KR19990007663A

KR19990007663A - 항알레르기물질

Info

Publication number: KR19990007663A
Application number: KR1019980043546A
Authority: KR
Inventors: 임융호; 박관하; 고동수; 이승호
Original assignee: 맹원재; 학교법인 건국대학교
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 1999-01-25

Abstract

본 발명은 오이풀 뿌리 (약명은 지유, 地楡, 학명은Sanguisorba officinalis)로부터 분리한 항알레르기물질 SO3에 관한 것으로서, 제 1 도의 자외선 흡수 스펙트럼, 제 2 도의 적외선 흡수 스펙트럼, 제 4 도의 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 제 5 도의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 가지며, 분자량이 342이고 C₁₂H₂₂O₁₁의 분자식으로 표시되며, 3-C-하이드록시메틸릭소스의 퓨라노스형태와 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 퓨라노스형태로 이루어진 이당류의 구조를 갖고, 3-C-하이드록시메틸릭소스의 1번과 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 5번이 산소로 연결된 항알레르기물질에 관한 것이다.

Description

항알레르기물질

본 발명은 오이풀 뿌리 (약명은 지유, 地楡, 학명은Sanguisorba officinalis)로부터 분리한 항알레르기물질 SO3에 관한 것이다.

알레르기성 질환은 환경오염의 결과로 인해 해마다 증가하고 있는 추세여서 이의 치료제 개발이 필요한 실정이다. 알레르기는 항원에 대하여 면역계가 과도하게 반응하여 생기는 제반 현상으로 인해 발생하는데, 통상 알레르기 질환으로 일컬어지는 유형은 비만세포(mast cell)에서 분비되는 각종 화학매체(chemical mediators)들의 직간접적인 약리작용과 이로 인해 야기되는 염증 반응에 의한 것으로 기관지 천식이나 알레르기성 비염 등이 주종을 이루는 증상이다. 항알레르기 분야에서 현재까지 출시된 의약품들은 항히스타민계, 스테로이드계 등이 주류를 이루고 있으나 이 두 분야의 의약품 모두 부작용을 수반하므로 새로운 형태의 알레르기 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

항히스타민제의 경우는 졸음유발 등의 중추신경계 부작용과 스테로이드계의 경우는 상위조절 호르몬의 유리방해에 따른 정상 반응세포의 기능장해 등이 부작용으로 알려져 있다. 또한 천식치료제로 사용되는-길항제 역시 혈압의 하강으로 인한 무기력증 등의 문제점이 지적되고 있다. 본 연구에서 발견한 SO3는 비만세포에서의 히스타민 분비를 억제하기 때문에 기존의 항히스타민제가 갖는 부작용을 줄일 것으로 기대된다.

본 발명자들은 낮은 농도에서도 효과가 우수하고 독성이 적은 항알레르기물질을 개발하기 위하여 고등식물들에 대한 스크리닝을 거듭한 결과 우수한 항알레르기 활성을 보이는 물질을 오이풀 뿌리 (약명은 지유, 地楡, 학명은Sanguisorba officinalis)로부터 분리하여 SO3이라 명명하였다.

상기의 식별자가 없습니다.

제 1 도는 SO3의 자외선 흡수 스펙트럼

제 2 도는 SO3 (KBr 펠렛)의 적외선 흡수 스펙트럼

제 3 도는 FAB/MS에 의하여 측정된 SO3의 질량분석

제 4 도는 SO3의 양성자 핵자기 공명 스펙트럼 (400MHz)

제 5 도는 SO3의 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 (100MHz)

제 6 도는 SO3의 구조

다음의 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

실시예 1

항알레르기물질 SO3의 분리, 정제

지유 600g을 실온에서 메탄올로 추출하여 추출물을 얻었다. 추출물에 물을 더하였고 여기에 메틸렌클로라이드(methylene chloride)를 더하여 분액깔대기로 층분리를 한후 에틸아세테이트(ethylacetate)로 다시 층분리를 하여 수용액층을 모아서 여기에 노르말부탄올(n-butanol)을 더하여 분액깔대기로 다시 층분리를 하였다. 노르말부탄올층을 취하여 감압농축하였다. 농축된 물질을 물에 녹인 후 1.5% 카페인을 더하여 탄닌을 제거한 후 클로로폼(chloroform)을 더하여 분액깔대기로 층분리를 한 후 수용액층을 모아서 감압농축하였다. 농축된 물질을 실리카겔(Silica Gel)을 충진한 칼럼에 통과시켰는데 이 때 용매는 물을 사용하였다. 통과액을 감압농축한 후 리크로프렙역상(LiChroprep reversed phase C18) 충진제로 충진한 칼럼을 물을 용매로 통과시켰다. 통과액을 다시 감압농축한 후 분취고성능액체크로마토그라피 (preparative-HPLC)를 이용하여 분리 하였으며 가장 늦게 칼럼을 통과한 물질이 항알레르기 활성을 보였다. 통과액을 동결건조시켜 분말상태로 100mg을 얻었고 이 물질을 SO3이라 명명하였다.

참고예 1

실시예 1의 분리, 정제과정을 통하여 얻은 SO3의 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 분석한 결과 SO3는 SO3a와 SO3b의 2:1 혼합물임을 확인하였다. SO3a와 SO3b는 동일한 분자식을 가진 이성질체로 밝혀져서 분취고성능액체크로마토그라피에서는 더 이상 분리가 어려웠기 때문에 항알레르기 활성시험에는 혼합물인 SO3를 사용하였다.

(1) 분취고성능액체크로마토그라피 상의 특징

용매는 물과 아세토니트릴(acetonitrile)의 9.5 : 1 혼합용액을 사용하였고 바이닥(Vydak) 역상 (reversed phase C18) 칼럼을 사용하였다. 측정계기는 길슨(Gilson)사의 분취고성능액체크로마토그라피였고 검지기는 길슨사의 118UV/VIS detector였다. SO3는 머무름시간(retention time)의 42분일 때 통과되었다. 이 때 유속은 최초 30분간은 분당 0.5ml였고 30분이 지난 후는 분당 5ml였다.

(2) 용해성

SO3는 수용액에 잘 용해되었다.

(3) 용융점

160 - 180℃

(4) 자외선 흡수 스펙트럼

SO3를 물에 용해시킨 시료는 204nm와 270nm에서 최대 흡광도를 보여 두 개의 첨두를 나타냈고 자외선 흡수 스펙트럼은 제 1 도에 보는 바와 같다.

(5) 적외선 흡수 스펙트럼

측정계기는 퍼킨엘머(Perkin Elmer)사의 파라곤 2000(Paragon 2000) FT-IR이었으며 SO3를 포타슘브로마이드(KBr)로 펠렛(pellet)을 만들어 측정 하였다. 적외선 흡수 스펙트럼은 제 2 도에 보는 바와 같다.

(6) 질량분석

측정계기는 VG사의 마크로매스오토스펙(Micromass Autospec)였으며 FAB/MS를 위한 용매는 글리세롤(glycerol)을 사용하였고 질량(M+1)은 361.3으로 관찰되었다. 질량분석 스펙트럼은 제 3 도에 보는 바와 같다.

(7) 핵자기공명 스펙트럼

측정계기는 브루커(Bruker)사의 DPX400(9.4 T)이었으며 용매는 중수소였다.

가) 양성자 핵자기공명 스펙트럼

ppm 단위의 화학적 이동 / ( )는 양성자 개수와 다중도를 표시

/ J는 Hz단위의 결합상수(coupling constant)

(s) : 단일선, (d) : 이중선, (t) : 삼중선, (m) : 다중선

3.46(d, J=11,3), 3.56(dd, J=12.1/5.6), 3.58(dd, J=4.8/12.3), 3.59(d, J=11.3), 3.63(d, J=11.3), 3.71(d, J=11.3), 3.74(dd, J=12.1/2.5), 3.75(dd, J=2.8/12.3), 3.77(d, J=7.8), 3.78(d, J=3.0), 3.89(dd, J=2.5/5.6), 3.95(dd, J=2.8/4.8), 5.10(s), 5.17(s)

참조 : 제 4 도

나) 탄소 핵자기공명 스펙트럼

ppm 단위의 화학적 이동 / ( )는 양성자 개수와 다중도를 표시

(s) : 단일선, (d) : 이중선, (t) : 삼중선, (m) : 다중선

60.5(t), 62.2(t), 62.3(t), 62.7(t), 69.6(d), 70.9(d), 77.7(s), 80.7(s), 81.0(d), 81.9(d), 97.1(d), 100.7(d)

참조 : 제 5 도

(8) SO3의 전체적 구조

양성자 핵자기공명 스펙트럼의 모든 첨두가 3ppm에서 5.2ppm 사이에 위치하는 사실로부터 SO3는 당의 일종으로 판단되었다. 질량분석 결과 360.3이었기 때문에 이당류의 일종으로 추정되었으나 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서 12개의 큰 첨두들과 12개의 작은 첨두들이 관찰되어 두가지 화합물의 혼합이라고 판단하였다. 고성능액체크로마토그라피를 이용한 당분석과 양성자 핵자기공명 스펙트럼의 해석으로부터 두가지 화합물은 2 : 1의 비율로 구성되어 있으며 두가지 모두 이당류만으로 구성된 화합물임이 밝혀졌다. 그러나 양성자 핵자기공명 스펙트럼에서의 첨두들과 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서의 첨두들이 거의 유사한 화학적 이동을 보이고 동일한 질량을 갖기 때문에 이 두가지 화합물은 서로 이성질체라고 판단되었다. 따라서 구조분석은 다량 포함된 물질로 국한 시켜서 수행하였다.

데프트(DEPT) 핵자기공명 스펙트럼으로부터 각 탄소들의 다중도를 분석한 결과 CH가 6개, CH2가 4개, C가 2개 존재하는 것으로 밝혀졌는데 당 중에서 이와 같은 조건을 갖는 6탄당은 프락토스(fructose), 프시코스(psicose), 소르보스(sorbose), 타가토스(tagatose)의 네가지가 알려져 있는데 이들은 모두 이당류를 구성할 때 1번 위치의 양성자가 관측이 안된다. 그러나 본 실험에서 얻은 양성자 핵자기공명 스펙트럼은 5.10ppm과 5.17ppm에서 1번 위치의 양성자가 관찰되었으므로 위의 네가지 종류에는 속하지 않음을 알 수 있었고 또한 고성능액체크로마토그라피를 이용한 당분석에서도 이들과 일치하는 머무름시간(retention time)에서는 첨두가 발견되지 않았다. 또한 탄소 핵자기공명 스펙트럼은 SO3가 피라노스(pyranose) 형태가 아닌 퓨라노스(furanose) 형태의 당으로 구성되었음을 나타내었다. 탄소 핵자기공명 스펙트럼에서 62.2, 70.9, 77.7, 81.0 및 100.7ppm의 다섯 첨두들은 기존에 알려진 α-D-릭소스(lyxose)와 일치하였다. 그러나 릭소스의 경우는 3번 탄소의 다중도가 d인데 반해 본 스펙트럼에서 그에 해당하는 77.7 ppm의 탄소는 다중도가 s이기 때문에 3번 위치의 양성자가 탄소로 치환되었다고 판단되었다.

이차원 코지(2D-COSY) 핵자기공명 스펙트럼으로부터 하이드록시메틸기로 치환되었음이 밝혀졌고 이에 해당하는 탄소의 화학적 이동은 62.7ppm이었다. 따라서 SO3을 구성하고 있는 6탄당의 하나는 3-C-하이드록시메틸릭소스의 퓨라노스형태로 판명되었다. 나머지 여섯 개의 탄소 첨두들 중 60.5ppm을 제외한 다섯 개는 β-D-아라비노스와 잘 일치하고 이차원 코지(2D-COSY) 핵자기공명 스펙트럼의 해석으로부터 2번 위치의 양성자가 하이드록시메틸기로 치환되었음이 밝혀졌다. 따라서 SO3을 구성하는 다른 한 종류의 당은 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 퓨라노스형태로 결정되었다. 3-C-하이드록시메틸릭소스의 1번 위치의 하이드록시기와 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 5번 위치의 하이드록시기가 결합하면서 물이 빠져 나온 상태로 이들 두 가지 당은 결합되어 있음이 화학적 이동에 따라 결정되었다. 이 결과는 질량분석 실험과도 잘 일치한다. 즉, SO3은

3-C-하이드록시메틸릭소의 퓨라노스형태의 1번과 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 퓨라노스형태의 5번이 산소로 연결된 이당류로서 한분자의 물을 함께 포함하고 있는 화합물인데 이름은 5-O-α-D-(3-C-Hydroxymethyl)lyxofuranosyl-

β-D-(2-C-hydroxymethyl) arabinofuranose이고, 구조는 제 6도와 같다.

다음의 참고예를 통하여 본 발명의 약효 측정 방법을 상세하게 설명한다.

참고예 2

래트(Rat)에서의 수동적 피부 아나필락시스

실험동물에서 항알레르기효과를 측정하기 위해 수동적 피부 아나필락시스법을 사용하였다. 즉 오발부민(Ovalbumin) 1mg/rat과 Pertussis antigen 0.7ml를 웅성 위스타래트(Wistar rat)에 근육 내와 복강으로 각각 투여하고 12일 째에 복대동맥으로 채혈하여 혈청을 분리하였다. 이 혈청을 적당한 농도로 생리식염액에 희석하여 새로운 웅성 위스타래트(Wistar rat)의 등부위 털을 깎고 2개부위에 0.1ml씩을 피내 투여하고 48시간 후 오발부민(Ovalbumin) 5 mg을 0.5 ml의 생리식염액에 용해한 에반스블루(Evans blue)(0.1%)와 혼합하여 꼬리정맥으로 투여하여 아나필락시스반응을 유발하였다.

오발부민(Ovalbumin) 투여 30분 후 피부를 박리하고 에반스블루(Evans blue)의 확산직경을 측정함으로서 시험약물이 알레르기 반응에 미치는 효과를 평가하였다. 시험약물은 오발부민(Ovalbumin)으로 아나필락시스유도 30분 전에 정맥내로 투여하였다.

마우스(Mouse)에서의 능동적 전신 아나필락시스

마우스(Mouse)를 이용한 능동적 전신 아나필락시스 모델에서의 약효도 측정하였다. 즉 웅성 Balb/C 마우스에 오발부민(Ovalbumin) 100μg 및 Al(OH)₃1mg을 복강내로 2주 간격으로 3회 투여하고 마지막 투여 2주 후 피검물질을 30분 전 복강 내 투여하고 생리식염액에 용해한 오발부민(Ovalbumin) 1mg을 정맥 내로 투여 후 나타나는 사망률을 관찰하였다.

다음의 참고예를 통하여 본 발명의 효과를 상세하게 설명한다.

참고예 3

래트(Rat)를 사용한 수동적 피부 아나필락시스 시험에서 11mg/kg의 SO3 투여에 의해 에반스블루(Evans blue) 확산직경이 50%의 수준으로 감소되었다.

마우스(Mouse)를 이용한 능동적 전신 아나필락시스 시험에서 SO3를 50mg/kg의 용량으로 복강 내 투여하였을 때 동물의 사망률이 현저히 감소하였다.

Claims

제 1 도의 자외선 흡수 스펙트럼, 제 2 도의 적외선 흡수 스펙트럼, 제 4 도의 양성자 핵자기공명 스펙트럼과 제 5 도의 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 가지며, 분자량이 342이고 C12H22O11의 분자식으로 표시되는 이당류의 구조를 갖는 항알레르기물질.
제 1 항에 있어서 3-C-하이드록시메틸릭소스의 퓨라노스형태의 1번과 2-C-하이드록시메틸아라비노스의 퓨라노스형태의 5번이 산소로 연결된 항알레르기물질.