CN102947336B - 用dll4拮抗剂治疗糖尿病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了预防、治疗或减轻糖尿病的方法，通过对有需要的受试者施用治疗有效量的阻断D114-Notch信号途径的D114拮抗剂。如在糖尿病的小鼠模型中观察到的，D114拮抗剂通过调节T细胞（Treg）的扩增，展示了对胰岛的保护作用，降低了血糖水平，并阻断了自身抗体的产生，包括针对胰岛素和谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的自身抗体。因此，本发明还提供了降低血糖，和/或减少或阻断自身抗体产生的方法，通过对有需要的受试者施用治疗有效量的阻断D114-Notch信号途径的D114拮抗剂。合适的用于本发明的D114拮抗剂包括特异性结合D114和阻断D114-Notch相互作用的抗体或抗体片段,D114的细胞外结构域,等等。

Description

用DLL4拮抗剂治疗糖尿病的方法

发明背景

发明领域

此发明涉及使用δ样配体4(D114)拮抗剂治疗疾病、紊乱或病症的方法，其中增加调节T细胞(Treg细胞或Treg)的数量是有益的。更具体地，本发明的方法可通过用D114拮抗剂阻断D114与Notch受体的结合，从而增加Treg的数量，预防、治疗或减轻糖尿病。此外，本发明涉及用D114拮抗剂降低血糖水平，或减少或阻断自身抗体，包括分别针对胰岛素和谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的自身抗体的产生的方法。

相关领域的描述

Notch受体及其配体之间的相互作用代表了一条在进化上保守的途径，此途径不仅对细胞命运的决定很重要，而且对调节在造血作用和发育中的胸腺中的种系决定（lineagedecision）很重要(Artavanis-Tsakonas等人，1999，Science284:770-776;Skokos等人，2007;JExpMed204:1525-1531;和Amsen等人，2004，Cell117:515-526)。最近有研究显示，D114-Notch1抑制导致在T细胞发育的完全阻断，并伴随B细胞的异位出现（ectopicappearance）和树枝状细胞(DC)的扩增，DC是由胸腺内的原T细胞到DC的命运转化产生(Hozumi等人，2008，JExpMed205(11):2507-2513;Koch等人，2008，JExpMed205(11):2515-2523;和Feyerabend等人，2009，Immunity30:1-13)。因此，越来越多的证据表明，Notch信号转导对决定造血祖细胞中的细胞命运决定是至关重要的。此外，已有研究显示了DC对调节T细胞(Treg)体内平衡的体内反馈控制(Darrasse-Jèze等人，2009，JExpMed206(9):1853-1862)。然而，Notch信号转导在控制DC来源和发育，和因此在Treg体内平衡中的作用仍然未知。这是一个非常重要的问题，因为鉴定诱发Treg扩增的新方法可用于治疗自身免疫疾病和紊乱。

人D114(hD114)的核酸和氨基酸序列分别显示在SEQIDNO:1和2中。D114拮抗剂及其用途在WO2007/143689，WO2007/070671，WO2008/076379，WO2008/042236,和WO/2008/019144中公开。

发明概述

本发明是部分基于发明人的如下观察，即特异性结合D114并阻断D114结合Notch受体的抗体能够完全预防在小鼠中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)（此为人多发性硬化症的动物模型）的发展，而对照抗体没有预防EAE。此外，发明人已发现，抗D114抗体的此作用与增加的Treg细胞数有关。另外，还观察到，抗D114抗体避免了血糖水平的增加和保持了NOD/ShiLtJ小鼠（1型糖尿病的动物模型）中的胰岛数和形态,且这些作用至少部分是通过Treg的扩增介导的。

因此，在第一个方面，本发明涉及增加Treg细胞数的方法，其包括对有需要的受试者施用有效量的D114拮抗剂，其中所述D114拮抗剂阻断D114和Notch受体之间的相互作用，且Treg细胞数增加。

在第二个方面，本发明涉及预防、治疗或减轻疾病、紊乱或病症的方法，其中增加Treg细胞数是有益的,所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的D114拮抗剂。本发明的方法可治疗的疾病或紊乱是任意疾病、紊乱或病症，其通过去除、抑制或降低D114活性而受益，即改善、减轻、抑制或预防，从而在治疗的受试者中增加Treg细胞数。本发明的方法可治疗的这样的疾病或紊乱之一是糖尿病，即1型和2型糖尿病。因此，在一个实施方案中，本发明提供了预防、治疗或减轻1型或2型糖尿病的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的D114拮抗剂。

在第三个方面，本发明涉及降低血糖水平的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的D114拮抗剂。

在第四个方面，本发明涉及减少或阻断自身抗体的产生的方法，其包括对有需要的受试者施用治疗有效量的D114拮抗剂。自身抗体可包括针对胰岛素的自身抗体，针对GAD65的自身抗体，等等。

在一个实施方案中，用于上述本发明的任意方法的D114拮抗剂是D114抗体或其片段(“抗D114Ab”或“D114Ab”)，其以高亲和力特异性结合D114并阻断D114与Notch受体的结合和/或阻断D114-Notch信号途径。抗体可为多克隆、单克隆(mAb)、嵌合、人源化或全人抗体或其片段。抗体片段可为单链抗体、Fab或(Fab’)₂。

在一个实施方案中，D114Ab或其抗原结合片段结合hD114(SEQIDNO:2)的N-端结构域(残基S27-R172),或δ/Serrate/Lag-2(DSL)结构域(残基V173-C217),或N-端-DSL结构域(残基S27-C217)中的表位。在另一个实施方案中，D114Ab或其抗原结合片段结合hD114(SEQIDNO:2)的EGF结构域,即约氨基酸残基Q218-N251(结构域1),E252-D282(结构域2),D284-E322(结构域3),E324-E360(结构域4),S362-E400(结构域5),K402-E438(结构域6),H440-E476(结构域7),或S480-E518(结构域8)之一中的表位。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可结合涉及超过一种上面枚举的表位的构象表位。用于本发明的方法的D114Ab或其片段能够以高亲和力结合人D114，并具有通过表面等离子共振测量的约1nM或更低,约500pM或更低,约300pM或更低,约200pM或更低,约100pM或更低,或约50pM或更低的平衡解离常数(K_D)。

在一个实施方案中，D114Ab或其片段包含重链可变区(HCVR)，其包含3个重链互补决定区，HCDR1，HCDR2和HCDR3，分别具有SEQIDNO:22，24和26的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含轻链可变区(LDVR)，其包含3个轻链互补决定区，LCDR1，LCDR2和LCDR3，分别具有SEQIDNO:30，32和34的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab或其片段包含重链和轻链CDR序列，所述CDR序列包含SEQIDNO:22，24，26，30，32和34的CDR序列组合。在另一个实施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQIDNO:20或116的氨基酸序列,或D114Ab包含LCVR，其包含SEQIDNO:28或118的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab包含SEQIDNO:20/28(REGN281)或116/118(REGN421)的HCVR/LCVR组合。

在某些实施方案中，D114Ab包含选自下述的重链CDR1/CDR2/CDR3组合和轻链CDR1/CDR2/CDR3组合:SEQIDNO:6/8/10和SEQIDNO:14/16/18，分别地;SEQIDNO:38/40/42和SEQIDNO:46/48/50，分别地;SEQIDNO:54/56/58和SEQIDNO:62/64/66，分别地;SEQIDNO:70/72/74和SEQIDNO:78/80/82，分别地;SEQIDNO:86/88/90和SEQIDNO:94/96/98，分别地;和SEQIDNO:102/104/106和SEQIDNO:110/112/114，分别地。在另一个实施方案中，D114Ab包含HCVR，其包含SEQIDNO:4，36，52，68，84,或100的氨基酸序列,或LCVR，其包含SEQIDNO:12，44，60，76，92,或108的氨基酸序列。在另一个实施方案中，D114Ab包含选自:SEQIDNO:4/12(REGN279);SEQIDNO:36/44(REGN290);SEQIDNO:52/60(REGN306);SEQIDNO:68/76(REGN309);SEQIDNO:84/92(REGN310);和SEQIDNO:100/108(REGN289)的HCVR/LCVR组合。

编码SEQIDNO:4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116和118的氨基酸序列的核苷酸序列分别显示在SEQIDNO:3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115和117中。

在另一个实施方案中，适用于本发明的方法的D114拮抗剂是融合蛋白，其包含与多聚化成分（multimerizingcomponent）融合的至少一种可溶性Notch受体或其能够结合D114的片段。在一个实施方案中，可溶性Notch受体是人Notch1或Notch4。在另一个实施方案中，本发明的D114拮抗剂是能够结合Notch受体的修饰的D114蛋白，但这样的结合不导致受体的活化。在某些实施方案中，本发明的D114拮抗剂是融合蛋白，其包含与多聚化成分，例如免疫球蛋白结构域，例如，人IgG的Fc结构域融合的D114的细胞外结构域或其片段。在某些实施方案中，D114拮抗剂包括可阻断D114-Notch相互作用的小分子和其他试剂。

在第五个方面，本发明涉及上述任意方法，其中将D114拮抗剂与至少一种另外的治疗剂同时或相继地共同施用，例如，降血糖剂（例如胰岛素、胰岛素类似物等等）,例如，免疫抑制剂（immunosuppressiveagent）或免疫抑制剂（immunosuppressant），抗炎剂，镇痛剂，等等)，其中多种治疗剂可能具有彼此重叠的治疗效果。用于与D114拮抗剂组合的合适的免疫抑制剂包括，但不限于，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，干扰素β(IFN-β)，他克莫司，西罗莫司，硫唑嘌呤，巯嘌呤，阿片样物质，霉酚酸酯，TNF结合蛋白，例如英夫利昔单抗（infliximab），依那西普（eternacept），阿达木单抗,等等，细胞毒性抗生素，例如放线菌素D，蒽环类，丝裂霉素C，博来霉素，光辉霉素,等等，靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体，抗CD3抗体,等等。用于与抗D114拮抗剂组合治疗的合适的抗炎剂和/或镇痛药包括，皮质类固醇，非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗剂，IL-1拮抗剂，IL-6拮抗剂，对乙酰氨基酚，吗啡类似物,等等。

在第六个方面，本发明涉及药物组合物，其包含D114拮抗剂，至少一种另外的治疗剂,和可药用的载体。在一个实施方案中，D114拮抗剂是以高亲和力特异性结合D114并中和D114活性的D114Ab或其片段,至少一种另外的治疗剂是任意上述降血糖剂,免疫抑制剂，抗炎剂，镇痛药，等等。

在第七个方面，本发明涉及试剂盒，其包含容纳本发明的药物组合物的容器,和具有使用说明的说明书（packageinsert）。在一个实施方案中，试剂盒可包含容纳特异性结合hD114的抗体或其片段的容器，和容纳至少一种上述另外的治疗剂的另一个容器。

通过以下发明详述的综述，其他目的和优势将变得显而易见。

附图简述

图1A-1B显示了Dll4阻断对T细胞和B细胞发育的影响。对小鼠注射抗D114抗体(REGN577)或对照人Fc片段(hFc)。14天后，收获胸腺，通过流式细胞术评估T细胞和B细胞亚群。图1A:显示CD4^-CD8^-(双阴性胸腺前体或“DN”)，CD4⁺CD8⁺(双阳性胸腺前体或“DP”)，CD4⁺或CD8⁺(单阳性胸腺前体或“SP”),和DN/CD44⁺CD25^-(处于DN1阶段的胸腺前体)T细胞数的点图。点图中的数字代表T细胞亚群在全部胸腺细胞中的百分比（平均值±SEM）。图1B:显示B细胞(B220⁺)在DN1细胞中的百分比(平均值±SD)的柱状图(即，用CD4^-CD8^-CD44⁺CD25^-门控)。

图2A-2B显示了D114阻断对骨髓中的B细胞发育阶段(图2A)和对脾中的B细胞体内平衡(图2B)的影响。点图中的数字代表B细胞亚群在骨髓或脾中的全部细胞中的百分比（平均值±SEM）。GC:生发中心B细胞;T1和T2:B细胞亚群;M:边缘B细胞;和Fo:滤泡B细胞。

图3A-3D显示了D114阻断对树突细胞（DC）发育的影响。图3A:显示在抗D114Ab处理后，在胸腺中的传统DC(“cDC”;B220^-CD11C⁺)和浆细胞样DC(“pDC”;PDCA1⁺B220⁺CD11C⁺)的扩增。点图中的数字代表在第14天时，DC在全部细胞中的平均百分比（平均值±SEM）。图3B:条形图显示在D114Ab处理的小鼠(■)和hFc对照处理的小鼠(□)的胸腺中的cDC和pDC扩增的动力学。图3C:点图显示Dll4Ab对胸腺中的DC前体细胞(MHCII^loCD11c^latintCD135⁺Sirp-α^int)和晚期DC前体细胞(MHCII^loCD11c^int)的影响。点图中的数字代表在第14天时，DC前体细胞在全部细胞中的平均百分比（平均值±SEM）。图3D:点图显示MHCII^loCD11c^intDC在用Dll4Ab处理的小鼠的胸腺中的DN1(CD4^-CD8^-CD44⁺CD25^-)原T细胞群中存在，但在用hFc对照Ab处理的小鼠的胸腺中不存在。点图中的数字代表在第3天时，MHCII^loCD11c^intDC在DN1原T细胞群中的平均数(平均值±SEM)。

图4显示了Dll4阻断对源自T/DCDN1共同祖细胞的胸腺内可变（alternative）DC系发育为未成熟DC(imDC)的影响。将DN1CD45.1⁺Lin^-分选细胞转移到用Dll4Ab(■)或hFc对照Ab(□)处理的CD45.2⁺宿主小鼠的胸腺内。

图5显示了Dll4阻断对参与DC发育的关键细胞因子，CSF-1(M-CSF)的血清水平的影响。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量未处理的或用同种型对照Ab(□)或Dll4Ab(■)处理的小鼠的血清CSF-1水平。

图6显示了在用三苯氧胺（TAM）处理后，遗传D114缺失对包含三苯氧胺诱导的Cre重组酶构建体，CreERT2的DLL4COIN小鼠中的B细胞和DC体内平衡的影响。点图中的数字代表B细胞、以及pDC和cDC二者在胸腺中的全部细胞中的平均百分比(平均值±SEM)。

图7A-7C显示了Dll4阻断/缺失对Treg体内平衡的影响。图7A:点图显示相比用hFc对照Ab处理的小鼠，在用D114-Ab处理2周的小鼠的胸腺内的Treg的扩增。点图中的数字代表Treg在胸腺中的CD3⁺CD4⁺T细胞中的平均百分比(平均值±SEM)。图7B:条形图分别显示在用Dll4Ab(■)和hFc对照Ab(□)处理的小鼠的胸腺(上图)和脾(下图)中的Treg发育的动力学。图7C:点图显示相比用玉米油对照处理的对照DLL4COIN，在用三苯氧胺(TAM)处理的DLL4COIN小鼠的胸腺内的Treg的扩增。点图中的数字代表Treg在胸腺中的CD3⁺CD4⁺T细胞中的平均百分比(平均值±SEM)。

图8A-8B显示了在每周2次持续2周用D114-Ab(REGN421)处理(1mg/kg或5mg/kg)或hFc处理(5mg/kg)后，在第7和14天，和在处理停止后第28天观察到的Dll4阻断对表达人D114(hD114)的小鼠胸腺中的DC(图8A)和Treg体内平衡(图8B)的影响。点图中的数字代表pDC和cDC(图8A)或Treg(图8B)在胸腺中的全部细胞中的平均百分比(平均值±SEM)。

图9A-9B显示了Dll4阻断在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中的影响。图9A:图表显示了每个处理组的EAE发病率(%)。图9B:图表显示了基于平均疾病评分的EAE的发展。处理为用抗D114Ab(REGN577)预诱导同种型对照Ab预诱导(□);REGN577后诱导(▲);或抗VLA-4Ab(PS/2)预诱导(■)。

图10显示了Dll4阻断对EAE小鼠淋巴结中的IL-17和IFN-γ产生的影响。通过ELISA在第12和18天测量了用Dll4Ab(■)或hFc对照Ab(□)处理的EAE小鼠淋巴结中的IL-17(左图)和IFN-γ(右图)的水平。

图11A-11E显示了Dll4Ab在NOD小鼠糖尿病模型中的影响。图11A显示了接受hFC对照Ab(●)或抗D114Ab(REGN577)(■)的9周龄小鼠中的%糖尿病发生率(血糖水平2次连续测定高于250mg/dL)。也显示了用Dll4Ab处理和之后在20周时注射PC61Ab的5只小鼠的%糖尿病发生率(□)。PC61Ab是抗CD25抗体并消耗Treg细胞。图11B显示了通过ELISA测量的相比未处理的野生型(WT)小鼠，在用Dll4Ab或hFc对照处理的NOD小鼠中的抗胰岛素自身抗体(□)和抗谷氨酸脱羧酶65(GAD65)自身抗体(■)的产生。图11C显示了用Dll4Ab(左图)或hFc对照(右图)处理的NOD小鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的胰腺切片。黑色箭头指示单独的胰岛，白色箭头指示胰岛内的浸润细胞(右图)。图11D显示了在用hFc对照处理的(□)或D114Ab处理的(■)小鼠胰腺中的胰岛数(左图)或%浸润的胰岛(右图)。图11E显示了在处理后42天在疾病发作时用D114Ab(●)或hFc对照(□)处理的小鼠中的血糖水平的改变。

发明详述

在描述本方法以前，应当理解，此发明不受限于描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可改变。还应当理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，无意为限制性的，因为本发明的范围仅受限于随附的权利要求书。

如在此说明书和随附的权利要求书中所使用的，单数形式“一个”，“一种”,和“所述”包括复数形式，除非上下文明确地另外指出。因此例如，提及“一种方法”包括本文描述的，和/或在阅读了此公开后对本领域技术人员显而易见的类型的一种或多种方法,和/或步骤。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与此发明所属领域普通技术人员通常理解的具有相同的含义。尽管可使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任意方法和材料实践或检验本发明，现在描述优选方法和材料。本文提及的所有出版物以其整体引入本文作为参考。定义

术语“D114拮抗剂”，如本文使用的，包括能够阻断D114结合Notch受体(例如Notch1和Notch4)和/或阻断D114-Notch信号途径(见，例如，WO2008/076379)的针对D114的抗体及其片段，包含与多聚化成分融合的D114细胞外结构域的融合蛋白,或其片段(见例如，美国专利公开号2006/0134121和2008/0107648)，阻断D114和Notch受体之间的相互作用的肽和肽体（peptibody）(见，例如，美国专利号7,138,370),等等。因此，在某些实施方案中，所述术语也包含拮抗剂，例如特异性结合Notch受体(例如，抗Notch1抗体，抗Notch4抗体，等等)和阻断D114-Notch信号途径的小分子，抗体或其抗原结合片段,等等。

术语"抗体"，如本文使用的，旨在指免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的4条多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文简称为HCVR或V_H)和重链恒定区(C_H)。重链恒定区包含3个结构域，C_H1，C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(本文简称为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，C_L。V_H和V_L区可进一步细分为名为互补决定区(CDR)的高变区，在其中穿插更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3,和FR4。

鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域已知的，其可用于鉴定在本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于鉴定CDR边界的常规方法包括Kabat定义，Chothia定义,和AbM定义。一般来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区的位置,AbM定义是Kabat和Chothia方法的折衷。见，例如，Kabat，"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,"NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991);Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997);和Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：9268-9272(1989)。用于鉴定抗体内的CDR序列的公共数据库也是现有的。

也可以取代一个或多个CDR残基或省略一个或多个CDR。在科学文献中已经描述了如下抗体，其中可省去1或2个CDR用于结合。Padlan等人(1995FASEBJ.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体及其抗原之间的接触区，并得出结论，仅约1/5至1/3的CDR残基实际接触抗原。Padlan也发现许多抗体中有1或2个CDR不含与抗原接触的氨基酸(又见，Vajdos等人2002JMolBiol320:415-428)。

可基于以前的研究(例如，CDRH2中的残基H60-H65经常是不需要的)，通过分子建模和/或实验方法从位于ChothiaCDR之外的KabatCDR区中鉴定不接触抗原的CDR残基。如果省略CDR或其残基，其通常被取代为占据另一种人抗体序列或这些序列的共有序列的对应位置上的氨基酸。也可实验选择在CDR内的取代位置和用于取代的氨基酸。实验取代可为保守或非保守取代。

术语“抗体”也包括具有修饰的糖基化模式的抗体。在一些应用中，去除不期望的糖基化位点的修饰可能是有用的,或例如，去除海藻糖部分以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(见Shield等人(2002)JBC277:26733)。在其他应用中，去除N-糖基化位点可降低针对治疗抗体的不期望的免疫应答,或提高抗体的亲和力。在其他应用中，可进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。

术语抗体的"抗原结合片段"(或简单地"抗体片段”)，如本文使用的，指保留特异性结合hD114、或任意其他预期靶蛋白的能力的抗体的一种或多种片段。抗体片段可包括Fab片段，F(ab')₂片段，Fd片段，Fv片段，单链Fv(scFv)分子，dAb片段，由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，包含CDR的片段,或分离的CDR)。其他工程分子，例如双抗体（diabody），三链抗体（triabody），四链抗体（tetrabody）和微抗体（minibody），也包括在如本文使用的措辞“抗原结合片段”中。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可缀合治疗部分(“免疫缀合物”)，例如细胞毒素，化疗药物，免疫抑制剂或放射性同位素。

抗体的抗原结合片段将一般包含至少一个可变结构域。可变结构域可为任意大小或氨基酸组成，并通常包含至少一个CDR，所述CDR与一种或多种框架序列相邻，或位于同一读框（inframewith）。在具有V_H结构域和V_L结构域相连的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可彼此处于任意合适的排列。例如，可变区可为二聚的并包含V_H-V_H，V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可包含单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含至少一个可变结构域，所述可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。在本发明的抗体的抗原结合片段内可见的可变和恒定结构域的非限制性代表构型包括:(i)V_H-C_H1;(ii)V_H-C_H2;(iii)V_H-C_H3;(iv)V_H-C_H1-C_H2;(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3;(vi)V_H-C_H2-C_H3;(vii)V_H-C_L;(viii)V_L-C_H1;(ix)V_L-C_H2;(x)V_L-C_H3;(xi)V_L-C_H1-C_H2;(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3;(xiii)V_L-C_H2-C_H3;和(xiv)V_L-C_L。在包括上面列出的任意代表构型的可变和恒定结构域的任意构型中，可变和恒定结构域可彼此直接连接，或通过完全或部分的铰链或接头区连接。铰链区可由至少2个(例如，5，10，15，20，40，60个或更多)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的灵活（flexible）或半灵活的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含上面列出的任意可变和恒定结构域构型与另一种上述构型和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域非共价连接(例如，通过二硫键)的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。

如同全抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的(例如，双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少2个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域现有的常规技术，任意的多特异性抗体形式可经改变以适用于本发明的抗体的抗原结合片段的情况。

术语"人抗体"，如本文使用的，旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变引入的突变)，例如在CDR、特别是CDR3中的。然而，术语"人抗体"，如本文使用的，不旨在包括下述mAb，其中在人FR序列上嫁接来源于另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)种系的CDR序列。

本文公开的全人抗D114抗体可包含相比对应种系序列，在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中的一种或多种氨基酸取代、插入和/或缺失。通过比较本文公开的氨基酸序列和从例如公共抗体序列数据库中得到的种系序列，可容易地确定这样的突变。本发明包括来源于本文公开的任意氨基酸序列的抗体,及其抗原结合片段，其中在一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变为抗体来源种系序列的对应残基，或另一种人种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守氨基酸取代(这样的序列改变在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地产生许多包含一个或多个独立的种系回复突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，在V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为在抗体所来源的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被回复突变为原始的种系序列，例如，仅在FR1的最初8个氨基酸内或FR4的最后8个氨基酸内的突变残基,或仅在CDR1，CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基被突变为不同种系序列(即，与抗体最初来源的种系序列不同的种系序列)的对应残基。此外，本发明的抗体可包含在框架和/或CDR区内的2个或多个种系突变的任意组合，例如，其中某个单独的残基被突变为特定种系序列的对应残基，而某个与原始种系序列不同的另外的残基被保留或被突变为不同种系序列的对应残基。一旦得到，可容易地检测包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望性能，例如改进的结合特异性、提高的结合亲和力、改进或增强的拮抗或激动生物性能(视情况而定)、降低的免疫原性，等等。以此一般方式得到的抗体和抗原结合片段包括在本发明中。

本发明也包括下述抗D114抗体，其包含本文公开的任意HCVR，LCVR,和/或CDR氨基酸序列的具有一种或多种保守取代的变体。例如，本发明包括下述抗Dll4抗体，其具有相对本文公开的任意HCVR，LCVR,和/或CDR氨基酸序列，具有例如，10个或更少，8个或更少，6个或更少，4个或更少，2个或1个保守氨基酸取代的HCVR，LCVR,和/或CDR氨基酸序列。在一个实施方案中，HCVR包含SEQIDNO:116的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQIDNO:116的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQIDNO:116的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQIDNO:116的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，HCVR包含SEQIDNO:116的氨基酸序列，其中具有2个或1个保守氨基酸取代。在一个实施方案中，LCVR包含SEQIDNO:118的氨基酸序列，其中具有10个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQIDNO:118的氨基酸序列，其中具有8个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQIDNO:118的氨基酸序列，其中具有6个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQIDNO:118的氨基酸序列，其中具有4个或更少的保守氨基酸取代。在另一个实施方案中，LCVR包含SEQIDNO:118的氨基酸序列，其中具有2个或1个保守氨基酸取代。

“中和”或“阻断”抗体，旨在指下述抗体，其与Dll4的结合导致Dll4生物活性的抑制。可通过测量Dll4生物活性的一种或多种指示，评估此Dll4生物活性的抑制。可通过本领域已知的若干标准体外或体内测定评估Dll4生物活性的这些指示。例如，通过D114结合Notch受体的抑制评估抗体中和Dll4活性的能力。同样地，术语也适用于针对其他靶，例如Notch1和Notch4的抗体；这样的抗体抑制靶的生物活性，从而抑制D114-Notch相互作用或信号途径。

术语"特异性结合"等等，指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过至少约1x10^-6M或更低的平衡解离常数表征(例如，较小的K_D表示较紧密的结合)。测定2个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，包括，例如，平衡透析，表面等离子共振,等等。然而，特异性结合hD114的分离的抗体可展示对其他抗原，例如其他物种的D114分子的交叉反应性。此外，虽然如此，认为结合hD114和一种或多种其他抗原的多特异性抗体(例如，双特异性)是如本文使用的"特异性结合"hD114的抗体。

术语"K_D"，如本文使用的，旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。

术语“高亲和力”抗体指以表面等离子共振，例如，BIACORE^TM或溶液-亲和ELISA测量的约1nM或更低，约500pM或更低，约400pM或更低，约300pM或更低，约200pM或更低,或约100pM或更低,或约50pM或更低的K_D结合D114的抗体。

术语"表面等离子共振"，如本文使用的，指通过检测生物传感器矩阵内的蛋白质浓度的改变，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIACORE^TM系统(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，Sweden和Piscataway，N.J.)。

术语"表位"是与抗体结合的抗原区。表位可被定义为结构或功能的。功能表位一般是一组结构表位，并具有对相互作用的亲和力有直接贡献的残基。表位也可为构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，决定簇是分子的化学活性表面基团，例如氨基酸，糖侧链，磷酰基,或磺酰基，在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征,和/或特定的电荷特征。表位在独特的空间构象中一般包括至少3个,和更通常地，至少5个或8-10个氨基酸。

术语“治疗”，如本文使用的，除非另外说明，旨在指预防（或预防性）和治疗程序。需要治疗的受试者不仅包括已患上特定病症、紊乱或疾病的受试者，而且包括具有患上这样的病症、紊乱或疾病的倾向或容易患上这样的病症、紊乱或疾病的受试者，所述受试者受益于预防程序，从而相比未作治疗的受试者，降低了这样的病症、紊乱或疾病的发生或复发，或发展（如果发生的话）。

短语“治疗有效量”，“预防有效量”,或“有效量”指产生施用的期望效果的量。精确的量将取决于治疗目的、接受治疗的受试者的年龄和体型（size）、施用途径,等等,可由本领域技术人员使用已知技术确定(见，例如，Lloyd(1999)TheArt，ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding)。

一般描述

本发明是部分基于以下发现，即通过D114-特异性抗体阻断D114导致Treg细胞数增加，其进而预防、减轻或延缓小鼠中的EAE或糖尿病的发展。有关全人D114Ab，包括重组人D114Ab的描述，见国际专利公开号WO2008/076379。

治疗施用和制剂

本发明提供了预防、治疗或减轻疾病或紊乱的方法，其中增加Treg细胞数是有利的，所述方法包括施用治疗有效量的包含D114拮抗剂，例如D114Ab的药物组合物。包含D114拮抗剂的药物组合物还可包含一种或多种另外的治疗剂，例如免疫抑制剂，抗炎剂，镇痛剂，降血糖剂,等等(见以下章节)。依照本发明的治疗组合物可与合适的载体、赋形剂和掺入制剂以提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起施用。许多合适的制剂可见所有药物化学家已知的药典：Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，PA。这些制剂包括，例如，粉末，糊剂，药膏，凝胶剂，蜡类，油类，脂类，含脂(阳离子或阴离子)小泡(例如LIPOFECTIN^TM)，DNA缀合物，无水吸收糊剂，水包油和油包水乳剂，乳剂聚乙二醇(多种分子量的聚乙二醇)，半固体凝胶,和含聚乙二醇的半固体混合物。又见Powell等人"Compendiumofexcipientsforparenteralformulations"PDA(1998)JPharmSciTechnol52:238-311。

用于全身施用，最初可通过体外测定估计治疗有效剂量。例如，可在动物模型中制定剂量以得到循环浓度范围，范围中包括在细胞培养物中测定的IC₅₀。这样的信息可用于更准确地确定人中的有效剂量。也可使用本领域熟知的技术，从体内数据，例如动物模型估计初始剂量。本领域普通技术人员基于动物数据可容易地优化对人的施用。

剂量可根据待施用的受试者的年龄和体型(例如，体重或体表面积)、靶疾病、病症、施用途径,等等而变化。用于D114拮抗剂，特别是用于D114抗体的全身施用，用于静脉内施用的一般剂量范围是约0.01至约100mg/kg体重，约0.1至约50mg/kg,或约0.2至约10mg/kg的每日剂量。用于皮下施用，可以约1mg至约800mg，约10mg至约500mg，约20mg至约400mg，约30mg至约300mg,或约50mg至约200mg，以至少约25mg/ml，约50mg/ml，约75mg/ml，约100mg/ml，约125mg/ml，约150mg/ml，约175mg/ml，约200mg/ml,或约250mg/ml的抗体浓度，至少，每天1至5次，每周1至5次,或每个月1至5次施用抗体。可选地，最初可通过静脉内注射施用抗体，随后通过相继的皮下施用。

多种递送系统是已知的，并可用于施用本发明的药物组合物，例如，在脂质体中封装、微粒、微囊、能够表达突变病毒的重组细胞,受体介导的胞吞(见，例如，Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入方法包括，但不限于，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任意方便的途径施用组合物，例如通过输注或团注注射，通过经上皮或粘膜皮肤层（lining）(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等等)吸收，也可与其他生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部的。

也可在小泡，特别是脂质体中递送药物组合物(见Langer(1990)Science249:1527-1533;Treat等人(1989)在LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer中，LopezBerestein和Fidler(编)，Liss，NewYork，pp.353-365;Lopez-Berestein，同上，pp.317-327;一般同上)。

在某些情况下，可在受控的释放系统中递送药物组合物。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer，见上;Sefton(1987)CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料;见，MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer和Wise(编)，CRCPres.，BocaRaton，Florida(1974)。在另一个实施方案中，受控的释放系统可位于组合物的靶附近，因此仅需要部分全身剂量(见，例如，Goodson，inMedicalApplicationsofcontrolledRelease，见上，vol.2，pp.115-138，1984)。

可注射的制品可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射，点滴输注等的剂型。可通过公知方法制备这些可注射的制品。例如，可通过例如，在传统用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上述抗体及其盐制备可注射的制品。作为用于注射的水性介质，可使用例如，生理盐水，含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液，等等，其可与合适的增溶剂例如醇(例如，乙醇)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇)，非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物)]，等等组合使用。作为油性介质，可使用例如芝麻油，大豆油，等等，其可与增溶剂例如苯甲酸苄酯，苯甲醇，等等组合使用。优选地在合适的安瓿中装满这样制备的注射剂。可使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，有关皮下递送，笔式递送装置（pendeliverydevice）可容易地用于递送本发明的药物组合物。这样的笔式递送装置可为可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用可替换的包含药物组合物的盒。一旦盒内的所有药物组合物被施用，盒变空，可容易地丢弃空盒并替换为包含药物组合物的新盒。然后可重复使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中没有可替换的盒。相反地，一次性笔式递送装置预先装满在装置内的容器中储存的药物组合物。一旦容器中的药物组合物耗尽，就丢弃整个装置。

许多可重复使用的笔式和自我注射器递送装置可用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括，但当然不限于AUTOPEN^TM(OwenMumford，Inc.，Woodstock，UK)，DISETRONIC^TMpen(DisetronicMedicalSystems，Burghdorf，Switzerland)，HUMALOGMIX75/25^TMpen，HUMALOG^TMpen，HUMALIN70/30^TMpen(EliLilly和Co.，Indianapolis，IN)，NOVOPEN^TMI，II和III(NovoNordisk，Copenhagen，Denmark)，NOVOPENJUNIOR^TM(NovoNordisk，Copenhagen，Denmark)，BD^TMpen(BectonDickinson，FranklinLakes，NJ)，OPTIPEN^TM，OPTIPENPRO^TM，OPTIPENSTARLET^TM,和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis，Frankfurt，Germany)，仅举出这几个例子。可用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括，但当然不限于SOLOSTAR^TMpen(sanofi-aventis)，FLEXPEN^TM(NovoNordisk),和KWIKPEN^TM(EliLilly)。

有利地，将用于上述口服或胃肠外使用的药物组合物制成适应活性成分剂量的单位剂量剂型。这样的单位剂量剂型包括，例如，片剂，丸剂，胶囊，注射剂(安瓿)，栓剂，等等。包含的D114拮抗剂，例如D114抗体的量一般为每单位剂量剂型约0.1至约800mg;特别地在注射剂剂型中，优选包含的抗体为约5至约100mg，用于其他剂型约10至约250mg。

在某些实施方案中，可能期望对需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物;这可通过例如(但不用于限制)手术期间的局部输注，局部应用，例如，通过注射，通过导管或通过植入物实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜，纤维或商业皮肤替代品。

组合治疗

在本发明的治疗方法中，D114拮抗剂可单独提供，或与一种或多种另外的治疗剂组合提供，例如免疫抑制剂或免疫抑制剂，抗炎剂，镇痛剂，直接或间接降血糖剂,等等。合适的免疫抑制剂包括，但不限于，糖皮质激素，环孢菌素，甲氨蝶呤，干扰素β(IFN-β)，他克莫司，西罗莫司，硫唑嘌呤，巯嘌呤，阿片样物质，霉酚酸酯，TNF结合蛋白，例如英夫利昔单抗，依那西普，阿达木单抗,等等，细胞毒性抗生素，例如放线菌素D，蒽环类，丝裂霉素C，博来霉素，光辉霉素,等等，靶向免疫细胞的抗体，例如抗CD20抗体，抗CD3抗体,等等。用于与抗D114拮抗剂组合治疗的合适的抗炎剂和/或镇痛药包括，皮质类固醇，非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生等等，TNF-α拮抗剂(例如，CentocorInc.的英夫利昔单抗或CentocorInc.的戈利木单抗;Amgen/Wyeth的依那西普或AbbottLaboratories的阿达木单抗或等等)，IL-1拮抗剂(例如，IL-1结合融合蛋白，例如，RegeneronPharmaceuticals，Inc.的见美国专利号6,927,044;Amgen的等等)，IL-6拮抗剂(例如，在美国专利号7,582,298中公开的抗IL-6受体抗体,和Roche的)，对乙酰氨基酚，吗啡类似物,等等。合适的降血糖剂包括，但不限于，胰岛素及其类似物，双胍类，磺胺类药物及其尿素衍生物，α-葡糖苷酶抑制剂，噻唑烷二酮（thiazolidinedione）及其衍生物，二肽基肽酶-4抑制剂，瓜尔豆胶，瑞格列奈，那格列奈，艾塞那肽（exenatide），普兰林肽，苯氟雷司，利拉鲁肽，米格列奈，醛糖还原酶抑制剂,等等。

D114拮抗剂，例如hD114Ab或其片段,和上述另外的治疗剂可一起或分别地共同施用。当使用单独的剂量制剂时，本发明的抗体或其片段和其他试剂可同时施用，或在交错的时间分别施用，即以合适的顺序相继施用。

试剂盒

本发明还提供了制成品或试剂盒，其包含包装材料、容器和包含在容器中的药物试剂，其中所述药物试剂包含至少一种D114拮抗剂，例如D114抗体,和至少一种另外的治疗剂,且其中所述包装材料包含显示适应症和使用说明的标签或说明书。在一个实施方案中，D114拮抗剂和另外的治疗剂可包含在单独的容器中。

实施例

提供以下实施例以为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的方法和组合物的完全公开和描述，且无意限制发明人视作其发明的范围。已经努力确保有关使用的数字（例如，量、温度等等）的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，部分是以重量计的部分，温度是以摄氏度计的，压力是在大气压下或接近大气压下，图的误差条=平均值±SEM。

在以下实施例中，用于流式细胞术的目的，使用在补充3%FCS的Dulbecco’sPBS(INVITROGEN^TM)1X中的以下抗体染色细胞：用于DC，分别用针对信号调节蛋白α(Sirp-α;货号P84;BDBiosciences)，B220(货号RA3-6B2)，PDCA-1(货号eBio927)，CD8(货号53-6.7)，CD11b(货号M1/70)，MHCII(货号M5/114.15.2)，CD11c(货号N418),和CD135(货号A2F10)的抗体;用于T，B和NK细胞，分别用针对CD4(货号GK1.5或L3T4)，CD3(货号145-2C11)，CD25(货号PC61或7D4)，CD44(货号IM7)，FoxP3(货号FJK16s);和F4/80(货号BM8)，NK1.1(货号PK136)，IgM(货号II/41)，IgD(货号26-11c)，CD43(货号S7)，CD21(货号eBio4E3)，HSA(货号M1/69),和CD23(货号B3B4)的抗体(均来自eBioscience)。

实施例1:D114阻断对B细胞，树突细胞和T细胞发育的影响

据显示，D114-Notch1抑制导致T细胞发育的完全阻断，并伴随B细胞的异位出现和树突细胞(DC)的扩增，DC是由胸腺内的原T细胞到DC的命运转化产生(Hozumi等人，2008，JExpMed205(11):2507-2513;Koch等人，2008，JExpMed205(11):2515-2523;和Feyerabend等人，2009，Immunity30:1-13)。然而，仍然不知道受D114阻断直接影响的是DC发育的哪个特定阶段。

为了回答此问题，用5或25mg/kg抗D114Ab(REGN577)(n=5)或人Fc片段(对照)(n=5)皮下注射6周龄C57B1/6小鼠(JacksonLabs)，1周2次持续2周。基于公布的序列(WO2007/143689)自制REGN577。REGN577结合人和小鼠D114，但检测不到其结合人D111和JAG1。注射后14天收获胸腺和脾，并在补充10%胎牛血清(FCS)和包含胶原酶D(SigmaAldrich)的完全RPMI1640培养基(Invitrogen)中在37°C下消化30分钟。为终止反应，加入2mMEDTA，使器官悬浮物通过70-mm细胞过滤器。通过在补充10%FCS的完全RPMI1640培养基冲洗股骨和胫骨从每只小鼠收集骨髓(BM)，并在RPMI培养基中重悬细胞。在用上述针对特定标记物的抗体染色细胞后，通过流式细胞术评估T细胞、B细胞和DC亚群。在BD^TMLSRII流式细胞仪(BDBiosciences)上操作染色的细胞，和使用FlowJo软件(版本8.8.6;TreeStarInc.)分析数据。

图1A和1B显示了胸腺中的T和B细胞群。如在图1A中显示，D114阻断诱发胸腺内双阴性(“DN”;CD4^-CD8^-)T细胞数的显著增加和双阳性(“DP”;CD4⁺CD8⁺)T细胞数的减少。另外，相同的处理诱发胸腺内B细胞的异位出现，所述B细胞来源于原T细胞(即，处于DN1阶段的CD44⁺CD25^-CD4^-CD8^-细胞)(见图1B)。相反地，D114阻断对骨髓中(图2A)或外周脾B细胞亚群中(图2B)的B细胞发育没有影响。此外，D114阻断诱发胸腺中常规DC(“cDC”;B220^-CD11c⁺)和浆细胞样DC(“pDC”;PDCA1⁺B220⁺CD11C⁺)的扩增(图3A)，在初次注射D114Ab后第7天(p＜0.001)开始显著扩增直至第14天(p＜0.001)，并继续扩增直至第21天(p＜0.01)(图3B)。在图3A的点图中的数字代表在第14天时DC在总细胞中的平均百分比。此外，DC在用D114Ab(REGN577)处理的小鼠外周中扩增。在表1中显示了相比对照小鼠(hFc处理)，用D114Ab处理后脾中DC的百分比和绝对数的增长倍数。

表1

已经知道，淋巴样组织cDC，pDC和单核细胞共有被称为“巨噬细胞和DC前体”或“MDP”的共同祖细胞，其可通过其表面表型“Lin^-cKit^hiCD115⁺FLT3⁺”鉴定，而具有“Lin^-cKit^loCD115⁺FLT3⁺”表型的被称为“共同DC前体”或“CDP”的另一种祖细胞仅能产生cDC和pDC。尽管单核细胞在炎症条件下可产生许多DC的表型特征，cDC，pDC和单核细胞系在它们到达组织时分开，单核细胞和pDC在稳定状态条件下都不发育为cDC。与单核细胞和pDC不同，认为在淋巴样组织中的cDC以不成熟的细胞形式来源于骨髓，必须在淋巴样器官中进一步分化和分裂。DC前体细胞(MHCII^loCD11c^intCD135⁺Sirp-α^int)和晚期DC前体细胞(MHCII^loCD11c^int)，是来源于骨髓的cDC的主要前体(Liu等人，2009，Science324:392-397)。

为了鉴定D114Ab对DC祖细胞体内平衡有何影响，通过流式细胞术评估了胸腺、骨髓和脾中的MDP和CDP水平。仅在骨髓中检测到MDP和CDP，而在胸腺和脾中都没有检测到(数据未显示)。此外，相比对照处理的小鼠，D114阻断不诱发骨髓中早期祖细胞的扩增。因此，结果表明D114Ab可在MDP和CDP之后的DC发育阶段起作用，即，DC前体细胞阶段。

因此，使用流式细胞术研究了胸腺和骨髓中的DC前体细胞和晚期DC前体细胞。如在图3C中所示，通常存在于骨髓中的MHCII^loCD11c^intDC仅在D114Ab处理(p＜0.001)14天后在胸腺中扩增，而在同一小鼠的BM中没有检测到MHCII^loCD11c^intDC的扩增(数据未显示)。因此，源自DC前体细胞阶段的DC扩增仅限于胸腺。为了评估胸腺中MHCII^loCD11c^intDC的来源，进行流式细胞术以鉴定DN1(CD4^-CD8^-CD44⁺CD25^-)原T细胞群中的MHCII^loCD11c^intDC。如在图3D中所示，在D114阻断后第3天检测到DN1原T细胞群内的MHCII^loCD11c^intDC。未用D114Ab处理，以及在用D114Ab处理后的DN2，DN3和DN4T细胞群中没有检测到MHCII^loCD11c^intDC(数据未显示)。在用D114Ab处理后，没有观察到外周DC体内平衡的变化(数据未显示)。因此，D114阻断在第3天诱发胸腺中的DN1原T细胞群内的MHCII^loCD11c^intDC的显著扩增(p＜0.01)(图3D)，在第14天扩增达到顶峰(p＜0.001)(数据未显示)。同时，如上所述，胸腺中的成熟DC亚群从第7天(p＜0.001)扩增至第21天(p＜0.01)(见图3B)。

为了研究DC扩增是否源自未定向的T细胞前体，将DN1CD45.1⁺Lin^-分选细胞转移至用抗D114Ab处理的CD45.2⁺宿主小鼠的胸腺内。发现，CD45.1⁺细胞在DN1阶段积累(数据未显示)，并在胸腺中检测到未成熟DC(imDC)及其扩增(图4)(p<0.01)。在对照Ab处理的小鼠中没有检测到细胞，可能是因为大多数DN1转移细胞被T细胞阴性选择排除。结论是，D114阻断促进胸腺内源自T/DCDN1共同祖细胞的胸腺内可变DC系的发育。

fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)对骨髓祖细胞发育为DC和外周DC的发育是充分和必要的。Flt3-L的血清水平在用抗D114Ab处理的WT动物中没有变化(数据未显示)。此外，如在下表2和3中所示，相比用对照Ab处理的小鼠，胸腺中的DC百分比在均用Dll4Ab处理过的野生型小鼠(WT)(表2和3)，FLt3-L敲除小鼠(Flt3-L^-/-)(p<0.05)(表2),和Flt3-R敲除小鼠(Flt3-R^-/-)(p<0.001)(表3)中扩增。因此，D114阻断诱发了胸腺中不依赖于Flt3的DC扩增。

表2

表3

已经观察到早期T淋巴祖细胞反向转换（re-derive）为非T细胞表型(JamesP.DiSanto，2010，Science329:44-45)。在胸腺细胞和原T细胞中进行了基因阵列分析，以测定抗D114Ab处理对涉及T对B和DC细胞系特化（specification）中的基因的影响。发现，对T细胞定向关键的基因(例如，Tcf7，Gata3，和Ets1)被下调，而可分别阻断T细胞发育的基因(Lyll，Sfpi1)被上调(数据未显示;见DiSanto，2010，见上)。最有趣地是，控制DC(PU.1和Spi-B)和B细胞发育的基因也被上调了(数据未显示;见M.Merad等人，2009，Bood113:3418-3427)。另外，RelB和Id2以及干扰素调节因子(IRF)2，4和8——参与DC亚群发育的关键转录因子——的表达增加了(数据未显示;见Merad等人，2009，见上)。最后，发现在用抗D114Ab处理后，参与DC发育的关键细胞因子CSF-1(M-CSF)的基因表达被上调(p<0.05;数据未显示)。此外，在用抗D114Ab处理后，CSF-1血清水平增加了(图5;p＜0.05)(见B.Francke,等人，2008，Blood111:150-159)。因此得到结论，D114-Notch信号转导阻断下调用于T细胞系定向的特异性转录因子，而上调在DC发育中重要的其他因子。

实施例2:D114缺失对T细胞发育的影响

为了评估在以上实施例1中观察到的D114对DC发育的影响是否是D114固有的，制备了DLL4COIN小鼠，其中条件失活D114。“倒位条件（Conditional-by-inversion）(COIN)”等位基因是条件等位基因，其依赖于可倒位（inversible）的元件(“COIN元件”)以提供重组酶介导的条件突变。DLL4COIN小鼠包含可用三苯氧胺诱导的Cre重组酶构建体，CreERT2，其编码与突变的雌激素配体结合结构域(ERT2)融合的Cre重组酶。CreERT2在缺乏三苯氧胺时基本无活性，也不被内源雌激素激活。用三苯氧胺处理小鼠将激活CreERT2并导致COIN元件的倒位，其取消COIN插入点下游的所有外显子的转录，从而敲除D114。有关CreERT2重组酶系统的细节，见Feil等人，1997，Biochemical和BiophysicalResearchCommunications237:752-757。

每只小鼠以三苯氧胺(TAM)(货号T-5648，Sigma)3mg/150μl玉米油腹膜内(i.p.)注射DLL4COIN小鼠(n=6)，每周3次持续2周。用不含三苯氧胺的玉米油注射DLL4COIN对照小鼠(n=6)。同样地，用三苯氧胺(n=6)或仅玉米油(n=6)处理野生型C5B1/6小鼠。监控小鼠的应激迹象(例如，皮毛外观，低活力，等等)，感染和体重的过度减少。每周大约称重小鼠3次。从实验中去除体重减少超过20%的小鼠。处理2周后，收获胸腺，通过流式细胞术分析胸腺细胞。

如在图6中所示，相比用玉米油处理的小鼠，在缺乏D114时(即，在三苯氧胺处理的小鼠中)，B细胞、及pDC和cDC二者在胸腺中扩增，指示在实施例1中观察到的D114对DC发育和体内平衡的影响的确是D114固有的。因此，D114-Notch信号转导似乎通过抑制原T细胞群内潜在的非T细胞系维持T细胞定向。

实施例3:D114阻断或D114缺失对Treg体内平衡的影响

最近有研究显示，Treg对维持DC的正常数量很重要。在Treg消耗后，存在补偿性的fms样酪氨酸激酶3(Flt3)依赖性的DC增加(Liu等人，2009，见上)。此外，2个独立的研究组显示了DC对调节性T细胞体内平衡的体内反馈控制;即，增加DC数导致增加的Treg分裂和积累，这可预防自身免疫疾病的发展(Darrasse-JezeG.等人，2009，JExp.Med.206(9):1853-1862;和SweeLK等人，2009，Blood113(25):6277-6287)。

为了测定D114阻断是否可影响Treg体内平衡，通过流式细胞术测量了实施例1中用D114Ab或人Fc(对照)处理的小鼠胸腺中的Treg数。如在图7A中所示，在初次注射后第14天，D114阻断导致胸腺内Treg的大量扩增。在初次注射后，胸腺中的Treg的扩增开始于第7天(p＜0.001)，并在第14天达到最大效果(p＜0.001)(见图7B)，而在外周(即，脾)中，Treg仅在第14和21天之间开始出现(p＜0.05)(图7B和表4)。在表4中显示了，相比对照小鼠(hFc处理的)，在用D114Ab处理后在脾中的Treg的百分比和绝对数的增长倍数。

表4

为了评估观察到的Treg扩增是否是D114分子固有的，也通过流式细胞术测量了实施例2中的DLL4COIN小鼠胸腺中的Treg数。如通过D114Ab的D114阻断中所观察到的，相比用玉米油处理的小鼠(见图7C)以及用三苯氧胺处理的野生型小鼠(数据未显示)，通过三苯氧胺处理的D114的条件失活也导致Treg在胸腺中的扩增。因此，D114-Notch信号转导维持了DC，从而维持Treg的体内平衡和T细胞定向。

使用已知结合人D114的N-端DSL结构域的抗D114Ab(REGN421，分别具有SEQIDNO:116和118的HCVR和LCVR序列)，在表达人D114的小鼠(“人源化D114小鼠”)中进行了类似实验。通过在F1C57BL/6/129的胚胎干(ES)细胞中将小鼠D114基因的整个细胞外结构域替换为对应的人D114基因的胞外区(7kb)，制备人源化D114小鼠。产生纯合hD114小鼠并在C57BL/6背景中培育。用5mg/kghFc(对照;n=6)，或1mg/kg(n=6)或5mg/kg(n=6)REGN421Ab处理人源化D114小鼠，每周2次持续2周。在第7天从每个处理组处死2只小鼠，在第14天再每组处死2只小鼠。收获胸腺并染色细胞，通过流式细胞术检查。允许其余小鼠另外恢复4周，不进行任何处理，在处理停止后第28天处死小鼠并使用流式细胞术分析胸腺细胞。在处理2周后，在用抗D114Ab处理的小鼠胸腺中观察到cDC和pDC的增加(图8A)以及Treg群的显著增加(图8B)(p＜0.01)。在接受D114Ab处理2周，随后4周不进行处理的小鼠胸腺中，DC和Treg二者数在该时期最后都恢复至正常水平(图8A和8B)。同时，相比用hFc处理的小鼠，在用D114-Ab处理的小鼠外周中也观察到DC和Treg的扩增(数据未显示)。

实施例4:Notch受体阻断对Treg的影响

已经有研究显示，DC的扩增导致Treg的扩增(Darrasse-JezeG.等人，2009)。如上所述，观察到在D114阻断后，DC和Treg都在胸腺中扩增(图3A和图7A)。另外，也发现在用D114-Ab处理的小鼠外周中，DC和Treg的百分比和绝对数都增加(表1和4)。为了确定Notch受体的阻断是否将导致与D114缺失相同的表型，研究了Nicastrin敲除(KO)小鼠(Nic^-/-)。Nicastrin是参与Notch信号转导途径的分子，在nicastrin缺陷小鼠中的nicastrin的基因剔除导致Notch受体1，2，3和4下游信号转导的阻断(Aifantis等人，未公布的数据)。研究显示，NicastrinKO小鼠展示与D114缺失/阻断小鼠类似的表型，在胸腺以及脾中具有增加的Treg数，无论是百分比还是绝对数(见表5)。

表5

最后，当将Nic^-/-小鼠的骨髓细胞(BM)转移进经过致死辐射的WT小鼠中时，在Nic^-/-→WT嵌合体中观察到胸腺Treg的扩增，表明这样的扩增是细胞自主性作用；用抗D114Ab阻断受体小鼠的D114没有累加作用(见表6)。

表6

这些结果表明，通过阻断D114或Notch受体中断D114-Notch信号转导导致在Treg扩增方面的类似的表型。

为了测定在D114阻断后的Treg扩增是否与DC数相关(Darrasse-JezeG.等人，2009，见上)，制备了缺乏DC的小鼠并如实施例1中用D114Ab检测。表达灵长类白喉毒素受体(DTR)的转基因小鼠的细胞被赋予白喉毒素(DT)敏感性，否则细胞是对DT不敏感的。DT通过其B亚基与细胞DTR的相互作用进入细胞，在内吞后释放DTA亚基并催化延长因子2的ADP核糖基化，导致蛋白质合成的抑制，随后在有丝分裂和终末分化细胞二者中的迅速凋亡。通过细胞类型特异性启动子/增强子元件和毒素施用方案可分别测定细胞剔除的特异性和时机。为了将DT敏感性靶向DC，Jung等人(2002，Immunity17:211-220)已生成了携带处于鼠CD11c启动子控制下的编码猿DTR-GFP(绿色荧光蛋白)融合蛋白的转基因的小鼠(CD11cre-DTR小鼠)。因为CD11c为所有DC编码，在施用DT后，所有表达CD11c的鼠DC亚群都被缺失。

根据实施例1中描述的方案，用D114Ab或hFc对照处理这样制备的缺乏DC的转基因小鼠。处理后14天，收获和制备胸腺和脾用于分析。通过流式细胞术评估在特定DC或T细胞亚群表面上的DII4表达水平，以测定D114Ab与哪个特定亚群结合。结果显示，DC和T细胞在其表面上不表达可检测到的D114水平(数据未显示)。此观察被DII4在胸腺上皮细胞(TEC)表面上表达的报导证实(Koch等人2008，见上)。然而最重要地，发现用Dll4Ab处理缺乏DC的小鼠不能诱导Treg的扩增，而用D114Ab处理野生型小鼠(即，DC未缺失的小鼠)显著增加了Treg在CD3⁺CD4⁺细胞中的比例(p＜0.001)，表明在用D114Ab处理后的Treg的扩增至少部分是通过DC扩增介导的。

实施例5:D114阻断对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的影响

CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺自然调节T细胞(即，Treg)在维持自体耐受性和抑制自身免疫疾病，例如1型糖尿病，自身免疫性脑脊髓炎，GVHD和炎症性肠病(IBD)(Darrasse-JezeG.等人，2009，见上；SweeLK等人，2009，见上；和McGreachy等人，2005，175(5):3025-3032)中起重要作用。

为了观察由D114阻断导致的增加的Treg数是否可预防自身免疫疾病，在小鼠模型中研究了D114阻断对EAE的影响。通过在C57B1/6小鼠的足垫中注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽，接着（24小时后）通过注射百日咳毒素(PTX)以诱发疾病，建立EAE小鼠模型。基于以下症状测定疾病得分:(0)无症状;(1)软尾;(2)软尾和后腿无力;(3)后腿部分麻痹;(4)后腿完全麻痹;(5)四肢麻痹;和(6)濒死。免疫前20至24小时，在预诱导组中的小鼠(n=10)也接受25mg/kg的抗D114Ab(REGN577)或同种型对照Ab(特异性针对CD20的人抗体，根据US2008/0260641中的公开自制),或PS/2(针对鼠整联蛋白样细胞粘附分子VLA-4的大鼠/小鼠IgG2b;ATCC#CRL-1911)的皮下注射，而在后诱导组中的小鼠(n=10)在症状出现当天接受相同的处理。已知PS/2Ab加剧疾病复发，和增加复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎(R-EAE)小鼠模型中的中枢神经系统中的CD4⁺T细胞积累(TheienBE等人，2001，JClinInvest107(8):995-1006)。每周2次进行抗体注射，持续2周。在实验结束时，小心地移除小鼠的脊髓，压碎，然后在包含胶原酶D(SigmaAldrich)的RPMI1640培养基中孵育。加入2mMEDTA终止反应，使混合物通过70-mm细胞过滤器，并通过流式细胞术分析细胞内含物。

如在图9A和9B中所示，用同种型对照Ab处理的小鼠从MOG注射后约10-14天开始出现症状(即，具有超过“0”的疾病得分)，并在15和21天之间达到顶峰。相反地，用D114Ab处理的小鼠相比用对照Ab处理的小鼠，完全避免了疾病的发展。表7显示了相比用对照Ab处理的小鼠，在用D114Ab处理的小鼠的胸腺和脾中的Treg百分比和绝对数的增长倍数。

表7

Treg似乎主要在约第18天在胸腺内扩增，仅在第21天后观察到在外周(即，脾)中的显著扩增。

在此特定实验条件下，在后诱导阶段的D114Ab处理没有显示在疾病发展中的显著改进。D114Ab施用的剂量和/或频率可在本领域技术人员知识范围内进一步调节。然而，重要的是，接受预诱导D114Ab的小鼠相比接受对照Ab的小鼠，在第18天展示了进入脊柱的细胞浸润的显著减少(见下表8)。在用对照Ab处理的小鼠的脊髓中观察到的细胞浸润可能是这些小鼠中的疾病发展的主要因素。

如在表8中所示，在第21天，相比用对照Ab处理的小鼠的脊髓，在用D114Ab处理的小鼠的脊髓中的巨噬细胞(F4/80⁺)减少了8倍(p＜0.0001)，NK细胞减少了2.7倍(p＜0.0001)，CD11b细胞减少了1.7倍(p＜0.001),B细胞减少了2.5倍(p＜0.001)。

表8

此外，用D114Ab处理的小鼠淋巴结中的IL-17和IFN-γ产生显著减少(p＜0.001)(图10)。因此，D114可能通过介导Th1发育参与EAE的发病机制，D114Ab处理可通过阻断Th1和Th17细胞因子的分泌预防疾病产生。

实施例6.D114阻断对糖尿病的影响

也在用于1型糖尿病的多基因模型，NOD/ShiLtJ小鼠(“NOD小鼠”)(MakinoS等人，1980，JikkenDobutsu29(1):1-13;SerrezeDV等人，1997，JImmunol158(8):3978-86)中检测了D114阻断对糖尿病的影响。在NOD/ShiLtJ小鼠中的糖尿病的特征是胰岛炎和胰岛的白细胞浸润。在约12周龄的雌性和那之后几周的雄性中自发出现胰腺胰岛素含量的大量减少。因此，血浆葡萄糖水平增至超过250mg/dL。使用mini(LifeScan，Inc.)每周2次检查NOD小鼠的血糖水平。在血糖2次连续读数大于250mg/dL后，认为小鼠患上糖尿病。将首次连续的糖尿病量数记录为糖尿病发作的日期。以25mg/kg用hFc(n=5)或抗D114Ab(Regn577)(n=10)注射小鼠，从9周龄开始，每周2次持续7周。每周1次用尾部血样监控血糖水平。

如在图11A中所示，用hFc处理的小鼠在13周龄后血糖水平高于250mg/dL，开始患上自发的糖尿病(●)。相反地，用抗D114Ab治疗的小鼠(REGN577)直到25周龄都没有显示葡萄糖水平增加的迹象(■)，且测量另外持续10周。在糖尿病发作前的D114-Ab处理预防了糖尿病的产生，且处理的动物似乎从未患上糖尿病。有趣地是，当10只用D114Ab处理的小鼠中的5只在第20周龄时被注射抗CD25(PC61)mAb以消耗Tregs时(□)，它们的血糖水平在1-2周后开始增加且小鼠患上糖尿病。这表明，D114Ab对I型糖尿病的预防作用至少部分是通过Treg介导的(图11A).

胰岛素和GAD65是在糖尿病NOD小鼠以及糖尿病个体的血清中可见的2种标准自身抗体。因此，通过ELISA测量了在用hFc对照或D114Ab处理的小鼠中的自身抗体的血清水平。如图11B中所示，D114-Ab处理阻断了抗胰岛素(□)和抗GAD65(■)自身抗体的产生，阻断水平与未处理的WTC57Bl/6(即，非NOD小鼠;阴性对照动物)中的类似。相反地，接受hFc对照的NOD(糖尿病)小鼠在其血清中具有高水平的自身抗体。另外，当用H&E(苏木精和伊红)染色已用D114Ab处理且未显示糖尿病症状的23周龄小鼠的胰腺切片时，观察到正常数目的保持形态的胰岛(产生胰岛素或胰高血糖素的细胞，其破坏与糖尿病发生率直接相关)(图11C，左图,和图11D，左图)。此外，使用D114Ab处理的小鼠在胰岛内未观察到细胞浸润(图11C，左图,和图11D，右图)。相反地，已用hFc对照处理的糖尿病动物比D114Ab处理的小鼠在其胰腺中具有少得多的胰岛数(图11C，右图,和图11D，左图)，且剩余的非常少的胰岛包含高水平的细胞浸润(图11C，右图,和图11D，右图)。因此，D114Ab能够在延长的时期内完全预防糖尿病，其作用似乎至少部分是通过Treg的扩增介导；然而，有可能有另外的机制参与D114Ab对胰岛和/或胰岛素的保护作用。

测定了用D114Ab处理的糖尿病小鼠的实际血糖水平，并与用hFc对照处理的小鼠比较。用25mg/kg的D114Ab(n=3)或对照hFc(n=4)在疾病发作时（第0天）处理糖尿病小鼠。在用D114Ab治疗后，糖尿病小鼠的葡萄糖水平显著降低，从约350mg/dL降低至正常水平(约120-130mg/dL)(图11E)。此作用平均持续4-5周。大体上，还观察到当用D114Ab处理具有低于350mg/dL血糖的糖尿病小鼠时，它们的葡萄糖水平回落至正常水平，且此作用比治疗时具有高于350mg/dL的血糖的小鼠持续时间更长。这表明，使用D114Ab控制血糖水平存在特定的时机进行延长和有效的治疗。因此，不受限于本文描述的任何特定机制，这些观察表明，D114抗体具有对I型糖尿病的巨大的治疗潜力。

上述实验的结果显示，存在以前未知的调控环在体内控制Treg细胞和DC数。此调控回路有可能对平衡免疫力和耐受性很重要，但最重要地是首次在免疫系统的3种重要成分，即D114-DC-Treg之间建立了连接。因此，使用D114拮抗剂的治疗代表了控制体内Treg数，从而控制自身免疫疾病和相关病症的发展的有效方法。

Claims (9)

1.δ样配体4(Dll4)拮抗剂在制备用于在受试者中预防、治疗或减轻1型糖尿病的药物中的用途，其中所述Dll4拮抗剂是结合人Dll4(hDll4)并阻断Dll4和Notch受体之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区(HCVR)，其分别包含SEQIDNO:22,24和26的重链CDR1,CDR2和CDR3序列，和轻链可变区(LCVR)，其分别包含SEQIDNO:30,32和34的轻链CDR1,CDR2和CDR3序列。

2.权利要求1的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用于在诊断为患有1型糖尿病的受试者中降低血糖水平。

3.权利要求1的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用于在受试者中减少或阻断自身抗体的产生。

4.权利要求3的用途，其中所述自身抗体是针对胰岛素的自身抗体，或针对谷氨酸脱羧酶65(GAD65)的自身抗体，或这二者。

5.权利要求1-4任一项的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:20或SEQIDNO:116的HCVR序列，和SEQIDNO:28或SEQIDNO:118的LCVR序列。

6.权利要求5的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:20/28的HCVR/LCVR组合。

7.权利要求5的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:116/118的HCVR/LCVR组合。

8.权利要求1-4、6-7中任一项的用途,其中所述抗体或其抗原结合片段用于与治疗有效量的至少一种另外的降血糖剂共同施用。

9.权利要求8的用途,其中所述降血糖剂是胰岛素或其类似物。