JP6630831B2 - 生体内肺組織の顕微鏡イメージを取得するための微小吸引型肺ウィンドー装置及びそれを用いたイメージ取得方法 - Google Patents

Description

本出願は、2015年8月31日に出願された大韓民国特許出願第10-2015-0123216号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
本発明は、生体内肺組織の顕微鏡イメージを取得するための微小吸引型肺ウィンドー装置及びそれを用いたイメージ取得方法に関する。

蛍光信号を利用したレーザー走査共焦点顕微鏡は、細胞及び分子レベルの現象を観察する目的で使用される。

他の組織とは異なり、肺器官は、呼吸過程と、近接して位置した心臓の拍動により周期的な動きが発生し、これらのモーションアーティファクト（Motion-artifact）により、顕微鏡イメージ取得時に正確なイメージを得られない問題点がある。

このような制限によって、従来、肺の分子生物学的研究の殆どが組織摘出及び固定後観察で行われてきたが、これは実際に生きている動物内での血管の変化や、血管、肺実質内の組織細胞、及び赤血球、白血球、血小板を含む循環細胞の変化や相互作用を把握し難いという問題点がある。

従って、生きている動物の呼吸及び循環を生理的に維持しながら、同時に細胞及び分子レベルの構造と相互作用を把握することが主な課題となった。
このためには、生体内肺組織及び血管から発生する分子生物学的メカニズムの観察を可能にしながら、同時に共焦点顕微鏡を通して得られた顕微鏡イメージのモーションアーティファクトを克服できるイメージングウィンドーの開発が必要である。

前記の従来技術の問題点を解決するために、本発明は、動物の呼吸及び循環を生理的に維持して、これに干渉を与えないながらも、同時に生体内肺組織の細胞及び分子レベルの顕微鏡イメージを安定的に得られる生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置及びこれを利用したイメージ取得方法を提案する。

前記目的を達成するために、本発明の一実施例によると、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置され、下部に肺組織が接触される開放窓；前記開放窓の一の側から吸引装置に延長されて、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管；及び前記開放窓の一の側から延長され、前記カバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部を含む、肺ウィンドー装置が提供される。

本発明の一実施例によると、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置され、下部に肺組織が接触する開放窓；前記開放窓の一の側から吸引装置に延長されて前記開放窓内部を真空状態にする吸引管；及び前記開放窓の一の側から延長され、前記カバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部からなる、肺ウィンドー装置が提供される。

本発明の一実施例によると、本質的に、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置され、下部に肺組織が接触される開放窓；前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管；及び前記開放窓の一の側から延長され、前記カバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定する傾斜マウント固定部からなる、肺ウィンドー装置が提供される。

前記開放窓は、前記上部から下部方向に直径が広がる円錐形状を有することができる。
前記傾斜マウント固定部は、前記傾斜マウントが結合される複数の締結孔を含む。
前記開放窓及び前記吸引管は、第1ボディ部と、前記第1ボディ部と段差を有して前記第1ボディ部の側面に突出した第1突起部とを含む第1プレートに形成され、前記傾斜マウント固定部は、第2ボディ部と、前記第2ボディ部と段差を有し、前記第1突起部と噛み合って結合される第2突起部とを含む第2プレートに形成できる。

本発明の他の態様によると、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置されて下部に肺組織が接触される開放窓、及び前記開放窓の一の側から吸引装置に延長されて前記開放窓内部を真空状態にする吸引管が形成される第1プレート；及び前記第1プレートと結合され、前記開放窓に配置されたカバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部が形成された第2プレートを含む肺ウィンドー装置が提供される。

本発明の他の態様によると、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置されて下部に肺組織が接触される開放窓、及び前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管が形成される第1プレート；及び前記第1プレートと結合され、前記開放窓に配置されたカバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定された傾斜マウント固定部が形成された第2プレートからなる、肺ウィンドー装置が提供される。

本発明の他の態様によると、本質的に、生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置として、上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置されて下部に肺組織が接触される開放窓及び前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管が形成される第1プレート；及び前記第1プレートと結合され、前記開放窓に配置されたカバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部が形成された第2プレートからなる、肺ウィンドー装置が提供される。

本発明のさらに他の態様によると、共焦点顕微鏡システム及び微小吸引型肺ウィンドー装置を利用したイメージ取得方法であって、前記肺ウィンドー装置の傾斜マウント固定部に固定された傾斜マウントを利用して肺ウィンドー装置の角度を調節する段階；複数の波長を有するレーザー光を前記肺ウィンドー装置に形成された開放窓を通して肺組織に照射する段階、前記開放窓の一の側にはカバーグラスが形成され、下部には肺組織が接触されて前記開放窓の一の側には吸引装置まで延長され、吸引管が形成されて前記開放窓の内部が真空状態に維持される段階；及び前記肺組織で励起された蛍光信号を検出する段階を含み、前記傾斜マウントの角度調節により、前記開放窓に固定されたカバーグラスと前記共焦点顕微鏡システムの対物レンズが、呼吸又は循環過程の中で平行状態を維持するイメージ取得方法が提供される。

本発明のさらに他の態様によると、共焦点顕微鏡システム及び微小吸引型肺ウィンドー装置を利用したイメージ取得方法であって、前記肺ウィンドー装置の傾斜マウント固定部に固定された傾斜マウントを利用して肺ウィンドー装置の角度を調節する段階；複数の波長を有するレーザー光を前記肺ウィンドー装置に形成された開放窓を通して肺組織に照射する段階、前記開放窓の上部にはカバーグラスが形成され、下部には肺組織が接触されて、前記開放窓の一の側には吸引装置まで延長される吸引管が形成されて前記開放窓の内部が真空状態に維持される段階；及び前記肺組織で励起された蛍光信号を検出する段階からなり、前記傾斜マウントの角度調節によって、前記開放窓に固定されたカバーグラスと前記共焦点顕微鏡システムの対物レンズが呼吸又は循環過程中に平行状態を維持するイメージ取得方法が提供される。

本発明のまた他の態様によると、共焦点顕微鏡システム及び微小吸引型肺ウィンドー装置を利用したイメージ取得方法であって、本質的に、前記肺ウィンドー装置の傾斜マウント固定部に固定した傾斜マウントを利用して肺ウィンドー装置の角度を調節する段階；複数の波長を有するレーザー光を前記肺ウィンドー装置に形成された開放窓を通して肺組織に照射する段階；複数の波長を有するレーザー光を前記肺ウィンドー装置に形成された開放窓を通して肺組織に照射する段階、前記開放窓の上部にはカバーグラスが形成されて下部には肺組織が接触されて、前記開放ウィンドーの一の側には吸引装置に延長される吸引管が形成されて前記開放ウィンドー内部が真空状態で維持される段階；及び前記肺組織から励起された蛍光信号を検出する段階からなり、前記傾斜マウントの角度調節により前記開放窓に固定されたカバーグラスと前記共焦点顕微鏡システムの対物レンズが呼吸又は循環過程中で平行状態を維持するイメージ取得方法が提供される。

本発明の用語「〜を含む（comprising）」とは、含有する、又は、特徴とすると同様に使用され、装置構成又は方法において、言及されていない追加的な装置要素、成分要素又は方法段階等を排除しない。用語「〜からなる（consisting of）とは、別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分等を除く。用語「本質的に〜からなる（essentially consisting of）」とは、装置構成又は方法の範囲において、記載された装置要素、成分要素又は段階と共に、これらの基本的な特性に実質的に影響を与えない装置要素、成分要素、又は段階等を含むことを意味する。

本発明によると、肺組織に押し付けられ、対物レンズと隣接して配置される開放窓と、開放窓から延長され、傾斜マウントが固定される固定部を提供し、動物の呼吸及び循環が発生する間、開放窓と対物レンズの平行状態を維持することができ、安定的なイメージ取得が可能な長所がある。

図1は、本発明の望ましい一実施例による肺ウィンドー装置の斜視図である。 図2は、本実施例による肺ウィンドー装置の分離状態を示した図である。 図3は、本実施例による肺ウィンドー装置の正面図と底面図である。 図4は、本実施例による肺ウィンドー装置の側断面図である。 図5は、本実施例による共焦点顕微鏡システム及び肺ウィンドー装置と対物レンズの配置状態を示した図である。 図6は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得された肺組織イメージを示した図である。 図7は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得された C57BL6/JマウスにFITC-Dextranを与えて赤血球の動きを連続的に撮影したイメージを示した図である。 図8は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得されたLysM-GFPマウスで白血球の動きを連続的に撮影したイメージを示した図である。

本発明は、多様な変更を加えることができ、多様な実施例を有することができる非特定実施例を図面に例示して詳細に説明する。

しかし、これは本発明を特定した実施形態について限定するものでなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変更、均等物ないし代替物を含むことと理解されるべきである。各図面の説明において、類似した参照符号を類似した構成要素に対して使用した。

以下では、本発明による実施例を、添付した図面を参照して詳細に説明する。

図1は、本発明の望ましい一実施例による肺ウィンドー装置の斜視図であり、図2は、本実施例による肺ウィンドー装置の分離状態を示した図であり、図3は、本実施例による肺ウィンドー装置の正面図と底面図であり、図4は、本実施例による肺ウィンドー装置の側断面図である。

図1〜図4を参照すると、本実施例による肺ウィンドー装置は、開放窓（100）、吸引管（102）及び傾斜マウント固定部（104）を含むことができる。
開放窓（100）は、上部から下部方向に直径が広がる円錐形状を有し、上下部が開放された形状を有する。
開放窓（100）の下部には、肺組織が接触され、上部にはカバーグラス固定部（106）が提供される。
イメージ取得時、カバーグラス固定部（106）にカバーグラス（110）が配置され、カバーグラス（110）上部に対物レンズ（120）が配置される。
吸引管（102）は、開放窓（100）の一の側から吸引装置側（図示せず）に延長される。
開放窓（100）の下部に肺組織断面が接触され、上部がカバーグラス（110）で覆われ、開放窓（100）の一の側に吸引管（102）が形成されるため、イメージ取得の過程で開放窓（100）の内部を真空状態に維持できる。

傾斜マウント固定部（104）は、開放窓（100）の一の側で延長されて形成され、複数の締結孔（130）が形成され、複数の締結孔（130）のうち少なくとも一部によって傾斜マウント（140）が結合される。

本実施例による傾斜マウント（140）は、キネマチック（kinematic）傾斜マウントとして、肺ウィンドー装置の角度を調節して、肺ウィンドー装置と対物レンズ（120）が平行状態を維持するようにする。

キネマチック傾斜マウント（140）によって肺ウィンドー装置の角度を調節して開放窓（100）に配置されたカバーグラス（110）と対物レンズ（120）を平行に維持した状態に固定しておけば、呼吸及び循環が生理的に維持される間にも肺ウィンドー装置の動きを抑制でき、安定的にイメージを獲得することができる。

本発明の一実施例によると、肺ウィンドー装置は、互いに独立した第1プレート（200）と第2プレート（202）が互いに結合する方法で提供できる。

図2を参照すると、第1プレート（200）の第1ボディ部（210）の一の側に形成される第1突起部（212）と、第2プレート（202）の第2ボディ部（220）の一の側に形成される第2突起部（222）を互いに噛み合う状態に配置した後、ボルト（230）を締結する方法で、傾斜マウント固定部（104）と開放窓（100）を含む肺ウィンドー装置を提供することがでる。

ここで、第1ボディ部（210）は、開放窓（100）が形成された部分であり、第2のボディ部（220）は、傾斜マウント固定部（104）が形成された部分である。
本実施例によると、第1突起部（212）の厚さは第1ボディ部（220）より小さく、また第2の突起部（222）の厚さは第2ボディ部（222）より小さい。

好ましくは、第1ボディ部（210）と第2ボディ部（220）は、同じ厚さを有し、第1突起部（212）と第2突起部（222）が噛み合う場合の全体厚さは、第1ボディ部（210）と第2ボディ部（220）の厚さと同じである。

このように第1プレート（200）と第2プレート（202）は、段差を有する形状で提供され、第1突起部（212）と第2突起部（222）が互いに噛み合いながら全体的に均一な厚さを有するようになる。

図5は、本実施例による共焦点顕微鏡システムの構成及び肺ウィンドー装置と対物レンズの配置状態を示した図である。

本実施例によるイメージ取得過程は次のようになされる。
（1）肺ウィンドー装置角度調節
肺ウィンドー装置の傾斜マウント固定部（104）に装着された傾斜マウント（140）を利用して肺ウィンドー装置の角度を調節する。
（2）レーザー光照射
図5のように、複数の波長を有するレーザー光を、肺ウィンドー装置に形成された開放窓（100）を通して肺組織に照射する。
（3）蛍光信号検出
肺組織から励起された蛍光信号を、検出器によって検出する。

図5を参照すると、本実施例による共焦点顕微鏡システムは、可視光帯域の405nm、488nm、561nm、及び640nmの4波長レーザー光源（500-1〜500-4）と、回転多面体ミラー（polygonal rotation mirror、502）と、ガルバノミラー（galvanometer mirror、504）とを含み、これらの構成によってXYラスタースキャンパターンを形成する。

共焦点顕微鏡システムは、複数のND（中性濃度フィルター）と、ミラー（M）と、ビームスプリッタ（二色性ビームスプリッタ、DBS）と、肺組織から励起された蛍光信号を検出するためのBPF（ビーム通過フィルター）と、光電子増倍管（photomultiplier tube：PMT）とを含め得る。

本発明で製作した微小吸引型肺ウィンドーを通じた共焦点光学顕微鏡を利用して、実際の動物モデルで肺組織のイメージングを行った。
40倍対物レンズ（LUCPlanFL、NA0.6; Olympus）を使用した時に焦点から250×250μm²の観測視野を有するように光学系を設計し、蛍光信号は波長ごとに設置された光電子増倍管とフレームグラバ（Matrox、SOLIOS）で検出及び処理でき、Z軸区画化が可能な細胞レベルの解像度の2次元イメージを、毎秒30枚の速度で取得できるように搭載された。

これらの共焦点顕微鏡システムに本実施例による肺ウィンドー装置を取り付け、対物レンズを通過したレーザー光が肺組織に照射され、励起された蛍光信号によって細胞レベルのリアルタイムイメージングが可能となる。

図6は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得された肺組織イメージを示した図である。
肺組織は、肺胞と、肺胞を囲む毛細血管が存在し、毛細血管には血管内皮細胞とこれを囲む基底膜が存在する。

これらの肺の構造をまず確認するためのモデルとして、血管内皮細胞に存在するTie2受容体に緑色蛍光信号が発現されているTie2-GFPマウスと、アクチンフィラメントに赤色蛍光信号が発現されており、同時にヒストンに緑色蛍光信号が発現されているActin-DsRed＆Histone-GFPマウスの肺を、本実施例による肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して観察した。
前記の通り、黒色の円形の肺胞と、肺を取囲んでいる血管内皮細胞で構成されている毛細血管（図6aの緑色、図6bの赤色）を確認した。

また、肺組織に存在する第1型肺胞と第2型肺胞及び肺胞周辺のマクロファージの核（図6bの緑色）を確認できた。

図7は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得された、C57BL6/JマウスにFITC-Dextranを与えて赤血球の動きを連続的に撮影したイメージを示した図である。

微小吸引が肺組織内の細胞に影響を及ぼす可能性を考慮して、赤血球と白血球の動きを観察するイメージを確認した。ここでC57BL6/Jマウスの血管にFITC-Dextranを注入して黒色で対照される赤血球のイメージを獲得し、図7のように、赤血球の動きが連続であり、微小吸引に影響を受けないことを確認した。

図8は、本実施例による微小吸引型肺ウィンドー装置及び共焦点顕微鏡システムを利用して取得されたLysM-GFPマウスで白血球の動きを連続的に撮影したイメージを示した図である。

白血球の動きを観察するためにLysMタンパク質に緑色蛍光信号が発現されているLysM-GFPマウスに、血管は赤色で示すためにTMR-Dextranを注入して血管からLysMの移動経路を追跡した。図8のように、白血球の動きは連続的であり、微小吸引の影響を受けないことを確認した。

このように、本実施例による肺ウィンドー装置を利用する場合には、生理的な循環に干渉を与えず、動物モデルの肺組織に低侵襲であり、微視的アプローチに有用であることを確認し、肺実質と血管の安定的なイメージ確保と共に、細胞間の相互作用と単一細胞レベルの動態把握に関するイメージングに適していることを確認した。

以上のように本発明では、具体的な構成要素等のような特定の事項と、限られた実施例及び図面によって説明されたが、これは本発明のさらに全般的な理解を支援するために提供されたものであり、本発明は、前記の実施例に限定されるものではなく、本発明が属する分野で通常の知識を有する者であればこれらの記載から様々な修正及び変形が可能である。従って、本発明の思想は説明された実施例に限定されて定められてはならず、後述する特許請求の範囲だけでなく、この特許請求の範囲と均等であるか、又は等価的な変形がある全てのものは、本発明思想の範囲に属すると言える。

Claims (5)

1. 生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置であって、
   上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置され、下部に肺組織が接触される開放窓;
   前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管;及び
   前記開放窓の一の側から延長され、前記カバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部を含み、
   前記開放窓及び前記吸引管は、第1ボディ部と、前記第1ボディ部と段差を有して前記第1ボディ部の側面に突出した第1突起部とを含む第1プレートに形成され、
   前記傾斜マウント固定部は、第2ボディ部と、前記第2ボディ部と段差を有し、前記第1突起部と噛み合って結合される第2突起部とを含む第2プレートに形成される、前記肺ウィンドー装置。
2. 前記開放窓は、前記上部から前記下部の方向に直径が広がる円錐形状を有することを特徴とする、請求項１記載の肺ウィンドー装置。
3. 前記傾斜マウント固定部は、前記傾斜マウントが結合される複数の締結孔を含むことを特徴とする、請求項１記載の肺ウィンドー装置。
4. 生体内肺組織顕微鏡イメージ取得のための微小吸引型肺ウィンドー装置であって、
   上下部が開放されて、上部にカバーグラスが配置されて下部に肺組織が接触される開放窓、及び前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管が形成される第1プレート；及び
   前記第1プレートと結合され、前記開放窓に配置されたカバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部が形成された第2プレートを含み、
   前記第1プレートは、前記開放窓及び吸引管が形成される第1ボディ部と、前記第1ボディ部と段差を有して第1ボディ部の側面に突出した第1突起部とを含み、
   前記第2プレートは、前記傾斜マウント固定部が形成される第2ボディ部と、第2ボディ部と段差を有し、前記第1突起部と噛み合って結合される第2突起部とを含む、前記肺ウィンドー装置。
5. 共焦点顕微鏡システム及び微小吸引型肺ウィンドー装置を利用したイメージ取得方法であって、
   前記肺ウィンドー装置の傾斜マウント固定部に固定された傾斜マウントを利用して肺ウィンドー装置の角度を調節する段階；
   複数の波長を有するレーザー光を前記肺ウィンドー装置に形成された開放窓を通して肺組織に照射する段階、前記開放窓の上部にはカバーグラスが形成され、下部には肺組織が接触され、前記開放窓の一の側には吸引装置に延長される吸引管が形成されて、前記開放窓の内部が真空状態に維持される段階；及び
   前記肺組織から励起された蛍光信号を検出する段階を含み、
   前記傾斜マウントの角度調節により前記開放窓に固定したカバーグラスと前記共焦点顕微鏡システムの対物レンズが呼吸又は循環過程中に平行状態を維持し、
   前記微小吸引型肺ウィンドー装置は、
   上下部が開放され、上部にカバーグラスが配置され、下部に肺組織が接触される開放窓;
   前記開放窓の一の側から吸引装置に延長され、前記開放窓内部を真空状態にする吸引管;及び
   前記開放窓の一の側から延長され、前記カバーグラスと共焦点顕微鏡システムの対物レンズが平行状態を維持するようにする傾斜マウントが固定される傾斜マウント固定部を含み、
   前記開放窓及び前記吸引管は、第1ボディ部と、前記第1ボディ部と段差を有して前記第1ボディ部の側面に突出した第1突起部とを含む第1プレートに形成され、
   前記傾斜マウント固定部は、第2ボディ部と、前記第2ボディ部と段差を有し、前記第1突起部と噛み合って結合される第2突起部とを含む第2プレートに形成される、前記イメージ取得方法。