ES2609663T3 - Métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas del Dll4 - Google Patents

Métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas del Dll4 Download PDF

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Abstract

Un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de la esclerosis múltiple, en el que el antagonista del Dll4 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al Dll4 humano (hDll4) y bloquea las rutas de señalización Dll4-Notch, y el antagonista bloquea una interacción entre el Dll4 y el receptor Notch, aumentando así el número de linfocitos Treg, y la esclerosis múltiple se previene, se trata o se mejora, y en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas pesadas de las SEQ ID NO: 22, 24 y 26, respectivamente, y una región variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligeras de las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente.

Description

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DESCRIPCION
Metodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes con antagonistas del Dll4.
Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a antagonistas del ligando de tipo delta 4 (Dll4) para su uso en metodos para el tratamiento de la esclerosis multiple, especfficamente mediante el bloqueo de la union del Dll4 a un receptor Notch con antagonistas del Dll4, aumentando asf el numero de Tregs. La invencion tambien se refiere a antagonistas del Dll4 para su uso en metodos para la prevencion de la aparicion de la esclerosis multiple o de su reaparicion en un sujeto que esta predispuesto o que es susceptible.
Descripcion de la tecnica relacionada
Las interacciones entre los receptores Notch y sus ligandos representan una importante ruta conservada evolutivamente, no solo para las decisiones del destino de la celula, sino tambien en la regulacion de las decisiones de estirpe en la hematopoyesis y en el timo en desarrollo (Artavanis-Tsakonas et al., 1999, Science 284: 770-776; Skokos et al., 2007; J Exp Med 204: 1525-1531; y Amsen et al., 2004, Cell 117: 515-526). Recientemente se ha demostrado que la inhibicion Dll4-Notch1 da lugar a un bloqueo completo en el desarrollo de los linfocitos T, acompanado por la aparicion ectopica de linfocitos B y una expansion de las celulas dendrfticas (CD) que pueden surgir a partir de la conversion del destino de una celula Pro-T en una CD en el timo (Hozumi et al., 2008, J Exp Med 205 (11): 2507-2513; Koch et al., 2008, J Exp Med 205 (11): 2515-2523; y Feyerabend et al., 2009, Immunity 30:113). Por lo tanto, se acumulan pruebas de que la senalizacion Notch es crftica para la determinacion de la decision del destino celular a partir de las celulas progenitoras hematopoyeticas. Adicionalmente, se ha demostrado un control por retroalimentacion de la homeostasis de los linfocitos T reguladores (Treg) por parte de las CD in vivo (Darrasse-Jeze et al., 2009, J Exp Med 206 (9): 1853-1862). Sin embargo, el papel de la senalizacion Notch en el control del origen y el desarrollo de las CD, y consecuentemente en la homeostasis de los Treg, todavfa se desconoce. Es una cuestion crfticamente importante debido a que la identificacion de nuevos metodos de induccion de la expansion de los Treg podrfa usarse como tratamiento de enfermedades y trastornos de la autoinmunidad.
Se ha demostrado que la inhibicion del Notch3 con anticuerpos anti-Notch3 atenua la encefalomielitis autoinmune experimental (Jurynczyk et al., 2008, J Immunol 180 (4): 2634-2640).
Las secuencias de los acidos nucleicos y de los aminoacidos del Dll4 humano (hDll4) se muestran en las SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente. Los antagonistas del Dll4 y sus usos se divulgan en el documento WO 2007/143689, en el documento WO 2007/070671, en el documento wO 2008/076379, en el documento WO 2008/042236 y en el documento WO/2008/019144.
Sumario breve de la invencion
La presente invencion se basa en parte en la observacion por parte del presente inventor de que un anticuerpo, que se une especfficamente al Dll4 y bloquea la union del Dll4 a los receptores Notch, es capaz de prevenir completamente la progresion de una Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) en ratones, un modelo animal de la esclerosis multiple humana, mientras que un anticuerpo de control no previene la EAE. Adicionalmente, el presente inventor ha descubierto que este efecto del anticuerpo anti-Dll4 esta asociado con un aumento en el numero de linfocitos Treg. Ademas, se ha observado adicionalmente que un anticuerpo anti-Dll4 previene un aumento en el nivel de glucosa en sangre y preserva el numero y la morfologfa de los islotes pancreaticos en ratones NOD/ShiLtJ, un modelo animal de la diabetes de tipo 1, y dichos efectos estan mediados, al menos en parte, por la expansion de los Tregs.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invencion presenta un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) para su uso en la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, en el que el antagonista del Dll4 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especfficamente al Dll4 humano (hDll4) y bloquea las rutas de senalizacion Dll4-Notch y el antagonista bloquea la interaccion entre el Dll4 y el receptor Notch, aumentando asf el numero de linfocitos T reg y se previene, se trata o se mejora la esclerosis multiple, y en el que el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende las secuencias de las cadenas pesadas CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 22, 24 y 26, respectivamente, y una region variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende las secuencias de las cadenas ligeras CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente.
En un segundo aspecto, la invencion presenta el uso de un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) en la preparacion de un medicamento para la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, en el que el antagonista del Dll4 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especfficamente al Dll4 humano (hDll4) y bloquea las rutas de senalizacion Dll4-Notch y el antagonista bloquea una interaccion entre el Dll4 y el receptor Notch, aumentando asf el numero de linfocitos Treg y se previene, se trata o se mejora la esclerosis multiple, y en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena pesada (HcvR) que
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comprende las secuencias de las cadenas pesadas CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 22, 24 y 26, respectivamente, y una region variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende las secuencias de las cadenas ligeras CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente.
En una realizacion, el antagonista del Dll4 para dicho uso es un anticuerpo contra el Dll4 o un fragmento del mismo ("Ac anti-Dll4" o "Ac contra el Dll4") que se une especfficamente al Dll4 con una elevada afinidad y bloquea la union del Dll4 a los receptores Notch y/o bloquea las rutas de senalizacion Dll4-Notch. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal (AcMc), quimerico, humanizado o humano completo, o un fragmento de los mismos. El fragmento de anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena unica, un Fab o un (Fab')2.
En una realizacion, el Ac contra el Dll4 o el fragmento de union al antfgeno del mismo se une a un epftopo del dominio N terminal (residuos S27-R172) o del dominio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) (residuos V173-C217) o del dominio DSL N terminal (residuos S27-C217) del hDll4 (SEQ ID NO: 2). En otra realizacion, el Ac contra el Dll4 o el fragmento de union al antfgeno del mismo se une a un epftopo de uno de los dominios del EGF, es decir, aproximadamente en los residuos de aminoacidos Q218-N251 (dominio 1), E252-D282 (dominio 2), D284-E322 (dominio 3), E324-E360 (dominio 4), S362-E400 (dominio 5), K402-E438 (dominio 6), H440-E476 (dominio 7) o S480-E518 (dominio 8), del hDll4 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede unirse a un epftopo conformacional que implica a mas de uno de los epftopos enumerados anteriormente. El Ac contra el Dll4 o un fragmento del mismo puede ser capaz de unirse al Dll4 humano con una elevada afinidad, y tiene una constante de disociacion en equilibrio (Kd) de aproximadamente 1 nM o menos, de aproximadamente 500 pM o menos, de aproximadamente 300 pM o menos, de aproximadamente 200 pM o menos, de aproximadamente 100 pM o menos o de aproximadamente 50 pM o menos, medida mediante una resonancia de plasmon superficial.
El Ac contra el Dll4 o un fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada, HCDR1, HCDR2 y HCDR3, que tienen las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOS: 22, 24 y 26, respectivamente. El anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, que tienen las secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOS: 30, 32 y 34, respectivamente. En una realizacion, el Ac contra el Dll4 comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20 o 116, o una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 28 o 118. En otra realizacion, el Ac contra el Dll4 comprende una combinacion de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 20/28 (REGN281) o de las 116/118 (REGN421).
En ciertos aspectos descritos en el presente documento, el Ac contra el Dll4 comprende una combinacion de las CDR1/CDR2/CDR3 de la cadena pesada y una combinacion de las CDR1/CDR2/CDR3 de la cadena ligera seleccionada entre: las SEQ ID NO: 6/8/10 y las SEQ ID NO: 14/16/18, respectivamente; las SEQ ID NO: 38/40/42 y las SEQ ID NO: 46/48/50, respectivamente; las SEQ ID NO: 54/56/58 y las SEQ ID NO: 62/64/66, respectivamente; las SEQ ID NO: 70/72/74 y las SEQ ID NO: 78/80/82, respectivamente; las SEQ ID NO: 86/88/90 y las SEQ ID NO: 94/96/98, respectivamente; y las SEQ ID NO: 102/104/106 y las SEQ ID NO: 110/112/114, respectivamente. En otro aspecto descrito en el presente documento, el Ac contra el Dll4 comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 4, 36, 52, 68, 84 o 100, o una LCVR que comprende la secuencia de aminoacidos de las SEQ ID NO: 12, 44, 60, 76, 92 o 108. En otro aspecto mas, descrito en el presente documento, el Ac contra el Dll4 comprende una combinacion de HCVR/LCVR seleccionada entre: las SEQ ID NO: 4/12 (REGN279); las SEQ ID NO: 36/44 (REGN290); las SEQ ID NO: 52/60 (REGN306); las SEQ ID NO: 68/76 (REGN309); las SEQ ID NO: 84/92 (REGN310); y las SEQ ID NO: 100/108 (REGN289).
Las secuencias de nucleotidos que codifican para la secuencias de aminoacidos de las SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116 y 118, se muestran como las SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 y 117, respectivamente.
En ciertos aspectos descritos en el presente documento, el antagonista del Dll4 es una protefna de fusion que comprende el dominio extracelular del Dll4 o un fragmento del mismo fusionado con un dominio Fc de una IgG humana.
En algunas realizaciones, la invencion presenta el antagonista del Dll4 como se ha descrito anteriormente para su uso en un metodo para la prevencion o la reduccion de la aparicion o de la reaparicion de la esclerosis multiple, en un sujeto que esta predispuesto o que es susceptible al desarrollo de una esclerosis multiple, que comprende la administracion al sujeto de una cantidad profilacticamente eficaz del antagonista del Dll4.
En algunas realizaciones, la invencion presenta el antagonista del Dll4 como se ha descrito anteriormente para su uso en un metodo para la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, que comprende la administracion a un sujeto en necesidad de la misma de una cantidad eficaz del antagonista del Dll4 junto con un
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agente terapeutico adicional, por ejemplo, un agente inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un agente analgesico, un agente reductor de la glucosa en sangre (por ejemplo, insulina, analogos de la insulina, y similares), muchos de los cuales pueden tener unos efectos terapeuticos solapantes entre si. Algunos inmunosupresores adecuados para ser usados junto con el antagonista del Dll4 incluyen, pero no se limitan a, glucocorticoides, ciclosporina, metotrexato, interferon p (IFN-p), tacrolimus, sirolimus, azatioprina, mercaptopurina, opioides, micofenolato, protefnas de union al TNF, tales como infliximab, eternacept, adalimumab, y similares, antibioticos citotoxicos, tales como dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina, y similares, anticuerpos dirigidos a las celulas inmunitarias, tales como anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-CD3, y similares. Algunos agentes antiinflamatorios y/o analgesicos adecuados para las terapias de combinacion con antagonistas anti-Dll4 incluyen corticosteroides, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como acido acetilsalicflico, ibuprofeno, naproxeno y similares, antagonistas del TNF-a, antagonistas de la IL-1, antagonistas de la IL-6, paracetamol, morfinomimeticos, y similares.
En el presente documento tambien se describe una composicion farmaceutica que comprende un antagonista del Dll4, al menos un agente terapeutico adicional, y un portador farmaceuticamente aceptable. El antagonista del Dll4 puede ser un Ac contra el Dll4 o un fragmento del mismo que se une especfficamente al Dll4 con una elevada afinidad y neutraliza las actividades del Dll4, y al menos un agente terapeutico adicional es cualquiera de los agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes analgesicos, agentes reductores de la glucosa, y similares, descritos anteriormente.
En el presente documento tambien se describe un kit que comprende un envase que comprende la composicion farmaceutica y un prospecto con instrucciones para su uso. El kit puede comprender un envase que comprende en el mismo un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especfficamente al hDll4, otro envase que comprende en el mismo al menos un agente terapeutico adicional descrito anteriormente.
Otros objetos y ventajas seran evidentes a partir de una revision de la descripcion detallada que sigue.
Breve descripcion de las figuras
Las Fig. 1A - 1B muestran los efectos del bloqueo del Dll4 sobre el desarrollo de los linfocitos T y de los linfocitos B. Se inyectaron ratones con el anticuerpo anti-DII14 (REGN577) o con un fragmento Fc humano de control (hFc). Catorce dfas despues se recogieron los timos y se evaluaron los subconjuntos de linfocitos T y de linfocitos B mediante una citometrfa de flujo. Fig. 1A: graficas de puntos que muestran el numero de linfocitos T CD4'CD8' (precursores tfmicos dobles negativos o "DN"), CD4+CD8+ (precursores tfmicos dobles positivos o "DP"), CD4+ o CD8+ (precursores tfmicos positivos simples o "SP") y DN/CD44+CD25- (precursores tfmicos en el estadio DN1). Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes (media ± EEM) de las subpoblaciones de linfocitos T entre el total de las celulas tfmicas. Fig. 1B: histogramas que muestran el porcentaje (media ± DT) de linfocitos B (B220+) entre las celulas DN1 (es decir, los clasificados como CD4'CD8' CD44+CD25-).
Las Fig. 2A - 2B muestran los efectos del bloqueo del Dll4 en los estadios de desarrollo de los linfocitos B en la medula osea (Fig. 2A) y en la homeostasis de los linfocitos B en el bazo (Fig. 2B). Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes (media ± EEM) de los subconjuntos de linfocitos B entre el total de celulas en la medula osea o en el bazo. GC: centro germinal de los linfocitos B; T1 y T2: subconjuntos de linfocitos B; M: linfocitos B marginales; y Fo: linfocitos B foliculares.
Las Fig. 3A - 3D muestran los efectos del bloqueo del Dll4 sobre el desarrollo de las celulas dendrfticas (CD). Fig. 3A: graficas de puntos que muestran la expansion de las CD convencionales ("cCD"; B220-CD11C+) y de las CD plasmacitoides ("pCD"; PDCA1+B220+CD11C+) en el timo tras el tratamiento con el Ac anti-Dll4. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de las CD entre las celulas totales en el dfa 14. Fig. 3B: el grafico de barras muestra la cinetica de la expansion de las cCD y de las pCD en el timo de ratones tratados con el Ac contra el Dll4 (■) y de ratones tratados con un control de hFc (□). Fig. 3C: graficas de puntos que muestran los efectos del Ac contra el Dll4 en las pre-CD (MHCIIloCD11cintCD135+Sip-aint) y en las pre-CD tardfas (MHCIIloCD11cint) en el timo. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de las pre-CD entre las celulas totales en el dfa 14. Fig. 3D: graficas de puntos que muestran la presencia de MHCIIloCD11cintCD en la poblacion de linfocitos pro-T DN1 (CD4'CD8'CD44+CD25‘) en el timo de ratones tratados con el Ac contra el Dll4, pero no en el timo de los ratones tratados con el Ac de control hFc. Las cifras de las graficas de puntos representan el numero medio (media ± EEM) de CD MHCIIloCD11cint entre la poblacion de linfocitos pro-T Dn1 en el dfa 3.
La Fig. 4 muestra el efecto del bloqueo del Dll4 sobre el desarrollo de una estirpe alternativa intratfmica de CD en CD inmaduras (imCD) procedentes de un progenitor comun DN1 T/CD. Las celulas clasificadas como DN1 CD45.1+Lin- fueron transferidas intratfmicamente a ratones hospedadores CD45.2+ tratados con el Ac contra el Dll4 (■) o con el Ac de control hFc (□).
La Fig. 5 muestra el efecto del bloqueo del DII4 sobre los niveles sericos del CSF-1 (M-CSF), una citocina claramente implicada en el desarrollo de las CD. Los niveles sericos del CSF-1 de los ratones sin tratar (I® ), o de los tratados con el Ac de control de isotipo (□) o con el Ac contra el Dll4 (■), se midieron mediante un ensayo de inmunoadsorcion enzimatica (ELISA).
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La Fig. 6 muestra los efectos de la delecion genetica del Dll4 tras un tratamiento con tamoxifeno, en los linfocitos B y en la homeostasis de las CD en ratones Dll4COIN que contienen un constructo de recombinasa Cre inducible por tamoxifeno, CreERT2. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de los linfocitos B y tanto de las pCD como de las cCD entre las celulas totales en el timo.
Las Fig. 7A - 7C muestran los efectos del bloqueo/delecion del Dll4 en la homeostasis de los Treg. Fig. 7A: graficas de puntos que muestran una expansion de los Tregs en el timo de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 durante dos semanas, en comparacion con los ratones tratados con el Ac de control hFc. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de los Tregs entre los linfocitos T CD3+CD4+ en el timo. Fig. 7B: las graficas de barras muestran la cinetica del desarrollo de los Treg en el timo (panel superior) y en el bazo (panel inferior), respectivamente, de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 (■) y con el Ac de control hFc (□). Fig. 7C: graficas de puntos que muestran una expansion de los Tregs en el timo de ratones Dll4COIN tratados con tamoxifeno (TAM), en comparacion con el control de Dll4COIN tratado con aceite de mafz de control. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de los Tregs entre los linfocitos T CD3+CD4+ en el timo.
Las Fig. 8A - 8B muestran los efectos del bloqueo del Dll4 sobre la homeostasis de las CD (Fig. 8A) y de los Treg (Fig. 8B) en el timo de ratones que expresan el Dll4 humano (hDll4) observados en los dfas 7 y 14 despues del tratamiento con el Ac contra el Dll4 (REGN421) (1 mg/kg o 5 mg/kg) o del tratamiento con el hFc (5 mg/kg), dos veces por semana durante 2 semanas, y en el dfa 28, despues del cese del tratamiento. Las cifras de las graficas de puntos representan los porcentajes medios (media ± EEM) de las pCD y de las cCD (Fig. 8A) o de los Tregs (Fig. 8B) entre las celulas totales en el timo.
Las Fig. 9A - 9B muestran los efectos del bloqueo del Dll4 en un modelo de raton de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Fig. 9A: la grafica muestra las tasas de incidencia de la enfermedad EAE (%) por grupo de tratamiento. Fig. 9B: la grafica muestra el desarrollo de la EAE basada en las puntuaciones promedio de la enfermedad. El tratamiento fue con un Ac anti-Dll4 (REGN577) (▼) antes de la induccion; Ac de control de isotipo (♦) antes de la induccion; REGN577 tras la induccion (A); o un Ac anti-VLA-4 (PS/2) antes de la induccion (■).
La Fig. 10 muestra los efectos del bloqueo del Dll4 sobre la produccion de IL-17 y de IFN-y en los nodulos linfaticos de ratones con EAE. Los niveles de la IL-17 (panel izquierdo) y del IFN-y (panel derecho) en los nodulos linfaticos de los ratones con EAE tratados con el Ac contra el Dll4 (■) o con el Ac de control hFc (□) se midieron en los dfas 12 y 18 mediante un ELISA.
Las Fig. 11A - 11E muestran los efectos del Ac contra el Dll4 en un modelo de raton diabetico NOD. La Fig. 11A muestra el % de incidencia de diabetes (dos lecturas consecutivas de un nivel de glucosa en sangre mayor de 250 mg/dl) entre los ratones que recibieron bien el Ac de control hFC (•) o bien el Ac anti-Dll4 (REGN577) (■) a las 9 semanas de edad. Tambien se muestra el % de incidencia de diabetes en cinco ratones que habfan sido tratados con el Ac contra el Dll4 y posteriormente se les inyecto el Ac PC61 a las 20 semanas (♦). El Ac PC61 es un anticuerpo anti-CD25 y agota los linfocitos Treg. La Fig. 11B muestra la medicion mediante un ELISA de las producciones del autoanticuerpo anti-insulina (□) y del autoanticuerpo anti-decarboxilasa de acido glutamico 65 (GAD65) (■) en ratones NOD tratados con el Ac contra el Dll4 o con el control de hFc, en comparacion con los ratones naturales sin tratar (WT). La Fig. 11C muestra secciones de pancreas tenidas con hematoxilina y eosina (H&E) de ratones NOD tratados con el Ac contra el Dll4 (panel izquierdo) o con el control de hFc (panel derecho). Las flechas negras indican los islotes pancreaticos individuales, y las flechas blancas indican las celulas infiltrantes en el islote (panel derecho). La Fig. 11D muestra el numero de islotes pancreaticos (panel izquierdo) o el % de islotes pancreaticos infiltrados (panel derecho) en el pancreas de los ratones tratados con el control de hFc (□) o con el Ac contra el Dll4 (■). La Fig. 11E muestra los cambios en el nivel de glucosa en sangre en los ratones tratados, al inicio de la enfermedad, con el Ac contra el Dll4 (•) o con el control de hFc (□), durante 42 dfas despues del tratamiento.
Descripcion detallada
Antes de que se describan los presentes metodos, debe entenderse que esta invencion no esta limitada a los metodos y las condiciones experimentales descritas en particular, ya que dichos metodos y condiciones pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento es unicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante, dado que el ambito de la presente invencion estara limitado unicamente por las reivindicaciones anexas.
Segun se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural salvo que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un metodo" incluye uno o mas metodos y/o etapas del tipo descrito en el presente documento y/o que seran evidentes para las personas expertas en la materia tras la lectura de esta divulgacion.
Salvo que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual en la materia a la que pertenece esta invencion. Aunque en la practica o en el ensayo de la presente invencion puede usarse cualquier metodo y material similar equivalente a los descritos en el presente documento, ahora se describen los metodos y los materiales preferidos.
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Definiciones
El termino "antagonistas del Dll4", segun se usa en el presente documento, incluye anticuerpos contra el Dll4 y fragmentos de los mismos capaces de bloquear la union del Dll4 a un receptor Notch (tal como Notchl y Notch4) y/o de bloquear las rutas de senalizacion Dll4-Notch (vease, por ejemplo, el documento WO 2008/076379), protefnas de fusion que comprenden el dominio extracelular del Dll4 fusionado a un componente multimerizante, o fragmentos de los mismos (veanse por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. n° 2006/0134121 y 2008/0107648), peptidos y pepticuerpos (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.138.370), y similares, que bloquean la interaccion entre el Dll4 y un receptor Notch. El termino engloba antagonistas, tales como moleculas pequenas, anticuerpos o fragmentos de union al antfgeno de los mismos, y similares, que se unan especfficamente a los receptores Notch (por ejemplo, anticuerpos anti-Notch1, anticuerpos anti-Notch4, etc.) y bloqueen las rutas de senalizacion Dll4-Notch.
El termino "anticuerpo", segun se usa en el presente documento, pretende referirse a moleculas de inmunoglobulina formadas por cuatro cadenas de polipeptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes de disulfuro. Cada cadena pesada esta formada por una region variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una region constante de la cadena pesada (Ch). La region constante de la cadena pesada esta formada por tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera esta formada por una region variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera esta formada por un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en unas regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones en marco (FR). Cada Vh y Vl esta formada por tres CDR y por cuatro FR, dispuestas desde el amino terminal hacia el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Los metodos y las tecnicas para la identificacion de las CDR en las secuencias de aminoacidos de la HCVR y de la LCVR son conocidos en la materia y pueden ser aplicados para la identificacion de las CDR en las secuencias de aminoacidos especificadas de la HCVR y/o de la LCVR divulgadas en el presente documento. Las convenciones que pueden usarse para la identificacion de los lfmites de las CDR incluyen la definicion de Kabat, la definicion de Chotia y la definicion de AbM. En terminos generales, la definicion de Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia, la definicion de Chotia se basa en la ubicacion de las regiones estructurales en bucle y la definicion de AbM es un compromiso entre las metodologfas de Kabat y de Chotia. Vease, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 9268-9272 (1989). Tambien hay disponibles bases de datos publicas para la identificacion de las secuencias de las CDR en un anticuerpo
Tambien es posible la sustitucion de uno o mas residuos de la CDR o la omision de una o mas CDR. En la bibliograffa cientffica se han descrito anticuerpos en los que pueden dispensarse una o dos CDR para la union. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antfgenos, basandose en las estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente entre un quinto y un tercio de los residuos de la CDR entran realmente en contacto con el antfgeno. Padlan tambien descubrio muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenfan aminoacidos en contacto con un antfgeno (vease tambien Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320: 415-428).
Los residuos de la CDR que no entran en contacto con el antfgeno pueden ser identificados basandose en los estudios previos (por ejemplo, a menudo, los residuos H60-H65 en la CDRH2 no son necesarios), en las regiones de CDR de Kabat que esta fuera de las CDR de Chotia, mediante un modelado molecular y/o empfricamente. Si una CDR o algun residuo de la misma esta omitido, habitualmente esta sustituido por un aminoacido que ocupa la posicion correspondiente en otra secuencia de un anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para las sustituciones en las CDR y los aminoacidos que se van a sustituir tambien pueden seleccionarse empfricamente. Las sustituciones empfricas pueden ser unas sustituciones conservativas o no conservativas.
El termino "anticuerpo" tambien incluye anticuerpos que tienen un patron de glucosilacion modificado. En algunas aplicaciones, puede ser util una modificacion para eliminar los sitios de glucosilacion indeseables, o por ejemplo, la eliminacion de una fraccion de fucosa para aumentar la funcion de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ACDC) (vease Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, la eliminacion del sitio de N- glucosilacion puede reducir unas reacciones inmunitarias indeseables frente a los anticuerpos terapeuticos, o aumentar la afinidad de los anticuerpos. En otras aplicaciones mas, puede realizarse una modificacion en la galactosilacion con objeto de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CCD).
El termino "fragmento de union al antfgeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de anticuerpo"), segun se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse especfficamente al hDll4, o a cualquier otra protefna objetivo prevista. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, una molecula de Fv monocatenaria (scFv), un fragmento dAb, unas unidades de reconocimiento mfnimo que consisten en los residuos de aminoacidos que mimetizan la region hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento que contiene una
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CDR, o una CDR aislada). Otras moleculas modificadas, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, tambien estan englobadas en la expresion "fragmento de union al antfgeno", segun se usa en el presente documento. En ciertas realizaciones, el anticuerpo o los fragmentos de anticuerpos de la invencion pueden estar conjugados con una fraccion terapeutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un farmaco quimioterapeutico, un inmunosupresor o un radioisotopo.
Un fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo comprendera normalmente al menos un dominio variable. El dominio variable puede tener cualquier tamano o composicion de aminoacidos, y generalmente comprendera al menos una CDR que sera adyacente o estara en marco con una o mas secuencias en marco. En los fragmentos de union al antfgeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden estar situados el uno respecto del otro en cualquier disposicion adecuada. Por ejemplo, la region variable puede ser dimerica y contener dfmeros de Vh-Vh, de Vh-Vl o de Vl-Vl. Alternativamente, el fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomerico.
En ciertas realizaciones, un fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Algunos ejemplos no limitantes de configuraciones de dominios variables y constantes que pueden encontrarse en un fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo de la presente invencion incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh- Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) VL-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuracion de dominios variable y constante, incluyendo cualquiera de los ejemplos de configuraciones indicados anteriormente, los dominios variable y constante pueden estar unidos directamente entre sf, o pueden estar unidos por una bisagra completa o parcial, o por una region de conexion. Una region de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o mas) aminoacidos que dan como resultado una union flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una unica molecula de polipeptido. Ademas, un fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo de la presente invencion puede comprender un homodfmero o un heterodfmero (u otro multfmero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante indicadas anteriormente en una asociacion no covalente entre sf y/o con uno o mas dominios Vh o Vl monomericos (por ejemplo, mediante puentes de disulfuro).
Al igual que con las moleculas de anticuerpos completas, los fragmentos de union al antfgeno pueden ser monoespecfficos o multiespecfficos (por ejemplo, biespecfficos). Un fragmento de union al antfgeno multiespecffico de un anticuerpo comprendera normalmente al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable es capaz de unirse especfficamente a un antfgeno distinto o a un epftopo diferente del mismo antfgeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecffico puede ser adaptado para su uso en el contexto de un fragmento de union al antfgeno de un anticuerpo de la presente invencion mediante el uso de tecnicas rutinarias disponibles en la materia.
El termino "anticuerpo humano", segun se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas germinales humanas. Los AcMc humanos de la invencion pueden incluir residuos de aminoacidos que no son codificados por las secuencias de las inmunoglobulinas germinales humanas (por ejemplo, mutaciones inducidas mediante una mutagenesis aleatoria o dirigida in vitro o mediante una mutacion somatica in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular en la CDR3. Sin embargo, el termino "anticuerpo humano", segun se usa en el presente documento, no pretende incluir AcMc en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la lfnea germinal de otra especie de mamffero (por ejemplo, de raton), en secuencias de FR humanas.
Los anticuerpos anti-Dll4 completamente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una o mas sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoacidos en las regiones en marco y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparacion con las correspondientes secuencias germinales. Dichas mutaciones pueden ser facilmente verificadas mediante la comparacion de las secuencias de aminoacidos divulgadas en el presente documento con las secuencias germinales disponibles, por ejemplo, en bases de datos publicas de secuencias de anticuerpos. La presente invencion incluye anticuerpos y fragmentos de union al antfgeno de los mismos que derivan de cualquiera de las secuencias de aminoacidos divulgadas en el presente documento, en los que uno mas aminoacidos de una o mas regiones en marco y/o CDR estan mutados en los correspondientes residuos de la secuencia germinal de la que derivo el anticuerpo, o en los correspondientes residuos de otra secuencia germinal humana, o con respecto a las sustituciones conservativas de aminoacidos de los correspondientes residuos germinales (dichos cambios en las secuencias se denominan conjuntamente en el presente documento "mutaciones germinales"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la region variable de la cadena pesada y ligera, divulgadas en el presente documento, puede producir facilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de union al antfgeno que comprenden una o mas retromutaciones individuales germinales o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, todos los residuos en marco y/o de la CDR de los dominios Vh y/o Vl estan retromutados a los residuos que se encuentran en la secuencia germinal original a partir de la cual derivo el anticuerpo. En otras realizaciones, unicamente estan retromutados algunos residuos de la secuencia germinal original, por ejemplo, unicamente los residuos mutados que se encuentran en los primeros 8 aminoacidos de la FR1 o en los ultimos 8 aminoacidos de la FR4, o unicamente los residuos mutados que se encuentran en la CDR1, en la CDR2 o en la CDR3. En otras realizaciones, uno o mas de los residuos en marco y/o
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de la CDR estan mutados en los correspondientes residuos de una secuencia germinal diferente (es decir, una secuencia germinal que es diferente de la secuencia germinal a partir de la cual derivo originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invencion pueden contener cualquier combinacion de dos o mas mutaciones germinales en las regiones en marco y/o CDR, por ejemplo, en las que ciertos residuos individuales estan mutados en los correspondientes residuos de una secuencia germinal en particular, mientras que otros ciertos residuos que difieren de la secuencia germinal original se mantienen o se mutan en los correspondientes residuos de una secuencia germinal diferente. Una vez obtenidos, puede comprobarse facilmente que los anticuerpos y los fragmentos de union al antfgeno que contienen una o mas mutaciones germinales, tienen una o mas de las propiedades deseadas, tales como, una especificidad de union mejorada, una afinidad de union mejorada, unas propiedades biologicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (segun sea el caso), una inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y los fragmentos de union al antfgeno obtenidos de esta forma general estan englobados en la presente invencion.
En el presente documento se describen anticuerpos anti-Dll4 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoacidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o mas sustituciones conservativas. Por ejemplo, en el presente documento se describen anticuerpos anti-Dll4 que tienen unas secuencias de aminoacidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, 2 o 1, sustituciones conservativas de aminoacidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoacidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR divulgadas en el presente documento. En una realizacion, una HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 116 con 10 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 116 con 8 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 116 con 6 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 116 con 4 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion mas, una HCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 116 con 2 o 1 sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En una realizacion, una LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 118 con 10 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 118 con 8 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 118 con 6 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion, una LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 118 con 4 o menos sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma. En otra realizacion mas, una LCVR comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 118 con 2 o 1 sustituciones conservativas de aminoacidos en la misma.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante" pretende referirse a un anticuerpo cuya union al Dll4 da como resultado la inhibicion de la actividad biologica del Dll4. Esta inhibicion de la actividad biologica del Dll4 puede ser evaluada mediante la medicion de uno o mas indicadores de la actividad biologica del Dll4. Estos indicadores de la actividad biologica del Dll4 pueden ser evaluados mediante uno o mas de los diversos ensayos estandar in vitro o in vivo conocidos en la materia. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad del Dll4 es evaluada mediante la inhibicion de la union del Dll4 a un receptor Notch. Asimismo, el termino tambien es aplicable a los anticuerpos contra otros objetivos, tales como Notch1 y Notch4; dichos anticuerpos inhiben las actividades biologicas de los objetivos, inhibiendo asf las interacciones o las rutas de senalizacion Dll4-Notch.
El termino "que se une especfficamente," o similares, significa que un anticuerpo o el fragmento de union al antfgeno del mismo forma un complejo con un antfgeno que es relativamente estable en condiciones fisiologicas. La union especffica puede estar caracterizada por una constante de disociacion en equilibrio de al menos aproximadamente 1 x 10"6 M o menos (por ejemplo, una menor Kd representa una union mas fuerte). Los metodos para la determinacion de si dos moleculas se unen especfficamente son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, una dialisis en equilibrio, una resonancia de plasmon superficial, y similares. Un anticuerpo aislado que se une especfficamente al hDll4 puede mostrar, sin embargo, una reactividad cruzada con otros antfgenos tales como moleculas de Dll4 de otras especies. Ademas, los anticuerpos multiespecfficos (por ejemplo, biespecfficos) que se unen al hDll4 y a uno o mas antfgenos adicionales son considerados no obstante anticuerpos que "se unen especfficamente" al hDll4, segun se usa en el presente documento.
El termino "Kd", segun se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociacion en equilibrio de una interaccion anticuerpo-antfgeno en particular.
El termino anticuerpo de "elevada afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos que se unen al Dll4 con una Kd de aproximadamente 1 nM o menos, de aproximadamente 500 pM o menos, de aproximadamente 400 pM o menos, de aproximadamente 300 pM o menos, de aproximadamente 200 pM o menos o de aproximadamente 100 pM o menos, o de aproximadamente 50 pM o menos, medida mediante una resonancia de plasmon superficial, por ejemplo, BIACORE™, o mediante un ELISA de afinidad en disolucion.
El termino "resonancia de plasmon superficial", segun se usa en el presente documento, se refiere a un fenomeno optico que permite el analisis de las interacciones bioespecfficas en tiempo real mediante la deteccion de las
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alteraciones en las concentraciones de protefnas en una matriz de un biosensor, por ejemplo, mediante el uso del sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia, y Piscataway, N.J.).
El termino "epftopo" es una region de un antfgeno a la que se une un anticuerpo. Los epftopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epftopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epftopos estructurales y tienen aquellos residuos que contribuyen a directamente a la afinidad de la interaccion. Los epftopos pueden ser conformacionales, es decir, estar formados por aminoacidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epftopos pueden incluir determinantes que son agrupamientos de moleculas superficiales qufmicamente activos tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener unas caracterfsticas estructurales tridimensionales especfficas y/o unas caracterfsticas de carga especfficas. Un epftopo normalmente incluye al menos 3 y mas habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica.
El termino "tratamiento" o "tratar", segun se usa en el presente documento, pretende indicar procedimientos tanto profilacticos (o preventivos) como terapeuticos, salvo que se indique de otro modo. Los sujetos en necesidad de tratamiento incluyen no solo aquellos que han desarrollado una afeccion, un trastorno o una enfermedad en particular, sino tambien aquellos que estan predispuestos o son susceptibles al desarrollo de dicha afeccion, trastorno o enfermedad y que se benefician de los procedimientos profilacticos, de forma que la aparicion o la reaparicion, o la progresion si se produce, de dicha afeccion, trastorno o enfermedad se reduce, en comparacion con aquellas en ausencia del tratamiento.
Por la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz", "cantidad profilacticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el cual es administrada. La cantidad exacta dependera del fin del tratamiento, de la edad y del tamano del sujeto que se va a tratar, de la via de administracion, y similares y podra ser determinada por el experto en la materia mediante el uso de tecnicas conocidas (vease, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Descripcion general
La presente invencion se basa en parte en los hallazgos de que el bloqueo del Dll4 por parte de un anticuerpo especffico para el Dll4 da como resultado un aumento en el numero de linfocitos Treg, que a su vez, previene, reduce o retrasa la progresion de la EAE o de la diabetes en ratones. Para una descripcion de un Ac totalmente humano contra el Dll4, incluyendo un Ac recombinante humano contra el Dll4, vease la Publicacion de Patente Internacional n° WO 2008/076379.
Administracion terapeutica y formulaciones
La presente invencion proporciona un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) segun se define en las reivindicaciones para su uso en metodos para la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende el antagonista del Dll4. La composicion farmaceutica que comprende el antagonista del Dll4 puede comprender adicionalmente uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes analgesicos, agentes reductores de la glucosa en sangre, y similares (vease la siguiente seccion). Las composiciones terapeuticas pueden ser administradas con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que son incorporados en formulaciones para proporcionar una mejora en la transferencia, la administracion, la tolerancia, y similares. Una multitud de formulaciones apropiadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los qufmicos farmaceuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, unguentos, gelatinas, ceras, aceites, lfpidos, vesfculas que contienen lfpidos (cationicos o anionicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen carbowax. Vease tambien Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
Para una administracion sistemica, la dosis terapeuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentracion en circulacion que incluya la CI50 segun se determina en el cultivo celular. Dicha informacion puede usarse para determinar de forma mas precisa las dosis utiles en seres humanos. Las dosis iniciales tambien pueden ser estimadas a partir de los datos in vivo, por ejemplo, de modelos animales, mediante el uso de tecnicas que son bien conocidas en la materia. El experto habitual en la materia podrfa optimizar facilmente la administracion a seres humanos basandose en los datos con animales.
La dosis puede variar dependiendo de la edad y del tamano (por ejemplo, del peso corporal o del area superficial corporal) del sujeto al que se le va a administrar, de la enfermedad objetivo, de las condiciones, de la via de administracion, y similares. Para la administracion sistemica de los antagonistas del Dll4, en particular, para los anticuerpos contra el Dll4, los intervalos de dosificacion tfpicos para una administracion intravenosa estan en una
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dosis diaria de desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 50 mg/kg o desde aproximadamente 0,2 hasta aproximadamente 10 mg/kg. Para una administracion subcutanea, los anticuerpos pueden ser administrados a desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 800 mg, desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 500 mg, desde aproximadamente 20 mg hasta aproximadamente 400 mg, desde aproximadamente 30 mg hasta aproximadamente 300 mg o desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 200 mg, a una concentracion de anticuerpo, al menos, de aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 75 mg/ml, de aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 125 mg/ml, de aproximadamente 150 mg/ml, de aproximadamente 175 mg/ml, de aproximadamente 200 mg/ml o de aproximadamente 250 mg/ml, al menos, entre 1 y 5 veces al dfa, entre 1 y 5 veces por semana o entre 1 y 5 veces al mes. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser administrados inicialmente a traves de una inyeccion intravenosa, seguido de una administracion subcutanea secuencial.
Se conocen diversos sistemas de administracion y pueden ser usados para la administracion de la composicion farmaceutica, por ejemplo, una encapsulacion en liposomas, micropartfculas, microcapsulas, celulas recombinantes capaces de expresar virus mutantes, endocitosis mediada por un receptor (vease, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Algunos metodos de introduccion incluyen, pero no se limitan a, las vfas intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural y oral. La composicion puede ser administrada mediante cualquier via conveniente, por ejemplo, mediante una infusion o una inyeccion en bolo, mediante su absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, la mucosa oral, rectal y la mucosa intestinal, etc.), y pueden ser administrados junto con otros agentes biologicamente activos. La administracion puede ser sistemica o local.
La composicion farmaceutica tambien puede ser administrada en una vesfcula, en particular en un liposoma (vease Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, paginas 353-365; Lopez-Berestein, ibid., paginas 317327; vease de forma general ibid.).
En ciertas situaciones, la composicion farmaceutica puede ser administrada en un sistema de liberacion controlada. En una realizacion, puede usarse una bomba (vease Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). En otra realizacion, pueden usarse materiales polimericos; vease Medical Applications of Controlled Release Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). En otra realizacion mas, puede colocarse un sistema de liberacion controlada en las proximidades del objetivo de la composicion, requiriendo asf unicamente una fraccion de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, paginas 115-138, 1984).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificacion para inyecciones intravenosas, subcutaneas, intracutaneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden ser preparadas mediante metodos conocidos publicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante la disolucion, la suspension o la emulsificacion del anticuerpo o de su sal descrito anteriormente en un medio acuoso o en un medio oleoso esteril usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones existen, por ejemplo, solucion salina fisiologica, una solucion isotonica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse junto con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no ionico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 mol) un aducto de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso se emplean, por ejemplo, aceite de sesamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencflico, etc. La inyeccion asf preparada se introduce preferentemente en una ampolla apropiada. La composicion farmaceutica puede ser administrada por via subcutanea o intravenosa con una aguja y una jeringa estandar. Ademas, con respecto a la administracion subcutanea, un dispositivo de administracion en pluma tiene facilmente aplicaciones en la administracion de una composicion farmaceutica. Dicho dispositivo de administracion en pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administracion en pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho sustituible que contiene una composicion farmaceutica. Una vez que se ha administrado toda la composicion farmaceutica del cartucho, y el cartucho esta vacfo, el cartucho vacfo puede ser facilmente desechado y sustituido por un nuevo cartucho que contiene la composicion farmaceutica. El dispositivo de administracion en pluma puede entonces ser reutilizado. En un dispositivo de administracion en pluma desechable no hay ningun cartucho sustituible. Mas bien, el dispositivo de administracion en pluma desechable esta precargado con la composicion farmaceutica, contenida en un deposito en el interior del dispositivo. Una vez que el deposito se ha vaciado de la composicion farmaceutica, se desecha la totalidad del dispositivo.
Numerosos dispositivos de administracion en pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administracion subcutanea de una composicion farmaceutica. Algunos ejemplos incluyen, pero ciertamente no se limitan a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), pluma DISEtRoNIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™,
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OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo unos pocos. Algunos ejemplos de dispositivos de administracion en pluma desechables que tienen aplicaciones en la administracion subcutanea de una composicion farmaceutica incluyen, pero ciertamente no se limitan a, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly).
Ventajosamente, las composiciones farmaceuticas para un uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificacion en una dosis unitaria adecuada para que se ajuste a una dosis de los principios activos. Dichas formas de dosificacion en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pfldoras, capsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del antagonista del Dll4, tal como de un anticuerpo contra el Dll4, contenida es generalmente de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 800 mg por forma de dosificacion en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyeccion, se prefiere que el anticuerpo este contenido en desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg, y en desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 250 mg para las demas formas de dosificacion.
En una cierta realizacion, puede ser deseable la administracion de las composiciones farmaceuticas localmente en el area en necesidad de tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo y no como limitacion, mediante una infusion local durante una cirugfa, una aplicacion topica, por ejemplo, mediante una inyeccion, mediante un cateter o mediante un implante, siendo el implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, fibras o sustitutos de la piel comerciales.
Terapias de combinacion
El antagonista del Dll4 de la invencion puede ser proporcionado solo o junto con uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tales como agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes analgesicos, agentes reductores de la glucosa en sangre directos o indirectos, y similares. Algunos inmunosupresores adecuados incluyen, pero no se limitan a, glucocorticoides, ciclosporina, metotrexato, interferon p (IFN-p), tacrolimus, sirolimus, azatioprina, mercaptopurina, opioides, micofenolato, protefnas de union al TNF, tales como infliximab, eternacept, adalimumab, y similares, antibioticos citotoxicos, tales como dactinomicina, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina, mitramicina, y similares, anticuerpos dirigidos a celulas inmunitarias, tales como anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-CD3, y similares. Algunos agentes antiinflamatorios y/o analgesicos adecuados para las terapias de combinacion con antagonistas anti-Dll4 incluyen, corticosteroides, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), tales como acido acetilsalicflico, ibuprofeno, naproxeno y similares, antagonistas del TNF-a (por ejemplo, Infliximab o REMICADE® de Centocor Inc.; golimumab de Centocor Inc.; etanorcept o ENBREL® de Amgen/Wyeth; adalimumab o HUMIRA® de Abbott Laboratories, y similares), antagonistas de la IL-1 (por ejemplo, protefnas de fusion de union a la IL-1, por ejemplo, ARCALYST® de Regeneron Pharmaceuticals, Inc., vease la Patente de EE.UU. n° 6.927.044; KINERET® de Amgen, y similares), antagonistas de la IL-6 (por ejemplo, anticuerpos anti-receptor de la IL-6, segun se divulga en la Patente de EE.UU. n° 7.582.298 y ACTEmrA® de Roche), paracetamol, morfinomimeticos, y similares. Algunos agentes reductores de la glucosa adecuados incluyen, pero no se limitan a, insulina y analogos de la misma, biguanidas, sulfonamidas y derivados de urea derivados de los mismos, inhibidores de la alfa- glucosidasa, tiazolidinadiona y derivados de la misma, inhibidores de la peptidasa de dipeptidilo 4, goma guar, repaglinida, nateglinida, exenatida, pramlintida, benfluorex, liraglutida, mitiglinida, inhibidores de la reductasa de aldosa, y similares.
El antagonista del Dll4, tal como un hAc contra el Dll4 o un fragmento del mismo y el (los) agente(s) terapeutico(s) adicional(es) descritos anteriormente pueden ser coadministrados conjuntamente o por separado. Cuando se usan formulaciones de dosis individuales, el anticuerpo o un fragmento del mismo de la invencion y los agentes adicionales pueden ser administrados simultaneamente, o por separado en momentos escalonados, es decir, secuencialmente, en los ordenes apropiados.
Kits
En el presente documento tambien se describe un artfculo de elaboracion o kit, que comprende un material de envasado, un recipiente y un agente farmaceutico contenido en el recipiente, en el que el agente farmaceutico comprende al menos un antagonista del Dll4, tal como un anticuerpo contra el Dll4 y al menos un agente terapeutico adicional, y en el que el material de envasado comprende una etiqueta o un prospecto que muestra las indicaciones y las instrucciones para su uso. El antagonista del Dll4 y el agente terapeutico adicional pueden estar contenidos en recipientes individuales.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se establecen para proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgacion y una descripcion completa de como elaborar y usar las composiciones de la invencion, y no pretenden limitar el ambito de lo que los inventores contemplan como su invencion. Se han realizado esfuerzos para asegurar una precision con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero tambien deberfan tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura esta en grados centfgrados, la presion es la atmosferica o cercana, y las barras de
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En los ejemplos que siguen, se usaron los siguientes anticuerpos en PBS de Dulbecco (GIBCO® INVITROGEN™) 1X complementado con un 3 % de FCS, para la tincion de las celulas con el fin de una citometrfa de flujo: para las CD, anticuerpos contra la protefna reguladora de la senalizacion a (Sirp-a; n° de catalogo P84; BD Biosciences), los B220 (n° de catalogo RA3-6B2), el PDCA-1 (n° de catalogo eBio927), el CD8 (n° de catalogo 53-6.7), el CD11 b (n° de catalogo M1/70), el MHCII (n° de catalogo M5/114.15.2), el CD11c (n° de catalogo N418) y el CD135 (n° de catalogo A2F10), respectivamente; para los linfocitos T, B y NK, anticuerpos contra el CD4 (n° de catalogo GK1.5 o L3T4), el CD3 (n° de catalogo 145-2C11), el CD25 (n° de catalogo PC61 o 7D4), el CD44 (n° de catalogo IM7), FoxP3 (n° de catalogo FJK16s); y F4/80 (n° de catalogo BM8), NK1.1 (n° de catalogo PK136), IgM (n° de catalogo II/41), IgD (n° de catalogo 26-11c), CD43 (n° de catalogo S7), CD21 (n° de catalogo eBio4E3), HSA (n° de catalogo M1/69) y CD23 (n° de catalogo B3B4), respectivamente, (todos de eBioscience).
Ejemplo 1: efecto del bloqueo del Dll4 sobre el desarrollo de los linfocitos B, las celulas dendrfticas y los linfocitos T
Se ha demostrado que la inhibicion Dll4-Notch1 da lugar a un bloqueo completo en el desarrollo de los linfocitos T, acompanado por la aparicion ectopica de linfocitos B y por una expansion de las celulas dendrfticas (CD) que puede surgir a partir de la conversion del destino de una celula Pro-T a una CD en el timo (Hozumi et al., 2008, J Exp Med 205 (11): 2507-2513; Koch et al., 2008, J Exp Med 205 (11): 2515-2523; y Feyerabend et al., 2009, Immunity 30: 113). Sin embargo, todavfa se desconoce que estadio especffico del desarrollo de las CD se ve directamente afectado por el bloqueo del Dll4.
Para responder a esta pregunta, a ratones C57B1/6 de 6 semanas de edad (Jackson Labs) se les inyectaron por via subcutanea 5 o 25 mg/kg del Ac anti-Dll4 (REGN577) (n = 5) o un fragmento Fc humano (control) (n = 5), dos veces a la semana durante dos semanas. El REGN577 se preparo internamente basandose en la secuencia publicada (documento WO 2007/143689). El REGN 577 se une al Dll4 humano y de raton, pero no se une de forma detectable a los DII1 y JAG1 humanos. Catorce (14) dfas despues de la inyeccion, se recogieron los timos y los bazos y se digirieron a 37 °C durante 30 min en medio RPMI 1640 completo (Invitrogen) complementado con un 10 % de suero bovino fetal (FCS) y que contiene colagenasa D (Sigma Aldrich). Para detener la reaccion se anadio EDTA 2 mM y la suspension de organos se paso a traves de un colador de celulas de 70 mm. Se recogio la medula osea (BM) de cada raton mediante el lavado de los femures y de las tibias con medio RPMI 1640 completo complementado con un 10 % de FCS, y las celulas se resuspendieron en medio RPMI. Los subconjuntos de linfocitos T, de linfocitos B y de CD fueron evaluados mediante una citometrfa de flujo, tras lo cual las celulas se tineron con los anticuerpos contra los marcadores especfficos descritos anteriormente. Las celulas tenidas se analizaron con un citometro de flujo BD™ LSR II (BD Biosciences) y los datos fueron analizados mediante el uso del programa informatico FlowJo (version 8.8.6; Tree Star Inc.).
La Fig. 1A y la 1B se muestran las poblaciones de linfocitos T y B en el timo. Segun se muestra en la Fig. 1A, el bloqueo del Dll4 indujo un aumento significativo en el numero de linfocitos T dobles negativos ("DN''; CD4'CD8') y una disminucion en el numero de linfocitos T dobles positivos ("DP"; CD4+CD8+) en el timo. Ademas, el mismo tratamiento indujo una aparicion ectopica de linfocitos B en el timo, que surgieron a partir de Pro-linfocitos T (es decir, celulas cD44+CD25'CD4'CD8' en el estadio DN1) (vease la Fig. 1 B). Por el contrario, el bloqueo del Dll4 no tuvo ningun efecto sobre el desarrollo de los linfocitos B en la medula osea (Fig. 2A) ni en las subpoblaciones de linfocitos B perifericos esplenicos (Fig. 2B). Adicionalmente, el bloqueo del Dll4 indujo la expansion de las CD convencionales ("cCD"; b220-CD11c+) y de las CD plasmacitoides ("pCD"; PDCA1+B220+CD11C+) en el timo (Fig. 3A), con una expansion significativa comenzando el dfa 7 (p < 0,001) hasta el dfa 14 (p < 0,001) y que continuo hasta el dfa 21 (p < 0,01) (Fig. 3B) despues de la inyeccion inicial del Ac contra el Dll4. Las cifras de los graficos de puntos de la Fig. 3A representan los porcentajes medios de las CD entre las celulas totales en el dfa 14. Ademas, las CD estaban expandidas en la periferia de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 (REGN577). En la Tabla 1 se muestra el numero de veces de aumento en el porcentaje y en las cifras absolutas de CD en el bazo tras el tratamiento con el Ac contra el Dll4, en comparacion con los ratones de control (tratados con el hFc).
Tabla 1
Dfas despues de la inyeccion inicial
Numero de veces de aumento en el porcentaje Numero de veces de aumento en las cifras absolutas
3
1,0 1,0
7
1,1 1,1
14
1,6 2,0
21
1,3 1,7
Se sabe que las cCD, las pCD y los monocitos del tejido linfoide comparten un progenitor comun denominado "precursor de macrofagos y de CD" o "MDP", que puede ser identificado por su fenotipo de superficie "Lin- cKithiCD115+FLT3+", mientras que un progenitor distinto denominado "precursor comun de las CD" o "CDP" con "Lin-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
cKit'°CD115+FLT3+" esta restringido a la produccion de cCD y de pCD. Aunque los monocitos pueden desarrollar muchas de las caracterfsticas fenotfpicas de las CD en condiciones inflamatorias, las estirpes de cCD, de pCD y de monocitos se separan en el momento que alcanzan sus tejidos, y ni los monocitos ni las pCD se desarrollan en cCD en unas condiciones de estado estacionario. Al contrario que los monocitos y las pCD, se cree que las cCD del tejido linfoide emergen a partir de la medula osea en forma de celulas inmaduras que deben diferenciarse y dividirse adicionalmente ^ en los organos linfoides. Las pre-CD (MHCIIl°CD11cintCD135+Sirp-aint) y las pre-CD tardfas (MHCIIl°CD11cint), son precursores principalmente de las cCD que aparecen en la medula osea (Liu et al., 2009, Science 324: 392-397).
Para la identificacion de cualquier efecto del Ac contra el Dll4 sobre la homeostasis de las CD progenitoras, se evaluaron los niveles de los MDP y de los CDP en el timo, en la medula osea y en el bazo mediante una citometrfa de flujo. Los MDP y los CDP solo fueron detectados en la medula osea, pero no en el timo ni en el bazo (datos no mostrados). Adicionalmente, el bloqueo del Dll4 no indujo la expansion de los progenitores tempranos en la medula osea en comparacion con los ratones tratados con el control. Por lo tanto, el resultado sugirio que el Ac contra el Dll4 podrfa actuar en un estadio tardfo, es decir, en un estadio pre-CD, en el desarrollo de las CD, en lugar de los MDP y los CDP.
Consecuentemente, se buscaron las pre-CD y las pre-CD tardfas en el timo y en la medula osea mediante el uso de la citometrfa de flujo. Segun se muestra en la Fig. 3C, las CD MHClI^CDUc^, que normalmente estan presentes en la medula osea, solo se expandieron en el timo 14 dfas despues del tratamiento con el Ac contra el Dll4 (p < 0,001), mientras que no se detecto expansion de las CD MHCirCD11cint en la BM de los mismos ratones (datos no mostrados). Por lo tanto, la expansion de las CD originada a partir del estadio pre-CD estaba restringida al timo. Para la evaluacion del origen de las CD MHClI^CDUc^ en el timo, se llevo a cabo una citometrfa de flujo para la identificacion de las CD MHCIIloCD11cint en la poblacion de celulas pro-T DN1 (CD4'CD8'CD44+CD25‘). Segun se muestra en la Fig. 3D, las CD MHCIIloCD11cint se detectaron en la poblacion de celulas pro-T DN1 tras el bloqueo con el Dll4 en el dfa 3. No se detectaron CD MHCIIloCD11cint en ausencia del tratamiento con el Ac contra el Dll4, asf como en las poblaciones de celulas T DN2, DN3 y DN4 tras el tratamiento con el Ac contra el Dll4 (datos no mostrados). No se observo ningun cambio en la homeostasis de las CD perifericas tras el tratamiento con el Ac contra el Dll4 (datos no mostrados). Por lo tanto, el bloqueo del Dll4 indujo una expansion significativa de las CD MHCIIloCD11cint en la poblacion de celulas pro-T DN1 en el timo en el dfa 3 (p < 0,01) (Fig. 3D), con un pico de expansion en el dfa 14 (p < 0,001) (datos no mostrados). Mientras tanto, los subconjuntos de CD maduras se expandieron en el dfa 7 (p < 0,001) hasta el dfa 21 (p < 0,01) en el timo, segun se ha analizado mas arriba (vease la Fig. 3B).
Para analizar si la expansion de las CD podrfa originarse a partir de precursores de linfocitos T no comprometidos, las celulas clasificadas DN1 CD45.1+Lin- se transfirieron intratfmicamente a ratones hospedadores CD45.2+ tratados con el Ac anti-Dll4. Se averiguo que las celulas CD45.1+ se acumulaban en el estadio DN1 (datos no mostrados) y se detectaron y se expandieron CD inmaduras (imCD) en el timo (Fig. 4) (p < 0,01). No se detectaron celulas en los ratones tratados con el Ac de control, posiblemente debido a que la mayor parte de las celulas DN1 transferidas fueron eliminadas por una seleccion negativa de los linfocitos T. Se concluyo que el bloqueo del Dll4 promueve el desarrollo de una estirpe alternativa de CD intratfmica originaria de un progenitor comun DN1 de T/CD.
El ligando de cinasa de tirosina 3 de tipo Fms (Flt3-L) es suficiente y esencial para la diferenciacion de los progenitores de la medula osea en las CD y para el desarrollo de las CD perifericas. Los niveles sericos del Flt3-L no se modificaron en los animales WT tratados con el Ac anti-Dll4 (datos no mostrados). Adicionalmente, segun se muestra en las siguientes Tablas 2 y 3, los porcentajes de CD en el timo se expandieron en los ratones naturales (WT) (Tablas 2 y 3), en los ratones inactivados para el FLt3-L (Flt3-L_/_) (p < 0,05) (Tabla 2) y en los ratones inactivados para el Flt3-R (Flt3-R_/_) (p < 0,001) (Tabla 3), todos tratados con el Ac contra el Dll4, en comparacion con los tratados con el Ac de control. Por lo tanto, el bloqueo del Dll4 induce una expansion de las CD independiente del Flt3 en el timo.
Tabla 2
Ratones
% de CD en el timo de los ratones tratados con:
El Ac de control El Ac contra el Dll4
WT
0,04 ± 0,005 0,58 ± 0,13
_l CO -1—< LL
0,04 ± 0,006 0,45 ± 0,13
Tabla 3
Ratones
% de CD en el timo de los ratones tratados con:
El Ac de control El Ac contra el Dll4
WT
0,03 ± 0,003 0,37 ± 0,03
Flt3-R'/'
0,06 ± 0,01 0,44 ± 0,02
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se ha observado la capacidad de los progenitores de los linfocitos T tempranos para redirigirse hacia un fenotipo que no es de linfocito T (James P. Di Santo, 2010, Science 329: 44-45). Se llevo a cabo un analisis de matriz genica en timocitos y en pro-linfocitos T para la determinacion del efecto del tratamiento con el Ac anti-Dll4 en los genes implicados en la especificacion de estirpe de los linfocitos T frente a los B y a las CD. Se averiguo que los genes esenciales para el compromiso de los linfocitos T (por ejemplo, Tcf7, Gata3 y Ets1) estaban regulados por disminucion, mientras que los genes (Lyl1, Sfpil) que pueden bloquear, cada uno, el desarrollo de los linfocitos T, estaban regulados por aumento (datos no mostrados; vease Di Santo, 2010, supra). Lo mas interesante es que los genes que controlan el desarrollo de las CD (PU.1 y Spi-B) y de los linfocitos B tambien estaban regulados por aumento (datos no mostrados; vease M. Merad et al., 2009, Bood 113: 3418-3427). Ademas, la expresion de RelB y de Id2, asf como la de los factores reguladores del interferon (IRF) 2, 4 y 8, unos factores de transcripcion clave implicados en el desarrollo del subconjunto de CD, estaba aumentada (datos no mostrados; vease Merad et al., 2009, supra). Finalmente, se averiguo que la expresion genica del CSF-1 (M-CSF), una citocina clave implicada en el desarrollo de las CD, estaba regulada por aumento tras el tratamiento con el Ac anti-Dll4 (p < 0,05; datos no mostrados). Adicionalmente, los niveles sericos del CSF-1 estaban aumentados tras el tratamiento con el Ac anti- Dll4 (Fig. 5; p < 0,05) (vease B. Francke, et al., 2008, Blood 111: 150-159). Por lo tanto, puede concluirse que el bloqueo de la senalizacion Dll4 Notch regula por disminucion los factores de transcripcion especfficos para el compromiso de la estirpe de linfocitos T, mientras que regula por aumento otros cruciales en el desarrollo de las CD.
Ejemplo 2: efecto de la delecion del Dll4 sobre el desarrollo de los linfocitos T
Para evaluar si el efecto del Dll4 sobre el desarrollo de las CD observado en el Ejemplo 1 anterior era intrfnseco al Dll4, se prepararon ratones Dll4COIN, en los que el Dll4 esta inactivado condicionalmente. Los alelos "condicionales por inversion (COIN)" son alelos que se basan en un elemento invertible ("elemento COIN") para proporcionar mutaciones condicionales mediadas por la recombinasa. Los ratones Dll4COIN contienen un constructo de recombinasa Cre inducible con tamoxifeno, el CreERT2, que codifica para una recombinasa Cre fusionada con un dominio de union al ligando de estrogenos mutante (ERT2). El CreERT2 es esencialmente inactivo en ausencia de tamoxifeno, y tampoco es activado por los estrogenos endogenos. El tratamiento con tamoxifeno de los ratones activara el CreERT2 y provocara la inversion del elemento COIN, que anula la transcripcion de todos los exones secuencia abajo del punto de insercion del COIN, inactivando asf el Dll4. Para los detalles del sistema de recombinasa CreERT2, vease Feil et al., 1997, Biochemical and Biophysical Research Communications 237: 752757.
A los ratones Dll4COIN (n = 6) se les inyecto intraperitonealmente (i.p.) tamoxifeno (TAM) (n° de catalogo T-5648, Sigma) a 3 mg/150 pl de aceite de mafz por raton tres (3) veces a la semana durante 2 semanas. A los ratones de control Dll4COIN (n = 6) se les administro aceite de mafz sin tamoxifeno. Asimismo, se trataron ratones naturales C5B1/6 con tamoxifeno (n = 6) o unicamente con aceite de mafz (n = 6). Se monitorizaron los signos de distres (por ejemplo, aspecto del pelaje, baja actividad, etc.), infecciones y una excesiva perdida de peso corporal en los ratones. Los ratones se pesaron aproximadamente tres veces por semana. Cualquier raton que perdio mas de un 20 % de peso corporal se elimino del experimento. Despues de 2 semanas de tratamiento, se recogieron los timos y se analizaron las celulas tfmicas mediante una citometrfa de flujo.
Segun se muestra en la Fig. 6, en ausencia del Dll4 (es decir, en los ratones tratados con tamoxifeno), los linfocitos B, y tanto las pCD como las cCD, se expandieron en el timo, en comparacion con los ratones tratados con aceite de mafz, lo que indica que los efectos del Dll4 sobre el desarrollo y la homeostasis de las CD observado en el Ejemplo 1 eran de hecho intrfnsecos al Dll4. Por lo tanto, parece que la senalizacion Dll4-Notch sostiene el compromiso de los linfocitos T mediante la supresion de la potencial estirpe no linfocftica T entre la poblacion de celulas pro-T.
Ejemplo 3: efecto del bloqueo del Dll4 o de la delecion del Dll4 sobre la homeostasis de los Tregs
Recientemente se ha demostrado que los Tregs son esenciales para el mantenimiento del numero normal de CD. Tras el agotamiento de los Treg existe un aumento por compensacion de las CD dependiente de la cinasa de tirosina de tipo Fms 3 (Flt3) (Liu et al., 2009, supra). Adicionalmente, dos grupos independientes demostraron un control por retroalimentacion de la homeostasis de los linfocitos T reguladores por parte de las CD in vivo; es decir, un aumento en las cifras de las CD da lugar a un aumento en la division y la acumulacion de los Treg, que podrfa prevenir el desarrollo de una enfermedad autoinmune (Darrasse-Jeze G. et al., 2009, J Exp. Med. 206 (9): 18531862; y Swee LK et al., 2009, Blood 113 (25): 6277-6287).
Para determinar si el bloqueo del Dll4 podrfa afectar a la homeostasis de los Treg, se midieron las cifras de los Treg en los timos de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 o con el Fc humano (control) del Ejemplo 1 mediante una citometrfa de flujo. Segun se muestra en la Fig. 7A, el bloqueo del Dll4 dio como resultado una robusta expansion de los Tregs en el timo en el dfa 14 despues de la inyeccion inicial. La expansion de los Tregs comenzo en el dfa 7 (p < 0,001) y aumento hasta un efecto maximo en el dfa 14 en el timo (p < 0,001) despues de la inyeccion inicial (vease la Fig. 7B), mientras que la periferia (es decir, en el bazo) los Tregs empezaron a aparecer unicamente los dfas 14 y 21 (p < 0,05) (Fig. 7B y Tabla 4). En la Tabla 4 se muestra el numero de veces de aumento en el porcentaje y en el numero absoluto de Tregs en el bazo tras el tratamiento con el Ac contra el Dll4, en comparacion con los ratones de control (tratados con el hFc).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Dias despues de la inyeccion inicial
Numero de veces de aumento en el porcentaje Numero de veces de aumento en las cifras absolutas
3
1,0 1,0
7
1,0 1,2
14
1,1 1,7
21
1,1 1,2
Para evaluar si la expansion observada de los Treg era intrfnseca a la molecula de Dll4, tambien se midieron las cifras de los Treg en el timo de los ratones Dll4COIN del Ejemplo 2 mediante una citometrfa de flujo. Segun se observa con el bloqueo del Dll4 por parte del Ac contra el Dll4, la inactivacion condicional del Dll4 con el tratamiento con tamoxifeno tambien dio como resultado la expansion de los Tregs en el timo, en comparacion con los ratones tratados con aceite de mafz (vease la Fig. 7C) asf como con los ratones naturales tratados con tamoxifeno (datos no mostrados). Por lo tanto, la senalizacion Dll4-Notch sostiene las CD y consecuentemente la homeostasis de los Treg y el compromiso de los linfocitos T.
Se llevo a cabo un experimento similar en ratones que expresan el Dll4 humano ("ratones Dll4 humanizados") mediante el uso del Ac anti-Dll4 (el REGN421, que tiene las secuencias de la HCVR y de la LCVR de las SEQ iD NO: 116 y 118, respectivamente), del que se sabe que se une a un dominio DSL N terminal del Dll4 humano. El raton Dll4 humanizado se preparo mediante la sustitucion de la totalidad del dominio extracelular del gen Dll4 de raton por la correspondiente region extracelular del gen del Dll4 humano (7 kb) en celulas madre embrionarias (ES) de F1 C57BL/6/129. Se generaron ratones hDll4 homocigoticos y se cruzaron en un trasfondo de C57BL/6. Los ratones Dll4 humanizados se trataron con 5 mg/kg del hFc (control; n = 6) o con 1 mg/kg (n = 6) o con 5 mg/kg (n = 6) del Ac REGN421 dos veces por semana durante dos semanas. Se sacrificaron dos ratones de cada grupo de tratamiento en el dfa 7, y se sacrificaron 2 ratones mas por grupo en el dfa 14. Se recogieron los timos, y las celulas se tineron y se analizaron mediante una citometrfa de flujo. El resto de los ratones se dejo en recuperacion durante 4 semanas adicionales sin ningun tratamiento, y en el dfa 28 despues del cese del tratamiento, fueron sacrificados y las celulas del timo se analizaron mediante el uso de una citometrfa de flujo. Despues de dos semanas de tratamiento se observo un aumento en las cCD y en las pCD (Fig. 8A), asf como un aumento significativo en la poblacion de Treg (Fig. 8B) en el timo de los ratones tratados con el Ac anti-Dll4 (p < 0,01). En el timo de los ratones que recibieron el Ac contra el Dll4 durante 2 semanas, seguido de 4 semanas sin tratamiento, las cifras tanto de las CD como de los Treg volvieron a los niveles normales al final del periodo (Fig. 8A y 8B). Mientras tanto, tambien se observo una expansion de las CD y de los Tregs en la periferia de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4, en comparacion con los ratones tratados con hFc (datos no mostrados).
Ejemplo 4: efecto del bloqueo del receptor Notch sobre los Tregs
Se ha demostrado que una expansion de las CD da lugar a una expansion de los Tregs (Darrasse-Jeze G. et al., 2009). Como se ha analizado anteriormente, se observo que despues del bloqueo del Dll4, tanto las CD como los Tregs se expandieron en el timo (Fig. 3A y Fig. 7A). Ademas, tambien se encontro una expansion tanto de los porcentajes como de las cifras absolutas de las CD y de los Tregs en la periferia de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 (Tablas 1 y 4). Con objeto de determinar si el bloqueo de los receptores Notch darfa lugar al mismo fenotipo que la delecion del Dll4, se estudiaron ratones inactivados para la nicastrina (KO) (Nic-/-). La nicastrina es una molecula implicada en la ruta de senalizacion Notch, y la ablacion genetica de la nicastrina en ratones deficientes en nicastrina da como resultado un bloqueo en la transduccion de senales secuencia debajo de los receptores Notch 1, 2, 3 y 4 (Aifantis et al., datos no publicados). Se demostro que los ratones inactivados para la nicastrina mostraban un fenotipo similar al de los ratones con el Dll4 delecionado/bloqueado, con un aumento en las cifras de los Tregs, tanto en el porcentaje como en las cifras absolutas, tanto en el timo como en el bazo (vease Tabla 5).
Tabla 5
Treg
Timo Bazo
Ratones de control
Ratones inactivados para la nicastrina Ratones de control Ratones inactivados para la nicastrina
Treg (%) en las celulas CD3+CD4+
3,3 ± 0,2 15,2 ± 2,0 (p < 0,1) 16,0 ± 1,3 33,9 ± 2,1 (p < 0,0001)
Proporcion entre las cifras absolutas (Treg/Teff)
0,04 ± 0,002 0,2 ± 0,03 (p < 0,01) 0,2 ± 0,01 0,6 ± 0,06 (p < 0,0001)
Finalmente, cuando se transfirieron celulas de medula osea (BM) de ratones Nic-/" a ratones WT irradiados letalmente, se observo la expansion de los Tregs del timo en quimeras Nic-/ WT, lo que sugiere que dicha
expansion era un efecto autonomo de la celula; y el bloqueo del Dll4 de los ratones receptores del Ac anti-Dll4 no tenia ningun efecto aditivo (vease Tabla 6).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Donantes de BM
% de Treg en las celulas CD3+CD4+ de los ratones WT receptores tratados con:
El Ac de control
El Ac anti-Dll4
WT
3,6 ± 0,4 35 ± 4
Nic'/'
37 ± 2 41 ± 2
Estos resultados sugieren que la interrupcion de la senalizacion Dll4-Notch mediante el bloqueo del Dll4 o de los receptores Notch da lugar a unos fenotipos similares con respecto a la expansion de los Tregs.
Para determinar si la expansion de los Tregs tras el bloqueo del Dll4 se correlaciona con las cifras de las CD (Darrasse-Jeze G. et al., 2009, supra), se prepararon ratones que carecen de CD y se probaron con el Ac contra el Dll4 igual que en el Ejemplo 1. A ratones transgenicos que expresan el receptor de la toxina difterica de primate (DTR) se les confiere sensibilidad a la toxina (DT) en sus celulas, que de otro modo serfan insensibles a la DT. La DT entra en las celulas a traves de una interaccion de su subunidad B con el DTR celular y, despues de una endocitosis, la subunidad A de la DT es liberada y cataliza la ADP-ribosilacion del factor de elongacion 2, que da como resultado la inhibicion de la sfntesis de protefnas, seguido de una rapida apoptosis tanto en las celulas en mitosis como en las diferenciadas a termino. La especificidad y la cronologfa de la ablacion celular pueden ser determinadas mediante elementos promotores/potenciadores restringidos al tipo celular, y mediante el regimen de la administracion de la toxina, respectivamente. Para dirigir la sensibilidad frente a la DT a las CD, Jung et al. (2002, Immunity 17: 211-220) han generado ratones (ratones cre-DTR CD11) que portan un transgen que codifica para una protefna de fusion de DTR de simio-GFP (protefna fluorescente verde) bajo el control del promotor CD11 c murino. Dado que el CD11 c codifica para todas las CD, todos los subconjuntos de CD murinas que expresan el CD11c son delecionados tras la administracion de la DT.
Los ratones transgenicos asf preparados que carecen de CD se trataron con el Ac contra el Dll4 o con el control de hFc segun el protocolo descrito en el Ejemplo 1. Catorce (14) dfas despues del tratamiento, se recogieron los timos y los bazos y se prepararon para su analisis. El nivel de expresion del Dll4 en las superficies de los subconjuntos especfficos de celulas CD o de linfocitos T fue evaluado mediante una citometrfa con objeto de determinar a que subconjunto especffico se unfa el Ac contra el Dll4. Los resultados demostraron que las celulas CD y los linfocitos T no expresaban unos niveles detectables de Dll4 en su superficie (datos no mostrados). Esta observacion esta corroborada por el informe de que el Dll4 es expresado en la superficie de las celulas epiteliales del timo (TEC) (Koch et al. 2008, supra). Sin embargo, lo mas importante era que se averiguo que el tratamiento con el Ac contra el Dll4 de los ratones que carecen de CD no era capaz de inducir la expansion de los Treg, mientras que en los ratones naturales (es decir, en los ratones con las CD no delecionadas) tratados con el Ac contra el Dll4, aumento significativamente la proporcion de Tregs entre las celulas CD3+CD4+ (p < 0,001 ), lo que sugiere que la expansion de los Tregs despues del tratamiento con el Ac contra el Dll4 estaba mediada al menos en parte a traves de la expansion de las CD.
Ejemplo 5: efecto del bloqueo del Dll4 en una Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE)
Los linfocitos T CD4+CD25+FoxP3+ reguladores naturales (es decir, los Tregs) juegan un importante papel en el mantenimiento de la autotolerancia y en la supresion de las enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes de tipo 1, la encefalomielitis autoinmune, la GVHD y la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (Darrasse-Jeze G. et al., 2009, supra; Swee LK et al., 2009, supra; y McGreachy et al., 2005, 175 (5): 3025-3032).
Para ver si el aumento en el numero de Tregs como resultado del bloqueo del Dll4 podrfa prevenir enfermedades autoinmunes, se estudio el impacto del bloqueo del Dll4 sobre una EAE en un modelo de raton. El modelo de raton de EAE fue establecido mediante la inyeccion en la almohadilla plantar de ratones C57B1/6 del peptido glucoprotefna de mielina de oligodendrocitos (MOG) emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA), seguido (24 horas despues) por una inyeccion de toxina tosferfnica (PTX) para inducir la enfermedad. La puntuacion de la enfermedad se determino basandose en los siguientes sfntomas: (0) sin sfntomas; (1) cola flacida; (2) cola flacida con debilidad en las extremidades posteriores; (3) paralisis parcial en las extremidades posteriores; (4) paralisis completa en las extremidades posteriores; (5) paralisis en todas las extremidades; y (6) moribundo. Entre doce y veinticuatro horas antes de la inmunizacion, los ratones del grupo de induccion previa (n = 10) tambien recibieron una inyeccion subcutanea de 25 mg/kg, bien del Ac anti-Dll4 (REGN577), o bien del Ac de control de isotipo (un anticuerpo humano especffico para las CD20, preparado internamente segun la divulgacion del documento US 2008/0260641) o PS/2 (lgG2b de rata/raton contra la molecula de adhesion celular de tipo integrina murina VLA-4; n° de catalogo de la ATCC CRL-1911), mientras que los ratones del grupo posterior a la induccion (n = 10) la recibieron el mismo dfa que aparecieron los sfntomas. Se sabe que el Ac PS/2 exacerba las recafdas de la enfermedad y aumenta la acumulacion de linfocitos T CD4+ en el sistema nervioso central en un modelo de raton de recafda de la encefalomielitis autoinmune experimental (R-EAE) (Theien BE et al., 2001, J Clin Invest 107 (8): 995-1006). Las inyecciones de los anticuerpos se llevaron a cabo dos veces por semana, durante dos semanas. Al finalizar el experimento, se extrajeron cuidadosamente las medulas espinales de los ratones, se trituraron y despues se incubaron en un medio RPMI 1640 que contiene colagenasa D (Sigma Aldrich). Se anadio EDTA a 2 mM para
5
10
15
20
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35
40
45
detener la reaccion y la mezcla se paso a traves de un colador de celulas de 70 mm, y el contenido celular se analizo mediante una citometna de flujo.
Segun se muestra en la Fig. 9A y en la 9B, los ratones tratados con el Ac de control de isotipo desarrollaron smtomas (es decir, teman unas puntuaciones de enfermedad mayores de "0") que comenzaban alrededor de los 1014 dfas, y que teman un pico entre los dfas 15 y 21, despues de las inyecciones de la MOG. Por el contrario, los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 estaban totalmente protegidos frente a la progresion de la enfermedad en comparacion con los ratones tratados con el Ac de control. La Tabla 7 muestra el numero de veces de aumento en el porcentaje y en las cifras absolutas de los Tregs en el timo y en el bazo de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4, en comparacion con los ratones tratados con el Ac de control.
Tabla 7
Dfas despues de la inyeccion de la MOG
Treg en el timo Treg en el bazo
Numero de veces de aumento en el porcentaje
Numero de veces de aumento en las cifras absolutas Numero de veces de aumento en el porcentaje Numero de veces de aumento en las cifras absolutas
12
2,46 0,77 1,08 1,46
18
4,88 2,67 1,23 1,89
21
1,41 1,01 1,85 4,77
Parecfa que los Treg se expandfan principalmente en el timo alrededor del dfa 18, y se observa una expansion significativa en la periferia (es decir, en el bazo) unicamente despues del dfa 21.
En estas condiciones experimentales en particular, el tratamiento con el Ac contra el Dll4 en la fase posterior a la induccion no mostro ninguna mejora significativa en la progresion de la enfermedad. Las dosis y/o la frecuencia de las administraciones del Ac contra el Dll4 pueden ajustarse adicionalmente con el conocimiento del experto en la materia. De forma importante, sin embargo, los ratones que habfan recibido una induccion previa con el Ac contra el Dll4 mostraron una disminucion significativa en la infiltracion celular en la medula espinal el dfa 18, en comparacion con aquellos que recibieron el Ac de control (vease la siguiente Tabla 8). La infi ltracion celular observada en la medula espinal de los ratones tratados con el Ac de control podna ser una contribucion importante al proceso patologico en esos ratones.
Segun se muestra en la Tabla 8, se produjo una disminucion de 8 veces (p < 0,0001) en los macrofagos (F4/80+), una disminucion de 2,7 veces (p < 0,0001) en los linfocitos NK, una disminucion de 1,7 veces (p < 0,001) en las celulas CD11b y una disminucion de 2,5 veces (p < 0,001) en los linfocitos B en la medula espinal de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4, en comparacion con la medula espinal de los ratones tratados con el Ac de control en el dfa 21.
Tabla 8
Dfas despues de la inyeccion de la MOG
Numero absoluto de celulas infiltrantes en la medula espinal (x 106)
Macrofagos
Linfocitos NK Linfocitos B Celulas mieloides CD11 b+
Control
Ac contra el Dll4 Control Ac contra el Dll4 Control Ac contra el Dll4 Control Ac contra el Dll4
12
0,4 ± 0,05 0,3 ± 0,01 0,2 ± 0,03 0,1 ± 0,004 0,3 ± 0,005 0,2 ± 0,006 0,9 ± 0,09 0,6 ± 0,02
18
1,7 ± 0,5 0,2 ± 0,02 0,2 ± 0,06 0,1 ± 0,005 1,8 ± 0,2 1,0 ± 0,08 4,7 ± 0,7 1,8 ± 0,1
21
1,6 ± 0,1 0,2 ± 0,01 0,8 ± 0,07 0,3 ± 0,03 1,5 ± 0,1 0,6 ± 0,02 4,8 ± 0,1 2,9 ± 0,2
Adicionalmente, la produccion de IL-17 y de IFN-y en los nodulos linfaticos de los ratones tratados con el Ac contra el Dll4 habfa disminuido significativamente (p < 0,001) (Fig. 10). Por lo tanto, el Dll4 podna estar implicado en la patogenia de la EAE mediante la mediacion en el desarrollo de las Th1, y el tratamiento con el Ac contra el Dll4 puede prevenir la induccion de la enfermedad mediante el bloqueo de la secrecion de las citocinas Th1 y Th17.
Ejemplo 6. Efecto del bloqueo del Dll4 sobre la diabetes
Tambien se probo el efecto sobre la diabetes del bloqueo del Dll4 en ratones NOD/ShiLtJ ("ratones NOD"), un modelo poligenico de la diabetes de tipo 1 (Makino S et al., 1980, Jikken Dobutsu 29 (1): 1-13; Serreze DV et al., 1997, J Immunol 158 (8): 3978-86). La diabetes en los ratones NOD/ShiLtJ esta caracterizada por una insulitis y una infi ltracion de leucocitos en los islotes pancreaticos. Espontaneamente se producen unas notables disminuciones en el contenido de insulina en el pancreas de las hembras de aproximadamente 12 semanas de edad, y varias semanas despues en los machos. Consecuentemente, los niveles de glucosa en plasma aumentan hasta mas de 250 mg/dl. Dos veces por semana, se comprobaron los niveles de glucosa en sangre de los ratones NOD, mediante

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
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    50
    1. Un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) para su uso en la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, en el que el antagonista del Dll4 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especfficamente al Dll4 humano (hDll4) y bloquea las rutas de senalizacion Dll4-Notch, y el antagonista bloquea una interaccion entre el Dll4 y el receptor Notch, aumentando asf el numero de linfocitos Treg, y la esclerosis multiple se previene, se trata o se mejora, y en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas pesadas de las SEQ ID NO: 22, 24 y 26, respectivamente, y una region variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligeras de las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente.
  2. 2. El antagonista del Dll4 para su uso segun la reivindicacion 1, en el que:
    (i) el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de la HCVR de la SEQ ID NO: 20 o de la SEQ ID NO: 116; y
    (ii) el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de la LCVR de la SEQ ID NO: 28 o de la SEQ ID NO: 118.
  3. 3. El antagonista del Dll4 para su uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una combinacion de HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 20/28 o de la 116/118.
  4. 4. El antagonista del Dll4 para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores junto con al menos un agente terapeutico adicional seleccionado entre un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio y un agente analgesico, opcionalmente en el que:
    (i) el agente terapeutico adicional es al menos uno seleccionado entre glucocorticoides, ciclosporina, metotrexato, farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINES), antagonistas del TNF-a, antagonistas de la IL-1, antagonistas de la IL-6 y opioides;
    o
    (ii) el antagonista del Dll4 y al menos un agente terapeutico adicional son para una administracion simultanea o secuencial.
  5. 5. Uso de un antagonista del ligando de tipo delta 4 (Dll4) en la preparacion de un medicamento para la prevencion, el tratamiento o la mejora de la esclerosis multiple, en el que el antagonista del Dll4 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une especfficamente al Dll4 humano (hDll4) y bloquea las rutas de senalizacion Dll4-Notch, y el antagonista bloquea una interaccion entre el Dll4 y el receptor Notch, aumentando asf el numero de linfocitos Treg, y la esclerosis multiple se previene, se trata o se mejora, y en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una region variable de la cadena pesada (HCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas pesadas de las SEQ ID NO: 22, 24 y 26, respectivamente y una region variable de la cadena ligera (LCVR) que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de las cadenas ligeras de las SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente.
  6. 6. El uso segun la reivindicacion 5, en el que:
    (i) el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de la HCVR de la SEQ ID NO: 20 o de la SEQ ID NO: 116; y
    (ii) el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una secuencia de la LCVR de la SEQ ID NO: 28 o de la SEQ ID NO: 118.
  7. 7. El uso segun la reivindicacion 5 o 6, en el que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una combinacion de HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 20/28 o de la 116/118.
    A
    cn
    o
    imagen1
    CD25
    Fig. 1A-B
    B
    Control DII4 Ab
    imagen2
    imagen3
    B220
    imagen4
    Fig
    Bazo
    imagen5
    CM
    Q
    o
    CM
    o
    o
    Q
    O)
    imagen6
    imagen7
    2A-B
    cn
    K)
    PDCA1 B220
    0,4 ±0,2 0,06+0.03 7,6±3 0,51 ±0,17
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    CD11c 0.05 + 0.03
    0,27 ±0,09
    pDCs
    CD11c
    Fig. 3A
    Fig. 3B
    es
    % de cCD en las celulas totales
    % de pCD en las celulas totales
    imagen11
    imagen12
    0114 Ab
    II0HIA1
    imagen13
    imagen14
    Fig. 3C
    Control
    imagen15
    DII4 Ab
    imagen16
    Numero absoluto de imCD en las celulas CD45.1* en el timo (x 104)
    I—* NJ UO
    —i................i~4—............I,,.......... . I
    imagen17
    cn
    Nivel serico del CSF-1 (ng/ml)
    imagen18
    Sin tratar
    imagen19
    Ac de control Ac contra el DII4
    Fig. 5
    Aceite de maiz
    imagen20
    TAM
    0,05 ± 0,002 0,5± 0,07
    imagen21
    pDCs 0,6± 0,3
    cDCs 1,9± 0,7
    imagen22
    Fig. 6
    Control
    cn
    CD
    0114 Ab
    FoxP3
    imagen23
    — CD25 --------►
    Fig. 7A
    Fig. 7B
    imagen24
    Timo
    Aceite de maiz
    TAM
    FoxP3
    imagen25
    imagen26
    Fig. 7C
    B220
    (5mg/kg)
    imagen27
    imagen28
    (1mg/kg) (5mg/kg)
    imagen29
    CD! 1c
    Fig. 8A
    (5 mg/kg)
    imagen30
    CD25.
    (1 mg/kg) (5 mg/kg)
    imagen31
    Fig. 8B
    Fig. 9A-B
    *9
    Tasa de incidencia %
    >
    imagen32
    _
    o
    Puntuacion media
    DO
    O
    &
    ro
    —L™
    co
    -L.
    o
    03'
    C/>
    imagen33
    o
    O)
    Ol
    imagen34
    D12
    D18
    imagen35
    D12
    T
    *........r~
    D18
    Fig. 10
    CD
    CD
    Incidencia de diabetes (%)
    imagen36
    Fig. 11A
    Fig. 11B
    Z9
    Nivel del autoanticuerpo contra la IgG
    O O —^ ^ f\3 ^
    imagen37
    405 nm
    c
    D
    CD
    CO
    Cifras de islotes pancreaticos
    imagen38
    imagen39
    Fig. 11C-D
    Fig. 11E
    Nivel de glucose en sangre (mg/dl)
    o
    —s
    0)
    </>
    imagen40
    CJ1 ill O CL
    3
    CO Q.
    CL Q)'
    — cr (D
    r+
    <D
    V>
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