JP5543120B2 - サルcyp3a遺伝子多型の検出および利用 - Google Patents
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また、本発明は、前記CYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素が、CYP3A4またはCYP3A5である、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記CYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素が、CYP3A4であり、前記多型がIVS3+1delG、c.436G>C、c.442A>T、c.475A>T、c.485G>A、c.574A>G、c.577A>G、c.878T>A、c.886G>A、c.974C>G、c.1048G>A、c.1298C>T、c.1310G>Aおよびc.1468G>Cからなる群から選択される、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記多型がIVS3+1delGである、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記CYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素が、CYP3A5であり、前記多型がc.625A>T、c.264C>G、c.430G>A、c.463A>G、c.689T>C、c.878A>T、c.967A>T、c.1244G>A、c.1310G>Cおよびc.1437C>Gからなる群から選択される、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記多型がc.625A>Tである、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記サル個体がカニクイザルまたはアカゲザルである、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記サル個体において検出された多型を、ヒトにおいてCYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型と比較する工程をさらに含む、前記の方法に関する。
さらに、本発明は、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって:(a) サル個体において、CYP3A4をコードする遺伝子の多型1を検出する工程;(b) サル個体において、CYP3A5をコードする遺伝子の多型2を検出する工程;(c) 前記多型1が、CYP3A4の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;および(d) 前記多型2が、CYP3A5の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;を含む方法に関する。
また、本発明は、前記多型1がCYP3A4の発現および/または機能を変化するものでなく、かつ、前記多型2がCYP3A5の発現および/または機能を変化するものである場合に、前記サル個体をモデル動物として選択する、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記多型2がc.625A>Tである、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記多型1がCYP3A4の発現および/または機能を変化するものであり、かつ、前記多型2がCYP3A5の発現および/または機能を変化するものでない場合に、前記サル個体をモデル動物として選択する、前記の方法に関する。
また、本発明は、前記多型1がIVS3+1delGである、前記の方法に関する。
さらに、本発明は、ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって、少なくとも2以上のサル集団のそれぞれについて、少なくとも2以上のサル個体において、CYP3Aファミリーの薬物代謝酵素をコードする遺伝子における多型を検出する工程;検出された多型について、前記集団内におけるアレル頻度を算出する工程;および算出されたアレル頻度を前記集団間で比較する工程を含み、アレル頻度のより高いまたはより低いサル集団からのサル個体を、モデル動物として選択する方法に関する。
さらに、本発明は、ヒトまたはサルのCYP3A4およびCYP3A5の機能を評価するための試験に用いるモデル動物を作出する方法であって、(i) CYP3A5をコードする遺伝子においてc.625A>Tをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程;および(ii) 前記工程(i)で選択されたサル個体同士、または前記工程(i)で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程;を含む方法に関する。
さらに、本発明は、ヒトまたはサルのCYP3A4およびCYP3A5の機能を評価するための試験に用いるモデル動物を作出する方法であって、(i’) CYP3A4をコードする遺伝子においてIVS3+1delGをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程;および(ii’) 前記工程(i')で選択されたサル個体同士、または前記工程(i')で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程;を含む方法に関する。
さらに、本発明は、薬物動態試験、薬効試験および/または安全性試験に用いられるモデル動物であって:CYP3A4をコードする遺伝子においてIVS3+1delGをヘテロ接合体またはホモ接合体で有すること;および/またはCYP3A5をコードする遺伝子においてc.625A>Tをヘテロ接合体またはホモ接合体で有すること;を特徴とするサルに関する。
本発明に係る方法は、サル個体において、CYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型を検出する工程を含む。
CYP3A4をコードする遺伝子の多型としては、例えばIVS3+1delG、c.436G>C、c.442A>T、c.475A>T、c.485G>A、c.574A>G、c.577A>G、c.878T>A、c.886G>A、c.974C>G、c.1048G>A、c.1298C>T、c.1310G>A、c.1468G>C等が挙げられる。ここで、436、442等の数字は、カニクイザルCYP3A4遺伝子のcDNA配列としてGenBankに登録された配列番号1の塩基配列において翻訳開始点を+1として数えた場合の塩基配列の番号を表す。なお、翻訳開始点とは、配列番号1で表される塩基配列によりコードされるアミノ酸の開始コドンであるメチオニン(ATG)の最初の塩基(A)に対応し、配列番号1で表される塩基配列の55番目のAをいう。また、G>C、A>Tは、それぞれGがCに置換されていること、AがTに置換されていることを示す。IVS3+1delGはエクソン3の末端からイントロン3の第1番目の塩基にわたって存在するpolyGのうちの1塩基が欠損する遺伝子多型を示す。これによって、スプライシング・ドナーサイトが1塩基ずれることにより、スプライシングの結果生じる成熟mRNAのコード領域に1塩基の欠損が入る。従って、IVS3+1delGの多型が存在する場合には、フレームシフトが生じる。本発明者らは、カニクイザルCYP3A4において、IVS3+1delGの多型がある場合には発現タンパク質の酵素代謝能が失われることを確認している。他のサルやヒトにおいても、CYP3A4においてこの多型が存在する場合にはCYP3A4の機能が阻害される。
1. PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法
特定の多型を有する遺伝子では、制限酵素による切断によって生じる断片の長さが異なることを利用して、多型を検出する方法である。検出しようとする多型を含む領域をPCRによって増幅した後、増幅産物に変異部を認識する制限酵素を作用させ、断片を電気泳動法等により分離、同定する。生じた断片の長さから制限酵素による切断の有無、ひいては多型の有無を確認することができる。
2. ASP(Allele Specific Primer)-PCR
多型を含む領域にハイブリダイズするプライマーを用いてPCRを行い、多型を有する場合、当該プライマーと鋳型DNAとの間にミスマッチが生じるため伸長反応が起こらないことを利用する方法である。増幅産物を電気泳動法等により分離、同定し、増幅の有無を確認することによって、試料DNAの多型の有無を知ることができる。
3. 一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)法
サルから抽出したDNAをPCRで増幅した後、1本鎖に解離させると、1本鎖DNAは塩基対形成をはじめとする種々の分子内相互作用で、塩基配列に依存した固有の高次構造をとり、わずかな塩基配列の違いが存在しても、高次構造が変化する。そのため1本鎖DNAをポリアクリル・アミド中で電気泳動すると、高次構造の違いに応じて移動度も異なり、この移動度の違いを検出することによって多型の有無を判定することができる。
4. 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)法
尿素、ホルムアミド等の変性剤の濃度に勾配をつけたポリアクリルアミドゲル上で、必要に応じて制限酵素等で処理したサル由来の被検DNAサンプルと、正常DNA断片との混合物の電気泳動を行ってサンプルを分離する。多型に起因するミスマッチが存在すると、より低い濃度の変性剤で1本鎖に解離するため、ミスマッチのない2本鎖より泳動速度が速くなる。従って、正常DNAサンプルのバンドと比較することによって、1本鎖の存在の有無を検出することが可能となり、結果として多型の有無を検出することができる。
5. マイクロアレイを用いる方法
マイクロアレイ上に固定されたプローブDNAと、サル由来のDNAまたはRNAサンプルとのハイブリダイゼーションを検出して、多型の有無を解析する方法である。ハイブリダイゼーションの有無を検出する方法や、プローブDNAの3’末端を多型の予想される部位にあわせてハイブリダイゼーションさせ、標識したジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼを添加して、伸長反応の有無を検出する方法等がある。標識は、蛍光色素、放射性物質、電気化学的に検出できる化合物等各種選択することができる。
6. Pyrosequencing法
シーケンス反応を化学発光で検出する方法である。サル由来の被検DNAをPCRで増幅した後、1本鎖DNAを精製し、適当なプライマーをハイブリダイズさせてからデオキシヌクレオチドを一塩基ずつ添加する。伸長反応に伴って発生するピロリン酸がカスケード反応を開始させ、生じたATPによりルシフェリンを基質としてルシフェラーゼが発光する。この発光を検出することにより被検DNAの塩基配列を決定することができ、高精度に多型を検出できる(Alderborn, A. et ao.: Genome Res. (2000) 28:1249-1258)。
(i) CYP3A5をコードする遺伝子においてc.625A>Tをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程、および (ii) 前記工程(i)で選択されたサル個体同士、または前記工程(i)で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程を含む方法;あるいは
(i') CYP3A4をコードする遺伝子においてIVS3+1delGをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程、および (ii') 前記工程(i')で選択されたサル個体同士、または前記工程(i')で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程を含む方法も提供する。
78個体のカニクイザル(インドシナ産38個体、インドネシア産40個体)および34個体のアカゲザル(中国産)のゲノムサンプルを用いて、遺伝的変異を同定した。本実験の方法は、倫理委員会により承認されたものである。
まず、上記各個体の血液サンプルから、製造者の使用説明書に従ってPUREGENE(登録商標) DNA isolation kit (Gentra Systems、Minneapolis、MN)を用いて、ゲノムDNAを調製した。得られた各サンプルのゲノムDNAについて、プライマーを用いて、各エクソンおよびその近傍領域をPCRで増幅した。PCRは、1ngのゲノムDNA、5pmoleのPCR用プライマー(FWプライマーおよびRVプライマー)ならびに1ユニットのAmpliTaq(商標)Gold DNA polymerase (AppliedBiosystems、Foster City、CA)を含む、20μLの反応液中で行い、サーマルサイクラー(AppliedBiosystems)を用いて増幅を実施した。反応条件は、最初の変性を95℃ 10分で行った後、95℃ 20秒、55℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを30回繰り返し、最終伸長を72℃ 10分で行った。得られたPCR産物の配列決定は、シーケンス用プライマーおよびABI PRISM(登録商標)BigDye(商標)Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて実施した。その後、ABI PRISM(登録商標)3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems)を用いて電気泳動を行った。PCRおよび配列決定に用いたプライマーを表1に示す。表1中、「F」はFWプライマー、「R」はRVプライマー、「S」はシーケンス用プライマーを示す。
得られた配列データについて、DNASIS Pro (Hitachi Software、Tokyo、Japan)を用いてシーケンス解析を行った。カニクイザルのゲノムサンプルからの配列データについてはGenBankに登録されたカニクイザルのCYP3A4 (CYP3A8) cDNA配列 (GenBank アクセッション番号S 53047、配列番号1)を、アカゲザルのゲノムサンプルからの配列データについてはGenBankに登録されたアカゲザルのCYP3A4 (CYP3A64) cDNA配列 (GenBank アクセッション番号NM 001040414、配列番号2)を、それぞれレファレンス配列として用いて、各ゲノムサンプルのCYP3A4遺伝子において塩基置換を探索した。
検出された変異のうち13個はnon-synonymous変異(アミノ酸が変化する変異)であり、そのうちc.886G>Aおよびc.1310G>Aは、それぞれSRS4およびヘム結合領域に位置していた。カニクイザルおよびアカゲザル間でのアレル頻度の比較により、同定された43個のアレルのうち、11個(25.6 %)がこれらの種で重複しており、24個がカニクイザルのみで、8個がアカゲザルのみで、それぞれ確認された。最近の研究では、アカゲザルで見出された遺伝子多型の約半分は、カニクイザルにも存在することが示唆されており(非特許文献9)、いずれかの種のサルで同定された遺伝的変異は、他方の種における遺伝的変異の解析においても利用できることが示唆される。
CYP3A4のコード領域における、塩基対ごとの多様性を、アレル頻度に基づいて算出した。推定された多様度は、インドシナ産カニクイザルにおいて9.21 x 10-4、インドネシア産カニクイザルにおいて8.84 x 10-4、アカゲザルにおいて1.22 x 10-3であった。ヒトCYP3A4での遺伝的多様性は、既報のアレル頻度データ(Thompson EE et al., Am J Hum Genet (2004) 75:1059-1069)に基づいて、4.68 x 10-5であると推定された。ヒトと比較すると、サルにおけるCYP3A4の遺伝的多様性は、10倍程度高かった。このことは、ヒトと比較して、サルにおいて、CYP3A4が関与する薬物代謝能の個体差がより大きい可能性があることを示唆する。
カニクイザルにおいて同定された遺伝子変異のアレル頻度から、c.1610T>Cが、本実施例で解析した動物群におけるメジャーアレルであることがわかった。これは、カニクイザル CYP3A4 cDNA(配列番号1)の同定(クローニング)に用いられた動物と、本実験において用いた動物との間の遺伝的な差異を反映していると考えられた。カニクイザルにおいてのみ見出された24個のアレルのうち、non-synonymous変異3個を含む10個の変異がインドシナ産に、non-synonymous変異5個を含む11個の変異がインドネシア産に、それぞれ特異的であることが明らかになり、アレル頻度に地域差が存在することが示唆された。同様に、中国産アカゲザルとインド産アカゲザルとの間にアレル頻度の地域差が存在することが報告されている(非特許文献7〜8)。このような、異なる集団間での遺伝的多様性は、薬物代謝能における差異を生じる可能性があるため、薬物代謝の研究には同一集団からの動物を用いることが好ましいと考えられる。
実施例1で得られた遺伝的変異の機能的特性解析のために、発現プラスミドの構築、タンパク質の発現および該発現タンパク質についての薬物代謝活性の測定を、Uno Y et al., Arch Biochem Biophys (2007) 46:98-105およびYamazaki H et al., Drug Metab Dispos (1999) 27:999-1004に記載の手法を用いて行った。
実施例1において、エクソン3における潜在的ヌルアレルとして、IVS3+1delGが見出された(表2)。このアレルが存在するとフレームシフトが起こり、翻訳早期終止コドンが生じることにより、全タンパク質の約4分の1しか翻訳されないと推測される。公知の方法(Omura T et al., J Biol Chem (1964) 239:2379-2385)に従いU-3000 spectrophotometer (Shimadzu、Kyoto、Japan)を使用してCO差スペクトルを調べたところ、レファレンスとしたCYP3A4 cDNA配列(配列番号1)のタンパク質で観察された、450nm付近のCYP特異的ピークは、この変異タンパク質では観察されず、IVS3+1delGがヌルアレルであることが示唆された。
78個体のカニクイザル(インドシナ産38個体、インドネシア産40個体)および34個体のアカゲザル(中国産)のゲノムサンプルを用いて、遺伝的変異を同定した。本実験は、倫理委員会により承認されたものである。
表4に記載のプライマーを用いた以外は、実施例1と同様の手法を用いて実施した。表4中、「F」はFWプライマー、「R」はRVプライマー、「S」は配列プライマーを示す。
得られた配列データについて、DNASIS Pro (Hitachi Software、Tokyo、Japan)を用いてシーケンス解析を行った。カニクイザルのゲノムサンプルからの配列データについてはGenBankに登録されたカニクイザルのCYP3A5 cDNA配列(GenBank アクセッション番号DQ 074795、配列番号3)を、アカゲザルのゲノムサンプルからの配列データについてはGenBankに登録されたアカゲザルのCYP3A5 cDNA配列(GenBank アクセッション番号NM 001030219、配列番号4)を、それぞれレファレンス配列として用いて、各ゲノムサンプルのCYP3A5遺伝子における塩基置換を探索した。
検出された変異のうち9個はnon-synonymous変異であり、そのうちc.1310G>Cおよびc.1437C>Gは、それぞれヘム結合領域およびSRS6に位置していた。カニクイザルおよびアカゲザル間でのアレル頻度の比較により、同定された43個のアレルのうち、6個(17.6 %)がこれらの種で重複しており、22個がカニクイザルのみで、6個がアカゲザルのみで、それぞれ確認された。
CYP3A5のコード領域における、塩基対ごとの多様性を、アレル頻度に基づいて算出した。推定された多様度は、インドシナ産カニクイザルにおいて9.70 x 10-4、インドネシア産カニクイザルにおいて6.39 x 10-4であり、アカゲザルにおける値(1.02 x 10-3)と比較して若干低かった。ヒトCYP3A5での遺伝的多様性は、既報のアレル頻度データ(Thompson EE et al., Am J Hum Genet (2004) 75:1059-1069)に基づいて、1.10 x 10-4であると推定された。ヒトと比較すると、サルにおけるCYP3A5の遺伝的多様性は高かった。このことは、ヒトと比較して、サルにおいて、CYP3A5が関与する薬物代謝の個体差がより大きい可能性があることを示唆する。
同定された遺伝的変異のアレル頻度から、c.387T>Aおよびc.1310G>Cが、本実施例で解析した動物群におけるメジャーアレルであることがわかった。これは、カニクイザル CYP3A5 cDNA(配列番号3)の同定(クローニング)に用いられた動物と、本実験において用いた動物との間の遺伝的な差異を反映していると考えられた。カニクイザルにおいて見出された変異のアレルのうち、non-synonymous変異3個を含む11個の変異がインドシナ産のみで、non-synonymous変異6個を含む10個の変異がインドネシア産のみで、それぞれ認められ、実施例1と同様、CYP3A5についても、アレル頻度の地域差が存在することが示唆された。
ヘム結合領域およびSRSはタンパク質の機能に重要であると考えられているため、実施例2で得られた遺伝的変異のうち、コードされるアミノ酸が変化するc.1310G>C(ヘム結合領域)、c.1437C>G(SRS6)およびc.625A>T(SRS2)の遺伝的変異について、機能解析のために、発現プラスミドの構築、タンパク質の発現および該発現タンパク質についてのミダゾラムまたはニフェジピンを用いた薬物代謝活性の測定を行った。カニクイザルCYP3A5 cDNA(配列番号3)を含む発現プラスミドを用い、変異導入のためのプライマーとして表4に示したプライマー対を用いた以外は、実施例2と同様の手法を用いて行った。結果を表6に示す。レファレンスとして、カニクイザルCYP3A5 cDNA(配列番号3)から発現させたタンパク質を用いて活性を測定した。以下の実施例6に詳述するc.625A>T以外は、レファレンス配列から発現させたタンパク質と比較して代謝活性に顕著な変化を示さなかった。
実施例4において、エクソン7における潜在的ヌルアレルとして、c.625A>T (K209X)が見出された(表5)。このアレルが存在すると、翻訳早期終止コドンが生ずることにより、翻訳されたタンパク質は、ヘム結合領域および5つのSRSを含む、全アミノ酸の半分以上が欠損すると考えられ、完全なタンパク質が合成されない。この変異を有するタンパク質は、実施例4と同様の手法を用いて測定し場合にCO差スペクトルによる450nmのピークを示さなかった。
配列番号2は、アカゲザルCYP3A4 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 001040414)。
配列番号3は、カニクイザルCYP3A5 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号DQ 074795)。
配列番号4は、アカゲザルCYP3A4 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 001040219)。
配列番号5は、ヒトCYP3A4 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 017460)。
配列番号6は、ヒトCYP3A5 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 000777)。
配列番号7は、ヒトCYP3A7 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 000765)。
配列番号8は、ヒトCYP3A43 cDNAの塩基配列である(GenBank アクセッション番号NM 022820)。
配列番号9は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン1を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号10は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン1を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号11は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン1のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号12は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン2を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号13は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン2を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号14は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン2のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号15は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン3を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号16は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン3を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号17は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン3のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号18は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン4を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号19は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン4を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号20は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン4のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号21は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン5〜6を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号22は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン5〜6を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号23は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン5〜6のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号24は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン7を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号25は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン7を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号26は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン7のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号27は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン8を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号28は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン8を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号29は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン8のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号30は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン9を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号31は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン9を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号32は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン9のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号33は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン10を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号34は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン10を増幅するためのプライマー(RV)およびシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号35は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン11を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号36は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン11を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号37は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン11のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号38は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン12を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号39は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン12を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号40は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン12のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号41は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン13を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号42は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン13を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号43は、サルCYP3A4遺伝子のエクソン13のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号44は、サルCYP3A4遺伝子の変異IVS3+1delGをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号45は、サルCYP3A4遺伝子の変異IVS3+1delGをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号46は、サルCYP3A4遺伝子の変異c.886G>Aをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号47は、サルCYP3A4遺伝子の変異c.886G>Aをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号48は、サルCYP3A4遺伝子の変異c.1310G>Aをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号49は、サルCYP3A4遺伝子の変異c.1310G>Aをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号50は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン1を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号51は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン1を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号52は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン1のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号53は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン2を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号54は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン2を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号55は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン2のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号56は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン3を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号57は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン3を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号58は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン3のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号59は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン4を増幅するためのプライマー(FW)およびシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号60は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン4を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号61は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン5〜6を増幅するためのプライマー(FW)およびシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号62は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン5〜6を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号63は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン7を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号64は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン7を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号65は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン7のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号66は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン8を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号67は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン8を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号68は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン8のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号69は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン9を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号70は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン9を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号71は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン9のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号72は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン10を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号73は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン10を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号74は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン10のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号75は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン11を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号76は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン11を増幅するためのプライマー(RV)およびシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号77は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン12を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号78は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン12を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号79は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン12のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号80は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン13を増幅するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号81は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン13を増幅するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号82は、サルCYP3A5遺伝子のエクソン13のシーケンス用プライマー(S)の塩基配列である。
配列番号83は、サルCYP3A5遺伝子の変異c.625A>Tをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号84は、サルCYP3A5遺伝子の変異c.625A>Tをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号85は、サルCYP3A5遺伝子の変異c.1310G>Cをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号86は、サルCYP3A5遺伝子の変異c.1310G>Cをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
配列番号87は、サルCYP3A5遺伝子の変異c.1437C>Gをプラスミドに導入するためのプライマー(FW)の塩基配列である。
配列番号88は、サルCYP3A4遺伝子の変異c.1437C>Gをプラスミドに導入するためのプライマー(RV)の塩基配列である。
Claims (15)
- ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって:
サル個体において、CYP3A4またはCYP3A5をコードする遺伝子の多型を検出する工程;および
前記多型が、前記薬物代謝酵素の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;
を含み、
前記多型が、CYP3A4をコードする遺伝子の多型であるIVS3+1delG、c.485G>A、c.878T>A、c.886G>A、およびc.1310G>AならびにCYP3A5をコードする遺伝子の多型であるc.625A>T、c.1310G>Cおよびc.1437C>Gからなる群から選択される、方法。 - 前記多型がCYP3A4をコードする遺伝子の多型IVS3+1delGである、請求項1に記載の方法。
- 前記多型がCYP3A5をコードする遺伝子の多型c.625A>Tである、請求項1に記載の方法。
- 前記サル個体がカニクイザルまたはアカゲザルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サル個体において検出された多型を、ヒトにおいてCYP3Aファミリーに属する薬物代謝酵素をコードする遺伝子の多型と比較する工程をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって:
(a) サル個体において、CYP3A4をコードする遺伝子の多型1を検出する工程;
(b) サル個体において、CYP3A5をコードする遺伝子の多型2を検出する工程;
(c) 前記多型1が、CYP3A4の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;および
(d) 前記多型2が、CYP3A5の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;を含み、
前記多型2が、c.625A>T、c.1310G>Cおよびc.1437C>Gからなる群から選択される、方法。 - 前記多型1がCYP3A4の発現および/または機能を変化するものでなく、かつ、前記多型2がCYP3A5の発現および/または機能を変化するものである場合に、前記サル個体をモデル動物として選択する、請求項6に記載の方法。
- 前記多型2がc.625A>Tである、請求項7に記載の方法。
- ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって:
(a) サル個体において、CYP3A4をコードする遺伝子の多型1を検出する工程;
(b) サル個体において、CYP3A5をコードする遺伝子の多型2を検出する工程;
(c) 前記多型1が、CYP3A4の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;および
(d) 前記多型2が、CYP3A5の発現および/または機能を変化するものであるか評価する工程;を含み、
前記多型1がIVS3+1delG、c.485G>A、c.878T>A、c.886G>Aおよびc.1310G>Aからなる群から選択される、方法。 - 前記多型1がCYP3A4の発現および/または機能を変化するものであり、かつ、前記多型2がCYP3A5の発現および/または機能を変化するものでない場合に、前記サル個体をモデル動物として選択する、請求項9に記載の方法。
- 前記多型1がIVS3+1delGである、請求項10に記載の方法。
- ヒト用の医薬品候補化合物についての薬物動態、薬効および/または安全性を試験するために用いるモデル動物を選択する方法であって、
少なくとも2以上のサル集団のそれぞれについて、少なくとも2以上のサル個体において、CYP3A4またはCYP3A5をコードする遺伝子における多型を検出する工程;
検出された多型について、前記集団内におけるアレル頻度を算出する工程;および
算出されたアレル頻度を前記集団間で比較する工程を含み、
アレル頻度のより高いまたはより低いサル集団からのサル個体を、モデル動物として選択する方法であって、
前記多型が、CYP3A4をコードする遺伝子の多型であるIVS3+1delG、c.485G>A、c.878T>A、c.886G>A、およびc.1310G>AならびにCYP3A5をコードする遺伝子の多型であるc.625A>T、c.1310G>Cおよびc.1437C>Gからなる群から選択される、方法。 - ヒトまたはサルのCYP3A4およびCYP3A5の機能を評価するための試験に用いるモデル動物を作出する方法であって、
(i) CYP3A5をコードする遺伝子においてc.625A>Tをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程;および
(ii) 前記工程(i)で選択されたサル個体同士、または前記工程(i)で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程;
を含む方法。 - ヒトまたはサルのCYP3A4およびCYP3A5の機能を評価するための試験に用いるモデル動物を作出する方法であって、
(i') CYP3A4をコードする遺伝子においてIVS3+1delGをヘテロ接合体またはホモ接合体で有するサル個体を選択する工程;および
(ii') 前記工程(i')で選択されたサル個体同士、または前記工程(i')で選択されたサル個体と別のサル個体とを交配させる工程;
を含む方法。 - 薬物動態試験、薬効試験および/または安全性試験に用いられるモデル動物であって:
CYP3A4をコードする遺伝子においてIVS3+1delGをヘテロ接合体またはホモ接合体で有すること;および/または
CYP3A5をコードする遺伝子においてc.625A>Tをヘテロ接合体またはホモ接合体で有すること;
を特徴とするサル。
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