KR101670219B1 - Hcn2 유전자 조작을 이용한 우울증상발현 마우스모델 제작과 그의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HCN2 유전자조작을 이용한 우울증상발현 마우스모델에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 수정란을 이용한 우울증 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 우울증 동물 모델을 이용한 우울증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규하게 성립한 우울증 동물모델은 효과적인 치료제 개발을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 HCN2 유전자 조작을 이용한 우울증상발현 마우스모델에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 HCN2 유전자 조작된 수정란을 이용한 우울증 동물 모델의 제조 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 우울증 동물 모델을 이용한 우울증 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
우울증은 현재 유병률이 날로 증가하는 질환 중 하나로, 세계보건기구(WHO)도 21세 기에 인류를 괴롭히는 10대 질병 중 하나로 우울증이 대두되고 있다. 우리나라 역시 2001년도 국민건강 영양조사에 의하면 전 국민의 8%인 약 320만 명이 항상 우울증에 시달리린다고 밝혀졌다. 가끔 우울증을 느끼는 사람들로 53.60%나 되는 것으로 조사되었다. 또한 세계 보건기구(WHO)에서는 2020년 세계 5대 부담 질병에 우울증을 포함시켰다.
우울증의 주요 증상으로는 우울감, 무기력감, 불안, 흥미의 저하, 식욕장애, 수면장애, 자살 생각 등이 주요 증상으로 나타나며, 무가치감, 부적절한 죄책감, 집중력 및 기억력의 감퇴 등이 있다. 또한 우울증은 비만, 심혈관질환, 퇴행성신경질환 등 많은 합병증을 수반하는 것으로 알려져 있다. 우울증으로 인한 무기력감, 자살, 집중력 및 기억력의 감퇴는 개인의 건강뿐만 아니라 생산성 저하로 이어져 사회의 막대한 경제적 손실을 야기할 수 있다.
현재 많이 이용되고 있는 항우울제의 경우 40% 이상의 환자에서 치료효과가 나타나지 않고 있다. 또한, 효과가 나타나는 환자들의 경우에도 수주에서 수개월간의 시간이 소요된다. 이에 따라서 새로운 우울증 치료제 개발에 대한 필요성이 대두되고 있다.
효과적인 우울증 치료제 개발을 위해 우울증 동물모델은 필수적이다. 그러나 현재까지 우울증의 임상적 특성을 포괄적으로 반영하는 모델은 없었다.
동물모델에서 고려되어야 할 기본적인 요소는 행동의 조작적 증명과 재현성 및 항우울제 치료에 대한 반응성이다. 이러한 점을 고려할 때, 우울증 원인 유전자의 이식 및 화학물질 주입방법의 동물 모델 개발은 증상 발현의 균일성과 재현 가능한 결과 확보에 큰 장점이 있다. 또한, 이를 통해 신약의 효능 평가 및 개발기간의 단축을 유도할 수 있다. 특히 우울증 원인 유전자 이식을 통해 개발된 마우스를 이용하여 신약 스크리닝 시스템을 구축할 경우 다양한 물질의 효능을 개체 수준에서 단기간에 광범위하게 테스트가 가능할 것으로 기대된다.
본 발명자들은 상기와 같은 기술적 문제를 해결하기 위하여 신규한 우울증 동물 모델을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 특정 유전자의 과발현이 유도된 동물모델에서 우울증 증상이 균일하게 발생하며, 항우울증 치료제에 대한 반응성이 탁월한 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양상은 HCN2 유전자 조작을 이용한 우울증상발현 마우스모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 HCN2 유전자 조작된 수정란을 이용한 우울증 동물 모델의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 일 양상은 상기 우울증 동물 모델을 이용한 우울증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 HCN2 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 우울증 모델용 동물 수정란을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에서 HCN2 (Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 2 또는 hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 2) (GenBank: AB154248.1)는 ion channel인 hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated cation channel을 구성하는 세포막 단백질로서 여러 개의 transmembrane domain 및 extracellular loop와 cytoplasmic domain으로 구성되어 있다. 상기 HCN2는 HCN2 유전자로 코딩된다. 상기 HCN2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있다.
본 발명자는 우울증 동물 모델 개발을 위해 신경세포에 HCN2를 과발현시킨 생쥐를 제작하였다.
HCN channel은 신경세포에서 수상돌기 (dendrite)에 주로 분포하며, high pass filter 역할을 함으로써 신경세포의 흥분성을 감소시킨다. HCN channel은 filamin A, TRIP8b, S-SCAM, Tamalin, Mint2, c-src 등의 분자와 상호작용을 통해 신경세포에서 발현 및 분포가 조절된다. 포유류의 뇌에는 HCN1과 HCN2가 가장 많이 발현되는 것으로 알려져 있으며, HCN2 결손은 간질을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실은 포유류의 뇌에서 HCN2가 신경세포 흥분성 조절에 가장 크게 기여함을 암시할 수 있다.
상기와 같은 사실을 바탕으로, HCN1과 HCN2 결손에 우울증 유발 자극을 가한 결과 HCN2 결손쥐가 정상쥐와 비교하여 가장 큰 차이를 보이며, 우울증 유발율이 극히 낮은 것을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 HCN2 과발현을 통해 우울증 연구에 가장 적합한 동물 모델을 개발할 수 있을 것으로 판단하였다.
본 발명에서 우울증 모델용 동물 수정란은 HCN2 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “벡터"란 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 HCN2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 재조합 벡터를 이용하여 이를 수정란에 도입함으로써, 형질전환된 수정란을 제조할 수 있게 된다.
바람직하게 본 발명에서 사용되는 프로모터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제조하기 위한 프로모터 서열을 제한 없이 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예로는 SP6 프로모터, T3 프로모터, 또는 T7 프로모터 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 프로모터 서열이 제한되는 것은 아니다. 이러한 프로모터는 필요에 따라 조직 특이적으로 발현시키기 위하여 특정 프로모터를 사용할 수 있다.
HCN2 유전자가 과발현 되었는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 Flag tag을 사용하여 HCN2의 발현 유무 및 발현량을 확인하였다. 상기 Flag tag는 DYKDDDDK의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 포유류의 신경세포에 특이적으로 HCN2를 과발현 시키기 위해 CaMKIIα (calcium-calmodulin dependent protein Kinase II alpha) promoter 기반의 벡터를 디자인하였다. CaMKIIα는 신경세포에서 특이적으로 발현되며, 특히 뇌에서 해마 및 피질, striatum 에 가장 강하게 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한, 과발현된 HCN2의 효율적 분석을 위해 HCN2의 extracelluar domain에 FLAG tagging 을 디자인 하였으며, 이를 통해 immuno-blotting 및 immunohistochemistry를 통한 발현 분석이 가능하게 되었다.
바람직하게, 상기 벡터는 하기의 벡터맵으로 이루어진 것일 수 있다.
더욱 바람직하게 상기 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 사용되는 수정란에 대하여 당업계에서 형질전환을 위해 사용되는 수정란을 제한 없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 상기 수정란은 마우스의 수정란 일 수 있다. 수정란은 4 내지 7주령의 암컷 마우스에 PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) 및 hCG (human Choirinic Gonadotropin)를 주사하여 생산될 수 있으며, 바람직하게는 7 IU의 PMSG를 복강 주사하고, 48 시간 경과 후 hCG를 주사하여 과배란을 유도할 수 있다. 이어 수정란 생산을 위해 hCG 복강 주사 후 바로 12주령의 수컷 마우스와 교미시켜 질전 (vaginal plug)이 있는 암컷 마우스의 난관으로부터 수정란 (zygote)을 수득할 수 있다.
상기 HCN2 유전자를 포함하는 벡터를 수정란으로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 유전자를 수정란으로 도입하는 방법의 예는, 1) 수정 직후 전핵 단계에 있는 접합체의 웅성전핵 내에 미세조작 기술로 유전자를 주입하는 미세주입법 (Microinjection technique), 2) 배아 간세포 (embrynic stem cells)에 유전자를 삽입하고 이를 배반포기의 수정란 내에 이식하는 방법 (Stem cell insertion technique), 3) 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터를 이용하여 유전자를 수정란 내에 주입하는 방법 (retrovirus insertion technique), 및 4) 수컷의 정소 내에 유전자를 주입하여 정자에 삽입시키고, 이를 난자와 수정시키는 방법 (sperm-mediated gene transfer technique) 등이 있으나, 상기 예에 의해 벡터를 수정란에 도입하는 방법이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 미세조작에 의해 유전자를 도입하는 미세주입법을 이용하여 HCN2 유전자가 형질전환된 마우스 수정란을 제조하였다.
본 발명의 상기 동물 수정란은 바람직하게는 수탁번호 KCTC 18318P의 수정란 일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 제조하고, 상기 방법을 통하여 제조된 우울증 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명에서의 "형질전환 동물"이란 외부에서 도입된 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 의미하며, 동물의 종류는 자연계의 포유류라면 제한 없이 생산 가능하다.
본 발명에서 동물은 개과 동물, 멧돼지과 동물, 소과 동물, 말과 동물, 고양이과 동물, 영장류 또는 설치류일 수 있으며, 바람직하게는 설치류일 수 있고, 더욱 바람직하게는 마우스일 수 있다. 또한, 상기 동물은 스트레스에 민감할 수 있다.
상기와 같이 제조된 형질전환된 동물은 신경세포에서 HCN2가 특이적으로 발현할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 HCN2 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 상기 제조된 벡터를 수정란의 핵에 도입하는 단계; 및 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계를 포함하는, HCN2를 과발현하는 형질전환 동물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 벡터는 HCN2 유전자를 수득하고 상기 유전자를 증폭시킨 후, 벡터에 삽입함으로써 제조될 수 있다. HCN2 유전자는 HCN2 mRNA 추출물을 이용하여 역전사 (reverse transcription) 방법으로 하여 제조하거나, cDNA 라이브러리로부터 클로닝하여 수득할 수 있다.
또한 상기 벡터의 수정란에의 도입방법은 상기 서술한 바와 같이, 미세주입법, 줄기세포 삽입 방법 (stem cell insertion technique), 레트로바이러스를 이용한 삽입 방법 (Retroviral insertion technique), 또는 정자-매개 유전자 전달 방법 (sperm-mediated gene transfer technique)등의 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 분리된 유전자를 웅성전핵에 직접 주입하는 미세주입법에 의해 형질전환된 마우스 수정란을 제조하였다. 또한 상기 수정란은 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures)에 2014년 08월 12일자로 기탁하였다 (KCTC 18318P). 마지막 단계로서, 상기와 같이 형질전환된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 형질전환 동물 모델은 우울증과 관련된 약물을 연구하는 질환 모델로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상은 우울증 치료제의 스크리닝 방법 또는 항우울증제의 효능을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 동물 모델에 피검 물질을 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 우울증 모델용 마우스의 행동을 측정 및 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 우울증 모델 마우스는 스트레스에 민감하므로, 마우스에 스트레스를 주어 우울증을 유발하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 스트레스는 제한이 없으며, 예를 들면, 사회적 격리, 물리적 스트레스 (Restraint stress), 불예측성 스트레스 (unpredictable stress)
상기 마우스의 행동을 측정 및 분석하는 단계는 Forced swim test, Tail-suspension test, Open-field test, Anhedonia test 등일 수 있다.
상기 Forced swim test는 하기의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
지름 15 cm 높이 30 cm 의 투명한 원기둥 (transparent cylinder)에 26 ℃ 정도의 물을 20 cm 가량 채운 후 마우스를 원기둥에 넣는다. 10분간 마우스의 움직임을 video로 기록을 한다. 기록한 Video 파일 이용하여 마우스의 immobility time와 mobility time을 분석한다. immobility는 jumping, swimming, rearing, sniffing등의 행동이 없이 마우스가 물위에 떠서 움직이지 않는 상태로 마우스의 despair-like behavior를 나타낸다. 매 분당 immobility time을 분석하며, 전체 10분 동안 누적 immobility time를 함께 분석한다. 또한 누적 immobility time 뿐만 아니라 최초의 immobility behavior를 보이는 데까지 걸리는 시간(latency)도 마우스의 despair-like behavior의 척도가 될 수 있기 때문에 이에 대한 분석도 진행한다. 경우에 따라서는 마우스가 처음 물에 들어갔을 때 몇 분 안에 물에 적응하지 못하여 수면에서 균형을 잡기 위해 계속 움직이는 경우도 있기 때문에 24 시간 후 동일한 원기둥에 같은 온도의 물을 채운 후 마우스를 다시 넣어서 마우스의 움직임을 비디오 리코딩 및 분석을 통해 우울증 행동을 분석하는 것도 가능하다.
상기 Tail-suspension test는 하기의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
높이 60 cm 정도 되는 stand 에 실 또는 낚싯줄을 묶은 다음 마우스의 꼬리 끝부분 1 cm 정도 되는 지점에 연결을 하여 마우스가 바닥에 5 cm정도 높이에 거꾸로 매달 릴 수 있도록 한다. 6~10분간 마우스의 행동을 비디오 기록을 하며, 이후 기록된 비디오 파일을 이용하여 immobility time 및 지연시간 (latency)을 분석한다. Tail-suspension test의 경우 마우스의 체중이 변수가 될 수 있기 때문에 정상군과 실험군 마우스의 체중을 반드시 기록한다.
상기 Open-field test는 하기의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
특정 위치에서 나는 냄새나 빛으로 인해 마우스가 특정 위치를 선호 하거나 회피할 수 있기 때문에 박스 전체에 조명이 일정하도록 하며, 마우스를 넣기 전에 70% 에탄올로 소독 및 냄새를 제거한다. 가로, 세로, 및 높이 45 cm 의 빈 아크릴 상자에 마우스를 넣고 1시간 동안 비디오 기록을 통해 마우스의 움직임을 기록한다. 이후 기록한 video tracking software를 이용한 비디오 파일 분석을 통해 매 5~10분 단위로 마우스가 움직인 거리를 분석한다. 특히 초기 5분 동안 마우스가 벽에서 가까운 곳에서 보낸 시간과 상자의 중심 부분으로 벽에서 먼 위치에서 보낸 시간을 비교 분석을 통해 degree of thigmotaxis를 측정하며, 이는 마우스의 anxiety level과 비례한다.
상기 Anhedonia test는 하기의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
화학물질이나 chronic stress, unpredictable stress를 이용하여 우울증 모델 마우스를 개발하는 경우 우울증 유발인자에 대한 초기 적응과 이후 우울증 전이 단계가 있으며 우울증 발병에는 약 3주 이상의 시간이 필요하다. 이 경우 행동학적 변화는 우울증 전이 단계 이후에 나타나지만 동물의 체중과 같은 생리학적 변화는 초기 단계에서부터 나타난다. 특히 체중의 감소의 먹이의 섭취 감소에 기인하며, 이는 동물에서 즐거움을 추구하는 특성의 저하(anhedonia)를 의미한다. 즐거움을 추구하는 특성의 감소는 우울증에서 나타나는 주된 증상의 하나 이다. 따라서 마우스의 체중을 매일 측정하며, 우울증 유발 인자에 의한 체중 감소 및 체중 증가 억제를 분석한다.
본 발명에 따라 신규하게 성립한 우울증 동물모델은 효과적인 우울증 치료제 개발을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1는 Flag-tagged HCN2 발현 벡터이다.
도 2는 Flag-tagged HCN2의 발현을 확인한 도이다.
도 3은 FACS staining을 통한 HCN2의 세포내 발현을 분석한 도이다.
도 4는 FACS staining을 이용한 HCN2-Flag의 세포막 발현을 확인한 도이다.
도 5는 신경세포 특이적 HCN2 발현 벡터 모식도와 제한효소 처리 결과를 확인한 도이다.
도 6은 신경세포 특이적 HCN2 발현을 확인한 도이다.
도 7은 PCR genotyping을 통한 HCN2 형질전환 founder 마우스 선별한 도이다.
도 8은 Founder에서의 germline transmission 확인 및 이식유전자 삽입 정도를 확인한 도이다.
도 9는 PCR genotyping을 이용한 마우스 유전자형 분석 및 계통 확립 결과이다.
도 10은 전뇌와 해마에서 HCN2의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 11은 HCN2 형질 전환 마우스의 발달 및 생화학적 특성을 확인한 도이다.
도 12는 Open field test를 통한 마우스의 활동을 분석한 도이다.
도 13은 Elevated plus maze를 이용한 불안행동을 분석한 도이다.
도 14는 Marble burying test와 grooming test를 통한 반복행동을 분석한 도이다.
도 15는 Acoustic startle response 분석을 통한 신경학적 기능 이상 및 정신분열 행동을 분석한 도이다.
도 16은 Forced swim test를 이용한 제작동물의 우울증 행동을 분석한 도이다.
도 17은 Tail suspension test를 이용한 제작 동물의 우울증 행동을 분석한 도이다.
도 18은 사회적 격리 스트레스에 의한 형질전환마우스의 특이적 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 19는 Restraint stress에 의한 형질전환마우스의 특이적 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 20은 Fluoxetine에 의한 형질전환동물의 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 21 정상마우스와 형질전환마우스의 공간학습(좌) 및 운동협응과 학습(우)을 나타낸 도이다.
도 2는 Flag-tagged HCN2의 발현을 확인한 도이다.
도 3은 FACS staining을 통한 HCN2의 세포내 발현을 분석한 도이다.
도 4는 FACS staining을 이용한 HCN2-Flag의 세포막 발현을 확인한 도이다.
도 5는 신경세포 특이적 HCN2 발현 벡터 모식도와 제한효소 처리 결과를 확인한 도이다.
도 6은 신경세포 특이적 HCN2 발현을 확인한 도이다.
도 7은 PCR genotyping을 통한 HCN2 형질전환 founder 마우스 선별한 도이다.
도 8은 Founder에서의 germline transmission 확인 및 이식유전자 삽입 정도를 확인한 도이다.
도 9는 PCR genotyping을 이용한 마우스 유전자형 분석 및 계통 확립 결과이다.
도 10은 전뇌와 해마에서 HCN2의 발현 수준을 확인한 도이다.
도 11은 HCN2 형질 전환 마우스의 발달 및 생화학적 특성을 확인한 도이다.
도 12는 Open field test를 통한 마우스의 활동을 분석한 도이다.
도 13은 Elevated plus maze를 이용한 불안행동을 분석한 도이다.
도 14는 Marble burying test와 grooming test를 통한 반복행동을 분석한 도이다.
도 15는 Acoustic startle response 분석을 통한 신경학적 기능 이상 및 정신분열 행동을 분석한 도이다.
도 16은 Forced swim test를 이용한 제작동물의 우울증 행동을 분석한 도이다.
도 17은 Tail suspension test를 이용한 제작 동물의 우울증 행동을 분석한 도이다.
도 18은 사회적 격리 스트레스에 의한 형질전환마우스의 특이적 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 19는 Restraint stress에 의한 형질전환마우스의 특이적 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 20은 Fluoxetine에 의한 형질전환동물의 우울증 행동 변화를 분석한 도이다.
도 21 정상마우스와 형질전환마우스의 공간학습(좌) 및 운동협응과 학습(우)을 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 - HCN2 cloning 및 발현 벡터 제작
HCN2는 ion channel인 hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated cation channel을 구성하는 세포막 단백질로 여러 개의 transmembrane domain 및 extracellular loop와 cytoplasmic domain으로 구성되어 있다 (도 1).
HCN2의 발현 및 membrane expression을 확인하기 위해 HCN2의 S3-S4 사이의 extracellular loop 에 Flag tag (DYKDDDDK)을 삽입하였다. 또한 배양 세포에서 발현 테스트를 위해 클로닝 된 HCN2를 actin promoter가 들어있는 벡터에 삽입하였다 (도 1).
실시예 2 - Flag-tagged HCN2 벡터의 발현 및 분자량 확인
상기 실시예 1에서 제작한 발현 벡터를 HEK293 cell에 transfection 한 후 lysate를 immunoblotting을 통해 Flag가 tagging 된 HCN2 의 발현을 확인하였다. HCN2 의 분자량은 약 120 Kda 정도로 알려져 있다. Anti-Flag 항체를 이용한 immunoblotting (도 2A)과 anti-HCN2 항체를 이용하여 immunoblotting (도 2B) 했을 때 제작 벡터를 transfection 한 HEK 293 cell lysate에서 특이적으로 immuno-reactive signal 이 확인 되었으며, 분자량은 이전 보고에서 알려진 HCN2의 분자량과 유사하였다. 이를 통해 제작 벡터에 의해 HCN2가 정상적으로 발현됨을 확인하였다.
실시예3 - Flag-tagged HCN2 벡터의 세포막 발현 확인
Calcium phosphate를 이용하여 HEK293 cell 에 제작 벡터를 transfection 하였다. anti-Flag-antibody (mouse) 와 anti-mouse IgG-PE antibody를 이용하여 staining을 한 후 FACS analysis를 통해 제작한 벡터를 transfection한 세포에서 signal이 관찰되었다 (도 3). 세포막 표면 염색을 통해 HCN2의 세포막 발현 및 Flag tag이 extracellular loop에 발현됨을 확인하였다 (도 4).
실시예 4 - 신경세포 특이적 HCN2 발현 벡터 제작
신경세포에 특이적으로 HCN2를 과발현하는 형질전환 마우스를 생산하기 위해 alpha-CaMKII 유전자의 promoter를 이용하여 HCN2 발현 벡터를 제작하였다 (도 5, 좌).
alpha-CaMKII는 중추 신경에서 흥분성 신경세포에 특이적으로 발현 하는 것으로 알려져 있으며, 억제성 신경세포나 교세포에는 거의 발현이 되지 않는 것으로 알려져 있다. NotI, KpnI, SfiI 등의 enzyme digestion을 통해 제작 벡터의 이상 유무를 확인하였다 (도 5, 우)
제작 벡터의 전체 크기는 16.3 kb이며, 이후 sfiI 제한효소 처리를 통해 13.3 kb의 DNA fragment를 수정란에 이식하여 형질전환 동물을 생산하였다.
실시예 5 - 제작벡터의 신경세포 특이적 발현 확인
E18 rat의 해마를 Trypsin 처리를 통해 개별 신경세포로 분리한 후 7일 동안 in-vitro 배양을 하였다. 배양한 neuron 에 calcium phosphate를 이용하여 제작 벡터(6 mg)와 EGFP 벡터(2 mg)를 transfection 하였다. immunocytochemistry를 통해 EGFP 항체 (녹색)와 HCN2 항체 (빨간색)를 각각 FITC 와 Cy3 이차항체를 이용하여 labelling 한 후 confocal microscope를 통하여 관찰하였다.
contorl vector가 transfection 된 신경세포에서는 약한 HCN2 신호가 관찰된 반면 제작 벡터가 transfection 된 신경세포에서는 강한 HCN2 신호가 관찰되었다. 그러나 두 그룹에서 GFP 신호에는 차이가 없었다. 이를 통해 제작 벡터는 신경세포에서 HCN2를 특이적으로 발현함을 확인하였다 (도 6).
실시예 6 - 수정란 미세 주입 및 형질전환 founder 마우스 선별
수정란 미세 주입을 위해 제작 벡터를 SfiI 처리 및 gel extraction을 하여 DNA를 회수하였다. 회수 된 DNA를 수정란에 미세 주입을 통해 이식하였다. 태어난 산자에서 PCR genotyping을 통해 이식된 유전자가 genome 에 삽입된 개체를 3 두 확보하였다 (도 7).
실시예 7 - 수정란 미세 주입 및 형질전환 founder 마우스 선별
확보된 3두의 founder 마우스를 각각 wild-type mice 와 mating 하였고 이를 통해 태어난 산자의 tail에서 추출한 DNA를 PCR을 통해 증폭하였다 (도 8A). qPCR을 통해 산자의 genomic DNA에서 이식한 HCN2 의 integration 정도를 확인하였다 (도 8B). founder 3두 모두 이식된 유전자가 germline transmission이 됨을 확인하였다.
실시예 8 - HCN2 과발현 마우스 계통 확립 및 대량 생산
각 founder line 마다 wild-type C57B/6J (B6) 마우스와 3 generation 이상 backcross를 진행하였다. transgene의 segregation pattern 분석을 통해 단일 locus에 transgene이 insertion이 된 것으로 추정되는 마우스를 이용하여 계통을 확립하였다 (도 9). 이를 통해 3종류의 형질전환 마우스 라인을 확립할 수 있었다.
실시예 9 - 계통 별 HCN2 유전자의 발현 수준 확인
HCN2 항체를 이용한 Immunoblotting을 통해 wild-type 및 transgenic mice의 전뇌 (forebrain)와 해마(hippocampus)에서 HCN2의 발현 수준을 조사하였다. 생후 6주에서 분석한 결과 모든 라인에서 정상쥐에 비해 HCN2의 발현이 높게 나타 났으며, 특히 founder 1에서 유래한 마우스에서 이식한 유전자의 발현이 가장 높음을 확인하였다 (도 10).
실시예 10 - 제작 동물의 발달 및 생화학적 특성 분석
제작 동물의 발달 및 기초 건강 상태 분석ㅇ르 위해 생후 8주인 male mice에서 control과 HCN2 transgenic mice의 체중을 측정하였다. 정상쥐에 비해 transgenic 마우스의 체중이 감소한 경향을 보이나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다 (도 11A). 이를 통해 HCN2의 과발현은 마우스의 성장에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다. 또한 각 마우스들의 body appearance를 분석하였으나 특이점은 발견하지 못하였다.
제작 마우스의 혈청학적 분석을 위해 말초 혈액 내 백혈구 세포를 anti-CD4, anti-CD8, anti-Gr-1, anti-CD11b 항체로 염색한 후, 유세포 측정으로 확인 분석하였다. CD4 T세포, CD8 T 세포의 말초 혈액내 분획은 정상 마우스의 것과 차이가 없으나, Gr-1+ neutrophil, CD11b + macrophage, Gr-1+ CD11b + immature myeloid 세포의 분획이 정상 마우스의 것보다 높은 것을 확인하였다 (도 11B).
염증 반응에 의한 가능성을 확인하기 위해 외상 및 감염 유무를 조사하였으나 음성으로 확인되었다.
따라서 이에 대한 변화는 유전자 이식에 의한 형질전환 동물의 생화학적 특성으로 판단되었다. 혈액 내 세포 분획과 달리 비장이나 흉선의 분획에서는 정상마우스와 차이가 없었다.
실시예 11 - HCN2 형질전환 마우스의 활동도 분석
open field test를 통해 마우스의 explorative behavior와 general anxiety level에 대해 분석을 진행하였다. HCN2 과발현 마우스는 정상쥐에 비해 활동도가 낮은 양상을 보였다 (도 12A). 이러한 특징은 open filed box에서 시간이 증가할수록 더 뚜렷해짐을 확인하였다 (도 12B). 이에 대한 원인으로 불안 수준의 증가 여부를 확인하기 위해 open field box에서 thigmotaxis level을 측정하였다 (도 12C-E). 이상을 통해 HCN2 과발현 마우스는 anxiety level에는 차이가 없고, 활동도만 감소해있음을 확인하였다.
실시예 12 - 형질전환 마우스의 불안행동 분석
open field test에서 확인된 형질전환 마우스의 활동도 감소가 일반적인 불안 수준의 증가와 관련이 있는지에 대해 심층 분석을 위해 elevated plus maze test를 통해 정상 마우스와 형질전환 마우스의 불안 수준을 분석하였다 (도 13A). elevated plus maze의 closed arm과 open arm, 그리고 center zone에서 동물들이 보낸 시간을 측정하였을 때 두 그룹간에 차이가 없었다 (도 13B). 또한 각 구간을 이동한 빈도를 분석하였을 때에도 형질전환 마우스는 정상쥐와 비슷한 수준의 이동 빈도를 보였다 (도 13C).
이를 통해 형질전환 마우스의 불안 수준은 정상쥐와 비슷한 수준이며, 활동도의 감소는 불안에 의한 것이 아니라는 결론을 도출할 수 있었다.
실시예 13 - 형질전환 마우스의 반복행동 분석
open field test에서 확인된 형질전환 마우스의 활동도 감소가 반복행동에 의한 움직임 감소에 의한 것인가에 대한 분석을 위해 marble burying test와 grooming test를 통해 반복행동의 정도를 분석하였다. 각 test 마다 10분 동안 video recording을 통해 마우스의 움직임을 분석하였다.
Marble burying test (도 14A)와 grooming test (도 14B) 모두에서 HCN2 과발현 마우스는 정상쥐와 유사한 수준의 반복 행동을 보였다. 이를 통해 반복행동에 의한 활동도 감소의 가능성을 배제 할 수 있었다.
실시예 14 - 형질전환 마우스의 신경학적 이상 및 정신분열행동 분석
acoustic startle response 분석은 마우스에서 신경학적 기능 이상 검사에 많이 이용되고 있다. 75 db에서 120 db까지의 acoustic signal에 대한 반응을 측정함으로써 실험동물의 sensory motor gating ability에 대한 분석이 가능하다.
Acoustic signal에 대한 마우스의 최대 반응(Vmax)의 강도를 비교 했을 때 정상마우스와 형질전환 마우스 사이에 큰 차이가 없었다 (도 15A). 또한 acoustic signal이후 최대 startle response가 나오기까지 걸린 시간을 분석했을 때에도 두 그룹간에 차이가 없었다. 이를 통해 제작한 형질전환 마우스의 sensory motor gating ability에는 큰 이상이 없음을 알 수 있었다.
acoustic startle response를 이용한 마우스의 정신분열행동 분석을 위해 acoustic prepulse에 의해 startle response가 감소되는 정도는 분석하였다. startle response는 120 db의 acoustic signal에 대한 반응을 측정하였으며, prespulse는 75 db과 80 db의 acoustic signal을 이용하였다. 정상마우스와 형질전환 마우스 모두 75 db과 80 db의 prepulse에 의해 stargle response가 감소함을 확인하였다 (도 15C). startle response가 감소하는 비율이 정상마우스에 비해 형질전환마우스에서 다소 감소하는 경향을 확인 할 수 있었으나, 통계적으로 유의한 수준은 아니었다 (도 15D). 이를 통해 제작된 형질전환 마우스는 정신분열병에서 관찰되는 신경학적 이상을 가지고 있지 않음을 알 수 있었다.
실시예 15 - 형질전환 마우스의 우울행동 분석
개발된 동물이 우울증 치료제 개발 및 연구를 위한 동물 모델로서 활용 가능성을 타진하기 위해 제작 동물의 우울증 행동을 분석하였다. 기초 건강 상태 및 발달 분석에서 제작한 마우스에 큰 문제가 없었기 때문에 despair/immobility behavior analysis를 통해 마우스의 우울행동을 분석하였다.
forced swim test를 통해 정상마우스와 형질전환마우스의 immobility를 분석한 결과 일부 구간에서 형질전환마우스의 immobility가 증가했으나 (도 16B) 전체적으로 유의한 차이가 없었다 (도 16A-C). 이와 더불어 처음 immobility를 보이기까지 latency를 분석하였을 때에도 두 그룹 간에 큰 차이가 없었다 (도 16D)
제작 동물의 우울증 행동에 대한 심층 분석을 위해 tail-suspension test를 진행하였다. 생후 9주된 male 마우스(도 17A, B)와 생후 6주된 male 마우스(도 17C, D)중 정상마우스와 형질전환마우스를 각 그룹 당 8~10마리를 분석에 사용하였다. Tail-suspension test를 통해 정상마우스와 형질전환마우스의 immobility를 분석한 결과 각각 다른 연령대의 두 그룹 모두 전체적으로 유의한 차이가 없었다 (도 16A-C).
실시예 16 - 형질전환 마우스의 우울증 발병 조건 및 시기 최적화
제작 동물이 자연적인 상태에서 우울증 행동을 보이지 않았기 때문에(도 16, 도 17) 우울증 발병 조건 및 시기에 대한 분석을 진행하였다. 특히 약한 스트레스에 의해 우울증이 형질전환 마우스에서 선택적으로 발병되는지에 대해 실험을 진행하였다.
3~4주 정도의 기간 동안 개별 케이지 사육을 통한 사회적 격리는 실험동물에 약한 스트레스를 주는 것으로 알려져 있으며, 이러한 스트레스는 정상쥐에는 우울증을 유발하지 않는 것으로 알려져 있다. 12주 이상의 장기간 격리 사육은 정상쥐에도 우울증 행동을 유발할 수 있음이 알려져 있다.
생후 8주된 정상마우스와 형질전환마우스를 각각 4주 동안 개별 사육을 통해 사회적 격리 스트레스를 가한 후 12주에서 tail-suspension test를 통해 우울증 행동을 분석하였다.
정상마우스와 형질전환마우스의 immobility를 분석한 결과 형질전환마우스에서 immbility가 특이적으로 증가함을 확인 하였으며 (도 18A, 도 18B, 도 18D), 이와 함께 최초 immobility에 이르는 latency도 감소함을 확인하였다 (도 18C). 이러한 결과는 형질전환 마우스가 스트레스에 더 취약하여 정상마우스에서는 우울증 행동을 유발하지 않는 약한 스트레스에도 우울증이 유도됨을 암시한다.
3주간의 격리 사육으로 약한 스트레스를 가했을 때에는 정상쥐에 비해 immobility가 다소 증가하였으나, 통계적으로 유의한 수준은 아니었다.
이를 통해 형질전환마우스에 선택적으로 우울증을 유도하기 위해서는 4주 정도의 사회적 격리가 필요함을 확인하였다.
약한 스트레스인 사회적 격리 스트레스에 의해 형질전환마우스에서 우울증이 선택 적으로 유도되었기 때문에 또 다른 스트레스인 restraint stress에 의해 형질전환마우스에서 우울증이 증가하는지에 대해 분석을 진행하였다.
생후 4주된 마우스에서 매일 2시간씩 3주 동안 restraint stress를 가한 후 tail-suspension test를 했을 때 정상쥐에 비해 형질전환마우스에서 우울증 행동이 증가함을 확인하였다 (도 19). 이를 통해 비교적 주령이 어린 상태에서도 외부 스트레스에 의해 형질전환마우스에서 선택적으로 우울증 행동이 증가함을 알 수 있었다.
이상의 결과(도 18, 도 19)들을 통해 제작한 형질전환 마우스는 정상쥐보다 스트레스에 더 취약하며, 정상쥐에 행동변화를 유발하지 않는 약한 스트레스에 더 민감하게 반응하여 우울증 행동이 유도됨을 알 수 있다.
따라서 본 연구에서 제작한 형질전환마우스를 우울증 동물 모델로 사용하기 위해서는 약한 스트레스를 이용한 우울증 유도가 필요하며, 사회적 격리나 restraint 등의 스트레스가 우울증 유도 방법으로 사용 가능함을 확인하였다. 또한 주령에 상관없이 유도가 가능한 점으로 미루어 우울증 유도를 위한 마우스 주령 및 시기는 크게 중요하지 않은 것으로 판단하였다.
실시예 17 - 형질전환 마우스를 이용한 우울증 치료제 효능 평가
사회적 격리 및 반복적인 restraint 스트레스에 의해 우울증이 유발된 형질전환동물에 항우울제인 fluoxetine (30 mg/kg)처리를 통해 우울증 치료제에 의한 동물 행동 변화를 분석하였다. 사회적 격리에 의해 우울증이 유발된 실험동물(도 18)을 이용하여 tail-suspension test를 통해 despair/immobility behavior를 분석하였을 때 fluoxetine에 의해 immobility가 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다 (도 20A, 도 20B).
또한 restraint stress에 의해 우울증이 유발된 실험동물(도 19)을 이용하여 tail-suspension test를 통해 despair/immobility behavior를 분석하였을 때 fluoxetine에 의해 immobility가 정상 수준으로 회복됨을 확인하였다 (도 20C, 도 20D).
이를 통해 사회적 격리 및 restraint stress에 의한 형질전환동물의 특이적 행동 변화 는 동물의 우울증 행동을 나타냄을 확인할 수 있었다.
또한 약한 스트레스에 의해 우울증이 유도된 형질전환마우스는 항우울제 평가를 위한 모델로 사용 가능함을 암시하였다.
이와 더불어 본 연구에서 사용된 농도의 fluoxetine과 비교 분석을 통해 신물질의 항우울 기능 검증 및 용량 결정(dosage)이 가능할 것으로 판단되었다.
실시예 21 - 다양한 우울증 유도 방법에 의해 개발된 동물 모델의 특성 비교
chemical injection, restraint, 및 chronic unpredictable stress를 동물에 장기적으로 가했을 때, 세 가지 방법 모두 마우스에 체중 감소 및 우울증 유사 행동을 유발함을 확인하였다. 그러나 상기한 세 가지 방법 모두 동물의 활동도나 불안 수준에는 영향을 주지 않았다. 사람에서 우울증에 불안 증세가 흔히 동반됨을 감안하면, 이러한 결과는 마우스에서 우울증과 불안이 분리 될 수 있음을 암시한다. 또한 물리적 및 화학적 스트레스는 마우스에 우울증 유사행동을 선택적으로 유도함을 암시한다. 사회적 격리(social isolation)나 사회적 패배(social defeat) 등의 사회적 스트레스가 마우스에 불안 수준을 증가시킴을 감안하면, 불안 수준의 변화에는 사회적 요인이 필요함을 암시한다.
<110> KOREA FOOD & DRUG ADMINISTRATION
<120> Depression animal model using HCN2 transformation and use thereof
<130> 1-7p
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2592
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium
channel 2
<400> 1
atggatgcgc gcgggggcgg cgggcggccg ggcgatagtc cgggcacgac ccctgcgccg 60
gggccgccgc caccgccgcc gccgcccgcg ccccctcagc ctcagccacc acccgcgcca 120
cccccgaacc ccacgacccc ctcgcacccg gagtcggcgg acgagtccgg cccgcgcgcc 180
cggctctgca gccgcgacag cgcctgcacc cctggcgcgg ccaagggcgg cgcgaatggc 240
gagtgcgggc gcggggagcc gcagtgcagc cccgagggcc ccgcgcgcgg ccccaaggtt 300
tcgttctcat gccgcggggc ggcctccggg ccctcggcgg ccgaggaggc gggcagcgag 360
gaggcgggcc cggcgggtga gccgcgcggc agccaggcta gcttcctgca gcgccaattc 420
ggggcgcttc tgcagcccgg cgtcaacaag ttctccctgc ggatgttcgg cagccagaag 480
gccgtggagc gcgagcagga acgcgtgaag tcggcggggg cctggatcat ccacccctac 540
agcgacttca ggttctactg ggacttcacc atgctgttgt tcatggtggg aaatctcatt 600
atcattcccg tgggcatcac tttcttcaag gacgagacca ccgcgccctg gatcgtcttc 660
aacgtggtct cggacacttt cttcctcatg gacttggtgt tgaacttccg caccggcatt 720
gttattgagg acaacacgga gatcatcctg gaccccgaga agataaagaa gaagtacttg 780
cgtacgtggt tcgtggtgga cttcgtgtca tccatcccgg tggactacat cttcctcata 840
gtggagaagg gaatcgactc cgaggtctac aagacagcgc gtgctctgcg catcgtgcgc 900
ttcaccaaga tcctcagtct gctgcggctg ctgcggctat cacggctcat ccgatatatc 960
caccagtggg aagagatttt ccacatgacc tacgacctgg caagtgcagt gatgcgcatc 1020
tgtaacctga tcagcatgat gctactgctc tgccactggg acggttgcct gcagttcctg 1080
gtgcccatgc tgcaagactt ccccagcgac tgctgggtgt ccatcaacaa catggtgaac 1140
cactcgtgga gcgagctcta ctcgttcgcg ctcttcaagg ccatgagcca catgctgtgc 1200
atcggctacg ggcggcaggc gcccgagagc atgacagaca tctggctgac catgctcagc 1260
atgatcgtag gcgccacctg ctatgccatg ttcattgggc acgccactgc gctcatccag 1320
tccctggatt cgtcacggcg ccaataccag gagaagtaca agcaagtaga gcaatacatg 1380
tccttccaca aactgcccgc tgacttccgc cagaagatcc acgattacta tgaacaccgg 1440
taccaaggga agatgtttga tgaggacagc atccttgggg aactcaacgg gccactgcgt 1500
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ggagattaca tcatccgaga ggggaccatc gggaagaaga tgtacttcat ccagcatggg 1680
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tccatcttgc tgcacaaggt tcagcatgat ctcagctcag gtgtgttcaa caaccaggag 1980
aatgccatca tccaggagat tgtcaaatat gaccgtgaga tggtgcagca ggcagagctt 2040
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accctacagc aggctgtggc catgagcttc tgcccgcagg tggcccgccc gctcgtgggg 2160
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<211> 12822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vector sequences
<400> 2
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caggctgatg tcccaccgga tctgatggct tagggtggca gggaatctca gttcccctca 120
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tgtgtaggcg aaggccctgc tgtgaatttt gaaaatagtt atttttgtca ctggcaaagg 1440
aggccctgtt aggactcgtc agcttgtgga tgagcgggat gggtggagtg gggtgggtgc 1500
ggtgccgccg tggggggtta ccgctgcttg cagggctgca tcgcccaggc agtgactgaa 1560
tcctgcatga gggcctggcc taggctgtgg ggaggagatg accactgcgt cctagatctt 1620
tccttagccc tgtgcttcct ttcttccttt tttccttaag atttatttct aatgatgcgt 1680
aggttgtgta tttgtgtgtg ggtatgtgca cttgaataaa ggacccacag aggctataga 1740
catcagatcc tcctagagct ggggttacag agggcgtgag ttgtccaaca tgggcaccgg 1800
aaaataaact tatgtgctct acacgaccga gctgtctctc caacaccagc ccccttcttt 1860
tgacttttct catctccctc acttgtatgt tttcccttcc tcgataatgc tgatacccag 1920
atggtaggca cggcccagga taggcagggg tctctgcgct ccagtggctg tagtggtttt 1980
cctgcctgct ctgaagaaga cactggctaa ggtggtgtct tagcctactg tatcctagag 2040
gtgggttatt catagtctgc ccactgccca acacactcta ggcctgctgg ggcctactct 2100
aactctgctt gctggcttgc caccctggca cacagtgtag gcttccctgt agagccaggc 2160
tttagaaaac tgtatgagta cttctctgag aactgctgga ggggccctgc ctgccaggac 2220
ttttcaactt ccagccctgt catctatatc acttctgagg accccgtgtg ggggtcacga 2280
gaacaagacc atatgtagtg ctttctgttc tcccttgggt cccaggctct gaatcaatct 2340
ggtcccaaga tataagggat gattggtgct gaggctggtg tctgtttctg aagttttgaa 2400
gacaagggtt ggctcaagcc tccctgtgtt cagtcctcca ctcaatgcag aactcagtga 2460
actcagaatt ctcagcccag atgccagcat agcccagcat agcccagcat agcccaggag 2520
ctactggagc atcagtttga aaccaggtcc gcaggaacta gtgggcaaca gtgtgtgagg 2580
ccagtggtct ttggggtatt gtattgaatt gagaggtcct gcttagcagt cagcatgccc 2640
acaacctgtt ctctacggtg gtccggattc ccctcagcaa gcacacctga atctttacta 2700
catcccagtt cctggttggc tcctgacttc gggttactat ggctgtgatg aaacactacg 2760
actaaaagca atgtggggaa gaaagttaat ttttttactc gaccttccat agacagggtt 2820
catcactaaa agcagagggc agaggaaaag atagctcagc ggttaagagt gctgtctact 2880
caacaaagag gtcttgagtt caattcccag caaccacatg gtggctcaca actgtctatc 2940
ctgggatctg atgccctttt ctggcataca ggtatacata cagatagagg actcatatac 3000
ataaaataaa taaataaatc tttaaaagca acaagggcag aaattcaagc agggcaggga 3060
cccagaggcc aaagctgacg cagaggccat ggaggggtgt tgcttactgg cttgctcctc 3120
atggcttgct cagcctgttt tcttatagaa cccacaacca ccaggccaga gatgggacca 3180
cccacaaagg gcagagcctt tccctatcaa tcactaatgg gaaaacatcc tgcagtcgga 3240
tcttatgaag acattttctc agctgagctt ccctcctatc agataactct agcttgtgtc 3300
aaggtgactt aaaactagcc agcacagcac cttatgctca catcacctgg gtccctttgg 3360
agaggacata gttaaaggga gcccagaggc agtccctagg ccacaggtct tcattgcccc 3420
tctctgggac ggattagaca ggctgcagac ctgttagctg gaagagttag attcaggcaa 3480
gagcttgaat ctttacctga tcctggctat ggagtcctgg cctctaatga tcagctccct 3540
aacaacccaa tggagccata tacctgcctg ggccatggct gtgtctcctc ttctttcaga 3600
cactcctggc ttgcctagga cacaggctag catcctgtca atgccaggaa ggggcacagc 3660
agggaaagag caatgctgtt ggcctgactg ccaccaactg gtgtacctgt tagagggcaa 3720
cctctattct ctgcaccttg gttcctagct ctaagggata tgtggcccct aaaggtcttc 3780
atagcttgat atgggaggca ggggggctaa gaacagcgca agagtggtga gcttgcacag 3840
acccggattt gatctctggg tgagtgagga ggaaatgaga tgggggtggg ggaagcccta 3900
tttctagctg tcttagcata ggaactgaac ctccttctgc agggcctgtg tcactgcccc 3960
tttcccccag ggagggcccc tgcacggggc acctcagggc acagcccttt ttccctccct 4020
cctctcttag acctggaatt actcaacatc ctgccctgac tcagttgctc tcccctcaga 4080
ccctcacagt cttccttctc ttctggccca cttttggctg agcctgcccc caactttttc 4140
tgcccttagt gggacaggcc ccatggggac cattcagatg gcactttttt ccccccctgg 4200
ggtggttttc tgtggtggtg ccctattcag gcaactgcaa gaccctgtgg catttagcat 4260
atgcatgaga gcacatgaag aagctagcta tccctgtgtg ctgaggattg taatcctctc 4320
tcatccttcc cttgtctcct ggaacccagc ccagcctcct gtccctcccg ttgacacgag 4380
ccaatgctgg ctcagcaaac tccagggctc ccacccctgg ccatcagccc ttggcacaca 4440
ggcttgtgct tgagtactgc acacgtgttg cagctggggt acacgtgctg gactgttatg 4500
cctactgtgg ccccgggggt gtgtgggaag tctggcagaa ccaatccctc catcccccga 4560
tgcaatcatc agcttattct ctcacggcca ctcgggcatg cttgactcct tgatgcccgc 4620
cgccactagg cacagctgcc agctttgtgg gcacagagga tgtggcgaat tagtggtcat 4680
gcctcctcag tggaatggca attgcactca gcatgcaggt gtctaccaaa ggcagtccct 4740
acatccccga tgtactctcg agacccatct aaggactaga tctagtctct agaaggtccc 4800
atgcagatgt aagacagccc tccacaggga gattcttcca gctagttctc tattatcaga 4860
tgggtctaag atcctaggac ctgcctatcc cttagccctg cattcagcga gagaaggggt 4920
aaagatgtga ggatgccagg gaggaaggaa aagggcacaa ggaagaaaga aagggaagga 4980
agctggaagc atggaaggac aaagatggtg accacagtag aattaggatc ccatggttcc 5040
tgtcagtggc aggcagctat caggctgtct gtgcctccct gagcccctgg ggcatcttct 5100
aaatgctttg ctggcctctg agccaagcac tgcataccat cccgtgggga gtgacaggcc 5160
agcactggtc aacgaggatg atggctactt ttgttcacag ggtaacatct ccatggttac 5220
agcctttgca cattcctctt agtactttac caatctcaaa gcagttgcca agcccttggg 5280
ccctaataag tgagggtccc agtgccctct ttttaaaatt ccttgccatt tgttttgcag 5340
aatttactgc aaataaagcc aaccccaggc aatgtctaaa ccatgagtta accccccagc 5400
aaggtctcag agaactgtgc cccagagagc tgccaaggtt cagggaggag tatgaggaga 5460
caggatttct agttccttaa taattccttc tgtctcagcc actgtgttca tcttgtttca 5520
gccacaaaac tacctttatt ggtaaggaac attatttacc cagtttcaca cttgaagagg 5580
tccagagacg ttaacacatc gattcaaaag cacagcctgt aagtcacata gccactgtta 5640
gctgatcgac actatttccc ctgggcaatg gctgggtgat tccagggatc cccttgggaa 5700
caggctagag cactggctct caacctgtgc gggtcgtgac ctccttgagg ggtaggggtg 5760
agggcagtgt caaacaaccc ttttacagga gtcgtttaag accgttggaa aaaaaaccag 5820
atatttgcat tatttttcgt aacagaagca agattatagt tatggagtag tgacaaaaat 5880
tatgttacag ttggaggtca gcacagcatg aggaactgta tttaagggtt gcggcattag 5940
gaaggttgag aatcactggc ctagcggatc tgaatcagga acacggacgt acagctctgc 6000
gccactcctg ccttcctctg gtgcctctag ccttgcccat ggtgttctgg gcctgcctgc 6060
tacccaccag ctgtgcggcc ctgtgagcac aggcctttct gctccgctct gaattgccac 6120
gttggcggca gaagcgggaa gcgtattgtg cacagaaaca aaacggagtg gttttttttt 6180
cctttttctg aaggtggtaa tggtgcaatt agtggcgaag ccatcacccc ctcctccccg 6240
gctcgcctcc ctccttcctc tccacctccc ttctctttct ttcctgagaa aaaaagtggc 6300
tgagttgaaa agatctcccg tcaatctttc tgtaacggac tcaggaagag ggatagaggg 6360
ccccctaatg tttccagggt cctcgagcct cagttgggtc aggcacttgt tggtgctgga 6420
gaatattcaa aggtaccact atgttcccca caagggagtt gagcaatgga ttctgaggag 6480
caagtttgaa acagagaatt tgcgttccca ggtcttgtga tctgcccctt gttcactggg 6540
ggacaaatgc tggcatgaga ccctgagacc tctgctcagc cacctttctc tctctctctc 6600
tctctctttc tctctctctc tctctctctc tctgtcctta atggaggtgt gtgtgtgttc 6660
aagaccaagc tgcagtgttg gagtgcttgt gggctcattt taaaacttcc atgttttgcc 6720
ttctagaaac tgaaacataa gaaccccatt atggccttag gtcacttcat ctccatgggg 6780
ttcttcttct gattttctag aaaatgagat gggggtgcag agagcttcct cagtgacctg 6840
cccagggtca catcagaaat gtcagagcta gaacttgaac tcagattact aatcttaaat 6900
tccatgcctt gggggcatgc aagtacgata tacagaagga gtgaactcat tagggcagat 6960
gaccaatgag tttaggaaag aagagtccag ggcagggtac atctacacca cccgcccagc 7020
cctgggtgag tccagccacg ttcacctcat tatagttgcc tctctccagt cctaccttga 7080
cgggaagcac aagcagaaac tgggacagga gccccaggag accaaatctt catggtccct 7140
ctgggaggat gggtggggag agctgtggca gaggcctcag gaggggccct gctgctcagt 7200
ggtgacagat aggggtgaga aagcagacag agtcattccg tcagcattct gggtctgttt 7260
ggtacttctt ctcacgataa ggtggcggtg tgatatgcac aatggctaaa aagcagggag 7320
agctggaaag aaacaaggac agagacagag gccaagtcaa ccagaccaat tcccagagga 7380
agcaaagaaa ccattacaga gactacaagg gggaagggaa ggagagatga attagcttcc 7440
cctgtaaacc ttagaaccca gctgttgcca gggcaacggg gcaatacctg tctcttcaga 7500
ggagatgaag ttgccagggt aactacatcc tgtctttctc aaggaccatc ccagaatgtg 7560
gcacccacta gccgttacca tagcaactgc ctctttgccc cacttaatcc catcccgtct 7620
gttaaaaggg ccctatagtt ggaggtgggg gaggtaggaa gagcgatgat cacttgtgga 7680
ctaagtttgt tcgcatcccc ttctccaacc ccctcagtac atcaccctgg gggaacaggg 7740
tccacttgct cctgggccca cacagtcctg cagtattgtg tatataaggc cagggcaaag 7800
aggagcaggt tttaaagtga aaggcaggca ggtgttgggg aggcagttac cggggcaacg 7860
ggaacagggc gtttcggagg tggttgccat ggggacctgg atgctgacga aggctcgcga 7920
ggctgtgagc agccacagtg ccctgctcag aagccccaag ctcgtcagtc aagccggttc 7980
tccgtttgca ctcaggagca cgggcaggcg agtggcccct agttctgggg gcagcggggg 8040
atccactagt tctagagcgg ccgctaaacg ctcaactttg gcatggatgc gcgcgggggc 8100
ggcgggcggc cgggcgatag tccgggcacg acccctgcgc cggggccgcc gccaccgccg 8160
ccgccgcccg cgccccctca gcctcagcca ccacccgcgc cacccccgaa ccccacgacc 8220
ccctcgcacc cggagtcggc ggacgagccc ggcccgcgcg cccggctctg cagccgcgac 8280
agcgcctgca cccctggcgc ggccaagggc ggcgcgaatg gcgagtgcgg gcgcggggag 8340
ccgcagtgca gccccgaggg ccccgcgcgc ggccccaagg tttcgttctc atgccgcggg 8400
gcggcctccg ggccctcggc ggccgaggag gcgggcagcg aggaggcggg cccggcgggt 8460
gagccgcgcg gcagccaggc tagcttcctg cagcgccaat tcggggcgct tctgcagccc 8520
ggcgtcaaca agttctccct gcggatgttc ggcagccaga aggccgtgga gcgcgagcag 8580
gaacgcgtga agtcggcggg ggcctggatc atccacccct acagcgactt caggttctac 8640
tgggacttca ccatgctgtt gttcatggtg ggaaatctca ttatcattcc cgtgggcatc 8700
actttcttca aggacgagac caccgcgccc tggatcgtct tcaacgtggt ctcggacact 8760
ttcttcctca tggacttggt gttgaacttc cgcaccggca ttgttattga ggacaacacg 8820
gagatcatcc tggaccccga gaagataaag aagaagtact tgcgtacgtg gttcgtggtg 8880
gacttcgtgt catccatccc ggtggactac atcttcctca tagtggagaa gggaattagt 8940
gcttatggta taactgacta caaggacgac gatgacaagg ctatcgactc cgaggtctac 9000
aagacagcgc gtgctctgcg catcgtgcgc ttcaccaaga tcctcagtct gctgcggctg 9060
ctgcggctat cacggctcat ccgatatatc caccagtggg aagagatttt ccacatgacc 9120
tacgacctgg caagtgcagt gatgcgcatc tgtaacctga tcagcatgat gctactgctc 9180
tgccactggg acggttgcct gcagttcctg gtgcccatgc tgcaagactt ccccagcgac 9240
tgctgggtgt ccatcaacaa catggtgaac cactcgtgga gcgagctcta ctcgttcgcg 9300
ctcttcaagg ccatgagcca catgctgtgc atcggctacg ggcggcaggc gcccgagagc 9360
atgacagaca tctggctgac catgctcagc atgatcgtag gcgccacctg ccaataccag 9420
gagaagtaca agcaagtaga gcaatacatg tccttccaca aactgcccgc tgacttccgc 9480
cagaagatcc acgattacta tgaacaccgg taccaaggga agatgtttga tgaggacagc 9540
atccttgggg aactcaacgg gccactgcgt gaggagattg tgaacttcaa ctgccggaag 9600
ctggtggctt ccatgccgct gtttgccaat gcagacccca acttcgtcac agccatgctg 9660
acaaagctca aatttgaggt cttccagcct ggagattaca tcatccgaga ggggaccatc 9720
gggaagaaga tgtacttcat ccagcatggg gtggtgagcg tgctcaccaa gggcaacaag 9780
gagatgaagc tgtcggatgg ctcctatttc ggggagatct gcttgctcac gaggggccgg 9840
cgtacggcca gcgtgcgagc tgacacctac tgtcgcctct actcactgag tgtggacaat 9900
ttcaacgagg tgctggagga ataccccatg atgcggcgtg cctttgagac tgtggctatt 9960
gaccggctag atcgcatagg caagaagaac tccatcttgc tgcacaaggt tgtcaaatat 10020
gaccgtgaga tggtgcagca ggcagagctt ggccagcgtg tggggctctt cccaccaccg 10080
ccaccaccgc aggtcacatc ggccattgcc accctacagc aggctgtggc catgagcttc 10140
tgcccgcagg tggcccgccc gctcgtgggg cccctggcgc taggctcccc acgcctagtg 10200
cgccgcgcgc ccccagggcc tctgcctcct gcagcctcgc cagggccacc cgcagcaagc 10260
cccccggctg caccctcgag ccctcgggca ccgcggacct caccctacgg tgtgcctggc 10320
tctccggcaa cgcgtgtggg gcccgcattg cccgcacgtc gcctgagccg cgcctcgcgc 10380
ccactgtccg cctcgcagcc ctcgctgccc catggcgtgc ccgcgcccag ccccgcggcc 10440
tctgcgcgcc cggccagcag ctccacgccg cgcctgggac ccgcacccac cgcccggacc 10500
gccgcgccca gtccggaccg cagggactca gcctcgccgg gcgctgccag tggcctcgac 10560
ccactggact ctgcgcgctc gcgcctctct tccaacttgt gacggatccc aaggcccaac 10620
tccccgaacc actcagggtc ctgtggacag ctcacctagc ggcaatggct acaggtaagc 10680
gcccctaaaa tccctttggg cacaatgtgt cctgagggga gaggcagcga cctgtagatg 10740
ggacgggggc actaaccctc aggtttgggg cttctgaatg tgagtatcgc catgtaagcc 10800
cagtatttgg ccaatctcag aaagctcctg gtccctggag ggatggagag agaaaaacaa 10860
acagctcctg gagcagggag agtgctggcc tcttgctctc cggctccctc tgttgccctc 10920
tggtttctcc ccaggctccc ggacgtccct gctcctggct tttggcctgc tctgcctgcc 10980
ctggcttcaa gagggcagtg ccttcccaac cattccctta tccaggcttt ttgacaacgc 11040
tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtttgtaag 11100
ctcttgggga atgggtgcgc atcaggggtg gcaggaaggg gtgactttcc cccgctggga 11160
aataagagga ggagactaag gagctcaggg tttttcccga agcgaaaatg caggcagatg 11220
agcacacgct gagtgaggtt cccagaaaag taacaatggg agctggtctc cagcgtagac 11280
cttggtgggc ggtccttctc ctaggaagaa gcctatatcc caaaggaaca gaagtattca 11340
ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt ttctcagagt ctattccgac accctccaac 11400
agggaggaaa cacaacagaa atccgtgagt ggatgccttc tccccaggcg gggatggggg 11460
agacctgtag tcagagcccc cgggcagcac agccaatgcc cgtccttccc ctgcagaacc 11520
tagagctgct ccgcatctcc ctgctgctca tccagtcgtg gctggagccc gtgcagttcc 11580
tcaggagtgt cttcgccaac agcctggtgt acggcgcctc tgacagcaac gtctatgacc 11640
tcctaaagga cctagaggaa ggcatccaaa cgctgatggg ggtgagggtg gcgccagggg 11700
tccccaatcc tggagcccca ctgactttga gagctgtgtt agagaaacac tgctgccctc 11760
tttttagcag tcaggccctg acccaagaga actcacctta ttcttcattt cccctcgtga 11820
atcctccagg cctttctcta caccctgaag gggagggagg aaaatgaatg aatgagaaag 11880
ggagggaaca gtacccaagc gcttggcctc tccttctctt ccttcacttt gcagaggctg 11940
gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga cctacagcaa gttcgacaca 12000
aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc tgctctactg cttcaggaag 12060
gacatggaca aagtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt gccgctctgt ggagggcagc 12120
tgtggcttct agctgcccgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc 12180
ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctat aaaattaagt tgcatcattt 12240
tgtctgacta gtgtccttct atatatatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc 12300
aagttgggaa gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag 12360
tggcacaatc ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc 12420
agcctcccga gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt 12480
tttggtagag acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg 12540
tgatctaccc accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct 12600
tccctgtcct tctgatttta aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata 12660
ggctacctgg ccatgcccaa ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct 12720
catgcgttgg gtccactcag tagatgcctg ttgaattcct cgacctgcag cggccgccac 12780
ggtcgaggcc gcccgggcct tactcgaggg ggggcccggt ac 12822
Claims (14)
- HCN2 유전자를 포함하는 하기의 벡터맵으로 형질전환된 우울증 동물 모델 수정란을 대리인의 난관에 이식하여 생산된, HCN2 유전자가 과발현된, 우울증 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동물은 스트레스 민감성 동물인 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 HCN2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서,
상기 벡터는 flag tag를 포함하는 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델. - 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델.
- 청구항 1에 있어서, 상기 수정란은 수탁번호 KCTC 18318P인 마우스 수정란인 것을 특징으로 하는, 우울증 동물 모델.
- 하기 벡터맵으로 표시되는 HCN2 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 우울증 동물 모델 수정란을 대리인의 난관에 이식하여 산자를 생산하는 단계;를 포함하는 HCN2 유전자가 과발현된 우울증 동물 모델의 제조 방법.
- 청구항 1의 우울증 모델에 시험약물을 처리하는 단계;를 포함하는 우울증 치료제의 스크리닝 방법.
- 청구항 11에 있어서,
상기 우울증 모델의 행동을 측정 및 분석하는 단계를 더 포함하는, 우울증 치료제의 스크리닝 방법. - 청구항 11에 있어서,
상기 우울증 모델에 스트레스를 주어 우울증을 유발하는 단계를 더 포함하는, 우울증 치료제의 스크리닝 방법. - 청구항 1의 우울증 모델에 시험약물을 처리하는 단계;를 포함하는 우울증 치료제 효과의 평가 방법.
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| KR100758644B1 (ko) | 2006-02-21 | 2007-09-13 | 숙명여자대학교산학협력단 | 피케이디투 유전자를 이용한 낭포 발현 형질전환 동물의생산방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 논문 1(Science vol.344 pp.313-319 2014)* |
| 논문 2(Frontiers in Genetics vol.3 Article 116 2012) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160023022A (ko) | 2016-03-03 |
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