JP2005060297A - ササゲ赤褐色色素とその製造方法及びアポトーシス誘導物質 - Google Patents

Abstract

【課題】 安全性が非常に高く、従来の抗癌剤と比較して安価で副作用もなく、継続的に摂取することができるアポトーシス誘導物質を提供する。
【解決手段】 マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子から、抽出及び／或いは精製したササゲ赤褐色色素をアポトーシス誘導物質として使用する。
【選択図】 図３

Description

本発明は，ササゲに含有される赤褐色色素及びその製造方法、更には該赤褐色色素を有効成分とする癌予防剤として有効なアポトーシス誘導物質に関する。

現庄、癌は死亡原因のトップの病気であり、その予防に対する人々の関心は非常に高い。また、日常的に取り入れることができる癌予防のための方法が数多く提案されている。

近年、癌研究の分野では、アポトーシス、すなわち癌細胞自滅に関する研究が盛んになりつつある。アポトーシスは生物個体発生における組織・臓器の形成、生体の恒常性の維持と防御に重要な働きをしているだけでなく、多くの病気の発生に深い関係があることが解明されつつある。

アポトーシスによる細胞の制御作用の異常は、癌形成のひとつの原因であると考えられている。本来、死滅すべき細胞がアポトーシス、つまり細胞自滅を起こすことなく生き残ると、その細胞が様々な刺激を受けて染色体上に変異を重ね、最終的に癌細胞になるとされている。癌細胞は、アポトーシスの耐性機構を獲得して初めて増殖を可能にするのである。このことから、種々の遺伝子変異を伴う細胞の癌化の過程はアポトーシスに対する耐性獲得の過程に関係がある。
前述の癌予防のための方法としては、多種の薬剤や飲食品が提案され、その中でも多くの既存の制癌剤が癌細胞のアポトーシス誘導作用を持っていることが知られている。

しかしながら、既存の制ガン剤はきわめて高価であるため、適当な使用量の設定や長期間の使用をすることが困難であり、さらに殆どの既存の制癌剤は副作用を有するものであるため、それらの副作用は癌患者にとって大きな負担となるものである。

本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意研究を行った結果、マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子（以下、「ササゲ」と略称する。）から抽出された赤褐色色素は、癌細胞のアポトーシス誘導に優れた効果を有することを見出し、本発明をするに至った。
即ち、本発明は、ササゲから抽出及び／或いは精製されてなるササゲ赤褐色色素に関する。

また、本発明は、マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子を、熱水により抽出液を得、ついで該抽出液より精製することを特徴とするササゲ赤褐色色素の製造方法に関する。

さらに、本発明は、ササゲから抽出及び精製されてなるササゲ赤褐色色素を有効成分とするアポトーシス誘導物質に関する。

さらにまた、ササゲから抽出及び精製されてなるササゲ赤褐色色素を添加することにより、アポトーシス誘導機能を有することを特徴とする機能性食品並びに機能性飲料に関する。

本発明のアポトーシス誘導物質は、天然の食品由来の成分であり，古くから人類に食されていた食経験も有するササゲを原料とするものであるため、従来の制癌剤のように高価でも副作用を有するものでもなく、極めて安全性が高く、継続的に摂取することが可能である。 また、着色性に優れているので、特に各種食品に添加して摂取する場合において、着色した食品とすることができる視覚的効果をも有する。

本発明によれば、マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子を原料とし、且つ特定の処理を施すことにより、癌細胞のアポトーシス誘導に優れた効果を有する赤褐色色素を提供することができる。そして、本発明で得られるササゲ赤褐色色素は、安全性が非常に高く、従来の抗癌剤と比較して安価で副作用もなく、継続的に摂取することができるものである。また、本発明で得られるササゲ赤褐色色素を添加することにより、着色した食品或いは飲料とすることができる視覚的効果をも有する。

以下、本発明を詳しく説明する。
本発明に用いられるササゲは、マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子を乾燥したものであって、主として赤飯の製造時にもち米に色を付けるために用いられるものである。赤飯は日本の伝統的食物で、もち米を小豆またはササゲの煮汁で着色して作られるものである。

本発明におけるササゲ赤褐色色素は、洗浄したササゲ種子を水及び／或いはアルコールを溶媒として浸漬して溶出させることにより、該色素を抽出することができる。アルコール含有水溶液を溶媒として抽出する際には、まずササゲ種子を抽出溶媒に浸漬し、この溶液を遠心分離或いは濾過して上清を得て、次いで減圧濃縮によりアルコールを除去してササゲ赤褐色色素を得ることができる。

本発明において、ササゲ赤褐色色素の好ましい抽出方法としては、まず、ササゲ種子に約７倍量の熱水を加え、１５〜３０分間加熱して、ササゲより赤褐色の色素成分を溶出させる方法を挙げることができる。この時、加水量はササゲ豆重量に対して約３倍から１０倍程度であり、加水量が豆の吸水率（２倍程度）以上であれば問題はない。また、加熱温度は７０℃以上で、加熱時間は１時間程度まで良いが、１００℃、１５分〜３０分の加熱がもっとも良い。加熱によってササゲより、４５０ｎｍ〜５００ｎｍに特異的吸収を示す赤褐色色素を主体とした色素成分が溶出され、赤褐色を呈する煮汁が調製できる。

本発明で得られるササゲ赤褐色色素をアポト−シス誘導物質として用いる場合には、煮汁の状態でも良いし、さらに、煮汁をそのまま或いはデキストリン等の粉末助剤を添加して噴霧乾燥又は凍結乾燥を行い、色素粉末としても使用することが可能である。

特に、本発明で得られるササゲ赤褐色色素をアポト−シス誘導物質として用いる場合には、洗浄したササゲ種子を水及び／或いはアルコールを溶媒として浸漬して得られたササゲ赤褐色色素の抽出液を更に精製したものを使用することが好ましい。ササゲ赤褐色色素の抽出液から該色素成分を精製するには合成吸着樹脂，例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７（オルガノ社製）の様なメタアクリル酸エステル系樹脂やＨＰ−２０（三菱化成社製）の様なスチレン−ジビニルベンゼン系樹脂に吸着させ，色素成分をエタノールにて溶出させる。この時、エタノールは水との混合溶媒（重量％で５０％以上が好ましい）を用いることができる。 続いて吸着樹脂から溶出した色素成分液を凍結乾燥あるいは４０℃以下の温度で減圧乾燥して精製した粉末色素を得ることができる。

本発明で得られるササゲ赤褐色色素には、種々の生理機能を有する可能性が有ると考えられるが、本発明者らが鋭意検討した結果、このアントシアニン含有抽出物には、癌細胞のアポトーシス誘導作用に優れた効果を有することを見出した。

本発明で得られるササゲ赤褐色色素を飲料用に加工し、スポーツドリンクやお茶と同様の感覚で日常的に摂取することができ、或いは多くの食品或いは飲料に添加して健康食品・特定保健用食品等の機能性食品或いは飲料として摂取することができる。例えば、本発明で得られるササゲ赤褐色色素の凍結乾燥品或いは濃縮液を、乳製品、油脂製品、調味料、菓子、果実ジュース、清涼飲料等に添加して用いることができる。

或いは、本発明の効果を妨げない範囲で、必要に応じて賦形剤、甘味料、必須アミノ酸やビタミン類その他の任意成分を添加し、ビタミン剤のようにカプセルや錠剤、シロップ等、意識的にこの物質を摂取しやすいように所望に応じて各種形態に加工することができる。
経口投与製剤には、そのまま或いは適当な添加剤、例えば乳糖、マンニット、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン等の慣用の賦形剤と共に、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン等の結合剤、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、その他増量剤、湿潤化剤、緩衝剤、保存剤、香料等を適宜組み合わせて錠剤、散剤、顆粒剤或いはカプセル剤とすることができる。
本発明で得られるササゲ赤褐色色素を経口投与する場合、投与量は、投与形態、患者の年齢、体重、症状等により異なるが、一般には成人男子に対して１日約０．５ｇ〜５．０ｇを投与することが望ましい。

以下に本発明を比較例及び実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実験１〕
ササゲ煮汁及びササゲ煮汁を精製して得た色素によるヒト胃癌細胞におけるアポトーシス誘導作用を調べた。

ヒト胃癌細抱を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。５×１０⁵／ｍｌの密度になるようにヒト胃癌細胞の培養液を調整し、５０％エタノール（対照群）、ササゲ煮汁の乾燥粉末及び該煮汁からカラム処理により精製した色素粉末が所定の濃度になるように調整した５０％エタノール溶液（実験群）並びに小豆煮汁からカラム処理により精製した色素粉末が所定の濃度になるように調整した５０％エタノール溶液（比較群）をそれぞれ前述のヒト胃癌細胞の培養液に添加し、３７℃、９５％−５％ＣＯ₂の条件下で３日間培養した。

対照群及び実験群が添加された胃癌細胞をそれぞれ遠心分離した後、上清を除去した後に残った細胞をＰＢＳ（−）で1回洗浄した。細胞ペレットに細胞融解用バッファーを加え、細胞を融解させた。ＲＮＡｓｅ溶液を加え、５０℃で２．５時間反応させてから、プロテアーゼＫ溶液を加え、５０℃で２．５時間反応させてから、ＤＮＡ断片を抽出した。

ＤＮＡ抽出液とゲルローディング液を混合して、２％アガロースゲル板のウェルに添加し、１００Ｖで電気泳動を行った。ゲルを水に浸してから、ＵＶトランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を発するＤＮＡを検出し、その写真を図１に示した。
図中、Ｍ及び培養液に対する添加物を示す番号（１）〜（４）は、下記の通りである。

Ｍ ＤＮＡマーカー
（１） 対照群（５０％エタノール溶液）
（２） 実験群１（ササゲ煮汁乾燥粉末の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ）
（３） 実験群２（ササゲ煮汁をカラム処理することにより精製した色素粉末の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ）
（４） 比較群（小豆煮汁をカラム処理することにより精製した色素粉末の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ）

図1より明らかなように、実施群であるササゲ煮汁（レーン（２））及びササゲ煮汁をカラム処理して得られた色素（レーン（３））は、いずれにおいてもヒト胃癌細胞においてアポトーシスによるＤＮＡ断片化によって胃癌細胞が自滅したことが判る。尚、ＤＮＡ断片化効果について、レーン（２）とレーン（３）を比較すると、後者の方が強く現れていることから、ササゲ煮汁をカラム処理して得られた色素は、ヒト胃癌細胞におけるアポトーシス誘導作用において格段に優れることがわかる。

〔実験２〕
ササゲ煮汁をカラム処理して得られた色素について、高速液体クロマトグラフィーで分子量の同定及び分画を行った。図２は、当該ササゲ煮汁色素の高速液体クロマトグラフィーによる分画フラクションを示したグラフである。尚、前記の分画フラクションのグラフの結果から、Ａ〜Ｆ画分の分子量は、３００〜２０００の範囲内であることがわかった。

〔実験３〕
ササゲ煮汁をカラム処理して得られた色素（以下、「カラム処理後のササゲ色素」と省略する。）を高速液体クロマトグラフィーで分画を行い、上述の画分Ａ〜Ｆを分取した。ついで、これらの画分を使用して、実験１と同様の手法により、画分Ａ〜Ｆのそれぞれについて、ヒト胃癌細胞におけるアポトーシス誘導作用を調べた。電気泳動によりＤＮＡを検出した結果について、図３の写真に示した。
図中、Ｍ及び培養液に対する添加物を示す番号（１）〜（６）は、下記の通りである。

（右 図）
Ｍ ＤＮＡマーカー
（１）対照群（５０％エタノール溶液）
（２）カラム処理後のササゲ色素 Ｅ画分の５０％エタノール溶液 １．２ｍｇ／ｍｌ
（３）カラム処理後のササゲ色素 Ｆ画分の５０％エタノール溶液 ０．８ｍｇ／ｍｌ
（左 図）
（１）対照群（５０％エタノール溶液）
（２）カラム処理後のササゲ色素 Ａ画分の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ
（３）カラム処理後のササゲ色素 Ａ画分の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ
（４）カラム処理後のササゲ色素 Ｂ画分の５０％エタノール溶液 ２．５ｍｇ／ｍｌ
（５）カラム処理後のササゲ色素 Ｃ画分の５０％エタノール溶液 １．２５ｍｇ／ｍｌ
（６）カラム処理後のササゲ色素 Ｄ画分の５０％エタノール溶液 １．２５ｍｇ／ｍｌ

図３の電気泳動の写真から、アポトーシスによる胃癌細胞ＤＮＡ断片化の効果について検討すると、Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ画分に強い断片化が見られることが分かる。これらの画分のうち、Ａ画分はササゲ煮汁色素の６２％（ｗ／ｗ）を占める主要な成分画分である。そこで、Ａ画分についてスペクトロフォトメーター（商品名Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−７５００ 米国製）を使用して、３５０〜７００ｎｍの範囲内で吸収スペクトルを測定したところ、ササゲ煮汁の色素の特徴を示す４３０〜５００ｎｍの特異的吸収が認められた。

〔実験３〕
アポトーシス誘導能を示すササゲ煮汁の粉末を摂取したときの抗ガン作用について調べるために、以下の実験を行った。

Ａ／Ｊマウス（♀）に対してベンゾ（α）ピレン１．５ｍｇを１００μｌのコーンオイルに溶かしたものを１週間に１度ゾンデにて４週間、胃腔内へ投与した。その後、コントロール群には水道水のみを与え、実験群には表中の濃度になるようにサンプルを懸濁、溶解したものを給水ビンに入れて５ヶ月間、連続投与した。胃癌腫瘍が確認されたら、胃を取り出してアルミ箔上に胃を拡張固定し、腫瘍（直径２ｍｍ以上）の数を計測し、マウス１匹当たりの腫瘍の数を算出した。また、腫瘍を切り取り集め重量を測定し、マウス１匹当たりの腫瘍の重量を算出した。

表１の結果から明らかなように、ササゲ煮汁粉末は、胃癌発生を抑制することが確認された。すなわち、コントロール群の胃癌腫瘍数の平均値に対し、ササゲ煮汁粉末０．５％が投与された実験群の胃癌腫瘍数の平均値は約６１％、ササゲ煮汁粉末１％が投与された実験群では約４３％に減少している。一方、腫瘍重量の平均値を比較すると、コントロール群に対し、ササゲ煮汁粉末０．５％が投与された実験群では約５４％、ササゲ煮汁粉末１％が投与された実験群では約３９％に減少している。このように、ササゲ煮汁粉末を投与された実験群については、胃癌発生率が抑制されることが確認された。

〔実施例１〕（ティーバッグ）
市販の紅茶葉を粉砕し、この粉砕物に対して本発明のササゲ煮汁粉末を３重量％になるように添加してよく混合した。これらの３種類の混合物をティーバックに詰め、ササゲ煮汁粉末が添加されたティーバックを得た。このティーバックを熱湯で滲出することによって、ササゲ煮汁粉末が紅茶に溶出混合し、癌予防効果が付与された紅茶を得ることができる。

〔実施例２〕（飲料）
市販のオレンジジュース１ｋｇを３つ用意した。各々のオレンジジュースに対して本発明のササゲ煮汁粉末を３重量％になるようそれぞれ１種を添加してよく混合し、癌予防効果が付与されたオレンジジュースを得ることができる。

〔実施例３〕（錠剤）
成分 １錠当り（mg）
本発明のササゲ煮汁粉末 ４
乳糖 １０６
結晶セルロース ４０
カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０
ステアリン酸マグネシウム １０
計 １８０ｍｇ

〔実施例４〕（カプセル剤）
成分 １カプセル当り（mg）
本発明のササゲ煮汁粉末 １０
乳糖 ２００
タルク ４０
計 ２５０ｍｇ

〔実施例５〕（グミキャンディー）
グミキャンディー還元麦芽糖水飴１５０重量部を加熱し、減圧下で水分約１５ｗ／ｗ％に濃縮し、常法にしたがって、これにゼラチン１３重量部を水１８重量部に溶解したものと、本発明のササゲ煮汁粉末１重量部、クエン酸２重量部および適量の香料を混合し、成形、包装して製品を得ることができる。

〔実施例６〕（チューインガム）
チューインガムガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖４重量部およびマルトース粉末３重量部とを加え、本発明のササゲ煮汁粉末０．０２重量部を混合し、常法にしたがって、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得ることができる。

ササゲ煮汁及びササゲ煮汁色素によって断片化されたＤＮＡの分布状態を示す電気泳動図 ササゲ煮汁色素の高速液体クロマトグラフィーによる分画フラクションを示したグラフ ササゲ煮汁色素の高速液体クロマトグラフィー分画によって断片化されたＤＮＡの分布状態を示す電気泳動図

Claims (6)

1. マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子から抽出されたことを特徴とするササゲ赤褐色色素。
2. マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子から抽出され、且つ精製されてなることを特徴とするササゲ赤褐色色素。
3. マメ科ササゲ属ササゲ亜属に属する一年生のマメ科植物の種子を、熱水により抽出液を得、ついで該抽出液より精製することを特徴とするササゲ赤褐色色素の製造方法。
4. 請求項１又は請求項２のササゲ赤褐色色素を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス誘導物質。
5. 請求項１又は請求項２のササゲ赤褐色色素を添加することにより、アポトーシス誘導機能を有することを特徴とする機能性食品。
6. 請求項１又は請求項２のササゲ赤褐色色素を添加することにより、アポトーシス誘導機能を有することを特徴とする機能性飲料。