KR101651287B1

KR101651287B1 - Ｕｇｔ1ａ1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를예측하는 방법

Info

Publication number: KR101651287B1
Application number: KR1020037007790A
Authority: KR
Inventors: 하세가와요시노리; 안도유이치; 시모카타카오루
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2000-12-12
Filing date: 2001-12-10
Publication date: 2016-08-26
Also published as: US20110151474A1; ATE469966T1; AU2002221112A1; EP1352970A4; KR101651391B1; DE60142309D1; JP2009195247A; JPWO2002048400A1; CN1547613A; JP4447835B2; US20090263818A1; US20040058363A1; ES2346848T3; WO2002048400A1; EP1352970B1; CN100374575C; US20070082357A1; EP1352970A1; KR20030053064A; JP4616919B2

Abstract

본 발명은 이리노테칸의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 이리노테칸의 투여에 따른 부작용을 감소시키는 방법을 제공한다.

T1A1 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열의 반복수의 차이에 의한 다형 및 엑손 1내의 1염기 치환에 의한 2 종류의 다형(211 위치의 염기 및 686 위치의 염기)을 해석한다. 해석 결과에 기초하여 이리노테칸 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측한다. 또한, 부작용 발현 리스크에 따라 환자마다 이리노테칸 투여량을 설정하고, 이리노테칸 투여에 따른 부작용을 감소시킨다.

Description

ＵＧＴ1Ａ1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법{METHOD OF ESTIMATING RISK OF THE EXPRESSION OF SIDE EFFECT CAUSED BY THE ADMINISTRATION OF COMPOUND METABOLIZED, EITHER PER SE OR AS ITS METABOLIC INTERMEDIATE, BY UGT1A1 ENZYME}

본 발명은 약품의 대사에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 다형(polymorphism)을 해석함으로써, 약품의 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 부작용 발현 리스크를 예측하기 위해서 이용되는 키트에 관한 것이다. 또한, 부작용 발현 리스크의 예측 결과에 기초하여 약품의 부작용 발현 리스크를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명은 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 유전자의 다형을 분석함으로써, UGT에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법 및 부작용 발현 리스크 예측용 키트 및 부작용 발현 리스크를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

인간에게는 2 종류의 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제(UGT) 효소, 즉 UGT1과 UGT2가 존재한다. UGT1 패밀리는 스플라이싱에 의해 공통의 엑손 2에 연결되는 각 프로모터 및 엑손 1을 수반하는 유전자군으로 구성된다[참조: Ritter, J. K., Chen, F., Sheen, Y. Y., Tran, H. M., Kimura, S., Yeatman, M. T., and Owens, I. S., J. Biol. Chem., 267: 3257-3261 (1992)]. 따라서, 그 기질 특이성은 엑손 1에 의존하고 있다.

UGT1 패밀리의 하나인 UGT1A1 유전자는 프로모터 및 엑손 2∼5에 근접하는 엑손 1로 구성된다. UGT1A1 효소는 주로 빌리루빈의 포합(抱合)을 담당하고，약제(에티닐에스트라디올 등), 생체 이물 화합물(페놀, 안트라퀴논, 플라본 등), 내인성 스테로이드를 글루쿠로나이드화할 수 있다[참조: Senafi, S. B., Clarke, D. J., Burchell, B., Biochem. J., 303: 233-240 (1994)]. 현재 시점에서, 프로모터 영역과 엑손에 있어서의 30 이상의 유전자 다형이 UGT1A1 효소 활성을 저하시켜 체질성 비포합 황달, 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar syndrome), 길버트 증후군을 야기하는 것으로 알려져 있다[참조: Mackenzie, P. I. 등, Pharmacogenetics, 7: 225-269 (1997)]. 최근의 시험관내 분석에 의해 UGT1A1의 동형태가 SN-38의 글루쿠로나이드화를 담당하는 것 및 유전자 다형이 빌리루빈의 경우와 마찬가지로 SN-38의 글루쿠로나이드화 활성의 감소에 관여하는 것이 시사되었다[참조: Iyer, L. 등, J. Clin. Invest., 101: 847-854 (1998); Iyer, L. 등, Clin. Pharmacol. Ther., 65: 576-582 (1999)]. 또한, 본 발명자들은 UGT1A1 유전자형에 의존한 SN-38 및 SN-38 글루쿠로나이드의 약동학적 개인차를 지적하였다[참조: Ando, Y., Saka, H., Asai, G., Sugiura, S., Shimokata, K., and Kamataki, T., Ann. Oncol., 9: 845-847 (1998)].

UGT1A1 효소에 의해 그 중간 대사물이 대사(포합)되는 화합물의 하나에 이리노테칸(CPT-11)이 있다. 이리노테칸은 카르복실에스테라제에 의해 대사되어 활성형 SN-38이 된다. SN-38은 추가로 UGT1A1에 포합, 해독화되어 그 β-글루쿠로나이드가 된다. 그 후, 담즙을 통해 소장에서 배설되고, 세균 유래 글루쿠로니다제에 의해 SN-38과 글루쿠론산으로 분해된다[참조: Takasuna, K., Hagiwara, T., Hirohashi, M., Kato, M., Nomura, M., Nagai, E., Yokoi, T., and Kamataki, T., Cancer Res., 56: 3752-3757 (1996)]. SN-38에 대해서는 그 약동학적 개인차에 의해, 약품의 효과의 변동이 야기될 가능성이 시사되고 있다[참조: Gupta, E., Lestingi, T. M., Mick, R., Ramirez, J., Vokes, E. E., and Ratain, M. J., Cancer Res., 54: 3723-3725, (1994); Kudoh, S., Fukuoka, M., Masuda, N., Yoshikawa, A., Kusunoki, Y., Matsui, K., Negoro, S., Takifuji, N., Nakagawa, K., Hirashima, T., Yana, T., and Takada, M., Jap. J. Cancer Res., 86: 406-413 (1995)].

이리노테칸은 캄토테신 유사 화합물의 하나로서, 토포이소머라제 I을 억제함에 따른 강한 항종양 활성을 보유하는 것으로 알려져 있다. 이리노테칸은 특히 결장암이나 폐암의 치료약으로서 광범하게 사용되고 있지만, 백혈구의 감소, 설사(下痢)라고 하는 부작용이 보고되고 있고, 그 투여 약제의 용량 규정 인자(dose limiting toxicity)가 문제시 된다[참조: Negoro, S. 등, J. Natl. Cancer Inst., 83: 1164-1168 (1991); Akabayashi, A., Lancet, 350: 124 (1997); Pharmaceuticals and Cosmetics Division, Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare(ed), Summary Basis of Approval(SBA) No. 1(개정 판) irinotecan hydrochloride. Tokyo: Yakuji Nippo, Ltd. (1996)]. 이리노테칸의 부작용은 경우에 따라서는 치사적인 것으로[참조: Rougier, P. 등, Lancet, 352:1407-1412 (1998); Kudoh, S. 등, J. Clin. Oncol., 16:1068-1674 (1998); Masuda, N. 등, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 18:459a (1999); Negoro, S. 등, J. Natl. Cancer Inst., 83:1164-1168 (1991)], 실제, 임상 시험 중에, 1245명중 55명의 환자가 이리노테칸의 부작용에 의해 사망하고 있다는 보고가 있다[참조: Akabayashi, A., Lancet, 350: 124, 1997, Pharmaceuticals and Cosmetics Division, Pharmaceutical Affairs Bureau, Ministry of Health and Welfare(ed), Summary Basis of Approval(SBA) No. 1(개정판): irinotecan hydrochloride. Tokyo: Yakuji Nippo, Ltd. (1996)].

또한, Ratain 연구진은 UGT의 활성을 상승시키는 화합물을 이용함으로써, 이리노테칸의 부작용을 감소시키는 방법을 제안하고 있다(미국 특허 제5786344호).

이상과 같이, UGT1A1 효소가 대사에 관여하는 약제의 부작용은 심각한 문제이다. 그러나, 이러한 부작용을 예측하는 유효한 수단은 알려져 있지 않다. 한편, 암의 화학 요법에 있어서는, 많은 경우 치료 지표가 한정되기 때문에, 약제의 부작용을 감소시키고, 또한 그 효과를 높이기 위해서, 각 개인에 따른 약제 투여량을 설정하는 것이 매우 중요해진다.

이러한 상황을 감안하여 본 발명은 이리노테칸으로 대표되는, 그 자체 또는 중간 대사물이 UGT1A1 효소로 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용을 감소시키는 획기적인 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법, 그 방법을 이용한 키트 및 그 화합물의 부작용 발현 리스크를 감소시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 이상의 과제를 해결하기 위해 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 다형에 주목하여 연구를 수행하였다. 구체적으로는, 암의 화학 치료에 있어서 이리노테칸의 투여를 받은 환자를 대상으로, UGT1A1 유전자의 다형과 이리노테칸의 부작용과의 상관 관계에 대해서 조사하였다. 특히, UGT1A1 유전자의 프로모터 영역, 엑손 1, 엑손 4 및 엑손 5에 있어서의 다형에 대해서 검토하였다. 그 결과, 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열의 반복수의 차이에 의한 다형 및 엑손 1내의 1 염기 치환에 의한 2 종류의 다형(211 위치의 염기 및 686 위치의 염기)과 이리노테칸의 부작용과의 사이에 상관 관계가 확인되었다. 이러한 지견으로부터, UGT1A1 유전자에 있어서의 이들 다형과, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용의 정도와의 사이에 상관 관계가 있는 것이 시사되었다. 따라서, UGT1A1 유전자의 이들 다형을 해석하는 것이 이리노테칸으로 대표되는 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하기 위한 유효 수단이라고 생각되었다. 특히, 프로모터 영역에 있어서의 다형 및 엑손 1의 686 위치의 염기 치환에 의한 다형에 대해서는 각각 단독으로 이리노테칸의 부작용과의 사이에 상관 관계가 확인되고, 따라서, 그 2개의 다형의 해석은 각각 단독으로도 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또 는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하기 위한 유효 수단이라고 생각되었다. 본 발명은 이상의 지견 및 검토 결과에 기초하여 이루어진 것으로서, 다음 구성으로 이루어진다.

1. UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법으로서, 적어도 (a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하는 단계를 포함하는 방법.

2. TA 반복 서열수를 해석하는 단계가, TA 반복 서열수가 5 내지 8 중 어느 하나인 것을 해석하는 단계인 1에 기재한 방법.

3. TA 반복 서열수를 해석하는 단계가, TA 반복 서열수가 6 또는 7인 것을 해석하는 단계인 1에 기재한 방법.

4. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열 영역을 포함하는 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 1 내지 3 중 어느 하나에 기재한 방법.

5. UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법으로서, (b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하는 단계 및/또는 (c) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하는 단계를 더 포함하는 1 내지 4 중 어느 하나에 기재한 방법.

6. 686 위치의 염기를 해석하는 단계가, 686 위치의 염기가 시토신인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계인 5에 기재한 방법.

7. 211 위치의 염기를 해석하는 단계가, 211 위치의 염기가 구아닌인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계인 5에 기재한 방법.

8. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하는 DNA 및/또는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 5 내지 7 중 어느 하나에 기재한 방법.

9. UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법으로서, 적어도 (b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하는 단계를 포함하는 방법.

10. 686 위치의 염기를 해석하는 단계가, 686 위치의 염기가 시토신인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계인 9에 기재한 방법.

11. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 9 또는 10에 기재한 방법.

12. 상기 화합물은 캄토테신 유사 화합물인 것을 특징으로 하는 1 내지 11 중 어느 하나에 기재한 방법.

13. 상기 캄토테신 유사 화합물은 캄토테신 유도체인 것을 특징으로 하는 12에 기재한 방법.

14. 상기 캄토테신 유도체는 토포테칸 또는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 13에 기재한 방법.

15. 상기 캄토테신 유도체는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 13에 기재한 방법.

16. 1 내지 15 중 어느 하나에 기재한 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법의 결과에 기초하여 상기 화합물의 투여량을 설정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화합물의 투여량 설정 방법.

17. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산으로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 TA 반복 영역의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산.

18. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산으로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 TA 반복 영역의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 9 및 서열 번호 10의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브드화하는 핵산.

19. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산.

20. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산.

21. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산을 포함하는, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크 예측용 키트.

22. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산 및/또는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산을 더 포함하는 21에 기재한 키트.

23. UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산을 포함하는 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크 예측용 키트.

24. 상기 화합물은 캄토테신 유사 화합물인 것을 특징으로 하는 21 내지 23 중 어느 하나에 기재한 키트.

25. 상기 캄토테신 유사 화합물은 캄토테신 유도체인 것을 특징으로 하는 24에 기재한 키트.

26. 상기 캄토테신 유도체는 토포테칸 또는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 25에 기재한 키트.

27. 상기 캄토테신 유도체는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 25에 기재한 키트.

28. 이리노테칸의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서, 적어도 (a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산, (b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하는 키트.

29. 이리노테칸의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산을 더 포함하는 28에 기재한 키트.

30. 이리노테칸의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서, 적어도 (a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산, (b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산 중 어느 하나 이상을 포함하고, 추가로 해석 대상이 되는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열 영역을 포함하는 DNA 또는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약을 포함하는 키트.

31. 이리노테칸의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산 및 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약을 더 포함하는 30에 기재한 키트.

도 1은 실시예에 있어서 해석되는 UGT1A1 유전자의 다형을 정리한 표이다.

211G→A는 211 위치에 있어서의 구아닌으로부터 아데닌으로의 치환, 686C→A는 686 위치에 있어서의 시토신으로부터 아데닌으로의 치환, 1099C→G는 1099 위치에 있어서의 시토신으로부터 구아닌으로의 치환, 1456T→G는 1456 위치에 있어서의 티민으로부터 구아닌으로의 치환을 각각 나타낸다. 또한, G71R은 코돈 71에 있어서의 글리신으로부터 아르기닌으로의 치환, P229Q는 코돈 229에 있어서의 프롤린으로부터 글루타민으로의 치환, R367G는 코돈 367에 있어서의 아르기닌으로부터 글리신으로의 치환, Y486D는 티로신으로부터 아스파라긴산으로의 치환을 각각 나타낸다.

도 2는 실시예에 있어서 대상이 되는 환자의 임상 정보를 정리한 표이다. a는 일본 암치료학회의 기준에 따른다. 또한, b는 X²테스트(chi-square test)의 결과이며, c는 Mann-Whitney U 테스트의 결과이다.

도 3은 실시예에 있어서 대상이 되는 환자의 이리노테칸 화학요법의 정보를 정리한 표이다. a: 일본 암치료학회의 기준, b: X²테스트, c: Fisher's Exact 테스트.

도 4는 유전자형의 분포를 표로 정리한 것이다. 6/6은 TA 반복 서열이 6 대립유전자의 호모 접합인 것, 6/7은 TA 반복 서열이 6 대립유전자와 7 대립유전자와의 헤테로 접합인 것, 7/7은 TA 반복 서열이 7 대립유전자의 호모 접합인 것을 각각 나타낸다. Gly/Gly는 코돈 71이 글리신 대립유전자의 호모 접합인 것, Gly/Arg 은 코돈 71이 글리신 대립유전자와 아르기닌 대립유전자와의 헤테로 접합인 것, Arg/Arg은 코돈 71이 아르기닌 대립유전자의 호모 접합인 것을 나타낸다. Pro/Pro는 코돈 229가 프롤린 대립유전자의 호모 접합인 것, Pro/Gln은 코돈 229가 프롤린 대립유전자와 글루타민 대립유전자와의 헤테로 접합인 것을 각각 나타낸다. a: 일본 암치료학회의 기준, b: 평균치(사분위수 사이 영역).

도 5는 중독 부작용에 대한 UGT1A1^*28의 영향과 다른 인자의 영향을 통계적으로 비교(multiple logistic regression analysis)한 결과를 나타낸 표이다. a: 계수, b: 이리노테칸과 다른 항암제(플래티나제제를 제외함)와의 조합의 이력.

발명을 실시하기 위한 가장 바람직한 양태

본 발명은 (a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하는 단계를 포함하는, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법에 관한 것이다.

UGT1A1 효소란, UDP(우리딘인산)-글루쿠로노실트랜스퍼라제(UGT)의 1분자종이다. UGT는 생체에 있어서 빌리루빈이나 스테로이드 등의 내인성 물질, 특정한 구조를 갖는 약제 등의 글루쿠론산 포합(글루쿠로나이드 포합)을 촉매하는 효소의 총칭으로서, 많은 약제의 해독화에 관여한다. UGT1A1은 예컨대 상술한 바와 같이 이리노테칸의 대사에 깊게 관여하는 것으로 알려져 있다.

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자(이하, 「UGT1A1 유전자」라 칭함, GenBank Accession No.: AF297093)는 프로모터 영역, 엑손 1, 엑손 1에 이어서 배치되는 엑 손 2∼엑손 5를 갖는다. 프로모터 영역, 엑손 1∼엑손 5에는 복수의 다형이 존재하는 것으로 알려져 있다.

프로모터 영역에 있어서의 다형은 2염기 쌍(TA)의 반복 서열(TA 반복 서열)수의 차이에 의한 것이며, (TA)₅, (TA)₆, (TA)₇및 (TA)₈(TA 반복 서열이 각각 5, 6, 7 및 8 존재함)로 칭해지는 다형이 존재한다[참조: Monaghan, G. 등, Lancet, 347: 578-581 (1996); Bosma, P. J. 등, N. Engl. J. Med., 333: 1171-1175 (1995); Lampe JW 등, Pharmacogenetics, 9, 341-349 (1999)].

본 발명에 있어서의, 「TA 반복 서열수를 해석한다」라고 하는 것은 피검 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열의 수를 분석하는 것(그 배열수가 5 내지 8 중 어느 하나인 것, 그 배열수가 6 또는 7인 것을 해석하는 것을 포함함)을 의미한다.

한편, (b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하는 단계를 포함함으로써, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법을 구성할 수 있다.

또한, 상기 (a)의 단계와 상기 (b)의 단계를 포함함으로써 본 발명의 방법을 구성할 수도 있다. 또한, 상기 (a)의 단계와 (c) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하는 단계를 포함함으로써 본 발명의 방법을 구성할 수도 있다. 나아가서는, 상기 (a)의 단계, 상기 (b)의 단계 및 상기 (c)의 단계를 포함함으로써 본 발명의 방법을 구성할 수도 있다. 여기서, 686 위치의 염기는 UGT1A1 유전자의 전사 개시점에서부터 하류 방향으로 카운트하여 686번째의 염기를 의미하며, 마찬가지로 211 위치의 염기는 211번째의 염기를 의미한다.

단계 (b)는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하는 단계이다. 686 위치의 염기에는 시토신(C)과 아데닌(A)의 2 종류의 다형이 존재하는 것으로 알려져 있다[참조: Aono, S. 등, Lancet, 345: 958-959 (1995)]. 따라서, 「UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석한다」라고 하는 것은, 특히 686 위치의 염기가 시토신 또는 아데닌 중 어느 하나인 것을 분석하는 것을 의미한다.

단계 (c)는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하는 단계이다. 211 위치의 염기에는 구아닌(G)과 아데닌(A)의 2 종류의 다형이 존재하는 것으로 알려져 있다[참조: Aono, S. 등, Lancet, 345: 958-959 (1995)]. 따라서, 「UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석한다」라고 하는 것은, 특히 211 위치의 염기가 구아닌 또는 아데닌 중 어느 하나인 것을 분석하는 것을 의미한다.

또한, 상기 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수의 해석, 686 위치의 염기의 해석, 및/또는 211 위치의 염기의 해석은 양 대립유전자를 대상으로 할 수 있다.

TA 반복 서열수를 해석하는 방법, 686 위치 또는 211 위치의 염기를 해석하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, PCR법을 이용한 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한 효소 단편 길이 다형)법, PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism: 단일가닥 고차 구조 다형)법[ 참조: Orita, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770 (1989) 등], PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide: 특이적 배열 올리고뉴클레오티드)법, PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide: 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드) 하이브리드화법[참조: Saiki. Nature, 324, 163-166 (1986) 등], 또는 TaqMan-PCR법[참조: Livak, KJ, Genet Anal, 14, 143 (1999); Morris, T. 등, J. Clin. Microbiol., 34, 2933 (1996)], 인베이이더법[Invader법, 참조: Lyamichev V 등, Nat Biotechnol. 17, 292 (1999)], 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(매트릭스)법[참조: Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7, 378 (1997)], RCA(rolling cicle amplification)법[참조: Lizardi PM 등, Nat Genet 19, 225 (1998)], DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법[참조: Wang DG 등, Science 280, 1077 (1998) 등], 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법[참조: Southern, E., J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)] 등의 공지된 해석 방법을 이용할 수 있다. 또한, 그 서열 부분을 직접 서열결정하는 방법으로 해석하여도 좋다. 또한, 이들 방법은 임의로 조합하여 이용할 수도 있다. 또한, 단계 (a) 내지 (c)의 적어도 2개를 수행하여 부작용 발현 리스크의 예측을 하는 경우에는, 모든 단계에 있어서 동일한 해석 방법을 이용할 수 있는 것은 물론, 각각의 단계에 있어서 임의의 해석 방법을 선택하여 이용할 수 있다.

피검 DNA가 소량인 경우에는, PCR법을 이용한 PCR-RFLP법 등에 의해 해석하는 것이 검출 감도 내지 정밀도의 면에서 바람직하다. 또한, PCR법 또는 PCR법에 준한 유전자 증폭 방법에 의해 피검 DNA를 미리 증폭한 후, 상기한 어느 한 해석 방법을 적용할 수도 있다. 한편, 다수의 피검 DNA를 해석하는 경우에는, 특히 TaqMan-PCR법, 인베이더법, 프라이머 신장법을 이용한 MALDI-TOF/MS(매트릭스)법, RCA법, 또는 DNA 칩 또는 마이크로어레이를 이용한 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

UGT1A1 유전자는 피험자의 혈액, 피부 세포, 점막 세포, 모발 등으로부터 공지의 추출 방법, 정제 방법을 이용하여 획득할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 해석되는 염기 부분을 포함하는 것이면, 전장 DNA 또는 부분 DNA를 막론하고, 본 발명에 있어서의 UGT1A1 유전자로서 이용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 프로모터 영역의 반복 서열(TA)의 반복수를 해석하는 단계에 있어서는, 그 반복 서열 부분을 포함하는 한 임의 길이의 DNA 단편을 이용할 수 있다. 또한, 686 위치의 염기를 해석하는 단계에 있어서는, 그 염기 부분을 포함하는 한 임의 길이의 DNA 단편을 이용할 수 있다. 마찬가지로, 211 위치의 염기를 해석하는 단계에 있어서는, 그 염기 부분을 포함하는 한 임의 길이의 DNA 단편을 이용할 수 있다.

또한, UGT1A1 유전자의 전사 산물인 mRNA를 이용하여 각 단계의 해석을 수행할 수도 있다. 이 경우에는, 예컨대 UGT1A1 유전자의 mRNA를 피험자의 혈액 등으로부터 추출, 정제한 후, 역전사에 의해 cDNA를 제조한다. 그리고, 그 cDNA의 염기 서열을 해석함으로써 게놈 DNA의 다형 부분의 서열을 예측한다.

또한, 엑손 1에 있어서의 2개의 다형에 대해서는 UGT1A1 유전자의 발현 산물을 이용하여 해석할 수도 있다. 즉, 다형 부분의 발현 산물(아미노산)을 분석함으로써, 엑손 1의 유전자형을 결정할 수 있다. 이 경우, 엑손 1의 그 다형 부분에 대 응하는 아미노산을 포함하고 있는 한, 부분 펩티드라도 측정 대상으로 할 수 있다. 구체적으로는, 엑손 1의 211 위치 있어서의 다형은 코돈 71을 변화시키기 위해서(글리신 또는 아르기닌을 생성시킴), 코돈 71에 대응하는 아미노산을 적어도 포함하는 펩티드를 측정 대상으로서 이용할 수 있다. 마찬가지로, 엑손 1의 686 위치에 있어서의 다형은 코돈 229를 변화시키기 위해서(프롤린 또는 글루타민을 생성시킴), 코돈 229에 대응하는 아미노산을 적어도 포함하는 펩티드를 측정 대상으로서 이용할 수 있다. 또한, 코돈 71에 대응하는 아미노산 및 코돈 229에 대응하는 아미노산의 양자를 포함하는 펩티드 내지 단백질을 이용하면, 2개의 다형을 함께 해석하는 것이 가능하다.

펩티드 또는 단백질을 이용하여 다형 부분에 대응하는 아미노산을 분석하는 방법으로서는, 주지의 아미노산 서열 분석법(에드만법을 이용한 방법)을 이용할 수 있다. 또한, 아미노산의 변화에 의해 UGT1A1 유전자의 발현 산물의 입체 구조가 변하는 것이 예상되기 때문에, 면역학적 방법에 의해 아미노산의 종류를 분석할 수도 있다. 면역학적 방법으로는, 예를 들어, ELISA법(효소 결합 면역 흡착 정량법), 방사능면역 분석법, 면역 침강법, 면역 확산법 등을 들 수 있다.

「UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물」이란, 생체에 투여되었을 때에, 생체 내에서 UGT1A1 효소에 의해 직접 대사되는 화합물, 또는 일단 다른 효소 등에 의해 대사되고, 그 결과 생기는 대사산물(중간 대사물)이 UGT1A1 효소에 의해 대사되는 화합물을 의미한다. 이러한 특성의 화합물이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 캄토테신 유사 화합물이 이에 해당한다. 상기 특성을 갖는 캄토테신 유사 화합물이라면 그 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 토포테칸, 이리노테칸(CPT-11) 등의 공지의 캄토테신 유도체가 해당한다. 또한, 상기 성질이 유지되는 것을 조건으로, 공지의 캄토테신 유사 화합물, 공지의 캄토테신 유도체(토포테칸, 이리노테칸 등)에 있어서 1 또는 여러 개의 치환기가 다른 원자 또는 원자단으로 치환된 화합물이어도 좋다.

또한, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 적합한 예로는 이리노테칸을 들 수 있다.

부작용 발현 리스크란, 본 발명에 있어서의 화합물을 투여하는 것에 기인하여 부작용이 생기는 위험성을 말한다. 여기서, 부작용이란, 본 발명에 있어서의 화합물을 투여한 경우에 기대되는 효과(약효) 이외의 작용·효과를 말하고, 생체에 악영향을 미치게 하는 것은 물론, 그 화합물 본래의 효과를 감소시키는 것도 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법에서는 그 화합물 투여의 본래의 효과를 감소시키는 위험성도 부작용 발현 리스크에 포함된다.

본 발명의 화합물이 이리노테칸인 경우의 부작용의 일례를 나타내면, 백혈구 감소증 또는 설사가 있다. 이들 증상은 이리노테칸을 투여한 환자에 대하여, 경우에 따라서는 치사적인 악영향을 미친다.

부작용의 발현 리스크를 예측한 결과는 그 화합물의 투여량을 설정하는 것에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 상기 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법의 결과에 기초하여 상기 화합물의 투여량을 설정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 화합물의 투여량 설정 방법이다. 이러한 투여량 설정 방 법에 따르면, 그 화합물 투여에 따라 생기는 부작용의 정도 및 그 화합물 투여에 따라 기대되는 본래의 효과의 정도를 비교 고려하여, 투여 대상(환자)마다 적절한 투여량을 설정할 수 있다. 따라서, 부작용의 발생을 억제하면서, 그 화합물에 의한 효과적인 치료를 수행하는 것이 가능해진다. 즉, 다른 견지에서 생각하면, 그 화합물의 부작용을 감소시키기 위한 방법이 제공되게 된다.

본 발명의 다른 관점은 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산(이하, 「TA 반복수 해석용 핵산」이라 함), UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산(이하, 「686 위치 해석용 핵산」이라 함) 및 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산(이하, 「211 위치 해석용 핵산」이라 함)을 제공한다.

TA 반복수 해석용 핵산으로서는, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 TA 반복 영역의 염기를 포함하고, 또한 다음 2조의 프라이머 세트(서열 번호 7과 서열 번호 8의 조, 또는 서열 번호 9와 서열 번호 10의 조)중 어느 하나를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 들 수 있다.

순방향 프라이머(서열 번호 7)

5'-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3'

역방향 프라이머(서열 번호 8)

5'-CCACTGGGATCAACAGTATCT-3'

순방향 프라이머(서열 번호 9)

5'-GTCACGTGACACAGTCAAAC-3'

역방향 프라이머(서열 번호 10)

5'-TTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3'

686 위치 해석용 핵산으로서는, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 다음 프라이머 세트(서열 번호 3 및 서열 번호 4)를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 들 수 있다.

순방향 프라이머(서열 번호 3)

5'-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3'

역방향 프라이머(서열 번호 4)

5'-GTCCCACTCCAATACACAC-3'

211위 해석용 핵산으로서는, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하고, 또한 다음 프라이머 세트(서열 번호 1 및 서열 번호 2)를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 들 수 있다.

순방향 프라이머(서열 번호 1)

5'-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3'

역방향 프라이머(393 위치 ∼ 412 위치)(서열 번호 2)

5'-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3'

본 발명의 다른 관점은 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 TA 반복 서열수를 해석하기 위한 핵산(TA 반복수 해석용 핵산)을 포함하는, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크 예측용 키트를 제공한다.

한편, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산(686 위치 해석용 핵산)을 포함함으로써, UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크 예측용 키트를 구성할 수 있다.

또한, TA 반복 서열수 해석용 핵산 이외에, 686 위치 해석용 핵산을 포함함으로써, 본 발명의 키트를 구성할 수도 있다. 또한, TA 반복 서열수 해석용 핵산 이외에, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산(211 위치 해석용 핵산)을 더 포함함으로써, 본 발명의 키트를 구성할 수도 있다. 또한, 각 키트의 사용 방법에 따른 1 또는 2 이상의 시약을 조합하여 상기 각 키트를 구성하여도 좋다. 예를 들어, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 TA 반복 서열수 영역을 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기 영역을 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약 및/또는 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기 영역을 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약을 조합하여 키트를 구성할 수 있다.

이상의 각 핵산은 각각의 키트에 있어서 이용되는 해석 방법{상술한 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism: 제한 효소 단편 길이 다형)법, PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism: 단일 가닥 고차 구조 다형)법[참조: Orita, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770 (1989) 등]등의 해석 방법}에 이용되는 것이고, 예를 들어, 프라이머, 프로브이다. 프라이머의 예로는, 해석 대상이 되는 다형 부위(프로모터 영역, 686 위치의 염기, 211 위치의 염기)를 포함하는 영역을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 들 수 있다. 또한, PCR-RFLP법을 실행하는 키트를 구성하는 경우에는, 예를 들어, PCR 증폭 산물을 제한 효소 처리한 경우에 유전자형이 식별되도록, 특정한 다형을 갖는 경우에 그 다형 부분에 있어서 특정한 제한 효소 부위가 형성되도록 설계한 프라이머가 이용된다. 또한, TaqMan-PCR법, 인베이더법 등을 실행하는 키트를 구성하는 경우에는, 각 방법에 이용되는 프라이머 및/또는 프로브를 핵산의 예로서 들 수 있다.

프로브, 프라이머에는 해석 방법에 따라 적절하게 DNA 단편 또는 RNA 단편이 이용된다. 프로브, 프라이머의 염기 길이는 각각의 기능이 발휘되는 길이이면 좋고, 프라이머의 염기 길이의 예로는 15∼30 bp 정도, 바람직하게는 20∼25 bp 정도이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법을 용이하게 실시하기 위해서는 이것에 적합한 유전자 다형 검출 키트를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 키트는 상기 설명에 기초하여 용이하게 설계할 수 있지만, 기본적으로 PCR법 등에 의한 피검 DNA의 증폭을 수행하지 않고도 게놈 DNA라도 분석을 실시할 수 있는 방법인 인베이더법을 예로서 더 설명한다.

인베이더법에 의한 키트를 구성하는 경우에는, 2 종류의 비형광 표지 올리고뉴클레오티드(1, 2), 1 종류의 형광 표지 올리고뉴클레오티드(3) 및 DNA의 구조를 인식하여 절단하는 특수한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소(4)를 사용한다. 2 종류의 비형광 표지 올리고뉴클레오티드를 각각 「대립유전자 프로브(또는 시그널 프로브, 리포터 프로브)」, 「인베이더 프로브」라 칭하고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 「FRET 프로브」, DNA의 구조를 인식하여 절단하는 특수한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 「클리베이즈(cleavase)」라고 부른다.

(1) 대립유전자 프로브는 주형인 UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자(이하, 약칭으로 「UGT1A1 유전자」라고도 함) 중의 해석 대상이 되는 다형 부위(이하, 「다형 부위」라고 함)보다 5'측에 대하여 상보적이게 되는 염기 서열을 가지며, 다형 부위보다 1 염기 3'측에 대하여 상보 결합할 수 없는 임의의 염기 서열(플랩이라 함)을 갖도록 설계한다. 즉, 대립유전자 프로브 자체에서 보았을 경우, 5' 말단으로부터 플랩 부분·주형중의 다형 부위보다 5'측으로 상보적인 배열 부분의 순으로 구성되어 있다. 또 플랩의 배열은 UGT1A1 유전자 배열은 물론, 대립유전자 프로브 또는 인베이더 프로브, 나아가서는 시료중의 UGT1A1 유전자 이외의 DNA와 상보 결합을 할 수 없는 배열을 사용한다.

(2) 인베이더 프로브는 주형인 UGT1A1 유전자중의 다형 부위보다 3'측에 대하여 상보적으로 결합하도록 설계하지만, 다형 부위에 대응하는 배열은 임의의 염기(N)이어도 좋다. 즉 인베이더 프로브 자체에서 보았을 경우, 5' 말단으로부터 주형의 다형 부위보다 3'측에 대하여 상보적인 배열 부분-3' 말단에 N의 순으로 구성 되어 있다.

이와 같이 구성된 (1), (2)는 본 발명의 「TA 반복수 해석용 핵산」, 「686위 해석용 핵산」 또는 「211 위치 해석용 핵산」에 해당한다. (1), (2) 2 종류의 프로브와 UGT1A1 유전자를 상보 결합시키면 다형 부위에 인베이더 프로브의 1염기(N)가 침입(invasion)할 수 있다.

(3) FRET(fluorescence resonance energy transfer; 형광 공명 에너지 전이) 프로브는 UGT1A1 유전자와는 전혀 무관한 배열에 의해 구성할 수 있고, 검출하고 싶은 다형 부위에 상관없이 공통이어도 좋다. 5'측에는 자기 자신으로 상보 결합할 수 있는 배열을 가지며, 3'측에는 플랩에 대하여 상보적인 배열을 갖고 있다. 또한, 5' 말단에는 형광 색소를 표지하고, 그 상류에는 소광 물질(억제제)이 결합되어 있다.

(4) 클리베이즈는 구조 특이적 플랩엔도뉴클레아제(FENs)로 분류되는 DNA의 구조를 인식하여 절단하는 특수한 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 효소이며, 주형 DNA, 인베이더 프로브 및 대립유전자 프로브의 3개의 염기가 배열되고, 대립유전자 프로브의 5'말단이 플랩형으로 되어 있는 부분을 인식하여, 그 플랩 부분을 절단한다.

이상과 같은 3종류의 프로브(1)∼(3)과 클리베이즈(4)를 이용하면 모식적으로 이하와 같은 2 단계의 반응이 일어난다.

우선 대립유전자 프로브(1)가 UGT1A1 유전자와 상보 결합했을 때에, 다형 부위에 인베이더 프로브(2)의 3'말단(N)이 침입한다. 이 3 염기가 배열된 다형 부위 의 구조를 클리베이즈(4)가 인식하여 대립유전자 프로브(1)의 플랩 부분을 절단하고, 플랩 부분이 유리된다. 다음에, 대립유전자 프로브(1)로부터 유리된 플랩 부분은 FRET 프로브(3)와 상보적인 배열을 갖기 위해 FRET 프로브(3)와 상보 결합한다. 이 때 플랩 부분의 3'말단에 존재하는 다형 부위가 FRET 프로브(3) 자신의 상보 결합 부위로 침입한다. 클리베이즈(4)는 이번에는 이 구조를 인식하여 형광 색소가 결합하고 있는 부위를 절단한다. 이에 따라 형광 색소는 억제제와 떨어지기 위해서 형광을 발한다. 이 형광 강도를 측정하여 다형을 검출하고, 해석한다.

(1)∼(4)는 예를 들어, (1)과 (2), (3)과 (4)를 조합하여 2 종류의 시약 조성물로서 조합하여 사용하는 것이나, (3) 및 (4)를 사전에 건조시켜 미량역가평판에 봉입해 둘 수도 있다. 이들에 의해 분석법의 단계수를 줄일 수 있다. 또한 (1)과 (2)를 포함하는 시약 조성물에 마그네슘, 완충제 등을 적절하게 배합하고, 반응을 최적화할 수도 있다. 또한 (1)∼(4) 이외에 측정중인 시료의 증발을 방지하는 광유 등을 조합하여 키트로 할 수도 있다.

또, 대립유전자 프로브(1)에 대해서 2 종류의 프로브를 준비하면, UGT1A1 유전자가 호모 접합체인지 헤테로 접합체인지를 감별할 수도 있다.

이들은, 문헌[참조: 오오니시요우조우, 포스트 시퀀스의 게놈 과학 「SNP 유전자 다형의 전략」, 94-135, 나카야마 서점, 2000, Treble, M., 등, 유전자 의학, 4: 68-72 (2000)]의 총설이나 국제 공개 공보인 WO97/27214호, WO98/42873호에 도해되고, 기재되어 있기 때문에, 이들을 참조하여 최적의 설계를 하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트에 의해 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용 발현 리스크를 예측할 수 있기 때문에, 그 예측 결과에 기초하여 투여 대상마다 적절한 해당 화합물의 투여량을 설정할 수 있다. 환언하면, 본 발명의 키트는 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 화합물의 투여량을 설정하기 위해서 이용할 수 있다.

부작용 발현 리스크가 적다고 판단되는 유전자 다형(즉, 프로모터 영역의 TA 반복 서열수가 6이고, 엑손 1의 211 위치가 구아닌(G)이거나 및/또는 엑손 1의 686 위치가 시토신임)을 갖는 UGT1A1 유전자 또는 그 어느 다형 부위를 적어도 하나 함유하는 DNA 단편을, 화합물의 투여를 받는 환자의 세포, 특히, UGT1A1 효소가 해당 화합물의 대사, 해독화에 작용하는 부위에 있어서의 세포에 도입함으로써, 해당 화합물의 부작용 발현 리스크를 감소시킬 수 있다. 유전자의 도입은 해당 화합물의 투여 전, 투여 중, 또는 투여 후에 수행할 수 있다. 유전자의 도입은, 예를 들어, 유전자 도입용 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 이용한 방법, 전기천공법[참조: Potter, H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165 (1984)], 리포펙션[참조: Felgner, P. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417 (1984)], 미세주입법[참조: Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 366-370 (1976)] 등의 방법에 의해 수행할 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 실시예에서는, 이리노테칸 투여에 따른 부작용과 UGT1A1 유전자의 다형과의 상관 관계를 통계 학적으로 해석하였다.

환자 정보 및 임상 정보

1994년 7월부터 1999년 6월에 이리노테칸을 포함하는 화학요법을 받고 있는 일본인 환자를 대상으로 하였다. 환자의 안전을 확보하기 위해서, 이리노테칸 사용 전에 골수 기능이 문제없는 것(백혈구 3×10⁹/1 이상, 혈소판 100×10⁹/1 이상)을 확인하였다. 추가로, 수용성 설사, 마비성 일레우스(イレウス), 간질성 폐렴이나 폐선유증, 광범위에 걸친 중증의 복수나 흉수, 분명한 황달, 이리노테칸에 과민증의 기존 병력이 있는 환자를 제외하였다. 이 결과, 118명의 환자를 본 실시예의 대상으로 하였다.

이리노테칸의 적응성을 확인하기 위해 일주에 1회는 전혈, 혈소판수 및 혈청 화학치에 대해 측정하였다. 또한, 빌리루빈치는 항상 측정하였다.

환자 정보(연령, 성별 등)를 포함한 임상 기록 및 이리노테칸 투여량 및 투여 스케줄, 다른 약이나 방사선 요법의 기록, 이리노테칸에 의한 부작용 등에 대해서, 소급적으로 조사를 수행하였다. 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)나 이리노테칸 유도성 설사에 대하여 일본에서 일반적으로 처방되고 있는 염산 로페라미드의 투여일을 카운트하였다. G-CSF의 예방 투여에 의해 호중구 감소증이 분명히 발증하는 일은 없었다. 이리노테칸의 투여량 규정 인자(dose limiting toxicity)에 의해 백혈구 감소증과 설사를 야기하는 것이 알려져 있기 때문에, 4 등급의 백혈구 감소(＜0.9×10⁹/1), 3 등급 또는 그 이상 악화한 설사(3 등급은 5일 이상 계속되는 설 사, 4 등급은 출혈 또는 탈수 증상을 수반하며, 각 등급은 일본 암치료학회의 기준에 따름)를 중독 부작용(severe toxicity)이라 정의하였다. 다른 부작용은 각종 환자 배경에 영향을 받기 때문에, 본 실시예에 있어서 분석 대상으로 하지 않았다. 혈청 전체 빌리루빈치는 이리노테칸 투여 직전 및 치료 후의 최고치에 대해서 기록하였다.

유전자형의 분석

각 환자(118명)로부터 혈액 샘플을 채취하여, 각 샘플에 대해 유전자형을 분석하였다. 우선, 100∼200 ㎕의 전혈로부터 QIAamp Blood Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 게놈 DNA를 제조하였다. 또한, 조작은 해당 키트에 첨부된 설명서에 따라 수행하였다.

각 게놈 DNA에 대해서, 다음 변이 서열을 해석하였다(도 1 참조). 즉, UGT1A1 유전자에 있어서의, TATA 박스내의 2 염기 쌍(TA)의 삽입{이 결과, -39 위치 ∼ -53 위치에 (TA)₇ TAA를 생기게 한다. 이 타입을 UGT1A1^*28이라 칭한다[참조: Monaghan, G., Ryan, M., Seddon, R., Hume, R., and Burchell, B., Lancet, 347: 578-581 (1996); Bosma, P. J. 등, N. Engl. J. Med., 333: 1171-1175 (1995)]}, 엑손 1의 코돈 71에 있어서의 치환[전사 개시점의 하류 211 위치의 구아닌(G)을 아데닌(A)으로 치환한다. 해당 치환은 글리신을 아르기닌으로 변화시킨다(해당 변이를 G71R이라 나타낸다. 이 타입을 UGT1A1^*6이라 칭한다.)], 엑손 1의 코돈 229에 있 어서의 프롤린을 글루타민으로 바꾸는 치환(P229Q로 나타낸다. 이 타입을 UGT1A1^*27이라 칭한다.), 엑손 4의 코돈 367에 있어서의 치환[1099 위치에 있어서의 치환. 시토신(C)으로부터 구아닌(G)으로의 치환. 해당 치환은 아르기닌을 글리신으로 치환한다. R367G로 나타낸다. 이 타입을 UGT1A1^*29라 칭한다.] 및 엑손 5의 코돈 486에 있어서의 치환[1456 위치에 있어서의 치환. 티민(T)으로부터 구아닌(G)으로의 치환. 해당 치환은 티로신(Y)을 아스파라긴산(D)으로 치환한다. Y486D로 나타낸다. 이 타입을 UGT1A1^*7이라 칭한다.][참조: Monaghan, G., Ryan, M., Seddon, R., Hume, R., 및 Burchell, B., Lancet, 347: 578-581 (1996); Bosma, P. J. 등, N. Engl. J. Med., 333: 1171-1175 (1995); Aono, S. 등, Lancet, 345: 958-959 (1995); Aono, S. 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 197: 1239-1244 (1993)].

UGT1A1^*28은 먼저 보고된 PCR 증폭 반응을 이용한 방법[참조: Monaghan, G. 등, Lancet, 347: 578-581 (1996); Ando, Y. 등, Pharmacogenetics, 8: 357·360 (1998)에 기재되는 방법]에 의해 얻어지는 253-255 염기 쌍의 서열을 직접 결정함으로써, 가장 일반적인 대립유전자(UGT1A1^*1)로 식별되었다.

염기 서열의 해석은 ABI PRISM 310 유전자 분석기를 이용한 다이·터미네이터·서열결정 반응을 이용한 사이클 서열결정법에 의해 수행하였다(ABI Prism DNA Sequencing Kit, Perkin-Elmer, Foster City, CA).

기타 변이 유전자형(UGT1A1^*6 등)은 PCR-RFLP법에 의해 UGT1A1^*1로 식별되었다. 엑손 1의 분석을 위해, 엑손 1을 포함하는 923 염기 쌍의 단편을 먼저 보고된 방법[참조: Akaba, K. 등, Biochem. Mol. Biol. Int., 46: 21-26 (1998)]에 따라 제1 단계 PCR에 의해 증폭하였다.

계속해서, UGT1A1^*6의 분석을 위해, 235 염기 쌍의 단편을 증폭하도록 설계된 네스티드(nested) 프라이머를 이용하여 제2 단계 PCR에 의한 증폭 반응을 행하였다. 오결합(mismatch) 서열을 포함하는 순방향 프라이머와 역방향 프라이머는 다음과 같다.

순방향 프라이머(178 위치 ∼ 210 위치)(서열 번호 1)

5'-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3'

역방향 프라이머(393 위치 ∼ 412 위치)(서열 번호 2)

5'-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3'

밑출 친 부분은 오결합 부위이다. UGT1A1^*1에서는 MspI(다카라슈조 가부시키가이샤, 오츠시, 일본) 제한 효소 부위가 도입되고, UGT1A1^*6에서는 도입되지 않도록 순방향 프라이머는 설계되어 있다. 제1 단계 PCR 반응에 의한 증폭 산물을 1000배로 희석하고, 네스티드 프라이머를 이용한 PCR(네스티드 PCR, 제2 단계 PCR)에 제공하였다. 그 때, 샘플 50 ㎕중에, 0.2 mM의 각각의 디옥시뉴클레오티드 3인산, 50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂, 각 프라이머 0.5 μM 및 Taq 폴리머라제(다까라슈조 가부시키가이샤, 오츠시, 일본) 1.3 유닛을 함유시켰다. PCR의 조건은 다음과 같다. 95℃, 5 min의 반응 및 이것에 이어서 수행되는 25 사이클의 반응(94℃에서 30초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 40초)이다(PCR 열 사이클러 MP, 다까라슈조 가부시키가이샤, 오츠시, 일본). 1 ㎕의 PCR 증폭 산물을 4 유닛의 MspI로 37℃에서 1 시간 동안 처리하였다. UGT1A1^*1 유래의 DNA는 203 염기 쌍과 32 염기 쌍의 단편으로 절단되고, UGT1A1^*6으로부터는 절단되지 않는 235 염기 쌍의 단편이 생기고, 헤테로 접합 DNA로부터는 상기 3 단편의 전부가 생겼다.

UGT1A1^*27의 염기 서열의 결정에는 399 염기 쌍의 단편을 증폭하기 위해서 설계된 이하의 프라이머(한쪽은 네스티드 프라이머임)를 이용한 제2 단계 PCR를 행하였다.

순방향 프라이머(485 위치 ∼ 503 위치)(서열 번호 3)

5'-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3'

역방향 프라이머(865 위치 ∼ 867 위치 및 인트론 1)(서열 번호 4)

5'-GTCCCACTCCAATACACAC-3'

UGT1A1^*27에는 2개의 BsrI(New England Biolabs, Inc., Bevverly, MA) 제한 효소 부위가 존재하고(552 위치 ∼ 556 위치 및 684 위치 ∼ 688 위치), 한편, UGT1A1^*1에는 이러한 제한 효소 부위가 하나 존재한다(552 위치 ∼ 556 위치). 일련의 PCR 증폭 반응은 상기 MspI RFLP의 경우와 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 증 폭 산물을 2.5 유닛의 BsrI에 의해 65℃에서 1 시간 동안 절단하였다. 그 결과, UGT1A1^*27로부터는 199 염기 쌍, 132 염기 쌍 및 68 염기 쌍의 단편이 생기고, UGT1A1^*1로부터는 331 염기 쌍 및 68 염기 쌍의 단편이 생겼다. 또한, 헤테로 접합형의 DNA로부터는 상기 4 단편의 전부가 생겼다.

마찬가지로, UGT1A1^*29의 염기 서열을 네스티드 프라이머를 이용한 PCR·RFLP법에 의해 해석하였다. 엑손 2, 3 및 4를 포함하는 제1 계 PCR 증폭 반응을 먼저 보고되어 있는 방법[참조: Akaba, K. 등, Biochem. Mol. Biol. Int., 46: 21-26 (1998)]에 다소의 개량을 가한 방법에 따라 수행하였다. 즉, 제2 단계 PCR 증폭 반응에는 285 염기 쌍의 단편을 증폭하기 위해서 설계된 오결합 서열을 포함하는 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용하였다.

순방향 프라이머(인트론 3 및 1085 위치 ∼ 1098 위치, 밑줄 친 부분은 오결합 부위를 나타낸다)(서열 번호 5)

5'-TCCTCCCTATTTTGCATCTCAGGTCACCCGATGGCC-3'.

역방향 프라이머(인트론 4)(서열 번호 6)

5'-TGAATGCCATGACCAAA-3'

순방향 프라이머는 UGT1A1^*1로부터 Cfr13I(다까라슈조 가부시키가이샤, 오츠시, 일본) 제한 효소 부위(1095 위치 ∼ 1099 위치)를 생기게 하고, UGT1A1^*29로부터는 이러한 제한 효소 부위가 생기지 않도록 설계하고 있다. 또한, PCR 반응 시약 혼합물은 상기 UGT1A1^*6에 있어서의 제2 단계 PCR 반응의 경우와 동일한 것을 사용하였다. PCR 증폭 산물을 Cfr13I 효소에 의해 절단하였다. UGT1A1^*1 유래의 DNA는 252 염기 쌍 및 33 염기 쌍의 단편에 절단되고, UGT1A1^*29 유래의 DNA로부터는 절단되지 않는 285 염기 쌍의 단편을 생기게 하였다.

UGT1A1^*7의 검출을 위해, 먼저 보고된 프라이머[참조: Akaba, K. 등, Biochem. Mol. Bio1. Int., 46: 21-26 (1998)]를 이용하여 엑손 5의 579 염기 쌍의 단편을 PCR법에 의해 증폭하였다.

또한, PCR 반응 시약 혼합물은 상기 UGT1A1^*6에 있어서의 제2 단계 PCR 반응의 경우와 동일한 것을 사용하였다. UGT1A1^*1의 서열에는 BsrI 제한 효소 부위(1452 위치 ∼ 1456 위치)가 존재하고, 한편, UGT1A1^*7에는 해당 제한 효소 부위는 존재하지 않는다. 따라서, BsrI 효소를 덧붙여 항온처리함으로써 UGT1A1^*1은 365 염기 쌍 및 214 염기 쌍의 단편에 절단되고, 한편, UGT1A1^*7 유래 DNA로부터는 절단되지 않는 579 염기 쌍의 단편이 생겼다.

상기 조작의 결과 얻어진 각 제한 효소 단편을 4% 아가로즈 겔을 이용한 전기 영동 및 에티디움 브로마이드(EtBr) 염색에 의해 분석하였다. 이상 모든 변이에 대한 유전자형 해석의 결과는 직접 서열결정 분석에 의해 확인하였다.

이상의 조작에 의해 환자마다 UGT1A1 유전자의 형을 결정하였다.

통계적 해석

이리노테칸의 중독 부작용과 UGT1A1 유전자의 형(유전자 다형)과의 상관 관계의 해석 및 평가는 하기 통계적 방법에 의해 수행하였다.

후보 요인으로서, 성별, 연령, 일반 상태(Performance Status: PS), 주요 질환, 원격 전이의 존재, 치료 이력, 당뇨병과 간 질환과의 병발, 화학요법 이력, 동시에 행해지는 방사선 요법 및 이리노테칸 점적(instillation)의 투여 스케줄 및 1회당 투여량을 이용하였다. 화학요법 이력에 대해서는 3개의 그룹으로 나누었다. 즉, 이리노테칸만을 투여한 그룹, 이리노테칸 및 플라티나 제제[시스플라틴 또는 카르보플라틴)을 투여한 그룹, 이리노테칸 및 다른 약제(파크리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포시드(etoposide), 미토마이신 C(mitomysin C) 또는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)]를 투여한 그룹이다. 위치 변수 사이의 상관성(관련성)은 절대 변수에 대한 X²(chi-square) 테스트 또는 Fisher's exact 테스트 또는 연속 변수에 대한 Mann·Whitney U 테스트를 이용하여 평가하였다. 중독 부작용(p＜0.1)과 상관 관계가 있을 거라고 예상되는 후보 변수는 비한정 멀티플 로지스틱 회귀 분석(unconditional multiple logistic regression analysis)을 수행하였다. 과립구 콜로니 자극 인자 및 로페라미드 염산염의 실질적인 전체 투여량 및 사용에 대해서는 화학요법의 결과에 강하게 의존하는 것으로 생각되기 때문에, 다변량 해석에 있어서 고려하지 않았다. 최종적인 통계 모델에 있어서의 변수는 스텝와이즈법을 이용하여 유의 수준 0.25(순방향) 및 0.1(역방향)에서 선택하였다. 중독 부작 용의 발현에 대한 유전자 다형의 중요성은 그 밖의 요인을 보정함으로써 검토하였다.

상기 해석은 JMP ver.3.0.2 소프트웨어(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 이용하여 수행하였다. 양측 검정치(P치)가 0.05보다 작은 경우에 통계적으로 유의한 차이로 하였다.

이리노테칸의 부작용과 임상 정보

118명의 환자에 관한 임상 정보를 검토한 결과, 9명(8%)이 4 등급의 백혈구 감소증(≤0.9 x 10⁹/리터)을 경험하고 있고, 38명(32%)이 3 등급의 백혈구 감소증(1.9-1.0 x 10⁹/리터)을 경험하고 있었다. 한편, 3명(3%)이 4 등급(출혈성 또는 탈수증)의 설사를 경험하고 있고, 19명(16%)이 3 등급(5일 이상간, 수상)의 설사를 경험하고 있었다. 4 등급의 백혈구 감소증을 경험한 환자 9명 중, 5명은 3 등급 또는 4 등급의 설사도 경험하고 있었다. 또한, 3 등급 또는 4 등급의 설사를 경험한 환자 22명 중, 16명은 3 등급 또는 4 등급의 백혈구 감소증도 경험하고 있었다. 이상의 임상 정보를 기초로 중독 부작용을 경험한 환자(이하, 「부작용 경험자」라고 함) 26명과 경험하지 않는 환자(이하, 「부작용 비경험자」라고 함) 92명으로 구분하여 임상 정보 및 이리노테칸 화학요법의 정보를 도 2의 표 및 도 3의 표에 각각 정리하였다. 부작용 경험자로서는, 이리노테칸의 실질적 전 투여량이 보다 적고, 과립구 콜로니 자극 인자 또는 로페라미드(loperamide) 염산염을 보다 많이 투여한 것을 알 수 있다.

유전자형의 분포

118명 모든 환자에 대해서, 상기 방법에 의해 그 유전자형을 결정하고, 도 4에 정리하였다. 또한, UGT1A1^*29 또는 UGT1A1^*7을 갖는 환자는 없었다. 또한, 9명에 대해서는 이미 보고된 결과(UGT1A1^*28)를 이용하였다[참조: Ando, Y., Saka, H., Asai, G., Sugiura, S., Shimokata, K., and Kamataki, T., Ann. Oncol., 9: 845-847 (1998)]. 또한, 117명의 환자에 관해서, 화학요법 전의 전체 빌리루빈 레벨 및 화학요법 기간에 있어서의 전체 빌리루빈 레벨의 최대치를 측정하여, 그 결과를 도 4의 표에 함께 기재하였다.

도 4의 표에 나타낸 바와 같이, 5명이 유전자형에 있어서, 동시에 2개의 다형이 확인되었다. 즉, 2명(화살표 A로 표시함)은 헤테로 접합의 UGT1A1^*28 및 헤테로 접합의 UGT1A1^*6을 갖고 있었다. 또한, 3명은 헤테로 접합의 UGT1A1^*27을 가지며, 동시에 호모 접합(2명: 화살표 C로 표시함) 또는 헤테로 접합(1명: 화살표 B로 표시함)의 UGT1A1^*28을 갖고 있었다.

모두 헤테로 접합의 UGT1A1^*28 및 UGT1A1^*6을 갖는 2명(화살표 A로 표시함)의 빌리루빈 레벨은 정상 범위였다(화학요법 전에는 각각 13.9 μmol/리터와 15.4μmol/리터, 화학요법 개시 후에는 각각 10.3 μmol/리터와 15.4 μmol/리터). 이들 2명을 제외하고, 유전형간의 빌리루빈 레벨의 차이는 화학요법전(p=0.031, Kruskal-Wallis 테스트) 및 화학요법 개시후(p＜0.001) 모두 통계적으로 유의하였다.

UGT1A1^*28 대립유전자의 출현 빈도는 부작용 경험자와 부작용 비경험 환자에 대해서, 각각 0.308(95% CI, 0.004∼0.149)과 0.087(95% CI, 0.046∼0.128)이며, UGT1A1^*6 대립유전자의 출현 빈도에 대해서는, 마찬가지로 0.077(95% CI, 0.004∼0.149)과 0.136(95% CI, 0.086∼0.185)이었다.

부작용 경험자와 부작용 비경험자 사이의 대립유전자 분포에 있어서의 차이는 UGT1A1^*28에 관해서는 통계적으로 유의(p＜0.001)하였지만, UGT1A1^*6에 관해서는 유의하다고 확인되지 않았다(p＞0.2, GENEPOP ver.3.1d 소프트웨어, the Laboratoire de Genetique et Environment, Montpellier, France).

유전자형과 부작용과의 상관 관계

로지스틱 회귀 분석(logistic regression analysis)을 수행한 결과, 헤테로 접합 또는 호모 접합의 UGT1A1^*28을 갖는 유전자형이 중독 부작용의 유효한 지표가 되는 것으로 나타났다(예상 확률, 5.21; 95% CI, 1.98∼13.96; p＜0.001, 도 4를 참조). 한편, UGT1A1^*6과 중독 부작용과의 통계적 상관 관계는 확인할 수 없었다(예상 확률, 0.55; 95% CI, 0.15∼1.61; p＞0.2).

다음에, 중독 부작용에 영향을 주는 다른 인자와 유전자형의 변이와의 비교를 행하였다. 도 2의 표 및 도 3의 표에 나타낸 바와 같이, 성별, 화학요법 이력, 이리노테칸 점적 스케줄이 높은 독성에 관련된다. 그래서, 이들 요인에 대해서 상관성을 조사하였다. 그 결과, 화학요법 이력과 이리노테칸 점적 스케줄 사이에 유의한 상관 관계(p＜0.001, X²테스트)를 확인할 수 있었다. 즉, 3 또는 4주 사이클의 이리노테칸 치료를 받은 19명 중 12명(63%)이 기타 항암제의 투여를 받고 있었다. 화학요법 이력은 이리노테칸의 높은 독성과 강한 상관 관계를 나타내는 변수라고 생각되었기 때문에, 이것을 통계 모델로 받아들였다.

한편, 화학요법 이력, 성별 및 UGT1A1^*28 유전자형 사이에는 유의한 상관 관계를 확인할 수 없었다. 또한, UGT1A1^*28 이외에 여성인 것 및 다른 항암제(플라티나 제제를 제외함)를 사용하는 것이 중독 부작용에 중요한 인자인 것을 확인하였다. 이들 2개의 인자와 UGT1A1^*28과의 비교를 도 5의 표에 나타내었다. 도 5의 표에 나타낸 바와 같이, UGT1A1^*28을 가짐으로써, 이리노테칸에 의한 중독 부작용이 7배로 증가한다. 또한, 여성인 것과 이리노테칸의 중독 부작용과의 사이에는 유의한 레벨의 상관성은 확인되지 않았다. 이상의 지견으로부터, UGT1A1^*28이 중독 부작용에 대한 지표로서 매우 유효하다는 것을 알 수 있다.

한편, 4 등급의 백혈구 감소증 및 3 등급 이상의 설사를 병발한 5명의 환자 중 2명은 UGT1A1^*28 및 UGT1A1^*27을, 다른 2명은 헤테로 접합의 UGT1A1^*6을, 나머지의 1명은 호모 접합의 UGT1A1^*1을(즉, 변이한 유전형을 갖고 있지 않음) 각각 갖고 있었다. 한편, 5명 중 4명(80%)이 프로모터 영역(UGT1A1^*28) 및 엑손 1(UGT1A1^*6 또는 UGT1A1^*27)의 양쪽에 변이한 서열을 갖고 있고, 이들 환자는 생명에 위험한 레벨의 독성을 받고 있었다. 이상의 결과로부터, UGT1A1^*28에 주목하면, UGT1A1^*28을 가짐으로써, 높은 확률로 이리노테칸의 중독 부작용이 생기는 것이 시사된다. 따라서, 프로모터 영역의 변이(TA 반복 서열의 차이)를 해석함으로써 이리노테칸의 부작용 발현 리스크의 예측이 가능하다고 말할 수 있다. 또한, UGT1A1^*28과 UGT1A1^*6 또는 UGT1A1^*27 중 어느 하나를 아울러 가짐으로써, 높은 확률로 이리노테칸의 중독 부작용이 생기는 것이 시사된다. 따라서, 프로모터 영역의 변이와 엑손 1에 있어서의 변이를 함께 해석함으로써, 이리노테칸의 부작용 발현 리스크의 예측이 가능하다고 말할 수 있다.

또한, 호모 접합의 UGT1A1^*6을 갖는 2명(도 4의 표, 화살표 D로 표시함)은 중독 부작용을 경험하고 있지 않고, 또한, 헤테로 접합의 UGT1A1^*27을 갖는 3명(도 4의 표, 화살표 B 및 화살표 C로 표시함)은 모두 중독 부작용을 경험하고 있는 것을 알 수 있다. 이것으로부터, UGT1A1^*27을 가짐으로써, 높은 확률로 이리노테칸의 중독 부작용이 생기는 것이 시사된다. 따라서, UGT1A1^*27의 존재, 즉, 코돈 229에 있어서의 다형을 해석함으로써, 이리노테칸의 부작용 발현 리스크의 예측이 가능하 다고 말할 수 있다.

본 발명은 상기 발명의 실시 형태 및 실시예의 설명에 하등 한정되지 않는다. 특허청구범위의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 상도할 수 있는 범위에서 여러 가지 변형 형태도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 방법에 따르면, 이리노테칸을 대표로 하는, 그 자체 또는 중간 대사물이 UGT1A1 효소에 대사되는 화합물의 투여에 따른 부작용의 리스크를 사전에 예측할 수 있다. 그 결과, 환자마다 부작용의 리스크를 고려한 화합물(약제)의 투여가 가능해져, 부작용의 감소가 가능해진다. 특히, 이리노테칸의 투여에 따른 백혈구 감소증, 설사라는 부작용의 발현 리스크를 사전에 예측할 수 있어, 그 부작용의 리스크를 감소시킬 수 있다.

또한, 일본인의 20% 이상이 UGT1A1에 변이를 갖고 있고, 그 때문에 이리노테칸의 높은 독성에 대하여 높은 리스크를 가질 수 있다고 생각되기 때문에, UGT1A1의 유전형을 분석함으로써, 특히 일본인 환자에 있어서의 이리노테칸의 부작용을 감소시킬 수 있다고 말할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Nagoya Industrial Science Research Institute Hasegawa, Yoshinori Ando, Yuichi Shimokata, Kaoru <120> Method for predicting severe toxicity caused by dosing either a compound that is metabolized by UGT1A1 enzyme or a compound whose metabolite is metabolized by the enzyme. <130> C0000101 <140> <141> <150> JP P2000-376756 <151> 2000-12-12 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 235-bp segment to analyze UGT1A1*6 <400> 1 ctagcacctg acgcctcgtt gtacatcaga gcc 33 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 235-bp segment to analyze UGT1A1*6 <400> 2 ccatgagctc cttgttgtgc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 399-bp segment to analyze UGT1A1*27 <400> 3 agtacctgtc tctgcccac 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 399-bp segment to analyze UGT1A1*27 <400> 4 gtcccactcc aatacacac 19 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 285-bp to analyze UGT1A1*29 <400> 5 tcctccctat tttgcatctc aggtcacccg atggcc 36 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer for amplifying a 285-bp to analyze UGT1A1*29 <400> 6 tgaatgccat gaccaaa 17 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer for analyzing TATA box region <400> 7 aagtgaactc cctgctacct t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer for analyzing TATA box region <400> 8 ccactgggat caacagtatc t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer for analyzing TATA box region <400> 9 gtcacgtgac acagtcaaac 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR Primer for analyzing TATA box region <400> 10 tttgctcctg ccagaggtt 19

Claims

시험관 내에서 UGT1A1[우리딘 디포스페이트-글루쿠로노실트랜스퍼라제(UDP-glucuronosyltransferase)1A1] 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 캄토테신 유사 화합물의 투여에 따른 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법으로서,

(a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기가 시토신인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
시험관 내에서 UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 캄토테신 유사 화합물의 투여에 따른 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법으로서,

(a) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기가 시토신인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계 및

(b) UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기가 구아닌인지 또는 아데닌인지를 해석하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 단계 (a)에서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 211 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 단계 (b)에서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캄토테신 유사 화합물은 캄토테신 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 캄토테신 유도체는 토포테칸 또는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 캄토테신 유도체는 이리노테칸인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 기재한 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크를 예측하는 방법의 결과에 기초하여 상기 캄토테신 유사 화합물의 투여량을 설정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 캄토테신 유사 화합물의 투여량 설정 방법.
UGT1A1 효소에 의해 그 자체 또는 중간 대사물이 대사되는 캄토테신 유사 화합물의 투여에 따른 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
이리노테칸의 투여에 의한 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
이리노테칸의 투여에 의한 백혈구 감소 및 설사에서 선택되는 하나 이상의 부작용 발현 리스크 예측용 키트로서,

UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 해석하기 위한 핵산으로서, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하고, 또한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용한 PCR법에 의해 증폭될 수 있는 영역에서 유래하는 DNA 단편에 대해 특이적으로 하이브리드화하는 핵산을 포함하고, UGT1A1 효소를 암호화하는 유전자의 686 위치의 염기를 포함하는 DNA를 증폭하기 위한 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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