KR101643825B1 - 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법 - Google Patents

트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 이를 통해 종래 알려진 방법에 비해 효율적으로 엑소좀을 수득할 수 있으며, 관련 연구에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법 {Method for enhanced producing of stem cell-derived exosome using thrombin}
본 발명은 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법에 관한 것이다.
엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져있다. 특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀를 이용한 세포치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.
이에 본 발명자들은 상기와 같이 이용 가능성이 우수한 엑소좀의 생산 효율을 높이기 위한 방법에 대한 연구를 계속한 결과, 트롬빈을 이용할 경우 줄기세포 유래 엑소좀의 생성이 촉진됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트롬빈을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트롬빈을 이용한 줄기세포 유래 엑소좀 내 성장인자 발현 증진 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 트롬빈을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 내 성장인자 발현 증진 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 이를 통해 종래 알려진 방법에 비해 효율적으로 엑소좀을 수득할 수 있으며, 관련 연구에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀의 형태를 SEM 이미지를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀에서 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득한 줄기세포 유래 엑소좀에서 성장인자인 VEGF 및 HGF의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 트롬빈 처리 농도에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 LPS, H2O2 또는 트롬빈의 처리 농도에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 정도를 나타낸 도이다.
도 6은 트롬빈 처리에 의한 줄기세포 내 소포체의 형성 정도를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 트롬빈 처리에 의한 엑소좀 내 성장인자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법을 제공한다.
상기 트롬빈은 배지 내에 1 내지 1000 U/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 200 U/ml의 농도로 포함될 수 있다.
상기 배양 시간은 엑소좀이 생성될 수 있는 시간이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 12시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 "줄기세포"란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 "배지"는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 중간엽 줄기세포에 10 내지 100 U/ml의 트롬빈을 포함한 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)를 처리한 후 24시간 동안 배양하여 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진하였으며, 초고속원심분리를 통해 이를 분리하였다.
본 발명에 따른 방법은 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진시키는 우수한 효과를 가지고 있어, 이를 통해 종래 알려진 방법에 비해 효율적으로 엑소좀을 수득할 수 있다.
또한, 본 발명은 트롬빈을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진용 배지 조성물을 제공한다.
상기 트롬빈은 배지 내에 1 내지 1000 U/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 200 U/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 트롬빈 외에 공지된 엑소좀 생성 촉진 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 내 성장인자 발현 증진 방법을 제공한다.
본 발명에서 "성장인자"는 세포 분열이나 생장, 분화를 촉진하는 단백질성의 생리활성물질을 의미하는 것으로, 예를 들어, 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 유사인슐린 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF), 혈소판 유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 뼈 유래 성장인자(bone-derived growth factor, BDF), 콜로니 자극 인자(colony stimulation factor, CSF), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 각질세포 성장인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 등을 포함한다.
상기 성장인자는 바람직하게는 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF) 또는 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 유래 엑소좀의 분리
줄기세포 유래 엑소좀을 분리하기 위하여, 트롬빈 및 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 1×106개의 제대혈(umbilical cord blood) 유래 중간엽 줄기세포를 60 mm 배양접시(orange scientific cat# 4450200)에 분주 후 1주일간 배양하였다. 배양접시에 세포가 가득 증식된 것을 확인한 후, 농도별(10, 20, 50, 100 U/ml) 트롬빈(thrombin)이 희석되어있는 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)로 교체하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 원심 분리 튜브에 나누어 담아 4°C, 10000 rpm에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 부스러기(debris)를 제거하였다. 상기 상층액을 다시 4°C, 100,000 rpm에서 2시간 동안 초원심분리한 후, 상층액을 제거하고 엑소좀을 분리하였다(최종 농도: 15 μg/ml).
실시예 2. 줄기세포 유래 엑소좀의 확인
상기 실시예 1의 과정을 통해 분리한 엑소좀이 종래 공지된 엑소좀 고유의 특성을 가지고 있는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 분리된 엑소좀을 SEM 이미지를 통해 관찰하였으며, 웨스턴 블랏을 이용하여 알려진 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 확인하였다. 또한, 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 엑소좀 막을 용해한 후, 엑소좀 내의 단백질을 분리하고, Procarta immunoassay kit(affymatrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 엑소좀 내 성장인자인 HGF와 VEGF의 양을 측정하였다. 그 결과를 각각 도 1 내지 도 3에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1과 같은 방법을 통해 분리된 엑소좀은 약 100nm 지름의 구형을 나타내는 정상적인 형태를 보임을 확인하였다.
또한, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1과 같은 방법을 통해 분리된 엑소좀은 정상적으로 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9을 발현하고 있으며, 엑소좀 내에 성장인자인 VEGF 및 HGF가 존재함을 확인하였다.
실시예 3. 트롬빈 처리에 따른 엑소좀 생성 촉진 효과
3-1. 트롬빈 처리 농도에 따른 엑소좀 생성 정도 검증
트롬빈 처리 농도에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 정도를 확인하기 위하여, 줄기세포 배양 시 트롬빈의 농도를 달리하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하고 이를 정량하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 트롬빈의 처리 농도가 높아짐에 따라 줄기세포 유래 엑소좀의 생성이 유의하게 촉진됨을 확인하였다.
3-2. 트롬빈을 이용한 엑소좀 생성 촉진 방법의 효율성 검증
트롬빈을 이용한 엑소좀 생성 촉진 방법의 효율성을 검증하기 위하여, 트롬빈 대신 배양배지에 LPS 또는 H2O2를 처리한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하고 이를 정량하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 배양시 트롬빈을 처리할 경우, 다른 물질을 처리한 군에 비해 줄기세포 유래 엑소좀의 생성이 현저하게 증가함을 확인하였다.
3-3. 트롬빈 처리에 의한 줄기세포 내 소포체 형성 관찰
트롬빈 처리가 줄기세포 내 소포체의 형성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 50 U/ml의 트롬빈이 희석되어있는 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)에서 6 시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하고 이를 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리에 의해 줄기세포 내 소포체의 형성이 증가되며, 엑소좀의 분비가 유도됨을 확인하였다.
3-4. 트롬빈 처리에 의한 엑소좀 내 성장인자 발현 관찰
트롬빈 처리가 엑소좀 내 성장인자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 50 U/ml의 트롬빈이 희석되어있는 혈청프리-배양배지(MEM alpha media)에서 6 시간 동안 배양한 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 엑소좀을 분리하였다. 용해 완충액(lysis buffer)을 이용하여 엑소좀 막을 용해한 후, 엑소좀 내의 단백질을 분리하고, Procarta immunoassay kit(affymatrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 엑소좀 내 성장인자인 BDNF, FGF, HGF, NGF, IL-6 및 VEGF의 양을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리에 의해 엑소좀 내 성장인자인 BDNF, FGF, HGF, NGF, IL-6 및 VEGF의 발현이 증가됨을 확인하였다.
이상의 실험 결과를 통하여, 트롬빈을 이용하여 줄기세포 유래 엑소좀의 생성을 촉진시킬 수 있으며 엑소좀 내 성장인자의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 및 KnockOut DMEM으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 배지인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈은 배지 내에 1 내지 1000 U/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 12시간 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 트롬빈을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀의 생성 촉진용 배지 조성물.
  9. 줄기세포를 트롬빈을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 내 성장인자 발현 증진 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 성장인자는 뇌 유래 신경 성장인자(brain-derived neurotropic factor, BDNF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF) 및 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190063453A (ko) 2019-01-15 2019-06-07 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
KR101980453B1 (ko) 2017-11-29 2019-08-30 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
WO2020222503A1 (ko) * 2019-04-29 2020-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
KR20240019971A (ko) 2022-08-05 2024-02-14 주식회사 엠제이바이오젠 엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015142061A1 (ko) * 2014-03-18 2015-09-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌 염증성 질환의 치료용 조성물
EP4218780A1 (en) * 2015-06-12 2023-08-02 Hudson Institute of Medical Research Allogeneic mammalian amniotic exosomes for treating diseases
KR20170085010A (ko) * 2016-01-12 2017-07-21 주식회사 강스템바이오텍 고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀
KR101843634B1 (ko) 2016-04-15 2018-03-30 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 만성폐질환 치료용 조성물
WO2017188614A1 (ko) * 2016-04-27 2017-11-02 사회복지법인 삼성생명공익재단 미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법
KR101860266B1 (ko) * 2016-07-01 2018-05-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
WO2018004237A1 (ko) * 2016-07-01 2018-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
TWI601741B (zh) * 2016-07-11 2017-10-11 財團法人國家衛生研究院 利用前列腺素受體ｅｐ４－拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法及其應用
CN109562129B (zh) * 2016-08-05 2023-02-17 胞外体干细胞株式会社 含有从脂肪来源的干细胞分离的外排体作为活性成分的用于预防或治疗肺纤维化的组合物
KR101973284B1 (ko) * 2017-01-16 2019-04-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 신생아 ｈｉｅ 치료용 조성물
CN106676064A (zh) * 2017-01-20 2017-05-17 深圳中健生物技术有限公司 一种脐带血间充质干细胞培养液
WO2018226051A2 (ko) * 2017-06-07 2018-12-13 주식회사 엑소스템텍 인간줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포 배양용 무혈청 배지 조성물
CN107349220A (zh) * 2017-07-26 2017-11-17 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种包含成纤维细胞外泌体的制剂及其用途
WO2019040790A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Merakris Therapeutics, Llc COMPOSITIONS CONTAINING AMNIOTIC COMPONENTS AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE
KR20200098600A (ko) * 2017-12-14 2020-08-20 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 정제된 엑소좀 생성물, 제조 방법 및 사용 방법
CN108823159B (zh) * 2018-07-13 2022-08-09 上海齐昔生物科技集团有限公司 Pdgf-bb对间充质干细胞释放的外泌体的影响
WO2020204161A1 (ja) 2019-04-04 2020-10-08 日産化学株式会社 細胞外小胞の分泌を促進するための組成物
KR102268589B1 (ko) * 2019-04-29 2021-06-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
EP4066816A4 (en) 2019-11-28 2024-03-06 Exogenique Co Ltd NEW USE OF MILK EXOSOMES
JP6967308B1 (ja) * 2020-06-30 2021-11-17 国立大学法人高知大学 胎児付属物由来組織細胞培養上清を含む脳神経障害治療剤
WO2022218443A1 (zh) * 2021-04-16 2022-10-20 卓越细胞工程(香港)有限公司 间充质干细胞来源的外泌体治疗脑卒中的方法和组合物
WO2023080413A1 (ko) * 2021-11-02 2023-05-11 주식회사 디자인셀 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN114904043B (zh) * 2022-04-28 2023-07-21 深圳市儿童医院 复合水凝胶及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012125471A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to mesenchymal stem cell exosomes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060084082A1 (en) * 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
CA2403508A1 (en) * 2000-04-18 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US8537656B2 (en) 2000-07-19 2013-09-17 Ipr Licensing, Inc. Method for compensating for multi-path of a CDMA reverse link utilizing an orthogonal channel structure
PL378334A1 (pl) * 2002-12-13 2006-03-20 Celogos Kompozycja podłoża hodowlanego, sposób hodowli i sposób produkcji mioblastów, oraz ich zastosowanie
US8518390B2 (en) * 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
WO2005105985A1 (en) 2004-05-03 2005-11-10 Peter Maccallum Cancer Institute Methods for stem cell expansion and differentiation
US8034762B2 (en) * 2004-09-02 2011-10-11 Cognosci, Inc. Treatment of subarachnoid hemorrhage with Apo E analogs
CA2623950C (en) 2005-09-30 2016-01-26 Tobishi Pharmaceutical Co., Ltd. Activating agent of stem cells and/or progenitor cells
WO2007049096A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) A method of expansion of endothelial progenitor cells
KR100926975B1 (ko) * 2007-08-01 2009-11-17 리젠프라임 주식회사 알지네이트로 코팅된 피브린／ｈａ 혼합체 스캐폴드를이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법
KR101903049B1 (ko) * 2008-08-20 2018-11-07 안트로제네시스 코포레이션 단리된 태반 세포를 사용한 혈종 또는 혈관경련수축 치료
AU2009316541B2 (en) * 2008-11-19 2015-08-06 Celularity Inc. Amnion derived adherent cells
KR20100116812A (ko) * 2009-04-23 2010-11-02 서울대학교산학협력단 세포응집을 이용한 심장줄기세포의 유도, 배양 방법 및 이 방법에 의해 제조된 줄기세포
US20150045298A1 (en) 2011-08-16 2015-02-12 Samsung Life Public Welfare Foundation Composition including stem cell-derived microvesicles for promoting neurogenesis
WO2013039000A1 (ja) 2011-09-13 2013-03-21 Ochiya Takahiro アルツハイマー病の予防または治療のための医薬品
SI3321355T1 (sl) 2011-12-30 2021-11-30 Amit Patel Postopki in sestavki za klinično izpeljavo alogenske celice in terapevtske uporabe
WO2013150303A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
US20130273011A1 (en) 2012-04-17 2013-10-17 Medistem, Inc. Stem cells and stem cell generated nanoparticles for treatment of inflammatory conditions and acute radiation syndrome
KR20150059168A (ko) 2012-07-19 2015-05-29 레뉴런 리미티드 줄기 세포 마이크로입자
US20140056842A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Jonathan Sackner-Bernstein Cellular therapeutic approaches to traumatic brain and spinal cord injury

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012125471A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to mesenchymal stem cell exosomes

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101980453B1 (ko) 2017-11-29 2019-08-30 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
KR20190063453A (ko) 2019-01-15 2019-06-07 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
WO2020222503A1 (ko) * 2019-04-29 2020-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
KR20240019971A (ko) 2022-08-05 2024-02-14 주식회사 엠제이바이오젠 엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법

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