JP5268282B2

JP5268282B2 - 個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法

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Publication number: JP5268282B2
Application number: JP2007129723A
Authority: JP
Inventors: 明溝口; 輸作山口
Original assignee: 有限会社楠屋
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2027-05-15
Also published as: JP2008286883A

Description

本発明は、個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法に係わり、詳細には、個体自体の自発振動の影響を受けずに、２光子レーザー顕微鏡により個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法に関する。

近年の先端医療機器の発展は目覚ましいものがあり、個体（生体）内部の組織学的イメージ像をリアルタイムで観察・取得することが可能となってきている。
また、蛍光タンパク（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ等）の開発により、これまで目に見えなかった生物の現象を目に見えるようにし、生物学に革命的な変化をもたらしてきている。
例えば、蛍光タンパクであるＧＦＰは腫瘍細胞の動き、浸潤、転移や血管新生などのような生きた動物体内での癌の重要な側面を目で見ることを可能にし、また、多重蛍光タンパクは、in vivoで成育する癌細胞の色彩による識別を可能にしてきている（非特許文献１）。

これらの組織学的イメージ像を観察・取得するものとして共焦点レーザー顕微鏡或いはマルチ・フォトン・レーザー走査顕微鏡（２光子レーザー顕微鏡）が登場してきている。
共焦点レーザー顕微鏡は、従来の蛍光顕微鏡では観察できなかった生体組織や細胞の三次元的な構造を解析するための装置であり、光源には一般の蛍光顕微鏡で用いられている水銀光源ではなく、光を集光可能なレーザー光源を用いることで試料をスキャンニングしながら蛍光の画像を取り込むものである。
この共焦点レーザー顕微鏡では、焦点面のみの画像が得られるため、厚みのある組織などを光学的にセクションを行うことができ、最終的にコンピューター上で三次元立体構築画像を得ることができるものとなっている。
しかしながら、得られるイメージ像は、コンピューター上で三次元に立体構築された画像であることから、リアルタイムでの組織学的イメージ像を観察・取得することはできない。

これに対して２光子レーザー顕微鏡は、観察用と励起用の２本のレーザーを波長同期させて照射し、イメージングするため、生体組織のような厚みがあり、光散乱の大きい生体組織の内部において、高解像度の断層像を取得できる利点を有しており、またリアルタイムでの組織学的イメージ像を観察・取得することが可能となる。

そのため、個体が生きたままの状態でその生命現象を同一個体で経時的に観察できる利点があり、医学分野においては、病気の発生、進展及び治癒の過程を細胞レベルで観察できるが、観察対象となる細胞が蛍光タンパクであるＧＦＰ或いはＹＦＰ等、特にＧＦＰで標識された遺伝子改変モデルマウス（ＧＦＰトランスジェニックマウス）に限られていることから、そのモデルマウスの作成・維持の体制が完備していなければならない。

このＧＦＰトランスジェニックマウスは、β−アクチンのプロモーターにＧＦＰ遺伝子を結合させた、いわば人工的な遺伝子をもったマウスであり、β−アクチンプロモーターで発現されたＧＦＰ遺伝子は、全ての組織で発現しており、成熟マウスでは、ＧＦＰは心臓、肺、脾臓、膵臓、食道、胃及び十二指腸及び血液成分（赤血球、白血球、血小板等）でも発現をみせている。

したがって、２光子レーザー顕微鏡により、組織学的に厚みのあるこれらの組織における高解像度の断層像を取得でき、本発明者等もこれら組織等の高解像度の断層像を観察・取得し、細胞レベルでの病気の発生、進展及び治癒の過程を検討してきている。

しかしながら、これまでの２光子レーザー顕微鏡による、生体における組織学的に厚みのある組織の高解像度の断層像を取得する場合には、心拍等、生体個体の自発振動の影響を受け、鮮明な生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得するには問題があった。
すなわち、動物等の個体にあっては、その腹部内部の臓器は動物の呼吸や大動脈の拍動によって絶えず上下左右に振動（２０〜５０μｍ／分）しており、個体が生きたままの状態で、生体内部の組織学的なイメージ像をリアルタイムで獲得することは困難なものであった。また、これら組織の振動のために、取得した画像には縞状の波が現れ、細胞の像が撮影できない問題点があった。
Nature Review (Cancer)、Volume 5/October 2005, 796-806

したがって本発明は、上記現状を鑑み、生体（個体）自体の自発振動の影響を受けずに、２光子レーザー顕微鏡により生体個体の内部組織学的イメージ像を観察・取得する方法を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するべく本発明者らは鋭意検討した結果、被観察臓器・組織の表面を外部手段により固定し、臓器等の振動を除去することで、極めて鮮明な組織学的イメージ像を観察・取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。

したがって本発明は、その基本的態様として、その請求項１に記載の発明は、個体（生体）自体の自発振動の影響を受けずに２光子レーザー顕微鏡により個体（生体）内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法であって、
被観察組織の表面に中空部を有する薄板を載置・固定し、
被観察組織の表面に載置・固定した該薄板をさらに外部固定手段により固定し、
それにより被観察組織の振動を除去する、
ことを特徴とする前記個体（生体）内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法である。

より具体的な請求項２に記載の本発明は、生体内部の組織学的イメージ像が、個体内部組織の蛍光断層像である請求項１に記載の方法である。

請求項３に記載する本発明は、上記した本発明の方法において使用する前記中空部を有する薄板が、金属製の薄板又は硬質プラスチック製の薄板であることを特徴とし、請求項４に記載の本発明は、前記中空部を有する薄板が、リング状又は多角形リング状の薄板であることを特徴とする方法である。

また、請求項５に記載の発明は、前記中空部を有する薄板が、厚さ０．５〜２ｍｍ厚を有し、内径４〜３０ｍｍ／外径１０〜６０ｍｍであることを特徴とし、請求項６に記載の本発明は、前記中空部を有する薄板が、その一部に欠損部を設けていてもよい円盤形状又は多角形状のものである方法である。

更にまた、請求項７に記載の本発明は、被観察組織の表面に対する中空部を有する薄板の載置・固定手段を、接着剤により行うものである方法であり、また請求項８に記載の本発明は、かかる被観察組織の表面に対する中空部を有する薄板の載置・固定手段を、薄板に設けた吸引孔を利用した吸引接着により行うものである方法である。

また請求項９に記載の本発明は、薄板の中空部に生理的に許容される液体を充填させ、充填部分をカバーグラスにより被覆する方法であり、請求項１０に記載の本発明は生理的に許容される液体が生理食塩水である方法である。
かかる薄板の中空部に生理的に許容される液体を充填させ、充填部分をカバーグラスにより被覆することにより、より鮮明に、生体自体の自発振動の影響を受けずに２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得することが可能となる。

また、本発明は別の態様として上記の各発明において使用する中空部を有する薄板であり、詳細には以下の構成を有する。
すなわち、
（１）前記中空部を有する薄板が、金属製の薄板又は硬質プラスチック製の薄板であることを特徴とする薄板；
（２）前記中空部を有する薄板が、リング状又は多角形状の薄板であることを特徴とする薄板；
（３）前記中空部を有する薄板が、厚さ０．５〜２ｍｍ厚を有し、内径４〜３０ｍｍ／外径１０〜６０ｍｍであることを特徴とする薄板；
（４）前記リング状の中空部を有する薄板が、円盤状又多角形状のものである薄板；
である。

更に本発明は、また別の態様として上記の本発明に使用する上記（１）〜（４）に記載の薄板の使用方法である。

本発明が提供する生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法により、生体自体の自発振動の影響を受けずに２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得することが可能となり、例えば、個体が生きたままの状態でその生命現象を同一個体で経時的に観察できる。その結果、医学分野においては、病気の発生、進展及び治癒の過程を細胞レベルでリアルタイムでの観察が可能となる利点を有している。

さらに、本発明の方法により、例えば、生体における脳血栓の様子を立体的にリアルタイムで観察することが可能となり、今後脳血栓症に対して生きたままの状態で血栓の変化を観察しながらかかる疾患に対する治療を行える利点を有している。
また、かかる血栓の溶解に対する治療薬の効果をビジュアルに観察することが可能となり、より効果的かつ効率的な脳血栓症治療薬の開発を行える利点を有する。

また、血栓症のみならず、腫瘍細胞の動き、浸潤、転移や血管新生などのような生きた動物体内での腫瘍細胞の重要な側面を観察することが可能となり、腫瘍の治療に一助を与えるものである。
また、白血球等免疫担当細胞の働きをリアルタイムで経時的、かつビジュアルに観察することが可能となり、癌治療薬や感染症、免疫疾患治療薬など、より効果的な各種疾患の治療薬の開発を行える利点を有する。

更に、本発明にあっては、薄板の着脱と複数回の経時的観察を可能にする。
すなわち、被観察組織の表面に接着、固定した薄板は、接着面に極少量（例えば、０．０１ｍＬ程度）の接着剤除去液を塗布することにより、また、吸引接着の場合は、さらに簡単に陰圧を解除するだけで、組織表面から取り除くことができ、したがって、一度観察した組織は、ほとんど無傷で個体に戻すことが可能であり、その後皮膚を縫合すれば、個体も観察後２時間程度で自力歩行、飲食可能となる。この結果、同一個体の同一組織、場合によっては、同一の細胞を、数日から数週間にわたって、経時的に観察できる利点を有している。この点は、動物取り扱いの規定からみて、極めて重要なことといえる。

本発明は、前記した如く、生体（個体）自体の自発振動の影響を受けずに、２光子レーザー顕微鏡により生体（個体）内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法である。
かかる方法は、具体的には、
被観察組織の表面に中空部を有する薄板を載置・固定し、
被観察組織の表面に載置・固定した該薄板をさらに外部固定手段により固定し、
それにより被観察組織の振動を除去する、
ことにより、前記生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法である。

以下本発明を、図面を参照にしながら詳細に説明する。
図１に、共焦点レーザー顕微鏡と２光子レーザー顕微鏡の原理の比較を示した。
なお、この原理の比較の出典は、Denk W.ら、Neuron, 18(1997), 351-357による。
図中左に共焦点レーザー顕微鏡の原理を、右に２光子レーザー顕微鏡の原理を示した。本発明で使用する２光子レーザー顕微鏡は、要するに励起した２つの光子を同時に同じ蛍光分子に当て、フェムトセカンド（フェムト秒）レーザー１０^−１５秒の中に波長同期した光子を発生させ観察する技術であり、使用するレーザーが、波長９００ｎｍ付近の赤外線（インフラレッドレーザー、ＩＲレーザー）であるために組織の深部に到達しやすい性質があることから、生体組織のような厚みがあり、光散乱の大きい生体組織の内部において、高解像度の断層像を取得できる利点を有しており、またリアルタイムでの組織学的イメージ像を観察・取得することが可能となる。

従来、この２光子レーザー顕微鏡による生体組織の観察は、被観察組織をそのまま対物レンズによる観察で行っているが、被観察対象である動物は、その呼吸や大動脈の拍動により絶えず上下左右に振動している。
例えば、腹腔内組織においては０．２〜０．５ｍｍ程度の上下振動があり、心臓や肺組織の近くでは１ｍｍ程度の上下振動が認められる。したがって、観察用と励起用の２本のレーザーを波長同期させて照射し、同時に蛍光分子に当たるに際してその上下動のため、得られた画像には縞状の波が現れ、細胞の像の撮影は困難なものであった。

本発明においては、被観察組織（臓器）の表面に、中空部を有する薄板を載置・固定し、被観察組織の表面に載置・固定した該薄板をさらに外部固定手段により固定ずることにより、被観察組織の振動を除去し、薄板直下の組織（臓器）を振動無く可視化するものである。

かかる手段の実施例に変わる模式的な概略図を、図２として示した。
すなわち、図中１は被観察個体としての例えば、ＧＦＰトランスジェニックマウスであり、その腹部を切開し、切開した腹腔内の被観察組織（臓器）の表面に、中空部を有する薄板２を載置・固定し、該薄板を例えば、外部固定手段、例えば、ステージ上に固定されたマウス固定器の金属アーム３で固定し、２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する。
本実施例にあって、被観察組織（臓器）の表面に、載置・固定する中空部を有する薄板２としては、金属製のリングであるが、かかる薄板としては、金属製の薄板に加え、硬質プラスチック製の薄板等をあげることができる。

その薄板２の形状は特に限定されるものではなく、本実施例におけるようなリング状のものであっても、また、その一部に欠損部を設けていてもよい円盤形状、又は５から８多角形程度の多角形状の薄板であってもよい。
かかる薄板２は、２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的観察を可能にするように、中空部を有するものであり、その厚さとしては０．５〜２ｍｍ厚程度であり、その大きさとして内径４〜３０ｍｍ／外径１０〜６０ｍｍであるのが好ましく、被観察組織（臓器）の大きさにより種々変更させることができる。
なお、その厚み、内径／外径の大きさは、上記の範囲に限定されないことはいうまでもない。

かかる薄板を被観察組織（臓器）の表面に、載置・固定する手段としては、その着脱が容易に行える接着剤により行うのが好ましく、また、薄板に設けた多数の孔による吸引接着によるものであってもよい。

かくして被観察組織（臓器）表面上に載置・固定された薄板２は、更に例えば、外部固定手段、例えばステージ上に固定されたマウス固定器の金属アーム３で固定し、かくすることにより被観察組織の振動を除去することが可能となる。

このようにして、被観察組織（臓器）表面上に載置・固定された薄板２直下の組織を２光子レーザー顕微鏡にて観察するに当たっては、このままでも、また薄板２の中空部２１に、例えば生理的に許容される液体を充填させ、充填部分をカバーグラスにより被覆して観察するのがよい。
かくすることにより、２光子レーザーの透過がより安定し、より鮮明なイメージ画像を取得することができる。かかる生理的に許容される液体としては、簡便には生理食塩水を使用することができる。

以上の本発明方法により、２光子レーザー顕微鏡で生体個体の内部組織の蛍光断層像を極めて鮮明な画像として取得することができるが、その具体的画像取得の実際を、以下の実験例により実証する。

実験例１：
ＧＦＰトランスジェニックマウスに麻酔をかけ、頭蓋骨に穴を開ける。
頭蓋骨の開切部に、本発明の薄板である中空部を有する金属リングを接着剤にて載置・固定し、中空部に生理食塩水を充填させ、カバーグラスにより被覆した後、２光子レーザー顕微鏡により正常脳血管像を観察した。
かかる方法により得られた正常脳血管像の写真を図３として示した。
図３に示した写真から判明するように、本発明方法により極めて鮮明な脳血管の組織画像を取得することができていることが理解される。

このマウスにＬＰＳ（リポポリサッカライド：lipopolysaccharide）を注射し、それにより生じた血栓を観察した。
なお、このＬＰＳは微生物（グラム陰性菌体）の外膜成分であり、リピドＡ、コア多糖体、Ｏ−多糖体から構成されるものであり、血管の内皮細胞を傷害するものである。
ＬＰＳ投与後１日後に脳血管に形成された血栓の、本発明の方法による２光子レーザー顕微鏡による観察画像を図４として示した。
図中において、血管壁に形成された血栓２０及び白血球３０が鮮明に映し出されていることが判明する。

図３及び図４に示すように、本発明の方法により極めて鮮明に脳血管の映像を取得することができ、形成された脳血栓２０の画像を鮮明に取得することができることが理解される。
かくして形成された血栓を、例えば血栓溶解剤であるｔ−ＰＡを投与することにより血栓が溶解している様子を本発明の方法によりリアルタイムで観察することができた。
また、血栓溶解剤を投与しない場合であっても、白血球３０により形成された血栓２０が崩壊していく様子をリアルタイムに観察することができた。
かかる様子を観察した画像を図５として示した。

上記の実験は、ＧＦＰトランスジェニックマウスにおける脳血管での画像を示したものであるが、本発明の方法により腹腔内組織における各種組織の組織学的イメージ像を観察・取得することも可能である。
その画像は、特に、生体個体の自発振動の影響を受けることなく生体における組織学的に厚みのある組織の高解像度の断層像を取得することを可能にし、これら組織における病体を、鮮明なイメージ像として観察・取得できることから、疾患の治療の進行を確実に把握することも可能となる。

かかる比較を、実験例２として、以下に示した。
実験例２：
本発明方法と、本発明方法によらないＧＦＰトランスジェニックマウスの腹腔内組織における細胞像の比較写真を、図６及び図７に示した。
図６は、本発明の方法によらない２光子レーザー顕微鏡による観察画像であるが、組織の振動のため、図中矢印で示すように、画像に縞状の波が現れ、鮮明な像の撮影ができない状態であった。
これに対して、本発明方法による２光子レーザー顕微鏡による観察画像を図８として示したが、組織の振動がなくなるため、図中矢印で示すように、鮮明な細胞の像画が獲得できていることが理解される。

本発明は、上記したように、生体自体の自発振動の影響を受けずに、２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法であり、かかる方法は、特に、被観察組織の表面に中空部を有する薄板を載置・固定し、被観察組織の表面に載置・固定した該薄板をさらに外部固定手段により固定し、それにより被観察組織の振動を除去することによる生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得することにより行われる。したがって、本発明は、また別の態様として、かかる方法に使用する中空部を有する薄板に関するものであり、また、２光子レーザー顕微鏡により生体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法のためのかかる薄板を使用する方法にも関する。

したがって、かかる薄板自体のみならず、２光子レーザー顕微鏡の映像写真の取得における薄板の使用自体も本発明の権利範囲に包含されることに留意すべきである。

以上に説明した本発明による個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法は、例えば、以下に記載する応用があり、その技術は極めて有用なものといえる。
（１）多重蛍光標識個体における細胞同定と再生医療への本発明技術の有用性
多重に蛍光標識された動物個体では、たとえば、ＲＦＰが全身の細胞に発現され、ＧＦＰが特定の神経幹細胞にのみ発現されているマウスを用いれば、片方の蛍光（ＲＦＰ）による細胞イメージを位置同定の基準にして、もう一方の蛍光（ＧＦＰ）で標識された特定の神経幹細胞が、どこに移動し、どのような細胞に分化したかを検証することができることとなる。
このような二重蛍光標識動物と本発明の技法による細胞同定技術は、特に再生医療において、必須の技術になると考えられる。

（２）生体内細胞工学・マイクロサージャリーへの本発明技術の有用性
本発明技法と微細ガラス管マイクロマニピュレーションを組み合わせると、２光子レーザー顕微鏡のリアルタイムイメージングによって、微細ガラス管先端の位置を描出し、画像を見ながらガラス管先端を目的の細胞に刺入して、特定の遺伝子や蛋白質を微量注入したり、逆に、目的の細胞からｍＲＮＡを回収したり、電気生理学的解析を行うことが可能である。
また、将来、マイクロナノロッボットマシーンを用いた治療においては、このマシーン操作のモニター用として、本技法が有用である。

以上記載のように、本発明の方法により、生体個体自体の自発振動の影響を受けずに、２光子レーザー顕微鏡により生体個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法が提供される。
かかる本発明により、個体（生体）が生きたままの状態でその生命現象を同一個体で経時的に観察できることとなり、その結果、医学分野においては、病気の発生、進展及び治癒の過程を細胞レベルでリアルタイムでの観察が可能となる利点を有している。

特に本発明の方法により、例えば、生体における脳血栓の様子を立体的にリアルタイムで観察することが可能となり、今後脳血栓症に対して生きたままの状態で血栓の変化を観察しながらかかる疾患に対する治療を行える利点を有しているのみならず、かかる血栓の溶解に対する治療薬の効果をビジュアルに観察することが可能となり、より効果的な脳血栓症治療薬の開発を行える点で、その産業上の貢献度は多大なものである。

共焦点レーザー顕微鏡と２光子レーザー顕微鏡の原理の比較を示した図である。図中左が共焦点レーザー顕微鏡の原理であり、右が２光子レーザー顕微鏡の原理である。本発明の実施例に代わる模式的な概略図を示した図である。本発明方法により取得した正常脳血管像の写真である。ＬＰＳ投与後１日後に脳血管に形成された血栓について、本発明の方法による２光子レーザー顕微鏡による観察画像の写真である。白血球により、形成された血栓が崩壊していく様子を、本発明方法により観察した画像写真である。本発明の方法によらない、２光子レーザー顕微鏡による細胞の観察画像写真である。本発明の方法による、２光子レーザー顕微鏡による細胞の観察画像写真である。

符号の説明

１ＧＦＰトランスジェニックマウス
２中空部を有する薄板
３外部固定手段（金属アーム）
２０血栓
３０白血球

Claims

被観察個体自体の自発振動の影響を受けずに２光子レーザー顕微鏡により個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法であって、
被観察組織の表面に中空部を有する薄板を載置・固定し、
薄板の中空部に生理的に許容される液体を充填させ、充填部分をカバーグラスにより被覆し、
被観察組織の表面に載置・固定した該薄板をさらに外部固定手段により固定し、
それにより被観察組織の振動を除去する、
ことを特徴とする前記個体内部の組織学的イメージ像を観察・取得する方法。
個体内部の組織学的イメージ像が、個体内部組織の蛍光断層像である請求項１に記載の方法。
前記中空部を有する薄板が、金属製の薄板又は硬質プラスチック製の薄板であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記中空部を有する薄板が、リング状又は多角形リング状の薄板であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
前記中空部を有する薄板が、厚さ０．５〜２ｍｍ厚を有し、内径４〜３０ｍｍ／外径１０〜６０ｍｍであることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
被観察組織の表面に対する中空部を有する薄板の載置・固定手段を、接着剤により行うものである請求項１に記載の方法。
被観察組織の表面に対する中空部を有する薄板の載置・固定手段を、薄板に設けた吸引孔を利用した吸引接着により行うものである請求項１に記載の方法。
生理的に許容される液体が、生理食塩水である請求項１に記載の方法。