KR101131073B1 - 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 새로운 천연식물 혼합추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 혼합추출물은 주요 염증 매개물인 나이트릭옥사이드(NO)의 발생에 관여하는 iNOS(inducible NOS)의 활성을 효과적으로 저해하고, 염증 매개체인 프로스타글란딘을 형성하는 COX-2 유전자 발현 저해, 사람 섬유아세포에서의 PGE₂ 및 IL-6, IL-8의 생성 억제, 비만세포에서의 탈과립 저해 및 면역세포증식 효과가 뛰어남을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 혼합추출물은 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물 {Compositions for anti-inflammation, anti-irritation, and immune activity comprising the extracts of the roots of Tprunus persica Batsch, Prunus salicina var. salicina, and Prunus mume Sieb. et Zucc, and the bark of Juglans regia L.}

본 발명은 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 새로운 천연식물 혼합추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부표면은 피지선에서 분비되는 피지와 땀샘에서 나오는 수분이 자연적으로 잘 혼합된 피지막이 각질층을 덮고 있고, 매끄럽고 윤기 있으며 촉촉한 상태로 유지된다. 이러한 피부 각질층의 수분 함량이 20% 정도 일 때 피부는 가장 이상적이고 아름다운 상태가 되며 피부 각질층의 수분 함량이 10% 이하로 떨어지면 피부에서 각질이 떨어져 나가게 되고 이물질의 침투가 용이하게 되어 각종 염증 및 알러지가 유발되기 쉬워진다. 특히, 아기들이나 노인들은 각각의 피부 특성상 피부의 신진대사가 원활하지 못하므로 각종 염증 및 자극에 민감하게 반응한다. 아기피부의 경우, 세균이 침입하지 못하도록 몸을 보호해주며 땀과 열을 발산하여 체온을 조절한다. 또한, 폐, 내부 장기, 신장의 기능을 도와 체내의 노폐물을 제거하는 작용을 하기도 하나 성인과는 다른 점이 있다. 아기는 피부뿐만 아니라 땜샘 등의 주요 부속 기관들도 아직 미성숙한 상태이기 때문에, 땀을 내어 자신의 체온을 내리고 조절하는 체온 조절 능력이 부족하다. 이러한 이유가 많은 아기들의 땀띠의 원인으로 작용하기도 한다. 뿐만 아니라 쉽게 수분을 잃어 건조해지고 저항력이 떨어져 이로 인해 손상받기 쉬운 상태가 된다. 이와 같이 아기의 피부는 성인과 겉모습은 같지만 기능상으로 볼 때 미흡하며, 만 3세가 되고 나서야 어른피부의 두께 정도가 된다. 또한, 부드러운 아기피부는 얇고 연약하여 외부의 자극과 세균감염에 민감하고 침투력이 성인보다 매우 빠르기 때문에 피부 위에 남아있는 땀이나 세균 등이 다시 피부 속으로 침투되어 이로 인해 피부가 짓물러지게 되고 다른 피부 트러블이 발생할 수 있다. 즉, 아기 피부는 연약하고 섬세할 뿐만 아니라 민감하기 때문에 조그마한 외부 자극에도 피부 트러블이 생기기 쉬우므로 피부면역을 강화시켜줄 수 있는 원료를 선택하여 사용하는 것도 중요하다. 이렇듯 아기 피부는 손상 받기 쉽고 면역기능이 약화되어 아토피 피부염뿐만 아니라, 여러 피부 질환으로 발전할 수도 있으므로 이로 볼 때 약하고 민감한 피부일수록 면역과 피부회복 기능의 강화가 절실하다. 또한, 건조한 실내 환경, 공해, 자외선, 바람, 오용된 화장품이나 세제류 등 외부자극에 의해 피부가 민감해져가는 사람들도 늘어나고 있다. 외부 자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 단순히 가시적인 경우도 있으며, 가려움, 따가움 등과 같이 격심하고 불쾌한 염증반응을 나타내는 경우가 있으므로 대중적인 피부 화장료 조성물을 사용하기에는 약간 부담스럽고 지속적으로 사용하는 것을 자제하게 된다.

화장품은 피부를 보호하고 미화 청결을 위해 사용되는 제품이지만 화장료 조성물을 자세하게 살펴보면 본래의 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품형성에 필수불가결한 존재이기 때문에 사용된다. 예컨대, 가용화제 및 유화제, 방부제, 향료, 자외선 차단제 및 기타 효능?효과를 부여하기 위해 쓰이는 여러 가지 첨가물을 들 수 있다. 이러한 성분들은 일반적으로 피부에 염증이나 알러지, 뾰루지, 부종 등을 유발하는 주원인으로 알려져 있다.

염증은 세포나 조직이 어떠한 원인에 의해 손상을 받으면 그 반응을 최소화하고 손상된 부위를 원상으로 회복시키려는 일련의 방어목적으로 나타나는 상처나 질병에 반응하는 인체의 면역 반응으로, 자외선이나 활성산소, 스트레스 등이 염증성 인자를 활성화시켜 각종 질병 및 피부의 노화를 일으킨다. 염증의 특징 중 하나는 프로스타글란딘을 생성하는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase; COX) 및 류코트리엔(leukotriene)을 생성하는 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase) 경로에 의해 대사되는 아라키돈산(arachidonic acid)의 산소첨가반응의 증가이다. 프로스타글란딘 및 류코트리엔은 염증의 매개체이다. 따라서 COX 또는 리폭시게나제 활성 억제는 큰 관심사이다. COX 효소는 COX-1 및 COX-2의 2개의 형태가 있다. COX-2는 염증 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서 COX-2 효소를 억제하는 것이 비가 역적인 COX-1 억제와 관련된 부작용 없이 염증을 감소시킬 수 있는 효과적인 방법일 수 있다 [Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2003 Nov;69(5):329-37, Neurosurgery. 2005 Mar;56(3):590-604]. 또 하나의 강력한 염증 매개물인 나이트릭옥사이드(Nitric Oxide; NO)는 NO 합성 효소인 나이트릭옥사이드신타제(Nitric Oxide synthase; NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 생성되며 UV와 같은 스트레스나 엔도톡신, 사이토카인에 의해 많은 타입의 세포에서 발생된다. 이러한 염증 자극들은 세포내의 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)의 발현을 증가시킴으로 NO를 발생시키고 대식세포를 활성화시켜 염증 반응을 일으킨다. 인터루킨-8(interleukin-8; IL-8)은 단핵세포, 섬유아세포, 내피세포 및 각질세포를 비롯한 몇몇 세포 유형에 의해 생성되는 주화성 인자이다. 내피세포로부터 이의 생성은 IL-1, 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor; TNF) 또는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)에 의해 유도된다. IL-8은 시험관내에서 수많은 기능을 자극한다. 이는 호중구, T-림프구 및 호염기성 세포에 대해 화학 유인 특성을 갖는 것으로 나타나 있다. 게다가, 정상 및 아토피성 개체 모두의 호염기성 세포로부터의 히스타민 방출을 유도할 뿐만 아니라, 호중구로부터 리소좀 효소 방출 및 호흡 폭발을 유도한다. 또한, 단백질 신생 합성 없이 호중구상에서 Mac-1(CD11b/CD18)의 표면 발현을 증가시키는 것으로 나타나 있고, 이는 혈관내피세포에 대한 호중구의 부착을 증가시키는데 기여할 수 있다. 많은 질환은 호중구 대량 침투를 특징으로 한다 [Pol Merkuriusz Lek. 2003 Jan;14(79):9-12].

앞서 언급한 히스타민은 가려움과 통증을 매개하는 가장 잘 알려진 물질이 다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면 가려움증을 감지하는 특정한 수용기는 없으며, 국부적인 통증과 같이 상피세포나 진피와 표피사이의 간극에 존재하는 불특정한 자율신경 말단에 의한 것으로 생각되고 있다. 가려움증과 통증을 매개하는 물질들은 주로 비만세포로부터 유리되며 FCε RIα 수용체의 교차결합에 의해 유리된다. 또한, 히스타민은 FCε RIα 수용체와는 별도로 기질 P, 간세포인자, 혈관작용성장 펩티드 등의 염증 매개체에 의해서도 피부 비만세포로부터 유리될 수 있다. 이에 대하여 현재까지 홍반이나 부종 같은 자극완화 및 염증완화 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계의 프루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin)등이 있고, 스테로이드계의 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone)등이 있으며 [김창종, 병태생리학, 한림상사, p61-69, 1988], 알란토인, 아즈렌, ε-아미노키프론산, 하이드로코티존(ⅴ), 감초산 및 그 유도체(β-글리칠레친산, 글리칠레친산유도체)등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [광정무부, 신화장품학, 남산당, p162, 1993].

화장품에 있어서 피부 부작용 유발요인은 항상 잠재되어 있으며 이를 해결 하고자 여러 가지 연구가 진행되어 왔으나, 항염제로 쓰이는 인도메타신(indomethacin)은 화장료에는 사용할 수 없는 물질이고 하이드로코티존은 사용량이 제한되어 있고 감초산 및 그 유도체는 안정화시키기 어렵거나 용해도가 좋지 않아 실제 적용시 농도의 제한으로 인하여 실질적인 효과를 거두기가 어려운 점이 있는 등 지금까지 알려진 항염제는 피부안정성이나 화장료 배합시의 안정성에서 대부 분 문제점을 가지고 있어서 그 사용이 제한되고 있다. 특히, 최근에는 소비자들의 욕구에 부응하기 위하여 천연 원료를 이용한 화장료에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 피부에 안전성이 우수하며 화장료 배합 시 보존안정화가 쉽고 피부에서의 염증 및 자극을 예방하거나 완화시키며 면역을 증강시키는 효능이 있는 물질을 찾고자 여러 천연물질들 중에서 상기 효능의 효과가 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합추출물이 매우 우수한 항염, 자극완화 및 면역증강 효능을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 강력한 염증 매개물을 발생시키는 iNOS 및 COX-2의 활성을 억제하고, 또 다른 염증매개인자인 PGE₂ 및 IL-6, IL-8의 생성을 억제하며, 비만세포에서의 탈과립 저해 및 면역세포증식으로 우수한 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖으며, 안전성에 문제가 없는 식물성 천연 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 이러한 효능을 갖는 혼합추출물을 기존 제형에 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물을 제공한다.

복숭아 나무(prunus persica Batsch)는 잎지는 작은 키나무이다. 버드나무잎 모양 또는 타원형의 잎이 어긋나게 붙는다. 봄에 흰색 또는 분홍색 꽃이 핀다. 꽃에는 캠페롤과 그 배당체, 3 염기산과 디옥시 1 염기산이 있고 잎에는 니트릴 배당체가 있다. 씨는 도인이라고 하며 에물신 약 30%, 아미그달린 약 1.5%, 기름 40 ~ 50%를 함유하고 있다. 동의치료에서 꽃을 오줌내기약, 센 설사약으로 물고임, 변비 에 쓴다. 민간에서는 잎이 붙은 가지를 가마에 넣고 달인액으로 건포, 습진에 목욕한다 [약초의 성분과 이용, p 359, 최옥자, 일월서각].

자두 나무(Prunus salicina var. salicina)는 자도나무?오얏나무라고도 한다. 중국 원산으로 인가 부근에서 과수로 심으며 높이가 10m에 달한다. 잎은 어긋나고 긴 달걀을 거꾸로 세운 듯한 모양 또는 타원형 긴 달걀 모양이며 가장자리에 둔한 톱니가 있다.

꽃은 4월에 잎보다 먼저 피고 흰색이며 보통 3개씩 달린다. 열매는 달걀 모양 원형 또는 구형으로서 자연생은 지름 2.2cm이지만 재배종은 길이가 7cm에 달한다. 열매의 밑부분은 들어가고 7월에 노란색 또는 붉은빛을 띤 자주색으로 익으며 과육은 연한 노란색이다 [네이버 두산백과 사전].

매화 나무(Prunus mume Sieb. et Zucc)는 잎지는 작은 키나무이다. 달걀모양의 잎이 어긋나게 붙는다. 이른 봄 잎이 나기전에 흰색 또는 붉은색 꽃이 핀다. 열매는 둥글고 여물면 노란색을 띤다. 선열매를 따서 열매살을 벗겨 그을음이 섞인 연기에 그을려 말린 것을 오매라고 하며, 선열매는 레몬산의 원료로도 쓰인다. 오매는 동의치료에서 청량성 수렴약, 설사멎이약, 열내림약, 기침약, 가래약으로 쓰며, 주로 배아픔, 게우기, 설사 등에 쓴다 [약초의 성분과 이용, p 358, 최옥자, 일월서각].

호두 나무(Juglans regia L.)의 씨와 열매의 헛껍질, 잎에는 사람의 몸에 유익한 약용물질, 여러 가지 아미노산과 비타민이 들어있어 좋은 약 원료로 쓰인다. 잎지는 큰키나무로, 잎은 넓은 타원형의 쪽잎이 깃털처럼 붙은 모인잎이다. 열매는 둥글고 줄무늬가 있다. 여물지 않은 열매의 헛껍질에는 α- 및 β-히드로유글론이 있다. 씨에는 기름 60 ~ 70%, 단백질, 비타민 K, P, B, E와 프로비타민 A, 아미노산인 시스틴, 글루타민, 세린, 히스타민, 발린, 페닐알라닌이 있다. 동의치료에서는 씨를 자양강장약, 기침멎이약으로 허리아픔, 유정, 음의, 추위로 오는 기침, 변이 굳을 때에 쓴다 [약초의 성분과 이용, p 167~168, 최옥자, 일월서각].

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합은 복숭아 뿌리 : 자두 뿌리 : 매화 뿌리 : 호두 껍질이 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0의 중량비인 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 구체적으로 복숭아 뿌리 : 자두 뿌리 : 매화 뿌리 : 호두 껍질을 1 : 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 정제수, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 프로필렌글라이콜, 글리세린, 및 부틸렌글라이콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 한다

본 발명을 좀 더 자세히 설명하면 다음과 같다. 일차로 건조된 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질 혼합 추출물을 중량에 대하여 추출 용매로서, 물이나, 무수 또는 함수 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매를 5 ~ 20배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 ~ 95 ℃, 3 ~ 20시간 가열하여 추출하거나 5 ~ 37 ℃에서 1 ~ 15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이렇게 추출된 상기 혼합 추출물을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 동결건조나 분무건조하여 건조추출물을 얻는다.

더욱 구체적으로는 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 물로 세척하여 음건 후, 그 중량의 약 1 ~ 30배, 바람직하게는 약 3 ~ 10배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 약 1.0 : 0.1 ~ 1.0 : 10, 바람직하게는 1.0 : 0.2 ~ 1.0 : 3.0의 혼합비를 갖는 혼합용매, 바람직하게는 100% 에탄올로 10 ~ 120 ℃, 바람직하게는 15 ~ 80 ℃의 추출온도에서 약 0.5 시간 ~ 10일, 바람직하게는 3 시간 ~ 7일 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 환류냉각 추출법으로 추출한 후, 추출액을 냉각 후에 여과하고 여과액을 회전 감압 농축기로 건조하여 본 발명의 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질 혼합 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10%의 중량 백분율로 함유하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 0.1 ~ 8%의 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.5 ~ 5% 중량 백분율로 포함하나, 염증 및 자극완화 개선 정도에 따라서 적절히 선택하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 iNOS 및 COX-2 유전자 발현저해, 염증매개인자인 섬유아세포의 PGE₂ 및 IL-6, IL-8의 생성 억제, 비만세포의 탈과립 저해 또는 면역세포증식 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실험예에서는 본 발명의 혼합 추출물의 iNOS 및 COX-2 유전자 발현 저해, 염증매개인자 생성 억제, 비만세포 탈과립 저해 및 면역세포증식 효과를 실험적으로 증명하였다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 자외선차단 로션, 자외선차단제, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 유화형 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 비누, 유아 전용 목욕세정제, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 제형들은 당업계에 종래 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방 산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택되는 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 H, 피리독신, 염산피리독신, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산 등이 포함되며, 또한 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등) 또는 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘 등)도 포함될 수 있 다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 비타민 A, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d-알파 토코페롤), 카로틴 등이 포함되며, 또한 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산d1-알파 토코페롤, 니코틴산d1-알파 토코페롤, 비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 포함될 수 있다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 콜라겐, 가수분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해 엘라스틴, 케라틴 등이 포함된다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등이 포함된다. 예컨대, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등이 포함된다. 스핑고 지질 은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 물질도 가능하나, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등이 포함되며, 또한 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 포함될 수 있다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

이 외에도 첨가할 수 있는 배합 성분으로 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 첨가할 수 있다.

유지 성분으로는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등이 포함된다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸 헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아 르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등이 포함될 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등이 포함될 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등이 포함될 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등이 포함될 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지 등이 포함될 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등이 포함될 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴 리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등이 포함될 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등이 포함될 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등이 포함될 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등이 포함될 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등이 포함될 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등이 포함될 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등이 포함될 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등이 포함될 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등이 포함될 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등이 포함될 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등이 포함될 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등이 포함될 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신 산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등이 포함될 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등이 포함될 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등이 포함될 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등이 포함될 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올이 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들 면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물 제조.

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 각각 200g(뿌리는 잘게세절하고, 호두 껍질은 분쇄함)을 30% 함수 부틸렌글라이콜 2.0 kg에 넣고, 추출기로 상온에서 7일간 추출한 후, 400 메쉬 여과포로 여과하고 0.45μm 필터로 여과하여 추출물 1.68 kg을 수득하였다.

실시예 2 - 9. 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물 제조.

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 각각 200g을 하기 표 1에서 보는 바와같이 추출용매를 달리하여 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 실시예 2 내지 9의 추출물을 얻었다.

[표 1].

실시예 10. 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물 제조.

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 각각 200 g을 함수 부틸렌글라이콜 2.0 kg에 넣고 80 ℃에서 환류하면서 3시간 추출한 후, 실온까지 서서히 냉각한다. 400 메쉬 여과포로 여과한 후, 최종 0.45μm 필터로 여과하여 추출액 1.56 kg을 수득하였다.

실시예 11 - 18. 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물 제조.

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질을 각각 200 g을 하기 표 2에서 보는 바와같이 추출용매를 달리하여 실시예 10과 동일한 방법을 사용하여 실시예 11 내지 18의 추출물을 얻었다.

[표 2].

제형예 1. 스킨로션의 제조

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 스킨로션의 제형예 1은 다음 표 3과 같다. 이때 상기 혼합 추출물은 실시예 10의 것이다. 비교제형예 1은 상기 혼합 추출물을 함유하지 않은 제형이다.

[표 3].

제형예 2. 로션의 제조

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 로션의 제형예 2는 다음 표 4과 같다. 이때 상기 혼합 추출물은 실시예 10의 것이다. 비교제형예 2는 상기 혼합 추출물을 함유하지 않은 제형이다.

[표 4].

제형예 3. 영양크림의 제조

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 제형예 3은 다음 표 5과 같다. 이때 상기 혼합 추출물은 실시예 10의 것이다. 비교제형예 3은 상기 혼합 추출물을 함유하지 않은 제형이다.

[표 5].

제형예 4. 영양에센스의 제조

복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 함유한 화장료 중 영양에센스의 제형예 4는 다음 표 6과 같다. 이때 상기 혼합 추출물은 실시예 10의 것이다. 비교제형예 4는 상기 혼합 추출물을 함유하지 않은 제형이다.

[표 6].

실험예 1. 혼합 추출물의 세포독성 측정.

본 발명에 따른 상기 조성물에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, 사람 섬유아세포(ATCC, CRL-2076)를 1 x 10⁵ cells/ml의 농도로 하여 24-well 배양판에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Midium, BRL, USA)을 사용하였다. 접종 24 시간 후, 혈청이 없는 배지로 교체하고, 시험 시료(실시예 10)를 농도별로 첨가 한 후 1일 동안 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200 μl씩 가하여 세척하고, DMSO를 well당 1.0 ml씩 가한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 대조구는 추출용매만을 처리한 군이며, 측정결과는 표 7에 나타내었다.

<수학식 1>

[표 7].

실험결과, 혼합 추출물은 전 농도에서 세포 독성이 전혀 없었으며, 오히려 약간의 세포 증식 효과가 나타났다.

실험예 2. 혼합 추출물의 비만 세포 탈과립 저해 실험.

비만세포(mast cell, ATCC, BRL-2H3)를 15% FBS-MEM(Fetal Bovine Serum, 소 태아혈청, Modified Eagle Medium, 기브코 사) 배지에 1 x 10⁵ 세포를 현탁시켜 24-well 배양판에 접종하여 부착시킨 후, 0.5 μg/ml의 IgE(immunoglobulin E)를 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 그 후, 배지를 제거하고 시라가니안 완충액 Ⅰ(siraganian buffer, pH 7.2, 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM PIPES, 40 mM NaOH) 0.5 ml로 세척한 후 시라가니안 완충액 Ⅱ(상기 시라가니안 완충액 Ⅰ에 5.6 mM 글루코스, 1 mM CaCl₂, 0.1% BSA를 첨가)를 160 μl 첨가하여 37 ℃에서 10분간 반응시키고 시험 시료(실시예 10) 20 μl를 처리하여 10분간 37 ℃에서 반응시켰다. 그 후, 1 μg/ml DNP-BSA를 20 μl 처리하여 30분간 37 ℃에서 반응시킨다. 이 용액을 E-튜브로 옮겨서 원심분리 후 상층액 20 μl와 기질인 1 mM ρ-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드 20 μl를 96-well 배양판에 첨가하여 37 ℃에서 1시간 반응시킨다. 정지 시약(0.1 M Na₂CO₃) 200 μl를 처리하여 405nm에서 흡광도를 측정하였으며, 항알레르기 효과는 하기 수학식 2에 따라 계산한 후 결과는 표 8에 나타내었다.

대조구 : 시료를 첨가하지 않은 실험 군.

Blank : ELISA 플레이트에 시료와 기질만 첨가한 실험 군.

Spontaneous : DNP-IgE와 시료를 첨가하지 않은 실험 군.

<수학식 2>

[표 8].

실험결과, 혼합 추출물은 100 μg/ml의 농도에서 이미 IC₅₀(비만 세포의 탈과립 저해효과가 50%인 농도)을 넘어섰으며, 200 μg/ml의 농도에서 75%의 비만 세포의 탈과립 저해효과를 보였다.

실험예 3. 혼합 추출물의 iNOS 활성 저해 실험.

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포를 이용하여 인위적으로 유발시킨 염증의 억제 효과를 알아보기 위하여 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase, 유도성 나이트릭 옥사이드 생성 효소)의 활성을 측정하였다. 페놀-레드(phenol-red)가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청, Dulbecco's Modified Eagle Medium, 기브코 사) 배지에 8 x 10⁵ 세포를 현탁시켜 24-well 배양판에 접종하여 부착시켰다. 24시간 후, 시험 시료(실시예 10)를 농도별로 처리하여 18시간 배양한 후 1 μg/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, 시그마 사)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상층액을 회수하여 96-well 배양판에 100 μl씩 넣고 그리에스 시약(Griess reagent, 시그마 사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트리트를 표준품으로 하여 검량선을 작성하고 각 시료를 배양액 중의 나이트릭 옥사이드 생성량을 측정하였다. LPS를 처리한 군의 나이트릭옥사이드의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 수득률(%)을 구하였으며, 결과는 표 9에 나타내었다. 대조구는 배지만을 처리한 군이다.

[표 9].

실험결과, 혼합 추출물을 200 μl/ml 농도로 처리한 경우에만 대조구 군의 수준으로 떨어졌을 뿐, 나머지 혼합 추출물은 iNOS의 활성을 농도 의존적으로 저해시킴을 관찰할 수 있었다.

실험예 4. 혼합 추출물의 iNOS 및 COX-2 유전자 발현 저해 실험.

생쥐의 대식세포인 Raw 264.7 세포에 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리하여 인위적으로 COX-2(Cyclooxygenase-2) 유전자 발현을 증가시킨 후, 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질 혼합 추출물에 의한 저해능을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.

10% FBS-DMEM(Fetal Bovine Serum, 소태아혈청(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 기브코 사) 배지에 8 x 10⁵ 세포를 현탁시켜 100mm 디쉬에 접종하여 부착시켰다. 24시간 후, 시험 시료(실시예 10)를 농도별로 처리하여 18시간 배양한 후 1 μg/ml의 리포폴리사카라이드(LPS, lipopolysaccharide, 시그마 사)를 처리하여 8시간 동안 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 트라이졸(Trizol, 인비트로젠 사) 1 ml을 첨가하여 인비트로젠 산의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하고 260nm에서 정량하여 역전사 중합 반응(Reverse transcription - polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트(All-in-one RT-PCR kit, 수퍼바이오 사)를 사용하였고, 프라이머(primer)의 센스와 안티센스 서열과 반응 조건은 하기에 나타내었다. 올인원 역전사 중합 반응 키트의 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였으며, 결과를 표 10에 나타내었다. 대조구는 LPS를 처리하지 않고 추출용매만을 처리한 군이다.

iNOS 프라이머

센스 : 5'-CAGTTCTGCGCCTTTGCTCAT-3'

안티센스 : 5'-GGTGGTGCGGCTGGACTTT-3'

(반응 조건 : 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃, 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분간 32회 사이클로 PCR 반응)

COX-2 프라이머

센스 : 5'-CTGAAGCCCACCCCAAAC-3'

안티센스 : 5'-AACCCAGGTCCTCGCTTATG-3'

(반응 조건 : 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분간 32회 사이클로 PCR 반응)

액틴(actin) 프라이머

센스 : 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'

안티센스 : 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'

(반응 조건 : 50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분간 22회 사이클로 PCR 반응)

[표 10].

실험결과, 혼합 추출물을 100 μg/ml 처리하였을 경우, iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 대조구 군의 수준으로 감소시켜, 항염 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 5. PGE ₂ 및 IL-6, IL-8 생성 억제.

사람의 섬유아세포를 6-well 배양판에 1 x 10⁵ 세포의 농도로 접종하여 24시간 동안 37 ℃ 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. H₂O₂ 500 μm을 well에 처리하여 24시간 동안 자극을 준 후, 시험 시료(실시예 10)를 농도별로 처리하여 48시간 동안 반응시키고 배양액을 수거하여 ELISA 분석을 실시하였다. PGE₂는 어세이 디자인(Assay Design)사의 키트를 사용하였으며, IL-6, IL-8은 엔도젠(Endogen)사의 키트를 사용하였다. 상기 각 회사의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 본 실험예의 억제효과 측정은 하기 수학식 3에 의해 계산되었다. 결과는 표 11에 나타내었다. 대조구는 추출용매만을 처리한 군이다.

<수학식 3>

억제 효과 = 1-(시험 시료-대조구)/(H₂O₂-대조구) × 100

[표 11].

실험결과, 염증 매개 물질인 PGE₂, IL-6, IL-8의 생성량이 혼합 추출물의 첨가에 의해 현저하게 줄어들어 높은 억제 효과를 보임을 확인할 수 있었다. 특히, 혼합 추출물 100 μg/ml의 농도를 처리한 경우, PGE₂ 에서는 약 87%, IL-6 에서는 약 70%의 억제 효과를 보였으며, IL-8 에서는 약 90%의 억제 효과를 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 3차원 생 인공피부에서의 항염증 효과(IL-1α 방출량 측정) 실험.

IL-1α(interleukin-1α)는 전염증 작용인자(pre-inflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질(cytokine)의 염증, 감염 등에 의한 자극에 의해 골형성 세포, 단핵세포, 대식세포, 각질형성세포, 간세포, 섬유아세포 등의 생성을 일시적으로 증가시킨다. 또한 IL-1α는 상처의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라 알레르기 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 류코트리엔 B4(leukotriene B4), 5-, 12-, 15-HETE 같은 아라키도닉산 리폭시지네이스 신진대사물질(arachidonic acid lipoxygenase metabolites)의 생산을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이에, 3차원 인공피부를 배양하여 자극을 유발시킨 후 혼합 추출물의 IL-1α의 방출양을 측정하였다.

Type Ⅰ 콜라겐 기질(Bioland, korea)과 5배로 농축된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle Medium, GIBCO BRL, USA), 그리고 2.2% NaHCO₃, 200 mM HEPES 및 0.05 N NaOH로 제조된 완충용액을 7 : 2 : 1로 섞어 만든 인간 섬유아세포주(ATCC, American Type Culture Collection, Cat. No. CRL-2076)를 1×10⁵ cells/ml의 밀도로 혼합한 후, 직경 10 mm의 삽입물(insert)에 각각 200 μl의 섬유아세포가 혼합된 콜라겐 용액을 넣어 진피를 제조한다. 진피 제조 후, 10% FBS를 함유한 DMEM을 2일마다 교체하여 7일간 배양한다. 배양된 진피위에 정상 케라티노사이트를 3×10⁵ cells/insert로 접종한다. EGF(epidermal growth factor)와 BPE(bovine pituitary extract)가 첨가된 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium, GIBCO, USA)와 DMEM(10% FBS)를 1 : 1로 섞은 배지를 넣고 7일 동안 액침배양(submerge culture) 후, 기액계면(air-lipuid interface) 배양하기 위해 삽입물안의 배지는 제거하고 삽입물 밖에만 상기 액침배양시 사용한 배지를 사용하여 14일 동안 기액계면 배양 하였다. 배양된 인공피부의 배양배지를 모두 제거한 다음 새 배지를 조직 배양 용기밖에 1.5 ml 넣는다. 삽입물 내에 10 μl의 피부자극물질(sodium lauryl sulfate; SLS)을 투여하고, 4시간 후 각 농도의 혼합 추출물(실시예 10)을 10 μl 적용한 후 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한다. SLS와 혼합 추출물의 용매는 DMSO를 사용하였으며, 농도는 용액에 대한 독성물질의 무게 퍼센트로 하여 결정하였다. IL-1α는 배지 표본을 취하여 인간 IL-1α 에세이 키트(Human IL-1α assay kit)(Endogen Inc. Boston, MA, USA)를 이용하였으며 ELISA-reader(enzyme-linked immunosorbent assay)로 450nm에서 측정하였다. 결과는 표 12에 나타내었다. 대조구는 H₂O₂를 처리하지 않고 추출용매만을 처리한 군이다.

[표 12].

실험결과, 혼합 추출물을 100 μg/ml 처리시 H₂O₂를 처리하지 않고 추출용매만을 처리한 대조구 군과 비슷한 H₂O₂ 저해효과를 나타내었다.

실험예 7. 면역세포의 생육활성 측정.

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 포르마잔 유도체는 용해제를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다. 본 실시예를 좀 더 자세히 설명하면, 사람 면역세포인 Raji(Human B cell)과 Jurkat(Human CD4⁺ T cell)을 MTT assay를 이용하여 생육활성을 측정하였다. 세포의 생육은 RPMI1640(GIBCO, USA) 배지에서 10% FBS를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 면역세포 생육활성 측정은 24-well 배양판에 세포농도를 4×10⁴ cells/ml로 하여 배양 24시간 후 각 시험 시료(실시예 10)를 농도별로 적용한다. 48시간 배양 후, 각각의 well에 있는 배지를 버리고 MTT 용액을 well당 1000 μl씩 가한 후 4시간 후, MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1000 μl씩 가한 후 24시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 혼합 추출물을 첨가하지 않고 상기 방법으로 실험을 진행한 것을 대조군으로 하여 상대적인 흡광도의 차이를 총 8일에 걸쳐 측정하여 세포의 생육활성을 관찰하였다. 결과는 표 13에 나타내었다. 대조구는 추출용매만을 처리한 군이다.

[표 13].

측정결과, 혼합 추출물 처리시 농도 의존적으로 생육활성이 증가하여 세포 생육활성을 증진시킴을 관찰 할 수 있다.

실험예 8. 피부1차 자극 후 홍반 완화 효과(폐쇄첩포실험).

상기 제형예 1 내지 4와 비교제형예 1 내지 4에 대하여 피부자극시험을 다음과 같이 수행하였다.

제형 및 소디움라우릴설페이트 0.08% 수용액을 건강한 성인 남, 녀 50명을 대상으로 등 부위에 각각 시험 시료(제형예 1 내지 4와 비교제형예 1 내지 4)의 일정량(0.2 g)을 24시간 첩포한 후 핀챔버를 제거하고 4시간 경과 후, 육안으로 피부상태 변화를 판독하여 그 결과를 표 14에 나타내었다. 자극도는 하기 수학식 4에 따라 계산하였다.

<수학식 4>

[표 14].

측정결과, 실시예 10의 혼합 추출물이 첨가된 제형예 1 내지 4는 첨가되지 않은 비교제형예 1 내지 4에서 나타나는 자극을 완화시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 9. 피부 자극 실험(stinging test).

제형예 3과 비교제형예 3의 영양크림에 피부자극제인 젖산(Sodium Laurly Sulfate)이 6.0% 되도록 놓고 피부 도포시 자극 완화효과를 확인하기 위해서 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 이는 젖산에 민감한 반응을 보이는 성인 남녀 20명(평균연령 28세, 남자 5명, 여자 15명)을 대상으로 하였다.

먼저, 젖산에 민감한 자극을 보이는 피실험자를 비누 세안을 시킨 후, 항온 항습실 21 ℃, 47% 상대습도)에서 15분간 적용시켰다. 부직포에 시험 시료(제형예 3, 비교제형예 3)를 각각 400 μl씩 도포한 후 따가움과 가려움을 잘 느낀다고 보고된 코주변과 뺨에 부직포를 붙인 후 20초 경과 후에 제거하였다. 부직포 제거 후 경과 시간대 별로(10초, 2분 30초, 5분, 8분) 하기 표 15의 기분에 의거하여 피시험자의 주관적 판정으로 따가움, 가려움 정도를 측정하여 표 16에 나타내었고, 이들로부터 항자극률을 구하여 표 17에 나타내었다. 상기 항자극률은 하기 수학식 5에 따라 계산하였다.

<수학식 5>

[표 15].

[표 16].

[표 17].

실험결과, 혼합 추출물을 함유하지 않은 비교제형예와 비교해 볼때, 자극율이 낮아지는 것으로 보아 항 자극효과가 있음을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

상기 실시예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 혼합 추출물은 iNOS 및 COX-2 유전자 발현의 효과적인 저해 효과, 염증매개인자인 PGE₂ 및 IL-6, IL-8의 생성 억제 작용, 비만세포의 탈과립 저해, 면역세포의 효과적인 증식을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물로서의 사용이 기대된다.

Claims (6)

1. 복숭아 뿌리, 자두 뿌리, 매화 뿌리 및 호두 껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부의 항염, 자극완화 및 면역증강용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼합은 복숭아 뿌리 : 자두 뿌리 : 매화 뿌리 : 호두 껍질이 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0 : 0.5 ~ 2.0의 중량비인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 프로필렌글라이콜, 글리세린, 및 부틸렌글라이콜로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 10%의 중량 백분율로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 iNOS 및 COX-2 유전자 발현 저해, 섬유아세포의 PGE₂, IL-6, IL-8 생성 억제, 비만세포의 탈과립 저해 또는 면역세포증식 효과가 뛰어남으로써 항염, 자극완화 및 면역증강 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 자외선차단 로션, 자외선차단제, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 유화형 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 샴푸, 비누, 유아 전용 목욕세정제, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.