KR101832118B1 - Ｄｌｌ4 길항제를 사용하는 당뇨병의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Dll4-Notch 시그널 경로를 차단하는 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 당뇨병의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 피검체에게 투여함에 의해, 당뇨병을 예방하거나 치료하거나 완화시키는 방법을 제공한다. 당뇨병의 마우스 모델에서 관찰된 바와 같이, Dll4 길항제는 조절 T 세포(Treg)의 확장을 통해 췌장섬에 대한 보호 효과를 나타내고 혈당 수준을 저하시키며 자가 항체의 생성을 차단하고 인슐린 및 글루탐산 데카복실라제 65(GAD65)에 대한 항체들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 혈당 수준의 저하를 필요로 하는 피검체에게 투여함에 의해 혈당 수준을 저하시키고/시키거나 자가 항체의 생성을 차단시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 적합한 Dll4 길항제는 Dll4에 특이적으로 결합하고 Dll4-Notch 상호작용을 차단하는 항체 또는 이의 항체 단편, 또는 Dll4의 세포외 도메인 등을 포함한다.

Description

ＤＬＬ4 길항제를 사용하는 당뇨병의 치료 방법{METHODS OF TREATING DIABETES WITH DLL4 ANTAGONISTS}
본 발명은 델타-유사 리간드 4(Dll4) 길항제를 사용하여, 조절 T 세포(Treg 세포 또는 Treg) 수의 증가가 이로운 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 Dll4 길항제를 이용하여 Dll4의 Notch 수용체로의 결합을 차단함으로써 Treg의 수를 증가시킴에 의해 당뇨병을 예방하거나 치료하거나 완화시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 Dll4 길항제를 이용하여 혈당 수준을 저하시키거나, 각각 인슐린 및 글루탐산 데카복실라제 65(GAD65)에 대한 항체들을 포함하는, 자가 항체의 생성을 감소시키거나 차단시키는 방법에 관한 것이다.
Notch 수용체와 이의 리간드간의 상호작용은 조혈 및 흉선 발육에서 세포 운명의 결정뿐만 아니라 계통 결정을 조절하는데 중요한 진화적으로 보존된 경로를 나타낸다(문헌 참조: Artavanis-Tsakonas et al., 1999, Science 284:770-776; Skokos et al., 2007; J Exp Med 204:1525-1531 ; 및 Amsen et al., 2004, Cell 1 17:515-526). 최근에 Dll4-Notch1 억제가, 흉선 내에서 전구-T 세포로부터 수지상 세포(DC) 운명 전환시 발생할 수 있는 B 세포의 이소성 출현 및 수지상 세포(DC)의 확장을 수반하는 T 세포 발육을 완전히 차단시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 참조: Hozumi et al., 2008, J Exp Med 205(11):2507-2513; Koch et al., 2008, J Exp Med 205(11):2515-2523; 및 Feyerabend et al., 2009, Immunity 30:1-13). 따라서, Notch 시그널링이 조혈 전구 세포로부터 세포 운명 결정을 위해 중요하다는 증거가 축적되고 있다. 또한, 생체내 DC에 의한 조절 T 세포(Treg) 항상성의 피드백 제어가 밝혀졌다(문헌 참조: Darrasse-Jeze et al., 2009, J Exp Med 206(9):1853-1862). 그러나, DC의 기원 및 발육을 제어하고 결과적으로 Treg 항상성을 제어하는데 있어서의 Notch 시그널링의 역할은 여전히 밝혀지지 않았다. 이것은 Treg 확장을 유도하는 신규 방법을 동정하는 것이 자가면역 질환 및 장애의 치료로서 사용될 수 있기 때문에 임상적으로 중요한 과제이다.
사람 Dll4(hDll4)의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타낸다. Dll4 길항제 및 이들의 용도는 문헌[참조: WO 2007/143689, WO 2007/070671, WO 2008/076379, WO 2008/042236, 및 WO/2008/019144]에 기재되어 있다.
본 발명은 부분적으로 Dll4에 특이적으로 결합하여 Dll4가 Notch 수용체에 결합하는 것을 차단하는 항체가, 사람 다발성 경화증에 대한 동물 모델인 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 진행을 완전히 예방할 수 있지만 대조군 항체는 EAE를 차단시키지 않는다는 본 발명자의 관찰을 기초로 한다. 또한, 본 발명자는 항-Dll4 항체의 상기 효과가 Treg 세포의 증가된 수와 연관됨을 발견하였다. 추가로, 항-Dll4 항체가, 1형 당뇨병에 대한 동물 모델인 NOD/ShiLtJ 마우스에서 혈당 수준의 증가를 차단하고 췌장 섬의 수 및 형태를 유지하고 상기 효과가 적어도 부분적으로 Treg의 확장에 의해 매개된다는 것이 관찰되었다.
따라서, 제1 양상에서, 본 발명은, 유효량의 Dll4 길항제를 Treg 세포의 수의 증가를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, Treg 세포의 수를 증가시키는 방법을 특징으로 하고, 여기에서 상기 Dll4 길항제는 Dll4와 Notch 수용체간의 상호작용을 차단하고 Treg 세포의 수는 증가한다.
제2 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 Treg 세포수의 증가가 이로운 질환, 장애 또는 병태의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, Treg 세포수의 증가가 이로운 질환, 장애 또는 병태를 예방하거나 치료하거나 완화시키는 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애는, Dll4 활성을 제거하거나 억제하거나 감소시킴에 의해, 치료된 피검체에서 Treg 세포의 수를 증가시킴으로써 이로운, 즉 개선되거나 완화되거나 억제되거나 예방되는 임의의 질환, 장애 또는 병태이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 상기 질환 또는 장애 중 하나는 당뇨병, 즉 1형 및 2형의 진성 당뇨병이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 1형 또는 2형 진성 당뇨병의 예방, 치료 또는 완화를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, 1형 또는 2형 진성 당뇨병을 예방하거나 치료하거나 완화시키는 방법을 제공한다.
제3 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 혈당 수준의 저하를 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, 혈당 수준을 저하시키는 방법을 특징으로 한다.
제4 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 Dll4 길항제를 자가-항체 생성의 감소 또는 차단을 필요로 하는 피검체에게 투여함을 포함하는, 자가-항체의 생성을 감소시키거나 차단시키는 방법을 특징으로 한다. 자가-항체는 인슐린에 대한 항체 및 GAD65에 대한 항체 등을 포함할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 상기된 본 발명의 방법 중 어느 하나에 사용될 Dll4 길항제는 고친화성으로 Dll4에 특이적으로 결합하여 Dll4의 Notch 수용체로의 결합을 차단하고/하거나 Dll4-Notch 시그널 경로를 차단하는 Dll4 항체 또는 이의 단편("항-Dll4 Ab" 또는 "Dll4 Ab")이다. 상기 항체는 폴리클로날, 모노클로날(mAb), 키메라, 사람화 또는 완전한 사람 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 상기 항체 단편은 단일쇄 항체, Fab 또는 (Fab')2일 수 있다.
하나의 실시형태에서, Dll4 Ab 또는 이의 항원 결합 단편은 hDll4(서열번호 2)의 N-말단 도메인(잔기 S27-R172), 또는 Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) 도메인(잔기 V173-C217), 또는 N-말단-DSL 도메인(잔기 S27-C217) 내의 에피토프와 결합한다. 다른 실시형태에서, Dll4 Ab 또는 이의 항원 결합 단편은 EGF 도메인 중 하나의 도메인 내의 에피토프, 즉, hDll4(서열번호 2)의 아미노산 잔기 Q218-N251(도메인 1), E252-D282(도메인 2), D284-E322(도메인 3), E324-E360(도메인 4), S362-E400(도메인 5), K402-E438(도메인 6), H440-E476(도메인 7), 또는 S480-E518(도메인 8)에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 상기 열거된 하나 이상의 에피토프에 관여하는 입체구조적 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 Dll4 Ab 또는 이의 단편은 고친화성으로 사람 Dll4에 결합할 수 있고 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 약 1 nM 이하, 약 500 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하, 또는 약 50 pM 이하의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다.
하나의 실시형태에서, Dll4 Ab 또는 이의 단편은, 각각 서열번호 22, 24 및 26의 아미노산 서열을 갖는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 단편은, 각각 서열번호 30, 32 및 34의 아미노산 서열을 갖는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다. 다른 실시형태에서, Dll4 Ab 또는 이의 단편은 서열번호 22, 24, 26, 30, 32 및 34의 CDR 서열 조합을 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, Dll4 Ab는 서열번호 20 또는 116의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 또는 서열번호 28 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 Dll4 Ab는 서열번호 20/28(REGN281) 또는 116/118(REGN421)의 HCVR/LCVR 조합체를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 Dll4 Ab는, 각각 서열번호 6/8/10 및 서열번호 14/16/18; 각각 서열번호 38/40/42 및 서열번호 46/48/50; 각각 서열번호 54/56/58 및 서열번호 62/64/66; 각각 서열번호 70/72/74 및 서열번호 78/80/82; 각각 서열번호 86/88/90 및 서열번호 94/96/98; 및 각각 서열번호 102/104/106 및 서열번호 110/112/114로부터 선택되는 중쇄 CDR1/CDR2/CDR3 조합체 및 경쇄 CDR1/CDR2/CDR3 조합체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 Dll4 Ab는 서열번호 4, 36, 52, 68, 84, 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 HCVR 또는 서열번호 12, 44, 60, 76, 92, 또는 108의 아미노산 서열을 포함하는 LCVR을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 Dll4 Ab는 서열번호 4/12(REGN279); 서열번호 36/44(REGN290); 서열번호 52/60(REGN306); 서열번호 68/76(REGN309); 서열번호 84/92(REGN310); 및 서열번호 100/108(REGN289)로부터 선택되는 HCVR/LCVR 조합체를 포함한다.
서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 및 118의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 및 117로 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 적합한 상기 Dll4 길항제는 하나 이상의 가용성 Notch 수용체 또는 Dll4에 결합할 수 있는 이의 단편을 포함하는, 다량체화 성분에 융합된 융합 단백질이다. 하나의 실시형태에서, 가용성 Notch 수용체는 사람 Notch1 또는 Notch4이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 Dll4 길항제는 Notch 수용체(들)에 결합할 수 있는 변형된 Dll4 단백질이지만 상기 결합은 수용체(들)를 활성화시키지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 Dll4 길항제는 예를 들어, 사람 IgG의 Fc 도메인인 면역글로불린 도메인과 같은 다량체화 성분에 융합된 Dll4의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 실시형태에서, Dll4 길항제는 Dll4-Notch 상호작용을 차단할 수 있는 소분자 및 기타 제제를 포함한다.
제5 양상에서, 본 발명은, Dll4 길항제가 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 혈당 저하제(예를 들어, 인슐린, 인슐린 유사체 등), 면역억제성 제제 또는 면역억제제, 소염제, 진통제 등(이들 중 많은 제제는 서로 중첩된 치료학적 효과를 가질 수 있다)와 동시에 또는 연속적으로 공동투여되는 상기된 임의의 방법을 특징으로 한다. Dll4 길항제와 조합하여 사용될 적합한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 인터페론 β(IFN-β), 타크롤리무스, 시롤리무스, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 오피오이드, 마이코페놀레이트, TNF-결합 단백질, 예를 들어, 인플릭시마브, 에터나셉트, 아달리무마브 등, 세포독성 항생제, 예를 들어, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신 등, 면역 세포 표적화 항체, 예를 들어, 항-CD20 항체, 항-CD3 항체 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 항-Dll4 길항제와의 병용 치료요법을 위한 적합한 소염제 및/또는 진통제는 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센 등, TNF-α 길항제, IL-1 길항제, IL-6 길항제, 아세트아미노펜, 모르피노 모사체 등을 포함한다.
제6 양상에서, 본 발명은 Dll4 길항제, 하나 이상의 추가의 치료제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 하나의 실시형태에서, 상기 Dll4 길항제는 고친화성으로 Dll4에 특이적으로 결합하여 Dll4 활성을 중화시키는 Dll4 Ab 또는 이의 단편이고, 하나 이상의 추가의 치료제는 상기된 혈당 저하제, 면역억제제, 소염제, 진통제 등 중 어느 하나이다.
제7 양상에서, 본 발명은 사용 지침서와 함께 본 발명의 약제학적 조성물 및 패키지 삽입체를 포함하는 컨테이너(container)를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 하나의 실시형태에서, 키트는 그 안에 hDll4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 컨테이너 및 그 안에 상기된 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 다른 컨테이너를 포함할 수 있다.
다른 목적 및 이점은 하기 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 T 세포 및 B 세포의 발육에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. 마우스에 항-Dll4 항체(REGN577) 또는 대조군 사람 Fc 단편(hFc)를 주사하였다. 14일 후, 흉선을 수거하고 T-세포 및 B-세포 서브세트는 유동 세포측정으로 평가하였다. 도 1a: 도트 플롯은 CD4-CD8-(이중 네거티브 흉선 전구체 또는 "DN"), CD4+CD8+(이중 포지티브 흉선 전구체 또는 "DP"), CD4+ 또는 CD8+(단일 포지티브 흉선 전구체 또는 "SP"), 및 DN/CD44+CD25-(DN1 단계에서 흉선 전구체) T 세포의 수를 보여준다. 도트 플롯의 수는 총 흉선 세포에서dml T 세포 아집단의 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다. 도 1b: 히스토그램은 DN1 세포(즉, CD4-CD8-CD44+CD25- 상에 게이팅된 세포)에서의 B 세포(B220+)의 백분율[%](평균 ± SD)을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 골수에서의 B 세포 발육 단계에 대한 Dll4 차단 효과(도 2a) 및 비장에서의 B 세포 항상성에 대한 Dll4 차단 효과(도 2b)를 보여준다. 상기 도트 플롯의 수는 골수 또는 비장에서의 총 세포 중에 B 세포 서브세트의 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다. GC: 배아 중심(Germinal center) B 세포; T1 및 T2: B 세포 서브세트; M: 변연 B 세포; 및 Fo: 여포성 B 세포.
도 3a 내지 도 3d는 수지상 세포(DC) 발육에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. 도 3a: 도트 플롯은 항-Dll4 Ab 치료시 흉선에서 통상적인 DC("cDC"; B220-CD11C+)의 확장 및 형질세포양(plasmacytoid) DC("pDC"; PDCA1+B220+CD11C+)의 확장을 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 14일째에 총 세포 중의 DC의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다. 도 3b: 막대 그래프는 Dll4 Ab-치료된 마우스(■) 및 hFc-대조군 치료된 마우스(□)의 흉선에서 cDC 및 pDC 확장의 역학을 보여준다. 도 3c: 도트 플롯은 흉선에서 전구-DC(MHCIIloCD11cintCD135+Sirp-αint) 및 후기 전구-DC(MHCIIloCD11cint)에 대한 Dll4 Ab의 효과를 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 14일째에 총 세포 중의 전구-DC의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다. 도 3d: 도트 플롯은 hFc 대조군 Ab로 치료된 마우스의 흉선에서가 아니라 Dll4 Ab로 치료된 마우스의 흉선에서 DN1(CD4-CD8-CD44+CD25-) 전구-T 세포 집단내 MHCIIloCD11cint DC의 존재를 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 3일째에 DN1 전구-T 세포 집단 중에서 MHCIIloCD11cint DC의 평균 수(평균 ± SEM)를 나타낸다.
도 4는 통상적인 T/DC DN1 전구체로부터 기원하는 비성숙 DC(imDC)로의 흉선내 또 다른 DC 계통의 발육에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. DN1CD45.1+Lin-로 분류된 세포는 Dll4 Ab(■) 또는 hFc 대조군 Ab(□)로 치료된 CD45.2+ 숙주 마우스의 흉선 내로 전달하였다.
도 5는 DC 발육에 관여하는 주요 사이토킨인 CSF-1(M-CSF)의 혈청 수준에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. 미치료되거나(▧) 이소형 대조군 Ab(□), 또는 Dll4 Ab(■)로 치료된 마우스의 혈청 CSF-1 수준을 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정하였다.
도 6은 타목시펜 치료시, 타목시펜-유도성 Cre 재조합효소 작제물 CreERT2를 함유하는 DLL4COIN 마우스에서 B 세포 및 DC 항상성에 대한 유전학적 Dll4 결실 효과를 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 흉선에서의 총 세포 중에서 B 세포, 및 pDC와 cDC 둘 다의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 Treg 항상성에 대한 Dll4 차단/결실 효과를 보여준다. 도 7a: 도트 플롯은 hFc 대조군 Ab로 치료된 마우스와 비교하여 2주 동안 Dll4-Ab로 치료된 마우스의 흉선 내에서 Treg의 확장을 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 흉선 내의 CD3+CD4+ T 세포 중에서 Treg의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다. 도 7b: 막대 그래프는 각각 Dll4 Ab(■) 및 hFc 대조군 Ab(□)로 치료된 마우스의 흉선(상부 패널) 및 비장(하부 패널)에서의 Treg 발육의 역학을 보여준다. 도 7c: 도트 플롯은 옥수수유 대조군으로 치료된 대조군 Dll4COIN과 비교하여 타목시펜(TAM)으로 치료된 DLL4COIN 마우스의 흉선 내의 Treg의 확장을 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 흉선 내의 CD3+CD4+ T 세포 중에서 Treg의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 2주 동안 주당 2회 Dll4-Ab (REGN421) 치료(1 mg/kg 또는 5 mg/kg) 또는 hFc 치료(5 mg/kg) 후 7일 및 14일째 및 치료 중지 후 28일째에 관찰된 사람 Dll4(hDll4)를 발현하는 마우스의 흉선 내의 DC(도 8a) 및 Treg 항상성(도 8b)에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. 도트 플롯에서의 수는 흉선 내의 총 세포 중에서 pDC 및 cDC(도 8a) 또는 Treg(도 8b)의 평균 백분율[%](평균 ± SEM)을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 마우스 모델에서의 Dll4 차단 효과를 보여준다. 도 9a: 그래프는 치료 그룹 당 EAE 질환 발병률을 보여준다. 도 9b: 그래프는 평균 질환 스코어를 기준으로 하는 EAE의 발병을 보여준다. 항-Dll4 Ab(REGN577) 사전-유도(▼); 이소형 대조군 Ab 사전-유도(◆); REGN577 후-유도(▲); 또는 항-VLA-4 Ab(PS/2) 사전-유도(■)로 치료하였다.
도 10은 EAE 마우스의 림프절에서 IL-17 및 IFN-γ 생산에 대한 Dll4 차단 효과를 보여준다. Dll4 Ab(■) 또는 hFc 대조군 Ab(□) 로 치료된 EAE 마우스의 림프절에서 IL-17(좌측 패널) 및 IFN-γ(우측 패널)의 수준은 ELISA로 12일 및 18일째에 측정하였다.
도 11a 내지 도 11e는 NOD 마우스 당뇨 모델에서 Dll4 Ab의 효과를 보여준다. 도 11a는 9주령에서 hFC 대조군 Ab(●) 또는 항-Dll4 Ab(REGN577)(■) 중 어느 하나를 투여받은 마우스 중에서 당뇨 발병률[%](2개 연속 혈당 수준의 판독은 250mg/dL를 초과한다)을 보여준다. 20주째에 Dll4 Ab로 치료되고 이어서 PC61 Ab가 주사된 5마리 마우스의 당뇨 발병률[%]도 나타낸다(◆). PC61 Ab는 항-CD25 항체이고 Treg 세포를 고갈시킨다. 도 11b는 미치료된 야생형(WT) 마우스와 비교하여 Dll4 Ab 또는 hFc 대조군으로 치료된 NOD 마우스에서 항-인슐린 자가항체(□) 및 항-글루탐산 데카복실라제 65(GAD65) 자가항체(■) 생산의 ELISA에 의한 측정을 보여준다. 도 11c는 Dll4 Ab(좌측 패널) 또는 hFc 대조군(우측 패널)로 치료된 NOD 마우스의 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색된 췌장 부분을 보여준다. 검은 화살표는 개별 췌장섬을 나타내고 백색 화살표는 상기 췌장섬(우측 패널) 내 침윤 세포를 나타낸다. 도 11d는 hFc 대조군-치료된(□) 또는 Dll4 Ab-치료된(■) 마우스의 췌장에서 췌장섬의 수(좌측 패널) 또는 침윤된 췌장섬의 백분율[%](우측 패널)을 보여준다. 도 11e는 치료 후 42일 이상 동안에 질환 개시시 Dll4 Ab(●) 또는 hFc 대조군(□)으로 치료된 마우스내 혈당 수준의 변화를 보여준다.
본 발명의 방법을 기술하기 전에, 본 발명은 상기 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문에 기재된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기재할 목적인 것이고, 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야만 하며, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서 제한될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 명백히 달리 언급되지 않는 경우 복수 개념을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 방법("a method")에 대한 언급은 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계들을 포함하고 이는 본원의 기재를 숙지했을 때 당업자에게 자명할 것이다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만 지금부터 바람직한 방법 및 재료를 기재한다. 본원에 언급된 모든 공보는 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다.
정의
본원에 사용된 용어 "Dll4 길항제"는 Dll4의 Notch 수용체(예를 들어, Notch 1 및 Notch 4)로의 결합을 차단하고/하거나 Dll4-Notch 시그널 경로를 차단할 수 있는 Dll4에 대한 항체 및 이의 단편(문헌 참조: 예를 들어, WO 2008/076379), 다량체화 성분에 융합된 Dll4의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질 또는 이의 단편(문헌 참조: 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2006/0134121호 및 제2008/0107648호), Dll4와 Notch 수용체간의 상호작용을 차단하는 펩타이드 및 펩티바디(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,138,370호) 등을 포함한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 용어는 또한 Notch 수용체에 특이적으로 결합하여(예를 들어, 항-Notch 1 항체, 항-Notch 4 항체 등) Dll4-Notch 시그널 경로를 차단하는 소분자, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등과 같은 길항제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉, 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 언급하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인인 CL로 이루어진다. 상기 VH 및 VL 영역은 추가로 골격 영역(FR)으로 칭하는 보다 보존된 영역과 함께 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리우는 초가변성 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고 이들은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 하기의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에 CDR을 동정하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열내 CDR을 동정하기 위해 적용될 수 있다. CDR의 경계선을 동정하기 위해 사용될 수 있는 통상적인 방법은 캐뱃(Kabat) 정의, 초티아(Chothia) 정의 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 용어에서, 상기 캐뱃 정의는 서열 가변성을 기초로 하고, 초티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 하고 AbM 정의는 캐뱃 및 초티아 접근법 간의 절충된 방법이다. 예를 들어, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)를 참조한다. 항체 내 CDR 서열을 동정하기 위한 공공의 데이터베이스가 또한 사용가능하다.
하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 제거가 또한 가능하다. 항체는 과학적 문헌에서 1개 또는 2개의 CDR이 결합을 위해 배치될 수 있는 것으로 보고되었다. Padlan 등(문헌 참조: Padlan et al, (1995 FASEB J. 9:133-139))은 공개된 결정 구조를 기준으로 항체와 이의 항원간의 접촉 영역을 분석하였고 단지 CDR 잔기의 약 5분의 1 내지 3분의 1이 실제로 항원과 접촉하는 것으로 결론지었다. 또한, Padlan은 1개 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하는 어떠한 아미노산도 갖지 않는 많은 항체를 발견하였다(문헌 참조: Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
항원과 접촉하지 않은 CDR 잔기는 분자 모델링 및/또는 경험에 의해 초티아 CDR 외부에 존재하는 캐뱃 CDR 영역으로부터, 이전의 연구를 기초로 (예를 들어, CDRH2 내의 잔기 H60-H65는 흔히 요구되지 않는다) 동정될 수 있다. CDR 또는 이의 잔기(들)이 제거된 경우 이것은 일반적으로 다른 사람 항체 서열 또는 상기 서열의 컨센서스에서 상응하는 위치를 차지하는 아미노산으로 치환된다. CDR내 치환을 위한 위치 및 치환할 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다. 경험적 치환은 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다.
상기 용어 "항체"는 또한 변형된 당화 패턴을 갖는 항체를 포함한다. 몇몇 응용에서, 목적하지 않는 당화 부위를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 예를 들어, 퓨코스 모이어티는 항체 의존성 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 제거된다(문헌 참조: Shield et al. (2002) JBC 277:26733). 다른 응용에서, N-당화 부위의 제거는 치료학적 항체에 대해 목적하지 않은 면역 반응을 감소시킬 수 있거나 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 응용에서, 당화의 변형은 보체 의존성 세포독성(CDC)를 변형시키기 위해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 단편"( 또는 단순히 "항체 단편")은 hDll4 또는 임의의 다른 의도된 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 언급한다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일쇄 Fv (scFv) 분자, dAb 단편, 항체의 초가변 영역을 모사하는 아미노산 잔기로 이루어진 소형 인지 단위(예를 들어, CDR 또는 분리된 CDR을 함유하는 단편)을 포함할 수 있다. 다른 가공된 분자, 예를 들어, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 미니바디가 또한 본원에 사용된 바와 같은 표현 "항원-결합 단편"에 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 세포독소, 화학치료학적 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소와 같은 치료학적 모이어티("면역접합체")에 접합될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 것이다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 골격 서열에 인접하거나 이의 프레임내에 있는 하나 이상의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, 상기 VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 상대적으로 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 하나 이상의 불변 도메인에 공유 결합된 하나 이상의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불면 도메인의 비제한적인 예시적 배열(configuration)은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1 ; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1 -CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (x) VL- CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 열거된 예시적 배열 중 어느 하나를 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 배열에서, 상기 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 완전 또는 부분적 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 2개 이상(예를 들어, 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인간에 가요성 또는 반-가요성 연결을 유도한다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로간에 비-공유 연합되고/되거나 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과 연합된(예를 들어, 디설파이드 결합(들)에 의해) 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 배열 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전한 항체 분자와 관련하여, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다특이적(예를 들어, 이특이적)일 수 있다. 항체의 다특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 2개 이상의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이고, 여기에서, 각각의 가변 도메인은 분리된 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원상에 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 임의의 다특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용가능한 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편으로 사용하기 위해 조정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "사람 항체"는 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 mAb는 사람 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되어 있지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어, CDR 및 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "사람 항체"는, 다른 포유동물 종(예를 들어, 마우스)의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 FR 서열상으로 절편이식된(grafted) mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 기재된 완전한 사람 항-Dll4 항체는 상응하는 생식선 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 골격 및/또는 CDR 영역내에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이는 예를 들어, 공공의 항체 서열 데이터베이스로부터 이용가능한 생식선 서열에 대해 본원에 기재된 아미노산 서열을 비교함에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유도된 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기에서, 하나 이상의 골격 및/또는 CDR 영역내 하나 이상의 아미노산은 항체가 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들), 또는 다른 사람 생식선 서열의 상응하는 잔기(들) 또는 상기 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존성 아미노산 치환으로 돌연변이된다(상기 서열 변화는 본원에서 총체적으로 "생식선 돌연변이"로 언급된다). 당업자라면, 본원에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 시작으로 하나 이상의 개별 생식선 역-돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원-결합 단편을 용이하게 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인내 골격 및/또는 CDR 잔기 모두는 항체가 유도된 본래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기로 역 돌연변이된다. 다른 실시형태에서, 특정 잔기만이 본래의 생식선 서열로 역 돌연변이되고, 예를 들어, FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서만 돌연변이된 잔기가 발견되거나 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서만 돌연변이된 잔기가 발견된다. 다른 실시형태에서, 골격 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 본래 유도된 생식선 서열과는 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 골격 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식선 돌연변이 중 임의의 조합을 포함할 수 있고, 예를 들어, 여기에서, 특정 개별 잔기들은 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되고 본래의 생식선 서열과는 상이한 특정 다른 잔기들은 유지되거나 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 일단 수득된, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은 하나 이상의 목적하는 성질, 예를 들어, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 개선되거나 증진된 길항성 또는 효능성 생물학적 성질(경우에 따라), 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 상기 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 보존성 치환을 갖는, 본원에 기재된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 항-Dll4 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 기재된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나에 비해, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 2개 이하 또는 1개의 보존성 아미노산 치환(들)을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-Dll4 항체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, HCVR은 10개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, HCVR은 8개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, HCVR은 6개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, HCVR은 4개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, HCVR은 2개 또는 1개의 보존성 아미노산 치환(들)을 갖는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시형태에서, LCVR은 10개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, LCVR은 8개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, LCVR은 6개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, LCVR은 4개 이하의 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, LCVR은 2개 또는 1개의 보존성 아미노산 치환(들)을 갖는 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함한다.
"중화" 또는 "차단" 항체는 Dll4에 결합하여 Dll4의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 언급하는 것으로 의도된다. Dll4의 생물학적 활성의 상기 억제는 Dll4 생물학적 활성의 하나 이상의 지표(indicator)를 측정함에 의해 평가할 수 있다. Dll4 생물학적 활성의 상기 지표는 당업계에 공지된 수개의 시험관내 또는 생체내 표준 검사 중 하나 이상에 의해 평가할 수 있다. 예를 들어, Dll4 활성을 중화시키는 항체의 능력은 Notch 수용체로의 Dll4의 결합 억제에 의해 평가한다. 또한, 상기 용어는 또한 Notch 1 및 Notch 4와 같은 다른 표적에 대한 항체에 적용될 수 있고, 상기 항체는 표적의 생물학적 활성을 억제하여 Dll4-Notch 상호작용 또는 시그널 경로를 억제한다.
상기 용어 "특이적으로 결합하는" 등은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 생리학적 조건하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성함을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하의 평형 해리 상수(예를 들어, 보다 작은 KD는 보다 강한 결합을 나타낸다)를 특징으로 할 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 결합하는지를 측정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나 hDll4에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 기원의 Dll4 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 나타낼 수 있다. 또한, 그럼에도 불구하고, hDll4 및 하나 이상의 추가의 항원에 결합하는 다-특이적 항체(예를 들어, 이특이적)는 본원에 사용된 바와 같이 hDll4에 "특이적으로 결합하는" 항체로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 언급하는 것으로 의도된다.
용어 "결합 친화성" 항체는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화성 ELISA에 의한 측정시 약 1 nM이하, 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 또는 약 100 pM 이하, 또는 약 50 pM 이하의 KD로 Dll4에 결합하는 항체를 언급한다.
본원에 사용된 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들어, BIACORE™ 시스템(제조원: Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출함에 의해 실시간 생체특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 언급한다.
용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브세트이고 상호작용의 친화성에 직접 기여하는 잔기들을 갖는다. 에피토프는 또한 입체구조적, 즉 비선형 아미노산으로 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹 또는 설포닐 그룹과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹인 결정인자를 포함할 수 있고, 특정 실시형태에서 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 전형적으로 고유 공간적 형태에서 3개 이상, 일반적으로 5개 이상 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료한다"는 달리 지적되지 않는 경우 예방학적(또는 예방적) 및 치료학적 과정 둘 다를 의미하는 것으로 의도된다. 치료를 필요로 하는 피검체는 특정 병태, 장애 또는 질환이 발병된 피검체 뿐만 아니라 상기 병태, 장애 또는 질환을 발병할 성향이 있거나 이에 민감성이고 예방학적 과정에 의해 이로움을 받아 치료 부재의 피검체와 비교하여, 발병한 경우 상기 병태, 장애 또는 질환의 존재 또는 재발 또는 진행이 감소된 피검체도 포함한다.
용어 "치료학적 유효량", "예방학적 유효량" 또는 "유효량"은 투여되었을때 목적하는 효과를 생성시키는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적, 치료될 피검체의 연령 및 크기, 투여 경로 등에 의존할 것이고, 당업자가 공지된 기술을 사용하여 확인할 수 있을 것이다(문헌 참조: 예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
일반적 기재
본 발명은 부분적으로 Dll4-특이적 항체에 의한 Dll4의 차단이 Treg 세포 수를 증가시켜 이에 따라 마우스에서 EAE 또는 당뇨병의 진행을 예방하거나 감소시키거나 지연시킨다는 발견을 기초로 한다. 재조합 사람 Dll4 Ab를 포함하는 완전한 사람 Dll4 Ab의 기재에 대해 국제 특허 공개공보 제 WO 2008/076379를 참조한다.
치료학적 투여 및 제형
본 발명은 Dll4 Ab와 같은 Dll4 길항제를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, Treg 세포 수의 증가가 이로운 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하거나 경감시키는 방법을 제공한다. Dll4 길항제를 포함하는 약제학적 조성물은 추가로 면역억제제, 소염제, 진통제, 혈당 저하제 등(하기 섹션 참조)과 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 치료학적 조성물은 개선된 이동, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형내로 혼입되는 적합한 담체, 부형제 및 기타 제제와 함께 투여될 수 있다. 다수의 적당한 제형은 모든 약제학적 화학자에게 공지된 문헌에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이들 제형은 예를 들어, 산제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포(예를 들어 LIPOFECTIN™), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
전신 투여를 위해, 치료학적 유효 용량은 처음에 시험관내 검사로부터 평가될 수 있다. 예를 들어, 용량은 동물 모델에서 형성되어 세포 배양물에서 측정되는 IC50을 포함하는 순환계 농도 범위를 성취할 수 있다. 상기 정보를 사용하여 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 초기 용량은 또한 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들어, 동물 모델로부터 평가될 수 있다. 당업자는 동물 데이터를 기준으로 사람 투여용으로 용이하게 최적화할 수 있다.
상기 용량은 투여될 피검체의 연령 및 크기(예를 들어, 체중 또는 체표면적), 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. Dll4 길항제, 특히 Dll4 항체의 전신 투여를 위해, 정맥내 투여를 위한 전형적인 용량 범위는 하루 용량으로 체중 kg당 약 0.01 내지 약 100mg, 약 0.1 내지 약 50mg 또는 약 0.2 내지 약 10mg이다. 피하 투여를 위해, 항체는 적어도 하루 1 내지 5회, 적어도 주당 1 내지 5회 또는 적어도 1개월당 1 내지 5회로 적어도 약 25 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 125 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 175 mg/ml, 약 200 mg/ml, 또는 약 250 mg/ml의 항체 농도에서 약 1 mg 내지 약 800 mg, 약 10 mg 내지 약 500 mg, 약 20 mg 내지 약 400 mg, 약 30 mg 내지 약 300 mg, 또는 약 50 mg 내지 약 200 mg으로 투여될 수 있다. 대안으로, 상기 항체는 처음에 정맥내 주사에 이어서 연속적 피하 투여를 통해 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 미세입자, 미세캡슐내 캡슐화, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도시토시스(endocytosis)가 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다(문헌 참조: 예를 들어, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 상기 조성물은 임의의 간편한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 일시 주사, 상피 또는 점막성 라이닝(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 대장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 또한 소포체, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(문헌참조: Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적 주석 참조).
특정 상황에서, 상기 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다(문헌 참조: Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있고, 이는 문헌(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974))를 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 제어된 방출 시스템은 조성물의 표적에 인접하게 위치할 수 있어 단지 전신성 용량의 일부를 필요로 한다(문헌 참조: 예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984).
주사용 제제는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 적가 주입 등에 대한 용량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사용 제제는 대중에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는 예를 들어, 상기된 항체 또는 이의 염을, 통상적으로 주사용으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질 중에 용해시키거나 현탁시키거나 유화시킴에 의해 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서 예를 들어, 생리식염수, 글루코스 및 다른 보조제 등을 함유하는 등장성 용액이 있고 이는 알콜(예를 들어, 에탄올), 폴리알콜(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 캐스터 오일의 폴리옥시에틸렌(50 mol) 부가물)] 등과 같은 적당한 가용화제와 함께 사용될 수 있다. 유성 매질로서, 예를 들어, 참깨유, 대두유 등이 사용되고 이것은 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 함께 사용될 수 있다. 이와 같이 제조된 주사제는 바람직하게 적당한 앰플에 충전시킨다. 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용된다. 상기 펜 전달 장치는 재사용할 수 있거나 1회용일 수 있다. 재사용될 수 있는 펜 전달 장치는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 대체가능한 카트리지를 사용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비워진 상태가 되면, 빈 카트리지는 용이하게 폐기되거나 상기 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체할 수 있다. 이어서, 상기 펜 전달 장치는 재사용할 수 있다. 1회용 펜 전달 장치에서는 어떠한 대체가능한 카트리지가 없다. 오히려, 1회용 펜 전달 장치는 장치 내 저장소에 유지된 약제학적 조성물로 미리 충전된다. 일단 저장소에 약제학적 조성물이 비워진 상태이면 전체 장치가 폐기된다.
많은 재사용가능한 펜 및 자가주사기 전달 장치는 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 단지 일부를 언급하자면 이의 예는 AUTOPEN™(제조원: Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜(제조원: Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(제조원: Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III(제조원: Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™(제조원: Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜(제조원: Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™(제조원: sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 1회용 펜 전달 장치의 예는 SOLOSTAR™ 펜(제조원: sanofi-aventis), FLEXPEN™(제조원: Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(제조원: Eli Lilly)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
유리하게, 상기된 경구 또는 비경구용 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞게 적합화된 단위 용량의 투약 형태로 제조된다. 단위 용량으로의 상기 투약 형태는 예를 들어, 정제, 환제, 캅셀제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 함유된 Dll4 항체와 같은 Dll4 길항제의 양은 일반적으로 단위 용량으로의 투약 형태당, 특히 주사 형태로 약 0.1 내지 약 800 mg이고 항체가 다른 투약 형태를 위해 약 5 내지 약 100 mg으로 및 약 10 내지 약 250mg으로 함유되는 것이 바람직하다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물을 치료가 요구되는 영역으로 국소적으로 투여되는 것이 바람직할 수 있고 이것은 예를 들어, 제한 없이 수술동안에 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어, 주사, 카테터 또는 시알라스틱 막(sialastic membrane), 섬유 또는 상업적 피부 대용물을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질로 이루어진 이식체에 의해 성취될 수 있다.
병용 치료요법
본 발명의 치료학적 방법에서, Dll4 길항제는 단독으로 제공되거나 면역억제성 제제 또는 면역억제제, 소염제, 진통제, 직접적 또는 간접적 혈당 저하제 등과 같은 하나 이상의 추가의 치료제와 조합하여 제공될 수 있다. 적합한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 인터페론 β(IFN-β), 타크롤리무스, 시롤리무스, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 오피오이드, 마이코페놀레이트, TNF-결합 단백질, 예를 들어, 인플릭시마브, 에터나셉트, 아달리무마브 등, 세포독성 항생제, 예를 들어, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신 등, 면역 세포 표적화 항체, 예를 들어, 항-CD20 항체, 항-CD3 항체 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 항-Dll4 길항제와의 병용 치료요법을 위해 적합한 소염제 및/또는 진통제는 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 소염 약물(NSAID), 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 나프록센 등, TNF-α 길항제(예를 들어, 인플릭시마브 또는 REMICADE®(제조원: Centocor Inc.); 골리무마브(제조원: Centocor Inc.); 에타너셉트 또는 ENBREL®(제조원: Amgen/Wyeth); 아달리무마브 또는 HUMIRA®(제조원: Abbott Laboratories) 등), IL-1 길항제(예를 들어, IL-1-결합 융합 단백질, 예를 들어, ARCALYST®(제조원: Regeneron Pharmaceuticals, Inc., 문헌 참조: 미국 특허 제6,927,044호; KINERET®(제조원: Amgen) 등), IL-6 길항제(예를 들어, 항-IL-6 수용체 항체(미국 특허 제7,582,298호에 기재된 바와 같음), 및 ACTEMRA®(제조원: Roche)), 아세트아미노펜, 모르핀모사체 등을 포함한다. 적합한 당 저하제는 인슐린 및 이의 유사체, 비구아니드, 설폰아미드 및 이의 우레아 유도체, 알파-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온 및 이의 유도체, 디펩티딜 펩티다제-4 억제제, 구아 검, 레파글리니드, 나테글리니드, 엑세나티드, 프람린티드, 벤플루오렉스, 리라글루티드, 미티글리니드, 알도스 리덕타제 억제제 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다.
Dll4 길항제, 예를 들어, hDll4 Ab 또는 이의 단편 및 상기된 추가의 치료제(들)은 함께 동시에 투여되거나 별도로 투여될 수 있다. 별도의 투약 제형이 사용되는 경우, 본 발명의 상기 항체 또는 이의 단편 및 추가의 제제는 동시에 또는 시차를 둔 시점에서 별도로, 즉, 적당한 순서로 연속적으로 투여될 수 있다.
키트
본 발명은 추가로 패키징 재료, 컨테이너 및 컨테이너내에 함유된 약제학적 제제를 포함하는 제품 또는 키트를 제공하고, 여기에서, 상기 약제학적 제제는 하나 이상의 Dll4 길항제, 예를 들어, Dll4 항체 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하고 상기 패키징 재료는 사용 지침서를 보여주는 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, Dll4 길항제 및 추가의 치료제는 별도의 컨테이너에 함유될 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 완전한 기재를 당업자에게 제공하기 위해 제공되지만 발명자가 이들의 발명으로서 여기는 것의 범위를 제한하고자 의도하는 것은 아니다. 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확도를 확실히 하기 위해 노력했지만 일부 실험적 오류 및 오차가 고려되어야만 한다. 달리 지적되지 않는 경우, 부는 중량부이고 온도는 섭씨 온도이고 압력은 대기압 또는 이의 근처이고 수치 오류 막대는 평균 ± SEM이다.
하기 실시예에서, 3% FCS가 보충된 Dulbecco PBS(GIBCO® INVITROGEN™) 1X 중의 하기의 항체를 사용하여 유동 세포측정 목적을 위해 세포를 염색시킨다: DC에 대해, 시그널 조절 단백질α(Sirp-α; cat# P84; BD Biosciences), B220(cat# RA3-6B2), PDCA-1(cat# eBio927), CD8(cat# 53-6.7), CD11b(cat# M1 /70), MHCII(cat# M5/1 14.15.2), CD11c(cat# N418), 및 CD135(cat# A2F10) 각각에 대한 항체; T, B 및 NK 세포에 대해, CD4(cat# GK1.5 또는 L3T4), CD3(cat# 145-2C11), CD25(cat# PC61 또는 7D4), CD44(cat# IM7), FoxP3(cat# FJK16s); 및 F4/80(cat# BM8), NK1.1(cat# PK136), IgM(cat# II/41), IgD(cat# 26-11c), CD43(cat# S7), CD21(cat# eBio4E3), HSA(cat# M1/69), 및 CD23(cat# B3B4) 각각에 대한 항체(이 모두의 제조원(eBioscience)).
실시예 1 : B 세포, 수지상 세포 및 T 세포의 발육에 대한 Dll4 차단 효과
Dll4-Notch1 억제가 T 세포 발육을 완전히 차단하고 이는 흉선 내에서 전구-T 세포에서 DC로의 운명 전환을 일으킬 수 있는 B 세포의 이소성 출현 및 수지상 세포(DC)의 확장을 수반한다는 것이 나타나 있다(문헌참조: Hozumi et al., 2008, J Exp Med 205(11 ):2507-2513; Koch et al., 2008, J Exp Med 205(11):2515-2523; 및 Feyerabend et al., 2009, Immunity 30:1-13). 그러나, DC 발육의 어느 특정 단계가 Dll4 차단에 의해 직접적으로 영향을 받는지는 아직 밝혀지지 않았다.
상기 의문을 해명하기 위해, 6주령 C57B1/6 마우스(Jackson Labs)에 2주동안 주당 2회 5 또는 25 mg/kg의 항-Dll4 Ab(REGN577)(n=5) 또는 사람 Fc 단편(대조군)(n=5)을 피하 주사하였다. REGN577은 공개된 서열을 토대로 실험실에서 제조하였다(문헌 참조: WO 2007/143689). REGN 577은 사람 및 마우스 Dll4에 결합하지만 사람 Dll1 및 JAG1에는 검출가능하게 결합하지 않는다. 주사한지 14일 후, 흉선 및 비장을 수거하고 10% 태아 소 혈청(FCS)이 보충되고 콜라게나제 D(Sigma Aldrich)를 함유하는 완전 RPMI 1640 배지(Invitrogen)에서 30분동안 37℃에서 분해하였다. 반응을 종료하기 위해, 2 mM EDTA를 첨가하고 유기 현탁액을 70mm 세포 스트레이너에 통과시켰다. 골수(BM)는 10% FCS가 보충된 완전 RPMI 1640 배지에서 대퇴골 및 경골을 플러싱함에 의해 각각의 마우스로부터 수거하였고, 세포는 RPMI 배지에 재현탁시켰다. T 세포, B 세포 및 DC 서브세트는 세포를 상기된 특정 마커에 대한 항체로 염색시킨 후 유동 세포측정으로 평가하였다. 상기 염색된 세포는 BD™ LSR II 유동 세포 측정기(BD Biosciences)상에 적용하고 상기 데이터는 FlowJo 소프트웨어(버젼 8.8.6; Tree Star Inc.)를 사용하여 분석하였다.
도 1a 및 도 1b는 흉선 내 T 및 B 세포 집단을 보여준다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, Dll4 차단은 흉선 내에서 이중 네거티브("DN"; CD4-CD8-) T 세포 수를 상당히 증가시키고 이중 포지티브("DP"; CD4+CD8+) T 세포 수를 감소시켰다. 또한, 동일한 치료는 전구-T 세포(즉, DN1 단계에서의 CD44+CD25-CD4-CD8- 세포)(도 1b 참조)로부터 발생하는, 흉선 내의 B 세포의 이소성 출현을 유도하였다. 반대로, Dll4 차단은 골수(도 2a) 또는 말초 비장 B 세포 아집단(도 2b)에서 B 세포 발육에 대해 어떠한 효과도 갖지 않았다. 또한, Dll4 차단은 흉선 내에서 통상적인 DC("cDC"; B220-CD11c+) 및 형질세포양(plasmacytoid) DC("pDC"; PDCA1+B220+CD11C+)의 확장을 유도하였고(도 3a), 7일째(p<0.001) 개시하여 14일(p<0.001)에 걸쳐 상당히 확장하였고, Dll4 Ab의 최초 주사 후 21일(p<0.01) 동안 계속되었다(도 3b). 도 3a의 도트 플롯에서의 수는 14일째 총 세포 중에서 DC의 평균 백분율[%]을 나타낸다. 추가로, DC는 Dll4 Ab(REGN577)로 치료된 마우스의 말초에서 확장하였다. 대조군 마우스(hFc-치료)와 비교하여, Dll4 Ab를 사용한 치료시 비장에서 DC의 백분율[%] 및 절대수의 배수 증가는 표 1에 나타낸다.
Figure 112012069242303-pct00001
림프구 조직 cDC, pDC 및 단핵구는 이의 표면 표현형 "Lin-cKithiCD115+FLT3+"에 의해 동정될 수 있는 "마크로파지 및 DC 전구체" 또는 "MDP"로 불리우는 공통된 전구체를 공유하고, 한편 "Lin-cKitloCD115+FLT3+"를 갖는 "공통된 DC 전구체" 또는 "CDP"로 불리우는 독특한 전구체는 cDC 및 pDC를 생산하는데 국한되어 있는 것으로 공지되어 있다. 단핵구가 염증 조건 하에 DC의 많은 표현형 특징을 발현할 수 있지만, cDC, pDC 및 단핵구 계통은 이들이 조직에 도달하는 시차에 의해 분리되고 단핵구 또는 pDC는 정상(steady) 상태 조건 하에서 cDC로 발현하지 않는다. 단핵구 및 pDC와는 다르게 림프구 조직 내의 cDC는 림프구 기관에서 추가로 분화하고 분열해야만 하는 미성숙 세포로서 골수로부터 출현하는 것으로 사료된다. 전구-DC(MHCIIloCD11cintCD135+Sirp-αint) 및 후기 전구-DC(MHCIIloCD11cint)는 골수에서 발생하는 cDC에 대한 주요 전구체이다(문헌 참조: Liu et al., 2009, Science 324:392-397).
DC 전구체 항상성에 대한 Dll4 Ab의 임의의 효과를 동정하기 위해, 흉선, 골수 및 비장에서 MDP 및 CDP의 수준은 유동 세포측정으로 평가하였다. MDP 및 CDP는 단지 골수에서 검출되었고 흉선 또는 비장에서는 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 또한, Dll4 차단은 대조군-치료된 마우스와 비교하여 골수에서 초기 전구체의 확장을 유도하지 않았다. 따라서, 상기 결과는 Dll4 Ab가 후기 단계, 즉 MDP 및 CDP 보다는 DC 발육의 DC 전 단계에서 작용할 수 있음을 시사하였다.
따라서, 흉선 및 골수에서 전구-DC 및 후기 전구-DC는 유동 세포측정을 사용하여 검색되었다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 골수에 정상적으로 존재하는 MHCIIloCD11cint DC는 Dll4 Ab 치료(p<0.001)한지 14일 후 흉선에서만 확장되었고 동일한 마우스의 BM에서 MHCIIloCD11cint DC의 확장은 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 전구-DC 단계로부터 기원하는 DC 확장은 흉선으로 제한되었다. 흉선에서 MHCIIloCD11cint DC의 기원을 평가하기 위해, 유동 세포측정을 수행하여 DN1(CD4-CD8-CD44+CD25-) 전구-T 세포 집단에서 MHCIIloCD11cint DC를 동정하였다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, MHCIIloCD11cint DC는 3일째 Dll4 차단시 DN1 전구-T 세포 집단 내에서 검출되었다. Dll4 Ab 치료시 DN2, DN3 및 DN4 T 세포 집단 내에서뿐만 아니라 Dll4 Ab 치료 부재 하에서도 어떠한 MHCIIloCD11cint DC도 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). Dll4 Ab 치료시 말초 DC 항상성에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, Dll4 차단은 3일째(p<0.01) 흉선에서 DN1 전구-T 세포 집단 내에서 MHCIIloCD11cint DC의 상당한 확장을 유도하였고(도 3d) 14일째(p<0.001)에 최대로 확장되었다(데이터는 나타내지 않음). 한편, 성숙한 DC 서브세트는 상기 논의된 바와 같이 7일째(p<0.001)에서 21일(p<0.01)째까지 확장하였다(도 3b 참조).
DC 확장이 미치료된 T-세포 전구체로부터 기원할 수 있는지를 조사하기 위해, DN1 CD45.1+Lin- 분류된 세포를 항-Dll4 Ab로 치료된 CD45.2+ 숙주 마우스의 흉선내로 전달하였다. CD45.1+ 세포는 DN1 단계에서 축적되었고(데이터는 나타내지 않음) 미성숙 DC(imDC)는 흉선에서 검출되고 확장(도 4)(p<0.01)된 것으로 밝혀졌다. 대조군 Ab-치료된 마우스에서는 어떠한 세포도 검출되지 않았고 이는 DN1-전달된 세포 대부분이 T 세포 네거티브 선별에 의해 제거되었기 때문일 가능성이 있다. Dll4 차단은 공통된 T/DC DN1 전구체로부터 기원하는 흉선 내 대안의 DC 계통의 발육을 촉진시키는 것으로 결론지었다.
Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드(Flt3-L)는 골수 전구체의 DC로의 분화 및 말초 DC의 발육을 위해 효율적이고 필수적이다. Flt3-L의 혈청 수준은 항-Dll4 Ab-치료된 WT 동물에서 변화하지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 또한, 하기 표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 흉선내 특정 백분율(%)의 DC는 대조군 Ab로 치료된 것들과 비교하여 모두 Dll4 Ab로 치료된 야생형 마우스(WT)(표 2 및 3), FLt3-L 녹아웃 마우스(Flt3-L-/-)(p<0.05)(표 2), 및 Flt3-R 녹아웃 마우스(Flt3-R-/-)(p<0.001)(표 3)에서 확장하였다. 따라서, Dll4 차단은 흉선에서 Flt3-독립적 DC 확장을 유도한다.
Figure 112012069242303-pct00002
Figure 112012069242303-pct00003
초기 T 세포 전구체가 비-T 세포 표현형으로 재-유도하는 능력이 관찰되었다(문헌 참조: James P. Di Santo, 2010, Science 329:44-45). 유전자 어레이 분석은 흉선세포 및 전구-T 세포에서 수행하여 B 및 DC 세포-계통 세부사항에 비해 T 세포 세부사항에 관련된 유전자 내의 항-Dll4 Ab 치료 효과를 측정하였다. T 세포 활동(commitment)에 필수적인 유전자(예를 들면, Tcf7, Gata3, 및 Ets1)가 하향조절되고, 각각 T 세포 발육을 차단할 수 있는 유전자(Lyl1, Sfpi1)가 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음; 문헌(참조: Di Santo, 2010, supra)). 가장 흥미롭게도, DC(PU.1 및 Spi-B) 및 B 세포 발육을 제어하는 유전자가 또한 상향 조절되었다(데이터는 나타내지 않음; 문헌(참조: M. Merad et al., 2009, Bood 113:3418-3427)). 추가로, DC 서브세트 발육에 관여하는 인터페론 조절 인자(IRF) 2, 4 및 8-주요 전사 인자 뿐만 아니라 RelB 및 Id2의 발현은 증가하였다(데이터는 나타내지 않음; 문헌(참조: Merad et al., 2009, supra)). 최종적으로, DC 발육에 관여하는 주요 사이토킨인 CSF-1(M-CSF)의 유전자 발현은 항-Dll4 Ab 치료시 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(p<0.05; 데이터는 나타내지 않음). 또한, CSF-1 혈청 수준은 항-Dll4 Ab 치료시 증가하였다(도 5; p<0.05)(문헌 참조: B. Francke, et al., 2008, Blood 111:150-159). 따라서, Dll4-Notch 시그널링 차단은 T 세포 계통 활동에 특이적인 전사 인자를 하향조절하지만 DC 발육에 중요한 다른 것들은 상향조절하는 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 2: T 세포 발육에 대한 Dll4 결실의 효과
상기 실시예 1에서 관찰된 DC 발육에 대한 Dll4의 효과가 Dll4에 대해 고유한 것인지를 평가하기 위해, Dll4가 조건적으로 불활성화된 DLL4COIN 마우스를 제조하였다. "조건적 역위(Conditional-by-inversion)(COIN)" 대립유전자는 재조합효소 매개된 조건적 돌연변이를 제공하기 위해 역위가능한 요소("COIN 요소")에 의존하는 조건적 대립유전자이다. DLL4COIN 마우스는 돌연변이 에스트로겐 리간드-결합 도메인(ERT2)에 융합된 Cre 재조합효소를 암호화하는 타목시펜-유도성 Cre 재조합효소 작제물인 CreERT2를 함유한다. CreERT2는 타목시펜 부재 하에 필수적으로 불활성이고 또한 내인성 에스트로겐에 의해 활성화되지 않는다. 마우스의 타목시펜 치료는 CreERT2를 활성화시키고, COIN 삽입 지점의 하류에 있는 모든 엑손들의 전사를 차단하는 COIN 요소의 역위를 유발하여 Dll4를 녹아웃시킬 것이다. CreERT2 재조합효소 시스템의 세부사항에 대해서는 문헌(Feil et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 237:752-757)을 참조한다.
DLL4COIN 마우스(n=6)에 2주 동안 주당 3회 마우스당 3 mg/150 ㎕의 옥수수유로 타목시펜(TAM)(cat# T-5648, Sigma)을 복강내(i.p.) 주사하였다. DLL4COIN 대조군 마우스(n=6)에 타목시펜 불포함 옥수수유를 투입하였다. 또한, 야생형 C5B1/6 마우스는 단지 타목시펜(n=6) 또는 옥수수유(n=6)로 치료하였다. 마우스는 고통 징후(예를 들어, 털 출현, 활동 감소 등), 감염 및 과도한 체중 감소에 대해 모니터링하였다. 마우스의 체중을 주당 대략 3회 칭량한다. 체중이 20% 이상 감소한 임의의 마우스를 실험으로부터 제거하였다. 치료 2주 후, 흉선을 수거하고 흉선 세포는 유동 세포측정으로 분석하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, Dll4의 부재 하에(즉, 타목시펜-치료된 마우스에서) B 세포, 및 pDC 및 cDC 둘 다는 옥수수유-치료된 마우스에 비해 흉선에서 확장하였고 이는 실시예 1에서 관찰된 DC 발육 및 항상성에 대한 Dll4의 효과가 실제 Dll4에 고유한 것임을 지적한다. 따라서, Dll4-Notch 시그널링은 전구-T 세포 집단내에서 비-T 세포 계통 잠재력을 억제함에 의해 T 세포 활동을 지탱시키는 것으로 보인다.
실시예 3: Treg 항상성에 대한 Dll4 차단 또는 Dll4 결실의 효과
최근에 Treg가 정상적인 수의 DC를 유지하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다. Treg 결실시, DC는 보상적 Fms-유사 티로신 키나제 3(Flt3)에 의존하여 증가한다(문헌참조: Liu et al., 2009, supra). 또한, 2개의 독립적인 그룹은 생체내에서 DC에 의한 조절 T 세포 항상성의 피드백 제어를 보여주었고, 즉 DC의 수를 증가시켜 자가면역 질환 발병을 예방할 수 있는 Treg 분열 및 축적을 증가시킨다(문헌 참조: Darrasse-Jeze G. et al., 2009, J Exp. Med. 206(9):1853-1862; 및 Swee LK et al., 2009, Blood 113(25) :6277-6287).
Dll4 차단이 Treg 항상성에 영향을 미칠 수 있는지를 측정하기 위해, 실시예 1에서 Dll4 Ab 또는 사람 Fc(대조군)으로 치료된 마우스의 흉선에서 Treg 수는 유동 세포측정기로 측정하였다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, Dll4 차단은 처음 주사 후 14일째에 흉선 내에서 Treg를 강하게 확장시켰다. Treg의 확장은 처음 주사 후 흉선에서 7일째(p<0.001)에 개시되어 14일째(p<0.001)에 최대 효과에 도달하였고(도 7b 참조), 말초(즉, 비장) Treg는 14일 내지 21일째(p<0.05)에만 출현하기 시작하였다(도 7b 및 표 4). 표 4에서, Dll4 Ab를 사용한 치료시 대조군 마우스(hFc-치료된)와 비교하여 비장에서 Treg의 백분율[%] 및 절대수의 배수 증가를 나타낸다.
Figure 112012069242303-pct00004
관찰된 Treg 확장이 Dll4 분자에 고유한 것인지를 평가하기 위해, 실시예 2의 DLL4COIN 마우스의 흉선에서 Treg 수도 유동 세포측정기로 측정하였다. Dll4 Ab에 의한 Dll4 차단을 이용하여 관찰되는 바와 같이, 타목시펜 치료에 의한 Dll4의 조건적 불활성화는 또한 타목시펜으로 치료된 야생형 마우스 뿐만 아니라 옥수수유 치료된 마우스(도 7c 참조)와 비교하여 흉선에서 Treg의 확장을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, Dll4-Notch 시그널링은 DC 및 결과적으로 Treg 항상성 및 T 세포 활동을 지탱시켜준다.
사람 Dll4의 N-말단 DSL 도메인에 결합하는 것으로 공지된 항-Dll4 Ab(각각 서열번호 116 및 118의 HCVR 및 LCVR 서열을 갖는 REGN421)를 사용하여 사람 Dll4("사람화된 Dll4 마우스")를 발현하는 마우스에서 유사 실험을 수행하였다. 상기 사람화된 Dll4 마우스는 마우스 Dll4 유전자의 세포외 도메인을, F1 C57BL/6/129의 배아 줄기(ES) 세포에서 사람 Dll4 유전자(7kb)의 상응하는 전체 세포외 도메인으로 대체시켜 제조하였다. 동형접합성 hDll4 마우스를 제조하고 C57BL/6 배경으로 사육시켰다. 사람화된 Dll4 마우스는 2주 동안 주당 2회 5 mg/kg의 hFc(대조군; n=6), 또는 1 mg/kg(n=6) 또는 5 mg/kg(n=6)의 REGN421 Ab로 치료하였다. 각각의 치료 그룹으로부터 2마리의 마우스를 7일째 희생시키고 그룹당 2마리 이상의 마우스를 14일째 희생시켰다. 흉선을 수거하고 세포를 염색시키고 유동 세포측정기로 조사하였다. 나머지 마우스는 어떠한 치료도 하지 않고 추가 4주 동안 회복하도록 방치하였고 치료 중지 후 28일째에 이들을 희생시키고 흉선 세포를 유동 세포측정기를 사용하여 분석하였다. 치료 2주 후, Treg 집단의 상당한 증가(도 8b)뿐만 아니라 cDC 및 pDC(도 8a)의 증가가 항-Dll4 Ab-치료된 마우스(p<0.01)의 흉선에서 관찰되었다. 2주 동안 Dll4 Ab를 투여받고 이어서 4주 미치료된 마우스의 흉선에서, DC 및 Treg의 수가 둘 다 기간 종료 시점에 정상 수준으로 복귀하였다(도 8a 및 도 8b). 한편, DC 및 Treg의 확장은 또한 hFc 치료된 마우스와 비교하여 Dll4-Ab 치료된 마우스의 말초에서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 4: Treg 에 대한 Notch 수용체 차단 효과
DC의 확장은 Treg의 확장을 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌 참조: Darrasse-Jeze G. et al., 2009). 상기 논의된 바와 같이, Dll4 차단시 DC 및 Treg 둘 다는 흉선에서 확장하는 것으로 관찰되었다(도 3a 및 도 7a). 추가로, DC 및 Treg의 백분율[%] 및 절대수의 증가가 또한 Dll4-Ab 치료된 마우스의 말초에서 발견되었다(표 1 및 4). Notch 수용체의 차단이 Dll4 결실과 동일한 표현형을 유도하는지를 결정하기 위해, 니카스트린(Nicastrin) 녹아웃(KO) 마우스(Nic-/-)를 연구하였다. 니카스트린은 Notch 시그널링 경로에 관여하는 분자이고 니카스트린 결핍 마우스에서 니카스트린의 유전학적 절제는 Notch 수용체 1, 2, 3 및 4의 시그널링 하류를 차단한다(문헌 참조: Aifantis et al., 미-공개 데이터). 니카스트린 KO 마우스는 비장에서 뿐만 아니라 흉선에서도 백분율[%] 및 절대수 둘 다에서 Treg의 수 증가와 함께 Dll4-결실된/차단된 마우스와 유사한 표현형을 나타내는 것으로 밝혀졌다(표 5 참조).
Figure 112012069242303-pct00005
최종적으로, Nic-/- 마우스 기원의 골수 세포(BM)가 치명적으로 방사선 조사된 WT 마우스에 전달되는 경우, 흉선 Treg의 확장이 Nic-/- → WT 키메라에서 관찰되었고 이는 상기 확장이 세포-자발적 효과이고 항-Dll4 Ab를 사용한 수용체 마우스의 Dll4 차단이 부가적 효과를 갖지 않음을 시사한다(표 6 참조).
Figure 112012069242303-pct00006
이들 결과는 Dll4 또는 Notch 수용체를 차단시킴에 의한 Dll4-Notch 시그널링의 차단이 Treg의 확장과 관련하여 유사한 표현형을 유발함을 시사한다.
Dll4 차단시 Treg의 확장이 DC 수와 상호관련되어 있는지를 측정하기 위해(문헌 참조: Darrasse-Jeze G. et al., 2009, supra), DC 결핍 마우스를 제조하고 실시예 1에서와 같이 Dll4 Ab를 사용하여 시험하였다. 영장류 디프테리아 독소 수용체(DTR)를 발현하는 형질전환 마우스는 DT에 비민감성인 이들의 세포에 디프테리아 독소(DT)에 대한 민감성이 부여되었다. DT는 이의 B 서브유니트와 세포 DTR의 상호작용을 통해 세포에 진입하고 엔도시토시스시, DT A 서브유니트가 방출되고 연장 인자 2의 ADP-리보실화를 촉진하여 단백질 합성의 억제에 이어서 유사분열 및 최종 분화된 세포에서 신속한 아폽토시스를 유도한다. 세포 절제의 특이성 및 타이밍은 각각 세포 유형에 제한된 프로모터/인핸서 요소에 의해서 및 독소 투여 계획에 의해 결정될 수 있다. DC에 DT 민감성을 표적화하기 위해, 문헌[참조: Jung et al. (2002, Immunity 17:211-220)]에서는 뮤린 CD11c 프로모터의 제어 하에 원숭이 DTR-GFP(녹색 형광 단백질) 융합 단백질을 암호화하는 전이유전자를 함유하는 마우스(CD11cre-DTR 마우스)를 제조하였다. CD11c가 모든 DC를 암호화하고 있기 때문에, CD11c를 발현하는 모든 뮤린 DC 서브세트를 DT 투여시 제거한다.
이와 같이 제조된 DC 결핍 형질전환 마우스는 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 Dll4 Ab 또는 hFc 대조군으로 치료하였다. 치료한지 14일 후, 흉선 및 비장을 수거하고 분석을 위해 제조하였다. 특이적 DC 또는 T 세포 서브세트의 표면상에 Dll4의 발현 수준은 유동 세포측정으로 평가하여 Dll4 Ab가 어느 특이적 서브세트에 결합하는지를 측정하였다. 상기 결과는 DC 및 T 세포가 이들의 표면상에 검출가능한 수준의 Dll4를 발현하지 않음을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음). 상기 관찰은 Dll4가 흉선 상피 세포(TEC)의 표면상에 발현된다는 보고에 의해 확인된다(문헌참조: Koch et al. 2008, supra). 그러나 가장 중요하게, DC 결핍 마우스의 Dll4 Ab 치료가 Treg의 확장을 유도할 수 없고 Dll4 Ab로 치료된 야생형 마우스(즉, DC 비결실된 마우스)에서는 CD3+CD4+ 세포(p<0.001) 중에서 Treg의 백분율[%]이 상당히 증가되는 것으로 밝혀졌고, 이는 Dll4 Ab 치료시 Treg의 확장이 적어도 부분적으로 DC 확장을 통해 매개됨을 시사한다.
실시예 5: 실험적 자가면역 뇌척수염( EAE )에서의 Dll4 차단의 효과
CD4+CD25+FoxP3+ 천연 조절 T 세포(즉, Treg)는 자기-내성을 유지하는데 중요한 역할을 수행하고 1형 당뇨병, 자가면역 뇌척수염, GVHD 및 염증성 대장 질환(IBD)과 같은 자가-면역 질환을 억제한다(문헌 참조: Darrasse-Jeze G. et al., 2009, supra; Swee LK et al., 2009, supra; 및 McGreachy et al., 2005, 175(5):3025-3032).
Dll4 차단으로부터 비롯된 증가된 수의 Treg가 자가면역 질환을 예방하는지를 알아보기 위해, EAE에 대한 Dll4 차단 영향을 마우스 모델에서 연구하였다. EAE 마우스 모델은 C57B1/6 마우스의 풋패드에서 완전 프로인트 보조제(CFA) 중에 유화된 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG) 펩타이드를 주사함에 이어서 (24시간 후) 백일해 독소(PTX)를 주사하여 질환을 유발함으로써 확립하였다. 상기 질환 스코어는 하기의 증상을 토대로 결정하였다: (0) 무증상; (1) 늘어진 꼬리; (2) 뒷다리 쇠약과 함께 늘어진 꼬리; (3) 부분적인 뒷다리 마비; (4) 완전한 뒷다리 마비; (5) 모든 다리의 마비; 및 (6) 빈사. 면역화 12시간 내지 24시간 전에, 예비 유도 그룹 내 마우스(n=10)에 또한 25 mg/kg의 항-Dll4 Ab(REGN577) 또는 이소형 대조군 Ab(미국 제2008/0260641호의 기재에 따라 실험실에서 제조된 CD20에 특이적인 사람 항체), 또는 PS/2(뮤린 인테그린-유사 세포 부착 분자 VLA-4에 대한 래트/마우스 IgG2b; ATCC #CRL-1911)를 피하 주사하였고, 유도후 그룹내 마우스(n=10)에는 증상이 나타난 날에 동일한 것을 주사하였다. PS/2 Ab는 재발성 실험적 자가면역 뇌척수염(R-EAE)에 대한 마우스 모델에서 질환 재발을 악화시키고 중추 신경계내 CD4+ T 세포의 축적을 증가시키는 것으로 공지되어 있다(문헌 참조: Theien BE et al., 2001, J Clin Invest 107(8):995-1006). 항체의 주사는 2주 동안 1주일에 2회 수행하였다. 실험 종점에서 마우스의 척수를 주의 깊게 제거하고, 파쇄하고 이어서 콜라게나제 D(Sigma Aldrich)를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 항온처리하였다. 2mM의 EDTA를 첨가하여 반응을 중지시키고 혼합물을 70mm 세포 스트레이너에 통과시키고 세포 함량은 유동 세포측정기로 분석하였다.
도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 이소형 대조군 Ab로 치료된 마우스는 MOG 주사 후 10 내지 14일째에 개시하여 15일 내지 21일째에 최대에 달하는 증상(즉, "0" 이상의 질환 스코어를 가짐)을 발병하였다. 반대로, Dll4 Ab로 치료된 마우스는 대조군 Ab로 치료된 마우스에 비해 질환 진행이 완전히 차단되었다. 표 7은 대조군 Ab로 치료된 마우스와 비교하여 Dll4 Ab로 치료된 마우스의 흉선 및 비장에서 Treg의 백분율[%] 및 절대수의 배수-증가를 보여준다.
Figure 112012069242303-pct00007
Treg는 약 18일째에 흉선내에서 주로 확장하는 것으로 보이고 상당한 확장은 단지 21일 후에 말초(즉, 비장)에서 나타났다.
상기 특정 실험 조건 하에서, 유도후 단계에서 Dll4 Ab 치료는 질환 진행에 상당한 차도를 보이지 않았다. Dll4 Ab 투여 용량 및/또는 횟수는 당업자의 지식 범위 내에서 추가로 조정될 수 있다. 그러나, 중요하게도 사전-유도 Dll4 Ab를 투여받은 마우스는 대조군 Ab를 투여받은 것들과 비교하여 18일째 척추로의 세포 침윤이 상당히 감소함을 나타냈다(하기 표 8 참조). 대조군 Ab로 치료된 마우스의 척수에서 관찰된 세포 침윤은 상기 마우스에서 질환 프로세스에 주요 기여인자일 수 있다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 21일째에 대조군 Ab로 치료된 마우스의 척수와 비교하여, 마크로파지(F4/80+)는 8배 감소하고(p<0.0001), NK 세포는 2.7배 감소하고(p<0.0001), CD11b 세포는 1.7배 감소하고(p<0.001), B 세포는 2.5배 감소한다(p<0.001).
Figure 112012069242303-pct00008
또한, Dll4 Ab로 치료된 마우스에서 림프절내 IL-17 및 IFN-γ의 생산은 상당히 감소하였다(p<0.001)(도 10). 따라서, Dll4는 Th1 발육을 매개함으로써 EAE의 발병에 관여할 수 있고 Dll4 Ab 치료는 Th1 및 Th17 사이토킨의 분비를 차단하여 질환 유도를 예방할 수 있다.
실시예 6. 당뇨병에 대한 Dll4 차단 효과
당뇨병에 대한 Dll4 차단 효과는 또한 1형 당뇨병에 대한 다중유전자 모델인 NOD/ShiLtJ 마우스("NOD 마우스")에서 시험하였다(문헌 참조: Makino S et al., 1980, Jikken Dobutsu 29 (1):1-13; Serreze DV et al., 1997, J Immunol 158 (8):3978-86). NOD/ShiLtJ 마우스에서의 당뇨병은 췌장섬의 췌도염(insulitis) 및 백혈구 침윤을 특징으로 한다. 췌장 인슐린 함량의 현저한 감소는 약 12주령의 암컷 및 이후 수주에 수컷에서 자발적으로 발생한다. 결과적으로, 혈당 수준은 250mg/dL 초과로 증가한다. NOD 마우스는 ONETOUCH® mini(LifeScan, Inc.)를 사용하여, 혈당 수준에 대해 1주 2회 검사하였다. 마우스는 2회 연속으로 혈당이 250mg/dL 이상으로 판독된 후 당뇨병인 것으로 간주한다. 당뇨병의 개시는 연속 당뇨병 측정의 첫날로 하였다. 상기 마우스에 9주령에서 개시하여 7주 동안 주당 2회 hFc(n=5) 또는 항-Dll4 Ab(Regn577)(n=10) 25mg/kg을 주사하였다. 혈당 수준은 꼬리로부터의 혈액 샘플을 이용하여 1주 1회 모니터링하였다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, hFc로 치료된 마우스는 13주령 후 250mg/dL 초과의 높은 혈당 수준을 갖는 자발적 당뇨병을 발병하기 시작했다(●). 대조적으로, 항-Dll4 Ab(REGN577)로 치료된 마우스는 25주령을 거쳐 증가된 혈당 수준에 대한 징후를 나타내지 않았고(■), 상기 측정은 추가로 10주 동안 계속하였다. 당뇨병 개시 전 Dll4-Ab 치료는 당뇨병의 발병을 예방하였고 치료된 동물은 당뇨병을 발병할 것처럼 보이지 않았다. 흥미롭게도, Dll4 Ab로 치료된 10마리의 마우스 중 5마리에 Treg를 제거하기 위해 20주령에서 항-CD25(PC61) mAb를 주사한 경우(◆), 이들의 혈당 수준은 이후 1 내지 2주 동안 계속 증가하기 시작했고 마우스는 당뇨병을 나타냈다. 이것은 I형 당뇨병에 대한 Dll4 Ab의 예방적 효과가 적어도 부분적으로 Treg에 의해 매개됨을 지적했다(도 11a).
인슐린 및 GAD65는 당뇨병 개체의 혈청에서 뿐만 아니라 당뇨병 NOD 마우스의 혈청에서도 발견되는 2개의 표준 자가-항체이다. 따라서, hFc 대조군 또는 Dll4 Ab로 치료된 마우스에서 자가-항체의 혈청 수준은 ELISA로 측정하였다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, Dll4-Ab 치료는 미치료된 WT C57BI/6(즉, 비-NOD 마우스: 네거티브 대조군 동물)의 수준과 유사한 수준에서 항-인슐린(□) 및 항-GAD65(■) 자가-항체의 생산을 차단시켰다. 대조적으로, hFc 대조군을 투여받은 NOD(당뇨병) 마우스는 이들의 혈청에 고수준의 자가-항체를 가졌다. 추가로, Dll4 Ab로 치료되고 어떠한 당뇨병 증상도 나타내지 않은 23주령 마우스의 췌장 부분이 H&E(헤마톡실린 및 에오신)으로 염색되는 경우, 보존된 형태를 갖는 정상적인 수의 췌장섬(인슐린 또는 글루카곤을 생성하는 세포 및 이들의 파괴는 직접적으로 당뇨병 발병과 상호관련되어 있다)이 관찰되었다(도 11c, 좌측 패널, 및 도 11d, 좌측 패널). 추가로, 섬내에 어떠한 세포 침윤도 Dll4 Ab-치료된 마우스에서 관찰되지 않았다(도 11c, 좌측 패널, 및 도 11d, 우측 패널). 대조적으로, hFc 대조군으로 치료된 당뇨병 동물은 Dll4 Ab-치료된 마우스보다 이들의 췌장에서 상당히 낮은 수의 췌장섬(도 11c 우측 패널 및 도 11d 좌측 패널)을 가졌고, 나머지 매우 소수의 섬은 고수준의 세포 침윤을 함유하였다(도 11c, 우측 패널, 및 도 11d, 우측 패널). 따라서, Dll4 Ab는 연장된 기간 동안 당뇨병을 완전히 차단할 수 있었고 이의 효과는 적어도 부분적으로 Treg의 확장에 의해 매개되는 것으로 보였으나, 추가의 기작(들)이 췌장섬 및/또는 인슐린에 대한 Dll4 Ab의 보호 효과에 관여할 가능성이 있다.
Dll4 Ab로 치료된 당뇨병 마우스의 실제 혈당 수준을 측정하고, hFc 대조군으로 치료된 마우스의 수준과 비교하였다. 당뇨병 마우스는 질환 개시(0일) 시점에 25 mg/kg의 Dll4 Ab(n=3) 또는 대조군 hFc(n=4)로 치료하였다. Dll4 Ab 치료시에, 당뇨병 마우스에서 혈당 수준이 약 350mg/dL로부터 정상 수준(약 120 내지 130mg/dL)으로 상당히 감소하였다(도 11e). 상기 효과는 평균 4 내지 5주 동안 지속되었다. 일반적으로, 350mg/dL 미만의 혈당을 갖는 당뇨병 마우스가 Dll4 Ab로 치료된 경우 이들의 혈당 수준이 정상 수준으로 감소하고 상기 효과가 치료 시점에 350mg/dL 초과의 혈당을 갖는 것들 보다 오랫동안 지속되는 것으로 추가로 관찰되었다. 이것은 Dll4 Ab를 사용하는 특정 기회 범위에서 혈당 수준 제어에 대한 치료가 지속적이고 효과적이라는 것을 지적한다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 특정 기작에 국한되지 않고 이들 관찰은 Dll4 항체가 I형 당뇨병에 대해 치료학적 잠재력을 가짐을 시사한다.
상기 실험으로부터 비롯된 결과는 이전에는 알려지지 않은, 생체내 Treg 세포 및 DC의 수를 제어하는 조절 루프가 존재함을 밝혔다. 이러한 조절 회로는 면역과 내성의 균형에 필수적일 가능성이 있지만, 최초로 면역계, 즉 Dll4-DC-Treg의 3개의 중요한 성분들간의 연결 고리가 만들어졌다는 것이 가장 중요하다. 따라서, Dll4 길항제를 사용한 치료요법이 생채 내에서 Treg 수를 조절하고 결과적으로 자가면역 질환 및 관련 병태의 진행을 제어하는데 효과적인 방법을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS OF TREATING DIABETES WITH DLL4 ANTAGONISTS <130> 6050A1-WO <150> 61/299,801 <151> 2010-01-29 <150> 61/361,687 <151> 2010-07-06 <150> 61/388,697 <151> 2010-10-01 <160> 118 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2058 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggcggcag cgtcccggag cgcctctggc tgggcgctac tgctgctggt ggcactttgg 60 cagcagcgcg cggccggctc cggcgtcttc cagctgcagc tgcaggagtt catcaacgag 120 cgcggcgtac tggccagtgg gcggccttgc gagcccggct gccggacttt cttccgcgtc 180 tgccttaagc acttccaggc ggtcgtctcg cccggaccct gcaccttcgg gaccgtctcc 240 acgccggtat tgggcaccaa ctccttcgct gtccgggacg acagtagcgg cggggggcgc 300 aaccctctcc aactgccctt caatttcacc tggccgggta ccttctcgct catcatcgaa 360 gcttggcacg cgccaggaga cgacctgcgg ccagaggcct tgccaccaga tgcactcatc 420 agcaagatcg ccatccaggg ctccctagct gtgggtcaga actggttatt ggatgagcaa 480 accagcaccc tcacaaggct gcgctactct taccgggtca tctgcagtga caactactat 540 ggagacaact gctcccgcct gtgcaagaag cgcaatgacc 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20 25 30 Gly Ile Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Ile Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Trp Asn Lys His Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 ggttacacct ttacctacta tggt 24 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr Gly 1 5 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 atcagcgctt acgatggtaa caca 24 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 Ile Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr 1 5 <210> 89 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 gcgaggtata gttggaacaa gcactggttc 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cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ttggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatcc attatagtgg gaacacccac 180 tacaatccga ccctcaagag tcgaattacc atatcagtag acacgtctaa gaaccagttc 240 tcccttgagg tgaactctgt gactgccgcg gacacggccg tatactactg tgcgaggaat 300 atggttcggg gagttcactg gttcgacccc tggggccagg gaaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 100 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Pro Thr 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Glu Val Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asn Met Val Arg Gly Val His Trp Phe Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr 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tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtata tttctgtcaa cagtatagta gttcaccgct cactttcggc 300 ggagggacca agctggagat caaa 324 <210> 108 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 108 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Phe Cys Trp Ala Ser Arg Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Ser Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 109 cggagtgtta gcagcagcta c 21 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> 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catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcaacac cgtagcaact ggcctcccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 118 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 118 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (23)

  1. 델타 유사 리간드 4(Dll4)와 Notch 수용체 간의 상호작용을 차단하여 당뇨병을 예방하거나 치료하거나 완화시키는 항-Dll4 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상체에서 1형 진성 당뇨병을 예방하거나 치료하거나 완화시키기 위한, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상체에서 혈당 수준을 저하시키기 위한, 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 각각 서열번호 22, 24 및 26의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 각각 서열번호 30, 32 및 34의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열 번호 20 또는 116의 HCVR 서열 및 서열번호 28 또는 118의 LCVR 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호 20/28 또는 116/118의 HCVR/LCVR 조합체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈당 저하제와 병용하여 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈당 저하제가 인슐린 또는 이의 유사체인, 약제학적 조성물.
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