KR20080104759A - 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페린을유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산거울(Carex humilis Leyss) 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 산거울 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 멜란-에이(melan-a)세포에서 티로시나제 저해 효과 및 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내므로 피부 미백 효과를 갖는 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

산거울, 티로시나제, 멜라닌, 미백

Description

산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페린을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Composition comprising an extract of Carex humilis Leyss or α-viniferin compound isolated therefrom for skin whitening}

본 발명은 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부, 모발, 눈 등에서 발현되는 색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈에 의해 결정되어지며 특히 피부에 있어 색을 결정하는 가장 중요한 요인은 멜라닌으로, 멜라닌의 양과 성질 그리고 분포의 정도에 따라 피부색이 결정된다. 햇볕에 피부가 노출되면 자외선을 막기 위해 멜라닌 색소가 합성되고 이것이 피부표면으로 올라와 피부를 검게 하는 것으로 알려져 있다(M. Kubo, and H. Matsuda, Fragrance Journal, 8, p48, 1995).

멜라닌은 자연계에 널리 분포하는 페놀류의 생물고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌은 물리·화학적으로 노란색-적갈색의 페오멜라닌(pheomelanin), 갈색-검은색의 멜라닌(eumelanin) 그리고 특성이 유사한 트리코 크롬(trichochrome)으로 크게 3종류로 분류하며, 햇빛(자외선)에 의해 멜라노사이트에서 티로신이 티로시나제라는 효소에 의해 도파와 도파크롬으로 변환된 뒤 복잡한 산화와 축합 반응을 거쳐 생성된다. 생성된 멜라닌은 피부 세포에 전달되고 표피 박리와 함께 멜라닌이 상실되어 소멸되는 순환 작용을 보인다. 사람의 피부색은 이 색소의 종류와 양에 의해 결정되며 이 색소의 과잉생산은 인체에 기미, 주근깨를 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암의 유발에 관여하는 것으로 알려졌으며, 식품에서는 채소, 과일, 생선 등의 질을 저하시키기도 한다. 이러한 멜라닌 생성에는 주로 티로시나제라는 효소가 관여하며 티로시나제 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 막아줌으로써 피부 미백 효과를 기대할 수 있다. (M. Seiji, K. Shimao, M. S. Birbeck, and T. B. Fitzpatrick, Ann . N.Y. Acad . Sci ., 100, p497, 1963).

피부 미백 화장품에 있어 멜라닌 생성을 억제하는 방법은 크게 다음과 같이 나눌 수 있다. 한 가지 방법은 멜라닌 생성의 주원인인 자외선을 차단하여 제거하는 것으로, 이 방법은 화장품 조성물에 광 산란제 또는 광 차단제를 함유시켜 좋은 결과를 기대할 수 있다. 또 다른 한 가지 방법은 글루코사민과 같이 티로시나제가 활성을 나타내기 위해 필요한 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제시키는 것이다. 또한 효소산(코직산) 또는 알부틴과 같이 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나제의 기능을 방해하는 방법도 있다. 또 다른 방법은 하이드로퀴논과 같이 멜라닌을 생성하는 세포인 멜라노사이트에 대하여 특이적인 독성을 가지고 있어 세포 분열을 방해하는 방법이다. 비타민 C와 같이 티로신이 도파와 도파크롬을 거쳐 복잡한 산화와 축합반응을 거치는 동안에 강한 항산화 효과를 발휘하여 피부 미백효과를 기대하는 방법도 있다.

멜라닌 합성 저해제는 의약품, 화장품, 식품 등에서 피부질환 치료제, 피부 미백제, 식품 갈변방지제 등에 적용되고 있고, 최근 그 수요가 급증하고 있으며, 그 결과 다양한 미백제가 개발되어 사용되고 있으나, 여러 가지 문제점이 제기되고 있다.

미백제로서 발표된 선행 발명의 예를 보면, 아스코르빈산(일본 특개평 4-9320)의 사용으로 미백 효과를 볼 수 있는 방법이 제시되어 있다. 그러나 아스코르빈산 자체가 처방계 중에서 상 안정성의 문제로 시간이 경과하면서 그 유효 성분의 활성도가 떨어지므로 최근에는 캡슐 및 리포좀으로 안정화시키는 등의 다양한 방법이 제기되고 있으나 아직 뚜렷한 안정화 방법을 제시하지 못하고 있다. 하이드로퀴논(일본 특개평 6-192062)은 기미, 주근깨, 반점 및 임신기의 과잉색소증과 같은 과잉 색소증 치료에 국부적으로 사용되고 있다. 이들 화합물은 강력한 멜라닌 생성 저해활성을 보이지만 색소 세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 인해 일부 국가에서만 사용이 허가되고 있으며, 발암성 물질이여서 화장품으로서의 사용에 제한을 받고 있다. 코직산(일본 특개평 56~7710)은 티로신이 도파와 도파크롬으로 변해 가는 중간에 관여하는 유일한 효소인 티로시나제의 저해능이 탁월하여 미백 효과가 우수하게 나타나지만 처방계 중에서 갈색으로 변화하는 등 안전성 측면에서 재고되고 있다. 알부틴(일본 특개평 4~9315)은 코지산과 마찬가지로 티로시나제에 대한 억제 능력이 검증되고 있으나, 알부틴 자체가 하이드로퀴논에 당이 붙어있는 상태로 화장료로 적용시 피부 효소에 의해 당이 분리된 후 하이드로퀴논에 의한 피부자극이 우려되기도 하며, 낮은 저해활성, 사용중의 변색, 물질 자체의 불안정성 등의 문제점이 있다.

이에 따라 부작용 없이 안전하며, 어느 한 가지 요소에만 관여하는 물질이 아닌 실제 생체 임상실험에서 복합적으로 그 효과를 나타낼 수 있는 신규 미백제가 절실히 요구되고 있다.

산거울(Carex humilis Leyss)은 우리나라 각처의 그늘진 바위틈이나 건조한 숲 속에 나는 다년초이다. 키는 6-10cm, 근경은 굵고 짧으며, 줄기는 적고, 총생이다. 잎은 좁고 길며, 길이는 30cm 정도, 폭은 1mm 정도 되며, 가장자리는 거칠거칠하고, 짧은 털이 나 있다. 작은 이삭은 2-3개, 수꽃 이삭은 1개가 줄기 끝에 붙고, 선상 피침형, 자루가 있으며, 길이 12mm 정도의 엷은 적갈색이다. 암꽃이삭은 1-2개가 줄기 옆에 붙고, 선형이며, 길이는 3mm 정도의 적갈색이다. 비늘조각은 타원형으로 끝이 날카롭고 작으며, 가는 까락이 있다. 과낭은 비늘 조각보다 매우 짧으며, 암술머리는 3갈래로 갈라진다. 열매는 수과로 길이 2mm의 세모진 넓은 도란형이다(이영노, 한국식물도감, 교학사, p1086, 1998).

산거울 추출물로부터 분리된 화합물인 알파-비니페린(α-viniferin)은 선행 보고에서 COX(cyclooxygenase)-2의 활성과 TNF의 방출을 동시에 억제하고(공개특허 특2003-0084271), 프로스타글란딘(prostaglandin)이라는 염증유발 물질을 합성하는 COX 활성을 억제하여 염증반응 억제에 관여한다는 보고가 있었으며(Lee SH, Shin NH, Kang SH, Planta Med , 64(3), pp204-207 , Apr, 1998), 또한 해외특허 안티튜머 에이전트(Anti-tumor agents, NO99 04776)에서 토포아이소머레이즈 II(topoisomerase II)의 활성을 억제하여 항암 효과를 가지는 것으로 보고된 바 있지만 아직까지 산거울 추출물의 피부 미백 효과에 대해 보고된 적은 없다.

이에 본 발명자들은 산거울 추출물 및 이로부터 분리된 화합물이 멜라닌 생합성 억제를 통한 피부 미백에 탁월한 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(I)로 표기되는 알파-비니페린(α-viniferin) 을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 하기 화학식(I)로 표기되는 알파-비니페린(α-viniferin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 산거울 추출물은 산거울의 줄기, 종자, 잎 또는 뿌리, 바람직하게는 뿌리로부터 추출됨을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 75 내지 100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 n-부탄올에 가용된 추출물이고, 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매, 바람직하게는 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명의 산거울 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 산거울 조추출물은 산거울의 뿌리를 건조하여 그 중량의 약 1 내지 20배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매, 바람직하게는 약 75 내지 100% 에탄올로 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 20 내지 50℃의 추출 온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 6내지 8일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법, 바람직하게는 환류냉각추출 방법으로 추출한 추출액을 감압 여과하여 얻은 추출물을 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 50 내지 70℃에서 감압 농축한 후 본 발명의 산거울 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 산거울 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 산거울 조추출물, 바람직하게는 산거울 에탄올 가용 조추출물 중량의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 1 내지 10배 부피의 물을 분산시킨 후, 비극성용매부인 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린 또는 프로필렌글리콜, 바람직하게는 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트 및 극성용매부인 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 n-부탄올을 순차적으로 물과 동량 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 산거울 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 하기와 같이 분리될 수 있다.

상기 수득 방법으로 얻어진 비극성용매 추출물 중 에틸아세테이트 용매 추출물을 클로로포름 : 메탄올 (20 : 1 → 4 : 1(v/v))을 용출용매로 크로마토그래피를 수행하여 5개의 분획으로 나눈 다음, 세 번째 분획을 컬럼크로마토그래피로 5개의 분획으로 나누어 분획 중 세 번째 분획을 농축하여 농축액을 얻은 후, 메탄올로 재결정하여 본 발명의 알파-비니페린을 수득할 수 있다.

본 발명의 알파-비니페린은 시중 구입 가능하거나, 상기 방법으로 수득될 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 산거울 추출물 또는 이로부터 분리되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.001 ~ 20 중량% 포함한다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부외용 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크 림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 외용투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 산거울은 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이들로부터 추출된 본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 자극 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물은 피부 미백 효과를 위한 화장품 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를들어, 각종 크림, 로션, 스킨, 에센스 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 팩, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지 만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카 프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실 록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬 술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라 우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프 로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산거울 조추출물(ch-1)의 제조

경동시장에서 구입한 산거울(Carex humilis Leyss) 뿌리 1kg의 건조물을 95% 에탄올 7L로 7일간 실온에서 환류냉각추출방법으로 2회 반복 추출한 후, 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, H-100, 일본)로 감압 농축하여 750g의 산거울 조추출물을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, ch-1이라 명명함).

실시예 2. 산거울 비극성 용매 가용 추출물의 제조

2-1. 산거울 메틸렌클로라이드 추출물(ch-2)의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 산거울 조추출물 100g을 증류수 1kg에 현탁시킨 다음 메틸렌클로라이드 1kg을 사용하여 진탕 추출한 후 분획하고 유기용해층을 감압 농축하여 산거울 메틸렌클로라이드 가용추출물 6.5g(건조중량)을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, ch-2라 명명함).

2-2. 산거울 에틸아세테이트 추출물( ch -3)의 제조

상기 실시예 2-1의 잔류 물층을 에틸 아세테이트 1kg으로 진탕 추출한 후 분획하고 감압 농축하여 산거울 에틸아세테이트 추출물 7g(건조중량)을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, ch-3라 명명함).

실시예 3. 산거울 극성 용매 가용 추출물의 제조

3-1. 산거울 n-부탄올 추출물(ch-4)의 제조

상기 실시예 2-2의 잔류 물층을 n-부탄올 1kg으로 진탕 추출한 후 분획하고 감압 농축하여 산거울 n-부탄올 추출물 7g(건조중량)을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, ch-4라 명명함).

3-2. 산거울 추출물(ch-5)의 제조

상기 실시예 3-1의 잔류 물층을 감압 농축하여 산거울 추출물 15.3g(건조중량)을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다(이하, ch-5라 명명함).

실시예 4. 산거울 추출물로부터 알파-비니페린의 분리

실시예 2-2의 ch-3를 실리카겔(Merck silica gel 60, 0.063 ~ 0.20 ㎜)로 충진된 컬럼에서 클로로포름:메탄올 (20:1(v/v))의 혼합용매로 분리하여 5개의 분획물을 수득하였으며, 이중 세 번째 분획물을 캅셀팍(Capcellpak C18, 20 × 250 mm, 시세이도, 일본) 컬럼을 사용하여 세미-프렙(semi-prep) 분리를 하여 5개의 분획물을 얻었으며, 전개용매로는 45% 메탄올을 사용하였다. 그 후 3번 분획물에서 얻어진 농축액을 메탄올로 재결정하여 하기 물성치를 갖는 알파-비니페린(α-viniferin) 3.5g을 수득하였고, 하기 실험예에 사용하였다.

NMR 기기로 ¹H-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 500 MHz), ¹³C-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 200 MHz)의 NMR 기기로 그 구조를 분석하였으며(하기 표 1 참조), 사용된 용매는 아세톤(acetone-d⁶)으로 알드리치(Aldrich) 사에서 구입하여 사용하였고, 내부표준물질로 트리메칠실란을 사용하여 δ값(ppm)으로 나타내었으며, NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다(Lee SH, Shin NH, Kang SH, Planta Med , 64(3), pp204-207, Apr, 1998).

¹H-NMR (500MHz, Acetone-d₆): δppm 4.11 (s, 1H, H-3(I)), 4.77 (d, 1H, H- 3(III)), 4.85 (d, 1H, H-3(II)), 5.05 (d, 1H, H-2(III)), 6.09 (d, 1H, H-2(II)), 6.14 (d, 1H, H-5(I)), 6.22 (s, 1H, H-2(I)), 6.38 (m, 3H, H-7(I,II,III)), 6.74 (d, 1H, H-5(III)), 6.87 (m, 3H, H-3′, 5′(I), H-5(II)), 6.92 (m, 4H, H-3′,5′(II,III)), 7.18 (m, 4H, H-2′, 6′(I,III)), 7.36 (m, 2H, H-2′, 6′(II));

¹³C-NMR (125MHz, Acetone-d₆): δppm 46.4 (C-3(I)), 52.8 (C-3(II)), 55.7 (C-3(III)), 86.4 (C-2(I)), 90.0 (C-2(II)), 95.6 (C-2(III)), 96.6 (C-7(II,III)), 98.0 (C-7(I)), 105.8 (C-5(III), 106.2 (C-5(II)), 108.5 (C-5(I)), 115.7 (C-3′,5′(I)), 116.1 (C-3′,5′(III, II)), 118.8 (C-3a(I)), 119.7 (C-3a(III)), 120.9 (C-3a(II)), 128.1 (C-2′,6′(I)), 128.2 (C-2′,6′(II)), 128.6 (C-2′,6′(III)), 132.0 (C-1′(I)), 132.3 (C-1′(II)), 132.5 (C-1′(III)), 138.7 (C-4(III)), 139.7 (C-4(II)), 141.2 (C-4(I)), 157.8 (C-4′(I)), 158.2 (C-4′(II)), 158.4 (C-4′(III)), 159.4 (C-6(II,I)), 160.7 (C-7a(II)), 160.8 (C-6(III)), 161.6 (C-7a(I)), 161.8 (C-7a(III)).

이름	구조
알파-비니페린 (α-비니페린)

실험예 1. 머쉬룸 티로시나제 활성 저해 효과

상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 멜라닌 생합성 저해에 관여하는지 알아보기 위해 반니 등의 방법(A. Vanni, Annali di Chimica, 80, p35, 1990)으로 머쉬룸 티로시나제 활성 저해효과를 측정하였다.

0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8) 1.0 ㎖, 0.3 ㎎/㎖ 농도의 L-티로신 수용액 1.0 ㎖ 및 1,250 U/㎖ 농도의 머쉬룸 티로시나제(시그마사, T-7755) 0.1 ㎖를 혼합한 후 여기에 상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 시료용액을 1μg/㎖ 내지 300μg/㎖의 농도로 각각 0.2 ㎖를 첨가하여 37℃에서 10분간 효소반응을 진행시켰고, 양성대조군으로는 알부틴(바이오랜드 사)을 사용하였다. 반응용액의 흡광도를 480 nm에서 측정하여 하기 수학식 1로 티로시나제의 활성 억제율을 구하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

머쉬룸 티로시나제 활성 억제율 (%) = [(A-B)/A] × 100

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 480 nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 480 nm에서 흡광도

시험군	IC50 (μg/㎖)
알부틴(대조군)	114
실시예 1의 ch-1	12.24
실시예 2-1의 ch-2	150.59
실시예 2-2의 ch-3	8.84
실시예 3-1의 ch-4	187.25
실시예 3-2의 ch-5	142.98
알파-비니페린(α-viniferin)	13.12

실험결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 ch-1, 실시예 2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린에서 머쉬룸 티로시나제 억제 효과가 가장 높게 나왔다. 따라서 실제 멜라닌 생성의 초기 단계에 관여하는 티로시나제 활성을 저해함으로써 본 발명의 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페린이 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타내는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 2. 멜란-에이(melan-a)세포를 이용한 세포 독성 실험

상기 실험예 1에서 효과가 가장 좋았던 실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린(α-viniferin)을 시료로 사용하여 멜란-에이 세포(melan-a, St. George's University로부터 분양, 영국)의 세포 생존율을 측정함으로써, 이들이 독성이 있는지 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다(A. Vanni, Annali di Chimica, 80 , p35, 1990).

멜란-에이(melan-a)세포를 10% 소혈청(깁코사, 미국), 1% 항생제(깁코사, 미국), 200nM TPA(Tetradecanoyl phorbol acetate, 시그마사, 미국)가 첨가된 RPMI 1640 배지(깁코사, 미국)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 24웰 배양접시에 접종하고 하루 동안 10% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 그 후 새로운 배지로 교체하고, 시료를 농도별(1 또는 5 μg/㎖)로 처리하여 3일간 배양하였으며, 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. 3일 후 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT (3-[4,5- 디메틸띠아졸-2-일] -2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 시그마사, 미국)를 1.0 ㎖ 처리하여 37℃에서 4시간 반응시키고, MTT를 제거한 후 DMSO (Dimethylsulfoxide) 1.0 ㎖을 첨가하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시험군	실험농도 (μg/㎖)	세포생존율 (%)
실시예 1의 ch-1	1	101.15
	5	100.80
실시예 2-2의 ch-3	1	99.87
	5	101.24
알파-비니페린	1	100.57
	5	98.54

실험결과, 상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 또는 실시예 4의 알파-비니페린을 처리하여 배양한 멜란-에이(melan-a)세포는 세포생존율이 약 98.54 내지 101.24%였다. 따라서 실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린은 독성이 거의 없는 안전한 물질임을 알 수 있었다.

실험예 3. 멜란-에이(melan-a)세포를 이용한 티로시나제 활성 저해 효과

실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린의 멜란-에이(melan-a)세포에서 티로시나제 활성 저해 효과를 알아보기 위해 반니 등의 방법(A. Vanni, Annali di Chimica, 80 , p35, 1990)으로 하기와 같이 실험을 수행하였다.

멜란-에이(melan-a)세포를 10% 소혈청, 1%의 항생제와 200 nM TPA를 첨가한 RPMI 1640 배지에 1×10⁶ 세포의 밀도로 100 ㎜ 배양접시에 접종하고 하루 동안 10% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 그 후 새로운 배지로 교체한 후 실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 이로부터 분리된 알파-비니페린을 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하여 세포를 떼어낸 후 세포 침전물을 획득하여 1% 트리톤 X-100과 2mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)가 포함된 0.1M 포타슘 포스페이트 완충용액 (pH6.8) 0.5 ㎖을 첨가하여 얼음 속에서 1시간동안 초음파분쇄기로 세포를 깬 후 4℃ 원심분리기에서 15,000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리한 상층액 0.3㎖과 1.5mM 티로신 0.3 ㎖을 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 활성 억제 효과를 하기 표 4에 나타내었다. 상층액의 단백질 정량은 시그마사의 BCA 단백질 정량 방법에 따라 분석하였으며, 생성된 멜라닌의 흡광도를 단백질 양으로 나누어 계산하였다.

	실험농도(μg/㎖)	티로시나제 저해율(%)
알부틴(대조군)	1000	30.24
	2000	76.32
실시예 1의 ch-1	1	14.85
	5	19.45
실시예 2-2의 ch-3	1	15.98
	5	29.62
알파-비니페린	1	11.14
	5	10.28

실험결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 2-2의 ch-3을 처리하여 배양한 멜란-에이(melan-a)세포는 15.98 내지 29.62%로 농도대비 가장 높은 티로시나제 저해능을 보였으며, 실시예 1의 ch-1 및 알파-비니페린 역시 알부틴과 비교하여 적은 농도에서도 높은 티로시나제 저해능을 보였다. 따라서 실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린은 높은 티로시나제 저해율을 보임으로써 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과를 나타내는데 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 4. 멜란-에이(melan-a)세포를 이용한 멜라닌 생합성 억제 효과

실시예 1의 ch-1, 실시예 2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린의 멜란-에이(melan-a)세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 알아보기 위해 마에다 및 푸쿠다의 방법 (Maeda and Fukuda, J. Soc. Cosmetic Chem., 42 , p361, 1991)을 조금 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

멜란-에이(melan-a)세포를 10% 소혈청, 1%의 항생제와 200nM TPA를 첨가한 RPMI 1640 배지에 1×10⁵ 세포의 밀도로 6웰 배양접시에 접종하고 하루 동안 10% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 세포를 접종한 웰 배양접시는 멜라닌 생합성량과 세포생존율을 측정하기 위해 두 세트를 준비하였다. 1일 배양된 세포의 배지를 새로운 배지로 갈아준 후 시료를 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였으며, 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. 3일 후 멜라닌 양을 측정할 세트의 세포는 PBS로 세척 후 1N 수산화나트륨 0.5 ㎖을 처리하여 1.5 ㎖ 튜브로 수거하고 초음파 분쇄(sonication)하여 완전히 멜라닌을 용해한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 한 세트는 상기 실험예 2와 같은 방법으로 MTT를 처리하고 세포 생존율을 측정하여 생성된 멜라닌 생성량을 세포수로 나누어 단위 세포당 멜라닌 생합성 저해율(%)을 구하여 하기 표 5에 나타내었다.

	실험농도 (μg/㎖)	멜라닌 생합성 저해율(%)
알부틴(대조군)	1000	36.82
실시예 1의 ch-1	1	10.54
	5	19.84
실시예 2-2의 ch-3	1	11.84
	5	22.12
알파-비니페린	1	10.51
	5	9.64

실험결과, 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 2-2의 ch-3은 약 11.84 내지 22.12%로 알부틴에 비해 적은 농도에서도 멜라닌 생합성을 저해하는 효과가 가장 높았고, 농도가 높아져도 멜라닌 생합성 저해 효과가 증가하지 않는 알파-비니페린에 비해 실시예 1의 ch-1과 실시예 2-2의 ch-3은 농도가 증가할수록 멜라닌 생합성 저해 효과도 높아짐을 알 수 있었다.

실험예 5. 피부 자극성 시험

산거울 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 피부 자극 정도를 알아보기 위하여 식품의약품안전청 고시1999-61호 "의약품의 독성 시험 기준"에 따라 본 연구소 내부적으로 뉴질랜드 화이트(New Zealand White) 수컷 토끼를 대상으로 피부자극시험을 실시하였다. 관찰은 첩포 24시간 후 첩포 부위에 대한 홍반, 가피형성, 부종형성 등의 피부자극 반응을 관찰하였다.

실시예 1의 ch-1, 실시예2-2의 ch-3 및 실시예 4의 알파-비니페린 (α-viniferin)을 토끼의 피부에 적용한 결과, 이들에 따른 일반증상의 변화는 관찰되지 않았으며, 사망동물도 관찰되지 않았다. 또한 홍반, 가피 형성 등을 관찰한 결과 가벼운 홍조가 발견되었으나, 자극성을 평가한 결과 자극 지수가 약한 자극성 물질로 분류되어 자극성이 거의 없는 물질로 평가되어 안전하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 유연 화장수(스킨)의 제조

산거울 에틸아세테이트 추출물을 함유한 화장료 중 유연 화장수(스킨)의 제제예를 하기 표 6에 나타내었다.

번호	원료	단위 : 중량 %
		제형예 1	비교제형예 1
1	실시예 2-2의 ch-3	2.0	-
2	글리세린	3.0	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0	2.0
5	폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.00	1.0
6	에탄올	10.0	10.0
7	트라이에탄올아민	0.1	0.1
8	방부제	미량	미량
9	색소	미량	미량
10	향료	미량	미량
11	정제수	잔량	잔량
합 계		100	100

〈제조방법〉

제형예 1

11에 2, 3, 4 및 8을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 5를 60℃정도 가열하여 용해시킨다. 그 후 10을 투입, 교반하고 11에 투입한다. 마지막으로 1, 6, 7 및 9를 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이크로플루다이져를 통과시킨 후 숙성시켰다.

비교제형예 1

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

제제예 2. 영양화장수(로션)의 제조

산거울 에틸 아세테이트 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수(로션)의 제제예를 하기 표 7에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 2	비교제형예 2
1	실시예 2-2의 ch-3	2.0	-
2	시토 스테롤	1.70	1.70
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	1.2	1.2
6	콜레스테롤	1.5	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라우어오일	10.0	10.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
11	산탄검	0.3	0.3
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
합 계		100	100

〈제조방법〉

제형예 2

원료물질 2, 3, 4 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 2

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

제제예 3. 영양크림의 제조

산거울 에틸 아세테이트 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 제제예를 하기 표 8에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 3	비교제형예 3
1	실시예 2-2의 ch-3	3.0	-
2	시토 스테롤	4.0	4.0
3	폴리글리세릴 2-올레이트	3.0	3.0
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	2.0	2.0
6	콜레스테롤	3.0	3.0
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라우어오일	22.0	22.0
10	카르복시비닐폴리머	0.5	0.5
11	트라이에탄올아민	0.5	0.5
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
합 계		100	100

〈제조방법〉

제형예 3

원료물질 2, 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 3

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.

제제예 4. 에센스의 제조

산거울 에틸아세테이트 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 제제예를 하기 표 9에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 4	비교제형예 4
1	실시예 2-2의 ch-3	0.05	-
2	시토스테롤	1.70	1.70
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50
4	세라마이드	0.7	0.7
5	세테아레스-4	1.2	1.2
6	콜레스테롤	1.5	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4	0.4
8	농글리세린	5.0	5.0
9	선플라우어오일	15.0	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
11	산탄검	0.2	0.2
12	방부제	미량	미량
13	향료	미량	미량
14	정제수	잔량	잔량
합 계		100	100

〈제조방법〉

제형예 4

원료물질 2, 3, 4, 5 및 6을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 7, 8 및 14를 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 9를 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 10, 11, 12 및 13을 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켰다.

비교제형예 4

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 4와 동일한 방법으로 제조하였다.

제제예 5. 유화형 파운데이션의 제조

산거울 에틸아세테이트 추출물을 함유한 화장료중 유화형 파운데이션의 제제예를 하기 표 10에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 5	비교제형예 5
1	실시예 2-2의 ch-3	2.0	-
2	밀납	2.0	2.0
3	사이크로메치콘	2.0	2.0
4	유동파라핀	5.0	5.0
5	스쿠알란	5.0	5.0
6	스테아린산	2.0	2.0
7	친유성 모노스테아린산 글리세린	3.0	3.0
8	카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드	4.0	4.0
9	글리세린	4.0	4.0
10	프로필렌글리콜	3.0	3.0
11	부틸렌글리콜	3.0	3.0
12	트라이에탄올아민	1.0	1.0
13	알루미늄마그네슘실리케이트	0.5	0.5
14	안료	12	12
15	방부제	미량	미량
16	향료	미량	미량
17	정제수	잔량	잔량
합 계		100	100

〈제조방법〉

제형예 5

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 17을 혼합교반하면서 80~85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8을 80~85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화시킨다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 16을 투입하고 35℃까지 냉각한 뒤 1을 투입하였고, 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

비교제형예 5

원료물질 1을 제외하고 상기 제형예 5와 동일한 방법으로 제조하였다.

제제예 6. 세안제(클렌징 폼)

정제수에 N-아실글루타민산 나트륨, 글리세린, PEG-400 및 프로필렌 글리콜을 첨가하여 혼합한 후, 실시예 4의 알파-비니페린을 소량씩 가하고 EDTA-4Na를 첨가하여 교반하면서 80℃에서 가열하여 용해시켰다. 여기에 80℃에서 가열한 POE(15)올레일알코올 에테르, 라우린 유도체 및 메틸 파라벤 혼합용액을 첨가하여 교반한 다음, 향료를 가하여 서서히 냉각하여 알파-비니페린 함유 세안제를 제조하였다. 하기 표 11에 각 성분의 함량을 나타내었다.

원료	제형예 6 함량(w/w %)
알파-비니페린	20.0
N-아실글루타민산 나트륨	20.0
글리세린	10.0
PEG-400	15.0
프로필렌 글리콜	10.0
POE(15)올레일알코올 에테르	3.0
라우린 유도체	2.0
메틸 파라벤	0.2
EDTA-4Na	0.03
향료	0.2
정제수	잔량

제제예 7. 친수성 연고제의 제조

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	알파-비니페린	0.5	-
2	백색 바세린	250	250
3	스테아릴 알콜	220	220
4	에칠(또는 메칠)p-옥시벤조에이트	0.25	0.25
5	프로필렌 글리콜	120	120
6	라우릴 황산 나트륨	15	15
7	프로필 p-옥시벤조에이트	0.15	0.15

임상 실험예 1. 인체 피부 수준에서의 미백 효과

산거울 추출물 및 이로부터 분리된 알파-비니페린(α-viniferin)의 실제 인체 피부 수준에서의 미백 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

건강한 남녀 20명을 대상으로 피검자의 윗 팔 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소 홍반량(MED ; Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 색소 침착을 유도하고, 시험 물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 각 시험 물질(상기 제형예 1 내지 3 및 비교제형예 1 내지 3)을 아침과 저녁에 걸쳐 매일 2회 바르도록 하였다. 효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 L^* 값을 구하여 결정하였다. 일반적으로 인공적인 색소 침착을 유도하지 않은 한국인 피부의 L^* 값은 50~70의 영역에 속한다. 시험 물질들을 도포하여 효과가 있을 경우에는 L^* 값이 점차 증가하게 된다. 도포 시작 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(ΔL^*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하여 사람 피부에서의 미백 효과를 비교하였으며, 그 측정결과를 하기 표 13에 나타내었다.

ΔL^* =시험물질 도포 마지막 날의 L^* 값 - 시험물질 도포 전의 L^* 값

시험 물질	미백 효과 (ΔL*)
제형예 1	4.14
비교제형예 1	1.22
제형예 2	3.87
비교제형예 2	1.24
제형예 3	4.19
비교제형예 3	1.39

실험결과, 상기 표 13에 나타난 바와 같이, 산거울 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페린을 원료로 만들어진 화장품들은 3.87 내지 4.19로 그렇지 않은 제품이 1.22 내지 1.39 인 것과 비교하여 미백 효과가 탁월히 뛰어나다는 사실을 확인할 수 있었다.

본 발명의 산거울 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 멜란-에이(melan-a)세포에서 티로시나제 저해 효과 및 멜라닌 생합성 저해 효과를 나타내므로 피부 미백용 피부외용 약학조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (9)

1. 산거울(Carex humilis Leyss) 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페 린(α-viniferin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 피부외용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 산거울 추출물은 산거울의 줄기, 종자, 잎 또는 뿌리로부터 추출됨을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용된 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 극성용매 가용 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
6. 제 3항에 있어서, 상기 비극성용매 가용추출물은 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 또는 에테르로부터 선택된 용매에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 20 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
8. 산거울(Carex humilis Leyss) 추출물 또는 이로부터 분리된 알파-비니페린(α-viniferin)을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징 로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.