KR101689879B1 - 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법 - Google Patents

생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법을 개시한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중앙에 개방창이 형성되는 환형 구조를 가지며 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 유방조직이 배치되는 제1 챔버; 중앙에 개방창이 형성되며 상기 제1 챔버와 결합하여 상기 유방조직을 지지하는 제2 챔버; 및 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 고정하며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부가 형성된 챔버 홀더를 포함하는 윈도우 장치가 제공된다. 본 실시예에 따르면, 동물의 생체적 환경을 유지해주면서 동시에 장기적으로 생체 내 조직의 세포 및 분자 수준 미세영상을 안정적으로 획득할 수 있는 장점이 있다.

Description

생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법{Window apparatus for in vivo microscopic imaging of mammary tissue and method for obtaining image using the same}
본 발명은 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법에 관한 것이다.
형광 신호를 이용한 레이저 주사 공초점 현미경은 세포 및 분자 수준의 현상을 관찰하기 위한 목적으로 사용된다.
다른 조직과는 다르게 피하에 존재하는 유방구조는 영상화를 위한 피부절개로 인해 수분 증발과 염증이 발생할 수 있어 반복적이고 장기적인 영상기술 연구에 한계가 있다.
이러한 한계로 인해 종래의 분자생물학적 연구의 대부분이 조직의 적출 및 고정 후 관찰 과정으로 이루어졌다.
이러한 방식은 실제 살아있는 동물에서 세포의 움직임이나 모양의 변화를 관찰하기 힘들고, 유방조직의 특징인 유관과 그 주변의 혈관조직의 변화의 관찰을 통한 연구는 어려운 문제점이 있다.
살아있는 동물에서 생리적 환경을 유지해주면서 동시에 세포 및 분자수준의 구조와 상호작용을 장기적으로 파악하는 것은 생체 내 유방조직의 미세영상 연구에 있어 주요 과제이다.
이에 생체 유방조직 내 유관 및 혈관에서 발생하는 분자생물학적 기전을 관찰할 수 있으며 동시에 장기적으로 동일한 세포 및 조직을 반복적으로 촬영할 수 있는 장치가 요구되는 실정이다.
상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 생체 내 환경을 유지하면서 적출하지 않고 동시에 유방조직의 유관, 혈관의 실시간 세포 및 분자 수준 미세영상을 안정적으로 그리고 장기적으로 획득할 수 있는 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치 및 이를 이용한 영상 획득 방법을 제안하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 실시예에 따르면, 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치로서, 중앙에 개방창이 형성되는 환형 구조를 가지며 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 유방조직이 배치되는 제1 챔버; 중앙에 개방창이 형성되며 상기 제1 챔버와 결합하여 상기 유방조직을 지지하는 제2 챔버; 및 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 고정하며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부가 형성된 챔버 홀더를 포함하는 윈도우 장치가 제공된다.
상기 제1 챔버의 외주면 및 상기 제2 챔버의 외주면에는 서로 연통하는 복수의 구멍이 형성될 수 있다.
상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버는 하나 이상의 볼트 또는 봉합실을 통해 서로 결합될 수 있다.
상기 챔버 홀더의 일측에는 대향하는 부분이 단차진 형상을 갖는 제1 돌기부 및 제2 돌기부가 형성되며, 상기 제1 챔버 및 제2 챔버는 상기 제1 돌기부 및 상기 제2 돌기부 사이에 고정될 수 있다.
상기 제1 돌기부 및 상기 제2 돌기부에는 상기 제1 챔버가 안착되는 제1 챔버가 안착되는 제1 챔버 안착부가 형성될 수 있다.
상기 제1 챔버의 외주면 직경은 상기 제2 챔버의 외주면 직경보다 작게 형성되며, 상기 제1 챔버의 외주면 직경은 상기 제1 챔버 안착부의 상부의 제1 대향면의 길이에 상응하게 형성되어 상기 제1 챔버는 상기 제1 대향면에 억지 끼움으로 결합될 수 있다.
상기 제2 챔버의 외주면 직경은 상기 제1 챔버 안착부의 하부의 제2 대향면의 길이에 상응하게 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 공초점 현미경 시스템 및 제1 챔버, 제2 챔버 및 서로 결합된 제1 챔버 및 제2 챔버를 고정하며 틸팅 마운트 안착부가 형성된 챔버 홀더를 포함하는 윈도우 장치를 이용한 영상 획득 방법으로서, 상기 윈도우 장치의 상기 틸팅 마운트 안착부에 안착된 틸팅 마운트를 이용하여 윈도우 장치의 각도를 조절하는 단계; 복수의 파장을 갖는 레이저 광을 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버에 형성된 개방창을 통해 유방조직에 조사하는 단계-상기 제1 챔버의 상부에는 커버 글라스가 배치되고 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 유방조직이 위치함-; 및 상기 유방조직에서 여기된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하되, 상기 틸팅 마운트의 각도 조절에 의해 상기 커버 글라스와 상기 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 이미징을 획득하는 과정에서 평행 상태를 유지하는 영상 획득 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 유방조직을 사이에 부착하며 개방창을 갖는 2개의 챔버 및 2개의 챔버를 고정하며 틸팅 마운트가 안착되는 안착부를 갖는 챔버 홀더를 통해 살아있는 동물이 현미경 관찰부에 놓인 상태에서 개방창과 대물렌즈의 평행 상태를 유지할 수 있어 안정적인 영상 획득이 가능한 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 윈도우 장치의 사시도이다.
도 2는 본 실시예에 따른 윈도우 장치의 측단면도를 도시한 도면이다.
도 3은 본 실시예에 따른 윈도우 장치의 사용 상태를 도시한 도면이다.
도 4는 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템의 구성을 도시한 도면이다.
도 5는 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 Actin-GFP 쥐의 영상화한 유관의 세포 및 구조를 도시한 도면이다.
도 6은 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 유관이 형성되는 과정을 세포수준으로 관찰한 것을 도시한 도면이다.
도 7은 유방암세포 MDA-MB-231-GFP Cell을 유방조직에 이식하여 자라게 한 뒤 cell의 움직임을 30분 간격으로 관찰한 것을 도시한 도면이다.
도 8은 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경을 이용하여 암세포 주위로 형성된 혈관들을 관찰한 것을 도시한 도면이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
이하에서, 본 발명에 따른 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 윈도우 장치의 사시도이고, 도 2는 본 실시예에 따른 윈도우 장치의 측단면도를 도시한 도면이고, 도 3은 본 실시예에 따른 윈도우 장치의 사용 상태를 도시한 도면이다.
도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 본 실시예에 따른 윈도우 장치는 제1 챔버(100), 제2 챔버(102) 및 챔버 홀더(104)를 포함할 수 있다.
제1 챔버(100) 및 제2 챔버(102)는 환형 구조를 가지며, 중앙에 개방창(110)이 형성된다.
여기서, 제1 챔버(100)는 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈(140)에 인접한 측으로 배치되며, 제1 챔버(100)에는 커버 글라스(114)가 안착되는 커버 글라스 안착부(116)가 형성된다.
또한, 제1 챔버(100) 및 제2 챔버(102) 각각의 외측에는 서로 연통할 수 있는 복수의 구멍(112,122)이 형성된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 동물의 유방조직을 관찰하기 위해, 도 3에 도시된 바와 같이, 동물의 유방 측 피부를 절개하며, 절개된 유방조직을 제1 챔버(100)와 제2 챔버(102) 사이에 배치한다.
제1 챔버(100)와 제2 챔버(102)의 개방창(110)을 통해 제1 챔버(100)와 제2 챔버(102) 사이에 위치한 조직을 관찰하게 된다.
제1 챔버(100)와 제2 챔버(102)는 복수의 볼트(130)와 너트(132), 그리고 봉합실(미도시)을 통해 서로 결합된다.
본 실시예에 따르면, 제1 챔버(100) 및 제2 챔버(102)를 고정하고, 제1 챔버(100)에 안착된 커버 글라스(114)와 대물렌즈(140)가 평행한 상태를 유지할 수 있도록 하는 챔버 홀더(104)가 제공된다.
챔버 홀더(104)는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부(152) 및 틸팅 마운트 안착부(152)의 일측에서 연장되는 2개의 제1 돌기부(154-1) 및 제2 돌기부(154-2)를 포함할 수 있다.
틸팅 마운트 안착부(152)에는 복수의 체결공(156)이 형성되며, 복수의 체결공(156) 중 적어도 일부에 틸팅 마운트가 결합된다.
제1 돌기부(154-1) 및 제2 돌기부(154-2)는 서로 평행하게 연장되며 단차를 갖는다.
바람직하게, 제1 돌기부(154-1) 및 제2 돌기부(154-2)의 마주보는 위치에는 제1 챔버 안착부(158)가 형성된다.
본 실시예에 따르면, 제1 챔버(100)의 외주면 직경은 제2 챔버(102)의 외부면보다 크다.
또한, 제1 챔버(100)의 외주면 직경은 제1 돌기부(154-1) 및 제2 돌기부(154-2)의 제1 대향면(155) 사이의 길이(d1)에 상응하게 형성된다.
제2 챔버(102)의 외주면 직경은 제1 돌기부(154-1) 및 제2 돌기부(154-2)의 제2 대향면(157) 사이의 길이(d2)에 상응하게 형성된다.
이에 따라, 제1 챔버(100) 및 제2 챔버(102)는 제1 대향면(155) 및 제2 대향면(157)에 억지 끼움으로 끼워진다.
상기한 바와 같이, 서로 결합된 제1 챔버(100) 및 제2 챔버(102)가 챔버 홀더(104)에 고정된 이후, 틸팅 마운트 안착부(152)에 안착된 틸팅 마운트를 통해 윈도우 장치의 각도를 조절한다.
본 실시예에 따른 틸팅 마운트(미도시)는 키네마틱(kinematic) 틸팅 마운트일 수 있다.
키네마틱 틸팅 마운트를 통해 윈도우 장치의 각도를 조절하여 제1 챔버(100)에 배치된 커버 글라스(114)와 대물렌즈(140)를 평행하게 유지한 상태로 고정해두면, 안정적으로 동일 부위의 영상을 장기적으로 획득할 수 있다.
도 4는 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템의 구성을 도시한 도면이다.
본 실시예에 따른 영상 획득 과정은 다음과 같이 이루어진다.
(1) 윈도우 장치 각도 조절
윈도우 장치의 틸팅 마운트 안착부(152)에 안착된 틸팅 마운트를 이용하여 윈도우 장치의 각도를 조절한다.
(2) 레이저 광 조사
도 4와 같이 복수의 파장을 갖는 레이저 광을 윈도우 장치에 형성된 개방창(110)을 통해 유방조직에 조사한다.
(3) 형광 신호 검출
유방조직에서 여기된 형광 신호를 검출기를 통해 검출한다.
도 4를 참조하면, 본 실시예에 따른 공초점 현미경 시스템은 가시광 대역인 405nm, 488nm, 561nm 및 640nm의 4파장 레이저 광원(400-1 내지 400-4), 다각형 회전 거울(polygonal rotation mirror, 402) 및 갈바노 미러(galvanometer mirror, 404)를 포함하며, 이들 구성을 통해 XY 래스터 스캐닝 패턴을 형성한다.
공초점 현미경 시스템은 복수의 ND(Neutral Density filter), 미러(M) 및 빔스플리터(Dichroic Beam Splitter, DBS)와 유방조직에서 여기된 형광 신호를 검출하기 위한 BPF(Beam Pass Filter) 및 광전자 증배관(photomultiplier tube: PMT)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제작한 윈도우 장치를 통한 공초점 광학 영상 현미경을 이용하여 실제 동물 모델에서 유방조직의 영상화를 수행하였다.
40배 대물렌즈 (LUCPlanFL, NA0.6; Olympus)를 사용하였을 때 초점에서 250×250 μm2의 관측 시야를 가지도록 광학계를 설계하였고, 형광 신호는 각 파장마다 별도로 설치된 광전자 증배관과 Frame Grabber (Matrox, SOLIOS)로 감지 및 처리하여, Z축 구획화가 가능한 세포 수준 해상도의 2차원 이미지를 초당 30장의 속도로 획득할 수 있도록 구현되었다.
도 5는 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 Actin-GFP 쥐의 영상화한 유관의 세포 및 구조를 도시한 도면이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 유관 구조인 alveolar epithelial cell과 ductal epithelial cell을 관찰할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 6은 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경 시스템을 이용하여 유관이 형성되는 과정을 세포수준으로 관찰한 것을 도시한 도면이다.
도 7은 유방암세포 MDA-MB-231-GFP Cell을 유방조직에 이식하여 자라게 한 뒤 cell의 움직임을 30분 간격으로 관찰한 것을 도시한 도면이다.
도 6 내지 도 7에 도시된 바와 같이, 본 실시예에 따른 윈도우 장치를 이용하여 동물의 호흡 및 순환에 따른 움직임을 유지하도록 하되, 윈도우 장치와 대물렌즈는 평행한 상태로 유지시켜, 세포수준으로 암세포 모양의 변화를 관찰할 수 있었다.
도 8은 본 실시예에 따른 윈도우 장치 및 공초점 현미경을 이용하여 암세포 주위로 형성된 혈관들을 관찰한 것을 도시한 도면이다.
도 8을 참조하면, 암세포가 대사를 위해 그 주변에 빼곡하게 형성된 혈관을 CD31 항체에 형광물질을 통해 염색하여 확인할 수 있었다.
이상과 같이 본 발명에서는 구체적인 구성 요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 생체 내 유방조직 미세영상 획득을 위한 윈도우 장치로서,
    중앙에 개방창이 형성되는 환형 구조를 가지며 상부에 커버 글라스가 배치되고 하부에 유방조직이 배치되는 제1 챔버;
    중앙에 개방창이 형성되며 상기 제1 챔버와 결합하여 상기 유방조직을 지지하는 제2 챔버; 및
    상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 고정하며, 상기 커버 글라스와 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 평행한 상태를 유지하도록 하는 틸팅 마운트가 안착되는 틸팅 마운트 안착부가 형성된 챔버 홀더를 포함하는 윈도우 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 챔버의 외주면 및 상기 제2 챔버의 외주면에는 서로 연통하는 복수의 구멍이 형성되는 윈도우 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버는 하나 이상의 볼트 또는 봉합실을 통해 서로 결합되는 윈도우 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 챔버 홀더의 일측에는 대향하는 부분이 단차진 형상을 갖는 제1 돌기부 및 제2 돌기부가 형성되며,
    상기 제1 챔버 및 제2 챔버는 상기 제1 돌기부 및 상기 제2 돌기부 사이에 고정되는 윈도우 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 돌기부 및 상기 제2 돌기부에는 상기 제1 챔버가 안착되는 제1 챔버가 안착되는 제1 챔버 안착부가 형성되는 윈도우 장치.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 챔버의 외주면 직경은 상기 제2 챔버의 외주면 직경보다 작게 형성되며, 상기 제1 챔버의 외주면 직경은 상기 제1 챔버 안착부의 상부의 제1 대향면의 길이에 상응하게 형성되어 상기 제1 챔버는 상기 제1 대향면에 억지 끼움으로 결합되는 윈도우 장치.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2 챔버의 외주면 직경은 상기 제1 챔버 안착부의 하부의 제2 대향면의 길이에 상응하게 형성되는 윈도우 장치.
  8. 공초점 현미경 시스템 및 제1 챔버, 제2 챔버 및 서로 결합된 제1 챔버 및 제2 챔버를 고정하며 틸팅 마운트 안착부가 형성된 챔버 홀더를 포함하는 윈도우 장치를 이용한 영상 획득 방법으로서,
    상기 윈도우 장치의 상기 틸팅 마운트 안착부에 안착된 틸팅 마운트를 이용하여 윈도우 장치의 각도를 조절하는 단계;
    복수의 파장을 갖는 레이저 광을 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버에 형성된 개방창을 통해 유방조직에 조사하는 단계-상기 제1 챔버의 상부에는 커버 글라스가 배치되고 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 유방조직이 위치함-; 및
    상기 유방조직에서 여기된 형광 신호를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 틸팅 마운트의 각도 조절에 의해 상기 커버 글라스와 상기 공초점 현미경 시스템의 대물렌즈가 이미징을 획득하는 과정 중에 평행 상태를 유지하는 영상 획득 방법.

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