KR101656875B1

KR101656875B1 - 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물을 이용한 그람음성세균 억제용 정족수 감지 억제제

Info

Publication number: KR101656875B1
Application number: KR1020150159767A
Authority: KR
Inventors: 김수기; 국민
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2016-09-12

Abstract

본 발명은 식물추출물을 포함하는 정족수 감지 억제제에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명은 식물추출물을 포함하는 정족수 감지(quorum sensing) 억제제 및 이를 이용한 병원성 미생물에 의한 생물막 형성 억제제 또는 병원성 미생물에 의한 생물막 형성 억제방법 등을 제공함으로서 주변에서 흔히 볼 수 있는 식물의 추출물을 이용하여 생물막 형성으로 인한 피해를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 사료첨가제 등으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물을 이용한 그람음성세균 억제용 정족수 감지 억제제{QUORUM SENSING INHIBITOR USING PLANT EXTRACTS FOR PREVENTING THE PROLIFERATION OF GRAM-NEGATIVE BACTERIA}

본 발명은 정족수 감지 억제제(quorum sensing inhibitor)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 식물 추출물을 포함하는 정족수 감지 억제제에 관한 것이다.

정족수 감지(quorum sensing, QS)은 세균 사이의 의사소통(Communication)으로 특정한 화학물질(Autoinducer, AI)을 이용하여 biofilm 형성, 이차대사물의 생성, 생물발광(Bioluminescence), stress 반응 및 운동성(Motility) 등을 비롯한 다양한 표현형이 나타나는 것으로 많은 병원성 인자들이 이에 속한다. Vibrio fischeri에서 QS에 의해 생물발광(Bioluminescence)이 나타나는 현상이 처음 알려 진 이후, 여러 가지 세균의 QS에 대하여 연구되어지고 있다. 신호물질인 AI에는 다양한 분자들이 알려져 있다. 그람 음성 세균에서만 나타나는 AI-1 system에서는 N-acyl homeserine lactone (AHL)이 사용되어 지고 있고, AI-2 system은 QS가 알려지게 된 Vibrio 종이 주로 사용하고 있다. 그람 음성 세균과 그람 양성 세균이 모두 이용하고 이종 간의 통신(Communication)에 사용되는 것으로 알려진 furanosyl borate diester 및 oligopeptide (Auto-inducing peptides, AIP) 등이 많이 연구 되어졌다. AI-3 system은 정확한 메커니즘과 신호전달 물질은 현재 연구가 진행 중으로 사람의 스트레스 호르몬인 epinephrine 또는 norepinephrine과 비슷한 구조로 추정하고 있다.

대부분의 그람음성 세균의 경우에는 LuxR/LuxI homologue system을 이용한다. LuxI 단백질은 AHL을 생산하며 세균의 수가 늘어감에 따라 AHL의 농도가 증가하게 되고, LuxR 단백질이 AHL과 결합하여 특정 유전자의 발현을 유도한다. 대표적으로 AHL을 이용하는 그람음성 세균의 종류로는 Pseudomonas , Burkholderia, Erwinia , Aeromonas , Agrobacterium , Serratia , Citroateria , Enterobacteria , Proteus , Chromobacterium 및 Rhizobium 등이 있다. 이러한 그람음성 세균의 특성을 이용한 reporter strain인 Chromobacterium violaceum CV026은 wild-type의 Chromobacterium violaceum CV017로부터 얻어진 변이주로서 AI물질인 AHL을 생산하는 LuxI homologue 유전자를 knock-out 시킨 균주이다. AHL을 스스로 생성할 수 없기 때문에 외부에서 첨가한 AHL을 인식하여 보라색으로 발색되는 표현형을 가진다.

대표적으로 잘 알려진 Pseudomonas aeruginosa와 Burkholderia, 어병균인 Vibrio anguillarum, 식물의 병원균인 Erwinia carotovora와 Agrobacterium tumefaciens 등의 병원성 세균들이 QS를 통해 발병요소를 조절하여 숙주를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 이중 섬유성 낭포증 환자의 호흡기 감염 균인 P. aeruginosa의 연구가 활발히 진행되어져 왔다. 또 일부 Burkholderia 종들과 E. coli 등의 발병요인과 QS과의 관계가 연구되어 지고 있다.

병원성 세균과 QS와의 관계와 더불어 그 신호를 차단할 수 있는 방법인 QS 억제에 관한 연구도 활발히 진행되어 지고 있고, 그람음성 세균의 QS 신호물질인 AHL을 분해하는 효소를 가진 균주들을 이용한 QS 억제 활성에 관하여 보고도 되었으나, 균주나 특정 화합물외에 천연소재인 식물추출물의 QS 억제 활성에 대한 연구는 미흡한 상태이며 더 나아가 QS 억제 활성을 갖는 식물추출물을 병원성 세균의 감염성을 낮추는 물질로 사용하여 biofilm 형성으로 인한 피해를 감소시키는 등으로 활용된 사례는 없다.

한편, 관련 선행기술로는 한국등록특허 제10-0832565호(항균성 퓨라논 유도체 및 이를 이용한 생물막의 형성 방지 방법), 한국공개특허 제10- 2008-0060777호(항균성 아마이드 유도체 및 이를 이용한 생물막의 형성방지 방법) 등이 있다.

따라서 본 발명은 천연소재인 식물추출물을 포함하는 정족수 감지 억제제(quorum sensing inhibitor)를 제공하는 것을 일 목적으로 한다.

또한 본 발명은 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성을 갖는 식물추출물을 포함하는 생물막 형성 억제제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성을 갖는 식물추출물을 병원성 미생물과 접촉시켜 생물막 형성을 억제하는 단계를 포함하는 생물막 형성 억제 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성을 갖는 식물추출물을 포함하는 항병원성 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한 본 발명은 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성에 의한 생물막 억제 효과를 갖는 식물추출물을 포함하는 사료첨가제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 청구범위에 나타낸 수단 및 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 정족수 감지(quorum sensing) 억제제는 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물에서 선택되는 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 것을 일 특징으로 한다.

또한 본 발명의 생물막 형성 억제제는 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성을 갖는 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물에서 선택되는 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 것을 다른 특징으로 한다.

또한 본 발명의 항병원성 조성물은 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성을 갖는 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물에서 선택되는 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 것을 다른 특징으로 한다.

또한 본 발명의 사료첨가제는 병원성 미생물에 대하여 정족수 감지 억제 활성에 의한 생물막 형성 억제 효과를 갖는 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물에서 선택되는 어느 하나 또는 2 이상을 포함하는 것을 다른 특징으로 한다.

상기 단풍나무 추출물, 당단풍나무 추출물 및 박태기나무 추출물은 열수추출법 또는 유기용매추출법에 의해 제조될 수 있고, 바람직하게는 메탄올을 이용하여 추출하는 것이고, 더욱 바람직하게는 단풍나무 잎, 당단풍나무잎 또는 박태기나무 잎의 가루와 메탄올을 1:10의 비율로 혼합하여 추출물을 제조할 수 있고, 상기 병원성 미생물을 그람 음성균을 포함할 수 있다.

상기와 같은 본 발명은 식물추출물을 포함하는 정족수 감지(quorum sensing) 억제제 및 이를 이용한 병원성 미생물에 의한 생물막 형성 억제제 또는 병원성 미생물에 의한 생물막 형성 억제방법 등을 제공함으로서 주변에서 흔히 볼 수 있는 식물의 추출물을 이용하여 생물막 형성으로 인한 피해를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 사료첨가제 등으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 채집된 식물의 사진이다.
도 2 는 N-acyl homoserine lactone(AHL)의 구조이다.
도 3 은 Chromobacterium violaceum CV026에서의 정족수 감지(quorum sensing) 억제 실험결과이다((A) HHL, (B) OHHL).
도 4 는 항균활성분석 실험결과이다((A) Pseudomonas aeruginosa PAO1. (B) Escherichia coli O157:H7. (C) Burkholderia sp.).
도 5 는 생물막(biofilm) 형성 억제 분석 실험결과이다((A) Optical density of biofilm formation was measured at 570 nm. (B) Ratio of biofilm formation was calculated as compared with the control, 100%).
도 6 은 Pseudomonas aeruginosa PAO1의 운동성 분석 실험결과이다.
도 7 은 Escherichia coli O157:H7의 운동성 분석 실험결과이다.
도 8 은 식물추출물이 Pseudomonas aeruginosa PAO1 균주가 생산하는 pyocyanin 생산에 미치는 영향 측정한 실험결과이다.
도 9 는 생물발광 균주를 이용한 식물추출물의 정족수 감지(quorum sensing) 억제 활성을 측정한 실험결과이다.
도 10 은 Thin-layer chromatography(TLC)를 이용한 AI 분비 억제 활성을 측정한 실험결과이다.
도 11 은 Caenorhabditis elegans의 life cycle를 나타낸 모식도이다.
도 12 은 Caenorhabditis elegans 감염억제 활성을 측정한 실험결과이다(Survival ratio of C. elegans by P . aeruginosa PAO1 (A), E. coli O157:H7 (B), and Burkholderia sp (C)).

상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서 본 발명과 관련된 공지기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기고 한다. 이하, 첨부된 도면들을 함께 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1. 식물의 채집

정원수로 이용하고 있는 식물 샘플의 채집은 서울특별시 광진구 화양동에 위치한 건국대학교 캠퍼스에서 2014년 10월경에 이루어졌다. 식물 샘플의 잎들은 모두 깨끗이 씻어 실온에서 완전히 건조 후 분쇄기(DA5000, healthmic, Korea)를 이용하여 완전히 가루상태로 만든 후 -20℃에 보관하였다. 채집한 샘플의 잎의 사진, 일반명 및 학명은 도 1 및 표 1과 같다.

실시예 2. 식물추출물 제조

상기 실시예 1에 의해 채집한 식물가루상태의 sample을 메탄올과 1:10 비율로 50 ㎖ 튜브에 넣고 4℃에서 72 hr 배양하였다. 12,000 rpm에서 10 min 원심분리하여 부유 물질을 침전시킨 후 상등액은 필터페이퍼(ADVANTEC^ⓡ 1, 110 mm, Toyo Roshi Kaisha, Japan)로 걸러 주고 주사기 필터(Minisart^ⓡsyringe filter 0.45μm, Saltorius, Germany)를 이용하여 제균하였다. 상등액은 감압농축기(RE111, BUCHI, Germany)로 메탄올을 모두 증발시켰다. 남은 물질의 무게를 측정하여 총 100 mg/㎖의 농도로 메탄올에 녹였다. 실험에 사용한 식물추출물 시료들은 모두 멸균 증류수를 이용하여 1/10 희석하여 보관하면서 사용하였다.

실시예 3. 균주배양

AI reporter 균주로 사용한 Chromobacterium violaceum CV026 (SK730)은 한국 생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB)에서 분양 받아 사용하였다. Burkholderia sp. (SK1450)는 국립수의과학연구소에서 분양받았으며, Pseudomonas aeruginosa PAO1 (SK804)는 경기보건환경연구원에서, Escherichia coli O157:H7 (SK1293)는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받았다.

C. violaceum CV026은 30℃에서 24 hr LB (Luria bertani) 배지(Trypton 1%, yeast extract 0.5% 및 NaCl 1%)에서 배양하였고, P. aeruginosa PAO1, E. coli O157:H7 및 Burkholderia sp.는 37℃에서 16 hr LB 배지에 배양하였다.

실시예 4. N- acyl homoserine lactone ( AHL )

실험에 사용한 AHL은 Sigma Aldrich에서 구입하였고 DL-form으로 되어있고 가루형태이다. 총 3 가지 종류이며 구조는 도 2와 같다. 실험에 사용한 농도는 대체적으로 1 μM∼100 μM 범위로 사용하였으며 20℃에서 보관하였다.

실험예 1. Chromobacterium violaceum CV026을 이용한 quorum sensing 분석

Reporter strain으로 사용하기 위하여 Chromobacterium violaceum CV026을 미리 30℃에서 16 hr 배양하였다. LB agar plate에 배양한 C. violaceum CV026을 멸균된 면봉을 이용하여 얇게 도말 후 plate룰 건조시켰다. 멸균된 pasteur pipette을 이용하여 6 mm 크기의 구멍(Hole)을 만들었다. 각각의 식물추출물 50 ㎕와 C. violaceum CV026의 작용 기질로 사용될 상기 실시예 4의 AHL (HHL, OHHL)을 각각 50 ㎕을 넣어 주고 30℃에서 20 hr 배양한 후 보라색 환을 통하여 QS 억제 활성을 확인하였다. Control로는 식물추출물 대신 1/10 희석 메탄올을 넣어 주었다.

그 결과, HHL을 사용했을 때에는 K4 (단풍나무, Acer palmatum Thunb.), K9 (당단풍나무, Acer pseudosieboldianum (Pax) Kom.), K13 (박태기나무. Cercis chinensis)에서 QS 억제 활성이 나타났고 특히 K9에서 강한 억제 반응이 나타났다(도 3A, 표 2). 또 OHHL을 사용했을 는 K4과 K9에서 QS 억제 활성이 나타났으며 특히 K9에서 강한 활성이 나타났다(도 3B, 표 2). 그러나 K13에서는 활성이 나타나지 않았다. QS 억제 활성 반응은 단풍나무 2 종과 박태기나무 잎 추출물에서 나타났으며, 이하의 실험에서 상기의 3 가지 식물추출물에 대하여 보다 구체적으로 QS 억제 활성에 대하여 조사하였다.

QS 억제 반응은 샘플을 넣은 주변에 한정하여 나타났고 식물추출물이 확산하는 범위 외에는 보라색 반응이 나타났다. 이러한 현상으로 보았을 때 식물추출물들은 AHL을 분해하지는 않고 QS 신호전달을 방해하는 것으로 사료된다.

상기의 결과가 3가지 식물추출물이 C. violaceum CV026의 성장을 억제하여 일어날 수 있기 때문에 항균 활성을 측정하였다. 3 가지 식물추출물은 비롯한 나머지 식물추출물들도 C. violaceum CV026에 대하여 항균 활성은 나타내지 않았다(표 2).

실험예 2. 항균활성 분석

단풍나무, 당단풍나무 및 박태기나무의 잎 추출물이 Pseudomonas aeruginosa PAO1, Escherichia coli O157:H7, Burkholderia sp.의 quorum sensing의 표현형에 다양하게 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 이들 인수공통병원균에 항균활성이 있는지 여부를 조사하였다.

하루전날 미리 병원성 세균을 액체 배양 한 후 새로운 LB broth에 5 ㎖에 100 ㎕(2%)를 접종하였다. LB broth에서 자란 병원성균을 96 well plate에 180 ㎕씩 분주하여 각 식물추출물을 20 ㎕씩 첨가하였고 control로 1/10 메탄올을 사용하였다. 96 well plate를 micro plate multi reader (synergy2, BioTek, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하면서 매시간 마다 595 nm의 흡광도를 총 30 hr 측정하였다.

그 결과, 녹농균인 Pseudomonas aeruginosa PAO1과 Escherichia coli O157:H7은 3 가지 식물추출물에서 모두 항균 활성이 보이지 않았다(도 4A와 4B). Burkholderia sp.의 경우는 K4가 가장 많이 균체의 성장을 억제하였으며 K9은 균체의 성장을 억제하고 있다가 18 hr 이후, K13은 30 hr 이후에 각각 control과 같은 성장을 보였다.

실험예 3. 생물막 ( biofilm ) 형성 억제 분석(Spectrophotometer를 이용한 측정)

식물추출물을 첨가 배양하였을 때 3 가지 병원성균 Pseudomonas aeruginosa PAO1, Escherichia coli O157:H7, Burkholderia sp.의 생물막(Bifilm)의 형성에 미치는 영향을 알아보았다.

LB broth에서 O/N 하여 자란 병원성 미생물들을 새로운 LB에 5 ㎖에 100 ㎕(2%) 접종하여 O.D 값이 0.1이 되게 맞추어 주었다. 96 well plate의 각각의 구멍에 병원균을 180 ㎕씩 분주하였다. 식물추출물을 20 ㎕씩(Control, 1/10 메탄올) 넣어주고 37℃에서 20 hr 배양하였다.

배양 후 96 well plate에 내용물을 버린 후 증류수를 200 ㎕, crystal violet을 25 ㎕씩 각각 넣고 15 min 염색시켰다. 구멍속의 용액을 모두 버리고 다시 증류수 200 ㎕를 이용하여 세척하고 99% 에탄올 200 ㎕을 넣고 micro plate multi reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(synergy2, Biotek, USA). 실험은 3 반복으로 진행하였다.

그 결과 P. aeruginosa PAO1은 K4와 K9이 약 50%, K13이 약 40% 정도 biofilm 형성을 억제 하였다. E. coli O157:H7의 biofilm 형성은 3 가지 추출물이 약 70% 억제효과를 나타내었다. Burkholderia sp. 균주에 대해서는 K13이 약 10% 억제율을 보였으며 K4와 K9의 경우에는 식물추출물의 균체 성장 억제를 고려했을 때 biofilm 형성의 억제 효과는 거의 없는 것으로 판단되었다(도 5A와 5B). Control로는 1/10로 희석한 메탄올을 사용하였다. 결과적으로 식물추출물은 병원균의 종류에 따라 biofilm 형성 억제에 미치는 영향이 서로 다르다는 것을 보여 주었다.

실험예 4. 세균의 운동성(swarming motility) 측정

식물추출물이 2 가지 병원성균 Pseudomonas aeruginosa PAO1과 Escherichia coli O157:H7의 swarming의 운동성(Motility)에 미치는 영향을 조사하였다. 식물추출물이 첨가된 배지에서 병원균의 운동성에 있어서 차이를 확인하였다. 세균의 swarming은 편모에 의한 운동성으로 병원성 세균의 감염과 관련이 있다.

0.5%의 agar와 0.8% glucose를 첨가한 nutrient swarming 배지(P. aeruginosa PAO1)와 LB swarming 배지(E. coli O157:H7)에 식물추출물과 control로 사용되는 1/10 희석 메탄올을 500 ㎕/ LB 100 ㎖의 비율로 넣어주었다. 병원성 세균이 접종된 LB broth를 swarming plate에 3 ㎕를 올려놓고 37℃에서 20 hr 배양하고 관찰하였다. 실험은 3 반복으로 진행하였다.

그 결과 P. aeruginosa PAO1의 swarming 운동성의 변화에서는 도 6에서와 같이 K4, K9 및 K13에서 모두 약 50%의 감소 효과를 확인 할 수 있었다. E. coli O157:H7의 swarming 운동성의 변화는 도 7에서와 같이 K4에서 감소효과를 확인할 수 있었다(도 7).

실험예 5. 식물추출물이 Pseudomonas aeruginosa PAO1 균주가 생산하는 pyocyanin 생산에 미치는 영향 측정

Pyocyanin (PCN)은 Pseudomonas aeruginosa가 생산하는 청색의 염기성 색소물질이며 QS system에 의해서 생성 되는 것으로 알려져 있다. 생성된 Pyocyanin은 세균의 감염에도 영향을 미친다. 본 실험에서는 식물추출물을 첨가하였을 때 wild type의 P. aeruginosa PAO1에서 pyocyanin의 생성을 비교하였다(Krishnan et al., 2012). 각각의 식물추출물을 첨가해 주었을 때 정도의 차이는 있지만 pyocyanin의 생성이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다(도 8). 특히, K4와 K9의 경우 pyocyanin의 생성이 크게 줄어 QS system에 영향을 미치는 것으로 판단 되었다. 이들 식물추출물이 병원성 세균의 감염 억제에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되었다. 한편 실험정을 구체적으로 살펴보면 아래와 같다.

5 ㎖의 LB broth에서 37℃에서 하루 전부터 자란 wild type의 Pseudomonas aeruginosa PAO1을 새로운 LB broth에 O.D 값이 0.1이 되도록 접종 하였다. 각각의 시험관에는 식물추출물(Control로는 1/10 희석 메탄올) 250 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 O/N 진탕 배양 하였다. 배양액을 15 ㎖ tube에 옮기고 12,000 rpm에서 10 min 원심분리 한 후 상등액을 따로 분리하여 3 ㎖의 chloroform을 넣고 섞어 주었다. 분리된 chloroform 층과 배양액의 층에서 상등액을 버리고 chloroform 층을 분리한 후 0.2 M의 HCl을 1 ㎖ 넣고 다시 섞어 주었다. 28℃에서 8,000 rpm으로 10 min 원심분리 한 후 HCl 층의 흡광도를 520 nm에서 측정하였다(synergy2, Biotek, USA).

실험예 6. 생물발광 균주를 이용한 식물추출물의 정족수 감지(quorum sensing) 억제 활성 측정

Bioluminescence는 QS에 의해 조절되는 생물발광 현상으로 본 실험에서는 Pseudomonas aeruginosa PAO1에 인위적으로 lecA::luxCDABE genomic chromosomal reporter가 삽입되어진 균주를 이용하였다. 이 P. aeruginosa PAO1 변이주는 자신이 만들어 내는 AHL을 이용하여 스스로 생물발광 되도록 디자인 되어 있다.

실험에 사용한 균주는 University of Malaya의 Professor Kok-Gan Chan으로부터 분양받았으며 생물발광 균주에 대한 정보는 다음 표 3과 같다.

균주는 LB broth에서 37℃에서 16 hr 배양하였다. 이 균주 배양액을 새로운 LB broth에 2% 접종하고 96 well plate에 180 ㎕씩 나누어 분주한 후 식물추출물을 20 ㎕씩 넣어주었다. 생물발광은 relative light units (RLU)/ optical density (O.D) 495 nm로 측정하였고 micro plate multi reader (synergy2, Biotek, USA)를 이용하여 매시간 마다 측정하였다. 실험은 3 반복으로 진행하였다.

그 결과 생물발광은 7 hr에 가장 높은 peak를 기록 하였고 무 첨가군에서 가장 높게 나타났다(도 9). K13이 가장 낮은 생물발광 억제 활성을 보였고 K9이 가장 강한 억제 현상을 보였다. 본 실험을 통하여 3 종류의 식물추출물은 P. aeruginosa에서 강도의 차이는 있지만 생물발광 억제 활성 즉 QS network에 영향을 미치는 것으로 판단되었다.

실험예 7. Thin-layer chromatography (TLC)를 이용한 AI 분비 억제 활성 측정

본 실험은 식물추출물이 Pseudomonas aeruginosa PAO1의 autoinducer (AI)의 분비를 억제 하는지 보기 위하여, 병원성 세균을 LB broth에 성장시킬 때 식물추출물을 첨가하여 배양하였다. 그 후 배양 상등액에서 AI (AHL)를 분리하여 Chromobacterium violecteum CV026을 reporter로 Thin-layer chromatography (TLC) 상에서 분석을 하였다.

각각의 TLC 샘플들은 미생물의 상등액에서 농축한 AI를 이용하였다. 농축된 상등액은 TLC plate의 하단 부분으로부터 약 2 cm 위, 각 샘플들 간에는 약 2.5 cm 간격으로 각각 2 ㎕씩 3번에 나누어 총 6 ㎕를 loading 하였다. 분석에서 control로 HHL 100 μM (N-Heptanoyl-L-homoserine lactone, sigma)을 2 ㎕씩 3 번에 나누어 총 6 ㎕ loading하였다.

전개액은 메탄올과 H₂O를 60 : 40의 비율로 혼합한 용액 100 ㎖을 전개수조에 넣어 사용하였다. 수평계를 이용하여 평평한 위치에서 약 3∼4 hr 정도 전개한 후 충분히 건조시켰다.

Chromobacterium violaceum CV026 균주를 reporter strain으로 사용 하였고 LB top agar (0.8% agar)에 10% 넣고, 마른 TLC plate위에 얇게 펴 말린 후 30℃에서 20 hr 배양하였다. 배양 후 상온에서 TLC plate를 건조하였다.

그 결과 도 10 (1)과 같이 P. aeruginosa PAO1에 식물추출물을 첨가하여 배양하였을 때 AHL의 생성 정도가 다르게 나타났다. 식물추출물 대신 1/10로 희석한 메탄올을 넣었을 때에는 보라색 환이 정상적으로 나타났다. K4 첨가에서는 보라색의 환이 약간 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 그러나 K9와 K13 식물추출물을 첨가 배양 후 얻은 AI 분석에서는 보라색 환이 크게 감소한 것을 확인하였다.

위 실험의 내용을 TLC를 이용하여 확인 하였다. TLC상에서 식물추출물은 AHL의 합성을 억제 하였다(도 10 (2)).

실험예 8. Caenorhabditis elegans 감염억제 활성 측정

Caenorhabditis elegans는 토양에 서식하는 선충류로 짧은 life cycle을 가진 것이 특징으로 생명 현상을 밝히는 모델로 이용되어지고 있다. 본 실험에서는 C. elegans를 이용하여 식물추출물의 감염 활성 억제효과를 확인하고자 하였다.

도 11과 같이 Caenorhabditis elegans의 L4 유충기(Larval stage)를 많이 얻기 위하여 동기화(Synchronization)을 실시하였다. C. elegans plate를 4 ㎖의 3 차 멸균 증류수로 washing 하였다. 12% NaClO (Sodium hypochlorite) 100 ㎕와 10% NaOH 용액(Sodium hydroxide) 1 ㎖을 첨가하였다. 알을 제외한 모든 성충을 죽이기 위해 25℃에서 100 rpm으로 10 min shaking 하였다. 45 ㎖의 3차 멸균 증류수를 넣고 4℃에서 3,000 rpm으로 15 min 원심분리를 한 후 상등액을 제거하였다. K medium (Table 3)을 최종 부피 50 ㎖이 되도록 첨가하고 25℃에서 100 rpm으로 O/N 배양하였다. 4℃에서 3000 rpm으로 15 min 원심분리 후 상등액을 제거하고 미리 E. coli OP50을 깔아 놓은 NGM plate (Table 4)에 넣고 16℃에서 L4 stage가 될 때까지 배양하였다.

한편, 병원성 세균이 C. elegans에 감염될 때 식물추출물이 감염성을 억제 할수 있는지에 대하여 알아보기 위하여 C. elegans killing assay를 진행하였다. 식물추출물을 첨가한 NGM plate (500 ㎕/ NGM 배지 100 ㎖)에 미리 배양한 상기의 3 가지 병원성 세균을 100 ㎕를 plate의 중앙에 spreading 한 후 건조하였다. 이 NGM plate에 상기에서 준비한 C. elegans 배양액 100 ㎕ (약 10∼20 마리)을 넣고 16℃에서 배양하면서 관찰하였다.

16℃에서 배양 된 C. elegans를 매일 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다. C. elegans의 숫자 파악은 4 일과 7 일에 진행 하였고 상대적인 비율로 나타냈다.

그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이 4일에는 식물추출물 포함 배지와 무 첨가 배지에서 모두 거의 비슷한 생존율을 나타냈다. 하지만 7일에는 3 가지 병원균에서 식물추출물 무 첨가 배지에서 C. elegans가 사멸하였다. 각각의 식물추출물의 첨가 효과는 병원균마다 다른 생존율을 나타내면서 C. elegans의 감염을 억제시켰다. Pseudomonas aeruginosa PAO1는 7 일에서 약 10∼20%의 생존율을 나타냈다(도 12A). 그리고 Escherichia coli O157:H7과 Burkholderia sp.는 10∼50%의 생존율을 나타냈다(도 12B와 C). Burkholderia sp.에서 K4 식물추출물이 약 50%로 가장 높은 생존율을 보였다. 도 12에는 표시하지 않았으나 배양 1 일째에 식물추출물이 포함된 배지에서 자란 C. elegans는 이를 첨가하지 않는 배지의 것에 비해 보다 건강하게 자라는 것을 현미경으로 관찰 할 수 있었다.

이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니다.

Claims

삭제
삭제
병원성 미생물에 대하여 정족수 감지(quorum sensing) 억제 활성을 갖는 박태기나무 추출물, 단풍나무 추출물 및 당단풍나무 추출물을 포함하는 조성물을 병원성 미생물과 접촉시켜 생물막 형성을 억제하는 단계를 포함하는 생물막 형성 억제 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 병원성 미생물은 그람 음성균인 것을 특징으로 하는 생물막 형성 억제 방법.
삭제
삭제
병원성 미생물에 대하여 정족수 감지(quorum sensing) 억제 활성을 갖는 박태기나무 추출물, 단풍나무 추출물 및 당단풍나무 추출물을 포함하는 사료첨가제.
제 7 항에 있어서,
상기 병원성 미생물은 그람 음성균인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.