KR101843391B1 - 호흡기 질환 치료를 위한 약용 탄수화물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 후속 바이러스/세균 감염, 급/만성 기관지염, COPD, 낭포성 섬유증, 및 염증성 질환을 포함하는 호흡기 질환의 치료를 위한 방법 및 그의 조성물에 관한 것이다. 본 출원인에 의해 화학식 1 및/또는 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기염이 손상된 호흡기 관 세포의 표면 상의 시알당결합체를 복원함으로써 상기 세포의 생존도의 회복을 촉진시킬 수 있음이 규명되었다.

Description

호흡기 질환 치료를 위한 약용 탄수화물{MEDICINAL CARBOHYDRATES FOR TREATMENT OF RESPIRATORY CONDITIONS}
본 발명은 신규 방법, 일군의 화학식 1 및/또는 2의 탄수화물, 및 그의 기침 및 후속 바이러스/세균 감염(post viral/bactrial infections), 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및 염증성 질환을 포함하는 관련된 호흡기 질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
인간의 경우, 축구장 크기의 표면적을 갖는 호흡기관은 인체를 외부세계와 연결하는 가장 넓은 표면적을 갖는 기관으로서 공기의 충분한 교환을 위해 필요하다; 반면, 상기 호흡기관은 공기 중의 많은 물리적, 화학적 및 생물학적 물질에 의해 영향을 받아, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐 및 기관지의 염증성 질환을 포함하는 질병이 유발되기도 한다. 아울러, 낭포성 섬유증과 같은 일부 유전학적 질병은 기관지의 외부 세계와의 연결에 의해 발병한다. 바이러스 및 세균은 인체 내로 침투하여 기관지에서의 감염을 유발하기도 한다.
기침은 치료를 필요로 하는 흔한 질병 중의 하나이다. 그러나, 현재 가능한 치료방법은 인체가 스스로 회복되도록 증상을 완화시키는 것만으로 한정되어 있고 많은 경우 회복은 매우 느리다. 호주에서는 기침 시럽의 판매액이 연간 2천만 달러가 넘는다. 기침 시럽의 전세계 시장규모는 연간 10억 달러를 넘는 것으로 추정되고 있다.
몇달 또는 심지어 수년간 지속되는 지속성 기침은 때때로 기관지 천식, 잠재적 반사(occult reflex), 또는 바이러스 감염 후 세균 감염에 기여하기도 하고 흡연은 기도가 과민감성/과반응성이 되도록 하기도 한다. 따라서, 인체가 호흡계의 질병을 초래할 수 있는 공기 중의 많은 물리적, 화학적 및 생물학적 물질에 의해 영향을 받은 후 인체가 회복되도록 도울 수 있는 효과적인 치료방법에 대한 필요성이 있다.
문서, 법률, 물질, 기구, 기사 및 이와 유사한 것들에 대한 언급은 순전히 본 발명을 위한 전후사정을 제공할 목적으로 본 명세서에 포함된다. 그러한 사항 중 일부 또는 전부가 마치 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재한 것처럼, 선행기술의 부분을 형성하거나 본 발명이 속한 기술분야에서 상식에 속하는 것이라고 시사하거나 제시하는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에서 본 발명은 대상의 호흡기 질환을 치료하기 위해 상기 대상의 손상된 호흡 세포의 표면 위의 시알당결합체(sialylglycoconjugate)의 복원(restoration)를 촉진하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 시알당결합체의 생합성을 촉진할 수 있는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 화합물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 방법은 상기 세포가 호흡기 표면에 영향을 주고, 그럼으로써 기침, 후속 바이러스 또는 세균 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 다른 호흡기 염증성 질환과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 호흡기 질환을 유발할 수 있는 인자에 대응하는 정상적인 생물학적 기능을 위한 보다 나은 조건에 처하게 하는 것과 같이 상기 세포의 생존능력의 회복을 제공한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 화학식 1 및 화학식 2의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 유도체 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도를 제공한다. 상기 용도는 본 문서에 기재된 것과 같이 호흡기 질환의 치료 또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 다른 측면에서 호흡기 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 시알당결합체(sialylglycoconjugate) 생합성을 촉진할 수 있는 화합물을 포함하는 조성물 및 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서 호흡기 질환의 치료를 위한 화합물의 스크리닝 방법이 제공되는데, 상기 방법은
표면 위의 시알당결합체가 감소된 세포에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 세포에 상기 피검 화합물을 노출시킨 후, 상기 세포 표면 위의 시알당결합체의 복원 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 세포 표면 위의 상기 시알당결합체의 복원 정도의 측정은 상기 세포의 생존능력의 측정으로 결정될 수 있다.
아울러, 본 발명의 다른 측면에서, 대상의 호흡기 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 대상에게 상기 스크리닝 방법에 의해 확인된 적어도 하나 이상의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
세포생물학 및 분자생물학의 관점으로부터, 손상된 기관지의 과민감성/과반응성은 기관지의 세포 표면이 손상되고 그에 따라 손상된 세포 표면이 자극제의 자극에 감수성을 갖게 됨으로써 유발될 수 있다. 예를 들어, 본 출원인은 바이러스 또는 세균 감염 후 기관지 세포가 그 표면에 존재하는 시알당결합체에서 말단 시알산을 종종 상실하는 현상을 발견하였다. 그 결과, 상기 "노출된" 세포의 생존능력이 감소하였다. 이는 결국 기관지염과 기침으로 진행되는 염증 반응을 촉발하였다. 이론에 의해 한정되지 않더라도, 세포 표면 위의 시알산의 복원은 종종 기관지염의 신호가 되는 감염 또는 다른 물리학적, 화학적, 생물학적 인자에 의해 손상된 기관지를 회복시킬 수 있다고 예상된다.
본 출원인은 이제 본 출원에서 두 가지 인간 기관지 세포주인, 소 기도 상피세포(SAEC) 및 정상 인간 기관 상피 세포(NHBE)에서 수행된 세포배양 실험을 제시한다. 상기 세포들은 인플루엔자 바이러스 또는 세균으로부터 유래한 뉴라미니다제(neuraminidase, NAs)로 일차적으로 처리되었다. 상기 뉴라미니다제는 세포표면의 시알당결합체로부터 시알산을 절단한다. 그 결과 상기 "노출된" 세포의 생존능력은 감소하였다. 예를 들어, SAEC는 C. perfringens 뉴라미니다제를 0.01 U/ml 처리시 또는 인플루엔자 바이러스 NWS/S70C 뉴라미니다제를 0.17 ㎍/well 처리시 생존도가 25% 이상 낮아진다. 유사한 결과는 NHBE 세포주에서도 나타났다. 상기 세포를 뉴라미니다제로 처리하고, 세포를 세척하여 뉴라미니다제를 제거한 후, 화학식 1 및/또는 2의 화합물로 24시간 동안 처리하였다. 그에 따른 세포의 생존도를 측정하였다. 상기 결과(실시예 7-36)은 화학식 1 및/또는 2의 일군의 화합물이 손상된 기관지 세포의 표면의 시알당결합체의 복원을 통해 상기 세포의 생존도를 회복하는데 도움을 줄 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명의 일 측면에서 본 발명은 대상의 손상된 호흡기 세포의 표면 위의 시알당결합체의 복원을 촉진하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 시알당결합체의 생합성을 촉진할 수 있는 화합물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일 측면에서 본 발명은 대상에서 호흡기 질환을 치료하기 위해 상기 대상의 손상된 호흡기 세포의 세포 생존도의 회복을 촉진하는 방법이 제공하는데, 상기 방법은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 시알당결합체의 생합성을 촉진할 수 있는 화합물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
호흡기 세포의 표면 위의 시알당결합체의 복원의 촉진은 상기 세포가, 호흡세포 표면에 영향을 끼쳐서 기침, 후속 바이러스 또는 박테리아 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 다른 호흡기 염증성 질환과 같은, 그러나 그에 한정되지 않는 호흡기 질환에 이르게 할 수 있는 인자에 대응하여 정상적인 생물학적 기능을 위한 더 나은 조건에 처하게 할 수 있는, 상기 세포의 생존 가능 상태로의 회복 또는 생존도의 회복을 지시할 수 있다.
다른 실시예에서, 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 화합물은 시알당결합체 생합성의 중간물로서 참여할 수 있는 탄수화물, 그의 전구체 및 그의 프로드러그, 그의 약학적으로 허용 가능한 염 및 유도체 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기에서 언급된 화합물들은 흡입 또는 주입을 통해 경구적으로 기침, 후속 바이러스 또는 박테리아 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 다른 호흡기 염증성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 호흡기 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다.
본 명세서의 발명의 상세한 설명 및 청구항을 통해, 용어 "포함하다(comprise)"와 "포함하는(comprising)" 및 "함유하다(comprises)"와 같은 상기 용어의 변형체는 다른 첨가제, 요소, 정수 또는 단계를 배제할 의도로 사용된 것이 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명은 하기와 같이 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물의 용도를 제공한다;
화학식 1의 화합물:
Figure 112012009200514-pct00001
상기 식에서,
B=H일 때, A는 NHCOCH3, NH2, OH, NH2·HX, 또는 A=H일 때, B는 NHCOCH3, NH2, NH2·HX, HX는 염산, 황산, 인산, 초산, 구연산 등과 같은 약학적으로 적합한 무기 또는 유기산일 수 있고;
R1, R2, R3, R4는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2Ph, COCR5R6R7, 피바 에스테르(piva ester), 인데닐 에스테르(indenyl ester)와 같은 CO-활성 에스테르일 수 있으며;
R5, R6, R7는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), C6H5, CH2Ph, CH3CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200)일 수 있고;
R4는
Figure 112012009200514-pct00002
일 수 있으며;
상기에서, R5', R6'는 동일하거나 다를 수 있으며, H, 또는 Na, K, Ca, Mg, Zn, NH3, 트리에틸아민(triethylamine) 등과 같은 약학적으로 적합한 무기 또는 유기염일 수 있거나, 또는 R5', R6'는 (CH2)nCH3(n=1~20) 또는 CH3CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200) 또는 피바 에스테르, 인데닐 에스테르와 같은 활성 에스테르와 같은 약학적으로 적합한 에스테르일 수 있으며;
및 화학식 2의 화합물:
Figure 112012009200514-pct00003
상기 식에서,
R8는 H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2Ph, COCH2Ph, 피바 에스테르(piva ester), 인데닐 에스테르(indenyl ester), COCR14R15R16{여기서, R14, R15, R16 는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), C6H5, CH2Ph, CH2CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200)일 수 있음}와 같은 CO-활성 에스테르일 수 있고;
R8는 시티딘(cytidine), 시티딘 일인산(cytidine monophosphate), 시티딘 이인산(cytidine diphosphate), 시티딘 삼인산(cytidine triphosphate), 아데노신(adenosine), 아데노신 일인산(adenosine monophosphate), 아데노신 이인산(adenosine diphosphate), 아데노신 삼인산(adenosien triphosphate)일 수 있으며;
R9는 H, CH3, 또는 Na, K, Ca, Mg, Zn, NH3, 트리에틸아민(triethylamine) 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기염, 또는 피바 에스테르, 인데닐 에스테르과 같은 약학적으로 적합한 활성 에스테르, 또는 CH2CR17R18R19{여기서, R17, R18, R19 는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200), C6H5, CH2Ph일 수 있음}와 같은 CO-활성 에스테르일 수 있고;
R10, R11, R12, R13는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2Ph, 피바 에스테르 또는 COCR20R21R22{여기서, R20, R21, R22는 동일하거나 다를 수 있는데, H, CH3 , (CH2)nCH3 (n=1~20), C6H5 , CH2Ph, CH2CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200)일 수 있음}일 수 있으며;
R13은
Figure 112012009200514-pct00004
일 수 있는데;
상기에서 R23, R24은 동일하거나 다를 수 있으며, H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2CH2(OCH2CH2)mCH3(m=1~200), CH2Ph, 또는 피바 에스테르, 인데닐 에스테르와 같은 활성 에스테르, 또는 CH2CR25R26R27{R25, R26, R27 m은 동일하거나 다를 수 있고, H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), C6H5, CH2Ph일 수 있음), 또는 Na, K, Ca, Mg, Zn, NH3, 트리에틸아민 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 무기 또는 유기염일 수 있다.
화학식 1의 일 실시예에서, A=NHCOCH3, B=H, R1, R2, R3, R4=H일 때, 상기 화합물은 N-아세틸-D-만노사민(N-acetyl-D-mannosamine)이다. 이는 본 명세서 전반에 걸쳐 화합물 1로 언급될 것이다.
화학식 2의 일 실시예에서, R8, R10, R11, R12, R13=H, R9=Na일 때, 상기 화합물은 N-아세틸뉴라민산 나트륨염(N-acetylneuraminic acid sodium salt) 또는 시알산 나트륨염(Sialic acid sodium salt)이다. 이는 본 명세서 전반에 걸쳐 화합물 2로 언급될 것이다.
R8이 시티딘 일인산이고 R9, R10, R11, R12, R13=H일 경우, 상기 화합물은 CMP-시알산이다.
세포 표면 위의 당결합체의 다당쇄(oligosaccharide chains) 상의 말단 당(terminal sugars)으로서 시알산은 세포 부착(cell adhesion)[1]과, 인식 결정기(recognition determinants)의 형성 또는 차폐(masking)[2][3] 및 당단백질의 구조 안정화[4]와 같은 특정 생물학적 프로세스의 분자적 결정인자로 작용한다. 생체 내에서의 시알당결합체(sialylglycoconjugates)의 생합성 경로가 하기 도 1에 도시되어 있다[5].
N-아세틸뉴라민산은 농도의존적으로 뮤코섬모 수송(mucocilliary transport)의 손상을 보호하지만 유당(lactose)의 경우 그렇지 않은 것으로 보고되었다[6]. 더 나아가, N-아세틸뉴라민산을 토끼에 반복적으로(흡입에 의해) 투여함으로써 전처리할 경우, 이산화황의 장기간 노출에 의해 야기되는 염증성 변화를 현저하게 예방하였다[7]. 또한, N-아세틸-D-글루코사민을 포유동물에 경구 투여할 경우 포도당으로 급격하게 대사되는 것으로 보고된 바 있다[8]. 아울러, N-아세틸만노사민 또는 그의 유도체를 유전성 봉입체근염(hereditary inclusion body myopathy, HIBM) 및 공포(rimmed vacuoles)를 지닌 원위근염(distal myopathy)(Nonaka myopathy)를 포함하는 근위축증(muscular astropy)의 치료를 위하여(당 분자가 결핍된 환자에서 시알산을 생산하기 위해) 경구로 투여하는 방법이 보고된 바 있다. 또한, 신장막의 저시알화(hyposialytion)로부터 기인하는 것과 같은 특정 신장질환이 상기 방법에 의해 치료될 수 있다[8b][8c].
그러나, 이러한 중간물질의 호흡기 질환의 치료를 위한 용도와 관련된 치료는 보고된 바 없다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물에 관한 안전성 여부는 본 출원인에 의해 조사되었다. 예를 들어, 화합물 1 및 2는 Balb C 생쥐(AEC 승인 코드: BAM/B/2005/16)를 대상으로 한 내성(tolerance) 및 아만성(subchronic) 독성 연구에 사용하였다. 상기 내성 분석 결과 두 가지 화합물 모두 경구 투여량으로 5 g/Kg 또는 복강투여량으로 2 g/Kg 투여시 훌륭한 내성을 보였다. 아만성 독성 분석 결과 두 화합물 모두 경구 투여시 30일간 1 g/Kg/day 또는 복강 투여시 30일간 0.5 g/Kg/day 투여할 경우 독성이 없는 것으로 나타났다.
기니피그 기침 모델 역시 본 출원인에 확립되었다. 화합물 1 및 2를 상기 모델에 대하여 처리하였다. 3일간 500 mg/kg/day 경구 투여시 두 화합물 모두 기니피그에서 뉴라미니다제에 의해 야기된 기관지 손상을 복구할 수 있었다. 이러한 생체 내 실험 결과는 시험관 내 시험결과와 일치한다. 따라서, 상기 효과 및 안전성 데이터는 화학식 1 및/또는 2의 화합물 및 특정 화합물인 화합물 1 및 2가 의학적 용도로 유용할 수 있음을 지지한다.
본 출원인은 화학식 1 및/또는 2의 화합물이 손상된 기관지 세포 표면 상의 시알당결합체를 복원시킴으로써 상기 손상된 기관지 세포의 생존도의 회복을 촉진할 수 있음을 확인하였다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 상기 세포 내로 진입한 후 시알당결합체의 생산을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 일 측면은 화학식 1 및/또는 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 유도체 및 그의 조합 또는 그의 혼합물의 기침 및 그와 관련된 후속 바이러스/세균 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 염증성 질환을 포함하는 호흡기 질환의 치료를 위한 유효 치료제로서의 용도에 관한 것이다.
상기 화학식 1 및/또는 2의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 조성물 및 그의 혼합물은 또한 하나 또는 그 이상의 다른 호흡기 질환의 치료를 위한 유효 성분과 함께 조합하여 제형화될 수 있다. 이러한 유효성분의 예로는, 기관지 확장제인 콜린 테오필리네이트(choline theophyllinate)와 테오필린(theophylline), 천식 및 다른 호흡기 질환에 수반된 기관지 경련의 완화제인 사부타몰(sabutamol)과 터부탈린 설페이트(terbutaline sulfate), 뮤코다당 분해능을 가진 거담제인 브로모헥신(bromohexine), 진통제이자 진해제인 코데인(codeine)과 폴코데인(pholcodeine), 진해제인 코페다놀(cophedanol), 펜톡시페린(phentoxyverine), 디메톡사네이트(dimethoxanate) 및 글라우신(glaucine), 프롬데이트(promdate), 탈록시민(taloximine), 아세틸 피레라세타마이드(acetyl piperacetamide), 유칼립투스 오일(eucalypus oil), 염화암모늄, 및 항-기침 허브인 천패모(fritillariae cirrhosae)를 들 수 있다. 탈니플루메이트(talniflumate), 2-아미노-페닐-아세트산과 같은 뮤신 합성 저해제 또는 항천식제인 플루니솔리드(flunisolide)와 같은 일부 글루코코르티코이드(glucocorticoids)와의 병용 또는 약학적으로 병용가능한 증상 완화용 기침시럽과의 병용, 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료를 위한 실로밀라스트(cilomilast, Ariflo)와 같은 포스포디에스테라제-4(phosphodiesterase-4) 저해제와의 병용도 가능하다.
더 나아가, 화학식 1 및/또는 2의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 유도체 그리고 그의 조합 및 그의 혼합물의 약학적으로 허용가능한 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 유효 성분, 예를 들어, 항-인플루엔자 바이러스제인 자나미비르(zanamivir) 및/또는 오셀타미비르(oseltamivir), 및/또는 항 리노바이러스제인 플레코나릴(pleconaril) 및 엔비록심(enviroxime)와 같은 항-바이러스제 그리고 항생제{예를 들어, 에리트로마이신(erythromycins), 테트라사이클린(tetracyclines), 리파마이신(rifamycins), 페니실린(penicillins), 세팔로스포린(cephalosporins); 퀴놀론(quinolones), 플루오로퀴놀론(fluoroquinolones); 설폰아마이드(sulfonamides), 및 트리메토프림(trimethoprims)과 같은}; 항진균제{예를 들어, 암포테리신(amphotericins), 클로트리마졸(clotrimazole), 에코나졸(econazole), 플루코나졸(flucoazole), 플루시토신(flucytosine) 등과 같은}와 같은 항미생물제(antimicribial agent)와 조합하여 제형화될 수 있다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물에 대한 참조는 본 문서에 화학식 1 및/또는 2의 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 유도체 및 그의 염을 포함한다.
본 발명의 추가적인 또는 선택적인 실시예에서, 화학식 1 및/또는 2의 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 사람을 포함하는 동물에서의 후속 바이러스/세균 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 염증성 질환을 포함하는 호흡기 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공된다.
아울러, 본 발명의 부가적인 또는 선택적인 측면에서 화학식 1 및/또는 2의 화합물의 사람을 포함하는 동물에서의 후속 바이러스/세균 감염, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증 및 염증성 질환을 포함하는 호흡기 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 용도가 제공된다.
치료에 필요한 화학식 1 및/또는 2의 화합물의 투여량은 투여 경로, 치료될 대상의 질병의 특성, 나이 및 인간 환자를 포함한 동물의 컨디션에 따라 조절될 수 있고, 궁극적으로 담당 수의사나 의사의 결정에 따라 결정될 수 있다.
일반적으로 적합한 투여량은 하루에 체중 1 kg 당 0.1 내지 500 mg의 범위 내일 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg/day의 범위 내일 수 있다.
일반적으로 경구투여를 위한 투여량은 1 내지 500 mg/kg/day, 주사를 위한 투여량은 1 내지 100 mg/kg/day일 수 있다. 흡입을 위한 투여량은 0.01 내지 5 mg/kg/day일 수 있다. 바람직하게는, 상기 투여량은 경구투여 또는 주사시 5 내지 50 mg/kg으로, 5 내지 10일 동안 하루에 두 차례 또는 세 차례 투여될 수 있고; 상기 투여량은 흡입시 0.1 내지 0.5 mg/kg로, 5 내지 10일 동안 하루에 1 내지 5차례 투여될 수 있다.
치료는 기침 또는 그와 관련된 질병이 발생하여 종료되기 전까지 지속되는 시점 또는 직후 개시되는 것이 바람직하다. 적합한 치료는 하루에 1 내지 4 차례 수행되고 3 내지 30일간 지속된다.
바람직한 투여량은 단일 투여량으로 또는 하루에 두 번 , 또는 세 번, 네 번 또는 그 이상의 부분투여와 같이 적절한 간격을 갖고 분할투여량으로 제시될 수 있다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 단위 투여량으로 편리하게 투여될 수 있는데, 예를 들어 단위 투여 제형당 0.1 내지 500 mg의 유효성분이 포함될 수 있다. 본 문서에서 사용되는 용어 "단위 투여량"은 바이알과 같은 개별 포장된 단위 투여량은 물론 바이알로부터 주사기로 분주되는 부분량(aliquots)과 투입 용기에 포함된 투입용 조성물을 포함한다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 치료적 목적으로 가능한 한 원료 화학물질로 투여될 수도 있으나, 약제학적 제형으로 상기 유효 물질을 제시하는 것이 바람직하다.
본 발명은 추가적으로 화학식 1 및/또는 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 유도체와 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 그리고 선택적으로 다른 치료 및/또는 예방 성분을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 상기 담체는 상기 제형 내의 다른 성분과 양립가능하다는 의미에서 '허용 가능'해야 하며 치료대상에게 해롭지 않아야 한다.
약제학적 제형은 경구, 직장, 비강 또는 전신 투여(근육내, 피내, 피하 및 정맥내를 포함)를 위해 적합한 성분을 포함하거나, 위장관계 관에 대한 투여를 위해 적합한 형태, 또는 호흡기관(비강을 포함)에 대한 투여(예를 들어 흡입 또는 주입 또는 피내 또는 피하 삽입 또는 경피 패치에 의한)를 위해 적합한 형태를 포함할 수 있다. 상기 제형은 적절한 곳에서는 구분된 투여 단위로 편리하게 제조될 수 있고 약학 분야에서 잘 알려진 그 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다. 모든 방법들은 유효 화합물을 액체 담체 또는 미세하게 나눠진 고체 담체 또는 양자 모두와 함께 혼합되도록 하는 단계를 포함하며, 필요에 따라 원하는 제형으로 생성물을 성형하는 단계를 포함한다.
경구 투여에 적합한 약제학적 제형은 분말 또는 과립, 액상, 현탁액(suspension) 또는 유화물(emulsion) 형태의 상기 유효 성분의 미리 정해진 양을 각각 포함하는 캡슐, 카시에(cachets) 또는 정제와 같은 개별 단위로 제조될 수 있다. 상기 유효 성분은 또한 볼러스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트(paste)의 형태로 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 정제와 캡슐은 결합제(binding agents), 충전제(fillers), 윤활제(lubricants), 붕괴제(disintegrants) 또는 습윤제(wetting agents) 와 같은 통상의 부형제를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다. 액상 경구제형은 예를 들어 유성 현탁액의 수용액, 용액, 유화물(emulsion), 시럽 또는 엘릭시르(elixirs)의 형태로 제형화되거나, 물 또는 다른 적절한 용제와 사용 전에 혼합하기 위한 건조물 형태로 제형화될 수 있다. 그러한 액상 제형은 현탁제, 유화제(emulsifying agents), 비수용성 용제(식이성 기름을 포함할 수 있음) 또는 보존제(presevatives)를 포함할 수 있다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 또한 전신 투여(예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속 주입과 같은 주사)를 위하여 제형화될 수 있고, 앰플(ampules) 내의 단위 투여량이 담긴 앰플(ampules), 사전-충전된 주사기, 소량 주입 또는 보존제가 첨가된 다중-투여 용기의 형태로 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 용제 내의 유화물(emulsion)의 형태를 띠거나, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 유효 성분은 적절한 용제, 예를 들어, 멸균된 발열원(pyrogen)이 없는 물과 사용 전에 혼합을 위해, 멸균 고체의 무균성 분리에 의하거나 용액으로부터 동결건조함으로써 수득되는 분말 형태를 띨 수 있다.
직장 투여(rectal administration)를 위해, 담체가 고체인 단위 투여용 좌약이 제조될 수 있다. 적절한 담체는 코코아버터 및 당업계에서 통상적으로 사용되는 다른 물질을 포함하고 상기 좌약은 상기 유효 화합물과 연화되거나 녹은 담체와 혼합한 후 냉각하고 주형에서 성형함으로써 제형화될 수 있다.
비강내 투여를 포함하는 호흡기 관에 대한 투여를 위해, 화학식 1 및/또는 2의 화합물은 호흡기 관에 대한 투여를 위해 당업계에서 채용된 방법 및 제형 중 그 어떠한 것에 의해서도 투여될 수 있다.
따라서, 화학식 1 및/또는 2의 화합물은 일반적으로 용액 또는 현탁액 또는 건조 분말의 형태로 투여될 수 있다.
용액 및 현탁액은 물(예를 들어 멸균 또는 무-발열원 물) 단독으로부터 또는 물과 생리학적으로 허용가능한 공-용매(예를 들어 에탄올, 프로필렌 글리콜, PEG 400과 같은 폴리에틸렌 글리콜)로부터 수용성으로 제조되는 것이 바람직하다.
그러한 용액 또는 현탁액은 추가적으로 다른 부형제, 예를 들어 염화 벤잘코니움(benzalkonium chloride)와 같은 보존제, Tween® 80, Span® 80, 염화 벤잘코니움 등의 폴리소르베이트(polysorbates)와 같은 안정화제/계면활성제, 완충제(buffers), 염화 나트륨과 같은 등장성-조절제(isotonicity-adjusting agents), 흡수 촉진제(absorption enhancers) 및 증점제(viscosity enhancer)를 추가적으로 포함할 수 있다. 현탁액의 경우 추가적으로 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 카르복시메틸 셀룰루오스 나트륨염(carboxymethyl cellulose sodium salt)과 같은 현탁제(suspending agents)를 포함할 수 있다.
용액 또는 현탁액은 통상적인 수단(예를 들어, 점적기(dropper), 피펫 또는 분무기와 같은)을 통해 비강에 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 제형은 단일 또는 다중투여 형태로 제조될 수 있다. 후자의 경우 투여량 계측(dose metering) 수단이 필요에 따라 제공될 수 있다. 점적기 또는 피펫의 경우 투여는 환자에 의해 상기 용액 또는 현탁액의 미리 정해진 적절한 부피를 투여함으로써 달성될 수 있다. 분무기의 경우 예를 들어, 계량 세분화 분무 펌프(metering atomize spray pump)를 사용함으로써 투여를 달성할 수 있다.
에어로졸 제형 역시 호흡기 관 투여를 위해 사용될 수 있는데, 이 경우 화학식 1 및 2의 화합물은 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane) 또는 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane) 등의 클로로플루오로카본(chlorofluorocarbon, CFC), 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 추진체(propellant)로 가압 충전된 형태로 제공될 수 있다. 상기 에어로졸은 또한 레시틴(lecithin)과 같은 계면활성제를 통상적으로 포함할 수 있다. 약물의 투여량은 계량 밸브(metered valve)에 의해 조절될 수 있다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 선택적으로 건조 분말{예를 들어, 유당, 전분, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(hydroxypropylmethyl cellulose)와 같은 전분 유도체 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidine, PVP)와 같은 적절한 분말 베이스에 상기 화합물이 혼합된 혼합 분말}의 형태로 제조될 수 있다. 상기 분말 담체는 통상적으로 비강에서 겔(gel)을 형성한다. 상기 분말 조성물은 상기 분말이 흡입기(inhaler)를 통해 투여될 수 있는 캡슐 또는 젤라틴 등의 카트리지 또는 블리스터 팩(blister pack) 등의 단위 투여 제형으로 제조될 수 있다.
비강내 투여 제형을 포함한 호흡기 관에 대한 투여를 위한 제형에서, 상기 화합물은 예를 들어 5 마이크론 또는 그 이하의 작은 입자 크기를 가질 수 있다. 그러한 입자 크기는 미분화(micronisation)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다.
필요한 경우, 상기 유효 성분의 서방성이 보장되도록 조절된 제형이 채용될 수 있다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물은 또한 항생제(antibiotics), 항바이러스제(antiviral agents)와 같은 항-감염제(anti-infective agents) 및 호흡기 질환의 치료제 등의 다른 치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 다른 측면에서 화학식 1 및/또는 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 유도체와 다른 유효 치료제를 포함하는 조합(combiniation)을 추가적으로 제공한다.
상술한 상기 조합은 상술한 약학적 제형의 형태로 사용될 수 있고 따라서 상기 조합을 포함하는 그러한 제형은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기에서 한정된 바와 같이 본 발명의 다른 추가적인 측면을 포함한다.
그러한 조합의 상기 개별적 요소는 순차적으로 또는 동시에 개별적인 또는 조합된 약학적 제형으로 투여될 수 있다.
상기 화학식 1 및/또는 2의 화합물이 치료시 2차 유효 치료제와 함께 사용될 경우, 각각의 화합물의 투여량은 각 화합물이 단독으로 사용될 때 채용된 것과 동일하거나 다를 수 있다. 적절한 투여량은 당업계에 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 이해될 것이다.
화학식 1 및/또는 2의 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 유도체는 유사체 구조를 갖는 화합물의 제조를 위해 당업계에 잘 알려진 그 어떠한 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 호흡기 질환의 치료를 위한 화합물의 스크리닝 방법이 제공되는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
표면 상에 감소된 시알당결합체를 갖는 세포에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 피검 화합물에 노출된 세포의 생존도의 회복 정도를 측정하는 단계.
본 발명에 기반하여, 다른 화합물은 호흡기 세포의 표면 위의 시알당결합체의 회복을 촉진하거나 시알당결합체 생합성을 촉진하는 능력에 의해 상기 세포의 생존도의 회복을 촉진하는데 사용될 수 있다. 따라서 호흡기 질환을 유발할 수 있는 인자에 대응하여 정상적인 생물학적 기능을 위한 보다 나은 조건에 처하게 하는 상기 세포의 회복은 상기 세포의 표면 위에 회복된 시알당결합체을 제공함으로써 달성될 수 있다.
이러한 방법은 표면 위의 시알당결합체가 감소된 세포, 바람직하게는 호흡기 세포를 수득하는 것과 관련된다. 이러한 세포는 "노출된(naked) 세포"로 명명되는데, 상기 노출된 세포는 정상적으로 기능을 수행하는 능력에 영향을 미칠 수 있는 인자에 대해 취약하다.
상기 세포는 호흡기 세포와 같은 정상적인 세포를 상기 세포의 표면 위의 시알당결합체로부터 시알산을 제거하는 뉴라미니다제에 처리함으로서 유도될 수 있다. 상기 세포는 그 다음으로 표면 위의 시알당결합체를 복원하는 피검 화합물의 능력에 대하여 분석된다. 상기 피검 화합물은 시알당결합체 생합성을 촉진함으로서 또는 상기 세포의 표면 위의 시알당결합체의 복원을 초래하는 기타 다른 수단에 의해 시알당결합체를 복원할 수 있다.
세포 표면 위에서 시알당결합체를 복원하는 능력은 상기 세포의 생존도의 회복 정도에 의해 측정될 수 있다. 상기 세포의 생존도는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 활용 가능한 그 어떠한 방법에 의해서도 측정 가능하다. 그러나, 세포 증식을 위한 세포의 능력에 의해 결정될 수 있다. 이는 증식하는 세포의 새롭게 합성되는 DNA로의 BrdU의 삽입을 측정하기 위한 세포 증식 ELISA 키트 또는 [3H]-티미딘-기반 세포 증식 분석과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 표준 세포증식 키트를 이용함으로서 측정될 수 있다.
상기 능력은 또한 상기 피검 화합물에 상기 세포가 노출된 결과로서, 상기 세포 위에서 복원된 시알당결합체의 수를 계수함으로서 측정될 수 있다. 이는 상기 시알당결합체에 특이적인 항체의 사용과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 활용가능한 방법에 의해 측정될 수 있다.
다른 실시예로 대상의 호흡기 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 스크리닝 방법에 의해 확인된 적어도 하나 이상의 화합물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 살아 있는 세포에서 시알당결합체의 생합성 경로를 나타낸다.
최종적으로, 본 문서에서 기술된 본 발명은 특별히 언급되지 않은 다른 변이, 변형 및/또는 첨가가 허용되며, 본 발명은 본 문서에서 기술된 바와 같은 본 문서의 범위 내에 속하는 그러한 모든 변이, 변형 및/또는 첨가를 포함한다고 이해되어야 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 한정할 의도록 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예에서 사용된 일반적인 방법
ㆍNMR은 Bruker Avance 300, DPX 300A 상의 Xwin-NMR 버전3.5를 통해 기록되었다.
ㆍMS는 ESI(electrospray ionisation probe)를 이용한 질량분석기(Waters Micromass ZMD)를 이용하여 기록되었다. 상기 시스템은 Water Mass Lynx NT 소프트웨어를 통해 구동되었다.
ㆍ플래시 칼럼 크로마토그래피는 실리카겔 60 F245(E. Merck)를 이용하여 수행되었다.
ㆍ박막 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔이 사전 코팅된 판(E. Merck)을 이용하여 수행되었다.
ㆍHPLC는 Waters alliance 2690 분리 모듈을 이용하여 전개하였고, Waters 이중 파장 2487 UV 검출기로 검출하였으며, 사용 소프트웨어는 Waters Millenium 32이었다.
ㆍ세포 배양 및 세포 생존도 분석
방법 1
사용 세포: 소 기도 상피세포(SAEC)
배지: SAGM 불렛 키트(SAM + 성장 보충제)
및/또는
사용 세포: 정상 인간 기관 상피 세포(NHBE)
배지: BEGM 불렛 키트 (BEBM + 성장 보충제)
구체적 실험방법:
동결보존된 세포(1x106 cells/ml)를 녹인 후 175cm2 페트리-디쉬에서 완전 배지하에 배양하였다. 상기 배지는 다음 날 제거되고 신선한 배지로 교체되었다. 상기 세포는 70-80% 세포포화도(confluency)가 되도록 약 5-6일 동안 배양하였다. 송장기 동안 상기 배지는 매 이틀 마다 교체되었다.
적절한 세포포화도를 달성한 경우, 상기 배지를 제거하였다. 세포의 단일층을 1x PBS로 세척하였고, PBS 제거 후 트립신+EDTA 2 ml 을 첨가하였다. 상기 세포를 상온에서 2 분간 부드럽게 요동시켰다. 상기 세포는 1x PBS로 회수되고 200 g로 10 분간 원심분리시켰다. 펠렛을 5x104 cell/ml로 재현탁시켰다. 96웰 플레이트에서 상기 세포는 100 μl/well(약 5000 cells/well)로 분주된다. 상기 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
박테리아 뉴라미니다제(Clostridium perfringens 유래) 10 μl를 각 웰에 첨가하여 최종 농도가 SAEC의 겨우 0.01 U/ml 그리고 NHBE의 경우 0.008 U/ml이 되도록 조정하였다. 상기 세포를 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
상기 플레이트의 원심분리는 1000 rpm에서 10분동안 수행되었고, 배지를 제거한 후 200 μl의 신선한 배지가 추가되었다. 상기 플레이트를 다시한 번 원심분리하였고 상기 배지를 100 μl의 신선한 배지로 교체하였다.
피검 화합물은 필요로 하는 농도의 6배 농축액으로 제조되었다; 20 μl의 상기 화합물을 각 웰에 첨가하였는데 이를 세 번 반복하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 세포는 37℃에서 밤새(약 16시간) 10 μl의 BrdU 표지(세포 증식 ELISA 키트, Roche)로 표지되었다.
표지 배지를 제거한 후 상기 세포를 30분간 상온에서 제조사에서 제공된 고정액으로 고정하고 변성시켰다.
고정액의 제거 후, 100 μl의 항-BrdU-POD 항체를 제조사가 제시한 적절 농도로 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 상온에서 90분간 배양하였다.
상기 항체 콘쥬게이트를 제거한 후 상기 웰을 200 μl의 제공된 세척용액으로 세척하였다. 세척액의 제거 이후, 100 μl의 제공된 기질 용액을 첨가하였고, 30분간 상온에서 반응시켰다. 상기 반응은 50 μl의 1 M H2SO4를 첨가함으로써 중지되었다. 상기 시료의 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다(기준 파장은 690 nm였음).
소 기도 상피세포(SAEC)는 Clostridium perfringens 유래의 뉴라미니다제(NA) 0.01 U/ml로 처리되었다.
세포 생존도
(평균±표준편차, n=20)
대조군 (정상세포) 100%
NA로 처리한 대조군 72.82%±7.26
정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE)는 Clostridium perfringens 유래의 뉴라미니다제(NA) 0.008 U/ml로 처리되었다.
세포 생존도
(평균±표준편차, n=20)
대조군(정상 세포) 100%
NA로 처리한 대조군 73.30%±7.12
상기 세포 생존도 분석은 약 10% 정도의 작동 편차가 발생하였다. 따라서, 세포 생존도가 대조군과 비교하여 120%인 결과만이 유의한 것으로 간주되었다. 양성 결과를 나타낸 화합물은 48시간 내에 세포 생존도를 회복할 수 있었다. 화학식 1 및/또는 2의 화합물 중에서도 낮은 독성을 가지고 가장 활성이 높은 화합물은 N-아세틸만노사민(화합물 1)과 N-아세틸뉴라민산(화합물 2)이었다.
방법 2
사용 세포: 소 기도 상피세포(SAEC)
배지: SAGM 불렛 키트(SABM + 성장 보충제)
및/또는
사용 세포: 정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE)
배지: BEGM 불렛 키트(BEBM + 성장 보충제)
구체적인 실험 방법:
동결보존된 세포(1x106 cells/ml)를 녹인 후 175 cm2 페트리-디쉬에서 완전 배지하에 배양하였다. 상기 배지는 다음날 제거되고 신선한 배지로 교체되었다. 상기 세포는 70-80% 세포포화도(confluency)가 되도록 약 5-6일 동안 배양하였다. 송장기 동안 상기 배지는 매 이틀 마다 교체되었다.
적절한 세포포화도를 달성한 경우, 상기 배지를 제거하였다. 세포의 단일층을 1x PBS로 세척하였고, PBS 제거 후 트립신+EDTA 2 ml을 첨가하였다. 상기 세포를 상온에서 2 분간 부드럽게 요동시켰다. 상기 세포는 1x PBS로 회수되고 200 g으로 10 분간 원심분리시켰다. 펠렛을 5x104 cells/ml로 재현탁시켰다. 96웰 플레이트에서 상기 세포는 100 μl/well(약 5000 cells/well)로 분주된다. 상기 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
인플루엔자 바이러스 NWS/G70C 유래의 바이러스 뉴라미니다제 10 μl를 각 웰에 첨가하여 최종 농도가 0.017 μg/ml이 되도록 하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
상기 플레이트의 원심분리는 1000 rpm에서 10분동안 수행되었고, 배지를 제거한 후 200 μl의 신선한 배기가 추가되었다. 상기 플레이트를 다시한 번 원심분리하였고 상기 배지를 100 μl의 신선한 배지로 교체하였다.
피검 화합물은 필요로 하는 농도의 6배 농축액으로 제조되었다; 20μl의 상기 화합물을 각 웰에 첨가하였는데 이를 세 번 반복하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 세포는 37℃에서 밤새(약 16시간) 10 μl의 BrdU 표지(세포 증식 ELISA 키트, Roche)로 표지되었다.
표지 배지를 제거한 후 상기 세포를 30분간 상온에서 제조사에서 제공된 고정액으로 고정하고 변성시켰다.
고정액의 제거 후, 100 μl의 항-BrdU-POD 항체를 제조사가 제시한 적절 농도로 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 상온에서 90분간 배양하였다.
상기 항체 콘쥬게이트를 제거한 후 상기 웰을 200 μl의 제공된 세척용액으로 세척하였다. 세척액의 제거 이후, 100 μl의 제공된 기질 용액을 첨가하였고; 30분간 상온에서 반응시켰다. 상기 반응은 50 μl의 1 M H2SO4를 첨가함으로써 중지되었다. 상기 시료의 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다(기준 파장은 690 nm였음).
실시예 1: N-아세틸-D-만노사민(1)의 제조
[화합물 1, 화학식 1, B=H, A=NHCOCH3, R1=R2=R3=R4=H]
1 g. of N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 1 g을 키틴(chitin)의 가수분해를 통해 수득했고, 이를 3 ml의 물에 용해시킨 후, 30% NaOH 용액을 이용하여 pH를 11이 초과하도록 조정하였다. 상기 혼합물을 20 내지 40℃에서 48시간 동안 정치시켰다. 상기 반응 용액을 5 N H2SO4로 pH 6.5~7.0으로 중화하고 나서, 감압건조시켰다. 생성된 고체를 에탄올로 10분간 환류하고 상온으로 냉각한 후 여과하였다. 여과물을 진공건조시켰고, 결과 85% N-아세틸-D-만노사민(N-acetyl-D-mannosamine) 및 15% N-아세틸-D-글루코사민을 포함하는 백색 고체를 수득하였는데, 이는 1H-nmr로 확인하였다. 상기 고체를 백색 고체로서 N-아세틸-D-만노사민을 수득하기 위하여 에탄올/이소프로판올/초산에틸(EA)를 이용하여 분획 및 재결정을 하였다(125 mg, N-아세틸-D-만노사민의 20% 변환율에 기반할 때 62.5%). 반응이 안된 N-아세틸-글루코사민(0.8 g)은 그 다음 반응 배치를 위해 재사용될 수 있었다.
1H-nmr (D2O) δ(ppm)
5.15 (d, 0.7H), 3.85~3.32 (m, 6.3H), 1.99 (s, 3H).
MS 222 (M+1)
실시예 2: N-아세틸-뉴라민산(N-acetyl-neuraminic acid) 나트륨 염(2)의 제조
[화합물 2, 화학식 2, R8=R10=R11=R12=R13=H, R9=Na]
물 15 ml에 N-아세틸만노사민(2.7g, 12.2 mmole) 및 피루브산나트륨(sodium pyruvate, 2.7 g, 24.5 mmol)이 용해된 pH 7.0~7.5의 수용액을 3 ml의 물에 용해된 N-아세틸만노사민(0.54 g) 및 프루브산나트륨(0.54 g) pH 7.0~7.5의 반응 혼합물에 N-아세틸뉴라민산 분해효소(N-acetylneuraminate lyase [EC 4.1.3.3.]) 25 U이 포함된 투석 주머니(제한 분자량 20,000)에 추가하였다. 상기 반응 혼합물을 60 rpm으로 30℃에서 5일간 교반하였다. 상기 효소 주머니를 제거한 후 새로운 반응 배치를 위해 사용하였다. 상기 반응 혼합물을 물 15 ml로 희석시킨 후, 앰버라이트(Amberlite) IRA-400(HCOO- 형) 칼럼(150 ml)을 통과시켰다. 상기 레진을 물 300 ml로 세척하고, 0.5 M HCOOH 용액으로 용출시켰다. 용출물을 수집한 후 진공건조시켰다. 건조물을 물 2 ml에 용해시킨 후 냉각 초산 10 ml로 4℃ 밤새 희석하였고, 결정을 여과한 후 에탄올로 세척하고 백색 결정 분말로 N-아세틸뉴라민산(1.5 g, 39.8%)를 수득하였다.
1H-nmr (D2O) δ(ppm)
4.00 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.87 (d, 1H), 3.77 (dd, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.55 (dd, 1H), 3.48 (d, 1H), 2.24 (dd, 1H, J=13.2 HZ, 5.1HZ), 1.98 (s, 3H), 1.83 (dd, 1H, J=13.2 HZ, 11.5 HZ).
MS 310 (M+1)
N-아세틸뉴라민산(1 g, 3.23 mmol)을 20 ml의 물에 용해시킨 후, NaHCO3 (0.26g, 3.09 mmol, PH 6~6.5)를 첨가하여 백색 분말로서 N-아세틸-뉴라민산(1.05 g, 98%)을 수득하였다.
실시예 3: 에틸 N-아세틸-뉴라민산( ethyl N- acetyl - neuraminate)의 제조 (3)
무수 에탄올 75 ml 내의 N-아세틸-뉴라민산(1 g, 3.23 mmole) 현탁액에 1.5 ml 염화아세틸(acetyl chloride)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 밀봉한 후 16 시간 동안 상온에서 교반하여, 투명한 용액을 형성시켰다. 반응 상물을 진공건조시켰다. 생성된 백색 고체를 초산에틸(ethyl acetate)로 세척한 후 진공건조하여 에틸 N-아세틸-뉴라민산(1 g, 91.7%)를 수득하였다.
1H-nmr (D2O) δ(ppm)
4.27 (q, 2H), 4.04 (m, 2H), 3.91 (d, 1H), 3.78 (dd, 1H), 3.68 (dd, 1H), 3.57 (dd, 1H), 3.52 (d, 1H), 2.28 (dd, 1H), 2.01 (s, 3H), 1.88 (dd, 1H), 1.28 (t, 3H).
MS 338 (M+1), 360 (M+23)
실시예 4: 에틸 5-아세트아미도-4,7,8,9,-테트라-o-아세틸-3,5-디디옥시-β-D-글리세로-D- 갈락토 -2-노눌로피라노소네이트( ethyl 5- acetoamido -4,7,8,9,- tetra -o-acetyl-3,5-dideoxy-β-D- glycero -D- galactononulopyranosonate , ethyl 5-acetamido-4,7,8,9-tetra-o-acetyl-neuraminate)(4)의 제조
아세트산 무수물(0.72 g) 및 5 μl의 수용성 60% 과염소산(perchloric acid)의 40℃에서의 교반용액을 부분적으로 30분 동안 에틸 5-아세트아미도-뉴라민산(230 mg, 0.68 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간동안 40℃에서 교반한 후, 상온으로 냉각하고 차가운 물 10 ml로 희석한 다음 황산암모늄(ammonium sulfate)로 포화시키고 40 ml 초산에틸로 3회 추출하였다. 유기 추출물을 혼합한 후 포화 NaHCO3 용액과 물의 순으로 세척하였다. 상기 유기층을 MgSO4로 건조한 후 진공건조하였다. 건조물을 초산에틸로 용해시킨 후 헥산으로 희석하여 백색 결정으로 상기 제목의 화합물을 수득하였다(223 mg, 65%).
1H-nmr (CDCl3) δ(ppm)
5.71 (m, 1H), 5.36 (dd, 1H, J=1.5HZ, 5.6HZ), 5.25 (ddd, 1H, J=2.4HZ, 7.5HZ), 5.22 (ddd, 1H, J=11.4HZ, 5.4HZ, 9.5HZ), 4.51 (dd, 1H, J=12.4HZ), 4.47 (d, 1H, J=0.8HZ), 4.21~4.13 (m, 4H), 4.03 (dd, 1H), 2.26 (ddd, 1H, 12.8HZ), 2.19 (dd, 1H), 2.15, 2.11, 2.03, 2.02, and 1.91 (5s, 15H), 1.29 (t, 3H, J=7.2HZ).
MS 506 (M+1)
실시예 5: 시티딘-5'-모노포스포-5-아세트아미도-3,5-디디옥시-β-D-글리세로-D-갈락토-2-노눌로피라노소닌산(cytidine-5'- monophospho -5- acetamido -3,5,- dideoxy -β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopyranosonic acid, CMP -시알산)(5)의 제조
N-아세틸뉴라민산(100 mg, 0.32 mmol) 및 시티딘-5'-삼인산 나트륨염(156.3 mg, 0.32 mmol)을 20 mM의 MgCl2을 포함하는 Tris-HCl 완충용액(100mM, pH 8.8) 32 ml에 용해시켰다. 상기 용액에 N. meningitidis 유래의 CMP-Neu5Ac 합성효소 5 mg을 추가하였다. 반응 혼합물을 2~3시간 동안 37℃에서 반응시키며 TLC(실리카겔, EtOH: 1 M NH4HCO3=7:3)로 모니터링하였다. 상기 반응 혼합물을 50 ml의 메탄올로 희석하고 여과하여 불순물을 제거한 후, 여과물을 감압건조하였다. 건조물을 Bio Gel P-2 레진 50 ml로 크로마토그래피를 수행한 후, 동결건조함으로써 백색 결정 분말로서 상기 제목의 화합물(147 mg, 75%)을 수득하였다. .
HPLC 분석:
C-18 칼럼.
이동상: 완충액 A (0.1M 인산칼륨 완충액. 8 mM 테트라-부틸암모늄 하이드로겐설페이트(pH 5.3) 보충) 및 완충액 B(70% 완충액 A 및 30% 메탄올, pH 5.9)
구배 조건:
2.5분간 100% 완충액 A, 7.5분간 0~40% 완충액 B, 1분간 40~100% 완충액 B, 4분간 100% 완충액 B, 1분간 100~0% 완충액 B, 이어 4분간 100% 완충액 A로 평형상태
유속: 1 ml/min.
270 nm 파장에서 자외선 검출
1H-nmr (D2O) δ(ppm)
7.87 (d, 1H, J=7.6 HZ), 6.25 (d, 1H, J=7.6 HZ), 5.91 (d, 1H, J=4.4HZ), 4.26~4.20 (m, 2H), 4.17~4.10 (m, 3H), 4.09~3.98 (m, 2H), 3.90~3.80 (m, 3H), 3.59~3.40 (m, 2H), 2.42 (dd, 1H, J=4.8, 13.2 HZ), 1.98 (s, 3H), 1.60 (dt, 1H, J=5.6, 12.6 HZ).
MS 635 (M2 -+Na+)
실시예 6: 에틸 5-아세트아미도-8,9,0-이소프로필리딘-뉴라미네이트( ethyl 5- acetamido -8,9-O- isopropylidine - neuraminate) (6)의 제조
무수성 DMF 2 ml에 용해된 에틸 5-아시트아미도-뉴라미네이트(150 mg, 0.445 mmol) 용액에 1 ml(8 mmol)의 2,2-이메톡시프로판(2,2-dimethoxypropane)과 50 mg의 엠버리스트 15(Amberlyst 15)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 60℃에서 7시간 동안 교반한 후 상온으로 냉각하고 여과하였다. 여과물을 감압건조하였다. TLC(실리카겔, EA/MeOH=10:4)를 이용하여 반응의 완결 여부를 모니터링하였다. 건조물을 EA/MeOH=10/1 1 ml로 재용해시킨 후 속성 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 필요한 분획을 합한 후, 진공건조하여 백색 형태로 상기 제목의 화합물(135 mg, 75%)을 수득하였다.
1H-nmr (D2O) δ(ppm)
4.28~4.23 (m, 2H), 4.23~4.11 (m, 2H), 4.08~3.92 (m, 2H), 3.96~3.52 (m, 3H), 2.31 (dd, 1/3H), 2.23 (dd, 2/3H), 1.99 (s, 3H), 1.82 (dd, 2/3H), 1.70 (dd, 1/3H), 1.36 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.25 (t, 3H).
MS 428 (M+Na)
실시예 7: 소 기도 상피세포(SAEC)의 생존도의 회복에 대한 화합물 1의 활성
화합물 1 [화학식 1, B=H, A=NHCOCH3, R1=R2=R3=R4=H]
세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1
50 μg/ml
171%±6.33
12.5 μg/ml 175%±2.33
3.1 μg/ml 146%±7.10
0.77 μg/ml 139%±3.46
0.19 μg/ml 157%±4.47
실시예 8: 정상 인간 기관지/기도 상피세포( NHBE )의 생존도의 회복에 대한 화합물 1의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1
50 μg/ml
125%±3.20
12. 5μg/ml 124%±2.21
3.1 μg/ml 120%±0.79
0.77 μg/ml 119%±2.23
0.19 μg/ml 116%±1.42
실시예 9: SAEC 의 생존도의 회복에 대한 화합물 2의 활성
화합물 (2) [화학식 (2), R8=R10=R11=R12=R13=H, R9=Na]
세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 2
50 μg/ml
129%±3.96
12.5 μg/ml 127%±2.51
3.1 μg/ml 115%±1.56
0.77 μg/ml 130%±2.18
0.19 μg/ml 129%±3.22
0.05 μg/ml 138%±0.50
0.012 μg/ml 140%±2.15
0.003 μg/ml 124%±1.91
실시예 10: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 2의 활성
세포 생존도
(평균 ± 표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 2
50 μg/ml
137%±1.00
12.5 μg/ml 127%±4.02
3.1 μg/ml 117%±3.22
0.77 μg/ml 117%±0.68
0.19 μg/ml 126%±0.21
실시예 11: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 3의 활성
화합물 3[화학식 2, R8=R10=R11=R12=R13=H, R9=C2H5]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 3
50 μg/ml
104%±1.66
12.5 μg/ml 107%±0.41
3.1 μg/ml 109%±1.41
0.77 μg/ml 103%±3.43
0.05 μg/ml 104%±1.46
실시예 12: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 3의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 3
50 μg/ml
106%±1.35
12.5 μg/ml 100%±0.88
3.1 μg/ml 113%±0.84
0.77 μg/ml 111%±4.73
0.19 μg/ml 114%±5.14
0.05 μg/ml 130%±5.19
0.012 μg/ml 130%±6.11
0.003 μg/ml 154%±4.91
실시예 13: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 4의 활성
화합물 4[화학식 2, R8=H, R9=C2H5, R10=R11=R12=R13=CH3CO]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 4
50 μg/ml
99%±4.00
12.5 μg/ml 97%±3.00
3.1 μg/ml 100%±1.80
0.77 μg/ml 115%±4.40
0.19 μg/ml 121%±1.80
0.05 μg/ml 106%±6.09
0.012 μg/ml 116%±0.10
0.003 μg/ml 110%±1.09
실시예 14: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 4의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 4
50 μg/ml
110%±1.02
12.5 μg/ml 117%±0.29
3.1 μg/ml 111%±4.54
0.77 μg/ml 110%±3..77
0.19 μg/ml 125%±1.46
0.05 μg/ml 115%±5.22
0.012 μg/ml 113%±6.85
0.003 μg/ml 83%±0.88
실시예 15: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 5의 활성
화합물 5[화학식 2, R8=시티딘 일인산, R9=R10=R11=R12=R13=H]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 5
50 μg/ml
116%±5.30
12.5 μg/ml 108%±1.20
3.1 μg/ml 141%±1.70
0.77 μg/ml 141%±1.09
0.19 μg/ml 145%±4.89
실시예 16: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 5의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 5
50 μg/ml
116%±0.93
12.5 μg/ml 109%±3.60
3.1 μg/ml 112%±2.59
0.77 μg/ml 109%±1.92
0.19 μg/ml 89%±0.79
실시예 17: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 6의 활성
화합물 6[화학식 2, R8=H, R9=C2H5, R10=R11=H, R12 및 R13= >C(CH3)2]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 6
50 g/ml		 119%±3.17
12.5 μg/ml 125%±1.13
3.1 μg/ml 123%±5.02
0.77 μg/ml 135%±3.27
0.19 μg/ml 140%±1.92
실시예 18: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 6의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 6
50 μg/ml
90%±8.36
12.5 μg/ml 99%±3.17
3.1 μg/ml 121%±2.10
0.77 μg/ml 128%±3.60
0.19 μg/ml 133%±0.88
0.05 μg/ml 127%±1.81
0.012 μg/ml 122%±3.33
0.003 μg/ml 141%±4.70
실시예 19: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 7의 활성
화합물 7[화학식 1, B=H, A=NHCOCH3, R1=R2=R3=R4=COCH3]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 7
50 μg/ml
73%±2.18
12.5 μg/ml 134%±0.81
3.1 μg/ml 103%±1.14
0.77 μg/ml 112%±1.29
0.19 μg/ml 105%±2.01
0.05 μg/ml 128%±1.98
0.012 μg/ml 105%±1.83
0.003 μg/ml 102%±0.62
실시예 20: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 7의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 7
50 μg/ml
54%±0.98
12.5 μg/ml 117%±4.12
3.1 μg/ml 98%±5.65
0.77 μg/ml 99%±1.93
0.19 μg/ml 100%±0.66
0.05 μg/ml 104%±5.85
0.012 μg/ml 103%±4.70
0.003 μg/ml 85%±2.71
실시예 21: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 8의 활성
화합물 8[화학식 1, B=H, A=NHCOCH3, R1=H, R2=R3=R4=COCH3]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 8
50 μg/ml
91%±3.36
12.5 μg/ml 104%±1.95
3.1 μg/ml 109%±2.79
0.77 μg/ml 103%±3.21
0.19 μg/ml 115%±3.52
0.05 μg/ml 109%±1.16
0.012 μg/ml 분석하지 않음
0.003 μg/ml 125%±8.51
실시예 22: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 8의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 8
50 μg/ml
42%±1.55
12.5 μg/ml 81%±0.60
3.1 μg/ml 111%±2.44
0.77 μg/ml 133%±2.09
0.19 μg/ml 96%±1.21
0.05 μg/ml 93%±1.38
0.012 μg/ml 118%±3.19
0.003 μg/ml 129%±1.70
실시예 23: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 9의 활성
화합물 9[화학식 1, A=H, B=NHCOCH3, R1=R2=R3=R4=H]

 세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 9
50 μg/ml
122%±3.21
12.5 μg/ml 119%±3.04
3.1 μg/ml 115%±3.17
0.77 μg/ml 120%±3.14
0.19 μg/ml 121%±2.42
실시예 24: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 화합물 9의 활성
세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 9
50 μg/ml
106%±2.52
12.5 μg/ml 106%±3.49
3.1 μg/ml 108%±3.24
0.77 μg/ml 107%±1.26
0.19 μg/ml 107%±3.41
실시예 25: SAEC 의 생존도의 회복에 대한 D-포도당의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
D-포도당
50 μg/ml
94%±3.04
12.5 μg/ml 103%±1.05
3.1 μg/ml 101%±2.30
실시예 26: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 D-포도당의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
D-포도당
50 g/ml
106%±2.76
12.5 μg/ml 104%±2.13
3.1 μg/ml 107%±3.05
0.77 μg/ml 99%±3.15
0.19 μg/ml 104%±2.96
실시예 27: SAEC 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 1의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1
5 mg/ml
118%±2.15
1.25 mg/ml 121%±3.02
312.5 μg/ml 115%±1.51
78.1 μg/ml 127%±2.30
실시예 28: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 1의 활성

세포 생존도
(평균 ± 표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1
5 mg/ml
116%±2.11
1.25 mg/ml 125%±2.02
312.5 μg/ml 131%±3.04
78.1 μg/ml 128%±1.85
실시예 29: SAEC 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 2의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 2
5 mg/ml		 129%±1.76
1.25 mg/ml 115%±1.38
312 μg/ml 118%±1.95
78.1 μg/ml 135%±2.06
실시예 30: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 2의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 2
5 mg/ml
122%±2.05
1.25 mg/ml 129%±3.13
312.5 μg/ml 118%±2.17
78.1 μg/ml 107%±1.38
실시예 31: SAEC 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 9의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 9
5 mg/ml
3%±2.85
1.25 mg/ml 96%±3.16
312.5 μg/ml 90%±3.28
78.1 μg/ml 100%±2.92
실시예 32: NHBE 의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 9의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 9
5 mg/ml
6%±2.71
1.25 mg/ml 96%±2.42
312.5 μg/ml 95%±2.85
78.1 μg/ml 125%±3.23
실시예 33: SAEC의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 1(85%) 및 화합물 9(15%)의 혼합물의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1 및 9의 혼합물
5 mg/ml
88%±1.82
1.25 mg/ml 91%±2.03
312.5 μg/ml 87%±2.52
78.1 μg/ml 94%±1.91
실시예 34: NHBE의 생존도의 회복에 대한 고농도의 화합물 1(85%) 및 화합물 9(15%)의 혼합물의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1 및 9의 혼합물
5 mg/ml
89%±2.31
1.25 mg/ml 107%±2.48
312.5 μg/ml 105%±2.02
78.1 μg/ml 95%±3.12
실시예 35: SAEC의 생존도의 회복에 대한 화합물 1(85%) 및 화합물 9(15%)의 혼합물의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1 및 9의 혼합물
50 μg/ml
101%±3.41
12.5 μg/ml 107%±3.91
3.1 μg/ml 121%±4.82
0.77 μg/ml 120%±4.11
0.19 μg/ml 115%±4.02
0.05 μg/ml 113%±4.30
0.01 μg/ml 107%±4.12
0.003 μg/ml 108%±4.20
실시예 36: NHBE의 생존도의 회복에 대한 화합물 1(85%) 및 화합물 9(15%)의 혼합물의 활성

세포 생존도
(평균±표준편차, n=3)
대조군(뉴라미니다제로 처리) 100%
화합물 1 및 9의 혼합물
50 μg/ml
121%±2.05
12.5 μg/ml 109%±1.98
3.1 μg/ml 115%±1.76
실시예 37: 기니피그에 대한 기침 실험 [9][10]
웅성 기니피그를 우리에 가두어 사육하였고 물과 음식에 대한 접근을 자유롭게 하였다. 본 연구는 Bio21 연구소 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
24마리의 판단능력이 있는 웅성 하틀레이(Hartley) 기니피그(500~500 g)를 A, B, 및 C의 세 그룹으로 나누고(각 그룹별로 8 마리씩), 뉴라미니다제(Sigma N2133, 동결건조 분말, X 형, 150~400 U/mg 단백질) 5 U/ml 수용액(그룹 B 및 C) 또는 식염수 단독(그룹 A)으로 하루에 한 번 5분간 에어로졸 형태로 전 처리하였다. 그런다음, 1일, 2일 및 3일째에 상기 기니피그에 화합물 1(그룹 C)를 500 mg/kg 투여하거나 물 단독(그룹 A 및 B)을 경구로 투여하였다. 4일째에, 모든 동물에 대하여 0.5 M 구연산 용액을 네뷸라이저로 10분간 노출시킴으로써 접종하였다. 기침 빈도는 1차, 2차 및 3차까지 걸린 시간 그리고 1차 코 문지름까지 걸린 시간으로 15분 동안 기록하였다. 상기 결과는 화합물 1이 뉴라미니다제에 의한 손상을 회복시키는데 도움을 주는 경향을 나타내었다.
기침 빈도 (15분 내)
그룹 A
(식염수 단독, 대조군)

그룹 B
(뉴라미니다제 처리, 음성대조군)

그룹 C
(최초 뉴라미니다제 처리 후 화합물 1을 3일간 처리)
13±2.5


19±2.5


16±2.2

1차 기침 2차 기침 3차 기침
까지 걸린 시간(초)
그룹 A
(식염수 단독, 대조군)

그룹 B
(뉴라미니다제 처리, 음성대조군)

그룹 C
(최초 뉴라미니다제 처리 후 화합물 1을 3일간 처리)
87±10 157±23 200±25


70±11 109±6 150±20


85±15 137±31 220±10
1차 코 문지르기까지 걸린 시간(초)
그룹 A
(식염수 단독, 대조군)

그룹 B
(뉴라미니다제 처리, 음성대조군)

그룹 C
(최초 뉴라미니다제 처리 후 화합물 1을 3일간 처리)
50±4.3


27.7±3.6


49±6.5
화합물 1 대신 화합물 2를 사용하여 동일 실험 프로토콜을 이용하여 시험을 수행한 결과 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
참고문헌
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향후의 특허출원은 본 출원에 대한 우선권에 기반하거나 우선권을 향유하면서 출원될 수도 있다. 이하 청구항들은 실시예의 방법에 의해서만 제공되나 그러한 장래의 출원에서 청구될지도 모르는 범위를 제한할 의도가 아닌 것으로 이해되어야 한다. 발명 또는 발명들을 추가적으로 한정하거나 정교화하기 위해 추후에 특징들이 청구항에 추가되거나 그로부터 생략될 수 있다.
궁극적으로 본 문서에서 강조된 바와 같이, 본 발명의 의미로부터 벗어나지 않는 한 다양한 다른 변형 및/또는 대안이 형성될 수 있다고 이해되어야 한다.

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  12. 하기 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 바이러스 또는 박테리아 감염 후의 손상된 호흡기 세포로부터 야기되는 감기, 급/만성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및 낭포성 섬유종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 호흡기 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물:
    화학식 1의 화합물:
    Figure 112017088181930-pct00038
    (화학식 1)
    [상기 식에서,
    R1, R2, R3는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2Ph, 및 COCR5R6R7로 구성된 군으로부터 선택되며{상기에서, R5, R6, R7는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), C6H5, CH2Ph 및 CH3CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200)로 구성된 군으로부터 선택된다};
    R4는 R1, R2, R3와 동일하거나 다르고, H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2Ph, COCR5R6R7, 및
    Figure 112017088181930-pct00039
    로 구성된 군으로부터 선택되며{상기에서, R5', R6'는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, 및 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기염으로 구성된 군으로부터 선택된다};
    B가 H이고, A가 NHCOCH3, NH2, OH 및 NH2·HX로 구성된 군으로부터 선택되고,
    HX는 약학적으로 적합한 무기 또는 유기염이다];
    및 화학식 2의 화합물:
    Figure 112017088181930-pct00040
    (화학식 2)
    [상기 식에서,
    R8는 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2Ph, COCH2Ph, COCR14R15R16{상기에서, R14, R15, R16는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), C6H5, CH2Ph, 및 CH2CH2(OCH2CH2)mCH3(m=1~200)로 구성된 군으로부터 선택된다}, 시티딜(cytidyl), 시티딘 모노포스포릴(cytidine monophosphoryl), 시티딘 디포스포릴(cytidine diphosphoryl), 시티딘 트리포스포릴(cytidine triphosphoryl), 아데노실(adenosyl), 아데노신 모노포스포릴(adenosine monophosphoryl), 아데노신 디포스포릴(adenosine diphosphoryl) 및 아데노신 트리포스포릴(adenosine triphosphoryl)으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R9는 H, CH3, 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기염 및 CH2CR17R18R19{상기에서, R17, R18, R19는 동일하거나 다르고 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2CH2(OCH2CH2)mCH3(m=1~200), C6H5 및 CH2Ph로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다}로 구성된 군으로부터 선택되며;
    R10, R11, R12는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2Ph, 및 COCR20R21R22{상기에서, R20, R21, R22는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200), C6H5 및 CH2Ph로 구성된 군으로부터 선택된다}일 수 있고;
    R13은 R10, R11, R12와 동일하거나 다를 수 있고 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), CH2Ph, 및 COCR20R21R22{상기에서, R20, R21, R22는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), C6H5 , CH2Ph, CH2PhCH2CH2(OCH2CH2)mCH3 (m=1~200) 및
    Figure 112017088181930-pct00041
    로 구성된 군으로부터 선택된다}로 구성된 군으로부터 선택되며;
    상기에서, R23, R24은 동일하거나 다르고, 각각 선택적으로 H, CH3, (CH2)nCH3 (n=1~20), CH2CH2(OCH2CH2)mCH3(m=1~200), CH2Ph, 및 CH2CR25R26R27 또는 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기염{상기에서, R25, R26, R27는 동일하거나 다르고, 각각 독립적으로 H, CH3, (CH2)nCH3(n=1~20), C6H5 및 CH2Ph로 선택되는 군으로부터 선택된다}으로 구성되는 군으로부터 선택된다].
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화합물은 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid), CMP-시알산(CMP-sialic acid), 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제12항에 있어서,
    상기 화합물은,
    B는 H이고, A는 NHCOCH3이며, R1, R2, R3 및 R4는 각각 H인 화학식 1의 화합물;
    R8, R10, R11, R12 및 R13은 각각 H이고, R9는 Na인, 화학식 2의 화합물;
    R8, R10, R11, R12 및 R13은 각각 H이고, R9는 C2H5인, 화학식 2의 화합물;
    R8은 H이고, R9은 C2H5이며, R10, R11, R12 및 R13은 각각 CH3CO인, 화학식 2의 화합물;
    R8은 시티딘 모노포스포릴이고, R9, R10, R11, R12 및 R13은 각각 H인, 화학식 2의 화합물; 및
    R8, R10, 및 R11은 각각 H이고, R9은 C2H5이며, R12 및 R13은 함께 C(CH3)2인, 화학식 2의 화합물로 구성되는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  19. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 화합물은 흡입에 의해 투여되는, 조성물.
  20. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 화합물은 일일 0.1 mg 내지 500 mg/kg 체중의 범위로 투여되는, 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제20항에 있어서,
    상기 화합물은 일일 0.1 mg 내지 50 mg/kg 체중의 범위로 투여되는, 조성물.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 화합물은 흡입에 의해 투여되는, 조성물.
  25. 제18항에 있어서,
    상기 화합물은 일일 0.1 mg 내지 500 mg/kg 체중의 범위로 투여되는, 조성물.
  26. 삭제
  27. 제25항에 있어서,
    상기 화합물은 일일 0.1 mg 내지 50 mg/kg 체중의 범위로 투여되는, 조성물.
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