KR100644764B1 - 게닌화합물 및 그 염의 제조방법과 그를 포함한 조성물의용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지유에서 유래하는 게닌화합물 및 그의 염의 제조방법과 그를 한 가지 혹은 혼합한 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 게닌화합물 및 그 염은 섬유아세포에서의 세포외 간질 성분 분해 효소 (MMP)를 저해하고, 엘라스타제 및 콜라게나제 효소의 억제 작용을 통해 주름 생성 억제 및 주름 개선 효과를 가지며, 또한 iNOS 활성, COX-2 발현 및 인터루킨-Ia를 억제하는 항염활성을 가져 탁월한 상처 치유 효과를 가짐으로써 화장료조성물 및 약학조성물로 사용될 수 있다.

게닌화합물, 지유, 주름개선, 항염활성, 화장료조성물, 약학조성물

Description

게닌화합물 및 그 염의 제조방법과 그를 포함한 조성물의 용도{Novel method of process for Genin compounds and their salt and A use for composition containing the same}

도 1은 토멘토솔릭산의 고성능 액체크로마토그래피 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 2는 벤구에롤릭산의 고성능 액체크로마토그래피 스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 3은 토멘토솔릭산의 질량분석 스펙트럼이고,

도 4는 벤구에롤릭산의 질량분석 스펙트럼이고,

도 5는 토멘토솔릭산 수소핵자기공명분석 스펙트럼이고,

도 6은 벤구에롤릭산 수소핵자기공명분석 스펙트럼이고,

도 7은 토멘토솔릭산의 탄소핵자기공명분석스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 8는 벤구에롤릭산의 탄소핵자기공명분석스펙트럼을 나타낸 것이고,

도 9는 게닌화합물 및 그 나트륨염들의 세포독성을 나타낸 것이다.

본 발명은 게닌화합물의 일종인 일반식 (1)로 표기되는 토멘토솔릭산(tomentosolic acid)과 일반식 (2)로 표기되는 벤구에롤릭산(vanguerolic acid)의 제조방법과 이들의 한가지 또는 이들의 혼합조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법으로 제조된 게닌화합물 및 그 염은 섬유아세포에서의 세포외 간질 성분 분해 효소 (MMP)를 저해하고, 엘라스타제 및 콜라게나제 효소의 억제 작용을 통해 주름 생성 억제 및 주름 개선 효과를 가지며, 또한 iNOS 활성 및 COX-2 발현, 인터루킨-Ia를 억제하는 항염활성을 가져 탁월한 상처 치유 효과를 갖는다.

게닌은 배당체의 아글리콘이 스테로이드나 트리테르펜 골격을 가질 때의 총칭인데, 더 상세히 설명하면 다음과 같다. 당의 헤미아세탈성 히드록시기와 여러 가지 당, 알콜, 페놀, 카르복시산, 알데히드 등의 작용기의 에테르형 탈수 결합에 의해 이루어진 화합물을 글루코시드라 하며 배당체라고도 한다. 당 성분끼리 결합되어 이루어진 것을 홀로시드(holoside), 당성분과 비당 성분이 결합되어 이루어진 것을 헤테로시드(heteroside)라 하며, 헤테로시드에 있어서 당을 제외한 비당성분을 아글리콘(aglycon)이라 한다. 그 종류는 여러 가지가 있는데, 산 또는 글리코시다제의 촉매 작용에 의해 당 성분과 아글리콘으로 분해되며, 특히 스테로이드, 트리테르펜이 아글리콘일 경우에 이를 게닌이라 한다. 식물 심장독, 사포닌 등은 모두 배당체의 일종이며, 이 아글리콘이 게닌이다.

피부의 제일 바깥부분인 표피층은 진피층으로부터 생성되며, 진피층은 콜라겐과 엘라스틴으로 구성된다. 피부에 윤택을 주고 탄력을 주는 것은 진피층의 이 두성분인데, 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제와 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타제가 활성이 되면, 피부가 탄력을 잃고 주름이 생기게 된다. 또한 메트릭스 메탈로프로티나제(Matrix Metallo-Preoteinase ; MMP)-1은 활성중심부에 아연을 가지는 금속단백 분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소 (zymogen)형태로 분비된다. 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(macroglobulin)이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절되고 피부의 케라티노사이트(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다(Fisher, G. J. et al., Photochem. Photobiol., 69, pp154, 1999). 1회의 UV조사에도 피부내의 MMP활성이 증가되며 피부내의 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 MMP들이 진피층의 콜라겐 붕괴에 영향을 미치며 광 노화에 매우 중요한 역할을 한다.

병풀 (積雪草 : Centella Asiatica)에서 추출되어지는 아시아틱산 (asiatic acid), 마데카식산 (madecassic acid)은 대표적 게닌 화합물로서 대한민국특허 1322, 1328호에 그 분리방법이 공고되어 있으며, 대표적 약리효과로서 상처치유촉진이 알려져 있다(Planta Medica., 60(2), pp133-135, 1994 Apr.; Connect Tissue Res., 24(2), pp107-120, 1990). 감람나무(Olea Europaea)에서 추출되어지는 올레아놀릭산(oleanolic acid)또한 대표적 게닌화합물로서 상처치유촉진 효과, 항염, 항균, 피부노화 방지 등의 효과가 있으며(planta Medica., 63, pp582, 1997; 미국특허 제4,606,911호), 일본에서는 화장품 및 의약품 특히 피부에 있어 림프모구백 혈병 억제 효능이 있음이 알려져 있다(J. Indian Chem. Soc., 50, pp620, 1973). 그리고 게닌류 화합물들의 치아 치료에 있어서의 약리 효과도 밝혀졌다. (미국특허 제4,606,911호; J. of Med. Chemistry, 17(2), pp191, 1974).

지유(地楡, Sangusorbae radix)는 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)의 뿌리부분으로, 오이풀은 잎을 비비면 오이 또는 수박 냄새가 난다고 하여 오이풀, 수박풀이라고 한다. 오이풀의 뿌리를 지유라 하며 출혈을 멎게 하고 잎과 뿌리를 오래 달여서 만든 고약은 갖가지 염증과 피부병, 화상 치료에 효력이 뛰어남이 알려져 있다. 지유는 그 중에서도 화상으로 인한 화독을 없애고 감염을 막는데 최상의 약초로, 2차적인 조직 괴사와 삼출액을 빨리 줄어들게 하여 괴사된 피부 조직에 적용시에 피부 이식 수술을 하지 않아도 화상부위가 깨끗하게 되면서 새살을 돋게 하는 작용을 하여 흉터가 거의 남지 않는다(한문화 외 1, 약이 되는 우리풀, 꽃, 나무 2, pp204-210; 약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, p362-p363). 성분은 탄닌 (tannin), 트리테페노이드(triterpenoid) 계 사포닌 (saponin)이 함유되어 있고 분리된 사포닌에는 지유 글리코사이드Ⅰ (ziyu glycoside Ⅰ) 및 포몰릭 산 (pomolic acid), 지유 글리코사이드 Ⅱ (ziyu glycoside Ⅱ), 산구이소르비게닌(토멘토솔산)등이 함유되어 있다(도해 향약대사전, 영림사, 신민교 외1, pp654~656; 약초의 성분과 이용, 일월서각, 문관심, pp362~363; D. L. Cheng , X. P. Cao, Phytochemistry, 31, pp1317-1320, 1992). 토멘토솔릭산은 지유에 존재하는 천연물질이며(지유의 수치에 관한 연구(II), 서울대학교 약학석사학위논문. 오지연. 1994년 2월) 자연상태의 지유에는 오직 극미량만이 존재한다.

또한 요시오까 등은 지유에 많이 함유되어 있는 지유글리코사이드 화합물의 가수분해을 통하여 당이 제거된 게닌(genin) 화합물 얻고, 고성능액체크로마토그래피 법을 이용하여 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산의 두 물질를 분리하여 보고하였다(Yosioka. I et al., Chem . Pharm . Bull., 19(8), pp1700-1707, 1971; Barton, Cheung et al., Triterpenoids., 26, pp5163-5175, 1962).

그러나 지유 글리코사이드에서 제조 및 분리된 게닌 화합물 및 그 염의 피부 노화방지 및 항염증 효과에 대해서는 아직까지 보고되어진 바는 없다.

본 발명에서는, 이들 지유 글루코사이드 I, II에서 유래한 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 및 그들의 염이, 피부의 콜라겐을 분해하여 탄력을 저하시키고 주름을 생성시키는 작용을 하는 콜라게나아제 및 엘라스타제, 메트릭스 메탈로프로테나아제-1의 작용을 억제시키고, 염증 유도 물질인 사이클로옥시게나제 2 및 염증 매개체인 나이트릭 옥사이드를 생성시키는 iNOS의 활성을 억제시키고, 또한 3차원 생인공피부를 이용한 항염실험에서도 인터루킨-Ia의 분비량을 억제하는 것을 확인하여 화장료 조성물 및 약학 조성물로의 사용가능함을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 게닌화합물 및 그 염을 지유로부터 제조 및 분리하는 방법과 이들 중 한가지 혹은 이들의 혼합을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 생성 억제 및 주름개선 효과를 가지는 화장료조성물을 제공하는 것이다.

또한 항염 효과 및 상처치유 효과를 지닌 게닌 화합물 및 그들의 염을 유효 성분으로 하는 약학조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 일반식 (I)의 게닌 화합물 및 그 염을 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 하는 주름 예방 및 개선용 화장료조성물 및 항염 및 상처치유용 약학조성물을 제공한다.

(I)

상기 식에서 R은 수소원자 또는 알칼리 금속류, 알칼리 토금속류, 아민류, 리신, 수산염을 나타낸다.

상기 알카리 금속류로는 리튬, 나트륨, 칼륨 등을 포함하고, 알칼리 토금속류로는 마그네슘, 칼슘 등을 포함하며, 아민류로는 에틸렌디아민, 사이클로헥실아민, 아니린, 에타놀아민, 디에타놀아민, 에타놀아민, 에틸아민, 프로필아민, 아릴아민, 디에틸아민, 부틸아민, 이소부틸아민, 에틸아민, 펜틸아민, t-부틸아민, 이 소프로필아민을 포함하고, 수산염으로는 벤질 메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 염을 포함한다.

상시 일반식 (I) 화합물의 바람직한 화합물은 지유추출물로부터 분리되는 토멘토솔릭산 및 벤구에롤릭산이다.

본 발명은 시중구입가능하고 또한 지유 등의 식물 추출물로부터 당업계에 공지된 정제 및 분리 공정을 거쳐 수득 가능한 하기 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 이온교환수지를 사용하여 가수분해하고, 재결정하여 토멘토솔릭산 및 벤구에롤릭산과 같은 비당체를 얻고, 이를 유기용매에 용해시키고 염기를 가하고 교반시킨 후 용매를 제거하고 극성용매에서 재결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 염 형태의 일반식 (I) 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

(II)

이하, 구체적으로 상기 일반식 (I)의 게닌 화합물을 얻는 제조공정을 설명하 면,

지유의 추출물로부터 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 추출 및 분리하는 제조공정은 한국특허출원 제2004-0025427호 (주름생성억제 및 개선효과를 갖는 지유추출물을 함유하는 화장료조성물)에 기재된 추출방법을 기초로 하는데,

예를 들어, 본 발명의 지유를 건조, 세절하여 무게(㎏)의 약 1배 내지 10배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급알코올의 극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃내지 30℃ 추출온도에서 약 1일 내지 10일, 바람직하게는 약 2일 내지 7일 동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 극성용매에 가용한 조추출물을 얻는 제 1단계;

상기의 조추출물을 물 또는 메탄올 등과 같은 극성용매에 현탁하여, 이를 현탁액의 약 0.1내지 10배, 바람직하게는 약 0.2내지 2배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로르포름, 디클로로메탄과 같은 비극성용매, 바람직하게는 디클로로메탄을 가하여 극성용매가용층과 비극성용매가용층을 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 분획하여 지유글리코사이드 I을 포함하는 극성용매 가용부를 얻는 제 2단계;

이어서 상기 극성용매 가용부를 음이온교환수지을 이용하여 가수분해하여 지유글리코사이드 II를 얻는 제 3단계의 공정을 거쳐 지유글리코시드 I 및 II와 같은 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 수득할 수 있고 또한 시중에 서 구입하여 하기 비당체 수득단계로 전환이 가능하다.

상기 공정을 통하여 얻어진 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 이용하여 본 발명의 일반식 (I)의 게닌화합물 및 그 염을 제조하는 제조공정을 하기 반응식 1에 예를 들어 도시하나, 본 발명의 범위를 이에 제한하고자 함은 아니다.

먼저 상기 공정에서 얻은 지유글리코시드 I 및 II와 같은 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 이온교환수지를 이용하여 25 내지 80℃, 바람직하게는 25 내지 65℃에서 가수분해하고, 얻어진 물질을 재결정하여 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 비당체(aglycon)을 얻는 제 1단계;

제 1단계에서 얻은 게닌화합물을 유기용매에 용해시키고 25 내지 100℃ 바람직하게는 20 내지 60℃의 온도에서 0.1 내지 50 배, 바람직하게는 1 내지 10 배의 당량비를 갖는 염기를 가하고 교반시킨 후 용매를 농축하여 제거하고 극성용매에서 재결정하여 그들의 염을 얻는 제 2단계의 공정을 포함한다.

상기 방법으로 제조되는 게닌화합물의 염은 게닌화합물보다 물에 대한 용해도가 높은 특징을 갖는다.

상기 1단계의 이온교환수지로는 술폰기를 교환기로 하는 저가교도(low crosslinking)에서 고가교도까지의 겔(gel)타입 또는 다공성(porous) 타입의 스티렌계 강산성 양이온 교환수지, 술폰기와 페놀기를 교환기로 하는 강산성 양이온교환수지, 카복실산을 교환기로 하는 메타크릴계 다공성 타입의 약산성 양이온 교환수지, 카복실산을 교환기로 하는 아크릴계 고다공성(high porous) 타입의 약산성 양이온교환수지, 이미노아세틱산을 교환기로 하는 약산성 양이온교환수지임이고, 음이온교환수지로서 에틸암모늄을 교환기로 하는 겔타입 또는 다공성타입의 스티렌계 강염기성 음이온 교환수지, 디메틸 에탄올 암모늄을 교환기로 하는 겔타입 또는 다공성타입의 스티렌계 강염기성 음이온교환수지, 벤질디메틸(2-하이드록시에틸) 암모늄을 교환기로 하는 강염기성 음이온교환수지, 메틸암모늄을 교환기로 하는 아크릴계 약염기성 음이온교환수지, 3급 아민을 교환기로 하는 스티렌계 약염기성 음이온 교환수지, 메틸암모늄을 교환기로 하는 스티렌계 약염기성 음이온교환수지, 또는 벤질알킬암모늄을 교환기로 하는 스티렌계 약염기성 음이온교환수지이다.

또한, 상기 1단계의 재결정은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 상기 알코올과의 혼합 또는, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산 등의 유기용매와의 혼합용매를 사용할 수 있다.

또한 상기 2단계에서 제조되는 염의 종류에는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알카리 금속류, 마그네슘, 칼슘 등의 알카리토금속류염과 같은 무기염, 또는 에틸렌디아민, 사이클로헥실아민, 아니린, 에타놀아민, 디에타놀아민, 에타놀아민, 에틸아민, 프로필아민, 아릴아민, 디에틸아민, 부틸아민, 이소부틸아민, 에틸아민, 펜틸아민, t-부틸아민, 이소프로필아민, 리신, 벤질메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 염과 같은 유기염의 형태를 포함한다.

상기 2단계에서 유기 용매는 톨루엔, 벤젠, 자이렌, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르 및 이들의 혼합용매를 포함한다.

또한 2단계의 재결정은 토멘토솔릭산, 벤구에롤릭산과 마찬가지로 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 이들의 혼합용매, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산 등의 유기용매와의 혼합용매를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서는 이온교환수지를 사용한 가수분해 공정을 도입함으로써 반응 종료 후 촉매의 회수 및 제거가 여과공정만으로 가능하고, 회수되어진 촉매의 재사용이 가능하여, 간단하고 경제적으로 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산을 제조하거나 분리할 수 있었다.

또한 본 발명은 상기 일반식 (I)의 게닌 화합물 및 그 염을 단일 또는 상호 혼합한 성분을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 게닌화합물 및 그 염은 피부의 콜라겐을 분해하여 탄력을 저하시키고 주름을 생성시키는 작용을 하는 콜라게나아제 및 엘라스타제, 메트릭스 메탈 로프로테나아제-1의 작용을 억제하는 탁월한 피부 주름 생성 억제 및 주름개선 효과 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명의 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 화운데이션, 팩으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형을 가짐을 특징으로 하는 화장료 조성물을 포함한다.

본 발명의 게닌화합물 및 그 염을 포함하는 화장료 조성물은 그 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

예를 들어, 게닌화합물 및 그 염을 통상의 화장품 제조용 기제물질과 혼합하여 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 게닌화합물 및 그 염 단독으로 또는 주름 예방 및 개선 성분과 혼합하여 피부 화장료 조성물을 기준으로 0.00001 중량% 내지 10.00 중량 %의 유효성분 양으로 사용한다. 또한 화장료 조성물을 제조하기 위한 기제물질은 에멀젼 상에서는 정제수, 1가 또는 다가 알콜 지방 및 오일, 계면 활성제 등이고, 기타 첨가제로 착향제 및 착색료, 방부제 등이 조성물에 포함될 수 있다. 가용화 상태의 조성물에는 정제수, 계면 활성제, 1가 및 다가 알콜 등이 착향제 및 착색료, 방부제 등을 사용한다.

피부 화장료에서 크림, 로션은 각각 W/O 에멀젼 또는 O/W 에멀젼으로 제조할 수 있고, 이 때 사용되는 유화제의 종류는 음이온 형태, 양이온 형태, 비이온 형태 등일 수도 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 성분, 예를 들면, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 화합물 및 그 염을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 보습용 화장품, 세안제, 바디용 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료의 구체예로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등을 들 수 있다.

또한 본 발명은 상기 일반식 (I)의 게닌 화합물 및 그 염을 단일 또는 혼합한 성분을 함유하는 항염증 및 상처 치유용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 연고제, 경고제 등과 같은 피부 외용제; 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형; 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구형 제제등을 포함한다.

상기 상처는 찰상, 절상, 화상, 열상, 동상, 피부염, 피부사상균에 의한 진 무름, 각막창상, 치루 및 욕창으로부터 선택되는 상처를 포함하며, 특히 화상의 경우는 화상에 의한 혈관투과성을 증가시키는 효과를 통하여 효과를 나타낸다.

상기 항염증 작용은 사이클로옥시게나제 2, iNOS 및 인터루킨-Ia의 분비량을 억제하는 기전을 갖음을 특징으로 한다.

본 발명의 게닌화합물 및 그 염은 염증 유도 물질인 사이클로옥시게나제 2 및 염증 매개체인 나이트릭 옥사이드를 생성시키는 iNOS의 활성을 억제시킴을 확인하였으며, 3차원 생인공피부를 이용한 항염실험에서 인터루킨-Ia의 분비량을 억제하는 탁월한 항염증 및 상처치유 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 항염증 및 상처치유용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물 및 그 염을 0.00001 내지 10 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물 및 그 염을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 그 염의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물 및 그 염을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고제, 경고제 등과 같은 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리 스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 그 염의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 게닌화합물의 제조

1-1. 지유 조추출물 제조

건조된 지유 1 kg을 메탄올 3L을 가하여 실온에서 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 농축하여 건조된 조추출물 250g을 얻었다.

1-2. 지유글리코사이드 I의 제조

상기 실시예 1-1 단계에서 얻은 지유 조추출물 250g을 2 L 증류수로 현탁시킨 다음, 500 ml의 디클로로메탄을 가하여 용해한 다음, 이를 분별 추출하였다. 이 과정을 2회 반복 수행하여 화학식 3의 지유글리코사이드 I을 포함한 물층을 수득하였다.

1-3. 지유글리코사이드 II 제조

상기 실시예 1-2의 지유글리코사이드 I을 포함하는 물 층에 강염기성 음이온교환수지(Amberlite IRA400, 알드리치사)를 가하여 50℃에서 24시간 반응시켰다. 반응 종결 후 음이온교환수지를 여과하여 회수한 뒤, 여액을 농축하여 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 정제수로 세척하여 하기 화학식 4인 미색의 지유글리코사이드 II 45 g을 얻었다.

1-4. 게닌화합물의 제조

상기 실시예 1-3의 얻어진 파우더를 1 L의 메탄올로 현탁시킨 다음 강산성양이온교환수지(Amberlite IR120, 알드리치사)를 가하고 환류조건하에서 24시간 반응시켰다. 반응 종료 후 강산성양이온교환수지를 제거한 후에 얻어진 여액을 감압농축하여 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 메탄올로 재결하여 백색의 게닌화합물 27g 을 얻었다.

1-5. 게닌화합물 나트륨염의 제조

상기 실시예 1-4의 게닌화합물 10 g을 초산에틸 100 ml에 용해시켰다. 혼합용액에 5N 수산화나트륨 수용액 10 ml을 가하여 50℃로 가온하면서 격렬히 교반하였다. 반응 종료 후 실온에서 정치시켜 분리된 초산에틸층을 농축하여 파우더를 얻고, 얻어진 파우더를 메탄올로 재결하여 게닌화합물 나트륨염 8.7 g을 얻었다.

실시예 2. 게닌화합물의 분리

상기 실시예 1에 의해 얻어진 게닌 화합물을 고성능액체크로마토그래피(LC-6AD, SHIMATZU사; Shim-Pak prep-ODS column, SHIMATZU사; 자외선분광검출기, λ=220 nm)를 이용하여 메탄올 : 정제수 = 9 : 1의 용매조건에서 분리를 실시하여 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산으로 분리하여 본 발명의 시료로 사용하였다. 분리한 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산의 크로마토그램은 도 1, 2에 나타내었다.

참고예 1. 게닌화합물의 분석

1-1. 질량분석

본 발명에 의해 얻어진 게닌화합물을 액체크로마토그래피-질량분석기(LCMSD-300, agilent사)분석을 하였다. 얻어진 질량분석 스펙트럼을 도 3 및 도 4에 나타내었다.

1-2. 핵자기공명분석

상기 실시예 2에서 수득한 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산의 구조를 ¹H-NMR, ¹³C-NMR (Varian Mercury plus 400 spectrometer)로 분석하였다. 용매로는 CDCl₃(Chloroform-d, 알드리치사)를 사용하였으며, 그 스펙트럼은 도 5 내지 도 8에 나타내었다.

실험예 1. 세포독성에 관한 실험

상기 실시예 1 및 2에서 얻은 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 및 그들의 염에 대한 세포독성을 알아보기 위하여 섬유아세포 (Human Skin fibroblast)를 배양하여 MTT [3-(4,5-dimethylthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide reduction test] 법을 수행하였다.

1-1. MMT 어세이 실험원리

MTT 어세이는 세포증식이나 독성측정에 사용되는 실험법으로, 살아있는 세포의 미토콘드리아내에서 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase라고 지칭됨)에 의해 황색 수용성염인 MTT가 불수용성인 파란색의 포르마잔 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 포르마잔 유도체는 용해제(보통 DMSO 이용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다.

1-2. 세포배양

사람 섬유아세포 (ATCC, CRL-2310)를 5x10⁴ cells/ml의 농도로 하여 24웰 배양판에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium; BRL, USA)를 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 2%를 함유한 DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium; BRL, USA)를 교체하고, 실시예 2의 시료를 농도별로 첨가한 후 3일 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

1-3. 세포생존율 측정

상기 실험예 1-2의 세포에 상등액을 제거 하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200ul씩을 가하여 세척하였다. MTT 용액을 웰당 1.0㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 1.0㎖씩 가한 후 12시간 37 ℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율을 하기의 수학식을 이용하여 계산하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

Cell viability (%)= (시료 OD_570nm 값 /대조구 OD_570nm 값)× 100

결과에서 보는 바와 같이 10 내지 100uM의 농도 범위에서 토멘토솔릭산과 벤 구에롤릭산 및 그들의 나트륨염이 섬유아세포에 대해서 전혀 독성이 없음을 알 수 있다. 이 후 세포 실험에 있어서 최고 농도를 100uM로 정하여 실험을 진행하였다.

실험예 2. 엘라스타제 억제 효과

2-1. 용액의 제조

0.267M 트리스 용액을 pH 8.0이 되도록 0.267M 염산액으로 조정하여 완충액을 만들었다.

엘라스타제 기질은 Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 표준품을 8.8mM 농도로 하여 기질액을 만들었다.

돼지 췌장 엘라스타제(Porcine Pancreatic Elastase) 표준품을 10㎍/㎖ 농도로 하여 효소액을 만들었다.

2-2. 대조군의 흡광도 측정

시료 대신 정제수 100㎕를 가지고 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 공시험액으로 하여 그 흡광도 A를 측정하며, 효소액 및 검액 대신 정제수 120㎕를 넣어 검액과 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 색보정액으로 하여 그 흡광도 D를 측정하고 다음식에 따라 엘라스타제 억제율(%)을 구한다.

2-3. 엘라스타제 저해측정

실험예 2-1에서 만든 완충액 60㎕에 기질액 20㎕, 실시예 2의 시료 100㎕를 넣어 섞은 뒤, 효소액 20㎕를 넣어 흔들어 섞어 25 ℃에서 15분간 반응시키고, p-니트로아닐린의 생성량을 410nm에서 흡광도 B를 측정한다. 완충액 60㎕에 기질액 20㎕, 정제수 20㎕, 시료 100㎕를 넣어 위와 같은 방법으로 조작하여 얻은 액을 대조액으로 하여 흡광도 C를 측정한다.

엘라스타제 저해율(%) = [1-{(B-C)/(A-D)}]×100

엘라스타제 저해활성 IC₅₀ 은 엘라스타제의 기질을 50% 저해하는데 요구되는 농도로써 표시하여 하기 표 1에 기재하였다.

시료	IC50(uM)
토멘토솔릭산	486
벤구에롤릭산	503
게닌화합물(TA:VA=1:1)	500
토멘토솔릭산 나트륨염	464
벤구에롤릭산 나트륨염	486
게닌화합물 나트륨염	450

실험예 3. 콜라게나제 억제 효과

시험관 내에서 콜라게나제 효소에 대한 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 또는 이들의 혼합 게닌화합물 및 그들의 나트륨염의 실험 농도는 50 uM과 최고 실험 가능농도인 100 uM으로 하였다. 아조 염색약 함유 콜라겐(Azo dye- impregnated collagen; Sigma 사) 5 mg과 0.1 M 인산칼륨 완충용액(pH 7.8) 1 ml에 시료를 500 ul를 첨가한 후 정제수로 총 부피가 2ml이 되게 한다. 그 후 37℃에서 1 분간 전처리를 하고 콜라게나제 (타입 IA, 시그마 사)를 최종 0.01unit가 되게 넣어 준 후 20분간 반응시킨다. 얼음물에 냉침시킨 후 3500 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 520 nm에서 흡광도 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 DMSO(시료를 녹인 용매) 500 ul를 첨가한 후 정제수로 총 부피가 2 ml이 되게 하여 사용하였다.

측정된 흡광도를 하기 수학식 3을 이용하여 콜라게나제 저해율(%)를 계산하여 표 2에 나타내었다. 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 혹은 이들의 혼합 게닌화합물 및 그들의 나트륨염의 각 시료에 대한 콜라게나제 저해 효과는 큰 차이가 없고, 모두 50uM 농도에서 50%가 넘는 저해 효과를 보이고 있어 주름 생성을 탁월하게 억제할 수 있을 것으로 사료된다.

콜라게나제 저해율(%)

= [1 - (각 농도 시료의 효소 활성도/대조군의 효소 활성도)] X 100

시료	콜라게나제 저해율(%)
	50uM	100uM
토멘토솔릭산	47.4	65.7
벤구에롤릭산	46.6	63.2
게닌화합물(TA:VA=1:1)	50.0	62.2
토멘토솔릭산 나트륨염	49.3	60.9
벤구에롤릭산 나트륨염	51.2	61.4
게닌화합물 나트륨염	52.3	62.7

실험예 4. MMP-1 mRNA 발현 저해 효과

피부내의 콜라겐 붕괴를 촉진하는 메트릭스 메탈로프로티나제(Matrix Metallo-Preoteinase)-1 에 대한 유전자 발현 저해 효과를 보기 위해 RT-PCR을 실시하였다. SNP는 세포내에서 산화질소를 발생시키는 물질로서 사용되며(B. Brune et al., J. Biol. Chem., 264, pp8455-8458, 1989), 사람 섬유아세포에서 MMP-1과 2의 발현을 증가시킨다. 또한 산화질소는 다기능성 메신저로서 작용하여 MMP-1, SNP에 의해 iNOS(유도성 산화질소 생성효소)가 활성화되면 세포내 산화질소의 양이 증가하여 MMP의 발현이 증가된다고 보고되어 있다(Taeboo Choe et al., J. Cosmet. Sci., 54, pp229-238, 2003).

4-1. 세포배양

섬유아세포를 100 mm 디쉬에 1 x 10⁶의 밀도로 분주한 후 24 시간 37℃에서 배양한다. 소디움 니트로프루사이드 (Sodium Nitroprusside, 시그마사) 50uM을 산화질소의 공급원으로 사용하여 배지에 첨가하고 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 또는 이들의 혼합 게닌화합물 및 그들의 나트륨염을 100uM의 농도가 되게 첨가하여 24시간동안 37℃에서 배양한다.

4-2. RNA 분석

세포의 배지를 제거하고 트리졸 (Trizol; 인비트로젠 사) 1ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260 nm에서 정량한 후, 역전사 중합 반응 (Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트 (All-in-one RT-PCR kit; 수퍼바이오 사)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 하기 표 3과 4와 같으며 올인원 역전사 중합 반응 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다.

MMP-1 프라이머
센스	Seq. ID 1: 5'-TGGGAGCAAACACATCTGA-3'
안티센스	Seq. ID 2: 5'-ATCACTTCTCCCCGAATCGT-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 48℃ 1분, 72℃ 1분간 29 cycle로 중합 반응.

Actin 프라이머
센스	Seq. ID 3: 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'
안티센스	Seq. ID 4: 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불활성화, 94℃ 1분, 62℃ 1분, 72℃1분간 22 cycle로 중합 반응

MMP-1 발현 억제 효과를 측정한 결과는 액틴에 대해 보정을 하여 나타내었고, 하기 표 5에서 보이는 바와 같이 소디움 니트로프루사이드로 유도된 MMP-1의 활성을 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 또는 이들의 혼합 게닌화합물 및 그들의 나트륨염이 탁월하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

시료	MMP-1 발현정도 (%, 액틴에 대해 보정한 값)
대조군	100
소디움 니트로프루사이드	120.71
소디움 니트로프루사이드 + 토멘토솔릭산 100uM	55.04
소디움 니트로프루사이드 + 벤구에롤릭산 100uM	72.37
소디움 니트로프루사이드 + 게닌화합물(TA:VA=1:1) 100uM	68.23
소디움 니트로프루사이드 + 토멘토솔릭산 나트륨염 100uM	61.54
소디움 니트로프루사이드 + 벤구에롤릭산 나트륨염 100uM	69.36
소디움 니트로프루사이드 + 게닌화합물 나트륨염 100uM	67.28
소디움 니트로프루사이드 + EGCG 25uM	66.65

실험예 5. 염증억제효과 측정

생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포를 이용하여 염증의 억제 효과를 측정하였다. 리포폴리사카라이드로 염증을 유도하고, iNOS(inducible Nitric Oxide Synthase; 유도성 니트릭 옥사이드 생성 효소)의 활성 및 COX-2 (Cyclooxygenase 2) 유전자 발현을 확인하였다.

5-1. 세포배양

페놀-레드(phenol-red)가 들어있지 않은 10% FBS-DMEM (Fetal Bovine Serum-Dulbecco's Modified Eagle Medium; 기브코 사) 배지에 8 x 10⁵세포를 현탁시켜 24웰 배양판에 접종하여 부착시켰다. 하루 후 시료를 10uM, 50uM, 100uM의 농도별로 처리하여 18시간 배양하고, 1ug/ml의 리포폴리사카라이드 (LPS, lipopolysaccharide; sigma 사)를 처리하여 세포 염증을 유발한 후, 24시간 동안 배양한다.

5-2. 니트릭 옥사이드 활성측정

상기 실험예 5-1의 방법으로 배양된 세포의 상층액을 회수하여 96웰 플레이트에 100ul씩 넣고 그리에스 시약 (Griess reagent; sigma 사)을 동량 첨가하여 상온에서 10분간 가볍게 흔들어 주어 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 소디움 나이트를 표준품으로 하여 검량선을 작성하고, 각각의 시료를10uM, 50uM, 100uM의 농도로 처리한 배양액 중의 나이트릭 옥사이드 생성량을 구하였다. 리포폴리사카라이드를 처리한 군의 나이트릭 옥사이드의 생성량을 100%로 하여 각 시료의 생성량을 구하였다. 그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 농도 의존적으로 iNOS의 생성을 억제함을 확인할 수 있었다.

시료	10uM (생성량 %)	50uM (생성량 %)	100uM (생성량 %)
리포폴리사카라이드	100	100	100
토멘토솔릭산	78.54	58.13	50.24
벤구에롤릭산	79.12	58.98	51.76
게닌화합물	82.15	63.63	59.93
토멘토솔릭산 나트륨염	79.46	55.42	49.35
벤구에롤릭산 나트륨염	78.26	52.48	46.21
게닌화합물 나트륨염	85.21	60.87	45.28

5-3. COX-2 유전자 발현 측정

상기 실험예 5-1의 방법으로 배양된 세포의 배지를 제거하고 트리졸 (Trizol; 인비트로젠 사) 1ml을 첨가하여 인비트로젠 사의 RNA 분리법에 따라 RNA를 분리하고, 자외선 검출기를 이용하여 260nm에서 정량한 후, 역전사 중합 반응 (Reverse transcription - polymerase chain reaction)을 실시하였다. 역전사 중합 반응은 올인원 역전사 중합 반응 키트 (All-in-one RT-PCR kit; 수퍼바이오 사)를 사용하였고, 프라이머와 반응 조건은 하기 표 7과 같으며 올인원 역전사 중합 반응 키트의 메뉴얼에 따라 실험을 진행하였다.

COX-2 프라이머
센스	Seq. ID 5: 5'-CTGAAGCCCACCCCAAAC-3'
안티센스	Seq. ID 6: 5'-AACCCAGGTCCTCGCTTATG-3'
반응 조건	50℃에서 30분간 역전사 후 96℃에서 3분간 역전사 효소를 불 활성화, 94℃30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분간 32 cycle로 중합 반응.

COX-2 발현 억제 효과를 측정한 결과는 액틴에 대해 보정을 하여 나타내었고, 하기 표 8에서 보이는 바와 같이 리포폴리사카라이드로 유도된 COX-2 의 활성을 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 또는 이들의 혼합 게닌화합물 및 그들의 나트륨염이 탁월하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

시료	COX-2발현 저해 효과 (%, 액틴에 대해 보정한 값)
대조군	100
리포폴리사카라이드	154
리포폴리사카라이드 + 토멘토솔릭산 100uM	115
리포폴리사카라이드 + 벤구에롤릭산 100uM	109
리포폴리사카라이드 + 게닌화합물 100uM	118
리포폴리사카라이드 + 토멘토솔릭산 나트륨염 100uM	124
리포폴리사카라이드 + 벤구에롤릭산 나트륨염 100uM	119
리포폴리사카라이드 + 게닌화합물 나트륨염 100uM	121

실험예 6. 3 차원 생인공피부를 이용한 항염 활성 측정 (인터루킨-1a의 분비량 측정)

인공 진피를 이용하여 염증의 억제 효과를 측정하였다. 과산화수소로 염증을 유도하고, 인터루킨-Ia의 분비량을 측정하였다.

6-1. 인공진피배양

타입 I collagen과 5배로 농축된 DMEM 배지, 래프트 완충용액(Raft buffer; 2.2% NaHCO₃, 200mM HEPES, 0.05N NaOH)을 7:2:1로 섞어 만든 용액과 사람 섬유아 세포를 1 x 10⁴ cell/ml 의 밀도로 혼합한 후, 인서트(insert; Miliphore)에 넣어 인공진피를 제조하였다. 이틀마다 한번씩 비타민 C(50ug/ml, Sigma)가 들어간 배지로 갈아 주면서 7일째 표피 세포인 케라티노사이트(표피 조직에서 분리한 normal keratinocyte)를 5X10⁵ cells/cm²의 밀도로 진피 조직위에 얹어 7일간 더 배양한다. 생인공 피부 배양시에는 10% 소혈청이 첨가된 DMEM 배지와 K-SFM (Keratinocyte-Serum free medium; Gibco)를 1 : 1로 섞은 배지로 배양한다.

6-2. 인터루킨-1a의 분비량 측정

실험예 6-1에서 배양한 세포에 인서트 내의 배지를 제거하여 표피 세포의 분화를 유도한다. 분화된 표피 세포는 각질을 형성하고 14일 후 시료를 24시간 처리하여 시료에 의한 염증인자의 방출량을 측정한다. 배지를 수거하여 인터루킨-1a의 분비량 측정 실험에 사용하였다. 엔도겐(Endogen)사의 사람 인터루킨-1a 엘리사 키트를 사용하였으며, 방법은 키트의 메뉴얼에 따라 실시하였고, 엘리사 판독기로 450nm의 파장에서 측정하였다.

인터루킨-1a의 분비량을 측정한 결과, 표 9에서 보이는 바와 같이 과산화수소로 유도된 인터루킨-Ia의 활성을 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 또는 이들의 혼합 게닌화합물과 그들의 나트륨염이 농도의존적으로 탁월하게 억제시킴을 확인할 수 있었다.

시료	인터루킨-1a pg/ml (억제효과)
	pg/ml	억제효과 (%)
대조구	23.9	-
H2O2 (500uM)	182.3	-
H2O2 +토멘토솔릭산 50uM	132.08	27.5
H2O2 +토멘토솔릭산 100uM	87.54	52.0
H2O2 +벤구에롤릭산 50uM	114.59	37.1
H2O2 +벤구에롤릭산 100uM	87.92	51.8
H2O2 +게닌회합물(TA:VA=1:1) 50uM	119.41	34.5
H2O2 +게닌회합물(TA:VA=1:1) 100uM	91.51	49.8
H2O2 +토멘토솔릭산 나트륨염 50uM	120.54	33.9
H2O2 +토멘토솔릭산 나트륨염 100uM	84.23	53.8
H2O2 +벤구에롤릭산 나트륨염 50uM	113.25	37.9
H2O2 +벤구에롤릭산 나트륨염 100uM	90.28	50.5
H2O2 +게닌회합물 나트륨염 50uM	127.79	29.9
H2O2 +게닌회합물 나트륨염 100uM	88.60	51.4

하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 화장료 조성물 및 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 유연 화장수

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	0.5	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	0.5
3	부틸렌 글리콜	4.0	4.0
4	글리세린	8.0	8.0
5	카르복시비닐폴리머	0.06	0.06
6	디소디움 에틸렌디아민테르라아세틱에시드	0.01	0.01
7	에탄올	7.0	7.0
8	에탄올아민	0.2	0.2
9	소르비탄모노스테아레이트	0.8	0.8
10	하이드로지네이티드 캐스터 오일	0.4	0.4
11	페닐메티콘	3.5	3.5
12	파라옥시안식향산프로필	0.2	0.2
13	파라옥시안식향산메틸	0.2	0.2
14	정제수	잔량	잔량
계		100.0	100.0

제제예 2. 영양화장수

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	0.5	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	0.5
3	스테아린산	1.0	1.0
4	세틸알코올	1.0	1.0
5	글리세릴모노스테아레이트	1.0	1.0
6	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	1.0	1.0
7	솔비탄세스퀴올레이트	1.0	1.0
8	유동파라핀	4.0	4.0
9	카르릴릭/카프릭글리세라이드	4.0	4.0
10	스쿠알란	3.0	3.0
11	카르복시비닐폴리머	0.1	0.1
12	부틸렌글리콜	5.0	5.0
13	에탄올아민	0.2	0.2
14	파라옥시안식향산프로필	0.2	0.2
15	파라옥시안식향산메틸	0.2	0.2
16	정제수	잔량	잔량
계		100.0	100.0

제제예 3. 영양크림

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	0.5	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	0.5
3	스테아린산	2.0	2.0
4	세틸알코올	2.0	2.0
5	글리세릴모노스테아레이트	2.0	2.0
6	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5	0.5
7	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
8	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0	1.0
9	왁스	1.0	1.0
10	유동파라핀	4.0	4.0
11	카르릴릭/카프릭글리세라이드	4.0	4.0
12	스쿠알란	4.0	4.0
13	카르복시비닐폴리머	0.3	0.3
14	부틸렌글리콜	5.0	5.0
15	글리세린	3.0	3.0
16	에탄올아민	0.5	0.5
17	파라옥시안식향산프로필	0.2	0.2
18	파라옥시안식향산메틸	0.2	0.2
19	정제수	잔량	잔량
계		100.0	100.0

제제예 4. 에센스

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	0.5	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	0.5
3	시토 스테롤	1.70	1.70
4	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50	1.50
5	세라마이드	0.7	0.7
6	세테아레스-4	1.2	1.2
7	콜레스테롤	1.5	1.5
8	디세틸포스페이트	0.4	0.4
9	농글리세린	5.0	5.0
10	선플라우어오일	15.0	15.0
11	카르복시비닐폴리머	0.2	0.2
12	산탄검	0.2	0.2
13	방부제	미량	미량
14	향료	미량	미량
15	정제수	잔량	잔량
계		100.0	100.0

제제예 5. 유화형 화운데이션

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	2.0	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	2.0
3	밀납	2.0	2.0
4	사이크로메치콘	2.0	2.0
5	유동파라핀	5.0	5.0
6	스쿠알란	5.0	5.0
7	스테아린산	2.0	2.0
8	친유성 모노스테아린산 글리세린	3.0	3.0
9	카프릴릭/카프릭글리세라이드	4.0	4.0
10	글리세린	4.0	4.0
11	프로필렌글리콜	3.0	3.0
12	부틸렌글리콜	3.0	3.0
13	에탄올아민	1.0	1.0
14	알루미늄마그네슘실리케이트	0.5	0.5
15	안료	12	12
16	방부제	미량	미량
17	향료	미량	미량
18	정제수	잔량	잔량
계		100.0	100.0

제제예 6. 친수성 연고제

번호	원 료	함량(중량%)	함량(중량%)
1	게닌화합물	0.5	-
2	게닌화합물 나트륨염	-	0.5
3	백색 바세린	250	250
4	스테아릴 알콜	220	220
5	에칠(또는 메칠)p-옥시벤조에이트	0.25	0.25
6	프로필렌 글리콜	120	120
7	라우릴 황산 나트륨	15	15
8	프로필 p-옥시벤조에이트	0.15	0.15

본 발명은 콜라겐과 같은 세포외 간질을 생합성하는 섬유아 세포의 증식과 대사를 원활히 함은 물론, 세포외 간질인 콜라겐의 생합성 및 유지를 위해 세포외 간질 성분 분해 효소(MMPs) 및 콜라게나제, 엘라스타제를 억제하여 현저한 피부 주 름 생성 억제 및 주름개선 효과를 가짐은 물론 뛰어난 iNOS 활성 억제, 인터루킨-1a의 분비량 억제 및 사이클로옥시게나제 2의 유전자 발현 억제를 통한 염증 반응 저해로 인해 상처 치유에 탁월한 효과를 지니는 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 및 그들의 염의 제조방법과 이를 한가지 또는 이들의 조합을 함유하는 조성물에 관한 것으로 주름 및 염증 개선화장료의 유효성분으로 첨가하여 주름개선효과 혹은 주름방지효과 또는 염증개선 및 방지 효과를 나타내는 화장료를 제공할 것으로 기대되어지며, 피부 연고제 등에 적용되어 염증 억제 및 혈관 투과성 증대로 인한 상처 치유 개선 효과를 가지는 상처치유제로의 적용이 기대되어진다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

1. 하기 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 이온교환수지를 사용하여 가수분해하고, 재결정하여 토멘토솔릭산 및 벤구에롤릭산과 같은 비당체를 얻고, 이를 유기용매에 용해시키고 염기를 가하고 교반시킨 후 용매를 제거하고 극성용매에서 재결정하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 염 형태의 일반식 (I) 화합물의 제조방법:

   

   (II)

   

   (I)

   상기 식에서 R은 수소원자 또는 알칼리 금속류, 알칼리 토금속류, 아민류, 리신, 수산염을 나타낸다.
2. 제 1항에 있어서, 상기 일반식 (I) 화합물은 지유추출물로부터 제조되거나 분리되는 토멘토솔릭산 및 벤구에롤릭산인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 알칼리 금속류로는 리튬, 나트륨, 칼륨으로부터 선택되는 알칼리 금속류; 알칼리 토금속류는 마그네슘, 칼슘으로부터 선택되는 알카리토금속류; 아민류는 에틸렌디아민, 사이클로헥실아민, 아니린, 에타놀아민, 디에타놀아민, 에타놀아민, 에틸아민, 프로필아민, 아릴아민, 디에틸아민, 부틸아민, 이소부틸아민, 에틸아민, 펜틸아민, t-부틸아민, 이소 프로필 아민으로부터 선택되는 아민류; 수산염으로는 벤질 메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드로부터 선택됨을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 일반식 (II)으로 표기되는 지유글리코사이드 배당체를 이온교환수지를 이용하여 25 내지 80℃에서 가수분해하고, 얻어진 물질을 재결정하여 토멘토솔릭산과 벤구에롤릭산 비당체(aglycon)를 얻는 제 1단계; 제 1단계에서 얻은 비당체 화합물을 유기용매에 용해시키고 25 내지 100℃의 온도에서 0.1 내지 50 배의 당량비를 갖는 염기를 가하고 교반시킨 후 용매를 농축하여 제거하고 극성용 매에서 재결정하여 그들의 염을 얻는 제 2단계의 공정을 포함함을 특징으로 하는 염 형태의 일반식 (I) 화합물의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 1단계에서 양이온교환수지는 술폰기를 교환기로 하는 저가교도(low crosslinking)에서 고가교도까지의 겔(gel)타입 또는 다공성(porous) 타입의 스티렌계 강산성 양이온 교환수지, 술폰기와 페놀기 를 교환기로 하는 강산성 양이온교환수지, 카복실산을 교환기로 하는 메타크릴계 다공성 타입의 약산성 양이온 교환수지, 카복실산을 교환기로 하는 아크릴계 고다공성(high porous) 타입의 약산성 양이온교환수지 또는 이미노아세틱산을 교환기로 하는 약산성 양이온교환수지임을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 4항에 있어서, 상기 1단계의 음이온교환수지는 에틸암모늄을 교환기로 하는 겔타입 또는 다공성타입의 스티렌계 강염기성 음이온 교환수지, 디메틸 에탄올 암모늄을 교환기로 하는 겔타입 또는 다공성타입의 스티렌계 강염기성 음이온교환수지, 벤질디메틸(2-하이드록시에틸) 암모늄을 교환기로 하는 강염기성 음이온교환수지, 메틸암모늄을 교환기로 하는 아크릴계 약염기성 음이온교환수지, 3급 아민을 교환기로 하는 스티렌계 약염기성 음이온 교환수지, 메틸암모늄을 교환기로 하는 스티렌계 약염기성 음이온교환수지, 또는 벤질알킬암모늄을 교환기로 하는 스티렌 계 약염기성 음이온교환수지임을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제 4항에 있어서, 상기 1 단계의 재결정은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 상기 알코올과의 혼합 또는, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산 등의 유기용매와의 혼합용매를 사용함을 특징으로 하는 방법.
8. 제 4항에 있어서, 상기 2단계에서 제조되는 염의 종류에는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알카리 금속류, 마그네슘, 칼슘 등의 알카리토금속류염과 같은 무기염, 또는 에틸렌디아민, 사이클로헥실아민, 아니린, 에타놀아민, 디에타놀아민, 에타놀아민, 에틸아민, 프로필아민, 아릴아민, 디에틸아민, 부틸아민, 이소부틸아민, 에틸아민, 펜틸아민, t-부틸아민, 이소프로필아민, 리신, 벤질메틸암모늄 하이드록사이드, 테트라메틸암모늄 하이드록사이드 염과 같은 유기염의 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 4항에 있어서, 상기 2단계에서 유기 용매는 톨루엔, 벤젠, 키실렌, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르 또는 이들의 혼합용매를 사용함을 특징 으로 하는 방법.
10. 제 1항의 일반식 (I)의 게닌 화합물 및 그 염을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 피부의 콜라겐을 분해하여 탄력을 저하시키고 주름을 생성시키는 작용을 하는 콜라게나아제 및 엘라스타제, 메트릭스 메탈로프로테나아제-1의 작용을 억제하여 탁월한 피부 주름 생성 을 억제함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
12. 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 화운데이션, 팩으로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형을 가짐을 특징으로 하는 화장료 조성물.
13. 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 피부 화장료 조성물을 기준으로 0.00001 중량% 내지 10.00 중량 %의 유효성분 양으로 사용함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 제 1항의 일반식 (I)의 게닌 화합물 및 그 염을 유효성분으로 함유하는 항염증 및 상처 치유용 약학 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 상기 조성물은 피부 화장료 조성물을 기준으로 게닌화합물 및 그 염 단독으로 또는 주름 예방 및 개선성분과 혼합하여 피부 화장료 조성물을 기준으로 0.0001 중량% 내지 10.00 중량 %의 양으로 사용함을 특징으로 하는 약학 조성물.
16. 제 14항에 있어서, 상기 약학조성물은 연고제, 경고제 등과 같은 피부 외용제인 약학 조성물.
17. 제 14항에 있어서, 상기 상처는 찰상, 절상, 화상, 열상, 동상, 피부염, 피부사상균에 의한 진무름, 각막창상, 치루 및 욕창으로부터 선택되는 상처임을 특 징으로 하는 약학 조성물.
18. 제 14항에 있어서, 상기 항염증 작용은 사이클로옥시게나제 2, iNOS 및 인터루킨-Ia의 분비량을 억제하는 기전을 갖음을 특징으로 하는 약학 조성물.
19. 제 14항에 있어서, 상기 항염증 및 상처치유용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물 및 그 염을 0.00001 내지 10 중량%로 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.

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