JP2017500033A - トロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法 - Google Patents
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Abstract
Description
幹細胞由来のエキソソームを分離するために、トロンビンおよび超遠心分離機(Ultracentrifuge)を利用した。より具体的に、1×106個の臍帯血(umbilical cord blood)由来間葉系幹細胞を60mm培養皿(orange scientific cat# 4450200)に分注した後、1週間の間培養した。培養皿に細胞がいっぱいに増殖したのを確認した後、濃度別(10、20、50、100U/ml)トロンビン(thrombin)が希釈されている血清フリー培養培地(MEM alpha media)に取り替え、さらに24時間の間培養した。その後、培養液を遠心分離チューブに分けて入れて4℃、10000rpmで30分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して細胞破片(debris)を除去した。前記上澄み液を再び4℃、100、000rpmで2時間の間超遠心分離した後、上澄み液を除去してエキソソームを分離した(最終濃度:15μg/ml)。
前記実施例1の過程を通じて分離したエキソソームが従来の公知のエキソソーム固有の特性を有しているかを確認するために、下記のような実験を遂行した。まず、分離したエキソソームをSEMイメージを通じて観察し、ウェスタンブロットを利用して公知のエキソソームマーカーであるCD63およびCD9(System Bioscience、Mountain View、CA、USA)の発現を確認した。また、溶解緩衝液(lysis buffer)を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Procarta immunoassay kit(affymatrix、Santa Clara、CA、USA)を利用してエキソソーム内成長因子であるHGFとVEGFの量を測定した。その結果をそれぞれ図1〜図3に示した。
また、図2および図3に示した通り、前記実施例1と同じ方法を通じて分離したエキソソームは正常にエキソソームマーカーであるCD63およびCD9を発現しており、エキソソーム内に成長因子であるVEGFおよびHGFが存在することを確認した。
3−1.トロンビン処理濃度によるエキソソーム生成程度検証
トロンビン処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を確認するために、幹細胞培養時にトロンビンの濃度を異ならせて前記実施例1と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図4に示した。
トロンビンを利用したエキソソーム生成促進方法の効率性を検証するために、トロンビンの代わりに培養培地にLPSまたはH2O2を処理したことを除いては前記実施例1と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図5に示した。
トロンビン処理が幹細胞内小胞体の形成に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を50U/mlのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地(MEM alpha media)で6時間の間培養した後、前記実施例1と同じ方法でエキソソームを分離してこれを電子顕微鏡で観察した。その結果を図6に示した。
トロンビン処理がエキソソーム内成長因子の発現に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を50U/mlのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地(MEM alpha media)で6時間の間培養した後、前記実施例1と同じ方法でエキソソームを分離した。溶解緩衝液(lysis buffer)を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Procarta immunoassay kit(affymatrix、Santa Clara、CA、USA)を利用してエキソソーム内成長因子であるBDNF、FGF、HGF、NGF、IL−6およびVEGFの量を測定した。その結果を図7に示した。
Claims (10)
- 幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む、幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法。
- 前記幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞および羊膜上皮細胞で構成された群から選択される1種以上の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される1種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 前記培地はDMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、MEM (Minimal Essential Medium)、BME (Basal Medium Eagle)、RPMI 1640、DMEM/F−10(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F−10)、DMEM/F−12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F−12)、α−MEM(α−Minimal essential Medium)、G−MEM(Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMDM(Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium)、およびKnockOut DMEMからなる群から選択された1種以上の培地であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記トロンビンは培地内に1〜1000U/mlの濃度で含まれることを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養は12時間〜48時間の間実行されることを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれか一項に記載の方法。
- トロンビンを含む、幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物。
- 幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む、幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法。
- 前記成長因子は脳由来神経成長因子(brain−derived neurotropic factor、BDNF)、繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor、FGF)、肝細胞成長因子(hepatocyte growth factor、HGF)、神経成長因子(nerve growth factor、NGF)および血管上皮成長因子(vascular endothelial growth factor、VEGF)からなる群から選択された1種以上であることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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