 통해서 지질 방울들이 세포질로 나타나게 되고, 시간이 지남에 따라 커지고 또 합쳐지면서 하나 혹은 몇 개의 큰 방울(droplet)이 된다.

상기 비만을 해소하고 적정한 체중을 유지하기 위한 비만치료기전으로는 식욕의 조절, 지방의 소화 및 흡수 방해, 에너지 소비의 증가, 지질대사의 조절 등이 있다. 현재 보편적으로 사용되는 비만 치료제로는 세로토닌(serotonin)과 지방분해효소의 활성을 억제하여 콜레스테롤(cholesterol) 및 중성지방(triglyceride)의 가수분해를 방해하며 산화되지 않은 지방을 변으로 배설시키도록 돕는 약물인 orlistat(XenicalR)등이 있다.

그러나, 세르토닌의 경우 혈압을 높여 심혈관계 질환을 가진 환자에게 주의하여 사용해야 하고, orlistat의 경우 소화기 장애, 지방변, 배변실금, 지용성 비타민 흡수 방해 등을 유도한다고 보고되고 있는 등 기존의 비만 치료제의 경우에는 상당한 부작용을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 상대적으로 안전성에 대한 문제가 발생할 가능성을 최소화 할 수 있을 것으로 기대되는 천연물 중에서 비만세포의 성장 및 분화를 억제하여, 지방조직의 과다나 지방대사 이상으로 유발되는 비만에 대한 항비만 효과는 높고 부작용은 미약한 비만 치료 약물의 개발이 요구되고 있다.

KR 10-1148978 B KR 10-0990260 B KR 10-0869856 B KR 10-2012-0107557 A

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명은 개꼬시래기 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료, 개선 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비만 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물은 약학조성물 또는 의약조성물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 비만 개선 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 비만 개선 또는 예방용 조성물은 식품조성물일 수 있다. 상기 식품조성물은 기능성 식품조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 비만 치료 또는 예방용 약학조성물은 개꼬시래기(Gracilaria chorda) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함한다.

상기 아임계수 추출물은 160℃ 내지 260℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 것 일 수 있고, 구체적으로 상기 아임계수 추출물은 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 것 일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 비만 개선 또는 예방용 식품조성물은 개꼬시래기(Gracilaria chorda) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함한다. 상기 식품조성물은 건강기능식품일 수 있다.

상기 아임계수 추출물은 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 것 일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 항비만 활성을 가진 개꼬시래기 아임계수 추출물 제조방법을 제공한다.

상기 항비만 활성을 가진 개꼬시래기 아임계수 추출물 제조방법은 개꼬시래기(Graccilaroipsis chorda)를 분쇄하여 개꼬시래기 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 개꼬시래기 분쇄물에 물을 첨가하는 단계; 및 상기 개꼬시래기 분쇄물 및 물을 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건에서 반응시켜 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 개꼬시래기 분쇄물에 첨가되는 물의 양은 개꼬시래기 분쇄물 100 중량부를 기준으로 500 중량부 내지 1,500 중량부이고, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계의 반응조건은 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 부작용이 적고 투약이 쉬운 천연물질 중 지방세포 생성과 지방 내 지질 방울의 생성을 억제하여, 항비만 효과를 갖는 소재에 대하여 연구하던 중, 장흥 지역에 풍부한 개꼬시래기가 추출 방법 및 추출조건에 대해 항비만 효과를 가진다는 것을 확인하였고, 보다 구체적으로 상기 개꼬시래기의 용매 추출물에 비하여 상기 개꼬시래기의 아임계수 추출물이 우수한 항비만 효과를 가지며, 특히, 상기 개꼬시래기의 아임계수 추출물은 특정조건, 구체적으로 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건에서 제조될 경우, 다른 조건에 비하여 지방화 즉, 지방세포 형성 관련 유전자의 발현 억제, 지질 방울 생성 억제와 NO 생성 및 IL-6 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하여, 이로부터 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 유효성분이란 조성물, 구체적으로 의약 조성물 또는 식품조성물에 있어서 항비만 효과를 제공하는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 초임계 유체(supercritical fluid)란 물질이 액체와 기체의 두 상태가 서로 분간할 수 없게 되는 임계상태에서의 온도와 이때의 증기압에 있을 때 즉, 초임계점 이상의 상태에 있는 유체를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 아임계 유체(sub-supercritical fluid)란 아임계 상태에 있는 유체 즉, 초임계 유체와 거의 비슷한 성격을 가진 유체를 의미한다.

또한, 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 아임계 추출법이란 아임계 유체를 이용한 추출법을 의미한다. 상기 아임계 유체는 아임계 상태에 있는 물, 이산화탄소(CO₂), 에틸렌, 에탄, 프로판, 아세틸렌 또는 암모니아 등일 수 있다. 일 예로, 아임계수란 아임계 조건의 물을 의미한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 개꼬시래기(Gracilaria chorda) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물은 비만 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다.

상기 개꼬시래기(Graccilaroipsis chorda)는 홍조식물 돌가사리목 꼬시래기과의 해조류이다. 상기 개꼬시래기는 예로부터 식용으로 사용되거나 한천을 만들기 위해 사용되어 왔다. 상기 개꼬시래기는 주로 외해에 면한 조용한 점심대에 분포한다. 상기 개꼬시래기는 높이가 약 1m 정도까지 자라고, 원기둥 모양이고 주축이 뚜렷하고, 가지는 성글게 나고 길며, 중심가지에 어긋나고 주축 또는 중심가지와 같은 모양이다. 낭과는 공을 반으로 잘라놓은 모양이며 부풀어올라 커지고, 빛깔은 연하고 다 자라서 오래되면 연골질이 되며 잘 부러진다.

상기한 바와 같이, 지방생성 억제 및 지방세포 분화 유도 관련 유전자의 발현을 감소시켜, 지방화를 억제하는 항비만 효과의 측면에서, 개꼬시래기 아임계수 추출물은 개꼬시래기 용매 추출물보다 우수한 항비만 효과를 갖는 것으로 확인되었다.

따라서, 상기 개꼬시래기 추출물은 바람직하게는 개꼬시래기 아임계수 추출물일 수 있다. 상기 아임계수 추출물은 경제적이고, 유해성분이 없으며, 안전하게 폐기할 수 있어 친환경적이란 유리한 효과를 갖는다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 160℃ 내지 260℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 개꼬시래기 아임계수 추출물일 수 있다.

구체적으로, 상기 아임계수 추출물을 제조하기 위한 아임계 추출법의 조건과 관련하여, 압력조건은 1 MPa 내지 5 MPa, 또는 2 MPa 내지 4 MPa, 또는 2.5 MPa 내지 3.5 MPa, 또는 3 MPa일 수 있고, 온도조건은 180℃ 내지 260℃, 또는 190℃ 내지 240℃, 또는 200℃ 내지 220℃, 또는 210℃일 수 있다.

상기 아임계수 추출물을 제조하기 위한 아임계 추출법은 상기와 같은 압력조건 및 온도조건에서 5초 내지 10분, 또는 10초 내지 5분, 또는 30초 내지 3분, 또는 45초 내지 2분, 또는 1분 동안 수행할 수 있다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 바람직하게는 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건의 아임계수로 추출한 것일 수 있다. 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물의 추출조건에 따른 항비만 효과를 확인하기 위하여, 3 MPa의 압력조건에서 온도를 달리하며 추출한 추출물의 항비만 효과를 확인한 결과, 210℃ 조건에서 다른 온도 조건에 비하여 우수한 지질 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

이러한 측면에서, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 바람직하게는 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건에서 1분 동안 추출한 것, 구체적으로 바람직하게는 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건에서 1분 동안 추출한 것일 수 있다.

상기 아임계수 추출물은 상기 아임계 추출 후에 여과공정, 농축공정 또는 건조공정을 선택적으로 추가하여 수행한 것일 수 있으며, 상기 여과공정은 여과지를 이용하여 수행할 수 있고, 상기 농축공정은 감압농축 등을 통하여 수행할 수 있으며, 상기 건조공정은 열풍건조 또는 냉동건조 등의 방법으로 수행할 수 있다.

상기 비만은 체내에 지방세포(adipocyte)가 양적, 수적 증가로 인해 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하고, 이러한 지방세포의 양적, 수적 증가는 지방화 즉, 지방세포의 분화와 지방의 축적에 의하여 발생한다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 지방전구세포의 지방세포로의 분화 유도 유전자의 발현을 억제하여 지방세포의 분화 및 지방의 축적이 발생하지 않도록 함으로써 비만을 치료 또는 예방할 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물은 비만 치료 또는 예방용 조성물, 구체적으로 비만 치료 또는 예방용 약학조성물의 유효성분일 수 있다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 단독으로 포함하거나 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물에 항비만 효과가 있는 물질을 유효성분으로 더욱 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분 즉, 개꼬시래기 아임계수 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 상기 비만 치료 또는 예방용 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 20 중량% 범위에서 추가할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분 즉, 개꼬시래기 아임계수 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은 상기 유효성분을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 조성물은, 상기 유효성분 이외에 공지의 비만 치료 또는 예방 효과를 갖는 화합물 또는 천연물에 대한 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 200 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품조성물은 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품조성물일 수 있다. 상기 식품조성물은 기능성 식품조성물, 구체적으로 비만 개선 또는 예방용 건강기능식품일 수 있다.

본 명세서에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능식품품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체중조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물 100 중량부 당 0 내지 2,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g이다.

또한, 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품조성물에 있어서, 상기 유효성분은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다.

본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물은 항비만효과, 구체적으로 지방세포 분화 억제 효과 및 지방세포 크기 증가 억제능이 우수하다는 것이 확인되어, 본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 뛰어난 비만 예방 또는 개선 효과를 보이는 것으로 확인되었다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 항비만활성을 가진 개꼬시래기 아임계수 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 개꼬시래기 아임계수 추출물의 제조방법에 의해 제조된 추출물은 항비만 활성이 가장 우수한할 뿐만 아니라, 본 발명의 제조방법은 다른 추출방법 또는 다른 추출조건에 비하여 추출수율도 가장 높다는 장점을 갖는다.

구체적으로, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물의 제조방법은 개꼬시래기(Graccilaroipsis chorda)를 분쇄하여 개꼬시래기 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 개꼬시래기 분쇄물에 물을 첨가하는 단계; 및 상기 개꼬시래기 분쇄물 및 물을 2.5 MPa 내지 3.5 MPa의 압력조건 및 200℃ 내지 220℃의 온도조건에서 반응시켜 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 가진 개꼬시래기 아임계수 추출물 제조방법일 수 있다.

상기 개꼬시래기 분쇄물을 제조하는 단계는 상기 개꼬시래기를 통상의 해조류 분쇄기를 이용하여 수행할 수 있고, 상기 분쇄물 제조과정에 앞서 개꼬시래기의 건조 과정을 추가로 수행할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 개꼬시래기 분쇄물을 제조하는 단계는 상기 개꼬시래기를 건조하는 과정 및 상기 건조된 개꼬시래기를 분쇄하는 과정을 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 개꼬시래기 건조는 통상의 해조류 건조방법, 일 예로 자연건조법, 열풍건조법, 냉동건조법 등의 방법으로 수행할 수 있으며, 상기 자연건조법은 20℃ 내지 30℃의 온도조건 및 통풍이 가능한 통기조건에서 수행할 수 있다.

상기 개꼬시래기 분쇄물에 물을 첨가하는 단계에서, 첨가되는 물의 양은 개꼬시래기 분쇄물 100 중량부를 기준으로 500 중량부 내지 1,500 중량부 또는 700 중량부 내지 1300 중량부 또는 900 중량부 내지 1100 중량부일 수 있다.

상기 물은 일반적인 물 또는 증류수일 수 있고, 상기 증류수는 1차 증류수 또는 2차 증류수 또는 3차 증류수일 수 있다.

상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계는 상기 개꼬시래기 분쇄물 및 물을 일정 온도 및 일정 압력 조건에서 일정 시간 동안 반응시키는 방법으로 수행할 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 압력 조건 구체적으로, 상기 아임계 추출의 압력 조건은 1 MPa 내지 5 MPa 또는 2 MPa 내지 4 MPa 또는 2.5 MPa 내지 3.5 MPa 또는 3 MPa일 수 있고, 상기 온도 조건 구체적으로, 상기 아임계 추출의 온도 조건은 180℃ 내지 260℃ 또는 190℃ 내지 240℃ 또는 200℃ 내지 220℃ 또는 210℃일 수 있다. 또한, 상기 반응시간, 구체적으로 상기 아임계수 추출물을 제조하기 위한 아임계 추출법을 수행하는 시간은 5초 내지 10분, 또는 10초 내지 5분, 또는 30초 내지 3분 또는 45초 내지 2분, 또는 1분일 수 있다.

구체적으로, 상기 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계의 반응조건은 2.5 MPa 내지 3.5 MPa 및 200℃ 내지 220℃ 또는 3 MPa 및 210℃의 조건에서 1분간 수행하는 것일 수 있다.

상기 아임계 추출에 있어서, 운반체(carrier)가 필요한 경우, 상기 운반체는 질소가스(nitrogen gas)일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 아임계 추출법은 아임계 유체로 아임계수를 이용하고, 운반체로 질소가스를 사용하는 것일 수 있다.

상기 아임계수 추출법에 의한 경우, 기존 추출법이 가지는 유기용매의 제거를 위한 과도한 비용 및 공정이 요구된다는 점과 환경문제를 유발할 수 있다는 문제점을 해결하였을 뿐만 아니라, 본 발명의 최적 조건에 의해 추출을 수행하는 경우, 특히 최적 조건인 3 MPa 및 210℃의 조건에서 수행하는 경우, 기존 추출법인 용매 추출법에 비하여 현저하게 향상된 수율을 얻을 수 있는 것으로 평가되었다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 아임계수를 이용하여 항비만 활성을 갖는 개꼬시래기 추출물을 제조하는 방법은 기존 방법에 비하여, 안전성 및 친환경성이 인정되고, 비교적 간단한 공정으로 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 항비만 활성도 개선되고, 수율도 현저하게 상승되는 장점이 있다.

본 발명의 항비만 조성물의 유효성분인 개꼬시래기 아임계수 추출물은 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고, 지방세포의 크기 증가 억제 및 축적을 억제하여 항비만 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 체중 감소와 비만 치료, 개선 또는 예방에 효과가 있을 뿐만 아니라, 인공 화합물질인 기존의 비만 치료제와 달리 천연물의 추출물인 본 발명의 유효성분은 부작용 등이 문제되지 아니하고, 세포 독성도 없으며, 나아가 우리나라 해안에서 풍부하게 서식하는 개꼬시래기를 유효성분으로 이용하는 것이므로 경제성도 긍정되어, 본 발명의 조성물은 산업적으로 그 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 개꼬시래기 아임계수 추출물의 독성을 확인한 결과를 나타내는 그래프로, 도 1a는 추출온도에 따라 구분된 개꼬시래기 아임계수 추출물, 구체적으로 GC90(90℃ 아임계수 추출물), GC150(150℃ 아임계수 추출물), GC210(210℃ 아임계수 추출물)의 투여량에 따른 지방전구세포(3T3-L1)의 생존율을 나타낸 그래프이고, 도 1b는 용매 종류에 따라 구분된 개꼬시래기 용매 추출물, 구체적으로 GCW(물추출물), GCM(메탄올 추출물) 및 GCE(에탄올 추출물)의 투여량에 따른 지방전구세포(3T3-L1)의 생존율을 나타난 그래프이다. 상기 그래프의 가로축은 대조군(Control) 및 시료의 종류와 함량를 나타내는 것으로, 구체적으로 125, 250 및 500 μg/ml은 각 추출 시료의 투여량을 의미하며, 세로축은 대조군 대비 세포 생존률(세포독성)을 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 개꼬시래기 아임계수 추출물의 지방생성 억제효과를 확인한 사진 및 그래프로, 가로축은 지방세포로 분화유도 하지 않은 정상군(normal), 분화 유도된 대조군(control) 및 각 추출물 처리군, 구체적으로 GC90(90℃ 아임계수 추출물), GC150(150℃ 아임계수 추출물), GC210(210℃ 아임계수 추출물), GCW(물추출물), GCM(메탄올 추출물) 및 GCE(에탄올 추출물)을 나타내고, 세로축은 Oil Red O 염색시약으로 염색한 사진을 이용하여 확인한 대조군(control) 대비 세포 내 지방의 축적 정도를 상대적으로 나타낸 값이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 210℃ 아임계수 추출물의 처리 함량에 따른 지방생성 억제효과를 확인한 그래프로, 가로축은 210℃ 아임계수 추출물의 처리 함량을 나타내고, 세로축은 Oil Red O 염색시약으로 염색한 사진을 이용하여 확인한 대조군(control) 대비 세포 내 지방의 축적 정도를 상대적으로 나타낸 값이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 210℃ 아임계수 추출물의 함량에 따른 지방세포 분화 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 그래프로, 도 3a는 PPARγ, FAS 및 SREBP1c의 mRNA 전사량을 확인한 것이고, 도 3b는 PPARγ 및 C/EBPα의 발현량을 확인한 것으로, 가로축은 대조군(control) 및 210℃ 아임계수 추출물 처리한 처리군 또는 대조군(control)과 210℃ 아임계수 추출물 함량 별로 구분하여 처리한 처리군을 나타내고, 세로축은 대조군 대비 PPARγ, FAS 및 SREBP1c의 mRNA 전사량(도 3a) 또는 PPARγ 및 C/EBPα의 단백질 발현 정도(도 3b)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 210℃ 아임계수 추출물의 함량에 따른 NO 및 IL-6 생성 억제 효과를 확인한 그래프로, 도 4a는 IL-6 생성 억제 정도를 나타낸 것이고, 도 4b는 NO의 생성 억제 정도를 나타낸 것이며, 가로축의 첫 번째 줄은 LPS의 첨가여부를 두 번째 줄은 아임계수 210℃ 추출물의 첨가여부 및 함량을 나타내고, 세로축은 각각 대조군(control) 대비 IL-6 생성 억제 정도(도 4a) 및 NO의 축적 정도(도 4b)를 나타낸 값이다. 상기 도 3에서 '-'는 첨가하지 않은 것을 의미하고, '+'는 첨가한 것을 의미하며, 수치는 첨가된 함량을 의미한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[ 제조예 : 실험재료의 준비 및 추출물의 제조]

제조예 1. 실험 재료의 준비

제조예 1-1. 3 T3 - L1 지방전구세포와 Raw264 .7 세포의 배양

3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection(ATCC; USA)으로부터 분양받아 사용하였다. 3T3-L1 지방전구세포는 37℃의 온도조건과 95% O₂ 및 5% CO₂를 공급하는 배양조건에서 100 Units/ml penicilin, 100 ㎍/ml streptomycin 및 10% FCS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 이러한 3T3-L1 지방전구세포는 2일마다 신선한 배지로 보충하면서 계대 배양하여 실험에 사용하였다. Raw264.7 대식세포는 ATCC(USA)로부터 분양 받아 사용하였다. Raw264.7 세포는 37℃의 온도조건과 95% O₂ 및 5% CO₂를 공급하는 배양조건에서 100 Units/ml penicilin, 100 ㎍/ml streptomycin 및 10% FCS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 이러한 Raw264.7 세포는 2일마다 신선한 배지로 보충하면서 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

제조예 1-2. 3 T3 - L1 지방전구세포의 지방세포로 분화유도

상기 제조예 1-1에서 배양한 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하고 100% confluent 상태가 되면 분화유도 물질인 5 ㎍/ml insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 배지를 교환하여 분화를 유도였으며(0 day), 분화 유도 후 2일이 경과한 뒤, 5 ㎍/ml insulin이 포함된 DMEM(10% FBS)배지로 교환하였다. 이로부터 2일에 한번씩 DMEM(10% FBS)배지로 보충하면서 4일 후 (8 days) 실험에 이용하였다.

제조예 1-3. 3 T3 - L1 지방전구세포와 Raw264 .7 세포의 co - culture

상기 제조예 1-2에서 지방세포로 분화시킨 3T3-L1 세포(6 days)와 Raw264.7 세포를 1×10⁵ cells/well로 각각의 well에 분주하고 24시간 후 시료를 첨가하였다. 24시간이 경과한 후, IL-6와 NO 생성량을 측정하였다.

제조예 2. 개꼬시래기 추출물의 제조

해조류 즉, 개꼬시래기 시료는 전라남도 장흥지역에서 채취된 개꼬시래기를 20℃ 내지 30℃의 온도조건 및 통풍이 가능한 조건에서 3일간 자연건조시킨 후, 분쇄기로 분쇄하여 제조하였다.

개꼬시래기 아임계 추출물은 상기 개꼬시래기 분쇄물 20 g과 3차 증류수 200 mL를 아임계 추출장치에 넣은 후, 3MPa의 압력 조건에서 온도를 각각 90℃, 150℃ 및 210℃로 조절하고, 상기 각각의 압력 및 온도 조건에서 1분간 반응시켜 추출하는 방법으로 제조하였다.

개꼬시래기 용매 추출물은 물, 에탄올 및 메탄올을 이용하여 용매 추출법으로 제조하였다. 구체적으로, 개꼬시래기 열수 추출물은 상기 개꼬시래기 분쇄물 20 g을 3차 증류수 200 mL에 침지시킨 후, 100℃에서 15분동안 추출하는 방법으로 제조하였다.

에탄올 및 메탄올을 이용한 개꼬시래기 용매 추출물은 상기 개꼬시래기 분쇄물 20 g을 에탄올(Ethanol) 및 메탄올(Methanol) 각 200 mL에 침지하여 24시간 동안 추출하는 방법으로 제조하였다.

상기 제조된 각 추출액을 종이여과지(Whatman, No.2)를 이용하여 감압여과 하였으며, 상기 여과 후 회전식 감압농축기(Rotary Vacuum Evaporator)를 이용하여 농축하였으며, 상기 농축 후 동결건조기를 이용하여 건조시켜 분말화시켜 추출물을 제조하였다. 최종 제조된 추출물 GC90(90℃ 아임계수 추출물), GC150(150℃ 아임계수 추출물), GC210(210℃ 아임계수 추출물), GCW(물 추출물), GCM(메탄올 추출물) 및 GCE(에탄올 추출물) 각각은 -20℃ 보관하며 실험에 사용하였다.

[ 실험예 : 개꼬시래기 추출물의 비만 치료 또는 개선 효과 확인]

상기 준비예에서 제조된 개꼬시래기 아임계수 추출물을 이용하여 비만 치료, 개선 또는 예방 효과를 확인 하기 위하여 상기 세포주에 대하여 실험을 실시 하였다.

실험예 1. 개꼬시래기 추출물의 세포독성 평가

3T3-L1 지방전구세포에 미치는 해조류 추출물의 세포독성 또는 세포사멸을 평가하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 3T3-L1 지방전구세포를 96-well plate에 1 ×10⁵ cells/well로 분주하였으며, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후에 각 추출물(GC90, GC150, GC210, GCW, GCM 및 GCE)을 처리하고 다시 24시간 배양한 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium-12-bromide(MTT, 2 mg/ml) 용액을 각 well에 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 DMSO(Sigma-Aldrich, USA)를 넣고 15분 경과한 후에 540 nm(Immuno Mini NJ-2300)에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정한 흡광도를 아무런 시료를 처리하지 않은 대조군(control)과 비교하여 상기 대조군에 대한 상대값으로 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

상기 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 개꼬시래기 아임계수 추출물 및 용매 추출물의 세포독성을 실험한 결과, 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 모든 추출물에서 500 μg/ml 농도까지는 세포사멸이 나타나지 않았으므로, 세포독성이 없는 것으로 확인되었다. 상기 실험결과에 따라, 500 μg/ml 농도까지는 세포독성이 없어 안전한 것으로, 본 실험에 사용이 가능한 농도라고 사료되어 개꼬시래기 추출물과 관련하여 500 μg/ml 농도 이하에서 항비만 효과에 대한 실험을 실시하였다.

실험예 2. 지방생성 억제효과 확인

세포 내 생성된 지방구 생성 정도를 확인하기 위하여 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주된 3T3-L1 지방전구세포에 시료를 처리하고, 8일간 분화유도를 끝낸 후에 PBS로 세척하였다. 10% formalin 용액으로 30분간 고정하고 증류수로 1회 세척하였다. 0.3% Oil Red O 용액으로 1시간 처리한 후, 60% isopropanol로 1회 세척하고 현미경으로 염색된 지방구를 관찰하였다. 생성된 지방구의 정량을 위해 100% isopropanol을 가하여 지방을 염색시킨 Oil Red O 염색시약을 추출한 후에 ELISA reader(Immuno Mini NJ-2300)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 또한 추출물의 처리 함량에 따른 지방축적 억제효과를 확인하기 위하여 아임계수 210℃ 추출물 125 μg/ml 및 250 μg/ml 각각을 처리한 처리구의 지방축적 정도를 확인하여, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화유도 하지 않은 정상군(normal)에 비해 분화유도를 수행한 대조군(control)에서 중성지방이 붉은색으로 염색되므로 지방생성 정도가 뚜렷하게 증가되는 것으로 관찰되었다. 한편, 개꼬시래기 아임계수 추출물 전체와 물 추출물에서 지방의 생성이 억제되었으나, 개꼬시래기 메탄올과 에탄올 추출물의 경우에는 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 오히려 지방의 생성이 증가하였다. 상기한 결과로부터, 개꼬시래기 추출물의 경우 추출방법에 따라 지방생성 억제 효과가 상이한 것으로 확인되었고, 구체적으로 용매 추출법에 비하여 아임계수 추출법이 항비만 효과란 측면에서 더 바람직한 것으로 확인되었으며, 특히 아임계수 추출법과 관련하여, 210℃의 온도조건에서 추출한 아임계수 추출물이 지방생성 억제효과가 현저하게 우수한 것으로 확인되었다.

상기에서 지방생성 억제효과가 우수한 것으로 확인된 210℃의 온도조건에서 추출한 아임계수 추출물의 함량에 따른 지방생성 억제 효과를 실험하여 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 210℃의 온도조건에서 추출한 아임계수 추출물은 농도의존적으로 지방생성 축적 정도를 유의하게 억제시키는 것으로 확인되었다.

실험예 3. 지방생성 관련 유전자 발현 억제효과

지방세포의 크기는 지방조직에서 대식세포의 침윤 정도의 강력한 예측인자이므로 비만한 개체의 지방조직은 염증과 비만이 발전되면서 대식세포의 침윤을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 대식세포는 TNF-α, IL-1, IL-6, MCP-1 등의 사이토카인 또는 케모카인을 과도하게 생성시키는 것으로 알려져 있다.

그러므로, 지방조직에서 지방생성의 억제 여부와 관련된 확인으로, 대식세포의 활성화 및 침윤 관련된 인자의 확인 즉, 대식세포로 매개된 염증반응과 관련하여 대식세포가 분비하는 사이토카인 또는 케모카인의 발현 여부를 확인하였다.

실험예 3-1. 사이토카인의 mRNA 생성 억제효과 확인

개꼬시래기 아임계수 추출물이 지방생성 관련된 전사인자의 mRNA 전사 및 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하였다.

우선, 3T3-L1 지방전구세포를 2.7×10⁵ cells/well로 60π culture dish에 분주하고 분화유도 물질과 시료 즉, 개꼬시래기 아임계수 210℃ 추출물을 함께 넣고 분화를 유도한 후 8일째에 1 ml의 TRI REAGENT(Molecular Research Center, Inc.)과 함께 넣고 homogenation을 하였다. 그 다음 0.2 ml의 chloroform을 넣고 가볍게 섞어준 후, 12,000×g 및 4℃의 조건에서 15분 동안 원심분리를 하였다. 상층액과 0.5 ml isopropanol을 넣고 vortex를 하고 상온에서 10분 정도 보관 후, 12,000×g 및 4℃의 조건에서 8분 동안 원심 분리를 하였다. 상층액을 제거하고 75% 에탄올(DEPC+에탄올(ethanol anhydrous))을 1 ml 넣고 볼텍싱한 후, 12,000×g 및 4℃의 조건에서 5분 동안 2번 반복으로 washing을 하였다. Washing이 끝나면 75% 에탄올을 제거하고 3분 동안 air dry를 한 후, DEPC(diethylpyrocarbonate) 50 ㎕를 넣고 실험에 사용할 때까지 -0℃에 보관하였다.

상기 보관중인 RNA는 nanodrop spectrometer(Sigma-Aldrich, USA)의 260 nm와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

상기 수득한 RNA 300 ng을 포함한 RNA 3 ㎕ primer와 각각 1 ㎕ buffer를 이용하여 전체 부피(total volume) 30 ㎕의 반응용액을 제조한 후, Diastar^TM 2X One Step RT-PCR Premix kit를 사용하여, 역전사를 수행하였다.

각 프라이머의 염기 배열은 다음과 같다.

PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ)의 프라이머 서열은 5'-ACC ACT CGC ATT CCT TTG AC-3'(Forward Primer) 및 5'-TCA GCG GGA AGG ACT TTA TG-3'(Reverse Primer)이고, FAS(fatty acid synthase)의 프라이머 서열은 5'-CTG CGG AAA CTT CAG GAA ATG-3'(Forward Primer) 및 5'-GGT TCG GAA TGC TAT CCA GG-3'(Reverse Primer)이며, SREBP-1c(sterol regulatory element-binding protein 1)의 프라이머 서열은 5'-CAC TTC TGG AGA CAT CGC AAA C-3'(Forward Primer) 및 5'-TGG TAG ACA ACA GCC GCA TC-3'(Reverse Primer)이고, β-actin의 프라이머 서열은 5'-TGC CCA TCT ATG AGG GTT ACG-3'(Forward Primer) 및 5'-TAG AAG CAT TTG CGG TGC ACG-3'(Reverse Primer)이다.

PCR 조건은 50℃에서 30분 및 95℃에서 15분 반응 시킨 후, 95℃에서 1분 동안 변성시키고, 55℃에서 1분 동안 붙인 후, 72℃에서 2분 동안 확장하는 사이클(cycle)을 30회를 수행하였다. 상기 PCR 산물은 nucleic acid staining solution(Red Safe, iNtRON, 대한민국)로 염색된 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동을 하였으며, β-actin은 증폭된 유전자들의 대조군으로 사용하였다.

상기 방법을 통해서 확인된 PPARγ, FAS 및 SREBP1c의 유전자의 전사량을 도 3a에 나타내었다.

또한, PPARγ 및 C/EBPα 유전자의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 통하여 확인하였다.

우선, 3T3-L1 지방세포는 1×10⁵ cells/well로 분주하고 분화유도 물질과 시료 즉, 개꼬시래기 아임계수 210℃ 추출물을 함께 넣고 분화를 유도한 후 8일째에 cell lysate를 제조하였다. 구체적으로, 상기 배양한 세포를 PBS 용액으로 2회 세척한 후, lysis buffer(PRO-PREP protein extraction solution, 인트론바이오테크놀로지, 대한민국)를 넣고 4℃에서 10분간 용해시킨다. 용해된 세포를 수거하여 13,000×rpm 및 4℃의 조건에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 단백질을 정량화하였다.

상기 각각의 상등액에서 단백질 30 ㎍를 취하여 SDS loading buffer(60 mM Tris, 25% glycerol, 2% SDS, 0.5% 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)와 혼합 후 10% SDS polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 전이시켰다. 이후에 membrane은 5% 무지분유가 첨가된 TTBS(10 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.1% tween 20) 용액에 넣고 상온에서 1시간 동안 blocking 시켰다. TTBS 용액으로 10분간 3회 세척한 후 일차항체(PPARγ 1:250 및 C/EBPα 1:250)로 2시간 동안 반응시킨 다음에 다시 TTBS 용액으로 3회 세척하였다. 그 다음에 peroxidase가 포함된 2차 항체(goat anti mouse 1:2000, goat anti rabbit 1:2000)로 1시간 동안 반응시켰고 항체의 검출은 chemiluminescent substrate 용액을 이용하여 가시화하고 UVP(Image acquisition and analysis software, Visionwork^TMLS)로 분석하였다.

상기 분석한 결과를 각각 도 3b에 각각 나타내었다.

도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와같이, 개꼬시래기 아임계수 210℃ 추출물은 지방생성과 관련된 전사인자 PPARγ, FAS 및 SREBP1c의 유전자의 전사량과 PPARγ 및 C/EBPα 유전자의 발현 정도를 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의하게 억제시켰다. 따라서, 상기한 결과로부터 개꼬시래기 아임계수 추출물은 지방분해를 유도하는 전사인자의 유전자의 전사 및 발현을 억제하여 지방생성 및 축적이 일어나지 않도록 하여 비만을 치료, 개선 또는 예방할 수 있음을 확인되었다.

실험예 3-2. NO 생성 및 IL -6 생성 억제효과 확인

NO의 생성 및 IL-6 생성 억제는 상기 제조예 1-3에서 3T3-L1 지방세포와 Raw264.7 세포를 함께 배양(co-culture)하였다. 구체적으로, 상기 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하고 100% confluent 상태가 되면 분화유도 물질인 5 ㎍/ml insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하며 분화를 유도였으며(0 day), 2일 후 5 ㎍/ml insulin이 포함된 DMEM(10% FBS) 배지로 교환하였다. 이후, 2일 간격으로 상기 DMEM(10% FBS) 배지를 교환하면서, 4일 동안 더 배양하여, 총 6일째 배양하여 지방세포로 분화되면, 상기 지방세포에 Raw264.7 세포를 1×10⁵ cells/well로 각각의 well에 분주하고, 24시간 동안 함께 배양하였다. 배양 후, 상기 실험예 2에서 지방생성 억제효과가 우수한 것으로 확인된 210℃의 온도조건에서 추출한 아임계수 추출물을 125 ㎍/ml 및 250 ㎍/ml 각 함량별로 첨가하고, 24시간 더 배양한 후, IL-6와 NO 생성량을 측정하였다.

IL-6의 생성량은 상기 각각의 분주된 세포 배양액에 mouse IL-6 Kit(Cat. No EM2IL6; Thermo Scientific, Inc., USA)를 이용하여 측정하였고, 그 결과는 도 4a에 나타내었다.

또한, NO 함량은 상기 각각의 분주된 세포 배양액에 Griess 시약(N-1-naphthylethylene diamine 0.1% in H₂O, sulfanilamide 1% in 5% H₃PO₄) 100 ㎕을 첨가하고, 5분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정값을 NaNO₂를 serial dilution하여 작성한 NO₂ ^-농도에 대한 표준 곡선을 이용하여 상대적인 수치로 확인하였고, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

상기 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 3T3-L1 지방세포와 Raw 264.7 대식세포를 co-culture한 후에 개꼬시래기 210℃ 아임계수 추출물을 첨가한 처리군에서 NO와 IL-6 생성 정도는 3T3-L1 지방세포만을 배양한 경우보다 뚜렷하게 감소하는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, 지방세포에 의해 대식세포로부터 유도되는 NO와 IL-6 생성이 개꼬시래기 아임계수 210℃ 추출물을 첨가함으로써 유의적으로 억제됨이 확인되어, 개꼬시래기 아임계수 210℃ 추출물이 지방세포 크기의 증가 또는 분화를 억제할 수 있는 것으로 예상되었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (7)

1. 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건의 아임계수로 아임계 추출한 개꼬시래기(Gracilaria chorda) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 치료 또는 예방용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건의 아임계수로 아임계 추출한 개꼬시래기(Gracilaria chorda) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 개선 또는 예방용 식품조성물.
5. 삭제
6. 개꼬시래기(Graccilaroipsis chorda)를 분쇄하여 개꼬시래기 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 개꼬시래기 분쇄물에 개꼬시래기 분쇄물 100 중량부를 기준으로 1,000 중량부 물을 첨가하는 단계; 및 상기 개꼬시래기 분쇄물 및 물을 3 MPa의 압력조건 및 210℃의 온도조건에서 반응시켜 개꼬시래기 아임계수 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 항비만 활성을 가진 개꼬시래기 아임계수 추출물 제조방법.
7. 삭제

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