TWI600433B - 以Dll4拮抗劑治療自體免疫疾病之方法 - Google Patents

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Description

以Dll4拮抗劑治療自體免疫疾病之方法
本發明是有關於使用類δ配位子4(delta-like ligand 4,Dll4)拮抗劑治療一其中增加調節性T細胞(Treg細胞或Tregs)是有益的疾病、障礙或病況的方法。更特別地，本發明之方法可藉由以Dll4拮抗劑阻斷Dll4結合至Notch受體來治療各種自體免疫疾病以及器官移植排斥與移植物-抗-宿主疾病(graft-versus-host diseases,GVHD)，藉此增加Tregs的數目。本發明更有關於在一傾向罹患或易罹患該等疾病或障礙的個體中預防此等疾病或障礙發生或復發的方法。
Notch受體及其配位子之間的交互作用代表一個在演化上保守的路徑，它不僅是對於細胞命運決定來說是重要的，對於在造血作用中調節譜系決定與胸腺發育也是重要的(Artavanis-Tsakonas et al.,1999,Science 284：770-776；Skokos et al.,2007；J Exp Med 204：1525-1531；以及Amsen et al.,2004 Cell 117：515-526)。近來顯示，Dll4-Notch1抑制會導致T細胞發育完全阻斷，伴隨著B細胞的異位外觀(ectopic appearance)以及樹突狀細胞(dendritic cells,DC)擴增，這些可能是因為原-T細胞(Pro-T cell)在胸腺內轉換命運至DC 所引起(Hozumi et al.,2008,J Exp Med 205(11)：2507-2513；Koch et al.,2008,J Exp Med 205(11)：2515-2523；以及Feyerabend et al.,2009,Immunity 30：1-13)。因此，Notch傳訊對於決定造血前驅細胞的細胞命運決定來說是關鍵性的有了累積證據。再者，已顯示調節性T細胞(Treg)恆定在活體內藉由DCs回饋控制(Darrasse-Jèze et al.,2009 J Exp Med 206(9)：1853-1862)。但是，Notch傳訊在控制DC來源與發育以及隨後的Treg恆定中的角色仍未知。這在臨床上是一個重要的問題，因為鑑定會誘導Treg擴增的新穎方法可用作為治療自體免疫疾病以及障礙。
人類Dll4(hDll4)的核酸以及胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：1以及2中。Dll4拮抗劑及其應用揭示於WO 2007/143689、WO 2007/070671、WO 2008/076379、WO 2008/042236以及WO/2008/019144中。
本發明一部分是基於發明人觀察到專一地結合Dll4並且阻斷Dll4結合至Notch受體的抗體能夠在小鼠中完全預防實驗性自體免疫腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)(一種關於人類多發性硬化症的動物模型)的進展，但對照抗體無法預防EAE。再者，發明人發現，抗-Dll4抗體的這個作用是與Treg細胞的數目增加有關。此外，進一步觀察到，抗-Dll4抗體在NOD/ShiLtJ小鼠(一種關於第1型糖尿病的動物模型)的胰臟中會預防血糖含量增加並且維持β-島的數目與型態，而這些作用至少有一部分是由Tregs的擴增所媒介。
因此，在第一個方面，本發明是以一種增加Treg細胞數目的方法為特徵，該方法包含有將一有效量的Dll4拮抗劑投藥給有需要的 個體，其中該Dll4拮抗劑會阻斷Dll4與Notch受體之間的交互作用並且增加Treg細胞的數目。
在第二個方面，本發明是以一種治療或改善其中增加Treg細胞的數目是有益的疾病、障礙或病況的方法為特徵，該方法包含有將一治療有效量的Dll4拮抗劑投藥給有需要的個體。可為本發明之方法所治療的疾病或障礙是任一種透過移除、抑制或減少Dll4活性，藉此在受治療個體體內增加Treg細胞數目而受益(亦即，增進、改善、抑制或預防)的疾病、障礙或病況。此等疾病、障礙或病況包括，但不限於各種自體免疫疾病，諸如多發性硬化症、糖尿病、類風濕性關節炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、古巴士德氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、格雷氏病(Graves’ disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barré syndrome,GBS)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)、特發性血小板減少性紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura)、腸躁症(irritable bowel syndrome)、紅斑狼瘡、混合性結締組織病、重症肌無力(myasthenia gravis)、嗜睡病(narcolepsy)、天狼瘡(pemphigus vulgaris)、惡性貧血、多發性肌炎、原發性膽汁肝硬化(primary biliary cirrhosis)、休格倫氏症候群(Sjögren’s syndrome)、潰瘍性大腸炎、血管炎、華格納氏肉芽病(Wegener’s granulomatosis)以及類似者，還有器官移植排斥與GVHD。
在一個具體例中，用於本發明之方法中的Dll4拮抗劑是Dll4抗體或其片段(“抗-Dll4 Ab”或“Dll4 Ab”)，其以高親和力專一地結合Dll4並且阻斷Dll4結合至Notch受體和/或阻斷Dll4-Notch傳訊路徑。該抗體可以是多株的、單株的(mAb)、嵌合的、人類化的或完全人類抗體或其片段。抗體片段可以是單鏈抗體、Fab或(Fab’)2。
在一個具體例中，Dll4 Ab或其抗原-結合片段結合hDll4(SEQ ID NO：2)的N-端領域(domain)的抗原決定位(epitope)(殘基 S27-R172)，或Delta/Serrate/Lag-2(DSL)領域中的抗原決定位(殘基V173-C217)，或N-端-DSL領域中的抗原決定位(殘基S27-C217)。在另一個具體例中，Dll4 Ab或其抗原-結合片段結合EGF領域之一者中的抗原決定位，亦即約在hDll4(SEQ ID NO：2)的胺基酸殘基Q218-N251(領域1)、E252-D282(領域2)、D284-E322(領域3)、E324-E360(領域4)、S362-E400(領域5)、K402-E438(領域6)、H440-E476(領域7)或S480-E518(領域8)。在一些具體例中，該抗體或抗體片段可結合涉及超過1個上列抗原決定位的構形抗原決定位(conformational epitope)。當藉由表面電漿共振(surface plasmon resonance)來測量時，用於本發明之方法的Dll4 Ab或其片段能夠以高親和力結合人類Dll4並且具有約1nM或更少、約500pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少、約100pM或更少，或約50pM或更少的平衡解離常數(KD)。
在一個具體例中，Dll4 Ab或其片段包含一重鏈可變區域(HCVR)，其包含3個分別具有SEQ ID NO：22、24以及26之胺基酸序列的重鏈互補決定區域HCDR1、HCDR2以及HCDR3。在另一個具體例中，該抗體或其片段包含一輕鏈可變區域(LDVR)，其包含3個分別具有SEQ ID NO：30、32以及34之胺基酸序列的輕鏈互補決定區域LCDR1、LCDR2以及LCDR3。在另一個具體例中，該Dll4 Ab或其片段包含重鏈與輕鏈CDR序列，其含有SEQ ID NO：22、24、26、30、32以及34的CDR序列組合。在又另一個具體例中，該Dll4 Ab包含一具有SEQ ID NO：20或116之胺基酸序列的HCVR，或包含一具有SEQ ID NO：28或118之胺基酸序列的LCVR。在又另一個具體例中，該Dll4 Ab包含有SEQ ID NO：20/28(REGN281)或116/118(REGN421)的HCVR/LCVR組合。
在某些具體例中，該Dll4 Ab包含一重鏈CDR1/CDR2/CDR3組 合以及一輕鏈CDR1/CDR2/CDR3組合，其是分別選自於下列：SEQ ID NO：6/8/10以及SEQ ID NO：14/16/18；SEQ ID NO：38/40/42以及SEQ ID NO：46/48/50；SEQ ID NO：54/56/58以及SEQ ID NO：62/64/66；SEQ ID NO：70/72/74以及SEQ ID NO：78/80/82；SEQ ID NO：86/88/90以及SEQ ID NO：94/96/98；與SEQ ID NO：102/104/106以及SEQ ID NO：110/112/114。在另一個具體例中，該Dll4 Ab包含一具有SEQ ID NO：4、36、52、68、84或100之胺基酸序列的HCVR，或一具有SEQ ID NO：12、44、60、76、92或108之胺基酸序列的LCVR。在又另一個具體例中，該Dll4 Ab包含一選自於下列的HCVR/LCVR組合：SEQ ID NO：4/12(REGN279)；SEQ ID NO：36/44(REGN290)；SEQ ID NO：52/60(REGN306)；SEQ ID NO：68/76(REGN309)；SEQ ID NO：84/92(REGN310)；以及SEQ ID NO：100/108(REGN289)。
編碼SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78，80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116以及118之胺基酸序列的核苷酸序列分別顯示為SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115以及117。
在另一個具體例中，可用於本發明之方法中的Dll4拮抗劑是一種融合蛋白質，其包含至少一能夠結合Dll4的可溶性Notch受體或其片段，其融合至一多聚化組分(multimerizing component)。在一個 具體例中，該可溶性Notch受體是人類Notch1或Notch4。在另一個具體例中，本發明之Dll4拮抗劑是一個經修飾的Dll4蛋白質，其能夠結合Notch受體(等)，但是這樣的結合不會造成受體(等)活化。在某些具體例中，本發明的Dll4拮抗劑是一種融合蛋白質，其包含Dll4的細胞外領域或其片段融合至一個多聚化組分(諸如免疫球蛋白領域，例如人類IgG的Fc領域)。在某些具體例中，該等Dll4拮抗劑包括可以阻斷Dll4-Notch交互作用的小分子以及其他藥劑。
在第三個方面，本發明是以一種在傾向罹患或易罹患上述自體免疫疾病或障礙之個體中預防或降低該疾病或障礙發生或復發的方法為特徵，其包含將一預防有效量的Dll4拮抗劑投藥給該個體。在一個相關具體例中，本發明進一步是以一種在移植接受者體內預防或降低器官移植排斥或GVHD之可能性的方法為特徵，其包含在移植之前和/或之後將一預防有效量的Dll4拮抗劑投藥給該接受者。
在第四個方面，本發明是以預防、治療或改善自體免疫疾病或障礙，或器官移植排斥的方法為特徵，其包含將一有效量的Dll4拮抗劑組合額外的治療劑(例如，免疫抑制劑(immunosuppressive agent)或免疫抑制劑(immunosuppressant)、抗發炎劑、鎮痛劑、諸如胰島素的降血糖劑以及類似物，它們之中的數者具有彼此重複的治療效用)投藥給有需要的個體。與Dll4拮抗劑組合使用的適當免疫抑制劑包括，但不限於糖皮質素(glucocorticoids)、環孢素(cyclosporin)、胺甲喋呤(methotrexate)、干擾素β(IFN-β)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰嘌呤(mercaptopurine)、類鴉片(opioids)、黴酚酸(mycophenolate)、TNF-結合蛋白(諸如因福利美(infliximab)、依坦西普(eternacept)、阿達木單抗(adalimumab)與類似物)、細胞毒性抗體(諸如放線菌素(dactinomycin)、蔥環黴素(anthracyclines)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、米拉黴素(mithramycin)與類似物)、標靶免疫細胞的抗體(諸如抗-CD20抗體、抗-CD3抗體與類似者)。用於與抗-Dll4拮抗劑組合治療的適當抗發炎劑和/或鎮痛劑包括阿司匹靈，布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)與類似物、TNF-α拮抗劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑、乙醯胺酚(acetaminophen)、類嗎啡肽(morphinomimetics)以及類似物。
在第五個方面，本發明是以一種包含Dll4拮抗劑、至少一額外的治療劑以及一醫藥上可接受之載體的醫藥組成物為特徵。在一個具體例中，該Dll4拮抗劑是以高親和力專一地結合至Dll4並且中和Dll4活性的Dll4 Ab或其片段，以及任一種上述免疫抑制劑、抗發炎劑、鎮痛劑、降血糖劑與類似物。
在第六個方面，本發明是以一種包含一容器(含有本發明之醫藥組成物)以及一包裝說明書(具有使用指引)的套組為特徵。
其他目的以及優點將因為回顧隨後的詳細說明而變得清楚。
詳細說明
在說明本發明之前，要理解的是，本發明不限定於所述的特定方法以及實驗條件，因為此等方法以及條件可能會改變。也要理解的是，此處所使用的術語僅是作為說明特定具體例之用，而並非意欲為限制，因為本發明的範圍僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
如同在本說明書以及隨付申請專利範圍中所用，除非內文另有清楚指明，單數形“一(a)”、“一(an)”以及“該(the)”包括所參照者的複數形。因此，例如提到“一方法”包括一或多種此處所述類型的方法，和/或步驟，和/或在閱讀本揭示內容之後那些熟習此藝將會變得清楚。
除非另有定義，所有此處使用的技術以及科學術語具有與本發 明所屬技藝中具有通常技術者普遍理解相同的意思。儘管任何類似或等同於此處所述方法以及材料可應用於本發明的實施或測試，現將說明較佳的方法以及材料。所有此處述及的公開文件以其整體併入此處做為參考文件。
定義
術語“Dll4拮抗劑”，如此處所用，包括能夠阻斷Dll4結合至Notch受體(諸如Notch1以及Notch4)和/或阻斷Dll4-Notch傳訊路徑之針對Dll4的抗體及其片段(參見，例如WO 2008/076379)、包含有融合至多聚化組分之Dll4的細胞外領域的融合蛋白質或其片段(參見例如，美國專利公開第2006/0134121號以及第2008/0107648號)、肽或肽體(參見例如，美國專利第7,138,370號)以及類似物，它們會阻斷Dll4與Notch受體之間的交互作用。因此，在某些具體例中，該術語亦含括諸如小分子、抗體或其抗原-結合片段以及類似物的拮抗劑，它們專一地結合Notch受體(例如抗-Notch1抗體、抗-Notch4抗體等)並且阻斷Dll4-Notch傳訊路徑。
術語”抗體”，如此處所用，欲意指一個免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈。各個重鏈含有1個重鏈可變區域(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區域(CH)。重鏈恆定區域含有3個領域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區域(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域含有1個領域，CL。VH與VL區域可進一步分為具有超變異性的區域(命名為互補決定區域(CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDRs以及4個FRs所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。
用於鑑定HCVR以及LCVR胺基酸序列中之CDRs的方法以及 技術在該技藝中是已知的並且可以應用於鑑定此處揭示之特定HCVR和/或LCVR胺基酸序列中的CDRs。可用來鑑定CDRs邊界的習知方法包括Kabat限定、Chothia限定以及AbM限定。一般來說，Kabat限定是以序列變異性為基礎，Chothia限定是以結構環區域的位置為基礎，而AbM限定是介於Kabat以及Chothia法之間的折衷法。參見，例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。關於鑑定抗體中的CDR序列，也可使用公開資料庫。
置換一或多個CDR殘基或省略一或多個CDRs也是可行的。在科學文獻中已說明過對於結合來說可免除1或2個CDRs的抗體。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)依據已公開的晶體結構分析抗體及其抗原之間的接觸區域，並推論僅有約五分之一至三分之一的CDR殘基實際接觸到抗原。Pandlan也發現到，許多抗體在其1或2個CDRs中沒有胺基酸與抗原接觸(亦參見Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。
未接觸到抗原的CDR殘基可以依據先前研究(例如CDRH2中的殘基H60-H65通常是不需要的)從Chothia CDs以外的Kabat CDRs的區域藉著分子模型和/或憑經驗來鑑定出。若忽略CDR或其(等)殘基，通常會以一個在另一個人類抗體序列或此等一致序列的對應位置的胺基酸予以置換。關於在CDRs內置換的位置以及要置換的胺基酸也可以憑經驗來選定。憑經驗置換可以是守恆或非守恆置換。
術語“抗體”亦含括帶有經修飾之醣化形式(glycosylation pattern)的抗體。在一些應用中，移除非所欲醣化位置的修飾可能是有利的，或例如移除岩藻糖部分以增加抗體依賴型細胞毒性(ADCC)功能(參 見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，移除N-醣化位置可降低非所欲的免疫反應對抗治療抗體，或增加抗體的親和力。在又其他應用中，為了修飾補體依賴型細胞毒性(CDC)，可以做出半乳糖化的修飾。
術語抗體的“抗原-結合片段”(或簡化“抗體片段”)，如此處所用，意指維持專一地結合至hDll4或其他所欲標的蛋白質之能力的抗體的一或多個片段。抗體片段可包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)分子、dAb片段、由模擬抗體之超變異區域的胺基酸殘基所構成的最小辨識單位(例如，含有CDR或分離CDR的片段)。其他經工程化的分子，諸如雙鍵抗體(diabodies)、三鍵抗體(triabodies)、四鍵抗體(tetrabodies)以及微抗體(minibodies)亦含括在如此處所用的詞句“抗原-結合片段”內。在某些具體例中，本發明之抗體或抗體片段可接合至一個治療部分(“免疫接合物”)，諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素。
抗體的抗原-結合片段典型包含至少1個可變領域。該可變領域可能是任何的大小或胺基酸組成並且通常包含至少1個鄰接一或多個骨架序列或在一或多個骨架序列內的CDR。在帶有與VL領域締合之VH領域的抗原-結合片段中，VH與VL領域可以任何適當的排列順序彼此相對。例如，可變區域可以是二聚體並且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。另擇地，抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL領域。
在某些具體例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少1個共價連結至少1個恆定領域的可變領域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定領域的非限定例示性型態包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix) VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定領域的任一種型態中(包括上面列示的任一種例示性型態)，可變與恆定領域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區域是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變和/或恆定領域間會產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明之抗體的抗原-結合片段可包含有上列可變與恆定領域型態的任一者彼此和/或與一或多個單體VH或VL領域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他多聚體)。
就完整的抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體的多專一性抗原-結合片段典型包含有至少2個不同可變領域，其中各個可變領域能夠專一地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多專一性抗體形式，包括此處所揭示的例示性雙專一性抗體形式，可使用該技藝中可取得之慣用技術而改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
術語“人類抗體”，如此處所用，欲包括帶有從人類生殖細胞免疫球蛋白序列衍生而來之可變與恆定區域的抗體。本發明的人類mAbs可包括非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如在活體外藉由隨機或位置-專一性突變誘發或藉由在活體內體突變引入的突變)，例如，在CDRs以及特別是在CDR3中。然而，術語“人類抗體”，如此處所用，未意欲要包括自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖細胞衍生而來的CDR序列(被接枝至人類FR序列上)的mAbs。
當與對應的生殖細胞序列相較之下，此處揭示的完全人類抗-Dll4抗體可包括一或多個在重鏈與輕鏈可變領域之骨架和/或CDR 區域中的胺基酸置換、插入和/或刪除。此等突變可易於藉著將此處揭示的胺基酸序列拿來與生殖細胞序列(可得自於例如公開的抗體序列資料庫)比較而被確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，它們是由此處揭示的胺基酸序列的任一者衍生而來，其中在一或多個骨架和/或CDR區域中的一或多個胺基酸可以突變成抗體衍生而來之生殖細胞序列的對應殘基(等)，或突變成另一種人類生殖細胞序列的對應殘基(等)，或突變成對應生殖細胞殘基(等)的守恆性胺基酸置換(此等序列變化在此完全意指為“生殖細胞突變”)。在該技藝中具有通常技術者從此處揭示的重鏈以及輕鏈可變區域序列可易於做出許多含有一或多個獨立生殖細胞回復突變或其組合的抗體以及抗原-結合片段。在某些具體例中，所有在VH和/或VL領域中的骨架和/或CDR殘基突變回復成在抗體衍生而來之生殖細胞序列中所發現到的殘基。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成原來的生殖細胞序列，例如僅僅在FR1的前8個胺基酸或FR4的最後8個胺基酸中被發現到有突變殘基，或僅僅在CDR1、CDR2或CDR3中發現到有突變殘基。在其他具體例中，骨架和/或CDR殘基(等)的一或多個突變成不同生殖細胞序列(亦即，不同於抗體原先衍生而來的生殖細胞序列的生殖細胞序列)的對應殘基(等)。再者，本發明的抗體在骨架和/或CDR區域內可含有2或多個生殖細胞突變的組合，例如，其中某些單獨殘基突變成特定生殖細胞序列的對應殘基，而某些其他不同於原有生殖細胞序列的殘基仍保留著或突變成不同生殖細胞序列的對應殘基。在得到之後，含有一或多個生殖細胞突變的抗體以及抗原-結合片段可易於測試一或多個所欲特性，諸如增進結合專一性、增高結合親和力、增進或增高拮抗或促效生物特性(視情況而定)、降低免疫原性等等。以這樣一般方法所得到的抗體以及抗原-結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括包含此處揭示之HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者之變異體的抗-Dll4抗體，其具有一或多個守恆性置換。例如，本發明包括相對於此處揭示之HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少、2個或1個守恆性置換(等)之具有HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列的抗-Dll4抗體。在一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO：116的胺基酸序列，它有10個或更少個守恆性胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO：116的胺基酸序列，它有8個或更少個守恆性胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO：116的胺基酸序列，它有6個或更少個守恆性胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO：116的胺基酸序列，它有4個或更少個胺基酸置換在其中。在又另一個具體例中，HCVR包含有SEQ ID NO：116的胺基酸序列，它有2個或1個守恆性胺基酸置換(等)在其中。在一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO：118的胺基酸序列，它有10個或更少個守恆性胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO：118的胺基酸序列，它有8個或更少個守恆性胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO：118的胺基酸序列，它有6個或更少個胺基酸置換在其中。在另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO：118的胺基酸序列，它有4個或更少個胺基酸置換在其中。在又另一個具體例中，LCVR包含有SEQ ID NO：118的胺基酸序列，它有2個或1個守恆性胺基酸置換(等)在其中。
“中和”或“阻斷”抗體欲意指一種結合至Dll4會致使Dll4之生物活性受到抑制的抗體。Dll4的這個生物活性抑制可以藉由測量Dll4生物活性的一或多個指標來評估。Dll4生物活性的這些指標可以藉 由該技藝中已知的數種標準活體外或活體內分析的一或多者來評估。例如，抗體中和Dll4活性的能力是藉由抑制Dll4結合至Notch受體來評估。相同地，術語也適用於對抗其他標的(諸如Notch1與Notch4)之抗體，此等抗體會抑制標的之生物活性，藉此抑制Dll4-Notch交互作用或傳訊路徑。
術語“專一地結合”或類似者表示抗體或其抗原-結合片段與抗原形成一個在生理條件下相對穩定的複合物。專一性結合的特徵可以是在於至少約1x10-6M或更低的KD(例如較小的KD表示較為緊密的結合)。用於決定2個分子是否專一地結合的方法在該技藝中為熟知的並包括，例如，平衡透析、表面電漿共振以及類似者。但是，專一地結合hDll4的分離抗體可能會對其他抗原(諸如來自於其他物種的Dll4分子)有交叉反應性。此外，結合至hDll4以及一或多個額外抗原的多專一性抗體(例如雙專一性)仍被視為是如此處所用的“專一地結合”hDll4的抗體。
術語“KD”，如此處所用，欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語”高親和力”抗體意指當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM或溶液-親和力ELISA)來測量時，那些以約1nM或更低、約500pM或更低、約400pM或更低、約300pM或更低、約200pM或更低，或約100pM或更低、或約50pM或更低的KD結合Dll4的抗體。
術語“表面電漿共振”，如此處所用，意指一種容許藉由在生物偵測器基質中偵測蛋白質濃度變化來分析即時生物專一性交互作用的光學現象(例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.))。
術語“抗原決定位”是抗原被抗體所結合的一個區域。抗原決定 位可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定位通常是結構性抗原決定位的一個次類並且具有那些直接提供交互作用之親和力的殘基。抗原決定位也可能是構形性的，意即，是由非線性胺基酸所構成。在某些具體例中，抗原決定位可包括具有諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基基團或磺醯基基團之在化學上有活性的表面基團分子的決定位，而在某些具體例中，可具有特定三維結構特性，和/或特定電荷特性。一個抗原決定位在一個特有空間構形中典型包括至少3個或更多個(通常至少是5個或8-10個)胺基酸。
術語“治療(treatment)”或“治療(treat)”，如此處所用，除非另有指明，欲表示預防性(prophylactic)(或預防性(preventative))以及治療性步驟。需要治療的個體不只包括那些患有特定病況、障礙或疾病者，也包括那些有傾向罹患或懷疑會罹患此一病況、障礙或疾病且可受益於預防性步驟的人，而使得相較於那些沒有治療者會降低此一病況、障礙或疾病(若有的話)之發生或復發，或進展。
依據詞組“治療有效量”、“預防有效量”或“有效量”表示被投藥時會產生所欲效用的數量。確切數量將視治療目的、治療個體的年紀以及身材、投藥路徑以及類似者而定，並且將由習於該技藝者使用已知技術來確認(參見例如，Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
一般說明
本發明一部分是以發現到藉由Dll4-專一性抗體來阻斷Dll4會導致Treg細胞的數目增加為基礎，換言之，其會預防、降低或延緩EAE或糖尿病在小鼠體內的進展。有關於完全人類Dll4 Ab的說明(包括重組型人類Dll4 Ab)，參見國際專利公開第WO 2008/076379號。
治療性投藥以及調配物
本發明提供預防、治療或改善其中增加Treg細胞的數目會是有益的疾病或障礙的方法，其包含投與治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含Dll4拮抗劑(諸如Dll4 Ab)。包含Dll4拮抗物的醫藥組成物可進一步包含一或多個額外的治療劑，諸如免疫抑制劑、抗發炎劑、鎮痛劑、降血糖劑以及類似物(參見下段)。依據本發明的醫藥組成物可與適當載體、賦形劑以及其他併入調配物中以提供增進轉移、投遞、耐受性以及類似者的藥劑一起投藥。許多適當的調配物可以在所有藥化學家所熟知的處方書中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA.。這些調配物包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水中油與油中水乳劑、乳化卡波蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA,(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
就全身性投藥來說，治療有效劑量最初可以由活體外分析來估算。例如，在動物模型中劑量可以調配成達到包括如同在細胞培養物中所測定之IC50的循環濃度範圍。這樣的資訊可以用來更為準確地決定用於人類體內的劑量。初始劑量也可以從活體內數據(例如動物模型)使用該技藝中所熟知的技術來估算。在該技藝中具有通常技術者可易於依據動物數據而將對人類的投藥最佳化。
劑量可以隨著要投藥的個體的年齡以及身材(例如體重或體表面積)、標的疾病、病況、投藥路徑以及類似者而改變。就Dll4結抗劑的全身性投藥來說，特別是就Dll4抗體來說，用於靜脈內投藥的典型劑量範圍是每日劑量為約0.01至約100mg/kg體重、約0.1至約50mg/kg，或約0.2至約10mg/kg。就皮下投藥而言，抗體可 以約1mg至約800mg、約10mg至約500mg、約20mg至約400mg、約30mg至約300mg或約50mg至約200mg來投藥，抗體濃度為至少約25mg/ml、約50mg/ml、約75mg/ml、約100mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml或約250mg/ml，每天至少1至5次、每週1至5次或每月1至5次。另擇地，抗體在最初可以經由靜脈內注射投藥，接著藉由連續皮下投藥。
不同的投遞系統是已知的並且可以用來投與本發明的醫藥組成物，例如囊封在脂質體中、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見例如Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服路徑。組成物可以藉由任一種習知路徑投藥，例如藉由注入(infusion)或球劑(bolus)注射、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸與腸黏膜等)的吸收並且可以與其他生物活性劑一起投藥。投藥可以是全身性或局部的。
醫藥組成物也可以在囊泡中投遞，特別是在脂質體中(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat et al.(1989)in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds),Liss,New York,pp.353-365；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；同前所述)。
在某些情況下，醫藥組成物可以在控制釋放系統中投遞。在一個具體例中，可以使用泵(參見Langer，上文；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一個具體例中，可以使用聚合物材料；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。在又另一個具體例中，控制釋放系統可以位在組成物標的之鄰近處，因此僅需要全身性劑 量的一部分而已(參見，例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release，上文，vol.2,pp.115-138,1984)。
可注射製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內以及肌肉內注射、滴注(drip infusions)等的劑型。這些可注射製備物可以藉由公眾知悉的方法製備。例如，可注射製備物可以例如藉由將上述抗體或其鹽類溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性媒介物或油性媒介物。作為用於注射的水性媒介物，有例如生理時鹽水、含有葡萄糖以及其他輔助劑等的等張溶液，其可以與適當的助溶劑(諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如聚丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑(例如聚山梨糖醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物)等一起使用。作為油性媒介物，採用例如芝麻油、大豆油等，它們可以與助溶劑(諸如苯甲酸苄酯、苄醇等)等一起使用。因此注射物較佳地是充填在適當安瓿中來製備。本發明的醫藥組成物可以皮下地或靜脈內地以標準針頭以及注射器來投遞。此外，關於皮下投遞，筆型投遞裝置易於應用在投遞本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型投遞裝置可以是重複使用或拋棄式的。重複使用筆型投遞裝置通常使用含有醫藥組成物的可置換藥匣。一旦藥匣中的所有醫藥組成物已被投藥且藥匣空了，空藥匣可易於拋棄並且置換一個含有醫藥組成物的新藥匣。那麼就可以重複使用筆型投遞裝置。在拋棄式筆型投遞裝置中，沒有替換式藥匣。相反地，拋棄式筆型投遞裝置重新填充保存在該裝置之眝器中的醫藥組成物。一旦眝器沒有醫藥組成物，丟棄整個裝置。
許多可重複使用的筆型以及自動注射投遞裝置已應用於皮下投遞本發明之醫藥組成物。實例包括，但肯定不限於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM 筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II與III(NOVO Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NOVO Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅列舉一些。應用於皮下投遞本發明之醫藥組成物的拋棄式筆型投遞裝置包括，但肯定不限於SOLOSTARTM筆(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
有利地，用於上述口服或非經口服用途的醫藥組成物被製備成適於填充一次劑量的活性成分之單位劑量的劑量形式。此等呈單位劑量的劑量形式包括，例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。所含有的Dll4拮抗劑(諸如Dll4抗體)的數量通常是一個單位劑量中每劑型約0.1至約800mg；特別是呈注射劑的形式，就其他劑量形式來說偏好含約5至約100mg以及約10至約250mg的抗體。
在某些具體例中，將本發明的醫藥組成物局部投予至需要治療之區域可能是所欲的；這可以例如，但非限定的，在外科手術期間藉著局部灌注、局部施用，例如藉著注射、藉由導管的方式或藉由移植物的方式，該移植物可能是多孔性、非多孔性或膠質材料，包括膜(諸如矽橡膠膜(sialastic membrane)、纖維或商用皮膚代用品)。
組合療法
在本發明的治療方法中，Dll4拮抗劑可單獨提供或與一或多種額外的治療劑(諸如免疫抑制劑或免疫抑制劑、抗發炎劑、鎮痛劑、直接或間接降血糖劑以及類似物)組合一起提供。適當的免疫抑制劑包括，但不限於糖皮質素、環孢素、胺甲喋呤、干擾素β(IFN-β)、他克莫司、西羅莫司、硫唑嘌呤、巰嘌呤、類鴉片、黴酚酸、TNF- 結合蛋白(諸如因福利美、依坦西普、阿達木單抗與類似物)、細胞毒性抗體(諸如放線菌素、蔥環黴素、絲裂黴素C、博來黴素、米拉黴素與類似物)、標靶免疫細胞的抗體(諸如抗-CD20抗體、抗-CD3抗體與類似者)。用於與抗-Dll4拮抗劑的結合療法的適當抗發炎劑和/或鎮痛劑包括皮質類固醇、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)，諸如阿司匹靈、布洛芬、萘普生與類似物、TNF-α拮抗劑(例如Centocor Inc.的因福利美或REMICADETM；Centocor Inc.的戈利木單抗(golimumab)；Amgen/Wyeth的依那西普或ENBREL®；Abbott Laboratories的阿達木單抗或HUMIRA®，與類似物)、IL-1拮抗物(例如IL-1結合融合蛋白質，例如Regeneron Pharmaceuticals,Inc.的ARCALYST®，參見美國專利第6,927,044號；Amgen的KINERET®，與類似物)、IL-6拮抗劑(例如像是美國專利第7,582,298號中所述的抗-IL-6受體抗體，與Roche的ACTEMRA®)、乙醯胺酚(acetaminophen)、類嗎啡肽(morphinomimetics)以及類似物。適當的降血糖劑包括，但不限於胰島素及其類似物、雙胍、磺醯胺及其脲衍生物、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮及其衍生物、二肽基肽酶-4抑制劑、瓜爾膠(guar gum)、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide)、艾塞那肽(exenatide)、普藍林肽(pramlintide)、苯氟雷司(benfluorex)、利拉魯肽(liraglutide)、米格列奈(mitiglinide)、醛糖(aldose)還原酶抑制劑以及類似物。
Dll4拮抗物(諸如hDll4抗體或其片段)以及上述額外的治療劑(等)可以一起或分開來共投藥。當使用個別的劑量調配物時，本發明之抗體或其片段以及額外藥劑可以同時投藥，或者在交錯時間分開投藥，意即以適當順序連續投藥。
套組
本發明進一步提供一種製品或套組，其包含有一包裝材料、容 器以及包含在該容器內的藥劑，其中該藥劑含有至少一Dll4拮抗劑(諸如Dll4抗體)以及至少一額外的治療劑，且其中該包裝材料含有一顯示關於使用之指引與用法說明的標籤或包裝說明書。在一個具體例中，該Dll4拮抗劑以及額外治療劑可以包含在個別的容器內。
第1A-1B圖顯示Dll4阻斷對於T細胞以及B細胞發育的影響。以抗-Dll4抗體(REGN577)或對照人類Fc片段(hFc)注射小鼠。14天之後，收取胸腺並且藉由流動式細胞測量術評估T細胞與B細胞次群。第1A圖：點狀圖顯示CD4-CD8-(雙重陰性胸腺前驅細胞或“DN”)、CD4+CD8+(雙重陽性胸腺前驅細胞或“DP”)、CD4+或CD8+(單陽性胸腺前驅細胞或“SP”)以及DN/CD44+CD25-(在DN1階段的胸腺前驅細胞)T細胞的數目。點狀圖中的數字表示T細胞次群在總胸腺細胞中的百分比(平均值±SEM)。第1B圖：柱狀圖顯示B細胞(B220+)在DN1細胞(亦即在CD4-CD8-CD44+CD25-圈出者)中的百分比(平均值±SD)。
第2A-2B圖顯示Dll4阻斷對於B細胞在骨髓中的發育階段(第2A圖)以及對於B細胞在脾臟中的恒定(第2B圖)的影響。點狀圖中的數字表示B細胞次群在骨髓或脾臟的總細胞中的百分比(平均值±SEM)。GC：生殖中心B細胞；T1與T2：B細胞次群；M：基質膠B細胞；以及Fo：濾泡B細胞。
第3A-3D圖顯示Dll4阻斷對於樹突狀細胞(DC)發育的影響。第3A圖：點狀圖顯示習知DCs(“cDCs”；B220-CD11C+)以及漿細胞樣DCs(“pDCs”；PDCA1+B220+CD11C+)在抗-Dll4 Ab處理時於胸腺中的擴增。點狀圖中的數字表示DCs在第14天時於總細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。第3B圖：柱狀圖顯示cDC以及pDC擴增 在以Dll4 Ab處理的小鼠(■)與以hFc-對照處理的小鼠(□)之胸腺中的動力學。第3C圖：點狀圖顯示Dll4 Ab對於胸腺中的前-DCs(MHCIIloCD11cintCD135+Sirp-αint)以及晚期前-DCs(MHCIIloCD11cint)的影響。點狀圖中的數字表示前-DCs在第14天於總細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。第3D圖：點狀圖顯示在以Dll4 Ab處理之小鼠胸腺的DN1(CD4-CD8-CD44+CD25-)原-T細胞群中有MHCIIloCD11cint DCs存在，但是在以hFc對照Ab處理的小鼠胸腺中沒有。點狀圖中的數字表示MHCIIloCD11cint DCs在第3天於DN1原-T細胞群中的平均數目(平均值±SEM)。
第4圖顯示Dll4阻斷對於胸腺內另擇DC譜系發育成源自於共同T/DC DN1前驅細胞的不成熟DCs(imDCs)的影響。分類為DN1CD45.1+Lin-的細胞在胸腺內被轉移至以Dll4 Ab(■)或hFc對照Ab(□)處理的CD45.2+宿主小鼠。
第5圖顯示Dll4阻斷對於CSF-1(M-CSF)(一種涉及DC發育的關鍵性細胞激素)的血清含量的影響。藉由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)測量未經處理()或以同位素對照Ab(□)或Dll4 Ab(■)處理的小鼠的血清CSF-1含量。
第6圖顯示在他莫西芬處理時，遺傳Dll4刪除在含有他莫西芬誘發型Cre重組酶構築體的DLL4COIN小鼠體內對於B細胞以及DC恆定的影響。點狀圖中的數字表示B細胞與pDCs以及cDCs這兩者在胸腺之總細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。
第7A-7C圖顯示Dll4阻斷/刪除對於Treg恆定的影響。第7A圖：點狀圖顯示與以hFc對照Ab處理的小鼠相較之下，Tregs在以Dll4-Ab處理歷時2週的小鼠胸腺內的擴增。點狀圖中的數字表示Tregs在胸腺的CD3+CD4+ T細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。第7B圖：柱狀圖分別顯示在以Dll4 Ab(■)與hFc對照Ab(□)處理 的小鼠之胸腺(上區)與脾臟(下區)中的Treg發育動力學。第7C圖：點狀圖顯示與以玉米油對照處理的對照組DLL4COIN相較之下，Treg在以他莫西芬(TAM)處理的DLL4COIN小鼠胸腺中的擴增。點狀圖中的數字表示Tregs在胸腺的CD3+CD4+ T細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。
第8A-8B圖顯示於表現人類Dll4(hDll4)的小鼠胸腺中，在Dll4-Ab(REGN421)處理(1mg/kg或5mg/kg)或hFc處理(5mg/kg)每週2次、持續2週之後的第7和14天，以及在停止處理之後第28天觀察到的Dll4阻斷對於DC(第8A圖)以及Treg恆定(第8B圖)的影響。點狀圖中的數字表示pDCs與cDCs(第8A圖)或Tregs(第8B圖)在胸腺的總細胞中的平均百分比(平均值±SEM)。
第9A-9B圖顯示Dll4阻斷在實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠模型中的影響。第9A圖：該圖顯示每個處理組的EAE疾病發病率(%)。第9B圖：該圖顯示EAE依據平均疾病記分的進展。治療是使用抗-Dll4 Ab(REGN577)前-誘發(▼)；同位素對照Ab前-誘發(◆)；REGN577後-誘發(▲)；或抗-VLA-4 Ab(PS/2)前-誘發(■)。
第10圖顯示Dll4阻斷對於EAE小鼠的淋巴結中IL-17以及IFN-γ生成的影響。在第12天以及第18天藉由ELISA測量IL-17(左區)以及IFN-γ(右區)在以Dll4 Ab(■)或hFc對照Ab(□)處理之EAE小鼠的淋巴結中的含量。
第11A-11E圖顯示Dll4 Ab在NOD小鼠糖尿病模型中的影響。第11A圖顯示在9週大時接受hFc對照Ab(˙)或抗-Dll4 Ab(REGN577)(■)之小鼠中的%糖尿病發病率(連續2次血糖含量的讀值高於250mg/dL)。亦顯示以Dll4 Ab處理接著注射PC61 Ab的5隻小鼠在20週時的%糖尿病發病率(◆)。PC61 Ab是一種抗CD25抗體並且會使Treg細胞耗竭。第11B圖顯示與未經處理的野生型(WT) 小鼠相較之下，抗-胰島素自體抗體(□)以及抗-麩胺酸去羧酶65(GAD65)自體抗體(■)生成在以Dll4 Ab或hFc對照處理的NOD小鼠根據ELISA的測量值。第11C圖顯示以蘇木精與伊紅(H&E)染色之經Dll4 Ab(左區)或hFc對照(右區)處理的NOD小鼠的胰臟切片。黑色箭頭表示個別的β-島而白色箭頭表示β-島中的浸潤細胞(右區)。第11D圖顯示在以hFc對照處理(□)或以Dll4 Ab處理小鼠的胰臟中β-島的數目(左區)或%浸潤β-島(右區)。第11E圖顯示於疾病發病時，血糖含量在以Dll4 Ab(˙)或hFc對照(□)處理的小鼠體內於治療之後42天的變化。
實施例
提出下列實施例，以提供那些在該技藝中具有通常知識者完整的揭示內容與說明如何做出以及使用本發明的方法以及組成物，且並非意欲要限定被發明人視為其發明的範疇。已盡力確保有關所用數字(例如數量、溫度等等)的精度，但會產生某些實驗誤差以及偏差。除非另有指明，部分為以重量計的部分，溫度為攝氏溫度，壓力為在大氣下或接近大氣，而圖式誤差槓=平均值±SEM。
在下面的實施例中，使用配於補充有3%FCS之杜貝可氏PBS(GIBCO® INVITROGENTM)1X中的下列抗體來對細胞染色以供流動式細胞測量術之用：關於DCs，分別為對抗傳訊-調節性蛋白α(Sirp-α；cat# P84；BD Biosciences)、B220(cat# RA3-6B2)、PDCA-1(cat# eBio927)、CD8(cat# 53-6.7)、CD11b(cat# M1/70)、MHCII(cat# M5/114.15.2)、CD11c(cat# N418)以及CD135(cat# A2F10)的抗體；關於T、B與NK細胞，分別為對抗CD4(cat# GK1.5或L3T4)、CD3(cat# 145-2C11)、CD25(cat# PC61或7D4)、CD44(cat# IM7)、FoxP3 (cat#FJK16s)與F4/80(cat# BM8)、NK1.1(cat# PK136)、IgM(cat# ll/41)、IgD(cat#26-11c)、CD43(cat# S7)、CD21(cat# eBio4E3)、HSA(cat# M1/69)以及CD23(cat# B3B4)的抗體(全部來自於eBioscience)。
實施例1：Dll4阻斷對於B細胞、樹突狀細胞以及T細胞的發育的影響
已顯示Dll4-Notch1抑制會完全阻斷T細胞發育，伴隨著B細胞的異位外觀以及樹突狀細胞(DC)擴增，可能是因為原-T細胞在胸腺內轉換命運(fate)至DC所引起(Hozumi et al.,2008,J Exp Med 205(11)：2507-2513；Koch et al.,2008,J Exp Med 205(11)：2515-2523；以及Feyerabend et al.,2009,Immunity 30：1-13)。但是，DC發育的哪個特定階段會直接受到Dll4阻斷所影響仍是未知。
為了回答這個問題，將5或25mg/kg抗-Dll4 Ab(REGN577)(n=5)或人類Fc片段(對照)(n=5)皮下注射至6週大C57B1/6小鼠(Jackson Labs)體內，1週2次，持續2週。REGN577是內部依據公開序列(WO 2007/143689)製備。REGN577結合至人類與小鼠Dll4，但是在可偵測到的情況下不會結合人類Dll1與JAG1。注射之後第14天，收取胸腺以及脾臟並且在37℃下於補充有10%胎牛血清(FCS)以及含有膠原蛋白酶D(Sigma Aldrich)的完全RPMI 1640培養基(Invitrogen)中予以分解。為了停止反應，加入2mM EDTA並且令器官懸浮物通過70mm細胞濾網。藉由沖洗股骨與脛骨將來自於各小鼠的骨髓(BM)收集於補充有10% FCS的完全RPMI 1640培養基並且將細胞懸浮於RPMI培養基中。在以對抗上述特定標記之抗體對細胞進行染色之後，藉由流動式細胞測量術來評估T細胞、B細胞以及DC次群。被染色的細胞在BDTM LSR II Flow Cytometer(BD Biosciences) 上運行著並且使用FlowJo軟體(版本8.8.6；Tree Star Inc.)分析數據。
第1A以及1B圖顯示胸腺中的T與B細胞群。如第1A圖中所示，Dll4阻斷在胸腺中會誘發雙陰性(“DN”；CD4-CD8-)T細胞的數目明顯增加，而雙陽性(“DP”；CD4+CD8+)T細胞的數目降低。此外，相同的處理會誘發胸腺內的B細胞有異位外觀，這是因為原-T細胞(亦即，在DN1階段的CD44+CD25-CD4-CD8-細胞)所引起(參見第1B圖)。相對地，Dll4阻斷對於骨髓中的B細胞發育(第2A圖)或週邊脾臟B細胞次群(第2B圖)沒有影響。此外，Dll4阻斷會在胸腺中誘發習知樹突狀細胞(“cDCs”；B220-CD11c+)以及漿細胞樣DCs(“pDCs”；PDCA+B220+CD11C+)擴增(參見第3A圖)，而在最初注射Dll4 Ab之後，從第7天(p<0.001)至第14天(p<0.001)有明顯擴增並且持續到第21天(p<0.01)(第3B圖)。第3A圖的點狀圖中的數字表示在第14天總細胞中的DCs平均百分比。再者，在以Dll4 Ab(REGN577)處理的小鼠之週邊的DCs有擴增。與對照組小鼠(以hFc-處理)相較之下，在以Dll4 Ab處理之後，DCs在脾臟中的百分比與絕對數目增加倍數顯示於表1中。
已知淋巴樣組織cDCs、pDCs以及單核細胞擁有共同的前驅細 胞，稱為“巨噬細胞與DC前驅細胞”或“MDP”，它們可以藉由表面表現型“Lin-cKithiCD115+FLT3+”被鑑定出，而不同的前驅細胞稱為“共同DC前驅細胞”或具有“Lin-cKitloCD115+FLT3+”的“CDP”，受限於生成cDCs以及pDCs。儘管單核細胞可以在發炎狀態下產生一些DCs的表現型特徵，cDC、pDC以及單核細胞譜系依據它們到達組織的時間而分開來，且在穩態狀態下不論是單核細胞或pDCs都不會發育成cDCs。不同於單核細胞與pDCs，淋巴樣組織中的cDCs被認為是有如不成熟細胞從骨髓而來，必須在淋巴樣器官中進一步分化以及分裂。前-DCs(MHCIIloCD11cintCD135+Sirp-αint)以及晚期前-DCs(MHCIIloCD11cint)主要是cDCs的前驅細胞，從骨髓而來(Liu et al.,2009,Science 324：392-397)。
為了鑑定Dll4 Ab對於DC前驅細胞恆定的影響，藉由流動式細胞測量術評估MDP以及CDP在胸腺、骨髓以及脾臟中的含量。僅在骨髓中偵測到MDP以及CDP，但是在胸腺或脾臟中沒有偵測到(數據未示出)。此外，相較於對照處理的小鼠，Dll4阻斷不會誘發骨髓中的早期前驅細胞擴增。因此，結果暗示，Dll4 Ab在要比MDP與CDP還晚的DC發育階段(亦即前-DC階段)有作用。
因此，使用流動式細胞測量術研究胸腺與骨髓中的前-DCs以及晚期前-DCs。如第3C圖中所示，通常出現在骨髓中的MHCIIloCD11cint DCs在Dll4 Ab處理之後第14天僅會在胸腺中擴增(p<0.001)，而在相同小鼠的BM中偵測到MHCIIloCD11cint DCs沒有擴增(數據未示出)。因此，源自於前-DC階段的DC擴增被限制於胸腺。為了評估胸腺中的MHCIIloCD11cint DCs的來源，進行流動式細胞測量術以鑑定DN1(CD4-CD8-CD44+CD25-)原-T細胞群中的MHCIIloCD11cint DCs。如第3D圖中所示，於第3天Dll4阻斷時在DN1原-T細胞群中偵測到MHCIIloCD11cint DCs。在沒有Dll4 Ab處 理的情況下沒有偵測到MHCIIloCD11cint DCs，在Dll4 Ab處理時於DN2、DN3和DN4 T細胞群中也沒有(數據未示出)。在Dll4 Ab處理時於週邊DC恆定方面觀察到沒有改變(數據未示出)。因此，Dll4阻斷會在第3天於胸腺中誘發DN1原-T細胞群的MHCIIloCD11cint DCs明顯擴增(p<0.01)(第3D圖)，同時在第14天有擴增波峰出現(p<0.001)(數據未示出)。同時，成熟的DC次群於第7天(p<0.001)至第21天(p<0.01)在胸腺中擴增，如上面所討論扳(參見第3B圖)。
為了調查DC擴增是否是源自於未定向T-細胞前驅細胞(uncommitted T-cell precursors)，分類為DN1 CD45.1+Lin-的細胞被胸腺內地轉移到以抗-Dll4 Ab處理的CD45.2+宿主小鼠體內。發現到，CD45.1+細胞累積在DN1階段(數據未示出)而且未成熟DCs(imDCs)在胸腺中被偵測到以及擴增(第4圖)(p<0.01)。在以對照Ab處理的小鼠體內沒有偵測到細胞，可能是由於大多數DN1-轉移的細胞會因為T細胞負向選擇(T cell negative selection)而被消除。推論Dll4阻斷會促進源自於共同T/DC DN1前驅細胞的胸腺內另擇DC譜系發育。
類Fms酪胺酸激酶3配位子(Flt3-L)對於骨髓前驅細胞分化成DCs以及週邊DCs的發育是需要並且不可或缺的。Flt3-L的血清含量在以抗-Dll4 Ab處理的WT動物體內沒有變化(數據未示出)。此外，如表2與3中所示，與那些以對照Ab處理的小鼠相較之下，在野生型小鼠(WT)(表2與3)、FLt3-L剔除小鼠(Flt3-L-/-)(p<0.05)(表2)與Flt3-R剔除小鼠(Flt3-R-/-)(p<0.001)(表3)體內(這些小鼠全部以Dll4 Ab來處理)，胸腺中的DC百分比增加。因此，Dll4阻斷會在胸腺中誘發Flt3-依賴型DC擴增。
已發現早期T細胞前驅細胞有往非-T細胞表現型再衍生(re-derive)的能力(James P.Di Santo,2010,Science 329：44-45)。在胸腺細胞以及原-T細胞中進行基因陣列分析以決定抗-Dll4 Ab處理在涉及T相對於B與DC細胞-譜系特化之基因的影響。發現到對於T細胞定向來說不可或缺的基因(例如Tcf7、Gata3與Ets1)向下調節，而可以各自阻斷T細胞發育的基因(Lyll、Sfpi1)向上調節(數據未示出；參見Di Santo，2010，上文)。最令人吃驚的是，控制DC的基因(PU.1與Spi-B)以及控制B細胞發育的基因也向上調節(數據未示出；參見M.Merad et al.,2009,Bood 113：3418-3427)。此外，RelB以及Id2，還有干擾素調節因子(IRFs)2、4以及8(涉及DC次群發育的關鍵性轉錄因子)的表現增加(數據未示出；參見Merad et al.，2009，上文)。最後，CSF-1(M-CSF)(一種涉及DCs發育的關鍵性細 胞激素)的基因表現被發現到在抗-Dll4 Ab處理時會向上調節(p<0.05；數據未示出)。此外，CSF-1血清含量在抗-Dll4 Ab處理時會增加(第5圖；p<0.05)(參見B.Francke,et al.,2008,Blood 111：150-159)。因而可以推論，Dll4-Notch傳訊阻斷會向下調節對於T細胞譜系定向來說有專一性的轉錄因子，同時向上調節其他在DC發育中的重要轉錄因子。
實施例2：Dll4刪除對於T細胞發育的影響
為了評估Dll4在上面實施例1觀察到對於DC發育的影響是否為Dll4所固有的，製備DLL4COIN小鼠(其中Dll4有條件地不活化)。“依據條件倒位”(Conditional-by-inversion,COIN)”對偶基因是條件對偶基因，其仰賴於可倒位要素(“COIN要素”)提供重組酶-媒介的條件突變。DLL4COIN小鼠含有他莫西芬-誘發型Cre重組酶構築體CreERT2，其編碼一個融合至一個突變雌激素配位子-結合領域(ERT2)的Cre重組酶。CreERT2在他莫西芬不存在時本來是不活化的而且也不會被內生性雌激素所活化。他莫西芬處理小鼠將活化CreERT2並且使得COIN要素倒位，其取消COIN插入點下游的所有表現子的轉錄，藉此剔除Dll4。關於CreERT2重組酶系統的細節，參見Feil et al.,1997,Biochemical and Biophysical Research Communications 237：752-757。
以每隻小鼠3mg/150μl玉米油的方式將他莫西芬(TAM)(cat# T-5648,Sigma)腹膜內(i.p.)注射至DLL4COIN小鼠(n=6)，每週3次，持續2週。DLL4COIN對照組小鼠(n=6)給予玉米油而沒有他莫西芬。同樣地，以他莫西芬(n=6)或僅僅玉米油(n=6)處理野生型C5B1/6小鼠。針對痛苦徵兆(例如毛皮外觀、活動力低等)、感染或體重過度減少監測小鼠。每週秤重小鼠約莫3次。任何體重減少超過20% 的小鼠要從實驗屏除。處理2週之後，收取胸腺並且藉由流動式細胞測量術分析胸腺細胞。
如第6圖中所示，與以玉米油處理的小鼠相較之下，在Dll4不存在時(亦即以他莫西芬處理的小鼠)，B細胞以及pDCs與cDCs這兩者在胸腺中擴增，表示Dll4在實施例1中所觀察到的對於DC發育以及恒定的影響就Dll4來說確實是固有的。因此，Dll4-Notch傳訊似乎會藉著抑制非-T細胞譜系在原-T細胞群中的潛力來維持T細胞定向。
實施例3：Dll4阻斷或Dll4刪除對於Tregs恆定的影響
近來已顯示Tregs對於維持DCs的正常數目來說是很重要的。在Treg耗竭時，DCs會有補償性類Fms酪胺酸激酶3(Flt3)-依賴型增加(Liu et al.,2009，上文)。此外，2個獨立的研究團隊證明，調節性T細胞恆定在活體內會藉由DCs回饋控制；亦即，增加DCs的數目而造成Treg增加分裂與累積，其能防止自體免疫疾病生成(Darrasse-Jeze G.et al.,2009,J Exp.Med.206(9)：1853-1862；以及Swee LK et al.,2009,Blood 113(25)：6277-6287)。
為了確定Dll4阻斷能否影響Treg恆定，藉由流動式細胞測量術來測量在實施例1中以Dll4 Ab或人類Fe(對照組)處理的小鼠的胸腺內Treg數目。如第7A圖中所示，Dll4阻斷在最初注射之後第14天會造成胸腺中的Treg強烈擴增。在最初注射之後，Treg在第7天(p<0.001)開始於胸腺中擴增並且在第14天(p<0.001)達到最高作用(參見第7B圖)，而Tregs在週邊(亦即脾臟)僅有在14與21天開始看的到(p<0.05)(第7B圖以及表4)。在表4中顯示與對照組小鼠(hFc-處理)相較之下，以Dll4 Ab處理時Tregs在脾臟內的百分比與絕對數目的增加倍數。
為了評估觀察到的Treg擴增對於Dll4分子來說是否為固有的，藉由流動式細胞測量術來測量在實施例2的DLL4COIN小鼠的胸腺內Treg數目。如同藉由Dll4 Ab之Dll4阻斷所觀察到的，與以玉米油處理的小鼠(參見第7C圖)與以他莫西芬處理的野生型小鼠(數據未示出)相較之下，Dll4因為他莫西芬處理而有條件不活化也會在胸腺中造成Treg擴增。因此，Dll4-Notch傳訊會維持DCs以及之後的Treg恆定與T細胞定向。
使用抗-Dll4 Ab(REGN421，具有分別為SEQ ID NO：116以及118的HCVR以及LCVR，已知會結合人類Dll4的N-端-DSL領域)在表現人類Dll4的小鼠(“人類化Dll4小鼠”)體內進行類似的實驗。人類化Dll4小鼠是藉由在F1 C57BL/6/129的胚胎幹(ES)細胞中將小鼠Dll4基因的整個細胞外領域置換為人類Dll4基因的對應細胞外區域(7kb)而製備。生育同型合子hDll4小鼠並且育種成C57BL/6背景。以5mg/kg的hFc(對照組；n=6)，或1mg/kg(n=6)或5mg/kg(n=6)的REGN421 Ab來處理人類化Dll4小鼠每週2次，持續2週。在第7由各個處理組犧牲2隻小鼠而在第14天每組又犧牲2隻小鼠。收取胸腺並且對細胞染色以及藉由流動式細胞測量術來檢驗。剩餘的小鼠允許在沒有任何處理的情況下復原歷時額外4週，並且 在停止治療之後第28天犧牲牠們，而且使用流動式細胞測量術來分析胸腺細胞。處理2週之後，在以抗-Dll4 Ab處理的小鼠的胸腺中，cDC以及pDCs(第8A圖)增加，還有Treg群(第8B圖)明顯增加(p<0.01)。在接受Dll4 Ab歷時2週，接著不處理歷時4週的小鼠胸腺中，DC以及Treg數目在期間結束時回復到正常含量(第8A與8B圖)。同時，與以hFc處理的小鼠相較之下，在以Dll4-Ab處理小鼠的週邊也發現到DCs以及Tregs擴增(數據未示出)。
實施例4：Notch受體阻斷對於Tregs的影響
已證明DCs擴增會造成Tregs擴增(Darrasse-Jeze G.et al.,2009)。如同上面討論的，在Dll4阻斷時發現到DCs與Tregs均會在胸腺中擴增(第3A與7A圖)。此外，在以Dll4-Ab處理的小鼠的周邊中，也發現到DCs與Tregs的百分比以及絕對數目會增加(表1與4)。為了確定阻斷Notch受體能否造成與Dll4刪除相同的表現型，研究Nicastrin剔除(KO)小鼠(Nic-/-)。Nicastrin是一種涉及Notch傳訊路徑的分子而且在缺乏nicastrin的小鼠體內遺傳去除nicastrin會導致Notch受體1、2、3和4下游的訊息轉導被阻斷(Aifantis et al.，未公開的數據)。Nicastrin KO小鼠被證明會表現出與Dll4-刪除/阻斷小鼠類似的表現型，Tregs的數目增加(百分比與絕對數目均有)，在胸腺中與在脾臟中是相同的(參見表5)。
最後，當Nic-/-小鼠的骨髓細胞(BM)轉移至經致死照射的WT小鼠時，在Nic-/-→WT嵌合體中觀察到胸腺Tregs擴增，暗示這樣的擴增是細胞-自主作用(cell-autonomous effect)；而以抗-Dll4 Ab來阻斷Dll4的接受者小鼠沒有加成效用(參見表6)。
這些結果暗示，藉由阻斷Dll4或Notch受體來中斷Dll4-Notch傳訊會造成與Treg擴增類似的表現型。
為了確定在Dll4阻斷時Treg的擴增是否與DC數目相關聯(Darrasse-Jeze G.et al.,2009，上文)，製備缺乏DCs的小鼠並且如同在實施例1中使用Dll4 Ab來進行試驗。表現靈長動物白喉毒素受體(DTR)的轉殖基因小鼠被賦予白喉毒素(DT)敏感性給它們的細胞，除此以外它們是DT-不敏感。DT經由其B次單位與細胞DTR交互作用而進入細胞，DT A次單位在胞吞作用時被釋出而催化延長 因子2的ADP-核糖苷化，在有絲分裂或末端分化細胞中造成蛋白質合成受到抑制接而快速細胞凋亡。細胞切除的特異性與計時可分別透過細胞類型-限定的啟動子/增強要素以及投予毒素的攝生法來決定。為了標定DT對於DC的敏感性，Jung等人(2002,Immunity 17：221-220)生育出帶有編碼類人猿DTR-GFP(綠色螢光蛋白)融合蛋白質之轉基因(受鼠CD11c啟動子所控制)的小鼠(CD11cre-DTR小鼠)。因為CD11c會在所有DCs中編碼、表現CD11c的所有鼠DC次群在DT投藥時被刪除。
依據實施例1中所述的操作步驟以Dll4 Ab或hFc對照來處理製備出之缺少DCs的轉殖小鼠。治療之後的第14天，收取胸腺以及脾臟並且製備供分析之用。藉由流動式細胞測量術評估Dll4在特定DC或T細胞次群之表面上的表現含量，以確定Dll4 Ab結合至哪個特定次群。結果顯示，DCs以及T細胞不會在其表面表現可偵測到的Dll4含量(數據未示出)。這個發現被Dll4表現在胸腺上皮細胞(TECs)的表面的報導(Koch et al.2008，上文)所證實。但最重要的是，發現以Dll4 Ab處理缺乏DCs的小鼠無法誘發Treg擴增，而以Dll4 Ab處理的野生型小鼠(亦即DC未刪除的小鼠)會明顯地增加Treg在CD3+CD4+細胞中的比例(p<0.001)，暗示在Dll4 Ab處理時Tregs的擴增至少於某種程度上是經由DC擴增所媒介。
實施例5：Dll4阻斷在實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)中的影響
CD4+CD25+FoxP3+天然調節性T細胞(亦即Tregs)在維持自我-耐受性扮演重要角色並且抑制自體免疫疾病，諸如第1型糖尿病、自體免疫腦脊髓炎、GVHD與發炎性腸病(Darrasse-Jeze G.et al.,2009，上文；Swee LK et al.,2009，上文；以及McGreachy et al.,2005,175(5)：3025-3032)。
為了瞭解因為Dll4阻斷導致Treg數目的增加能否預防自體免疫疾病，在小鼠模型中研究Dll4阻斷對於EAE的影響。EAE小鼠模型是藉由將髓鞘寡樹突狀細胞醣蛋白(MOG)肽(於傳氏完全佐劑(CFA)中乳化)注射至C57B1/6小鼠的腳墊中接著(24小時之後)為注射百日咳毒素(PTX)來誘發疾病而被建立。疾病記分是依據下列症狀來決定：(0)沒有症狀；(1)尾巴不舉；(2)尾巴不舉加上後腳虛弱；(3)部分後腳麻痺；(4)完全後腳麻痺；(5)四肢麻痺；以及(6)垂死。免疫之前的12至24小時，前誘發組的小鼠(n=10)也接受皮下注射25mg/kg的抗-Dll4 Ab(REGN577)或同位素對照Ab(對CD20有特異性的人類抗體，內部依據US 2008/0260641中的揭示內容製備)或PS/2(對抗鼠類整合素細胞附著分子VLA-4的大鼠/小鼠IgG2b；ATCC #CRL-1911)，而後誘發組的小鼠(n=10)在症狀出現當天接受相同處理。PS/2 Ab已知會在有關復發性實驗性自體免疫腦脊髓炎(R-EAE)的小鼠模型中使疾病復發惡化並且增加CD4+T細胞累積在中樞神經系統(Theien BE et al.,2001,J Clin Invest 107(8)：995-1006)。1週注射抗體2次，持續2週。實驗結束時，小心取出小鼠的脊髓、壓碎並且繼而培育在含有膠原蛋白酶D(Sigma Aldrich)的RPMI 1640培養基中。加入2mM的EDTA以停止反應並且令混合物通過70-mm細胞濾網以及藉著流動式細胞測量術分析細胞內含物。
如第9A以及9B圖中所示，在MOG注射之後，以同位素對照Ab處理的小鼠從約第10-14天起產生症狀(亦即，具有超過“0”的疾病記分)並且在第15與21天之間達到最高。相反地，與以對照Ab處理的小鼠相較之下，以Dll4 Ab處理的小鼠完全免於疾病進展。表7顯示與以對照Ab處理的小鼠相較之下，在以Dll4 Ab處理的小鼠的胸腺以及脾臟中的Tregs百分比與絕對數目的增加倍數。
在約第18天左右Tregs似乎主要是在胸腺中擴增並且只有在第21天之後於週邊(亦即脾臟)看到明顯擴增。
在這個特定的實驗條件下，在後誘發階段的Dll4 Ab處理未顯示出會明顯改善疾病進展。Dll4 Ab投藥的劑量和/或頻率可以在習於該技藝者的知識內被進一步調整。但重要的是，與以那些接受對照Ab的小鼠相較之下(參見下面表8)，接受前-誘發Dll4 Ab的小鼠於第18天在細胞浸潤至脊髓方面展現出明顯增加。在以對照Ab處理的小鼠脊髓中所觀察到的細胞浸潤於那些小鼠體內是疾病過程的主要促成因素。
如表8中所示，在第21天與以對照Ab處理的小鼠的脊髓相較之下，以Dll4 Ab處理的小鼠的脊髓中，巨噬細胞(F4/80+)降低8倍(p<0.0001)，NK細胞降低2.7倍(p<0.0001)，在CD11b細胞降低1.7倍(p<0.001)，而在B細胞降低2.5倍(p<0.001)。
此外，在以Dll4 Ab處理的小鼠體內，淋巴節中的IL-17以及IFN-γ的生成明顯減少(p<0.001)(第10圖)。因此，Dll4可能透過媒介Th1發育涉入EAE的致病機轉，而Dll4 Ab處理可透過阻斷Th1與Th17細胞激素分泌來防止誘發疾病。
實施例6：Dll4阻斷對於糖尿病的影響
亦在NOD/ShiLtJ小鼠(“NOD小鼠”，一種有關第1型糖尿病的多基因模型(Makino S et al.,1980,Jikken Dobutsu 29(1)：1-13；Serreze DV et al.,1997,J Immunol 158(8)：3978-86))中測試Dll4阻斷對於糖尿病的影響。糖尿病在NOD/ShiLtJ小鼠中的特徵在於胰島炎(insulitis)以及胰島的白血球浸潤。胰島素含量明顯降低，自發地在 約12週大時發生於雌性並且在數週之後發生於雄性。因此，血漿葡萄糖含量增加到超過250mg/dL。使用ONETOUCH® mini(LifeScan,Inc.)檢驗NOD小鼠的血糖含量1週2次。在連續2次讀值超過250mg/dL血糖之後，小鼠被視為有糖尿病。從連續糖尿病測量值的第1次起註明日期為糖尿病開始。自9週大時以hFc(n=5)或抗-Dll4 Ab(Regn577)(n=10)25mg/kg注射小鼠每週2次，歷時7週。以取自於尾部的血液樣品監測血糖含量1週2次。
如第11A圖中所示，以hFc處理的小鼠在13週大之後開始產生自發性糖尿病，血醣含量高於250mg/dL(˙)。相對地，以抗-Dll4 Ab(REGN577)處理的小鼠在25週大時未顯示出有血糖含量增加的徵候(■)，而且測量值又額外持續了10週。Dll4-Ab處理在糖尿病發病之前能預防糖尿病發病，而經處理的動物似乎至今未發生糖尿病。有趣的是，當在20週大以抗-CD25(PC61)mAb來注射10隻以Dll4 Ab處理的小鼠中的5隻以使得Tregs耗竭(◆)時，牠們的血糖含量在1-2週之後開始增加而且小鼠變成有糖尿病。這表示Dll4 Ab對於第1型糖尿病的預防效用至少在某個程度上是由Tregs所媒介(第11A圖)。
胰島素以及GAD65是2種標準自體抗體，可以在糖尿病NOD小鼠還有糖尿病個體的血清中發現到它們。因此，藉由ELISA來測量自體抗體在以hFc對照或Dll4 Ab處理之小鼠中的血清含量。如第11B圖中所示，Dll4-Ab處理會以類似於那些未處理WT C57B1/6者(亦即，非NOD小鼠；陰性對照組動物)的含量阻斷抗-胰島素(□)以及抗-GAD65(■)自體抗體的生成。相反地，接受hFc對照的NOD(糖尿病)小鼠在牠們的血清中有高含量的自體抗體。此外，當以H&E(蘇木精與伊紅)來對以Dll4 Ab處理並且未顯示糖尿病症狀之23週大小鼠的胰臟切片進行染色時，觀察到正常數目的β-島(生成胰島素 的細胞而且它們的破壞與糖尿病發病率直接相關)並且維持著型態(第11C圖左區以及第11D圖左區)。再者，在以Dll4 Ab處理的小鼠體內沒有觀察到β-島有細胞浸潤(第11C圖左區以及第11D圖右區)。相反地，以hFc對照處理的糖尿病小鼠在其胰臟具有數目明顯要比以Dll4 Ab處理之小鼠還低的β-島(第11C圖右區以及第11D左區)並且在剩餘極少的β-島中含有高含量的細胞浸潤(第11C圖右區以及第11D圖右區)。因此，Dll4 Ab能夠完全防止糖尿病歷時長時間而且它的影響至少在某個程度上似乎是藉由擴增Tregs所媒介；但是，可能有額外的機制涉入Dll4 Ab對於β-島和/或胰島素之保護效用。
測定以Dll4 Ab處理的糖尿病小鼠的確切血糖含量並且拿來與以hFc對照處理的小鼠做比較。在糖尿病發病時(第0天)以25mg/kg的Dll4 Ab(n=3)或對照hFc(n=4)來處理糖尿病小鼠。在Dll4 Ab處理時，糖尿病小鼠的葡萄糖含量明顯從約350mg/dL降低至正常含量(約120-130mg/dL)(第11E圖)。這個效用持續平均4-5週。一般來說，更觀察到當以Dll4 Ab來處理具有血糖少於350mg/dL的糖尿病小鼠時，牠們的血糖含量掉至正常含量且這個效用要比在治療時具有血糖超過350mg/dL的小鼠持續更久。這表示就控制血糖含量來說，使用Dll4 Ab來長時間以及有效處理是有可能的。因此，在不受到此處所述的任何特定機制囿限的情況下，這些發現暗示：Dll4抗體對於第1型糖尿病具有極大的治療潛力。
上面實驗的結果已揭示有前所未知的調節環存在，其會在活體內控制Treg細胞以及DCs的數目。這個調節性迴路對於免疫性以及耐受性之間的平衡可能是必要的，但最為重要的是，首次推導出這個免疫系統的3個主要成員(亦即Dll4-DCs-Tregs)之間的連結。因此，使用Dll4拮抗劑的療法代表一種在活體內控制Treg數目而且 因此控制自體免疫疾病與相關病況進展的有效方法學。
<110> 再生元醫藥公司
<120> 以Dll4拮抗劑治療自體免疫疾病之方法
<130> 6050A-WO
<140> 待指派
<141> 隨之提申
<150> 61/299,801
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<151> 2010-10-01
<160> 118
<170> 用於Windows版本4.0的FastSEQ
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Claims (12)

  1. 一種專一地結合人類Dll4(hDll4)的抗體或其抗原結合片段之用途，其係製造用於治療或改善診斷患有多發性硬化症的個體中多發性硬化症之醫藥品，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類Dll4並且阻斷Dll4與Notch受體之間的交互作用，藉此增加調節性T(Treg)細胞的數目，且其中該抗體或其抗原結合片段包含一重鏈可變區域(HCVR)以及一輕鏈可變區域(LCVR)，該重鏈可變區域包含分別為SEQ ID NO：22、24以及26的重鏈CDR1、CDR2以及CDR3序列，該輕鏈可變區域包含分別為SEQ ID NO：30、32以及34的輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3序列。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：116之HCVR序列。
  3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：118之LCVR序列。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：20/28或116/118之HCVR/LCVR組合。
  5. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該醫藥品係用於治療或改善多發性硬化症，其與至少一種選自由免疫抑制劑、抗發炎劑以及鎮痛劑組成的群組之額外治療劑組合。
  6. 如申請專利範圍第5項的用途，其中該額外治療劑是選自由下列組成的群組中至少一者：糖皮質素、環孢素、胺甲喋呤、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、TNF-α拮抗劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑以及類鴉片。
  7. 一種專一地結合人類Dll4(hDll4)的抗體或其抗原結合片段之用途，其係製造用於降低先前診斷患有多發性硬化症的個體中多發性硬化症復發之醫藥品，其中該抗體或其抗原結合片段結合人類Dll4並且阻斷Dll4與Notch受體之間的交互作用，藉此增加調節性T(Treg)細胞的數目，且其中該抗體或其抗原結合片段包含一重鏈可變區域(HCVR)以及一輕鏈可變區域(LCVR)，該重鏈可變區域包含分別為SEQ ID NO：22、24以及26的重鏈CDR1、CDR2以及CDR3序列，該輕鏈可變區域包含分別為SEQ ID NO：30、32以及34的輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3序列。
  8. 如申請專利範圍第7項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：116之HCVR序列。
  9. 如申請專利範圍第7項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：118之LCVR序列。
  10. 如申請專利範圍第7至9項中任一項的用途，其中該抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：20/28或116/118之HCVR/LCVR組合。
  11. 如申請專利範圍第7項的用途，其中該醫藥品係用於治療或改善多發性硬化症，其與至少一種選自由免疫抑制劑、抗發炎劑以及鎮痛劑組成的群組之額外治療劑組合。
  12. 如申請專利範圍第7項的用途，其中該額外治療劑是選自由下列組成的群組中至少一者：糖皮質素、環抱素、胺甲喋呤、非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs)、TNF-α拮抗劑、IL-1拮抗劑、IL-6拮抗劑以及類鴉片。
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