KR100714172B1 - 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 화합물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 피부를 주름이 없는 생생한 피부를 유지하는데 있어 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 콜라겐과 같은 세포외 간질을 생합성하는 섬유아세포의 증식과 대사를 원활히 할 뿐만 아니라, 세포외 간질인 콜라겐의 생합성을 촉진하며 세포외 간질 성분 분해 효소(MMPs)를 억제함으로써 피부의 주름, 잔주름 및 거칠어짐 등의 피부 노화를 근본적으로 예방 및 개선 할 수 있는, 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물 및 피부 외용제로 사용할 수 있다.

화합물, 피부주름, 피부노화, 피부개선, 화장료

Description

주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 화장료 조성물{Cosmetic composition having the anti-wrinkle activity}

도 1 은 지유 글리코사이드 Ⅰ화합물의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타낸 도이고,

도 2 는 지유 글리코사이드 Ⅰ화합물의 ¹³C-NMR 분석 결과를 나타낸 도이며,

도 3 은 28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터 화합물의 ¹H-NMR 분석 결과를 나타낸 도이고,

도 4a 및 도 4b 는 그룹 1의 집단에 대하여 주름 깊이 감소에 의한 피부 탄력도 개선 효과를 피부탄력도측정기로 측정한 사진으로써, 도 4a 는 비교제형예 3을 오른쪽 눈 가장자리에 처리하여 사용전과 사용후 30일째의 피부 표면의 피부 주름 깊이를 측정한 사진이고, 도 4b 는 제형예 5를 왼쪽 눈 가장자리에 하루에 세안 후 아침 및 저녁에 2회 처리하여 사용전과 사용후 30일의 피부 표면의 피부 주름 깊이를 측정한 사진이며,

도 5a 및 도 5b 는 그룹 2의 집단에 대하여 주름 깊이 감소에 의한 피부 탄 력도 개선 효과를 피부탄력도측정기로 측정한 사진으로써, 도 5a 는 비교제형예 3을 오른쪽 눈 가장자리에 처리하여 사용전과 사용후 30일째의 피부 표면의 피부 주름 깊이를 측정한 사진이고, 도 5b 는 제형예 5를 왼쪽 눈 가장자리에 하루에 세안 후 아침 및 저녁에 2회 처리하여 사용전과 사용후 30일의 피부 표면의 피부 주름 깊이를 측정한 사진이다.

본 발명은 지유로부터 분리된 화합물을 함유하고 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 주름 증가와 탄력감소, 색소 침착 등의 여러 형태로 나타난다. 그 중 가장 대표적인 노화의 현상은 바로 주름이다. 이러한 주름을 생성하게 하는 피부의 노화원인은 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다. 나이가 들어감에 따른 자연적인 노화인 내적 요인과 외적 요인으로 인한 노화이다. 외적 요인으로는 자외선, 공해, 병, 음주, 흡연 등이 있고, 내적 요인으로는 프리라디칼과 염증의 발생, 스트레스, 세포 활성의 저하 및 돌연변이화, 세포대사 불균형 등이다(Peter T., et al., Physiology Of The Skin, Allured Publishing Corporation, pp61-72). 피부의 구조에 따라 주름 발생원인을 좀 더 자세히 설명하면, 피부는 크게 표피와 진피로 나뉜다. 표피에서의 주름 생성 원인으로는 각질 형성 세포의 턴-오버(turn-over)의 감소로 각질층의 누적과 이로 인해 각질층의 두꺼워지고, 각질층의 수분 함유 능력이 감소되고, 각질이 경화되어 주름이 발생하게 된다. 표피와 진피의 경계부위는 표피세포 지지, 부착, 영양물질의 이동, 표피 분화의 조절 등에 관여하는데, 각종 노화 요인으로 특히, UV 에 인하여 콜라겐 IV, VII이 감소되어 표피, 진피 지지기능이 감소되고, 선별 투과 기능이 약화되어 해로운 성분이 쉽게 진피에 영향을 미치게 되어 주름이 생성된다(Keene, J. Cell Biol., 104, pp611-621, 1987). 진피는 표피의 아래에 있는 결합조직으로 이루어지는 조직으로 표피 세포인 케라티노사이트처럼 치밀하게 채워져 있지 않고 세포외 공간이 많으며 세포외 간질(extracellular matrix)이라 불리는 거대 분자의 망상 구조에 의해 채워져 있다. 이 세포외 간질은 진피내의 섬유아세포에서 만들어지며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유상 단백질과 히알루론산 등의 산성 뮤코다당체라 불리는 다당류로 이루어져 있다. 세포외 간질은 피부의 탄력성, 신진대사, 생기 등에 직접적으로 관여하고 있다. 좀 더 자세히 설명하면, 산성 무코다당체는, 대량의 물을 이의 분자내에 유지하여 겔상을 나타내고, 이 겔내의 물이 영양분, 대사산물, 호르몬 등을 혈관으로부터 조직 중의 세포까지 침투시키는 작용을 담당하고 있다. 따라서, 세포외 간질에 있어서의 산성 무코다당체의 생산이 촉진되면, 피부가 싱싱하게 될뿐만 아니라, 피부의 신진 대사가 촉진되어, 피부 노화를 방지하는 것이 가능하게 된다.

또한, 섬유성 단백질은, 조직의 형태를 유지하거나, 피부에 탄성을 부여하는 등의 기능을 담당하고 있다. 따라서 세포외 간질에 있어서의 섬유성 단백질의 생 산이 촉진되면, 피부에 탄력을 주게 되어, 주름 또는 잔주름이 억제된다. 이러한 세포외 간질을 생산하는 섬유아세포의 활성이 내적, 외적인 노화 요인, 특히, UV에 의해 저하되게 되면 콜라겐 생합성이 감소하고 변성된 엘라스틴이 증가하게 된다. 또한 매트릭스 메탈로프로테나아제(Matrix Metalloproteinases. MMPs)의 증가로 콜라겐 등의 세포외 간질의 분해가 증가되고 진피내 태양열상이 발생하게 되고, 표피-진피 경계부가 파괴되어 유해 성분이 유입되고 진피 분해가 가속화된다. 특히, 콜라겐 I 은 피부 진피의 주성분으로 MMP-1 에 의해 분해 된다. 따라서, 결국에는 피부의 탄력성이나 싱싱함, 생기를 잃게 되고, 주름, 잔주름, 피부의 거칠어짐이 발생하게 되어 피부 노화를 초래하는 하나의 원인이 된다. (Funtional Cosmetology, society of cosmetic chemists of Japan, pp163-180;Herrmann G. et al., Journal of Investigative Dermatology, 107(3), pp92, 1996;Brenneisen P. et.al., Photochemistry & Photobiology, 64(5), pp649, 1996) 위와 같이 주름 생성 요인 중 가장 큰 부분을 차지하고 있는 콜라겐 등의 세포외 간질의 합성량을 증가시키고 매트릭스 메탈로프로테나아제(Matrix Metalloproteinases. MMPs)을 저해함으로서 생기가 있는 젊은 피부를 유지하기 위한 방법을 모색하기 위한 시도가 이루어지고 있다.

본 발명은 생귀소바(Sanguisorba)속에 속하는 식물로부터 추출된 추출물을 유효 성분으로 하여 주름의 생성을 억제 및 개선시키기 위한 화장료를 제조하기 위한 것이다. 주름 생성 억제제 및 개선제의 유효 성분으로 사용할 수 있는 추출물을 제공하는 생귀소바 속에 속하는 식물로는 큰오이풀(Sanguisorba alpinia L.), 오이 풀(Sanguisorba officinalis L.), 산오이풀(Sanguisorba hakusanensiss Makino.), 가는잎 오이풀(Sanguisorba tenuifolia Fisch.) 등이 있다.

지유는 오이풀 및 동속근연식물의 뿌리와 근경으로 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)은 잎을 비비면 오이 또는 수박 냄새가 난다고 하여 오이풀, 수박풀이라고 한다. 물기가 있는 논둑이나 밭둑 같은 데 흔히 자라며 겉은 갈색이고 속은 흰 빛이 나는 제법 굵은 뿌리가 달린다. 이 뿌리를 지유, 곧 땅 속에 있는 느릅나무라고 하여 출혈을 멎게 하고 잎과 뿌리를 오래 달여서 만든 고약은 갖가지 염증과 피부병, 화상 치료에 효력이 뛰어 나다. 지유는 그 중에서도 화상으로 인한 화독을 없애고 감염을 막는데 최상의 약초로, 2차적인 조직 괴사와 삼출액이 빨리 줄어들고 화상부위가 깨끗하게 되면서 새살이 돋아 나온다. 괴사된 피부 조직에 피부 이식 수술을 하지 않아도 새살이 돋아 나와 흉터가 거의 남지 않는다(약이 되는 우리풀, 꽃, 나무 2, 한문화, 최진규, pp204-210;약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, pp362-p363). 성분은 탄닌(tannin), 트리터페노이드(triterpenoid) 계 사포닌(saponin)이 함유되어 있고 분리된 사포닌에는 지유 글리코사이드Ⅰ(ziyu glycoside Ⅰ) 및 포몰릭 액산(pomolic acid), 지유 글리코사이드 Ⅱ(ziyu glycoside Ⅱ), 지유 글리코사이드 B(ziyu glycoside B)등이 함유되어 있다(도해 향약대사전, 영림사, 신민교 외1, p654-656; 약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, p362-363).

지유추출물에 관한 선행발명의 예를 보면, 피부 기저막 안정화 및 인공피부 제조에 있어서 기저막의 충분한 형성을 달성하기 위한 피부 기저막 형성 촉진제 및 인공피부 형성 촉진제(한국특허공개번호 제2002-0019920호), 지유 추출물을 포함하는 항산화(자유 라디칼 소거) 화장료(한국특허공개번호 제2002-0047762호), 피부트러블 개선 및 보완용 화장료 첨가제(한국특허공개번호 제2002-0093364호), 여드름 치료제 및 예방용 천연물질 조성물(한국특허공개번호 제2002-0073041호), 항알레르기물질(한국특허공개번호 제1999-007663호), 탄닌계 식물추출물을 함유한 인체 세정제 조성물(한국등록번호 제0127343호) 등이 있으나 본 발명에서 달성하고자 하는 주름 생성억제제 및 개선제로서 이를 함유한 화장료 조성물 및 피부 외용제와는 무관하다.

이에 본 발명자들은, 피부 주름 억제 및 개선에 효능이 있는 근본적 물질을 찾고자하여 자연의 여러 가지 천연물질들 중에서 주름예방에 유효한 물질을 스크리닝한 결과, 지유로부터 추출 및 분리된 성분이 매우 우수한 주름 생성 억제의 효능을 나타냄을 발견하였다.

또한 화장료 조성물에서 일정농도 이상 배합하여 사람 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 주름 감소 및 노화로 기인한 피부상태가 개선되는 효과를 발휘하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 지유로부터 분리된 화합물을 함유하고 주름, 잔주름, 피부의 거칠어짐 등으로 나타나는 피부 노화를 근본적으로 예방하고, 피부 주름의 생성을 억제 및 개선하는 효능이 있는 화장료를 제조하기 위함이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 생귀소바(Sanguisorba)속에 속하는 식물 추출물을 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 조성물에 사용가능한 생귀소바(Sanguisorba)속에 속하는 식물로는 큰오이풀(Sanguisorba alpinia L.), 오이풀(Sanguisorba officinalis L.), 산오이풀(Sanguisorba hakusanensiss Makino.) 또는 가는잎 오이풀(Sanguisorba tenuifolia Fisch.) 등의 식물들을 포함하며, 바람직하게는 오이풀이 사용가능하다.

상기 오이풀은 뿌리, 줄기 또는 잎 부위가 모두 사용가능하며, 바람직하게는 뿌리부위로서 지유로 통칭되는 부위이다.

본 발명은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 지유 조추출물을 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 지유 조추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

또한, 본 발명은 주름 생성 억제 및 개선 효과를 갖는 지유의 비극성용매 가용추출물을 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 비극성용매 가용추출물은 디클로로메탄, n-헥산, 클로로포름 및 메틸렌클로라이드로부터 선택된 비극성 용매, 바람직하게는 디클로로메탄에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명은 상기 비극성용매 가용추출물로부터 컬럼 크로마토그래피를 통하여 수득된 분획물을 감압 농축하고 재결정하여 분리된 화합물들을 활성성분으로 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 하기 일반식 1로 표기되는 트리테르펜 화합물을 활성성분으로 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

(I)

상기 식에서

R₁ 및 R₂는 수소, 글루코스 또는 아라비노즈이다.

상기 일반식 (I) 화합물군 중 바람직한 화합물로는 R₁이 수소 또는 아라비노즈이고 R₂가 수소 또는 글루코스인 화합물군이고, 보다 바람직하게는 R₁이 아라비노즈이고 R₂가 글루코스인 화합물, R₁이 아라비노즈이고 R₂가 수소원자인 화합물, 및 R₁이 수소원자이고 R₂가 글루코스인 화합물로서, 상기 화합물군에는 지유글리코사이드Ⅰ, 지유글리코사이드Ⅱ 또는 28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터 화합물을 포함하며, 바람직하게는 지유글리코사이드Ⅰ화합물을 포함한다.

상기 추출물 또는 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 20중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 10중량%로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 추출물 또는 화합물은 섬유아세포 증식, 결합 단백질의 생산 촉진 및 MMP 유전자의 발현 억제 효과를 갖음을 특징으로 한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 지유 조추출물은 다양한 추출방법에 의해 수득될 수 있으며, 수성 또는 유기용매를 가하여 추출하여 얻을 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 지유 조추출물은, 오이풀의 뿌리부위인 지유를 건조하여 그 중량의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로 20 내지 100℃ 바람직하게는 20 내지 50℃ 추출 온도에서 약 1 시간 내지 5일, 바람직하게는 1 일 내지 5일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 20 내지 100℃ 바람직하게는 50 내지 70℃서 감압 농축하여 용매를 제거하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물인 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 비극성 용매 가용추출물은 상기 조추출물을 물에 현탁한 후 이들 현탁액의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 디클로로메탄, 바람직하게는 디클로로메탄을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 비극성용매 가용성 분획부과 수가용성 분획부로 분리한 후 각각의 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축하여 용매를 제거하여 각각의 용매 가용성 추출물을 얻을 수 있으며, 또한 극성 용매 가용추출물은 상기 비극성용매 가용부를 제거후 남은 수가용성 분획부의 약 1 내지 10배, 바람직하 게는 약 1 내지 5배 부피의 아세톤, 이소프로판올 또는 부탄올 등과 같은 저급알콜, 바람직하게는 부탄올을 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 극성용매 가용성 분획부과 수가용성 분획부로 분리한 후 각각의 용매 분획부를 회전 진공 농축기로 감압농축하여 용매를 제거하여 각각의 용매 가용성 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 비극성 용매 가용추출물로부터 분리된 화합물은, 상기 비극성용매 가용추출물에 클로로포름:메탄올 혼합용매, 바람직하게는 클로로포름:메탄올 (10:1)의 혼합비를 갖는 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 수회 반복 수행함으로서 좀더 활성이 강한 분획물을 정제할 수 있으며, 추가적으로 실리카겔 또는 세파덱스 컬럼크로마토그래피법을 수행하여 좀더 정제된 형태의 분획물을 수득가능하고 이 정제된 분획물을 재결정하거나 감압농축하여 순수한 형태의 본 발명의 화합물들을 분리가능하다.

본 발명의 조성물은 상기 제조방법에 따라 얻어진 지유 조추출물, 비극성용매 가용추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 활성성분으로 포함하는 주름 생성 억제 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 지유 추출물 및 화합물을 포함하는 조성물은 피부노화방지 효과를 위한 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등 이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-α토코페롤, d-α토코페롤, d-δ토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-α토코페롤, 니코틴산dl-α토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지 만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴ㅇ카프린산)프로필렌글리콜, 디 카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, α-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실 록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬 술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우 릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-β-알라닌칼슘, N-라우로일-β-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; Nε-라우로일-L-리진, Nε-팔미토일리진, Nα-파리토일올니틴, Nα-라우로일아르기닌, Nα-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; α-아미노카프릴산, α-아미노라우린산 등의 α-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살 리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 중량 % 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 또는 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 피부노화방지 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데 이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장료의 구체예로서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 에센스, 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 바디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 핸드크림 및 파운데이션 등을 들 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정 성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예, 실험예, 및 시험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예, 및 시험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예, 및 시험예에 의해 한정되는 것은 아니며, 또한 본 발명의 범위를 제한고자 함이 아니다.

참고예. 사용기기 및 용매

본 발명에서 ¹H- NMR 및 ¹³C-NMR 분석에 사용된 핵자기공명분석기는 ¹H- NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 200MHz) 및 ¹³C-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 50MHz)의 NMR기기로 그 구조를 분석하였으며, 사용된 용매는 피리딘(pyridine)-d₅로 써 알드리치(Aldrich)사에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1. 지유 조추출물의 제조

오이풀의 뿌리 부위인 지유(경동시장, 서울, 대한민국)를 건조하여 1kg을 메탄올 3000㎖ 로 2일간 실온에서 3회 반복하여 환류냉각추출 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기로 농축하여 건조된 조추출물 250g을 수득하였다. 수득된 지유 조추출물을 고속액체크로마토그래피(Shimadzu LC-10Avp system, Japan)로 분석한 결과 지유글리코사이드 Ⅰ의 함량은 2.98 % 였다.

실시예 2. 지유의 디클로로메탄 가용추출물 제조

상기 실시예 1의 지유 조추출물을 1000 ㎖ 증류수로 현탁 시킨 다음 동량의 디클로로메탄을 가하여 진탕하여 생긴 불용물을 디클로로메탄과 물로 수차례 세척 후 건조하여 55g의 지유 디클로로메탄 가용추출물 분말을 얻었다.

실시예 3. 지유로부터 지유글리코사이드 화합물의 분리

실시예 2에서 얻어진 건조분말을 실리카겔(Merck silica gel60, 0.063~0.20mm)로 충진된 컬럼에서 클로로포름:메탄올(10:1)의 혼합용매를 전개용매로 분획하여 5개의 분획물을 각각 300㎖씩 수득하였으며, 이 중, 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째 분획물을 감압 농축하고 재결정하여 각각 하기 물성치를 갖는 지유글리코사이드Ⅱ 화합물(0.6g), 28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터 화합 물(0.55g) 및 지유글리코사이드Ⅰ화합물(4.95g)을 각각 수득하여, 개개의 화합물들을 핵자기공명분석기를 이용하여 분석한 결과를 표 1 내지 표 2와 도 1 내지 도 3에 나타내었다.

지유글리코사이드Ⅱ

mp. 243-245(dec.)

¹H-NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 1 참조.

¹³C NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 2 참조.

28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터

mp.279-280(dec.)

¹H-NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 1 참조.

¹³C-NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 2 참조.

지유글리코사이드Ⅰ

mp. 256-260(dec.)

¹H-NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 1 참조.

¹³C-NMR (200 MHz, pyridine-d ₅) : 표 2 참조.

아글리콘 (Aglycone)	지유글리코사이드Ⅰ	지유글리코사이드Ⅱ	28-O- β -D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터
3	3.40 dd	3.35 dd	3.40 dd
12	5.55 br t	5.60 br t	5.56 br t
29	1.67 s	1.75 s	1.67 s
30	1.05 d	1.15 d	1.07 d
18	2.88 s	3.04 s	2.92 s
Me x 5	0.90 s	0.87 s	0.95 s
	0.93 s	0.95 s	1.03 s
	1.13 s	1.10 s	1.22 s
	1.22 s	1.30 s	1.25 s
	1.39 s	1.45 s	1.42 s
3-Ara-1	4.75 d	4.75 d
2	4.03-4.47	4.40 dd
3	4.03-4.47	4.13 dd
4	4.03-4.47	4.30 m
5	3.77 dd	3.82 dd
28-Glc-1	6.20 d		6.27 d
2	4.03-4.47		4.27 br d
3	4.03-4.47		4.32 br d
4	4.03-4.47		4.38 dd
5	4.15 m		4.20 m
6	4.39 br d		4.47 dd

화합물	지유글리코사이드Ⅰ	지유글리코사이드Ⅱ	28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터
1	38.82	38.76	39.09
2	26.58	26.60	28.09
3	88.67	88.69	79.16
4	39.46	39.50	39.36
5	55.84	55.87	55.84
6	18.59	18.57	18.96
7	33.37	33.44	33.52
8	40.42	40.27	40.50
9	47.63	47.67	47.71
10	37.06	36.94	37.32
11	23.95	23.94	24.03
12	128.28	127.92	128.38
13	139.12	139.76	139.23
14	42.01	42.01	42.05
15	29.09	29.22	29.19
16	25.97	26.29	26.02
17	48.47	48.19	48.56
18	54.28	54.50	54.39
19	72.51	72.59	72.56
20	41.95	42.30	42.05
21	25.97	26.87	26.66
22	37.58	38.44	37.66
23	28.17	28.18	28.77
24	17.26	17.10	17.37
25	15.59	15.50	15.69
26	16.81	16.84	16.69
27	24.59	24.65	24.55
28	176.79	180.55	176.87
29	26.97	27.10	27.00
30	16.65	16.75	16.50
3-Ara-1	107.35	107.46
2	72.70	72.80
3	74.43	74.52
4	69.34	69.43
5	66.58	66.63
3-Glc-1	95.61		95.74
2	73.90		73.95
3	78.71		78.86
4	71.01		71.11
5	78.99		78.17
6	61.98		62.24

실험예 1. 지유 추출물의 단층 세포배양에서의 세포증식효과

상기 지유 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들에 대하여 단층 세포 배양에 서의 세포증식 효과를 MTT 법을 이용하여 측정 하였다. 인간 섬유아 세포(human fibroblasts cell line)(ATCC, CRL-2310)를 1 x 10⁴ 세포/㎖의 농도로 하여 24 웰 배양접시에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 2%를 함유한 DMEM 배지를 교체하고, 시험 시료를 각각 50㎍/㎖의 농도로 10㎕ 첨가 한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200㎕씩을 가하여 세척하고 MTT(3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 웰당 1.0 ㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO(dimethylsulfoxide)를 웰당 1.0㎖씩 가한 후 하룻밤동안 37℃에서 배양한 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 지유 추출물의 용해 용매(99% 에탄올)를 음성 대조군, 섬유아 세포의 활성을 도와 콜라겐 합성을 촉진시켜주는 비타민 C를 첨가한 것을 양성 대조군으로 같은 방법으로 실험을 진행하여 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

시료	세포 증식 효과(%)
지유 조추출물	110
지유글리코사이드Ⅰ	123
지유글리코사이드Ⅱ	117
28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터	105
음성 대조군(99% 에탄올)	101
양성 대조군(비타민 C)	115.4

실험예 2. 지유 추출물의 진피세포 배양에서의 세포증식효과

상기 지유 추출물 및 이로부터 분리된 화합물에 대하여 진피 세포 배양에서의 세포증식 효과를 MTT 법을 이용하여 측정 하였다. 타입 I 콜라겐 기질(collagen matrix)과 5배로 농축된 DMEM 배지, 그리고 완충용액을 섞어 만든 용액과 인간 섬유아세포를 1 x 10⁵ 세포/㎖로 혼합하여 직경 10mm의 삽입막(insert membrane)에 각각 200㎕의 인간 정상 섬유아세포(fibroblasts)가 혼합된 콜라겐 용액에 넣어 인공진피를 제조한다. 일주일 배양한 후 배양배지를 제거한 후 새 배지를 조직배양 용기밖에 1.0㎖을 넣고 각 시험물질을 50㎍/㎖의 농도로 10㎕씩 적용하였다. 자극물질로는 SLS(sodium laurly sulfate, sigma, USA)를 적용하였다. 적용 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에 넣어 24시간 동안 방치한다. 배지를 버린 후 인공진피를 PBS로 세척하고 MTT 분석을 하였다. MTT 용액을 웰당 100㎕씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 100㎕씩 가한 후 하룻밤동안 37℃에서 배양한 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 이때 지유 추출물의 용해 용매를 음성 대조군, 비타민 C를 첨가한 것을 양성 대조군으로 같은 방법으로 실험을 진행하여 상대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시료	세포 증식 효과(%)
지유 조추출물	115
지유글리코사이드Ⅰ	134
지유글리코사이드Ⅱ	125
28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터	114
음성 대조군(99% 에탄올)	101.3
양성 대조군(비타민 C)	123.5

실험예 3. 지유 추출물의 타입 Ⅰ 콜라겐 생합성량

상기 지유 추출물 및 이로부터 분리된 화합물에 대하여 타입 Ⅰ 콜라겐 생합성량을 측정하였다(Kanayama N., et al., Gynecol. Obstet. Invest., 34, pp24-26, 1992).

인간 섬유아세포에서 배지로 배출되는 콜라겐 합성 양을 측정하기 위하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 ELA 키트(procollagen type I C-peptide ELA kit)(TaKaRa사, MK101)을 사용하였다. 키트를 사용하기 전 인간 섬유아세포를 1 x 10⁴ 세포/㎖의 농도로 하여 24 웰 배양접시에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM 배지를 사용하였다. 접종 후 24시간 후 시험 시료를 50㎍/㎖의 농도로 10㎕ 첨가하고 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양한 배지를 E-튜브로 옮기고 15,000rpm에서 30초 동안 원심분리 하였다. 이 배지 상층액을 시험 시료로 하여 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드 ELA 키트 프로토콜에 의해 실시하였다. 실시 후 흡광도는 450nm에서 측정하였다. 이때 지유 추출물의 용해 용매를 음성 대조군, 비타민 C를 첨가한 것을 양성 대조군으로 같은 방법으로 실험을 진행하여 상 대적인 흡광도의 차이로부터 세포증식 효과를 비교하여, 그 결과를 표 5에 나타내었다.

시료	PIP(㎍/㎖)
지유 조추출물	273.6
지유글리코사이드Ⅰ	420.2
지유글리코사이드Ⅱ	375.8
28-O-β-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터	269
음성 대조군(99% 에탄올)	203.6
양성 대조군(비타민 C)	386.2

실험예 4. 지유 추출물에 대하여 MMP-1 저해 효과를 측정

상기 지유 추출물 및 이로부터 분리된 화합물에 대하여 MMP-1 유전자의 발현 정도를 측정하기 위하여 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 인간 정상 섬유아세포(ATCC CCL-110)를 100mm 배양접시에 1 x 10⁶의 밀도로 10% 소혈청(Gibco/BRL)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco/BRL)로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 키웠다. 그 후 혈청이 첨가되지 않은 배지로 교환해 주고 6~24시간동안 세포를 안정화시켰다. 안정화된 세포에 지유 추출물을 첨가하고 4시간 후 UV A 1J/㎠를 조사하여 MMP-1 발현을 증가시킨 후 24시간동안 배양기에서 키웠다. 세포로부터 트리졸 시약(Trizole reagent) (Gibco/BRL)를 이용한 구아니디움 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 방법 (Guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)으로 토탈 RNA를 분리하였다. RT-PCR을 하기 위해 위의 방 법으로 얻어진 RNA에 RNA 분해 효소가 없는 DNA 분해 효소 (RNase-free DNase, Promega)를 37℃에서 30분동안 처리하여 DNA의 오염을 제거하였으며 페놀/클로로포름 추출법과 에탄올 침전으로 순수 RNA를 얻었다. 1㎍의 RNA를 올 인 원 RT/PCR 키트 (All in one RT/PCR kit, Superbio)를 사용하여 RT-PCR를 실시하였다. 대조군으로 베타-엑틴을 사용하였으며 RT-PCR에 사용된 MMP-1의 프라이머(primer)는 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되어있고, 베타-엑틴의 프라이머는 서열번호 3 과 서열번호 4로 구성되어있다. 반응 조건은 MMP-1은 95℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분, 29사이클이며, 베타-엑틴은 95℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃ 1분, 22사이클이며, PCR 생산물은 1.5%(w/v) 아가로즈(agarose, Sigma사) 겔에 전기영동하여 겔 이미지 분석기(Biorad)로 정량하였다.

본 발명의 지유 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제조예 1. 지유 추출물을 함유한 화장료 중 유연 화장수(스킨)

지유 추출물을 함유한 화장료 중 유연 화장수(스킨)의 제조예를 표 6 에 나타내었다.

번호	원료	단위 : 중량 %
		제형예 1	제형예 2	비교제형예 1
1	지유 조추출물	2.0	-	-
2	지유글리코사이드Ⅰ	-	0.005	-
3	글리세린	3.0	3.0	3.0
4	부틸렌 글리콜	2.0	2.0	2.0
5	프로필렌 글리콜	2.0	2.0	2.0
6	폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유	1.00	1.00	1.0
7	에탄올	10.0	10.0	10.0
8	트리에탄올아민	0.1	0.1	0.1
9	방부제	미량	미량	미량
10	색소	미량	미량	미량
11	향료	미량	미량	미량
12	정제수	잔량	잔량	잔량

〈제조방법〉

제형예 1 : 12번에 3, 4, 5 및 9번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 6번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 11번을 투입 교반하여 12번에 투입한다. 마지막으로 1, 7, 8 및 10번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이크로플루다이져를 통과시킨 후 숙성시킨다.

제형예 2 : 12번에 3, 4, 5 및 9번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 6번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 11번을 투입 교반하여 12번에 투입한다. 마지막으로 2, 7, 8 및 10번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이크로플루다이져를 통과시킨 후 숙성시킨다.

비교제형예 1 : 12번에 3, 4, 5 및 9번을 순서대로 투입하여 교반하여 용해시킨 후 6번을 60℃정도 가열하여 용해시킨후 11번을 투입 교반하여 12번에 투입한다. 마지막으로 7, 8 및 10번을 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이트로플루다이져를 통과시킨 후 숙성시킨다.

제조예 2. 지유 추출물을 함유한 화장료 중 영양화장수(로션)

지유 추출물을 함유한 화장료중 영양화장수(로션)의 제조예를 표 7 에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 3	제형예 4	비교제형예 2
1	지유 조추출물	2.0	-	-
2	지유글리코사이드Ⅰ	-	0.01	-
3	시토 스테롤	1.70	1.70	1.70
4	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50	1.50
5	세라마이드	0.7	0.7	0.7
6	세테아레스-4	1.2	1.2	1.2
7	콜레스테롤	1.5	1.5	1.5
8	디세틸포스페이트	0.4	0.4	0.4
9	농글리세린	5.0	5.0	5.0
10	선플라우어오일	10.0	10.0	10.0
11	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2	0.2
12	산탄검	0.3	0.3	0.3
13	방부제	미량	미량	미량
14	향료	미량	미량	미량
15	정제수	잔량	잔량	잔량

〈제조방법〉

제형예 3 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플 루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제형예 4 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 2, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

비교제형예 2 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제조예 3. 지유 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림

지유 추출물을 함유한 화장료 중 영양크림의 제조예를 표 8 에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 5	제형예 6	비교제형예 3
1	지유 조추출물	3.0	-	-
2	지유글리코사이드Ⅰ	-	0.02	-
3	시토 스테롤	4.0	4.0	4.0
4	폴리글리세릴 2-올레이트	3.0	3.0	3.0
5	세라마이드	0.7	0.7	0.7
6	세테아레스-4	2.0	2.0	2.0
7	콜레스테롤	3.0	3.0	3.0
8	디세틸포스페이트	0.4	0.4	0.4
9	농글리세린	5.0	5.0	5.0
10	선플라우어오일	22.0	22.0	22.0
11	카르복시비닐폴리머	0.5	0.5	0.5
12	트리에탄올아민	0.5	0.5	0.5
13	방부제	미량	미량	미량
14	향료	미량	미량	미량
15	정제수	잔량	잔량	잔량

〈제조방법〉

제형예 5 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제형예 6 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 2, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플 루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

비교제형예 3 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제조예 4. 지유 추출물을 함유한 화장료 중 에센스

지유 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 제조예를 표 9 에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 7	제형예 8	비교제형예 4
1	지유 조추출물	5.0	-	-
2	지유글리코사이드Ⅰ	-	0.05	-
3	시토스테롤	1.70	1.70	1.70
4	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50	1.50
5	세라마이드	0.7	0.7	0.7
6	세테아레스-4	1.2	1.2	1.2
7	콜레스테롤	1.5	1.5	1.5
8	디세틸포스페이트	0.4	0.4	0.4
9	농글리세린	5.0	5.0	5.0
10	선플라우어오일	15.0	15.0	15.0
11	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2	0.2
12	산탄검	0.2	0.2	0.2
13	방부제	미량	미량	미량
14	향료	미량	미량	미량
15	정제수	잔량	잔량	잔량

〈제조방법〉

제형예 7 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 1, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제형예 8 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 2, 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

비교제형예 4 : 원료물질 3, 4, 5, 6 및 7을 일정한 온도에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질이라 칭한다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 원료물질 8, 9 및 15을 혼합하고 일정한 온도에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 원료물질 10을 일정한 온도에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시킨다. 그리고 11, 12, 13 및 14를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시킨다.

제조예 5. 지유 추출물을 함유한 화장료 중 유화형 파운데이션

지유 추출물을 함유한 화장료중 유화형 파운데이션의 제조예를 표 10에 나타내었다.

번호	원료(중량 %)	단위 : 중량 %
		제형예 9	제형예 10	비교제형예 5
1	지유 조추출물	2.0	-	-
2	지유글리코사이드Ⅰ	-	0.01	-
3	밀납	2.0	2.0	2.0
4	사이크로메치콘	2.0	2.0	2.0
5	유동파라핀	5.0	5.0	5.0
6	스쿠알란	5.0	5.0	5.0
7	스테아린산	2.0	2.0	2.0
8	친유성 모노스테아린산 글리세린	3.0	3.0	3.0
9	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0	4.0
10	글리세린	4.0	4.0	4.0
11	프로필렌글리콜	3.0	3.0	3.0
12	부틸렌글리콜	3.0	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
14	알루미늄마그네슘실리케이트	0.5	0.5	0.5
15	안료	12	12	12
16	방부제	미량	미량	미량
17	향료	미량	미량	미량
18	정제수	잔량	잔량	잔량

〈제조방법〉

제형예 9 : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 35℃까지 냉각한 뒤 1번을 투 입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

제형예 10 : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 17번을 투입하고 35℃까지 냉각한 뒤 2번을 투입한다. 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 5 : 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 18를 혼합교반하면서 80∼85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 80∼85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 45℃까지 냉각한 뒤 16번을 투입하고 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

임상 시험예 1. 주름 깊이 감소에 의한 피부 탄력도 개선 효과 측정

피부주름에 대한 지유 추출물의 영향을 실험하기 위해 제조예 3의 제형예 5와 제형예 6을 여성 20명씩 2그룹으로 나누어 왼쪽 눈 가장자리에 하루에 세안 후 아침, 저녁 두 번 적용하였다. 비교제형예 3의 영양크림은 오른쪽 눈 가장자리에 처리하여 대조군으로 사용하였다. 적용 15일, 30일 후 피부 표면의 피부 주름 깊이를 피부탄력도측정기(Cutometer SEM 474)에 의해 측정하였다. 피부탄력도측정기에 의한 피부 탄력도 측정은 주름의 깊이를 측정하는 것으로서, 값이 적을수록 탄력성이 좋은 것이다. 탄력도 값은 대조군에 비해 감소한 값을 %로 나타내었으며, 피검 자 20명의 평균값을 결과에 나타내었다(표 11, 도 4a, 도 4b, 도 5a 및 도 5b 참조).

시 료	피부 탄력도(주름깊이 감소) 효과(%)
	0일	15일	30일
제형예 5 : 그룹 1	0.48	0.43	0.39
제형예 6 : 그룹 2	0.53	0.45	0.41
비교제형예 3	0.50	0.48	0.49

임상시험예 2. 피부 상태 개선효과 확인 실험

제조예 4의 제형예 7, 제형예 8 과 비교제형예 4의 에센스에 대한 피부도표시 피부상태 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 임상 확인 실험을 하였다. 36∼69세의 건강한 여성층으로서 30명씩 2그룹으로 나누어 안면 왼쪽 부분에는 제형예 7 및 제형예 8의 에센스를, 안면 오른쪽 부분에는 비교제형예 4의 에센스를 매일 아침, 저녁 세안 후 피부에 1일 2회 4주간 도포한 후 피부상태 개선을 확인하기 위하여 피부상태 개선 정도를 측정하였다. 피부의 탄력 및 늘어짐에 대한 개선 효과와 주름 및 잔주름에 대한 개선 효과에 관해서 표 12의 평점으로 판정하여, 30명의 평균점으로 평가한 결과를 표 13에 나타내었다. 제형예 7과 제형예 8을 사용한 군에서는 피부의 탄력 및 늘어짐에 대한 개선 효과와 주름 및 잔주름에 대한 개선 효과 모두에서 비교제형예 4를 사용한 군에 비교하여 훨씬 뛰어난 피부 개선 효과가 확인되었다(표 13 참조).

	피부의 탄력 및 늘어짐에 대한 개선 효과의 평점	주름 및 잔주름에 대한 개선 효과의 평점
대단히 개선되었다	3점	3점
개선되었다	2점	2점
약간 개선되었다	1점	1점
개선효과가 없다	0점	0점
악화되었다	-1점	-1점

시료	피부의 탄력 및 늘어짐	주름 및 잔주름
제형예 7 : 그룹 1	65	61
제형예 8 : 그룹 2	78	74
비교제형예 4	35	40

상술한 바와 같이, 본 발명의 지유로부터 분리된 화합물을 함유하는 화장료 조성물은 피부의 주름, 잔주름 및 거칠어짐 등으로 나타나는 피부 노화를 근본적으로 예방 및 개선하여, 주름 생성 억제 및 개선용 화장품 및 피부 외용제로 사용할 수 있다.

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10. 지유글리코사이드 I, 지유글리코사이드 II 또는 29-O-beta-D-글루코피라노실-포몰릭에시드에스터 화합물을 포함하는 주름생성 억제 및 개선용 화장료 조성물.
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14. 제 10항에 있어서, 화합물은 섬유아세포 증식, 결합 단백질의 생산 촉진 및 MMP 유전자의 발현 억제 효과를 갖음을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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