KR101743283B1 - 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법 - Google Patents

생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법을 개시한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상하부가 개방되며, 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 폐조직이 접촉되는 개방창, 상기 개방창의 일측에서부터 흡인장치로 연장되어 상기 개방창 내부가 진공 상태가 되도록 하는 흡인관 및 상기 개방창의 일측으로부터 연장되며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부를 포함하는 폐 윈도우 장치가 제공된다. 본 실시예에 따르면, 동물의 호흡 및 순환을 생리적으로 유지하고 이에 간섭을 주지 않으면서 동시에 생체 내 폐조직의 세포 및 분자 수준 미세영상을 안정적으로 획득할 수 있는 장점이 있다.

Description

생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법{Lung window apparatus based on micro-suction for in vivo microscopic imaging of lung tissue and method for obtaining image using the same}
본 발명은 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법에 관한 것이다.
형광 신호를 이용한 레이저 주사 공초점 현미경은 세포 및 분자 수준의 현상을 관찰하기 위한 목적으로 사용된다.
다른 조직과는 다르게 폐기관은 호흡 과정과 근접하여 위치한 심장의 박동으로 인해 주기적인 움직임이 발생하며 이러한 모션 아티팩트(Motion-artifact)로 인하여 미세영상 획득 시 정확한 영상을 얻을 수 없는 문제점이 있다.
이러한 한계로 인해 종래에 폐의 분자생물학적 연구의 대부분이 조직 적출 및 고정 후 관찰 과정으로 이루어졌으나, 이는 실제 살아있는 동물 내에서의 혈관의 변화나, 혈관, 폐 실질 내의 조직 세포 및 적혈구, 백혈구, 혈소판을 포함하는 순환세포의 변화나 상호작용을 파악하기 어려운 문제점이 있다.
따라서 살아있는 동물의 호흡 및 순환을 생리적으로 유지해주면서 동시에 세포 및 분자수준의 구조와 상호작용을 파악하는 것이 주요 과제가 되었다.
이를 위해서는 생체 내 폐조직 및 혈관에서 발생하는 분자생물학적 기전을 관찰할 수 있으면서 동시에 공초점 현미경을 통해 획득된 미세영상의 모션 아티팩트를 극복할 수 있는 이미징 윈도우의 개발이 필요한 실정이다.
상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 동물의 호흡 및 순환을 생리적으로 유지하고 이에 간섭을 주지 않으면서 동시에 생체 내 폐조직의 세포 및 분자 수준 미세영상을 안정적으로 획득할 수 있는 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법을 제안하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 실시예에 따르면, 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치로서, 상하부가 개방되며, 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 폐조직이 접촉되는 개방창; 상기 개방창의 일측에서부터 흡인장치로 연장되어 상기 개방창 내부가 진공 상태가 되도록 하는 흡인관; 및 상기 개방창의 일측으로부터 연장되며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부를 포함하는 폐 윈도우 장치가 제공된다.
상기 개방창은 상기 상부에서 하부 방향으로 직경이 넓어지는 원추 형상을 가질 수 있다.
상기 틸팅 마운트 안착부는 상기 틸팅 마운트가 결합되는 복수의 체결공을 포함할 수 있다.
상기 개방창 및 상기 흡인관은, 제1 바디부 및 상기 제1 바디부와 단차를 가지며 상기 제1 바디부의 측면으로 돌출된 제1 돌기부를 포함하는 제1 플레이트에 형성되며, 상기 틸팅 마운트 안착부는, 제2 바디부 및 상기 제2 바디부와 단차를 가지며, 상기 제1 돌기부와 맞물려 결합되는 제2 돌기부를 포함하는 제2 플레이트에 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치로서, 상하부가 개방되고, 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 폐조직이 접촉되는 개방창 및 상기 개방창의 일측에서부터 흡인장치로 연장되어 상기 개방창 내부가 진공 상태가 되도록 하는 흡인관이 형성되는 제1 플레이트; 및 상기 제1 플레이트와 결합되며, 상기 개방창에 배치된 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부가 형성된 제2 플레이트를 포함하는 폐 윈도우 장치가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 공초점 현미경 시스템 및 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치를 이용한 영상 획득 방법으로서, 상기 폐 윈도우 장치의 틸팅 마운트 안착부에 안착된 틸팅 마운트를 이용하여 폐 윈도우 장치의 각도를 조절하는 단계; 복수의 파장을 갖는 레이저 광을 상기 폐 윈도우 장치에 형성된 개방창을 통해 폐조직에 조사하는 단계-상기 개방창의 상부에는 커버 글라스가 형성되고 하부에는 폐조직이 접촉되며, 상기 개방창의 일측에는 흡인장치로 연장되는 흡인관이 형성되어 상기 개방창의 내부가 진공 상태로 유지됨-; 및 상기 폐조직에서 여기된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하되, 상기 틸팅 마운트의 각도 조절에 의해 상기 개방창에 안착된 커버 글라스와 상기 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 호흡 또는 순환 과정 중에서 평행 상태를 유지하는 영상 획득 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 폐조직에 부착되고 대물렌즈와 인접하게 배치되는 개방창과 개방창으로부터 연장되며 틸팅 마운트가 안착되는 안착부를 제공하여 동물의 호흡 및 순환이 발생하는 동안 개방창과 대물렌즈의 평행 상태를 유지할 수 있어 안정적인 영상 획득이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 사시도이다.
도 2는 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 분리 상태를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 정면도와 저면도이다.
도 4는 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 측단면도이다.
도 5는 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템 및 폐 윈도우 장치와 대물렌즈의 배치 상태를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 획득된 폐조직 이미지를 도시한 도면이다.
도 7은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 획득된 C57BL6/J Mouse에 FITC-Dextran을 주고 적혈구의 움직임을 연속적으로 촬영한 영상을 나타낸 도면이다.
도 8은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경시스템을 이용하여 획득된 LysM-GFP Mouse에서 백혈구의 움직임을 연속적으로 촬영한 영상을 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
이하에서, 본 발명에 따른 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 사시도이고, 도 2는 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 분리 상태를 나타낸 도면이고, 도 3은 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 정면도와 저면도이고, 도 4는 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치의 측단면도이다.
도 1 내지 도 4를 참조하면, 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치는 개방창(100), 흡인관(102) 및 틸팅 마운트 안착부(104)를 포함할 할 수 있다.
개방창(100)은 상부에서 하부 방향으로 직경이 넓어지는 원추 형상을 가지면서 상하부가 개방된 형상을 갖는다.
개방창(100)의 하부에는 폐조직이 접촉되고 상부에는 커버 글라스 안착부(106)가 제공된다.
영상 획득 시, 커버 글라스 안착부(106)에 커버 글라스(110)가 배치되며, 커버 글라스(110) 상부에 대물렌즈(120)가 배치된다.
흡인관(102)은 개방창(100)의 일측에서부터 흡인장치(미도시) 측으로 연장된다.
개방창(100)의 하부에 폐조직 단면이 접촉되고, 상부에 커버 글라스(110)가 덮여지며, 개방창(100)의 일측에 흡입관(102)이 형성되기 때문에 영상 획득 과정에서 개방창(100) 내부를 진공 상태로 유지할 수 있다.
틸팅 마운트 안착부(104)는 개방창(100)의 일측에서 연장되어 형성되며, 복수의 체결공(130)이 형성되고, 복수의 체결공(130) 중 적어도 일부를 통해 틸팅 마운트(140)가 결합된다.
본 실시예에 따른 틸팅 마운트(140)는 키네마틱(kinematic) 틸팅 마운트로서, 폐 윈도우 장치의 각도를 조절하여 폐 윈도우 장치와 대물렌즈(120)가 평행 상태를 유지하도록 한다.
키네마틱 틸팅 마운트(140)를 통해 폐 윈도우 장치의 각도를 조절하여 개방창(100)에 배치된 커버 글라스(110)와 대물렌즈(120)를 평행하게 유지한 상태로 고정해두면, 호흡 및 순환이 생리적으로 유지되는 동안에도 폐 윈도우 장치의 움직임은 억제될 수 있어 안정적으로 영상을 획득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 폐 윈도우 장치는 서로 독립된 제1 플레이트(200)와 제2 플레이트(202)가 서로 결합하는 방식으로 제공될 수 있다.
도 2를 참조하면, 제1 플레이트(200)의 제1 바디부(210)의 일측에 형성되는 제1 돌기부(212)와 제2 플레이트(202) 제2 바디부(220)의 일측에 형성되는 제2 돌기부(222)를 서로 맞물린 상태로 배치한 후 볼트(230)를 체결하는 방식으로 틸팅 마운트 안착부(104)와 개방창(100)을 포함하는 폐 윈도우 장치를 제공할 수 있다.
여기서, 제1 바디부(210)에는 개방창(100)이 형성된 부분이며, 제2 바디부(220)는 틸팅 마운트 안착부(104)가 형성된 부분이다.
본 실시예에 따르면, 제1 돌기부(212)의 두께는 제1 바디부(220)보다 작으며, 또한, 제2 돌기부(222)의 두께는 제2 바디부(222)보다 작다.
바람직하게, 제1 바디부(210)와 제2 바디부(220)는 동일한 두께를 가지며, 제1 돌기부(212)와 제2 돌기부(222)가 맞물린 경우의 전체 두께는 제1 바디부(210) 및 제2 바디부(220)의 두께와 같을 수 있다.
이처럼 제1 플레이트(200) 및 제2 플레이트(202)는 단차를 갖는 형상으로 제공되고, 제1 돌기부(212)와 제2 돌기부(222)가 서로 맞물리면서 전체적으로 균일한 두께를 갖게 된다.
도 5는 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템의 구성 및 폐 윈도우 장치와 대물렌즈의 배치 상태를 나타낸 도면이다.
본 실시예에 따른 영상 획득 과정은 다음과 같이 이루어진다.
(1) 폐 윈도우 장치 각도 조절
폐 윈도우 장치의 틸팅 마운트 안착부(104)에 안착된 틸팅 마운트(140)를 이용하여 폐 윈도우 장치의 각도를 조절한다.
(2) 레이저 광 조사
도 5와 같이 복수의 파장을 갖는 레이저 광을 폐 윈도우 장치에 형성된 개방창(100)을 통해 폐조직에 조사한다.
(3) 형광 신호 검출
폐조직에서 여기된 형광 신호를 검출기를 통해 검출한다.
도 5를 참조하면, 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템은 가시광 대역인 405nm, 488nm, 561nm 및 640nm의 4파장 레이저 광원(500-1 내지 500-4), 다각형 회전 거울(polygonal rotation mirror, 502) 및 갈바노 미러(galvanometer mirror, 504)를 포함하며, 이들 구성을 통해 XY 래스터 스캐닝 패턴을 형성한다.
공초점 현미경 시스템은 복수의 ND(Neutral Density filter), 미러(M) 및 빔스플리터(Dichroic Beam Splitter, DBS)와 폐조직에서 여기된 형광 신호를 검출하기 위한 BPF(Beam Pass Filter) 및 광전자 증배관(photomultiplier tube: PMT)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제작한 미세흡인 기반 폐 윈도우를 통한 공초점 광학 영상 현미경을 이용하여 실제 동물 모델에서 폐조직의 영상화를 수행하였다.
40배 대물렌즈 (LUCPlanFL, NA0.6; Olympus)를 사용하였을 때 초점에서 250×250 μm2의 관측 시야를 가지도록 광학계를 설계하였고, 형광 신호는 각 파장마다 별도로 설치된 광전자 증배관과 Frame Grabber (Matrox, SOLIOS)로 감지 및 처리하여, Z축 구획화가 가능한 세포 수준 해상도의 2차원 이미지를 초당 30장의 속도로 획득할 수 있도록 구현되었다.
이러한 공초점 현미경 시스템에 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치를 부착하고, 대물렌즈를 통과한 레이저 광이 폐조직에 조사되고, 여기된 형광 신호에 의해 세포 수준의 실시간 영상화가 가능해진다.
도 6은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 획득된 폐조직 이미지를 도시한 도면이다.
폐조직은 폐포와 폐포를 둘러싼 모세혈관이 존재하고, 모세혈관에는 혈관내피세포와 이를 둘러싼 기저막이 존재한다.
이러한 폐의 구조를 먼저 확인하기 위한 모델로 혈관내피세포에 존재하는 Tie2 Receptor에 녹색 형광 신호가 발현되어 있는 Tie2-GFP Mouse 와 Actin filament에 적색 형광 신호가 발현되어 있으며 동시에 Histone 에 녹색 형광 신호가 발현되어 있는 Actin-DsRed & Histone-GFP Mouse의 폐를 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 관찰하였다.
상기한 바와 같이, 흑색의 원형의 폐포와 폐를 둘러싸고 있는 혈관내피세포로 구성되어 있는 모세혈관(도 6a의 녹색, 도 6b의 적색)을 확인하였다.
또한 폐조직에 존재하는 제1형 폐포와 제2형 폐포 및 폐포 주변의 대식세포의 핵(도 6b의 녹색)을 확인할 수 있었다.
도 7은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 획득된 C57BL6/J Mouse에 FITC-Dextran을 주고 적혈구의 움직임을 연속적으로 촬영한 영상을 나타낸 도면이다.
미세흡인으로 인한 폐조직 내의 세포에 영향을 끼칠 가능성을 고려하여 적혈구와 백혈구의 움직임을 관찰하는 영상을 확인하였다. 이에 C57BL6/J Mouse의 혈관에 FITC-Dextran 을 주입하여 흑색으로 대조되는 적혈구의 영상을 획득하였고, 도 7과 같이 적혈구의 움직임이 연속적이며, 미세흡인에 영향을 받지 않음을 확인하였다.
도 8은 본 실시예에 따른 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치 및 공초점 현미경시스템을 이용하여 획득된 LysM-GFP Mouse에서 백혈구의 움직임을 연속적으로 촬영한 영상을 나타낸 도면이다.
백혈구의 움직임을 관찰하기 위하여 LysM 단백질에 녹색형광신호가 발현되어 있는 LysM-GFP Mouse에 혈관은 적색으로 나타내기 위하여 TMR-Dextran 을 주입하고 혈관에서 LysM 의 이동경로를 추적하였다. 도 8과 같이 백혈구의 움직임 또한 연속적이며, 미세 흡인에 영향을 받지 않음을 확인하였다.
이처럼 본 실시예에 따른 폐 윈도우 장치를 이용하는 경우, 생리적인 순환에 간섭을 주지 않으면서 동물 모델의 폐조직으로의 저침습적이고 미세한 접근에 유용함을 확인하였고, 폐 실질과 혈관의 안정적인 이미지 확보와 더불어서 세포 간의 상호 작용과 단일 세포 수준의 동태 파악에 관한 영상화에 적합함을 확인하였다.
이상과 같이 본 발명에서는 구체적인 구성 요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치로서,
    상하부가 개방되며, 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 폐조직이 접촉되는 개방창;
    상기 개방창의 일측에서부터 흡인장치로 연장되어 상기 개방창 내부가 진공 상태가 되도록 하는 흡인관; 및
    상기 개방창의 일측으로부터 연장되며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부를 포함하는 폐 윈도우 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 개방창은 상기 상부에서 하부 방향으로 직경이 넓어지는 원추 형상을 갖는 폐 윈도우 장치.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 틸팅 마운트 안착부는 상기 틸팅 마운트가 결합되는 복수의 체결공을 포함하는 폐 윈도우 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 개방창 및 상기 흡인관은, 제1 바디부 및 상기 제1 바디부와 단차를 가지며 상기 제1 바디부의 측면으로 돌출된 제1 돌기부를 포함하는 제1 플레이트에 형성되며,
    상기 틸팅 마운트 안착부는, 제2 바디부 및 상기 제2 바디부와 단차를 가지며, 상기 제1 돌기부와 맞물려 결합되는 제2 돌기부를 포함하는 제2 플레이트에 형성되는 폐 윈도우 장치.
  5. 생체 내 폐조직 미세영상 획득을 위한 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치로서,
    상하부가 개방되고, 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 폐조직이 접촉되는 개방창 및 상기 개방창의 일측에서부터 흡인장치로 연장되어 상기 개방창 내부가 진공 상태가 되도록 하는 흡인관이 형성되는 제1 플레이트; 및
    상기 제1 플레이트와 결합되며, 상기 개방창에 배치된 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부가 형성된 제2 플레이트를 포함하는 폐 윈도우 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 플레이트는, 상기 개방창 및 상기 흡인관이 형성되는 제1 바디부 및 상기 제1 바디부와 단차를 가지며 상기 제1 바디부의 측면으로 돌출된 제1 돌기부를 포함하고,
    상기 제2 플레이트는, 상기 틸팅 마운트 안착부가 형성되는 제2 바디부 및 상기 제2 바디부와 단차를 가지며, 상기 제1 돌기부와 맞물려 결합되는 제2 돌기부를 포함하는 폐 윈도우 장치.
  7. 공초점 현미경 시스템 및 미세흡인 기반 폐 윈도우 장치를 이용한 영상 획득 방법으로서,
    상기 폐 윈도우 장치의 틸팅 마운트 안착부에 안착된 틸팅 마운트를 이용하여 폐 윈도우 장치의 각도를 조절하는 단계;
    복수의 파장을 갖는 레이저 광을 상기 폐 윈도우 장치에 형성된 개방창을 통해 폐조직에 조사하는 단계-상기 개방창의 상부에는 커버 글라스가 형성되고 하부에는 폐조직이 접촉되며, 상기 개방창의 일측에는 흡인장치로 연장되는 흡인관이 형성되어 상기 개방창의 내부가 진공 상태로 유지됨-; 및
    상기 폐조직에서 여기된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 틸팅 마운트의 각도 조절에 의해 상기 개방창에 안착된 커버 글라스와 상기 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 호흡 또는 순환 과정 중에서 평행 상태를 유지하는 영상 획득 방법.

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