JP2021114957A - 培養組織の観察方法、培養方法、評価方法及び培養器具 - Google Patents
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Abstract
Description
表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台に、前記培養対象を載置し、前記貫通孔を通じて前記培養対象に培養液を接触させて培養する培養工程と、
以下の(a)又は(b)による観察工程と、
を含むことを特徴とする、観察方法である。
(b)前記貫通孔を通じて、前記培養台に載置された前記培養対象に、下方より光源からの光を照射し、正立顕微鏡により該培養対象を観察する。
前記観察工程を経時的に行う。
このように培養対象の位置を保持しながら培養対象を培養することにより、培養対象が培養液に漂って移動することが無いため、培養対象の特定の位置を経時的に観察することができ、その形態変化等を評価し易くなる。
貫通孔の直径を1mm以上とすることにより、顕微鏡の光路を十分に確保することができる。
このように培養台をいわばカルチャーインサートの構造のごとく構成することにより、簡便な培養と観察が可能になる。
かかる形態によれば、共培養対象が培養対象に与える影響を評価することができる。
本発明は皮膚組織の培養及びその観察評価系に適している。
本発明はゲル組成物に包埋された細胞や生体組織の観察に適している。
かかる形態はいわば気相液相界面培養である。本形態は、皮膚組織のような気相と液相に極性をもって接する組織の培養及びその観察評価に適している。
前記染色工程の後に前記観察工程を行い、
前記観察工程において、前記培養対象の染色像を観察する。
かかる形態によれば、簡便に培養対象を染色観察することができる。
このような形態とすることにより、より簡便に培養対象の染色が可能になる。
本発明の評価方法は、前記培養対象に試験対象を付与する付与工程と、前記培養工程と、前記観察工程と、を含み、
前記付与工程の後、任意の期間の前記培養工程を経た後に、前記観察工程を行い、該観察工程における観察結果に基づき、前記試験対象が前記培養対象に与える影響を評価することを特徴とする。
前記付与工程の前又は直後にも、前記観察工程を行い、
前記付与工程の前又は直後の前記観察工程における観察結果と、前記任意の期間の前記培養工程を経た後の前記観察工程における観察結果と、に基づき、前記試験対象が前記培養対象に与える影響を評価する。
前記付与工程において前記試験対象を前記皮膚組織に塗布する。
かかる形態の本発明によれば、生体適用する条件に近い条件でのスクリーニングが可能になり、より高精度に候補物質の絞り込みができる。
本発明の培養方法は、生体組織及び/又は細胞含有固形組成物である培養対象の培養方法であって、
表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台に、前記培養対象を載置し、前記貫通孔を通じて前記培養対象に培養液を接触させて培養することを特徴とする。
本発明の培養器具は、生体組織及び/又は細胞含有組織である培養対象を載置し培養するための、表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台を備えることを特徴とする。
かかる形態の本発明は、培養台上の位置を保持しながら培養対象を培養することができ、経時的な観察を要する培養系に有利である。
貫通孔の直径を1mm以上とすることにより、顕微鏡観察の際の光路を十分に確保することができる。
また、公知技術であるカルチャーインサートによる組織培養技術の模式図を図13〜図15に示し、本発明と適宜対比しながら説明する。
本発明の培養器具は培養台10を備える。培養台10には貫通孔11が設けられている。貫通孔11は、これを通じて顕微鏡観察するためのものであり、従来のカルチャーインサートの培養台(メンブレン)に設けられている微小孔とは孔径が全く異なるものである。
例えば培養台10には、貫通孔11の他に複数の微小孔を設けてもよい。微小孔の孔径は好ましくは0.01〜20μmであり、より好ましくは0.1〜10μmである。
このような実施の形態の培養台10は、市販のカルチャーインサートに貫通孔11を穿つことで製造することもできる。
後述する培養液貯留容器2の内部で共培養対象を培養する形態とする場合には、培養液貯留容器2は細胞培養に適した形態であることが好ましい。
培養液貯留容器2として、通常の培養操作に用いる培養皿や複数のウェルを備える培養プレートを使用しても良い。
この場合、灌流機構は自動制御されていることが好ましい。
保持手段の具体的な態様は特に限定されず、培養台10と一体である構成を採用してもよいし、培養台10とは別体の部材を採用してもよい。
正立顕微鏡又は透過型の倒立顕微鏡によって培養対象3を観察可能にするため、錘152は前記顕微鏡の光路を遮断しない形態であることが好ましい。顕微鏡の光路を確保する観点では、錘152は透明部材で構成されているか、または貫通孔を有する形態であることが好ましい。
また、気相液相界面培養を行う場合には、培養対象3と気相との接触を確保するため、錘152は貫通孔を有する形態であることが好ましい。
貫通孔を有する錘152の具体的な構造としては、ドーナツ型構造や網状構造が挙げられる。
<2−1>培養対象
本発明の培養対象3は、生体組織と細胞含有固形組成物である。ヒト、動物及び植物の何れの種に由来するものであっても本発明を適用することができる。
培養液4は培養対象3の種類により適宜選択する。
本発明を適用可能なヒト又は動物の生体組織としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織の何れもが挙げられ、より具体的には皮膚組織、骨組織、軟骨組織などが挙げられる。
本発明は気相液相界面培養に適しているため、皮膚組織の培養に応用することが好ましい。
ゲル組成物に包埋する細胞は培養細胞や生体より採取した細胞が挙げられ、その種類は限定されない。またゲル組成物に包埋する生体組織には生体より採取した組織と人工的に製造した組織のいずれもが含まれる。
培養対象3の厚みも顕微鏡観察に支障がない範囲で任意に選択することができる。
本発明の培養方法の特徴は、貫通孔11を通じて培養対象3に培養液4を供給する点にある(図1〜5)。培養対象3に培養液4を接触させるため、少なくとも培養液4の液面が貫通孔11の上部開口面にまで達している必要がある。
図1〜5に示した実施形態においては、培養液貯留容器2に貯留する培養液4の液量を調整することにより、前記構成を容易に実現することができる。
本発明においてはこの実施形態に限定されず、貫通孔11の上部開口面よりも、培養液貯留容器2における培養液4の液面の方が上方に位置していても良い。この場合には、貫通孔11より培養液4が培養台10上に溢れ出るため、図5に示すように培養対象3の上に錘152を載置することが好ましい。
共培養する培養対象3と共培養対象の組合せは特に限定されない。共培養対象の分泌物が培養対象3に形態変化や分化、培養・成長促進の影響を与えることが公知である何れの組合せを採用しても良い。
また、共培養対象が培養対象3に与える影響、又は培養対象3が共培養対象に与える影響が非公知である組合せを採用しても良い。この場合には、本発明の評価方法により、共培養対象が培養対象3に与える影響、または培養対象3が共培養対象に与える影響を観察評価することができる。
本発明の観察方法は、培養工程と観察工程を備える。培養工程の実施形態については、上述の培養方法の実施形態の説明がそのまま妥当する。
(a)倒立顕微鏡により、前記貫通孔を通じて、前記培養台に載置された前記培養対象を観察する。
(b)前記貫通孔を通じて、前記培養台に載置された前記培養対象に、下方より光源からの光を照射し、正立顕微鏡により該培養対象を観察する。
図8に示すように、透過型正立顕微鏡で観察する本発明の実施形態においては、光源51からの光が貫通孔11を通過して対物レンズ50に到達する。つまり、光源51の光路上に培養台10が存在しない。したがって、従来のカルチャーインサート上の培養対象3を透過型正立顕微鏡で観察する形態(図15)に比べ、光のロスが大幅に低減されており、より明瞭な顕微鏡像を得ることができる。
なお、本発明の培養方法で培養される培養対象3を落射型正立顕微鏡で観察しても問題は無い。
このような問題を解決するために、上述した保持手段を備える実施形態の培養器具(図4及び図5)を用いて、本発明の観察方法を実施することが好ましい。
基準点は好ましくは2以上、より好ましくは3以上設定する。
また、焦点面を少しずつずらして取り込んだ顕微鏡像を再構成して生成した3次元画像顕微鏡像(Zスタック画像)を取得し、複数の基準点を同一平面ではなく3次元的に分散させて設定することも好ましい。
基準点を合致させた上での複数顕微鏡像の重ね合わせは、公知の顕微鏡画像処理ソフトにより容易に実行することができる。
染色方法は特に限定されず、公知の何れの方法をも使用することができる。生きていない組織等を染色するin vitro染色と、生きている組織等を染色するin vivo染色の何れであっても採用することができる。
培養工程に供されている培養対象3を経時的に観察する場合には、in vivo染色を採用することが好ましい。
抗体の選択により任意の抗原を染色できることから、免疫染色を採用することが好ましい。
例えば、培養液貯留容器2から、培養対象3が載置された状態の培養台10を取り出し、これを染色液が貯留された容器の内部に置き、培養対象3を染色する実施の形態が挙げられる。この場合、貫通孔11を通じて培養対象3に染色液が接触することとなる。
図9には2回目の観察工程の後に再び培養工程を行い、3回以上の観察工程を実行する形態を示しているが、もちろん観察工程は2回で留めてもよい。
観察用の容器は透明材料で構成されていることが好ましい。また、観察工程において観察用の容器に培養液4を貯留してもよい(実質的に図6〜図8に示す実施の形態としてもよい)。
本発明は試験対象が培養対象に与える影響を評価する方法にも関する。本発明の評価方法は、例えば医薬品や化粧料、健康食品の有効成分のスクリーニングや、特定の物質の毒性試験、また、純粋な生物学・医学的研究に応用することができる。
例えば「試験対象」には、化学的に合成された化合物、天然物から抽出された化合物、人工的に製造した組成物、天然から抽出された抽出組成物など、化合物単体や混合物が制限なく含まれる。
また、光、ガス、電気刺激、物理的刺激などの目に見えないものも「試験対象」とすることができる。
さらには、上述した共培養における共培養対象、より具体的には共培養対象から分泌される分泌物も「試験対象」に含まれ得る。
直接付与する形態としては、培養対象3に試験対象を塗布、散布、注入する方法が挙げられる。培養対象3が皮膚組織である場合には、試験対象又は試験対象を含む組成物を培養対象3に塗布する形態が好ましく例示できる。
なお、共培養を行いながら他の試験対象を培養対象3に付与する実施形態も、当然ながら本発明の技術的範囲に含まれる。
図10Aは、まず観察工程により培養対象3を観察し、培養対象3の初期状態を確認した後に付与工程を行い、任意の期間の培養工程を経た後の培養対象3の形態を観察工程により確認する実施形態を示している。
図10Bは、付与工程を行った直後に観察工程を行い、培養対象3の初期状態を確認した後に任意の期間の培養工程を実施し、その後の培養対象3の形態を観察工程により確認する実施形態を示している。
図10A及びBの何れの形態であっても試験対象が培養対象3に与える影響を評価することができる。
5%アガロース溶液を加熱溶解した後、12ウェルプレートに注入し、インキュベーター内で保温した。
市販のヒト皮膚組織から脂肪組織を切り出し、これをインキュベーター内で保温していた5%アガロース溶液に添加し、12ウェルプレートを保冷剤で上下から挟み込み冷却固化した。
冷却固化したゲル組成物を剃刀で切り、脂肪組織が表面に露出した状態で扁平状に成形することで脂肪組織含有ゲル組成物を調製した。
図1に示す壁部12及び脚部13を備える培養台10を用意した。
培養台10に設けられた貫通孔11の孔径は直径3.0mmである。壁部12、脚部13、培養台10はそれぞれ透明の合成樹脂で成形されている。また、培養台10は多孔性メンブレンであり、貫通孔11の他、全体に渡って孔径約1μmの微小孔が設けられている。
PBSで脂肪組織含有ゲル組成物を洗浄した後、上述の2種類の一次抗体に対する蛍光標識二次抗体を培養液4(DMEM)で希釈した染色液が貯留された10cmディッシュに前記培養台10を載置した。貫通孔11を通じて脂肪組織含有ゲル組成物に染色液を接触させ、2時間インキュベートした。
PBSで脂肪組織含有ゲル組成物を洗浄した後、培養液4(DMEM)が貯留されたガラスボトムプレートの内部に培養台10を載置し、落射型倒立共焦点蛍光顕微鏡を用いて、貫通孔11を通じて下方から脂肪組織含有ゲル組成物の3次元染色像を撮影した(図6参照)。
培養液4(DMEM)が貯留され、共培養対象として脂肪由来幹細胞(ADMSC)が予め播種された6ウェルプレート(培養液貯留容器2)に前記培養台10を載置した。貫通孔11を通じて脂肪組織含有ゲル組成物に培養液4が接触する状態(図5に示す状態)で、7日間インキュベーター内で培養した。
なお、共培養の影響を比較評価するため、共培養対象である脂肪由来幹細胞が播種されていない6ウェルプレートにも前記培養台10を載置して同様に脂肪組織含有ゲル組成物を培養した。
上述した観察工程(1)と同様の手順で脂肪組織含有ゲル組成物を染色し、その3次元染色像を観察した。
脂肪由来幹細胞と共培養した脂肪組織の染色像を図11に示し、共培養することなく培養した脂肪組織の染色像を図12に示す。図11及び図12に示すように染色像は極めて明瞭である。
11 貫通孔
12 壁部
13 脚部
14 突起部
151 凸部
152 錘
2 培養液貯留容器
3 培養対象
4 培養液
50 対物レンズ
51 光源
521 ダイクロイックミラー
522 光源ミラー
6 メンブレン
Claims (17)
- 生体組織及び/又は細胞含有固形組成物である培養対象の観察方法であって、
表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台に、前記培養対象を載置し、前記貫通孔を通じて前記培養対象に培養液を接触させて培養する培養工程と、
以下の(a)又は(b)による観察工程と、
を含むことを特徴とする、観察方法。
(a)倒立顕微鏡により、前記貫通孔を通じて、前記培養台に載置された前記培養対象を観察する。
(b)前記貫通孔を通じて、前記培養台に載置された前記培養対象に、下方より光源からの光を照射し、正立顕微鏡により該培養対象を観察する。 - 前記培養工程において、前記培養台上における前記培養対象の位置を保持した状態で、記培養対象を培養し、
前記観察工程を経時的に行うことを特徴とする、請求項1に記載の観察方法。 - 前記貫通孔の直径が1mm以上であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の観察方法。
- 培養工程が、培養液貯留容器の内部に設けられた前記培養台に培養対象を載置し、培養液貯留容器に貯留された前記培養液が、前記貫通孔を通じて前記培養対象に接触するようにして、前記培養対象を培養する工程であることを特徴とする、請求項1〜3の何れか一項に記載の観察方法。
- 前記培養液貯留容器に貯留された培養液中で、細胞及び/又は生体組織である共培養対象の培養を行うことを特徴とする、請求項4に記載の観察方法。
- 前記培養対象が、皮膚組織であることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の観察方法。
- 前記培養対象が、細胞及び/又は生体組織が包埋されたゲル組成物であることを特徴とする、請求項1〜5の何れか一項に記載の観察方法。
- 前記培養工程において、少なくとも前記培養対象の上部表面が前記培養液に触れない状態に置いて、前記培養対象を培養することを特徴とする、請求項1〜7の何れか一項に記載の観察方法。
- 前記培養対象を前記培養台に載置した状態で、前記培養対象を染色する染色工程を含み、
前記染色工程の後に前記観察工程を行い、
前記観察工程において、前記培養対象の染色像を観察することを特徴とする、請求項1〜8の何れか一項に記載の観察方法。 - 前記染色工程において、前記培養対象が載置された培養台を染色液が貯留された容器に置き、前記貫通孔を通じて前記染色液を前記培養対象に接触させることにより、前記培養対象を染色することを特徴とする、請求項9に記載の観察方法。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の観察方法により、試験対象が培養対象に与える影響を評価する方法であって、
前記培養対象に試験対象を付与する付与工程と、前記培養工程と、前記観察工程と、を含み、
前記付与工程の後、任意の期間の前記培養工程を経た後に、前記観察工程を行い、該観察工程における観察結果に基づき、前記試験対象が前記培養対象に与える影響を評価することを特徴とする、評価方法。 - 前記培養工程において、保持手段により、前記培養台上における前記培養対象の位置を保持した状態で、記培養対象を培養し、
前記付与工程の前又は直後にも、前記観察工程を行い、
前記付与工程の前又は直後の前記観察工程における観察結果と、前記任意の期間の前記培養工程を経た後の前記観察工程における観察結果と、に基づき、前記試験対象が前記培養対象に与える影響を評価することを特徴とする、請求項11に記載の評価方法。 - 前記培養対象が皮膚組織であり、
前記付与工程において前記試験対象を前記皮膚組織に塗布することを特徴とする、請求項11又は12に記載の評価方法。 - 生体組織及び/又は細胞含有固形組成物である培養対象の培養方法であって、
表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台に、前記培養対象を載置し、前記貫通孔を通じて前記培養対象に培養液を接触させて培養することを特徴とする、培養方法。 - 生体組織及び/又は細胞含有組織である培養対象を載置し培養するための、表裏方向を貫く貫通孔を有する培養台を備えることを特徴とする、培養器具。
- 前記培養台上における前記培養対象の位置を保持するための保持手段を備えることを特徴とする、請求項15に記載の培養器具。
- 前記貫通孔の直径が1mm以上であることを特徴とする、請求項15又は16に記載の培養器具。
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