KR101977940B1 - 초고순도의 갈락토-올리고사카라이드의 생산을 위한 방법 - Google Patents

초고순도의 갈락토-올리고사카라이드의 생산을 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사카로미세스 세레비시아 및 스트렙토코커스 터모필러스를 포함하는 순차적인 미생물 정제를 사용함으로써 낮은 순도인 갈락토-올리고사카라이드 (GOS)로부터 출발하는, 초고순도 GOS(≥ 95%)를 제조하기 위한 방법을 기재한다.

Description

초고순도의 갈락토-올리고사카라이드의 생산을 위한 방법{Process for the production of ultrapure galacto-oligosaccharides}
본 발명은 낮은 갈락토-올리고사카라이드(galacto-oligosaccharides: GOS) 함량을 갖는 락토오스-유래 시럽으로부터 출발하는, 고순도(≥ 95%)의 GOS를 제조하는 분야에 관한 것이다.
갈락토-올리고사카라이드(GOS)는 적어도 디-, 트리-, 테트라-, 펜타- 및 헥사-사카라이드의 혼합물로 이루어지고, GOS 내의 글루코오스는 유리된 환원-말단 당이고 사슬의 다른 당들은 락토오스로부터 출발하는 당전이 반응(transglycosylation reaction)에 사용된 효소에 따라 다양한 방식으로 갈락토오스 상호간 및 글루코오스에 연결된 갈락토오스들이다.
현재, 최근 연구가 프리바이오틱스(prebiotics)로서 이러한 올리고사카라이드들의 효용성을 입증하고 있기 때문에 GOS에 대한 관심이 지속적으로 커지고 있다: 이런 의미에서 이것들은 위장내 균총(microflora)의 발달을 촉진하는 비-치아우식적(non-cariogenic) 비-소화성 저칼로리 올리고사카라이드의 혼합물이다.
GOS의 추가적인 잇점은 그것의 항-접착 활성이다: 이 올리고사카라이드들은 위장 상피 세포들을 일반적으로 공격하는 병원균의 결합 부위의 유사체로서 작용하여, 대장균과 같은 장내 병원균에 의해 야기되는 감염을 직접 저해할 수 있다.
상업적으로 이용가능한 GOS는 다양한 자연의 미생물들(예를 들어, 아스퍼길러스 오리자(Aspergillus oryzae ), 페니실리움 엑스판섬(Penicillium expansum) 및 바실러스 시르큘란스(Bacillus circulans)) 또는 변형된 미생물들로부터 분리된 베타-갈락토시다제(락타제)의 당전이 활성을 이용함으로써 락토오스로부터 합성된다. 상기 GOS 구조는 상기 효소의 기원에 따라 다양하다. 자연의 효소로부터 생산된 GOS의 수율은 일반적으로 20-45%이고 재조합 또는 변형된 효소를 사용함으로써 증가될 수 있다. 가장 폭넓게 상업적으로 이용가능한 GOS 형태는 중량당 약 50-60%의 농도인 GOS를 포함하고 또한 상당한 양의 (상기 GOS 형성 반응의 부산물인) 글루코오스와 (시작 물질인) 반응하지 않은 락토오스를 포함한다. 이것은 당뇨 또는 유당 불내증에 걸린 사람들에게는 그것들을 사용할 수 없게 만든다.
고순도의 GOS, 즉 소화가능한 당(락토오스, 글루코오스, 갈락토오스)들이 없는 것을 얻기 위한 방법들이 문헌에 알려져 있다. 이러한 방법들은 크로마토그래피, 효소적 산화 또는 미생물 발효에 의한 GOS 내 글루코오스 및 락토오스를 제거하는 것을 포함한다. 그러나 전술한 방법들은 (크로마토그래피의 경우) 대규모 적용가능성이 없거나 문제점들이 존재한다.
Shoaf, K. 등 Infect. Immun . 74 (12) 6920-6928, 2006에서, 모노- 및 디사카라이드가 없는 GOS를 포함하는 혼합물은 제조용 TLC(preparative TLC)에 의하여 (이런 이유로 몇 밀리그람의 양으로) 실험실에서 제조되었다.
Splechtna, B. 등 Enzyme and Microbial Technology 29 (6) 434-440, 2001은 곰팡이의 셀로비오스 데히드로게나제에 의한 선택적 산화에 의해 락토비온산으로 잔류 락토오스를 제거하는 것을 기재한다. 이 효소는 쉽게 이용가능하지 않고 락토오스 산화와 촉매적 농도로 존재하는, 2,6-디클로로-인도페놀의 환원을 커플링시킴으로써 작동한다. 상기 산화된 산화환원 매개체는 분자 산소의 물로의 균류 라카제(laccase)-촉매된 환원에 의하여 지속적으로 재생된다. 이온 교환 크로마토그래피가 락토비온산을 제거하는데 사용되었다.
Cheng, C.-C. 등 Biotechnol . Lett . 28 793-797, 2006은 클루이베로미세스 마르시아너스(Kluyveromyces marxianus)에 의한 발효에 의해 잔류 락토오스를 제거하는 것을 기재한다　: 상기 방법은 수율이 좋고 글루코오스, 갈락토오스, 락토오스가 없는 고순도의 생성물을 유도하지만, 락토오스뿐만 아니라, K. 마르시아너스로 처리하기 전에 GOS 혼합물에 존재하는 다른 모든 디사카라이드들 또한 상기 미생물에 의해 소비된다.
Li, Z. 등 Process Biochemistry 2008, 43(8), 896-899는 알긴산 칼슘에 고정된 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 크루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에 의한 발효에 의한 소화가능한 당을 제거하는 것을 기재한다. K. 락티스를 사용한 경우에는 그 결과가 좋으나, S. 세레비시아를 사용한 경우에는 만족스럽지 않다.
클루이베로미세스 마르시아너스 또는 락티스를 사용하는 것의 문제점은 둘다 대중에게 공개적으로 이용 가능함에도 불구하고, 그것들은 식품 산업에 일반적으로 사용되지 않고 그러므로 즉시 사용가능한 형태로 저비용으로 상업적으로 이용 가능하지 않다는 것이다.
고순도의 GOS를 생산하기 위해, 또한 산업적 규모로 적용가능하고 모든 소화가능한 당(락토오스, 글루코오스, 갈락토오스)들이 없거나 소량으로 존재하고, 쉽고 폭넓게 이용가능한 미생물들을 이용하는 대체적인 방법에 대한 분명한 필요가 존재한다.
정의 및 약어
GOS = 갈락토-올리고사카라이드(Galacto-oligosaccharides)
발명의 요약
본 발명은 낮은 순도의 GOS 혼합물로부터 출발하는, 소화가능한 당인 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스의 전체 백분율이 ≤ 5%인 순도 ≥ 95%의 GOS를 제조하기 위한 방법으로써 전술한 문제를 극복하고, 상기 방법은 스트렙토코커스 터모필러스에 의한 하나의 발효 단계 및 사카로미세스 세레비시아에 의한 하나 이상의 발효 단계를 포함하는 방법이고, 상기 순도는 GOS 및 상기 소화가능한 당을 구별하고 정량할 수 있는 임의의 분석적인 방법에 의하여 계산되는 것이다.
상기 방법은 상기 소화가능한 당을 미생물학적 정제에 의하여 선택적으로 제거될 수 있게 한다.
유리하게도 상기 방법은 GOS 혼합물을 소화가능한 당인 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스를 낮은 함량으로 수득할 수 있게 하고, 당전이에서 형성된 모든 당이 미생물에 의해 제거되는 것은 아니다.
유리하게도 S. 터모필러스에 의한 발효 단계는 락토오스의 체류 시간(retention time)에 아주 가까운 HPLC 체류 시간을 갖는 다른 디사카라이드를 보존하면서 락토오스를 선택적으로 제거될 수 있게 하는 것이 확인된다. 락토오스의 피크 바로 다음의 피크로 HPLC에 의해 구별가능한, 상기 올리고사카라이드의 이러한 구분된 보존(distinctive preservation)은 생성물이 당업계에 알려진 다른 것들과 다르게 한다.
전술한 방법은 식품 산업에 폭넓게 사용되는 저비용의 상업적으로 이용가능한 미생물들을 사용한다; 그것들은 예비발효 혼합물(pre-fermentation mixture)을 제조함으로써 그것들을 활성화시켜야 하는 것 없이 동결건조된 형태(그것들이 구매되는 형태)로 직접 사용될 수 있다.
상기 전술한 방법은 산업적 규모, 즉 복수의-kg 규모로 쉽게 적용될 수 있다.
도 1-실시예 1의, B. 시르큘란스(B. circulans) 락타제에 의하여 촉매된 당전이에 의하여 락토오스로부터 수득된 순도 40%인 GOS 출발 시료의 HPLC 추적(trace)을 나타낸다;
도 2-본 발명에 따른 사카로미세스 세레비시아로 글루코오스를 제거(deglucosation)한 후, 실시예 1의, GOS 시료의 HPLC 추적을 나타낸다;
도 3-본 발명에 따른 스트렙토코커스 터모필러스로 락토오스를 제거(delactosation)한 후, 실시예 1의, GOS 시료의 HPLC 추적을 나타낸다;
도 4-본 발명에 따른 사카로미세스 세레비시아로 도3에 상응하는 시료의 갈락토오스를 제거(degalactosation)한 후, 실시예 1의, GOS 시료의 HPLC 추적(trace)을 나타낸다; A: 20시간 이상의 발효 후; B: 40시간 이상의 발효 후;
도 5-본 발명의 방법에 따른, 실시예 1의, 완료시에 수득된 순도 ≥ 95%을 갖는 GOS 시료의 HPLC 추적을 나타낸다;
도 6-미국, 콜로라도, 골든, GTC Nutrition로부터 구입한, 실시예 2의, GOS 출발 시료 즉, 푸리문(Purimune)™ (GO-P90)의 HPLC 추적을 나타낸다;
도 7-본 발명의 방법에 따른, 실시예 2의, 완료시에 수득된 순도 ≥ 95%를 갖는 GOS 시료의 HPLC 추적을 나타낸다;
도 8-클루베로미세스 마르시아너스(Kluveromyces marxianus)로 발효시킨 후 수득된, 실시예 4의 GOS 시료의 HPLC 추적을 나타낸다.
본 발명의 방법에서, < 95%의 순도를 갖는 임의의 GOS 혼합물을 출발 물질로서 사용할 수 있고, 가장 편리하게는 불순물이 소화가능한 당인 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스로 근본적으로 이루어지는 순도 ≥ 40%를 갖는 GOS 혼합물이 사용된다.
본 발명의 목적을 위해, 상기 GOS 혼합물의 순도를 평가하기 위해 바람직하게는 GOS, 락토오스, 갈락토오스 및 글루코오스를 구별하고 정량화할 수 있는 임의의 HPLC 방법이 사용된다.
상기 용어 "순도(purity)"는 상기 GOS 및 소화가능한 당의 피크에 상응하는 HPLC에 의한 면적 백분율를 의미한다.
40-60% 순도 (또는 그 이상)인 GOS 혼합물은 상업적으로 이용가능하거나 (예를 들어, 올리고메이트 55, 비비날 GOS, 푸리문, 컵 올리고 P) 또는 바실러스 시르큘란스로부터 분리된 락타제와 같이, 상기 목적을 위해 알려진 적당한 락타제에 의해 촉매된 당전이에 의해 락토오스로부터 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법은 40-60% GOS 혼합물로부터 시작하는 경우에 편리하다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 S. 터모필러스에 의한 발효 단계 후 S. 세레비시아에 의한 발효 단계가 수행되는 것이다. S. 터모필러스가 락토오스를 가수분해하고 그 다음 생산된 글루코오스를 소비하고, 그 다음 S. 세레비시아에 의해 제거되는 갈락토오스를 축적한다. S. 터모필러스에 의한 발효 단계에 의해 상기 락토오스 함량은 요구되는 수준, 바람직하게는 HPLC 면적 백분율로 < 5%, 좀더 바람직하게는 < 3%로 감소될 수 있다. 출발 GOS 혼합물이 HPLC 면적 백분율로 글루코오스 함량 < 5%인 경우에, 그 후 상기 방법은 S. 세레비시아에 의한 발효가 뒤따르는 S. 터모필러스에 의한 발효 단계를 포함한다. S. 터모필러스가 락토오스를 가수분해한 후 처음에 존재하고 갈락토오스의 축적 과정 동안에 생산된 소량의 글루코오스를 소비하고, 갈락토오스는 그 다음 S. 세레비시아에 의해 그 후에 제거된다.
따라서, 예를 들어 (실시예 2 참조), 글루코오스가 HPLC 면적 백분율로 2%의 양으로 존재하는 약 80%의 순도인 상업적으로 이용가능한 GOS 혼합물로부터 출발함으로써, 상기 락토오스 함량은 요구되는 수준 즉 상기 GOS의 면적 백분율의 합에 대해 면적 백분율이 < 5%인 수준으로 S. 터모필러스에 의한 직접적인 발효에 의해 감소될 수 있다.
GOS 출발 혼합물이 HPLC 면적 백분율로 글루코오스 함량 ≥ 5%를 갖는 경우에, S. 터모필러스에 의한 발효 단계는 S. 세레비시아에 의한 발효 단계 후에 수행된다; 이 경우에서 상기 방법은 그러므로 하기 3 단계를 포함한다:
(a) 사카로미세스 세레비시아에 의한 발효;
(b) 스트렙토코커스 터모필러스에 의한 발효;
(c) 사카로미세스 세레비시아에 의한 발효.
따라서, 예를 들어(실시예 1 참조), B. 시르큘란스에 의한 당전이에 의해 수득된 약 40%의 순도를 갖는 GOS 혼합물로부터 출발할 때(도 1 참조), S. 세레비시아에 의한 발효 (a)는 출발 GOS 혼합물에 존재하는 글루코오스를 거의 완전히 제거되게 할 수 있다(도 2 참조).
발효 (b)는 락토오스를 3% 미만의 HPLC 면적 백분율로 낮춰지게 한다(도 3 참조).
글루코오스가 약 20%의 순도로 존재하는 40-60% 순도의 GOS 혼합물로 출발하는 때에는, 만일 S. 터모필러스에 의한 발효 (b) 전에 발효 (a)와 같은 글루코오스 분해 단계가 있다면 그 다음 락토오스는 3 면적 % 아래로 낮아질 수 있지만, 반면에 S. 세레비시아에 의한 글루코오스 분해 단계의 첫 수행없이 이루어진다면 S. 터모필러스에 의한 직접 발효는 40 시간 이상 지속될 때조차, 락토오스를 요구되는 수준으로 낮출 수 없다.
S. 세레비시아에 의한 발효 (c)는 S. 터모필러스에 의한 발효 후에 형성된 남은 갈락토오스를 거의 완전히 제거할 수 있게 한다(도 4 참조).
상기 방법의 마지막에서, 상기 얻어진 GOS 혼합물은 글루코오스 및 갈락토오스가 없지 않다면 락토오스와 함께, 그럼에도 불구하고 ≤ 5%의 양으로, 무시할 수 있는 양으로 존재하는 것인 순도 ≥ 95%를 갖는다(도 5 참조).
바람직하게는 S. 세레비시아에 의한 발효는 출발 GOS의 건조 중량 ㎏ 당 40-15 g의 탈수된 S. 세레비시아를 사용하여, 12시간 이상 동안 35±5℃의 온도, pH 6.5±0.5에서 수행된다. 상기 단계 (c)는 심지어 40시간 초과하는 시간 동안 수행될 수 있고 그 경우에, S. 터모필러스에 의한 발효 (b) 후에 형성된, 젖산의 상당한 제거가 실질적으로 달성된다(도 4B 참조).
바람직하게는 S. 터모필러스에 의한 발효는 15시간 이상 동안, 염기를 가하여 pH 6.0-6.5를 유지하고 출발 GOS의 건조 중량 ㎏ 당 1-0.4 g의 탈수된 S. 터모필러스를 사용하여, 40±5℃ 온도에서 시행된다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 발효 단계 후에 상기 혼합물은 바람직하게는 세라믹 초여과, 나노여과, 탄소로 탈색 및 이온-교환 수지 탈이온화에 의하여 더 처리될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 발효 단계 (b) 및 (c)의 전은 바람직하게는 75±5℃에서 5분 이상 시행되는, 저온살균 단계이다.
효과에서, 전술한 공정의 마지막에 수득된 상기 생성물은 구분된 GOS 프로파일을 제공한다; S. 터모필러스에 의한 발효 단계 동안, 락토오스가 주로 제거되고, 이것은 HPLC 결과로부터 분명하고(도 2를 도 3과 비교하고, 도 6을 도 7과 비교함) 또한 디사카라이드 영역에서 상기 락토오스 체류 시간(약 12.9 분) 바로 다음의 약 13.6 분의 체류 시간을 갖는 성분(실시예에서 GOS6으로 표시됨)이 남는다는 것을 알 수 있다. 상기 락토오스 제거에 수반되는, 약 12.4분의 체류시간을 갖는 성분(실시예에서 GOS5로 표시됨)이 사라지는 것은 상기 락토오스 체류 시간에 바로 선행하는 것을 알 수 있다. 이러한 상기 GOS 프로파일의 유지는 독특하고 상기 GOS 혼합물에 존재하는 모든 디사카라이드들을 무차별적으로 제거하는, 크로마토그래피의 분리에 의하여, 또는 클루이베로미세스 속 미생물들에 의한 정제 후 수득된 것들처럼(실시예 4 참조 및 도 8과 도 1를 비교함) 당업계에 알려진 다른 GOS 혼합물들과 구별될 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 상기 방법으로 수득된 GOS 혼합물, 즉 락토오스가 아닌 갈락토-디사카라이드가 양 ≥ 1%로 존재하고 소화가능한 당인 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스의 전체 백분율이 ≤ 5%인 순도 ≥ 95%를 갖는 GOS 혼합물에 관한 것이다.
상기 방법에 의하여 수득된, 상기 전술된 생성물은 약학적 조성물, 유아용 유동식 및 식품 조성물의 제조를 포함하는 알려진 목적들을 위해 이용될 수 있고, 이는 본 발명의 추가적인 측면이다.
본 발명은 하기 실행 실시예를 고려하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
실험적 부분
HPLC 방법
이것은 외부 표준과의 비교를 사용하는 HPLC 방법이다. HPLC 기구는 유사 프리컬럼(analogous precolumn)으로 설비된 제품 코드 ICE-99-9850 등용매(isocratic) 펌프, 자동 시료 주입기(autosampler), 컬럼 온도 조절을 위한 펠티에르 오븐, 굴절률 검출기(refraction index detector) 및 트랜스게놈의 컬럼 ICE-SEP ICE-ION 300을 가진 것으로 사용하였다. 상기 분석들은 하기 실행 조건하에서 실행하였다:
컬럼 온도: 40℃
유입: 20 ㎕
이동상: H2SO4 0.015N
유속: 0.4 ㎖/분
분석 시간 36 분
인테그레이터: 퍼킨 엘머 토탈크롬 워크스테이션
상기 표시된 조건하에서 각 생성물의 체류 시간은 락토오스의 경우 약 12.5분, 글루코오스의 경우 약 15.0분, 갈락토오스의 경우 약 16.2분, 젖산의 경우 약 21.3분 및 (외부 표준에 대한) 글리세린의 경우 22.2분이었다.
시료 용액에서, GOS 생성물의 6개의 피크들이 하기와 같이 구별되고 확인되었다:
GOS 1: 약 9.3 분에서 피크
GOS 2: 약 9.7 분에서 피크
GOS 3: 약 10.3 분에서 피크
GOS 4: 약 11.3 분에서 피크
GOS 5: 약 12.4 분에서 피크
GOS 6: 약 13.6 분에서 피크.
HPLC 도표 작성에서, 상기 용어 GOS1 내지 6은 여기서 존재하는 사카라이드 단위의 수와 무관하게, 단순히 GOS에 기인하는 피크들을 의미한다.
상기 인테그레이션 시스템은 하기 식에 의하여 함량을 자동적으로 계산하였다:
% = As x CSTD x V x 100 / ASTD x Ws
상기 식에서:
AC = 시료 용액에서 피크의 면적
CSTD = 표준 용액에서 당(sugar) 농도 백분율
Ws = 그램으로 시료 중량
ASTD= 표준 용액에서 당(sugar) 피크의 면적
모니터링 과정 동안, 상기 GOS 피크들의 함량은 그 자체의 표준에 대해 계산되지 않고 락토오스의 응답 계수(response factor)를 사용하거나 면적/총 면적으로 표시되는 그의 순도를 산출함으로써 계산되었다.
방금 기재된 분석 방법을 사용하여, 락토오스의 결정은 다른 갈락토-올리고사카라이드와 가능한 중복에 의하여 무효화되었다.
상기 전술된 분석 방법을 사용한 상업적 시료에서 락토오스의 결정과 증서(certificates)에 제공된 값들 간에 발견된 강력한 불일치에 유의하는 것이 중요하다.
예를 들어, Friesland Foods Domo 사에 의해 공급된 시료 비비날 GOS60 배치 번호 6297770는 17.5 %의 건조물 기준으로 인증된 락토오스 함량을 갖는 반면에 우리 분석 실험에서 수행된 HPLC에 의하면 락토오스 함량이 33.2%였다.
락토오스를 평가하는 것에서 비슷한 평가는 푸리문 시료 배치 번호 20081217에서 GOS의 인증된 전체 순도는 90.4%인 반면에, 우리 분석 실험실에서 실험된 HPLC에 의하면(첨부된) 상기 순도는 면적 백분율이 13.6%인 락토오스 순도를 갖는 83.0%인 것에서 확인되었다.
그러므로, 최종 생성물에 존재하는 락토오스의 농도의 초과하는 평가로 귀결되고, 락토오스의 결정은 우리 분석 방법에 의해 과평가되었다.
이 이후에 존재하는 실시예 및 도면의 부분에서, 기재에서 불명료함을 만들지 않기 위해, 전술된 HPLC 방법으로 얻어진 순도 값들이 상업적 제품에 대한 값으로, 제공된다.
실시예 1 - 락토오스로부터 출발하는 제조예
80㎏의 락토오스 모노히드레이트(0.22 kmol)를 120ℓ의 물에 현탁시키고 상기 락토오스가 완전히 녹을때까지 부드럽게 흔들면서 70℃로 가열하였다.
상기 용액은 온도를 50℃로 제어시키고 27㎖의 75% 인산으로 5.5 내지 5.0으로 pH를 조정시켰다.
바실러스 시르큘란스 유래의 락타아제(lactase) 266 g을 첨가하였다(1500 U/g).
상기 반응을 HPLC로 모니터링하고 22시간 후 GOS의 형성과 글루코오스 및 갈락토오스의 출현은 그 결과 락토오스 면적 백분율 순도가 40% 미만으로 낮아지는 것으로 검출되었다.
200㎏의 40% 조(crude) GOS 용액을 수득하고, 그것의 HPLC 추적(trace)을 도 1에 나타내고 표의 형태로 하기에 제시하였다:
Figure 112017085016181-pat00001
단계 1 - S. 세레비시아에 의한 글루코오스 제거
상기 전술된 시작 혼합물을 250㎖의 75% 인산으로 pH 3.0으로 산성화시켰다: 이러한 pH 조건 하에서 주위 온도로 보관이 가능하였다.
46㎏의 40% 조 GOS 용액(배치번호 01449IN9)을 140ℓ의 물로 희석시키고 37℃로 온도를 제어하였다. 600㎖의 24% 암모니아로 용액의 pH를 pH 2.8 내지 pH 7.0으로 조정한 후, 200g의 동결건조된 사카로미세스 세레비시아(brewer's yeast)를 첨가하였다. HPLC에 의해 모니터링된, 글루코오스 제거 단계는, 24시간 동안 격렬하게 흔든 후에 완료되었다.
상기 혼합물은 70℃에서 약 5분 동안 살균한 후 40℃로 온도를 제어하였다.
도 2는 저온 살균한 후 혼합물의 HPLC 추적을 나타내고, 표의 형태로 하기에 제시되었다.
Figure 112017085016181-pat00002
단계 2 - S. 터모필러스에 의한 락토오스 제거
2.5g/ℓ의 효모 추출물을 (단계 1로부터 기인한) 상기 혼합물에 첨가하고 400㎖의 15% 수산화 나트륨으로 pH를 pH 5.2 내지 6.6으로 조정하였다. 상기 혼합물을 5g의 스트렙토코커스 터모필러스로 접종하고; 발효를 pH-자동조절기(pH-stat)을 써서 15% 수산화 나트륨을 가함으로써 pH 6.4-6.5에서 진행시켰다. HPLC로 모니터링된, 상기 반응의 마지막은 상기 혼합물에서 상기 락토오스 함량이 3 면적 % 미만이 될 때인 26시간 후에 도달되었다.
상기 혼합물은 70℃에서 약 5분 동안 저온살균된 후 온도를 37℃로 제어하였다.
도 3은 저온살균 후 상기 혼합물의 HPLC 추적을 나타내고, 표의 형태로 하기에 제시되었다.
Figure 112017085016181-pat00003
단계 3 - S. 세레비시아에 의한 갈락토오스 제거
200g의 동결건조된 양조제조업자의 효모를 단계 2로부터 얻어진 혼합물에 첨가하였다: 20 시간 동안 격렬하게 흔든 후에, HPLC로 모니터링된 , 상기 갈락토오스 제거 단계는 완료되었다.
상기 반응을 pH 3.0에 도달할 때까지 5ℓ의 50% 황산을 가함으로써 정지시켰다.
도 4는 갈락토오스 제거 후 혼합물의 HPLC 추적(trace)을 도시하고, 표의 형태로 하기에 제공되었다.
Figure 112017085016181-pat00004
상기 혼합물을 초여과에 의해 세포를 제거함으로써 투명하게 하였다.
저분자량 발효 부산물(젖산, 글리세린 등)은 그 후 나노여과에 의해 제거되었다.
그 다음 상기 용액을 탄소로 탈색시키고, 연속하여 배치된, 이온-교환 수지, 즉 강력한 양이온성 ( 앰버리트 C-200 H + 형태, 3ℓ) 및 약한 음이온성 (IRA-96 유리 염기 형태, 3ℓ)의 쌍으로 탈염시켰다.
상기 미네랄을 제거시킨 용액을 그 다음 마이크로여과시키고 75°브릭스의 사카라이드 농도를 얻을 때까지 진공 하에서 농축시켰다.
9㎏의 GOS 혼합물이 순도 ≥ 95%로 수득되었다 ; 상기 방법의 마지막에서 얻어진 GOS 혼합물의 HPLC 결과는 도5에 보여지고 표의 형태로 하기에 제공된다.
Figure 112017085016181-pat00005
표로 작성된 데이터와 다양한 단계의 첨부된 크로마토그램으로부터, 단계 2(S. 터모필러스에 의한 발효) 동안 GOS5 피크는 사라진 반면, 상기 GOS6 피크는 조금 또는 덜 변하지 않고 남아있는 것을 볼 수 있다.
표 1은 실시예 1의 다양한 단계들의 결과의 요약을 제시한다:
Figure 112017085016181-pat00006
표에서: % 농도= 중량/중량%인 농도
% 순도 = HPLC 피크에 의해 둘러싸인 면적 백분율
상대 % = GOS의 순도/∑ GOS, 갈락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스의 순도
실시예 2 - 83%인 GOS(90% 상업용)으로부터 출발하는 제조예
200g의 푸리문 GOS (GO-P90) 배치 번호 20081217을 1800㎖의 물에 용해시켰다. 도 6은 크로마토그램을 나타내고 용액 HPLC는 표의 형태로 하기에 제시되었다.
Figure 112017085016181-pat00007
제시된 글루코오스는 < 5%의 면적 백분율를 갖고 따라서 상기 과정은 젖산 박테리아 배양에 의한 발효에 의하여 직접적으로 계속된다.
5g/ℓ의 효모 추출물을 첨가하고 pH를 3㎖의 15% 수산화 나트륨으로 pH 4.9 내지 pH 6.4로 조정하였다. 76㎎의 스트렙토코커스 터모필러스로 접종한 후, pH- 자동조절기(pH-stat)에 의하여 15% 수산화 나트륨을 가함으로써 발효를 pH 6.3-6.5에서 진행시켰다. HPLC에 의해 모니터링된, 반응의 마지막은 상기 혼합물의 락토오스 함량이 GOS의 면적 백분율의 합에 대해 면적 백분율로 5% 미만이 될 때인 15시간 후에 도달되었다.
Figure 112017085016181-pat00008
얻어진 결과들의 요약을 표 2에 제시한다.
Figure 112017085016181-pat00009
약어:
% 농도= 중량/중량%인 농도
% 순도 = HPLC 피크에 의해 둘러싸인 면적 백분율
상대 %= GOS의 순도/∑ GOS, 갈락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스의 순도
상기 실험은 이 단계에서 멈춰졌지만, 상기 혼합물은 그 다음에 갈락토오스 제거될 수 있고 실시예 1에 이미 기재된 방법으로 정제될 수 있다는 것은 명확하다.
스트렙토코커스 터모필러스에 의한, 따라서 이 경우에 불필요한 S. 세레비시아에 의한 글루코오스 제거를 피하는 직접 발효로, 이 락토오스에 대한 GOS의 요구되는 면적 비율로 귀결되었다. 더욱이, S. 세레비시아에 의한 그 다음의 발효가 갈락토오스를 제거할 수 있다는 것을 고려하면, 갈락토오스 단독에 상대적인 95.6%의 GOS 순도는 표 2에 보고된 면적 백분율 값에 기초하여 이론적으로 계산될 수 있다.
실시예 3 - 43%인 GOS(60% 상업용)으로부터 출발하는 제조예
427g의 비비날 Gos60 배치 번호 6297770을 1600㎖의 물에 용해시켰다: 용액의 HPLC 데이타는 표의 형태로 하기에 제시되었다:
Figure 112017085016181-pat00010
상기 과정은 먼저 S. 세레비시아에 의한 글루코오스 제거 단계 다음에 S. 터모필러스로 발효시키는, 실시예 1에 기재된 바와 동일하게 수행하였다; 이 단계의 마지막에서(실시예 1의 단계 2) HPLC를 수행하였고 실시예 1의 그것에 완전히 비교할 수 있는 것인, 그 결과를 하기 표로 기재하였다:
Figure 112017085016181-pat00011
S. 터모필러스에 의한 발효 동안 GOS5 피크는 사라지는 반면에, 상기 GOS6 피크는 조금 또는 덜 변하지 않고 남아있는 것을 이 실시예에서도 또한 볼 수 있다.
실시예 2에서 처럼, 이 실험은 이 단계에서 멈추고 상기 혼합물을 실시예 1에서 이미 기재한 방법으로 갈락토오스 제거하고 정제시켰다. 더욱이 S. 세레비시아에 의한 두번째 발효가 갈락토오스를 제거할 수 있었다는 점을 고려하면 락토오스 단독에 대한 95.2%의 GOS 순도는 이 실시예의 두번째 HPLC에 대한 표에 보고된 면적 백분율 값에 기초로 이론적으로 계산될 수 있다.
실시예 4 - K. 마르시아너스에 의한 40%인 GOS로부터 출발하는 제조예 (Cheng, C.-C.; et al. Biotechnol. Lett. 28 793-797, 2006)
스트레인 K. 마르시아너스 ATCC 56497을 효모를 위한 한천을 포함하는 고온고압-멸균된 YPD 배지를 포함하는 플레이트에서 배양하고, 30℃의 인큐베이터에서 48시간 동안 두었다.
예비발효 혼합물을 제조하기 위해, 100㎖의 액상 YPD 배지를 제조하고, 고온고압-멸균시킨 후 이전에 제조된 플레이트로부터 찍은 콜로니들을 접종하였다. 상기 미생물들을 30℃ 온도의 진탕기에서 200rpm으로 24시간 동안 진탕하면서 성장시켰다.
시험은 실시예 1과 같이 동일한 출발 용액에서 수행하였다: 460 g의 40% 조 GOS 용액(배치 번호 01449IN9)을 1.4ℓ의 물로 희석시켰다.
15% 수산화 나트륨으로 pH 2.8 내지 pH 5.4로 용액 pH를 조정한 후에, 온도를 30℃로 제어하였다.
전체 예비발효 혼합물을 접종을 위해 사용하였다. 상기 발효는 pH-자동조절기를 써서 15% 수산화 나트륨을 가함으로써 pH 5.2 내지 5.4에서 진행하였다. 하기 제시된 표로 기재된 HPLC 데이타(또한 도 8 참조)로부터 볼 수 있는 바와 같이, 상기 혼합물의 샘플링을 48시간 후에 수행하고 반응이 완료에 도달된 것을 볼 수 있다:
Figure 112017085016181-pat00012
상기 반응은 효과적으로 락토오스가 거의 완전히 사라지는 결과가 되었지만, 갈락토-올리고사카라이드에 기여할 수 있는 피크가 전체 디사카라이드 영역(12.2분 내지 13.2분)으로부터 없다는 것을 첨부된 크로마토그램(도 8)으로부터 유의하여야 한다.

Claims (9)

  1. 0% 초과 80% 미만 순도의 갈락토-올리고사카라이드(galacto-oligosaccharides) 혼합물로부터 출발하는, 소화가능한 당인 락토오스, 글루코오스 및 갈락토오스의 전체 백분율이 ≤ 5%인 순도 ≥ 95%를 갖는 갈락토-올리고사카라이드 혼합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 저온살균 단계, 후속적으로 스트렙토코커스 터모필러스(S. thermophilus)에 의한 하나 이상의 발효 단계, 및 사카로미세스 세레비시아(S. cerevisiae)에 의한 하나 이상의 발효 단계를 포함하는 방법이고, 상기 순도는 갈락토-올리고사카라이드 및 상기 소화가능한 당을 구별하고 정량할 수 있는 분석적인 방법에 의하여 계산되는 것인 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, S. 터모필러스에 의한 발효 단계 후 S. 세레비시아에 의한 발효 단계가 수행되는 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 출발 갈락토-올리고사카라이드 혼합물이 글루코오스의 HPLC 면적 백분율이 ≤ 5%인 글루코오스 함량을 갖는 경우에, S. 터모필러스에 의한 발효 단계 후에 S. 세레비시아에 의한 발효 단계인 것인 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 출발 갈락토-올리고사카라이드 혼합물이 글루코오스의 HPLC 면적 백분율이 > 5%인 글루코오스 함량을 갖는 경우, 상기 S. 터모필러스에 의한 발효 단계는 S. 세레비지아에 의한 발효 단계 후에 수행되는 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, S. 세레비지아에 의한 발효는 시작 갈락토-올리고사카라이드의 건조 중량 kg 당 40 내지 15 g의 탈수화된 S. 세레비지아를 사용하여 12시간 이상 동안 35±5℃의 온도에서 pH 6.5±0.5에서 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, S. 터모필러스의 발효는 시작 갈락토-올리고사카라이드의 건조 중량 kg 당 1 내지 0.4 g의 탈수된 S. 터모필러스를 사용하여 15시간 이상 동안, 염기를 가함으로써 pH 6.0 내지 6.5를 유지하면서 40±5℃의 온도에서 수행되는 것인 방법.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 단계 후에 상기 혼합물이 세라믹 초여과, 나노여과, 탄소로 탈색 및 이온-교환 수지 탈이온화에 의하여 더 처리되는 것인 방법.

  8. 삭제
  9. 삭제
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