WO2020222503A1 - 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법 - Google Patents

단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법 Download PDF

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장윤실
박원순
성동경
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Definitions

  • the present invention is a method for selecting stem cells having a high efficiency generation ability of extracellular vesicles, comprising measuring the activity of a protease-activated receptor (PAR)-mediated signaling pathway, stem cells and extracellular vesicles selected by the method It relates to a method for screening the production inducing agent.
  • PAR protease-activated receptor
  • Extracellular vesicles have a diameter of 40-150 nm and are secretory membrane vesicles secreted by various cells. Extracellular vesicles contain numerous proteins, lipids, and RNAs similar to those present in cells of origin, and have been recognized as important messengers for intercellular communication through the delivery of various factors contained therein. Recent studies have shown that the treatment of mesenchymal stem cells (MSCs) in various diseases such as cardiovascular disease, lung injury, acute kidney injury, fetal hypoxic ischemic brain injury, skin wound treatment, and hypoxic pulmonary hypertension.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • the present inventors have confirmed the effect of increasing the biosynthesis of extracellular vesicles and the concentration of internal substances as a result of pretreating thrombin to mesenchymal stem cells through previous studies.
  • the molecular mechanism through which thrombin treatment induces the above effect has not been clearly identified.
  • thrombin treatment as described above through the PAR (Protease-Activated Receptor) mediated signaling pathway. It was confirmed in detail that the effect was induced, and the present invention was completed based on this.
  • PAR Protease-Activated Receptor
  • the present invention selects stem cells having a high efficiency generation ability of extracellular vesicles, comprising measuring the degree of activation of a signaling pathway mediated by protease activated receptors (PAR) in stem cells. It aims to provide a method.
  • PAR protease activated receptors
  • Another object of the present invention is to provide a stem cell having the ability to produce highly efficient extracellular vesicles selected by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening an agent for enhancing the production of extracellular vesicles of stem cells.
  • the present invention comprises the step of measuring the activity level of the signaling pathway mediated by protease activated receptors (PAR), extracellular vesicles It provides a method for selecting stem cells with high efficiency generating ability.
  • PAR protease activated receptors
  • the present invention provides a stem cell having a high-efficiency generation ability of extracellular vesicles, selected through the above method.
  • the step of measuring the activity level of the PAR-mediated signaling pathway may include the following steps.
  • Ras-related protein Rab-5 Ras-related protein Rab-5 (Rab-5), early endosome antigen-1 (EEA-1), and Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/p-ERK1/2 in the thrombin-treated stem cells 2) measuring the expression level of at least one selected from the group consisting of and p-AKT (Phospho-Protein kinase B);
  • p-AKT Phospho-Protein kinase B
  • stem cells having the increased expression level as stem cells having the ability to produce highly efficient extracellular vesicles.
  • the PAR may be PAR1 or PAR3.
  • the highly efficient production ability of the extracellular vesicles may be that the amount of extracellular vesicles produced or the content of proteins in the extracellular vesicles is enhanced.
  • the protein is vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), angiogenin, and angiopoietin-1 ( angiopoietin-1) may be one or more selected from the group consisting of.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • angiogenin angiogenin
  • angiopoietin-1 angiopoietin-1
  • the stem cells may be embryonic stem cells or adult stem cells.
  • the adult stem cells are one or more selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, and multipotent stem cells. I can.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from at least one tissue selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, skin, amniotic membrane and placenta.
  • the thrombin may be treated with 1 to 10 U/mL.
  • the present invention provides a method for screening an agent for enhancing the production of extracellular vesicles of stem cells, including the following steps.
  • the generation of extracellular vesicles and the level of proteins in the vesicles remarkably increase in the stem cells through the PAR (Protease-activated receptors)-mediated signaling pathway.
  • PAR Protease-activated receptors
  • 1A is a result of analyzing the production level of extracellular vesicles in a group that was not treated with thrombin in mesenchymal stem cells (naive) or treated by concentration (1, 2, 4U/mL).
  • FIG. 1B shows proteins (VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1 and HGF) contained in extracellular vesicles in a group that was not treated with thrombin (naive) or treated by concentration (1, 2, 4U/mL) in mesenchymal stem cells. This is the result of analyzing the level of ).
  • 1C is a fluorescence image and a quantitative result of analyzing the initial endosome difference according to the presence or absence of thrombin treatment by labeling the initial endosome in mesenchymal stem cells with GFP.
  • 1D is a scanning electron microscope (SEM) and a transmission electron microscope (TEM) observation of extracellular vesicles isolated from mesenchymal stem cells (naive) not treated with thrombin and mesenchymal stem cells (Thrombin) pretreated with thrombin, respectively.
  • SEM scanning electron microscope
  • TEM transmission electron microscope
  • 1E is a result of measuring the diameter and number of each extracellular vesicle isolated from the same group as in FIG. 1D.
  • Figure 1f shows exosome-specific markers CD9, CD63 and CD81, mitochondrial marker cytochrome c (Cytochrome c), nuclear marker fibrillarin in each extracellular vesicle isolated from the same group as in FIG. This is the result of confirming the expression of GM130, a Golgi apparatus marker, through immunoblotting analysis.
  • Figure 2a is a result of measuring the expression levels of PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4 in mesenchymal stem cells not treated with thrombin and mesenchymal stem cells pretreated with thrombin, and quantitative results of PAR1 and PAR3.
  • 2B is a measurement of PAR1 and PAR3 expression levels in mesenchymal stem cells not treated with thrombin (naive), PAR3 specific siRNA treated group (PAR3 siRNA), and control siRNA treated group (Scrambled siRNA), respectively These are the results and the results of quantification.
  • 3A is a result of measuring the expression level of endosome markers (Rab-5, EEA-1) according to the presence or absence of thrombin treatment in mesenchymal stem cells.
  • 3B is a result of measuring the expression levels of ERK1/2, AKT, and their phosphorylated forms of pERK1/2 and pAKT proteins according to the presence or absence of thrombin treatment in mesenchymal stem cells.
  • 4A is a group in which the mesenchymal stem cells were not treated with thrombin (naive), the group pretreated with thrombin (Thrombin), the group treated with SCH79797, a PAR1-specific inhibitor after pretreatment with thrombin (Thrombin + SCH79797), and thrombin.
  • Endosomal markers (Rab-5, EEA-) in the group treated with PAR3-specific siRNA after pretreatment (Thrombin+PAR3 siRNA) and the group treated with both SCH79797 and PAR3 siRNA (Thrombin+SCH79797+PAR3 siRNA) after pretreatment with thrombin. This is the result of analyzing the expression level of 1).
  • 4B is a result of analyzing the expression levels of pERK1/2, pAKT, ERK1/2, and AKT proteins in the same group as in FIG. 4A.
  • 5A is a fluorescence image of measuring the number of endosomes in the same group as in FIG. 4A after labeling endosomes in mesenchymal stem cells with GFP and staining the nuclei with DAPI, respectively, and a quantitative result thereof.
  • 5B is a result of measuring the number of extracellular vesicles in each group identical to that of FIG. 4A.
  • 5C is a result of measuring the size and number distribution of extracellular vesicles in each group identical to that of FIG. 4A.
  • 5D is a result of measuring the levels of proteins (VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1, and HGF) in extracellular vesicles through ELISA in each of the same groups as in FIG. 4A.
  • proteins VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1, and HGF
  • thrombin treatment as described above through the PAR (Protease-Activated Receptor) mediated signaling pathway. It was confirmed in detail that the effect was induced, and the present invention was completed based on this.
  • PAR Protease-Activated Receptor
  • the present invention provides a method for screening stem cells having high efficiency generation ability of extracellular vesicles, comprising measuring the level of activity of a signaling pathway mediated by protease activated receptors (PAR). .
  • PAR protease activated receptors
  • the present invention provides a stem cell having the ability to generate highly efficient extracellular vesicles, selected by the above method.
  • the step of measuring the activity level of the PAR-mediated signaling pathway comprises the steps of: (a) treating thrombin after stem cell culture; (b) Ras-related protein Rab-5 (Rab-5), early endosome antigen-1 (EEA-1), and Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/p-ERK1/2 in the thrombin-treated stem cells 2) measuring the expression level of one or more selected from the group consisting of and p-AKT (Phospho-Protein kinase B); And (c) selecting the stem cells having the increased expression level as stem cells having the ability to produce highly efficient extracellular vesicles.
  • PAR Protein activated receptors
  • PAR is a subfamily of related G protein-coupled receptors that are activated by partial cleavage of the extracellular domain, and platelets, endothelial cells, myocytes and It is known to be highly expressed in neurons.
  • PAR is a subfamily of related G protein-coupled receptors that are activated by partial cleavage of the extracellular domain, and platelets, endothelial cells, myocytes and It is known to be highly expressed in neurons.
  • PAR There are four types of PAR, PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4, and are classified according to the major enzymes that can activate them.
  • PAR is involved in the regulation of vascular tone and permeability, and in vascular smooth muscle, it mediates contraction, proliferation and hypertrophy.
  • PAR of endothelial cells provides a positive signal for endothelial adhesion molecules such as VCAM-1, ICAM-1 and E-selectin, and is known to contribute to the inflammatory response. Recently, muscle growth and bone cell differentiation and proliferation It has been reported that it is related to.
  • PAR mediates the high-efficiency generation ability of extracellular vesicles in stem cells, preferably PAR1 or PAR3-mediated signaling pathways are involved, and more preferably, PAR1 is more effective in producing highly efficient extracellular vesicles of stem cells than PAR3. It was confirmed through specific examples that had a greater effect.
  • the present invention confirmed that the PAR-mediated signaling pathway has an important effect on the highly efficient production of extracellular vesicles of stem cells.
  • the effect of pretreatment of thrombin on the generation of extracellular vesicles in stem cells, protein levels in extracellular vesicles, and properties thereof was analyzed through various experiments.
  • the amount of extracellular vesicle production increased by more than 5 times and the level of protein content inside the extracellular vesicle increased by more than 2 times in proportion to the thrombin treatment concentration.
  • thrombin treatment significantly increased the level of early endosomes in stem cells (see Example 2).
  • mesenchymal stem cells express PAR1 and PAR3 receptors regardless of the treatment with or without thrombin (see Example 3).
  • the PAR signaling pathway mediates the production of extracellular vesicles induced by thrombin treatment, the increase of the internal protein content, and the increase in phosphorylation of endosome markers, ERK1/2, and AKT.
  • PAR1 and PAR3-mediated signaling pathways are involved in inducing the effect, and in particular, PAR1 has a more important effect than PAR3. Confirmed (see Example 5).
  • step (b) a known method capable of measuring the expression level of a protein in the relevant technical field can be appropriately selected and used by a person skilled in the art. Specifically, western blotting, radiation Immunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony , Complement fixation assay (complement fixation assay) and protein chip (protein chip) can be measured through one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the ability to produce highly efficient extracellular vesicles is preferably an increase in the amount of extracellular vesicles produced from stem cells and/or an increase in the level of proteins in the extracellular vesicles produced from the stem cells. it means.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • angiogenin angiopoietin-1
  • angiopoietin-1 angiopoietin-1
  • stem cell refers to a cell that has the ability to differentiate into two or more different types of cells while having self-replicating ability as undifferentiated cells.
  • the stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, may be derived from any type of animal including humans and non-human mammals, and whether the stem cells are derived from adults or embryos are not limited thereto. Does not.
  • the stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, and are preferably adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells derived from human tissue, mesenchymal stem cells derived from human tissue, and multipotent stem cells, preferably mesenchymal stem cells, but limited thereto. It doesn't work.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, skin, amniotic membrane, or placenta, and may preferably be derived from umbilical cord blood, but are not limited thereto.
  • the stem cells can be appropriately selected and used by a person skilled in the art according to a method known in the art.
  • the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were specifically cultured in ⁇ -MEM medium, but the present invention is not limited thereto.
  • the method of treating thrombin is not specifically limited, but is preferably added to a medium and stem cells are added to the medium for 2 to 10 hours, preferably 4 to 8 hours, more preferably 5 to 7 hours, most preferably Can be achieved by incubating for 6 hours.
  • Thrombin may be included in the medium at a concentration of 1 to 10 U/ml, preferably 1 to 5 U/ml, more preferably 2 to 4 U/mL.
  • the present invention comprises the steps of: (a) treating a stem cell with a candidate substance; (b) measuring the level of activity of a signaling pathway mediated by protease activated receptors (PAR); And (c) selecting a substance that increases the activity of the PAR-mediated signaling pathway as an inducing agent for promoting extracellular vesicle generation. It provides a screening method for an agent for enhancing extracellular vesicle production of stem cells. .
  • the candidate material may be selected from the group consisting of a compound, a microorganism culture solution or extract, a natural product extract, a nucleic acid, and a peptide
  • the nucleic acid is siRNA, shRNA, microRNA, antisense RNA, aptamer , Locked nucleic acid (LNA), peptide nucleic acid (PNA), and may be selected from the group consisting of morpholino, but is not limited thereto.
  • MSC Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells were first prepared with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco), 100 units/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin (Invitrogen , Carlsbad, CA, USA) supplemented with ⁇ -MEM (Gibco, Grand Island, NY, USA) was cultured under standard culture conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 units/mL
  • streptomycin Invitrogen , Carlsbad, CA, USA
  • ⁇ -MEM Gibco, Grand Island, NY, USA
  • the cells When the cells occupy about 90% of the culture plate area, the cells are washed three times with phosphate buffered saline (PBS) to remove contaminated FBS-derived exosomes, and then human recombinant thrombin (1, 2 and 4U/mL; Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) was incubated for 6 hours in new serum-free ⁇ -MEM supplemented. Then, the medium was recovered, and about 2 ⁇ 10 6 cells per 100 mm culture dish were counted using the Luna-FLTM system (Logos Biosystems, Anyang-si, Korea).
  • PBS phosphate buffered saline
  • EVs extracellular vesicles secreted from umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells pretreated with thrombin according to the method of Example 1-1
  • an experiment was conducted according to the following procedure. Specifically, the recovered medium was centrifuged at 3000 rpm at 4°C for 30 minutes to remove cell debris, and then centrifuged again at 4°C at 100,000 rpm for 120 minutes to precipitate EVs. Thereafter, the precipitated pellet was washed twice, resuspended in sterilized PBS, and then stored at -80°C until use.
  • the distribution of EVs was analyzed by measuring Brownian motion velocity using NanoSight (NanoSight NS300; Malvern, Worcestershire, UK) equipped with fast video capture and particle tracking software.
  • the obtained EVs were resuspended in PBS (500 ⁇ l, 1 mg/mL total protein), and size and polydispersity were measured.
  • PBS 500 ⁇ l, 1 mg/mL total protein
  • size and polydispersity were measured.
  • cells were counted using the LUNA-FL system according to the manufacturer's protocol using the medium recovered above. The number of EVs produced by single cells was calculated by dividing the total number of EVs by the number of cells.
  • EVs (5 ⁇ l) were fixed with 2% glutaraldehyde, and loaded on a 200-mesh formvar/carbon-coated electron microscope grid (Electron Microscopy Sciences, Washington, PA, USA). Incubate for minutes. Then, it was washed with filtered distilled water and stained with 2% uranyl acetate in water for 1 minute. After that, an image was obtained after observation using a Tecnai Spirit G2 transmission electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA) operating at 120 kV.
  • FEI Tecnai Spirit G2 transmission electron microscope
  • EVs were fixed with 2.5% glutaraldehyde and loaded onto a polycarbonate membrane.
  • the membrane was washed once with PBS and water and then dehydrated with acetone. Then, acetone was removed by critical point drying using liquid carbon dioxide.
  • the sample was mounted on an aluminum stub with carbon tape and mounted on an SEM stub. After sputter coating with 3-5 nm platinum, the sample was observed with a scanning electron microscope (Zeiss Auriga Workstation, Oberkochen, Germany) to obtain an image.
  • SCH79797 (N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3,2-f]quinazoline-1,3-diamine dihydro, a selective PAR1 antagonist Chloride) (N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3,2-f]quinazoline-1,3-diamine dihydrochloride) from Tocris (Bristol, UK) Got it. Thereafter, in order to treat the material to the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, the SCH79797 was added to the culture medium at a concentration of 1 ⁇ M 1 hour before thrombin treatment.
  • siRNA and PAR3 siRNA were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
  • GFP Cell Light ® reagent-green fluorescent protein
  • BacMam 2.0 Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA
  • mesenchymal stem cells were dispensed into a 12-well plate at a density of 1.5 x 10 4 per well, and BacMam 2.0 reagent was added at a concentration of 40 particles per cell (PPC) after the cells were attached.
  • PPC particles per cell
  • Rab5a-GFP expression early endosomes were labeled using Cell Light® Early endosomes-GFP, BacMam 2.0. Thereafter, in order to estimate the number of endosomes labeled with GFP, the optical density of green immunofluorescence was measured using ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
  • RIPA buffer Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • RIPA buffer Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
  • the amount of protein in the lysate was quantified by the Bradford method, and a sample containing 10 ⁇ g of protein was mixed with a loading buffer containing ⁇ -mercaptoethanol, heated for 10 minutes, and 12% SDS-polyacrylamide gel Proteins were separated by size through electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the separated protein was transferred to a nitrocellulose membrane, and then a 5% bovine serum albumin (BSA) solution was prepared with 1x PBS-T containing 0.5% Tween-20, and the membrane was treated to perform a blocking process at room temperature.
  • the primary antibody was treated and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the membrane was washed with 1x PBS-T, and then incubated with anti-mouse or anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated immunoglobulin G (1:2000) secondary antibody at room temperature for 1 hour while stirring.
  • protein bands were detected using ECL Select chemiluminescence reagent (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA), and band images were obtained with an X-ray film.
  • Example 2 Analysis of the effect of thrombin pretreatment on the synthesis, protein level and properties of EVs
  • the present inventors conducted the following experiments to analyze the effect of thrombin pretreatment for mesenchymal stem cells on EVs synthesis, protein levels present in EVs, and EVs characteristics.
  • Example 1-1 the concentration of thrombin was varied at 1-4 U/mL to treat mesenchymal stem cells, and the amount of EVs was analyzed according to the method of Example 1-2.
  • the amount of EV production increased depending on the thrombin concentration, and in particular, it was found that the amount of EV production increased significantly at the concentrations of 2 and 4U/mL.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the present inventors compared the mesenchymal stem cells (Naive) not treated with thrombin and mesenchymal stem cells (Thrombin) pretreated with thrombin by labeling the early endosomes in the stem cells with green fluorescence using the CellLight Early Endosomes-GFP kit. I did. Specifically, as a result of comparing the difference in endosomes between the two cells through fluorescence images and quantitative results thereof, a remarkably high level of early endosomes was observed in stem cells pretreated with thrombin as shown in FIG. 1C.
  • Example 1-3 In addition, in order to compare the difference in EVs according to the pretreatment of thrombin, EVs separated by a scanning electron microscope and a transmission electron microscope were observed according to the method of Example 1-3. As a result, more EVs were observed in mesenchymal stem cells pretreated with thrombin compared to mesenchymal stem cells not treated with thrombin, as can be seen in FIG. 1D.
  • the size was measured for each EVs isolated from the mesenchymal stem cells not treated with thrombin and the mesenchymal stem cells pretreated with thrombin. As a result, as shown in FIG. 1E, it was confirmed that the EVs isolated from each of the cells had the same size by showing a peak at 100 nm. However, it was confirmed that the number of isolated EVs was much higher in the mesenchymal stem cells pretreated with thrombin.
  • Example 2 Based on the results of Example 2, the present inventors performed immunoblotting analysis according to the method of Example 1-7 to determine whether mesenchymal stem cells express thrombin receptors. Specifically, the expression levels of PAR1, PAR2, PAR3 and PAR4 proteins were analyzed for each of the mesenchymal stem cells not treated with thrombin and the mesenchymal stem cells pretreated with thrombin. As a result, as shown in Fig. 2a, it was found that the mesenchymal stem cells expressed PAR1 and PAR3 and not PAR2 and PAR4 regardless of the treatment with thrombin. This suggests that thrombin pretreatment can affect mesenchymal stem cells through PAR1 and PAR3.
  • PAR3-specific siRNA PAR3 siRNA
  • control siRNA Scmbled siRNA
  • Fig. 2b when the PAR3 siRNA was treated, the expression level of PAR1 was not changed and only the expression of PAR3 was specifically inhibited, and when the control siRNA was treated, both PAR1 and PAR3 were expressed. It was confirmed that there was no change in.
  • the PAR3 siRNA used in this example specifically inhibited only the expression of PAR3.
  • Example 2 Based on the results of Example 2, the present inventors analyzed the change in the expression level of early endosome markers (Rab-5 and EEA-1) in mesenchymal stem cells with or without thrombin pretreatment by immunoblotting. As a result, as shown in Figure 3a, when thrombin was treated, it was confirmed that the expression levels of the initial endosome markers Rab-5 and EEA-1 were significantly increased.
  • ERK1/2 and AKT signaling pathways with or without thrombin treatment in mesenchymal stem cells according to the present invention
  • phosphorylation levels of ERK1/2 and AKT were analyzed.
  • the expression of pERK1/2 and pAKT proteins was significantly increased in the mesenchymal stem cells pretreated with thrombin as compared to the mesenchymal stem cells not treated with thrombin, as shown in FIG. 3B.
  • non-phosphorylated forms of ERK1/2 and AKT were not statistically significant, but showed a tendency to slightly increase their expression by thrombin treatment.
  • the present inventors treated mesenchymal stem cells pretreated with thrombin with SCH79797, a PAR1-specific antagonist, or PAR3-specific siRNA. After transfection or treatment with the two substances together, the expression levels of Rab-5 and EEA-1 were analyzed, respectively. As a result, as shown in FIG. 4A, Rab-5 and EEA- both in the SCH79797-treated group (Thrombin+SCH79797) and the PAR3 siRNA-treated group (Thrombin+PAR3 siRNA) compared to the thrombin-only pretreated group (Thrombin), respectively. It was found that the expression level of 1 was significantly reduced.
  • SCH79797 and/or PAR-3 specific siRNA were treated in mesenchymal stem cells pretreated with thrombin.
  • the increase in phosphorylation of ERK1/2 and AKT by thrombin pretreatment was significantly suppressed in the group treated with SCH79797 and PAR3 siRNA, respectively, and when treated with PAR-3 specific siRNA It was suppressed to a more significant level when SCH79797 was treated.
  • the two substances were most significantly inhibited when they were treated together.
  • thrombin-pretreated mesenchymal stem cells were transfected with PAR1-specific antagonist SCH79797 and/or PAR3-specific siRNA.
  • the endosomes were labeled with green fluorescence using the CellLight Early Endosomes-GFP kit after thrombin pretreatment. Subsequently, as a result of analyzing the fluorescence image and the quantitative result thereof, as shown in FIG. 5A, the increase in the number of initial endosomes by thrombin treatment was significantly suppressed in the groups treated with SCH79797 and PAR3 siRNA, respectively. In addition, it was confirmed that it was significantly suppressed by SCH79797 treatment than by PAR3 siRNA transfection, and was suppressed to the highest level when SCH79797 and PAR3 siRNA were treated together.
  • the degree of increase in the number of extracellular vesicles was compared in the umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell culture medium of the same group as above.
  • the increase in the number of extracellular vesicles by thrombin treatment was significantly suppressed in the groups treated with SCH79797 and PAR3 siRNA, respectively, and treated with SCH79797 compared to the case of transfection with PAR3 siRNA.
  • the change in the level of protein in EVs was analyzed by treatment with the PAR inhibitor. Specifically, as a result of measuring VEGF, angiogenin, angiopoietin-1, and HGF levels, respectively, as can be seen in FIG. It was suppressed, and it was confirmed that when SCH79797 was treated than when transfected with PAR3 siRNA, it was suppressed to a higher level, and when the two substances were treated together, it was confirmed that the suppression was at the highest level.
  • PAR-1 mediated signaling is strongly involved in EV production and increased cargo protein levels by thrombin pretreatment stimulation, and PAR3 signaling is partially involved.
  • the stem cells selected by this method can be usefully used for various purposes in basic research and clinical fields.
  • a new substance can be discovered by screening an agent for promoting extracellular vesicle generation. It can be usefully used to produce stem cells having high efficiency generation ability of extracellular vesicles that can be used in the field.

Abstract

본 발명은 단백질분해효소 활성 수용체(PAR) 매개 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법, 상기 방법에 의해 선별된 줄기세포 및 세포외 소포의 생성 유도제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 줄기세포에 트롬빈을 전처리하면 PAR(Protease-activated receptors) 매개 신호전달 경로를 통해 상기 줄기세포에서 세포외 소포의 생성 및 상기 소포 내 단백질의 수준이 현저히 증가하는바, 줄기세포에 트롬빈을 처리하고 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 정도를 측정함으로써 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 효율적으로 선별할 수 있으며, 이러한 방법에 의해 선별된 줄기세포는 관련 연구 및 임상 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
본 발명은 단백질분해효소 활성 수용체(PAR) 매개 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법, 상기 방법에 의해 선별된 줄기세포 및 세포외 소포의 생성 유도제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포외 소포(Extracellular vesicles; EVs)는 40-150nm의 직경을 가지며, 다양한 세포에서 분비되는 분비 막 소포이다. 세포외 소포는 기원 세포에 존재하는 것과 유사한 수많은 단백질, 지질 및 RNA를 함유하며, 내부에 포함된 다양한 인자들의 전달을 통해 세포 간 소통을 위한 중요한 메신저로 인식되어 왔다. 최근 연구에 따르면, 심혈관계 질환, 폐손상, 급성 신장 손상, 태아의 저산소성 허혈성 뇌 손상, 피부 상처 치료 및 저산소성 폐고혈압과 같은 다양한 질환에서 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cells; MSCs)의 치료 효능이 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포를 통한 mRNAs, 마이크로RNA(miRNA), 및 단백질의 전달에 의해 주로 매개된다고 보고되어 왔다(Circulation 2012, 126, 2601-2611.). 중간엽 줄기세포 자체를 이식하는 치료법에 비해 중간엽 줄기세포 유래 세포외 소포를 이용한 요법의 주요 이점은 세포외 소포가 세포 자체를 이용한 치료의 한계점을 극복할 수 있다는 것이다. 또한, 중간엽 줄기세포와 비교하여 세포외 소포는 생물학적 기능의 소실 없이 보관이 가능하여 “off the shelf” 의약품으로 사용하기에 더욱 적합하다. 그러나 세포외 소포의 이러한 장점에도 불구하고, 중간엽 줄기세포에서 소량만이 분비되며, 결과적으로 낮은 치료 효능은 세포외 소포의 임상 적용을 위해 극복해야 할 문제로 꼽힌다.
이러한 측면에서, 본 발명자들은 이전 연구를 통해 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 전처리한 결과 세포외 소포의 생합성 및 내부 물질의 농도가 증가하는 효과를 확인하였다. 그러나, 트롬빈 처리가 어떠한 분자적 기전을 통해 상기와 같은 효과를 유도하는 것인지에 대해서는 명확히 규명된 바가 없다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 처리가 어떠한 경로를 통해 세포외 소포의 생성능을 향상시키는지 규명하기 위하여 연구노력한 결과, 트롬빈 처리가 PAR(Protease-Activated Receptor) 매개 신호전달 경로를 통해 상기와 같은 효과를 유도함을 구체적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 줄기세포 내 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성화 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포 선별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 줄기세포의 세포외 소포(extracellular vesicle) 생성 증진 유도제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
(a) 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 물질을 세포외 소포 생성 증진 유도제로 선정하는 단계.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 통해 선별된, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 제공한다.
상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계는 하기의 단계를 포함할 수 있다.
(a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;
(b) 상기 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 Rab-5(Ras-related protein Rab-5), EEA-1(Early endosome antigen-1), p-ERK1/2(Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/2) 및 p-AKT(Phospho-Protein kinase B)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 발현수준이 증가된 줄기세포를 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포로 선별하는 단계.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 PAR은 PAR1 또는 PAR3일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포외 소포의 고효율 생성능은 세포외 소포의 생산량 또는 세포외 소포 내 단백질의 함량이 증진되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질은 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 안지오제닌(angiogenin) 및 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 트롬빈은 1 내지 10 U/mL로 처리되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 줄기세포의 세포외 소포(extracellular vesicle) 생성 증진 유도제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 물질을 세포외 소포 생성 증진 유도제로 선정하는 단계.
본 발명에 따르면, 줄기세포에 트롬빈을 전처리하면 PAR(Protease-activated receptors) 매개 신호전달 경로를 통해 상기 줄기세포에서 세포외 소포의 생성 및 상기 소포 내 단백질의 수준이 현저히 증가하는바, 줄기세포에 트롬빈을 처리하고 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 정도를 측정함으로써 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 효율적으로 선별할 수 있으며, 이러한 방법에 의해 선별된 줄기세포는 관련 연구 및 임상 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1a는 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 처리하지 않거나(naive), 농도별로 처리(1, 2, 4U/mL)한 군에서 세포외 소포의 생산 수준을 분석한 결과이다.
도 1b는 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 처리하지 않거나(naive), 농도별로 처리(1, 2, 4U/mL)한 군에서 세포외 소포 내부에 포함된 단백질(VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1 및 HGF)의 수준을 분석한 결과이다.
도 1c는 중간엽 줄기세포 내 초기 엔도좀을 GFP로 표지하여 트롬빈 처리 유무에 따른 초기 엔도좀 차이를 분석한 형광 이미지 및 이의 정량 결과이다.
도 1d는 트롬빈이 처리되지 않은 중간엽 줄기세포(naive) 및 트롬빈을 전처리한 중간엽 줄기세포(Thrombin)에서 각각 분리된 세포외 소포를 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과이다.
도 1e는 상기 도 1d와 동일한 군에서 분리된 각 세포외 소포의 직경 및 수를 측정한 결과이다.
도 1f는 상기 도 1d와 동일한 군에서 분리된 각 세포외 소포에서 엑소좀 특이적 마커인 CD9, CD63 및 CD81, 미토콘드리아 마커인 사이토크롬 c(Cytochrome c), 핵 마커인 피브릴라린(Fibrillarin) 및 골지체 마커인 GM130의 발현 여부를 면역 블롯팅 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 2a는 트롬빈이 처리되지 않은 중간엽 줄기세포 및 트롬빈을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 PAR1, PAR2, PAR3 및 PAR4의 발현수준을 측정한 결과 및 PAR1과 PAR3의 정량 결과이다.
도 2b는 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 처리하지 않은 군(naive), PAR3 특이적 siRNA를 처리한 군(PAR3 siRNA) 및 대조군 siRNA를 처리한 군(Scrambled siRNA)에서 각각 PAR1 및 PAR3발현수준을 측정한 결과 및 이를 정량한 결과이다.
도 3a는 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 처리 유무에 따른 엔도좀 마커(Rab-5, EEA-1)의 발현수준을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3b는 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 처리 유무에 따른 ERK1/2, AKT, 및 이의 인산화 형태인 pERK1/2, pAKT 단백질의 발현수준을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4a는 각각 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 처리하지 않은 군(naive), 트롬빈을 전처리한 군(Thrombin), 트롬빈을 전처리한 후 PAR1 특이적 억제제인 SCH79797을 처리한 군(Thrombin+ SCH79797), 트롬빈을 전처리한 후 PAR3 특이적 siRNA를 처리한 군(Thrombin+PAR3 siRNA) 및 트롬빈을 전처리한 후 SCH79797과 PAR3 siRNA를 모두 처리한 군(Thrombin+ SCH79797+PAR3 siRNA)에서 엔도좀 마커(Rab-5, EEA-1)의 발현수준을 분석한 결과이다.
도 4b는 상기 도 4a와 동일한 군에서 pERK1/2, pAKT, ERK1/2, 및 AKT 단백질의 발현수준을 각각 분석한 결과이다.
도 5a는 중간엽 줄기세포 내 엔도좀을 GFP로 표지하고 핵은 DAPI로 염색한 후 각각 상기 도 4a와 동일한 군에서 엔도좀 수를 측정한 형광 이미지 및 이의 정량 결과이다.
도 5b는 상기 도 4a와 동일한 각각의 군에서 세포외 소포의 수를 측정한 결과이다.
도 5c는 상기 도 4a와 동일한 각각의 군에서 세포외 소포의 크기 및 수 분포를 측정한 결과이다.
도 5d는 상기 도 4a와 동일한 각각의 군에서 ELISA를 통해 세포외 소포 내 단백질(VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1 및 HGF)의 수준을 측정하여 나타낸 결과이다.
본 발명자들은 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 처리가 어떠한 경로를 통해 세포외 소포의 생성능을 향상시키는지 규명하기 위하여 연구노력한 결과, 트롬빈 처리가 PAR(Protease-Activated Receptor) 매개 신호전달 경로를 통해 상기와 같은 효과를 유도함을 구체적으로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 선별된, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계는 (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계; (b) 상기 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 Rab-5(Ras-related protein Rab-5), EEA-1(Early endosome antigen-1), p-ERK1/2(Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/2) 및 p-AKT(Phospho-Protein kinase B)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 발현수준이 증가된 줄기세포를 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포로 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR)”는 세포외 도메인의 일부 절단에 의해 활성화되는 관련 G 단백질-결합 수용체의 서브패밀리이며, 혈소판, 내피세포, 근세포 및 뉴런에서 고도로 발현되는 것으로 알려져 있다. PAR은 PAR1, PAR2, PAR3 및 PAR4의 4가지 유형이 있으며, 이를 활성화시킬 수 있는 주요 효소에 따라 분류된다. 내피세포에서 PAR은 혈관긴장도 및 투과성 조절에 관여하고, 혈관 평활근에서는 수축, 증식 및 비대를 매개한다. 내피세포의 PAR은 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin과 같은 내피 접착 분자에 대한 양성적 신호를 제공하며, 또한 염증반응에도 기여한다고 알려져 있고, 최근에는 근육의 성장과 골세포 분화 및 증식과 관련되어 있음이 보고되어 있다. 본 발명에서는 PAR는 줄기세포에서 세포외 소포의 고효율 생성능을 매개하며, 바람직하게는 PAR1 또는 PAR3 매개 신호전달 경로가 관여하고, 더욱 바람직하게는 PAR1이 PAR3 보다 줄기세포의 세포외 소포의 고효율 생성능에 더 큰 영향을 미치는 것을 구체적인 실시예를 통해 확인하였다.
본 발명은 구체적인 실시예에서 PAR 매개 신호전달 경로가 줄기세포의 세포외 소포의 고효율 생성능에 중요한 영향을 미침을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 트롬빈의 전처리가 줄기세포에서 세포외 소포의 생성, 세포외 소포 내 단백질 수준 및 이의 특성에 미치는 영향을 다양한 실험을 통해 분석하였다. 그 결과, 트롬빈이 처리되지 않은 경우와 비교하여 트롬빈 처리 농도에 비례하게 세포외 소포의 생산량은 5배 이상, 세포외 소포 내부 단백질 함량 수준은 2배 이상 증가하였다. 또한, 트롬빈 처리는 줄기세포 내 초기 엔도좀의 수준을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 중간엽 줄기세포가 트롬빈의 처리 유무에 관계 없이 PAR1 및 PAR3 수용체를 발현하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에서 초기 엔도좀 마커(Rab-5 및 EEA1)의 발현수준이 유의하게 증가하고 ERK1/2, AKT의 인산화가 증가한 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, PAR 신호전달 경로가 트롬빈 처리에 의해 유도된 세포외 소포의 생산과 내부 단백질 함량의 증가 및 엔도좀 마커와 ERK1/2, AKT의 인산화 증가를 매개하는지 여부를 확인하기 위하여, PAR1 특이적 억제제 및 PAR3 siRNA를 각각 또는 함께 세포에 처리하여 분석한 결과, PAR1과 PAR3 매개 신호전달 경로가 상기 효과를 유도하는데 관여되어 있으며, 특히 PAR3 보다 PAR1이 더욱 중요한 영향을 미치는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
상기 단계 (b)에서 발현수준을 측정하는 방법은 해당 기술분야에서 단백질의 발현수준을 측정할 수 있는 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있으며, 구체적으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “세포외 소포의 고효율 생성능”은 바람직하게 줄기세포로부터 세포외 소포의 생성량이 증가되는 것 및/또는 상기 줄기세포로부터 생산된 세포외 소포 내 단백질의 수준이 증가하는 것을 의미한다.
상기 세포외 소포 내 단백질은 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 안지오제닌(angiogenin) 및 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “줄기세포(stem cell)”란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다.
본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다.
상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 또는 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 줄기세포의 배양은 해당 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 본 발명에서는 구체적으로 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 α-MEM 배지에서 배양하였으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트롬빈의 처리 방법은 구체적으로 한정되지 않으나, 바람직하게는 배지에 첨가하고 상기 배지에서 줄기세포를 2 내지 10시간, 바람직하게는 4 내지 8시간, 더욱 바람직하게는 5 내지 7시간, 가장 바람직하게는 6시간 동안 배양함으로써 이루어질 수 있다. 트롬빈은 상기 배지 내에 1 내지 10 U/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5 U/ml의 농도, 더욱 바람직하게는 2 내지 4U/mL로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 물질을 세포외 소포 생성 증진 유도제로 선정하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 세포외 소포(extracellular vesicle) 생성 증진 유도제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 중간엽 줄기세포 배양 및 전처리
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC)는 Medipost Co., Ltd. (서울, 한국)에서 구입하여 본 연구에 이용하였다. 상기 세포는 사전 동의를 얻은 단일 공여자로부터 분리된 것으로, 6 계대에서 우수한 제조 공정을 엄격히 준수하여 제조되었다. 상기 중간엽 줄기세포는 CD105 (99.6%) 및 CD73 (96.3%)을 발현하며, CD34 (0.1%), CD45 (0.2%) 또는 CD14 (0.1%)는 발현하지 않는 것을 확인하였고, 또한 인간 백혈구 항원 (HLA)-AB (96.8%)에 대해 양성이며 HLA-DR (0.1%)에 대해서는 양성이 아님을 확인하였다.
상기 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 트롬빈을 전처리 하기 위해, 먼저 상기 중간엽 줄기세포를 10%(v/v) 소태아혈청(FBS, Gibco), 100units/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 α-MEM(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 표준 배양조건 하에 배양하였다. 상기 세포가 배양 플레이트 면적의 약 90%를 차지할 때 세포를 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척하여 오염된 FBS-유래 엑소좀을 제거한 다음, 인간 재조합 트롬빈(1, 2 및 4U/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 보충된 새로운 무혈청 α-MEM에서 6시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 회수하고, Luna-FL™ system(Logos Biosystems, Anyang-si, Korea)을 이용해 100mm 배양 접시 당 약 2 × 106 세포를 계수하였다.
1-2. 세포외 소포(Extracellular Vesicle; EVs) 분리 및 정량화
상기 실시예 1-1의 방법에 따라 트롬빈이 전처리된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 분비된 세포외 소포(이하, EVs)를 분리하기 위하여 하기 과정에 따라 실험을 진행하였다. 구체적으로, 상기에서 회수된 배지를 3000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 세포 잔해물을 제거한 다음, 다시 4℃에서 100,000rpm으로 120분 동안 원심분리하여 EVs를 침전시켰다. 이후 상기 침전된 펠렛을 2회 세척하고, 멸균된 PBS에 재현탁한 다음, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다.
EVs의 분포는 빠른 비디오 캡처 및 입자 추적 소프트웨어가 장착된 NanoSight(NanoSight NS300; Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 브라운 운동(Brownian motion) 속도를 측정함으로써 분석하였다. 수득된 EVs를 PBS(500㎕, 1mg/mL 총 단백질)에 재현탁시키고, 크기 및 다분산성을 측정하였다. 또한, 단일세포에 의한 EVs 생산량을 정량화하기 위하여, 상기에서 회수된 배지를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 LUNA-FL 시스템을 사용하여 세포를 계수하였다. 단일세포에 의해 생성된 EVs의 수는 EVs의 총 개수를 세포 수로 나누어 계산하였다.
1-3. 투과전자현미경(TEM) 및 주사전자현미경(SEM) 관찰
EVs(5㎕)를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정시키고, 200-메쉬 포름바르(formvar)/탄소가 코팅된 전자현미경 그리드(Electron Microscopy Sciences, Washington, PA, USA)에 로딩한 후 10분 동안 배양하였다. 이어서, 여과된 증류수로 세척하고 1분 동안 물에서 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하였다. 이후 120kV에서 작동하는 Tecnai Spirit G2 투과전자현미경(FEI, Hillsboro, OR, USA)을 이용하여 관찰 후 이미지를 얻었다.
한편, 분리된 EVs를 주사전자현미경으로 관찰하기 위하여, EVs를 2.5% 글루타르알데히드로 고정시키고 폴리카보네이트 막 상에 로딩하였다. 다음으로, 상기 막을 PBS 및 물로 1회 세척한 후 아세톤으로 탈수시켰다. 이어서 액체 이산화탄소를 사용하여 임계점 건조에 의해 아세톤을 제거하였다. 샘플을 카본 테이프로 알루미늄 스터브에 마운팅하고 SEM 스터브에 마운팅하였다. 3-5 nm 백금으로 스퍼터 코팅한 후, 주사전자현미경(Zeiss Auriga Workstation, Oberkochen, Germany)으로 샘플을 관찰하고 이미지를 얻었다.
1-4. PAR1-특이적 억제제 처리 및 PAR3 넉다운
선택적 PAR1 길항제인 SCH79797(N3-사이클로프로필-7-[[4-(1-메틸에틸)페닐]메틸]-7H-피롤로[3,2-f]퀴나졸린-1,3-다이아민 다이하이드로클로라이드)(N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl]-7H-pyrrolo[3,2-f]quinazoline-1,3-diamine dihydrochloride)를 Tocris(Bristol, UK)로부터 얻었다. 이후 상기 물질을 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 처리하기 위하여, 트롬빈 처리 1시간 전에 상기 SCH79797을 배양 배지에 1μM 농도로 첨가하였다.
한편, PAR3를 넉다운(knockdown)시키기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine® RNAiMAX 형질감염 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용해 RAR3을 표적하는 siRNA를 중간엽 줄기세포에 형질감염시켰다. 이때, 음성대조군으로는 scrambled siRNA를 동일한 방법 및 조건으로 처리하였다. 대조군 siRNA 및 PAR3 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
1-5. 초기 엔도좀 표지화
초기 엔도좀(Early endosomes)은 제조사의 지시에 따라 Cell Light® 시약-녹색 형광 단백질(GFP), BacMam 2.0(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)을 이용하여 표지하였다. 간략하게, 중간엽 줄기세포를 12-웰 플레이트에 웰 당 1.5 x 104 밀도로 분주하고, 세포가 부착된 후에 BacMam 2.0 시약을 세포 당 40개의 입자 농도(particles per cell; PPC)로 첨가하였다. 다음으로 Rab5a-GFP 발현을 측정하기 위해 Cell Light® Early endosomes-GFP, BacMam 2.0을 사용하여 초기 엔도좀을 표지하였다. 이후 GFP로 표지된 엔도좀의 수를 추정하기 위해, 녹색 면역 형광의 광학 밀도를 ImageJ(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정하였다.
1-6. Bioplex 어세이
EVs의 사이토카인 수준을 ELISA를 통해 분석하기 위하여 하기 방법으로 실험을 진행하였다. 구체적으로, 단리된 EVs의 균질물을 ELISA 키트에서 0.1mL의 용해 완충액이 함유된 웰에 첨가하였다. 이후 Bradford 방법을 통해 EVs 내 단백질을 정량화한 다음, 1㎍의 단백질을 각각의 웰에 로딩하였다. 이어서 Human Angiogenesis Custom Premix Kit A(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)인 Fluorokine® MAP을 이용하여 EVs 내에 존재하는 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1), VEGF 및 HGF 수준을 정량화하였다.
1-7. 면역블롯 분석
동일한 부피의 RIPA 완충액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 EVs를 용해시켰다. Bradford 방법으로 용해물의 단백질량을 정량하고, 10㎍의 단백질이 포함된 샘플을 β-머캅토에탄올이 함유된 로딩 완충액과 혼합한 다음, 10분 동안 가열하고, 12% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 단백질을 크기별로 분리되도록 하였다. 이어서 분리된 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 다음, 0.5% Tween-20이 포함된 1x PBS-T로 5% 소혈청알부민(BSA) 용액을 제조하고 상기 멤브레인에 처리하여 실온에서 블로킹 과정을 실시한 후, 1차 항체를 처리하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 1x PBS-T로 멤브레인을 씻어낸 다음, 항-마우스 또는 항-토끼 홀스레디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 면역글로불린 G (1:2000) 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 교반하면서 배양하였다. 이어서 PBS-T로 세척한 후, ECL Select chemiluminescence reagent(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 단백질 밴드를 검출하고, X-선 필름으로 밴드 이미지를 얻었다.
1-8. 통계분석
모든 정량적 결과는 3회 반복실험 결과로부터 도출하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었고, 통계분석은 2개의 그룹의 경우에는 t-검정을 이용하여 비교하였고, 3개 그룹에 대해서는 일원분산분석(ANOVA)을 통계 분석하였다. p 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. 트롬빈 전처리가 EVs의 합성, 단백질 수준 및 특성에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 중간엽 줄기세포에 대한 트롬빈 전처리가 EVs 합성 및 EVs 내에 존재하는 단백질 수준, 및 EVs 특성에 미치는 영향을 분석하기 위해 하기 실험들을 진행하였다.
2-1. EVs 생산량 및 단백질 수준 분석
먼저 상기 실시예 1-1의 방법에 따라 트롬빈을 1-4U/mL로 농도를 달리하여 중간엽 줄기세포에 처리하고, 실시예 1-2의 방법에 따라 EVs의 양을 분석하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 트롬빈 농도에 의존적으로 EV 생산량이 증가하였고, 특히 2 및 4U/mL 농도에서 EV 생산량이 크게 증가한 것으로 나타났다.
또한, EVs 내 단백질 수준을 분석한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 트롬빈을 처리하지 않은 중간엽 줄기세포와 비교할 때, 2 및 4U/mL의 트롬빈을 처리한 군에서 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 안지오제닌(Angiogenin), 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1) 및 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)의 수준이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 나아가 상기 결과들에 기초하여 인간 트롬빈의 최적 처리 농도를 2U/mL로 선정하고 후속 실험들을 진행하였다.
2-2. 초기 엔도좀 분석
본 발명자들은 상기 줄기세포 내 초기 엔도좀을 CellLight Early Endosomes-GFP 키트를 이용해 녹색 형광으로 표지하여 트롬빈을 처리하지 않은 중간엽 줄기세포(Naive)와 트롬빈을 전처리한 중간엽 줄기세포(Thrombin)를 비교하였다. 구체적으로 형광 이미지 및 이의 정량 결과를 통해 상기 두 세포간 엔도좀 차이를 비교한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이 트롬빈을 전처리한 줄기세포에서 현저히 높은 수준의 초기 엔도좀이 관찰되었다.
2-3. 전자현미경을 통한 EVs 관찰
또한, 트롬빈 전처리에 따른 EVs 차이를 비교하기 위하여 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 분리된 EVs를 관찰하였다. 그 결과, 도 1d에서 볼 수 있는 바와 같이 트롬빈을 처리하지 않은 중간엽 줄기세포와 비교하여 트롬빈을 전처리한 중간엽 줄기세포에서 더 많은 EVs가 관찰되었다.
2-4. EVs의 특성 확인
트롬빈이 처리되지 않은 중간엽 줄기세포 및 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에서 분리된 각각의 EVs에 대하여 크기를 측정하였다. 그 결과, 도 1e에 나타낸 바와 같이 모두 100nm에서 피크를 나타내어 상기 각 세포에서 분리된 EVs의 크기가 동일한 것을 확인하였다. 그러나, 분리된 EV의 수는 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에서 훨씬 더 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 두 중간엽 줄기세포에서 분리된 EVs에 대하여 면역 블롯팅을 통해 다양한 마커의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 1f에서 볼 수 있는 바와 같이 트롬빈 처리 유무에 관계 없이 모든 EVs는 엑소좀 특이적 마커인 CD9, CD63 및 CD81을 모두 발현하였으며, 미토콘드리아 마커인 시토크롬 C(Cytochrome c), 핵 마커인 피브릴라린(Fibrillarin) 및 골지체 마커인 GM130은 발현하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3. 중간엽 줄기세포의 PARs 발현 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2의 결과에 근거하여, 중간엽 줄기세포가 트롬빈에 대한 수용체를 발현하는지 여부를 알아보기 위해 상기 실시예 1-7의 방법에 따라 면역 블롯팅 분석을 수행하였다. 구체적으로, 트롬빈을 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 및 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포 각각에 대하여 PAR1, PAR2, PAR3 및 PAR4 단백질의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 중간엽 줄기세포는 트롬빈의 처리 유무에 관계없이 PAR1 및 PAR3을 발현하고 PAR2 및 PAR4는 발현하지 않는 것으로 나타났다. 이는 트롬빈 전처리가 PAR1 및 PAR3을 통해 중간엽 줄기세포에 영향을 미칠 수 있음을 시사하는 것이다.
나아가 PAR3에 특이적인 siRNA(PAR3 siRNA)가 PAR3의 발현을 특이적으로 저해하는지 여부를 검증하고자 하였다. 이를 위해, 대조군 siRNA(Scrambled siRNA)를 상기 중간엽 줄기세포에 형질감염시키고 면역 블롯팅 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 PAR3 siRNA를 처리한 경우에는 PAR1의 발현수준은 변화하지 않고 PAR3의 발현만이 특이적으로 저해되었고, 대조군 siRNA를 처리한 경우에는 PAR1 및 PAR3 모두 발현수준에 변화가 나타나지 않은 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 실시예에서 이용한 PAR3 siRNA는 PAR3의 발현만을 특이적으로 저해하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 트롬빈 전처리에 의한 초기 엔도좀 마커 단백질 수준, 및 ERK1/2 및 AKT 경로의 인산화 증가 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2의 결과에 근거하여 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 전처리 유무에 따른 초기 엔도좀 마커(Rab-5 및 EEA-1)의 발현수준 변화를 면역 블롯팅으로 분석하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 트롬빈이 처리된 경우 초기 엔도좀 마커인 Rab-5 및 EEA-1의 발현수준이 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포에서 트롬빈 처리 유무에 따른 ERK1/2 및 AKT 신호전달 경로의 활성화 여부를 조사하기 위해, ERK1/2 및 AKT의 인산화 수준을 분석하였다. 그 결과 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 트롬빈이 처리되지 않은 중간엽 줄기세포와 비교할 때 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에서 pERK1/2 및 pAKT 단백질의 발현이 유의하게 증가된 것을 확인하였다. 또한 인산화되지 않은 형태의 ERK1/2 및 AKT의 경우에는 통계적으로 유의하지는 않으나 트롬빈 처리에 의해 약간 발현이 증가하는 경향을 보였다.
실시예 5. PAR 억제에 의한 Rab-5 및 EEA1 발현, ERK1/2 및 AKT 인산화 및 EV 생산 억제 확인
5-1. Rab-5 및 EEA1 발현, 및 ERK1/2 및 AKT 인산화 억제 확인
본 발명자들은 트롬빈이 어떻게 초기 엔도좀 마커인 Rab-5 및 EEA-1의 발현을 유도하는지를 조사하기 위하여, 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에 PAR1 특이적 길항제인 SCH79797을 처리하거나, PAR3 특이적 siRNA를 형질감염시키거나 또는 상기 두 물질을 함께 처리한 후 Rab-5 및 EEA-1의 발현 수준을 각각 분석하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 각각 SCH79797을 처리한 군(Thrombin+SCH79797) 및 PAR3 siRNA를 처리한 군(Thrombin+PAR3 siRNA) 모두 트롬빈 만을 전처리한 군(Thrombin)에 비하여 Rab-5 및 EEA-1의 발현수준이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 이때, SCH79797을 처리한 군이 PAR3 siRNA를 처리한 군 보다 발현 수준이 더욱 감소한 것으로 나타났다. 또한, SCH79797 및 PAR3 siRNA를 함께 처리한 군(Thrombin+SCH79797+PAR3 siRNA)에서 각 단백질의 발현수준이 가장 크게 감소된 것을 확인하였다.
이에 더하여, 트롬빈이 ERK1/2 및 AKT 경로의 활성화를 어떻게 유도하는지를 조사하기 위해, 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에 SCH79797 및/또는 PAR-3 특이적 siRNA를 처리하였다. 그 결과, 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 트롬빈 전처리에 의한 ERK1/2 및 AKT의 인산화 증가는 각각 SCH79797 및 PAR3 siRNA를 처리한 군에서 유의적으로 억제되었으며, PAR-3 특이적 siRNA를 처리한 경우 보다 SCH79797을 처리한 경우 더욱 유의한 수준으로 억제되었다. 더욱이 상기 두 물질을 함께 처리한 경우 가장 크게 억제된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 트롬빈 전처리에 의한 Rab-5, EEA-1, ERK1/2 및 AKT의 활성화에 PAR-1 신호전달이 더욱 많이 관여되어 있으며, 이에 반해 PAR-3 신호전달은 부분적으로 관여되어 있음을 시사하는 것이다.
5-2. EVs의 생산 및 EVs 내부 단백질 수준 증가 억제 확인
중간엽 줄기세포에서 EVs의 생산이 PAR에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위해, 트롬빈이 전처리된 중간엽 줄기세포에 PAR1 특이적 길항제 SCH79797 및/또는 PAR3 특이적 siRNA를 형질감염시켰다.
먼저 각 대조군 및 실험군에서 초기 엔도좀 비교하기 위해, 트롬빈 전처리 후 CellLight Early Endosomes-GFP 키트를 사용하여 녹색 형광으로 엔도좀을 표지하였다. 이후 형광 이미지 및 이의 정량 결과를 분석한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 트롬빈 처리에 의한 초기 엔도좀 수의 증가는 각각 SCH79797 및 PAR3 siRNA를 처리한 군에서 유의적으로 억제되었다. 또한, PAR3 siRNA 형질감염에 의한 것보다 SCH79797 처리에 의해 보다 유의하게 억제되었고, SCH79797 및 PAR3 siRNA를 함께 처리한 경우 가장 높은 수준으로 억제된 것을 확인하였다.
나아가 상기와 동일한 군의 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양배지에서 세포외 소포 수의 증가 정도를 비교하였다. 그 결과, 도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이 트롬빈 처리에 의한 세포외 소포 수의 증가는 각각 SCH79797 및 PAR3 siRNA를 처리한 군에서 유의적으로 억제되었으며, PAR3 siRNA를 형질감염시킨 경우보다 SCH79797을 처리한 경우 더욱 높은 수준으로 억제되었고, 상기 두 물질을 함께 처리한 경우 가장 높은 수준으로 억제된 것을 확인하였다.
또한, 상기와 동일한 군에서 PAR 억제제 처리에 의한 EVs 내 단백질의 수준 변화를 분석하였다. 구체적으로 VEGF, 안지오제닌, 안지오포이에틴-1 및 HGF수준을 각각 측정한 결과, 도 5d에서 볼 수 있는 바와 같이 각각 SCH79797 및 PAR3 siRNA를 처리한 군에서 상기 단백질들의 수준 증가가 유의적으로 억제되었으며, PAR3 siRNA를 형질감염시킨 경우보다 SCH79797을 처리한 경우 더욱 높은 수준으로 억제되었고, 상기 두 물질을 함께 처리한 경우 가장 높은 수준으로 억제된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PAR-1 매개 신호전달이 트롬빈 전처리 자극에 의한 EV 생산 및 카고 단백질의 수준 증가에 강하게 관여하고 PAR3 신호 전달은 부분적으로 관여함을 시사하는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 의하면, 줄기세포에 트롬빈을 처리하고 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 정도를 측정함으로써 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 효율적으로 선별할 수 있는바, 이러한 방법에 의해 선별된 줄기세포는 기초 연구 및 임상 분야에서 다양한 용도로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 줄기세포에서 특정 물질의 처리 후 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 방법을 통해 세포외 소포 생성 증진 유도제를 스크리닝하여 새로운 물질을 발굴할 수 있는바, 상기 발굴된 물질을 기초 연구 및 임상 분야에서 이용될 수 있는 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포를 제조하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Claims (15)

  1. 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 수준 측정 단계는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 선별방법:
    (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;
    (b) 상기 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 Rab-5(Ras-related protein Rab-5), EEA-1(Early endosome antigen-1), p-ERK1/2(Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/2) 및 p-AKT(Phospho-Protein kinase B)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 발현수준이 증가된 줄기세포를 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포로 선별하는 단계.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PAR은 PAR1 또는 PAR3인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포외 소포의 고효율 생성능은 세포외 소포의 생산량 또는 세포외 소포 내 단백질의 수준이 증진되는 것임을 특징으로 하는, 선별방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질은 혈관상피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 안지오제닌(angiogenin) 및 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 트롬빈은 1 내지 10 U/mL로 처리되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 선별방법에 의해 선별된, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포.
  11. 하기의 단계를 포함하는, 줄기세포의 세포외 소포(extracellular vesicle) 생성 증진 유도제의 스크리닝 방법:
    (a) 줄기세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 단백질분해효소 활성 수용체(Protesase activated receptors; PAR) 매개 신호전달 경로의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 물질을 세포외 소포 생성 증진 유도제로 선정하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 PAR 매개 신호전달 경로의 활성 수준 측정은 Rab-5(Ras-related protein Rab-5), EEA-1(Early endosome antigen-1), p-ERK1/2(Phospho-Extracellular signal-regulated kinases 1/2) 및 p-AKT(Phospho-Protein kinase B)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 발현수준을 측정하는 것임을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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