KR102015237B1 - 구강용 조성물 - Google Patents
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Abstract
종래부터 있는 항균제, 효소 저해제 또는 항생 물질을 사용한 우식 억제법에서는, 구강 바이오 필름의 균체외 다당이 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등의 침투를 방해하기 때문에, 목표로 한 대로의 우식 억제 효과를 내는 것이 곤란하다. 또, 항균제 등의 사용은 내성균이 출현할 위험성이 높기 때문에 바람직하지 않다. 그 때문에 우식 원인균의 컨트롤을 실시하는 것이 아니라, 우식 원인균에 의한 바이오 필름 형성의 제어를 실시하는 것에 의한, 보다 안전하고 효과가 높은 우식 억제 방법의 개발이 요구되고 있었다. 본 발명은, 쿼럼센싱을 제어하는 조성물에 의한 충치 바이오 필름 형성의 저해를 가능하게 하는 것이다.
Description
본 발명은 우식 예방에 유용한 바이오 필름 형성 억제 구강용 조성물에 관한 것으로, 특히, 구강 미생물의 쿼럼센싱을 이용하는 것에 의한 신규한 바이오 필름 형성 억제 방법을 이용한 구강용 조성물에 관한 것이다.
물체의 표면에 부착된 미생물은 단독으로 존재하고 있는 것이 아니라, 특징 있는 구조 중에서 다른 미생물과 함께 바이오 필름을 형성하고 있다. 이 바이오 필름은, 고정화 미생물의 이용에 볼 수 있는 바와 같이 인간에게 있어서 유익하게 작용하는 한편, 반대로 우식이나 식품 오염을 일으키는 원인이 되는 것도 분명해져, 최근 활발히 연구가 이루어지고 있다.
구강 바이오 필름은 700 종류 이상의 세균으로 구성되고, 1 ㎎ 중에 108 개 이상의 균이 존재하고 있다. 그 중에서 다수 (20％ ∼ 40％) 를 차지하는 Streptococci 는, 구강 표면에서의 다이나믹한 세균간 활성 물질을 통한 세균간 커뮤니케이션 하에서 바이오 필름을 형성하고 있다. 그 중에서도 Streptococcus mutans (S.mutans) 는, 점착성이 있는 균체외 다당을 산생하여, 병원성이 있는 바이오 필름 형성의 중심적인 역할을 하고 있다. 구강 바이오 필름은 우식이나 치주병의 원인이 되는 것을 알 수 있고, 이들 병은 S.mutans 를 비롯한 세균에 의한 미생물 감염증으로서 파악되고 있다.
종래의 우식 예방에서는 S.mutans 를 살균하거나, 또는 글루코실트란스페라아제 등의 효소를 저해하여 플라크의 형성을 방지함으로써 우식을 억제한다는 사고가 주류였다. 그러나, 실제 우식 병소에서는, 바이오 필름 표층을 덮는 균체외 다당에 의해 항균 물질, 효소 저해 물질 또는 항생 물질 등의 침투가 방해되므로, 생각한 것과 같은 효과가 얻어지지 않는 경우가 많다. 게다가, 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등의 사용은 내성균 출현의 위험성도 항상 가지고 있다. 또, 브러싱이나 스케일링 등의 기계적인 제거에 의해 바이오 필름을 억제하는 방법도 있지만, 그러한 기계적 구강 바이오 필름의 컨트롤이 곤란한 간호가 필요한 고령자 등에게 대해서는, 현상황의 방법으로 적확한 구강 케어를 실천하는 것은 어렵다.
이들 관점에서, 지금까지와는 상이한 방면에서의 바이오 필름 제거, 충치 예방 방법의 개발이 요망되고 있다. 또, 구강 바이오 필름의 컨트롤에 있어서는, 일상 습관적으로 계속하여 실시하는 것이 바람직하기 때문에, 껌 등의 식품 및 치약제 등의 구강용 조성물을 이용하는 것이 효과적이다.
새로운 구강 바이오 필름 제거법의 후보로서, 쿼럼센싱의 저해를 들 수 있다. 최근, 세균 상호 간에 있어서의 정보 전달계의 분자 메커니즘인 쿼럼센싱 (QS；세균 밀도 의존적 유전자 발현 제어계) 이 S.mutans 의 바이오 필름의 형성이나 병원성의 발현에 작용하고 있는 것이나, S.mutans 의 QS 는 오토인듀서인 Competence stimulating peptide (CSP) 에 의해 컨트롤되고 있는 것이 밝혀졌다. 현재는, 이 QS 를 타겟으로 하여 바이오 필름의 형성이나 병원성의 발현을 제어하는 연구가, 구강 질환을 비롯한 미생물 감염증의 예방 방법 개발로 이어질 것으로 기대되어, 여러가지 연구가 시도되고 있지만, 실용화에는 아직 도달하지 않았다.
예를 들어 비특허문헌 1 에는, S.salivarius 라는 균이 S.mutans 의 바이오 필름 형성을 저해하는 것, 및 특정한 유전자의 발현에 의해 CSP 를 제어할 수 있는 것이 개시되어 있다. 그러나, 미생물을 구강 내에 도입하는 것에는 안전성의 문제가 있고, 또 유전자 발현의 제어에는 많은 경우 곤란을 수반한다. 그 때문에, 보다 안전성이 높고, 또한 간편한 바이오 필름 형성 저해법의 개발이 요망되고 있다.
Oral Microbiology And Immunology, 2009 24(2):pp152-61
종래부터 있는 항균제, 효소 저해제 또는 항생 물질 등을 이용한 우식 억제법에서는, 구강 바이오 필름의 균체외 다당이 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등의 침투를 방해하기 때문에, 목표로 한 대로의 우식 억제 효과를 내는 것이 곤란하다. 또, 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등의 사용은 내성균이 출현할 위험성이 높기 때문에 바람직하지 않다. 그 때문에, 본 발명은 우식 원인균의 컨트롤을 실시하는 것이 아니라, 우식 원인균에 의한 바이오 필름 형성의 제어를 실시하는 것에 의한, 보다 안전하고 효과가 높은 우식 억제용의 구강용 조성물의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은 예의 연구를 진행시킨 결과, 쿼럼센싱을 제어하는 조성물에 의한 충치 바이오 필름 형성의 저해가 가능한 것을 알아내어, 이로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 구강용 조성물에 의해, 우식 원인균의 바이오 필름 형성이 저해된다. 이들 구강용 조성물은, 음식품, 의약품, 치약제 등에 첨가하여, 안전하게 충치의 예방 치료를 위해서 사용할 수 있다.
도 1 은 실시예 1 에 있어서 control 군과 sample 군의 각각에 있어서의 CSP 유도군과 CSP 비유도군의 바이오 포럼 형성량을 나타내는 그래프이다.
도 2 는 실시예 1 에 있어서 CSP 유도군과 CSP 비유도군의 각각에 있어서의 식물 추출물을 첨가했을 때의 바이오 포럼 형성량의 변화 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2 는 실시예 1 에 있어서 CSP 유도군과 CSP 비유도군의 각각에 있어서의 식물 추출물을 첨가했을 때의 바이오 포럼 형성량의 변화 비율을 나타내는 그래프이다.
비특허문헌 1 에 기재되어 있는 바와 같은 종래의 연구에 의해, S.mutans 의 쿼럼센싱 (QS) 이 특정한 미생물 또는 유전자 발현에 의해 제어되는 것을 알 수 있다. 그러나, 껌 등의 식품 및 치약제 등의 구강용 조성물에 배합하여 일상 습관적으로 우식 바이오 필름의 컨트롤을 실시한다는 관점에서는, 안전성이나 간편성 면에서 해결해야 할 과제가 많아, 이들 중 어느 QS 제어 방법도 아직 실용화에는 이르지 않았다.
이것에 대해, 본 발명자들은 예의 연구의 결과, S.mutans 의 쿼럼센싱이 일상적으로 안전하게 섭취할 수 있는 특정한 물질에 의해 제어될 수 있는 것을 발견하여, 이로써 쿼럼센싱을 제어하는 것에 우식 바이오 필름의 형성 저해를 실현하였다.
즉, 본 발명은, 콩류 추출물을 함유하는 구강용 조성물에 의해 쿼럼센싱에 관련된 충치 바이오 필름 형성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 관련된 구강용 조성물에 의하면, CSP 의존성의 S.mutans 의 바이오 필름 형성이 저해되기 때문에, 병원성 세균은 구강 내에 부착될 수 없다. 그 때문에, 브러싱이나 스케일링 등의 기계적인 방법에 의하지 않고 바이오 필름의 억제가 가능해진다.
또, 종래의 항균제, 효소 저해제 또는 항생 물질 등을 사용한 우식 억제법과 같은, 구강 바이오 필름의 균체외 다당이 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등의 침투를 방해하기 때문에 우식 억제 효과를 내는 것이 곤란하다는 문제도 발생하지 않는다.
또한 항균제, 효소 저해제, 항생 물질 등을 사용하지 않고 우식을 억제할 수 있으므로, 항균 물질이나 항생 물질에 대한 내성균이 출현할 가능성을 억제할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 콩류의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 동부, 팥, 자화두, 백화두, 흑 강낭콩, 붉은 강낭콩에서 선택되는 적어도 1 종류 이상의 콩류에서 추출한 추출물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유효 성분인 콩류의 추출물을 얻는 방법에 대해서는 특별히 한정 되지 않지만, 상기 콩류의 종자 또는 과실 (콩) 을 적당한 분쇄 수단으로 분쇄하여, 용매 추출 등의 방법에 의해 추출물을 조제한다. 추출 용매로는, 물 및 메탄올, 에탄올, n-프로판올 그리고 n-부탄올 등의 저급 알코올, 에테르, 클로로포름, 아세트산에틸, 아세톤, 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 유기 용매의 1 종 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용하지만, 바람직하게는 열수 또는 친수성의 유기 용매를 사용한다. 또, 본 발명의 추출물은, 음식품으로서 사용되는 경우가 많은 것을 고려하면, 추출 용매로는 안전성 면에서 물과 에탄올의 조합을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 90 ％ 이하의 에탄올로 추출하고, 더욱 바람직하게는 60 ％ 이하의 에탄올로 추출하고, 더욱 바람직하게는 30 ％ 이하의 에탄올로 추출하고, 가장 바람직하게는 열수로 추출한다.
추출 조건으로는, 고온, 실온, 저온 중 어떠한 온도에서 추출하는 것도 가능하지만, 50∼90 ℃ 에서 1∼5 시간 정도 추출하는 것이 바람직하다. 얻어진 추출물은 여과하여, 추출 용매를 증류 제거한 후, 감압하에서 농축 또는 동결 건조시켜도 된다. 또, 이들 추출물을 유기 용제, 칼럼 크로마토그래피 등에 의해 분획 정제한 것도 사용할 수 있다.
또, 본 발명의 구강용 조성물은, 안전성이 높은 점에서, 예를 들어, 구강 청결제, 치약, 소취 스프레이 등의 구강용 조성물, 혹은 추잉껌, 캔디, 정과, 구미젤리, 초콜릿, 비스킷, 스넥 등의 과자, 아이스크림, 셔벗, 빙과 등의 냉과, 음료, 빵, 핫케익, 유제품, 햄, 소세지 등의 축육 제품류, 어묵, 지쿠와 등의 어육 제품, 반찬류, 푸딩, 스프 그리고 잼 등의 음식품에 배합하여, 일상적으로 이용하는 것이 가능하다.
그 배합량으로는, 여러 가지 제조 조건에 따라 바뀔 수 있지만, 구강용 조성물에 대해, 콩류 추출물을 0.01 중량％ 이상 2.0 중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 중량％ 이상 1.0 중량％ 이하 배합시키는 것이 바람직하다.
본 발명은 종래부터 식용으로 되어 있는 것의 추출물을 사용하고 있으므로, 구강내나 체내에 섭취해도 그 안전성에 대해서는 문제없다. 또, 추잉껌 등의 식품이나 치약제 등에 함유시켜 간편하게 섭취하는 것이 가능하고, 유전자의 발현 조제와 같은 복잡한 순서를 필요로 하지 않기 때문에, 일상적으로 계속해서 바이오 필름의 컨트롤을 하는 것이 가능해진다.
실시예
이하에, 실시예를 이용하여 본 발명에 대해 설명하지만, 이들 실시예는 전혀 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
1. 추출물 조제
식물 샘플로서 동부, 팥 (다이나곤), 팥 (에리모 팥), 자화두, 백화두, 흑 강낭콩, 붉은 강낭콩의 7 종을 사용하였다.
각 식물 샘플은 시판품을 구입하고, 20 g 을 분쇄기로 잘게 분쇄 후, 물 200 ㎖ 로 70 ℃·2 시간 추출하였다. 얻어진 추출액은, 3000 rpm·10 분간 원심 분리하고, 상청을 여과 후, 동결 건조시킨 것을 각 식물 열수 추출물로서 시험에 제공하였다.
2. 바이오 필름 형성 억제 활성 평가
2-1. 바이오 필름 형성
S.mutans UA159 주 (株) 를 5 ㎖ 의 Brain Heart Infusion (BHI) 액체 배지에서 37 ℃·10 시간 혐기 배양하고, 3000 rpm·10 분간 원심 분리하여 모은 세균을, 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 에 의해 OD550㎚ = 0.5 로 조제하고, 이것을 공시균 현탁액으로 하였다.
바이오 필름 형성은, 96 구멍 마이크로 플레이트를 이용하여 시험을 실시하였다. 각 웰에, 식물 열수 추출물 60 ㎕, CSP 20 ㎕, S.mutans 공시균 현탁액 20 ㎕, 0.1 ％ Sucrose 첨가 Todd Hewitt Broth 100 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃·5 ％ CO2 조건하에서 16 시간 배양을 실시하여 CSP 유도군의 바이오 필름을 형성하였다. CSP 의 농도는 최종 농도로 1 μM, 각 샘플의 열수 추출물의 농도는 최종 농도로 1 ㎎/㎖ 였다.
비교를 위해, CSP 를 첨가하지 않고, 그 이외에는 상기와 동일한 조건으로 하여 배양을 실시하여, CSP 비유도군의 바이오 필름을 형성하였다.
또한 컨트롤로서, CSP 유도군 및 CSP 비유도군의 각각에 대해, 샘플의 열수 추출물을 첨가하지 않고, 그 이외에는 상기와 동일한 조건으로 하여 배양을 실시하였다.
2-2. 바이오 필름 정량
CPS 유도군과 CSP 비유도군의 각각에 대해, 배양 후의 상청을 제거하고, PBS로 2 회 각 웰의 세정을 실시하였다. 세정 후, 각 웰에 0.25 ％ 사프라닌 용액을 첨가하여 15 분간 가만히 정지시킨 후 잉여 사프라닌 용액을 제거하고, PBS 로 2 회 각 웰의 세정을 실시하였다. 세정 후 각 웰에 에탄올을 첨가하고, 30 분간 진탕함으로써 염색시킨 사프라닌을 용출시키고, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 492 ㎚ 의 흡광도를 측정하여, 바이오 필름 형성량을 정량하였다.
그 결과를 도 1 및 도 2 에 나타낸다.
도 1 은 식물 추출물을 첨가하여 배양을 실시한 군 (sample 군) 과 컨트롤군 (control 군) 에 있어서의 바이오 필름 형성량을, CSP 유도군과 CSP 비유도군의 각각에 대해 나타내고 있다. 또, 도 2 는 control 군의 바이오 필름 형성량을 100 으로 했을 때의 sample 군의 바이오 필름 형성량의 비율을, CSP 유도군과 CSP 비유도군의 각각에 대해 나타내고 있다.
도 1 로부터, control 군에서는 CSP 유도군에 있어서 CSP 비유도 군보다 바이오 필름 형성량이 증가되어 있었다. 이 증가분이, CSP 를 오토인듀서로 하는 쿼럼센싱에 의한 바이오 필름의 증가분인 것으로 생각되었다.
또, sample 군에서는, CSP 유도군 (흑봉) 의 바이오 필름 형성량은 control 군보다 적어져 있었지만, CSP 비유도군 (백봉) 의 바이오 필름 형성량은 control 군으로부터 변화되지 않았다. 이것은 도 2 로부터도 분명하여, CSP 유도군 (흑봉) 에서는 sample 군의 바이오 필름 형성량은 control 군보다 적었지만 (100 ％ 미만), CSP 비유도군 (백봉) 에서는 sample 군의 바이오 필름 형성량은 control 군과 변함이 없었다 (약 100 ％). 이것으로부터, sample 군에 첨가한 식물 추출물에 의해 CSP 를 오토인듀서로 하는 S.mutans 의 쿼럼센싱이 제어되어, 바이오 필름의 형성량이 증가하지 않은 것으로 생각되었다.
또, 도 1 에 있어서, CSP 유도군에 다이나곤 팥, 에리모 팥, 자화두, 붉은 강낭콩의 열수 추출물을 첨가하여 배양을 실시한 경우 (sample 군의 CSP+), CSP 도 식물 추출물도 첨가하지 않는 군 (control 군의 CSP-) 보다 바이오 필름 형성량이 감소되어 있었다.
또한 실시예 1 에서 조제한 팥 추출물을 이용하여, 추잉껌, 캔디, 치약을 통상적인 방법으로 조제하였다. 이하에 그 처방을 나타낸다. 또한, 이들은 본 발명물의 범위를 전혀 제한하는 것은 아니다.
[실시예 2]
이하의 처방에 따라 추잉껌을 조제하였다.
껌 베이스 20.0 중량％
설탕 55.0
글루코오스 15.0
물엿 9.0
향료 0.5
에리모 팥 열수 추출물 (실시예 1) 0.5
100.0
[실시예 3]
이하의 처방에 따라 캔디를 조제하였다.
설탕 50.0 중량％
물엿 34.0
향료 0.5
다이나곤 팥 열수 추출물 (실시예 1) 0.5
물 잔량
100.0
[실시예 4]
이하의 처방에 따라 치약을 조제하였다.
탄산칼슘 50.0 중량％
글리세린 20.0
카르복시메틸셀룰로오스 2.0
라우릴황산나트륨 2.0
향료 1.0
사카린 0.1
에리모 팥 열수 추출물 (실시예 1) 1.0
클로르헥시딘 0.01
물 잔량
100.0
본 출원은 2010년 9월 21일에 출원된 일본 특허 출원 제2010－211023호로부터의 우선권을 주장하는 것으로, 그 내용을 인용하여 본 출원의 일부로 하는 것이다.
Claims (5)
- CSP 에 의해 컨트롤되는 Streptococcus mutans 의 쿼럼센싱을 제어하는 팥 추출물을 배합하는 바이오 필름 형성 억제를 위한 구강용 조성물로서,
그 팥 추출물이, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, n-부탄올, 에테르, 클로로포름, 아세트산에틸, 아세톤, 글리세린 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종 이상의 추출 용매를 사용하여, 50 ~ 90 ℃ 에서 1 ~ 5 시간 추출함으로써 조제되는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
항균제, 효소 저해제 및 항생 물질을 배합하지 않는 것을 특징으로 하는 바이오 필름 형성 억제를 위한 구강용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
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