KR101125818B1 - 포스포릴콜린기 함유 화합물 및 이 화합물로 이루어지는표면 개질제 - Google Patents
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Abstract
하기식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물이다.
상기 식에서, m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3은 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 것이어도 좋다. R은 하기식 (2)~(4) 중의 구조 중 어느 하나이다(단, 하기식 (2)~(4) 구조에서 식 (1)의 화합물을 A-R-B로 나타낸다).
식 (2)~(4) 중 L은 1~6, P는 1~3을 나타낸다. 또한, 상기 포스포릴콜린기 함유 화합물로 이루어지는 표면 개질제, 이 표면 개질제로 처리된 개질 분체, 이 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 크로마토그래피용 충전제, 이 표면 개질제로 처리된 필터, 이 표면 개질제로 처리된 유리 기구이다.
크로마토그래피, 개질, 표면, 포스포릴콜린, 분체, 충전제, 필터, 유리, 담체
Description
본 발명은 포스포릴콜린기를 함유하는 신규한 화합물 및 이 화합물로 이루어지는 표면 개질제, 이 표면 개질제에 의해 개질된 개질 분체, 이 개질 분체를 담체로서 이용한 크로마토그래피용 충전제, 이 표면 개질제에 의해 개질된 필터 및 유리로 된 실험 기구에 관한 것이다.
본 발명의 화합물로 이루어지는 표면 개질제는 생체 적합성, 보습성, 기타 각종 유용한 기능을 물체에 부여한다.
포스포릴콜린기를 갖는 중합체는 생체 적합성 고분자로서 검토되고 있으며, 이러한 중합체를 각종 기제(base)에 피복시킨 생체 적합성 재료가 개발되고 있다.
예컨대 특허 문헌 1에는, 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린의 단독 중합체 및 공중합체로 피복한 분말을 화장료용 분말로서 이용하여 보습성이나 피부 밀착성을 개선한 화장료가 개시되어 있다.
또한 특허 문헌 2 및 특허 문헌 3에는 포스포릴콜린기를 갖는 중합체로 피복한 의료용 재료나 분리제가 개시되어 있다.
상기한 재료는 주로 수산기를 갖는 아크릴계 모노머와 2-클로로-1,3,2-디옥사포스포란-2-옥사이드를 반응시키고, 나아가 트리메틸아민에 의해 4차 암모늄으로 함으로써 포스포릴콜린 구조를 갖는 모노머를 합성하고 이를 중합하여 얻어지는 중합체에 의해 그 표면이 피복된 것이다(중합체의 제조 방법에 관해서는 특허 문헌 4 및 5 참조).
특허 문헌 4에는 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린과 메타크릴산 에스테르의 공중합체가 제조되어 있고, 특허 문헌 5에는 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린의 단독 중합체가 제조되어 있다.
한편, 단백질이나 단백질보다 분자량이 작은 폴리펩타이드 등의 생체 시료를 사이즈 배제에 의해 분리하는 GFC용 충전제에는 많은 시판품이 존재한다. 이러한 GFC용 충전제에는 가교된 친수성 고분자를 담체로 하는 충전제와 실리카겔을 담체로 하는 충전제가 존재한다.
가교된 친수성 고분자를 담체로 하는 충전제는 적용할 수 있는 이동 상의 pH범위가 넓고 범용성이 높다. 그러나, 고분자를 담체로 하는 충전제는 실리카겔을 담체로 하는 충전제보다 (1) 세공(pore) 직경의 제어가 곤란하기 때문에 고이론 단수를 얻기가 어렵다. 또한 (2) 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 사용될 때 걸리는 고압 조건에 대한 강도가 나쁜 것과 이동 상 용매에 의해 입자가 팽윤되는 것 때문에 재현성이 양호한 크로마토그램을 얻을 수 없는 경우도 많다.
실리카겔을 담체로 하는 충전제는 단백질이나 폴리펩타이드의 실리카겔 담체표면에 대한 흡착이 문제가 된다. 따라서, 분석 시료 내의 단백질이나 폴리펩타이 드의 실리카겔에 대한 흡착을 억제할 목적으로 비해리성의 친수성 기에 의해 표면이 수식된 실리카겔을 이용한 충전제가 시판되고 있다.
예컨대 실리카겔계 GFC용 칼럼으로서 SHOWA DENKO K. K에서는 Shodex PROTEIN KW-803(제품명)이 시판되고 있다. 이러한 실리카겔계 칼럼은 카탈로그에 분자량 수 천에서 100만 정도의 단백질의 분석에 적합한 실리카겔계의 GFC 모드의 칼럼이라고 설명되어 있다.
또한 YMC CO., LTD.에서는 YMC-Pack Diol(제품명)이 시판되고 있다. 이것도 실리카겔계의 GFC용 칼럼이며, 디올 구조를 갖는 작용기를 실리카겔 담체에 화학 결합시킨 것으로, 분자량 1만에서 수 십만의 단백질의 분리에 적용할 수 있다고 설명되어 있다.
비 특허 문헌 1에는 담체 상에 화학적으로 그래프트된 포스포릴콜린기에 의해 단백질의 흡착이 감소한다는 것이 기재되어 있다.
또한 특허 문헌 6 및 7에는 뛰어난 친수성을 나타내는 것으로 알려져 있는 베타인 구조를 갖는 유기 실란계 표면 개질제(실란 커플링제)가 개시되어 있다. 특허 문헌 6에서는 디메틸아미노알킬실란을 유기 용매 내에서 1,3-프로판설톤과 반응시킴으로써 4차 암모늄의 양 전하와 설폰산의 음 전하로 이루어지는 설포베타인을 갖는 실란 커플링제를 얻을 수 있다고 되어 있다. 특허 문헌 7에서는 4차 암모늄과 카르복실기로 이루어지는 카르복시베타인을 갖는 실란 커플링제의 제조 방법이 기재되어 있다. 이들 실란 커플링제는 유리 등에 도포하고 건조시킴으로써 물질 표면을 개질하는 것이 가능하다. 그러나, 이들 구조의 베타인에서는 물질 표면 에 뛰어난 친수성을 부여할 수 있어도, 베타인 내의 양 전하와 음 전하의 세기에 치우침이 있기 때문에 전기적으로 중성이 되지는 않는다. 예컨대 설포베타인에서는 설폰산의 강산성에 의해 음 전하를 띠고, 카르복시베타인에서는 4차 암모늄에 의한 양 전하의 성질이 나타난다. 이러한 베타인 구조에서는 단백질과의 사이에서 지나치게 강한 이온 교환 상호 작용을 발생시켜 단백질의 비 가역적인 흡착을 초래한다.
한편, 생체 적합성이나 단백질 흡착의 억제를 목적으로 하여 이들 실란 커플링제가 크로마토그래피용 충전제나 필터류 및 실험 기구류에 사용된 예는 없다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 평 7-118123호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 2000-279512호 공보
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 2002-98676호 공보
특허 문헌 4: 일본 특허 공개 평 9-3132호 공보
특허 문헌 5: 일본 특허 공개 평 10-298240호 공보
특허 문헌 6: 일본 특허 공개 평 5-222064호 공보
특허 문헌 7: 일본 특허 공개 소 63-295593호 공보
비 특허 문헌 1: Jian R.Lu 등, Langmuir 2001, 17, 3382-3389
그러나, 포스포릴콜린기를 갖는 중합체에 의해 물체의 표면을 피복하여 개질하는 방법에서는, 표면 전체를 효과적으로 피복하기가 어렵다. 또한 피복한 중합체가 물체로부터 박리되기 때문에 내구성에 문제가 생기는 경우가 있다. 나아가서는, 물체의 표면이 중합체에 의해 피복되기 때문에 포스포릴콜린기에 의한 생체 적합성 등 목적으로 하는 기능을 부여하는 목적에서 벗어나 물체 자체에 요구되고 있는 세공 등의 미세 구조와 같은 기본적 성질을 잃게 되는 경우도 있다.
또한 포스포릴콜린기의 유도체를 저분자로서 물체에 도입하는 경우에도, 물체에 포스포릴콜린기의 유도체와 반응시킬 수 있는 작용기를 먼저 도입하고, 이어서 포스포릴콜린기의 유도체를 반응시키는 방법에서는, 물체 표면에 미반응 작용기가 물체 표면에 남기 때문에 생체 적합성의 저하로 이어지게 된다.
예컨대 먼저 물체 표면에 아미노기를 도입하고, 다음으로 포스포릴콜린의 알데히드 유도체를 물체 표면의 아미노기와 반응시키는 경우, 많은 미반응 아미노기가 잔존하게 된다. 이들 잔존 아미노기는 다른 저분자 화합물을 결합시킴으로써 어느 정도 봉쇄하는 것이 가능하지만, 물체 표면의 친수성을 유지하는 것이 곤란할 뿐만 아니라 모두를 봉쇄할 수는 없다. 물질 표면에 아미노기가 잔존하는 경우, 아미노기는 강한 염기성을 가지고 있기 때문에 주로 산성의 단백질이 현저하게 강한 이온 교환적인 상호 작용을 나타내어 그 대부분이 흡착되어 버린다. 크로마토그래피용 충전제로 간주한 경우에는 해당 단백질의 회수율의 악화나 피크의 현저한 테일링(tailing)의 원인이 된다. 또한, 단백질의 흡착은 그 변성을 초래하며, 생체 적합성 소재로 간주한 경우에는 염증 등의 원인이 되기 때문에 바람직하지 못하다.
본 발명은 포스포릴콜린기를 함유하는 화합물과, 이 화합물과 반응하는 작용기를 가지며 물체 표면과 결합을 발생시키는 작용기를 갖는 물체를 직접 반응시키면, 간편하면서 높은 범용성으로 원하는 임의의 양의 포스포릴콜린기를 물체 표면에 직접 부여할 수 있다는 사실을 발견하였다.
그리고, 이 화합물로 이루어지는 표면 개질제에 의해 개질 분체, 이 개질 분체를 담체로서 이용한 크로마토그래피용 충전제, 이 표면 개질제에 의해 개질된 필터 및 유리로 된 실험 기구를 용이하게 제조할 수 있다는 사실을 알아내고 본 발명을 완성되기에 이르렀다.
즉 본 발명은, 하기식 (1)로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물을 제공하는 것이다.
상기 식에서, m은 2~6, n은 1~4이다.
X1, X2, X3은 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 것이어도 좋다.
R은 하기식 (2)~(4) 중의 구조 중 어느 하나이다(단, 하기식 (2)~(4) 구조에서 식 (1)의 화합물을 A-R-B로 나타낸다).
식 (2)~(4) 중 L은 1~6, P는 1~3을 나타낸다.
또한 본 발명은, 하기식 (5) 또는 (6)으로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물을 제공하는 것이다.
상기 식에서 m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3은 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 것이어도 좋다.
또한 본 발명은 상기한 포스포릴콜린기 함유 화합물로 이루어지는 표면 개질제를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 글리세로포스포릴콜린의 과요오드산 나트륨과 3염화 루테늄에 의한 산화 반응에 의해 포스포릴콜린기 및 카르복실기를 갖는 화합물을 합성하고, 아미노기를 갖는 유기 실란 화합물과 포스포릴콜린기 및 카르복실기를 갖는 화합물로부터 축합제에 의해 합성되는 것을 특징으로 하는 상기 식 (6)에 기재된 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기한 표면 개질제로 처리된 개질 분체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기한 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기한 표면 개질제로 처리된 필터를 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 상기한 표면 개질제로 표면 처리된 유리로 된 실험 기구를 제공하는 것이다.
도 1은 합성예 1에서 제조한 화합물의 구조식 및 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 2에서 제조한 개질 분체의 13C-CPMAS 스펙트럼이다.
도 3은 실시예 2에서 제조한 개질 분체의 31P-CPMAS 스펙트럼이다.
도 4는 실시예 2에서 제조한 개질 분체의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 5는 실시예 3에서 제조한 액체 크로마토그래피용 충전제를 GFC 모드로 이용한 경우의 교정 곡선이다.
도 6은 실시예 3에서 제조한 액체 크로마토그래피용 충전제를 사용하여 인간 혈청 단백질을 분리하였을 때의 크로마토그램이다.
도 7은 이동 상 염 농도 500mM에서 인간 혈청 단백질을 분리하였을 때의 크로마토그램이다. (a) 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 합성한 충전제. (b) Shodex PROTEIN KW803.
도 8은 이동 상 염 농도 150mM에서 인간 혈청 단백질을 분리하였을 때의 크로마토그램이다. (a) 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 합성한 충전제. (b) Shodex PROTEIN KW803.
도 9는 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 합성한 충전제를 이용하여 5종류의 유기산을 분리하였을 때의 크로마토그램이다.
도 10은 본원 발명의 표면 개질제의 스페이서 부분에 2차 아민을 삽입한 경우, 인간 혈청 단백질을 분리하였을 때의 크로마토그램이다.
도 11은 실시예 9에서 합성한 개질 분체의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 12는 실시예 10에서 제조한 액체 크로마토그래피용 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 13은 실시예 3에서 제조한 액체 크로마토그래피용 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 14는 비교예 2에서 제조한 식 (14)로 나타낸 화합물에 의해 표면 개질된 액체 크로마토그래피용 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 15는 비교예 2에서 제조한 식 (15)로 나타낸 화합물에 의해 표면 개질된 액체 크로마토그래피용 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 16은 실시예 7에서 제조한 화합물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 17은 실시예 7에서 제조한 화합물의 Mass 스펙트럼이다.
도 18은 합성예 1에서 제조한 화합물의 Mass 스펙트럼이다.
또한 본 발명의 화합물은, 정제, 비정제와 관계없이 표면 개질이 가능하여 단백질 흡착 억제 등의 효과를 얻을 수 있다.
하기식 (1), 또는 (5) 또는 (6)으로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물은 신규 화합물이다.
상기 식에서, m은 2~6, n은 1~4이다.
X1, X2, X3은 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 것이어도 좋다.
R은 하기식 (2)~(4) 중의 구조 중 어느 하나이다(단, 하기식 (2)~(4) 구조에서 식 (1)의 화합물을 A-R-B로 나타낸다).
식 (2)~(4) 중 L은 1~6, P는 1~3을 나타낸다.
하기식 (5) 또는 (6)으로 표시되는 포스포릴콜린기 함유 화합물.
상기 식에서 m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3은 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 것이어도 좋다.
"식 (1), 또는 (5) 또는 (6)의 포스포릴콜린기 함유 화합물의 제조 방법"
하기식 (7)에 나타낸 포스포릴콜린 유도체를 증류수에 용해시킨다. 하기식 (7)의 포스포릴콜린 유도체는 공지의 화합물로서 시판품을 입수할 수 있다.
식 (7)의 화합물의 수용액을 얼음물 욕조 내에서 냉각하고, 과요오드산 나트륨을 첨가하여 5시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조하고, 메탄올에 의해 하기식 (8)에 나타낸 알데히드기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 추출한다. 구조식 및 NMR 스펙트럼을 도 1에, Mass 스펙트럼을 도 18에 나타내었다.
다음, 식 (8)의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 O.5 당량 첨가한다. 이 혼합 용액을 실온에서 소정 시간 교반한 후 빙냉하고, 시아노하이드로 붕소화 나트륨을 적당량 첨가하고, 실온으로 되돌려서 16시간 동안 교반한다. 이 동안에도 반응 용기에는 건조 질소를 계속 흘린다. 침전을 여과한 후, 식 (5) 및/또는 식 (6)의 메탄올 용액을 얻는다.
다음, 본 발명의 화합물의 정제 방법에 대하여 설명한다. 본 발명의 화합물의 정제 방법은 이하에 한정되지 않는다.
얻어진 메탄올 용액을 감압 농축하고, 잔류물을 증류수에 용해시킨다. 이 수용액을 시료로 한다. 소수성 상호 작용과 양이온 교환능을 갖는 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼인 캡슐 팩 SCX UG80 S-5(사이즈:4.6㎜i.d.×250mm) (SHISEIDO CO., LTD.)를 HPLC 장치에 접속하고, 0.2mmol/L의 인산 완충액(pH 3.5)을 1mL/분의 유속으로 흘려 평형화시킨 후에 시료를 10μL 주입한다. 검출기로서 시차 굴절계 를 사용함으로써 크로마토그램을 얻을 수 있고, 목적으로 하는 화합물을 단리할 수 있다.
단, 본 발명의 화합물로 이루어지는 표면 개질제는 정제 전의 메탄올 용액의 단계에서 그대로 사용하는 것이 가능하다.
상기한 순서는 식 (5) 또는 (6)에 나타낸 화합물 중의 m, n이 바뀌어도 동일하게 실시할 수 있다. 여기서 나타낸 순서는 m=3, n=2인 경우이다. 또한, 아미노기를 갖는 실란 화합물로서 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란 등을 사용함으로써 실란 부위와 포스포릴콜린기 사이에 2차 아민을 삽입하는 것도 가능하며, 이에 대해서도 상기와 동일한 순서로 행할 수 있다. 반응 용매는 특별히 한정되지 않으며, 전술한 메탄올 이외에도 물이나, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올, N,N-디메틸포름아미드나 디메틸설폭사이드 등의 비프로톤성 용매를 사용할 수 있다. 단, 반응중인 유기 실란 화합물의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하다.
또한 식 (5) 또는 (6) 중의 메톡시기(OCH3)가 에톡시기(OC2H5)인 경우에는 메탄올을 에탄올로 바꾸어서 반응을 행하고, Cl인 경우에는 디메틸포름아미드나 디메틸설폭사이드로 변경한다.
나아가서는, Si와 결합하는 메톡시기 또는 에톡시기 또는 Cl 중 2개 또는 하나가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 하나로 치환되어 있는 경우에도 상기한 방법과 동일하게 제조할 수 있다.
"표면 개질제"
상기 식 (5) 및 (6)의 화합물은 물질의 표면 개질제로서 유용하다. 즉, 물질 표면에 용이하게 원하는 양의 포스포릴콜린기를 도입하여 개질하는 것이다. 구체적으로는, 수산기를 표면에 가지고 있는 물질의 경우, 그 물질 표면의 수산기와 식 (5) 및 (6)의 화합물의 Si-OCH3로부터 탈수 반응에 의해 화학 결합을 형성시킨다. 이러한 화학 반응은 대부분의 유기 용매 내에서 10℃에서 250℃의 온도 범위에서 매우 용이하게 정량적으로 진행된다. 이러한 탈수 반응에 의해 화학적, 물리적으로 매우 안정적인 포스포릴콜린기에 의한 표면 개질을 실시할 수 있다.
또한 물질 표면에 수산기가 존재하지 않는 경우에는, 식 (5) 및 (6)의 화합물을 휘발성 용매에 용해시키고, 그 용액을 물질 표면에 도포, 용매를 건조시키는 방법이 유효하다. 구체적인 예로서는, 식 (5) 및 (6)의 화합물을 메탄올에 용해시키고, 그것을 물질 표면에 도포한다. 다음, 10℃에서 250℃의 온도 범위에서 메탄올을 기화시킨다. 또한 필요에 따라 가열 처리를 행한다. 이 때, 식 (5) 및 (6)의 화합물의 Si-OCH3끼리 탈수 반응을 일으켜 Si-O-Si 결합을 생성하고, 물질 표면을 피복하는 것이 가능하다. Si-OCH3 끼리 탈수 반응을 일으켜 Si-O-Si 결합을 생성하는 반응은 이미 알려져 있다. 메탄올의 휘발 시에 이와 같이 생성되는 막은 대부분의 물질 표면에 미량으로 존재하는 수산기와 군데군데 결합을 발생시키기 때문에 안정성이 양호한 표면 개질 방법이 된다. 본 방법은 수산기를 가지지 않는 물질뿐만 아니라, 수산기를 갖는 물질에 대해서도 매우 유효한 표면 개질 방법이 다.
본 발명의 표면 개질제에 의해 개질되는 물질(또는 소재)은 생체 적합성 및 친수성이 뛰어난 재료 및 성형품이 된다. 생체 적합성을 갖는 포스포릴콜린기를 소재 표면에 직접 갖는 재료로서, 화장료, 의료용 재료(인공 장기, 수술용 기구 등), 크로마토용 충전제, 도료 등 폭넓은 용도에 응용 가능하다.
또한 본 발명의 표면 개질제는 분리 또는 분석 장치용의 배관, 배관 접속 부품, 샘플링을 위한 니들, 샘플 바이알(vial), 검출기 셀 등의 시험액이 접촉하는 부재의 개질 방법으로서 유용하며, 특히 HPLC, MS, NMR의 접속 배관이나 전기 영동 장치의 캐필러리 배관 등의 소재가 바람직하게 개질된다. 테프론(TEFLON)(등록 상표)관, 테프젤(TEFZEL)관, 피크 수지관, 퓨즈드 실리카관 등의 소재이다.
"카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 이용한 식 (6)에 기재된 화합물의 제조 방법"
포스포릴콜린 유도체는 친수성이 매우 높고, 유기 용매에 대한 용해도가 극단적으로 낮다. 포스포릴콜린 유도체의 합성은 디옥사포스포란류를 출발 물질로 하는 전합성법과 대두 등에 포함되는 인 지질인 포스파티딜콜린의 가수 분해에 의해 얻어지는 글리세로포스포릴콜린을 출발 물질로 하는 합성법으로 크게 나뉜다. 포스포릴콜린 유도체는 용해하는 유기 용매가 한정되기 때문에 합성 루트가 복잡해지고, 제조에 소요되는 비용이 비싸 실용화의 장벽이 되고 있다. 이러한 합성의 복잡함과 비용 문제는 전합성법에서 현저하게 나타나는데, 본 발명의 제조 방법에 의하면, 포스포릴콜린 유도체에 있어 양호한 용매 내에서 매우 간편하면서 고수율로 카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 제조할 수 있고, 아울러 저렴하게 대량으로 입수할 수 있는 포스파티딜콜린 유래의 글리세로포스포릴콜린으로부터 제조하는 것이 가능하며, 비용 면에서도 뛰어나다. 마지막으로, 식 (6)에 기재된 화합물도 간편하면서 고수율로 얻을 수 있다.
글리세로포스포릴콜린, 과요오드산 나트륨, 3염화 루테늄(수화물)을 아세토니트릴 수용액에 부가한다. 실온에서 교반한 후 여과하고, 여과액으로부터 용매를 제거한다. 얻어진 고형물로부터 메탄올로 목적물을 추출, 계속하여 메탄올을 증류 제거함으로써 하기식 (9)에 나타낸 카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 얻는다. 구조식 및 NMR 스펙트럼을 도 16에, Mass 스펙트럼을 도 17에 나타내었다.
반응 용매는 물이어도 가능하고, 또한 과요오드산 이외에도 다른 과요오드산염이나 과요오드산 등을 사용하는 것도 가능하며, 3염화 루테늄 이외에도 다른 2가 및/또는 3가의 루테늄 화합물이나 이들의 수화물 등을 사용하는 것도 가능하다.
다음, 식 (9)에 나타낸 화합물의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 0.5 등량 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-3-디아미노프로필카보디이미드(EDC)를 각각 1등량 첨가한다. 이 혼합 용액을 실온에서 3시간 동안 교반함으로써 식 (6)에 나타낸 화합물을 얻었다.
또한, 반응 용매는 N, N-디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 클로로포름 등 메탄올 이외이어도 가능하며, 또한 NHS, EDC 이외에도 디사이클로카보디이미드(DCC), 카르복시디이미다졸(CDI) 등을 사용하는 것도 가능하다.
상기한 순서는 식 (6)에 나타낸 화합물 중의 m, n이 바뀌어도 완전히 동일하게 행할 수 있다. 여기서 나타낸 순서는 m=3, n=2인 경우이다. 단, 반응중인 유기 실란 화합물의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하다.
또한 식 (6) 내의 메톡시기(OCH3)가 에톡시기(OC2H5)인 경우에는 메탄올을 에탄올로 바꾸어서 반응을 행하고, Cl인 경우에는 디메틸포름아미드나 디메틸설폭사이드로 변경한다.
나아가서는, Si와 결합하는 메톡시기 또는 에톡시기 또는 Cl 중 2개 또는 하나가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기 중 어느 하나로 치환되어 있는 경우에도 상기한 방법과 완전히 동일하게 제조할 수 있다.
"개질 분체"
본 발명의 표면 개질제는 수산기를 갖는 분체를 개질하기 위하여 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 개질 분체는 이하의 방법으로 제조된다. 이 방법에 의해 포스포릴콜린기를 분체 표면에 직접 갖는 개질 분체, 즉, 포스포릴콜린기가 분체 표면에 화학적인 결합으로 도입되어 있는 개질 분체를 용이하게 제조할 수 있다.
이러한 개질 분체는 포스포릴콜린기를 갖는 중합체로 피복함으로써 포스포릴 콜린기를 도입한 분체와 비교하여 중합체의 벗겨짐에 의해 포스포릴콜린기를 잃지 않게 된다는 이점을 갖는다. 또한 중합체로 피복되어 있지 않으므로, 분체 자체의 미세 구조를 손상시키지 않는다는 이점을 갖는다. 구체적으로는, 본 발명의 표면 개질제를 사용함으로써 분체 표면이 갖는 입체적인 수 nm 정도의 미세 구조(미세공 등)을 메우지 않고 표면을 포스포릴콜린기로 피복하는 것이 가능하다.
또한 포스포릴콜린기의 유도체를 저분자로 하여 물체에 도입하는 경우에도, 물체에 포스포릴콜린기의 유도체와 반응시킬 수 있는 작용기를 먼저 도입하고, 이어서 포스포릴콜린기의 유도체를 반응시키는 방법에서는, 물체 표면에 비반응 작용기가 물체 표면에 남기 때문에 생체 적합성의 저하로 이어지게 된다. 예컨대 먼저 물체 표면에 아미노기를 도입하고, 이어서 포스포릴콜린의 알데히드 유도체를 물체 표면의 아미노기와 반응시키는 경우, 많은 미반응 아미노기가 잔존하게 된다. 이들 잔존 아미노기는 다른 저분자 화합물을 결합시킴으로써 어느 정도 봉쇄하는 것이 가능한데, 물체 표면의 친수성을 유지하기가 곤란할뿐만 아니라, 모두를 봉쇄할 수는 없다. 물질 표면에 아미노기가 많이 잔존하는 경우, 아미노기는 강한 염기성을 가지고 있기 때문에 주로 산성인 단백질이 현저하게 강한 전기적인 상호 작용을 나타내고, 그 대부분이 흡착되어 버린다. 크로마토그래피용 충전제로 간주한 경우에는 해당 단백질의 회수율의 악화나 피크의 현저한 테일링의 원인이 된다. 또한, 단백질의 흡착은 그 변성을 초래하며, 생체 적합성 소재로 간주한 경우에는 염증 등의 원인이 되어 바람직하지 못하다.
본 발명에 의한 표면 개질제는 합성시 아미노기를 갖는 유기 실란 화합물에 대하여 포스포릴콜린의 알데히드 유도체를 과잉 첨가하고, 이 둘을 액상 내에서 반응시킨다. 아미노기와 알데히드기의 반응성은 매우 높으며, 알데히드를 과잉 첨가한 경우에는 약 100%의 아미노기가 알데히드와 반응한다는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 의한 표면 개질제에는 미반응 아미노기가 검출되지 않는다. 이를 위하여 본 발명에 의한 표면 개질에서는, 물체 표면에 미반응 아미노기를 혼재시키지 않고 포스포릴콜린기만을 도입할 수 있다. 이에 따라 고상 상에서 2단계의 반응을 행하는 방법보다 생체 적합성이 매우 뛰어나며, 단백질의 흡착이 적은 분체를 얻을 수 있다.
"개질 분체의 제조 방법"
식 (5) 또는 (6)의 화합물의 0.3mmol/mL의 농도의 메탄올 용액 20mL에 증류수 20mL을 부가하고, 표면 개질을 실시할 분체를 첨가한다. 분체의 질량은 그 비표면적에 따라 조정할 필요가 있다. 예컨대 100m2/g의 분체의 경우, 그 첨가량은 10g 정도가 적당하다. 이 분체 분산액을 오일 배스(oil bath) 내 80℃에서 환류하고, 5시간 후에 분체를 여과하고, 메탄올로 세정하고, 80℃에서 3시간 동안 감압 건조함으로써 개질 분체를 얻는다.
사용하는 분체는 특별히 제한되지 않는다. 용도에 따라 일반적으로 평균 입자 직경 0.01~10μm 혹은 0.01~1000μm정도의 임의의 물체를 의미한다. 구체적인 분체로서는, 예컨대 무기 분말(예컨대 탈크, 카올린, 운모, 견운모(세리사이트), 백운모, 금운모, 합성 운모, 홍운모, 흑운모, 퍼미큘라이트, 탄산 마그네슘, 탄산 칼슘, 규산 알루미늄, 규산 바륨, 규산 칼슘, 규산 마그네슘, 규산 스트론튬, 텅스텐산 금속염, 마그네슘, 실리카, 제올라이트, 황산 바륨, 소성 황산 칼슘(구운 석고), 인산 칼슘, 불소 아파타이트, 하이드록시아파타이트, 세라믹 파우더, 금속 비누(예컨대 미리스트산 아연, 팔미트산 칼슘, 스테아르산 알루미늄), 질화 붕소, 산화 세륨 등); 유기 분말(예컨대 폴리아미드 수지 분말(나일론 분말), 폴리에틸렌 분말, 폴리메타크릴산 메틸 분말, 벤조구아나민 수지 분말, 폴리 4불화 에틸렌 분말, 폴리메틸실세스퀴옥산 분말, 실리콘엘라스토머 분말, 셀룰로오스 분말 등); 무기 백색 안료(예컨대 2산화 티타늄, 산화 아연 등); 무기 적색계 안료(예컨대 산화철(벵갈라), 티타늄산 철 등); 무기 갈색계 안료(예컨대 γ-산화 철 등); 무기 황색계 안료(예컨대 황 산화 철, 황토 등); 무기 흑색계 안료(예컨대 흑 산화 철, 저차 산화 티타늄 등); 무기 자색계 안료(예컨대 망간 바이올렛, 코발트 바이올렛 등); 무기 녹색계 안료(예컨대 산화 크롬, 수산화 크롬, 티타늄산 코발트 등); 무기 청색계 안료(예컨대 군청, 감청 등); 펄 안료(예컨대 산화 티타늄 코팅된 운모(mica), 산화 티타늄 코팅된 옥시 염화 비스무트, 산화 티타늄 코팅된 탈크, 착색 산화 티타늄 코팅된 운모, 옥시 염화 비스무트, 은빛 등); 금속 분말 안료(예컨대 알루미늄 파우더, 구리 파우더 등); 지르코늄, 바륨 또는 알루미늄 레이크 등의 유기 안료(예컨대, 적색 201호, 적색 202호, 적색 204호, 적색 205호, 적색 220호, 적색 226호, 적색 228호, 적색 405호, 오렌지색 203호, 오렌지색 204호, 황색 205호, 황색 401호, 및 청색 404호 등의 유기 안료, 적색 3호, 적색 104호, 적색 106호, 적색 227호, 적색 230호, 적색 401호, 적색 505호, 오렌지색 205호, 황색 4호, 황색 5호, 황색 202호, 황색 203호, 녹색 3호 및 청색 1호 등); 천연 색소(예컨대 클로로필, β-카로틴 등) 등을 들 수 있다.
상기한 제조 방법에 의해 친수성의 포스포릴콜린기를 임의의 양으로 함유하는 분체가 간단히 얻어진다. 또한 분체가 합성 폴리머인 경우, 그 친수부로서 카르복실산기, 수산기, 1차~3차 아미노기, 설폰산기, 인산기, 폴리옥시에틸렌기, 암모늄기, 아미드, 카르복시베타인, 당류 등을 함유하여도 좋으며, 이들의 종류 및 함유량으로 분체의 기능을 설계할 수 있다. 또한, 그 소수부로서 탄소 원자 수 2~22의 직쇄상 또는 분기 알킬, 콜레스테롤 등의 환상 알킬, 올레일 등 불포화 결합을 포함하는 알킬기, 벤젠 환, 나프탈렌 환, 피렌(pyrene)을 비롯한 탄화 수소계 방향족, 피리딘 환, 이미다졸, 티아졸, 인돌 등의 헤테로계 방향족, 퍼플루오로알킬, 폴리알킬실록산 등의 소수기를 함유하여도 좋으며, 분체의 용도에 따라 선택하고 설계할 수 있다. 합성 폴리머 분체의 소수기의 결합 형태는 에스테르, 에테르, 아미드, 우레탄, 요소 결합 등에 의해 직접 폴리머 주요 체인과 결합되어 있어도 좋으며, 스페이서를 통하여 주쇄와 결합되어 있어도 좋다. 스페이서의 종류로는 친수성의 폴리에틸렌옥사이드, 소수성의 폴리프로필렌옥사이드, 직쇄상 알킬(탄소 원자 수 2~22) 등을 들 수 있다.
본 발명의 개질 분체는 친수성 및 보습성이 뛰어난 분체이다. 생체 적합성을 갖는 분체로서 화장료, 의료용 재료, 크로마토용 충전제, 도료 등과 같이 폭넓은 용도로 응용 가능하다.
"표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 크로마토그래피용 충전제"
본 발명의 표면 개질제에 의해 담체 표면을 개질하여 용이하게 원하는 양의 포스포릴콜린기를 갖는 크로마토그래피용 충전제를 제조할 수 있다.
구체적으로는, 담체 표면에 존재하는 수산기와 식 (5) 및 (6)의 화합물의 Si-OCH3 간 탈수 반응에 의해 포스포릴콜린기를 담체 표면에 도입한다.
식 (5) 및 (6)의 화합물의 메탄올 용액(0.3mmol/mL) 20mL에 증류수 20mL를 부가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 300 옹스트롬, 비표면적 100m2/g의 구상 고순도 실리카겔을 4g 첨가한다. 이 분체 분산액을 오일 배스 내에서 80℃로 환류하고, 5시간 후에 분체를 여과하고, 메탄올로 세정하고, 80℃에서 3시간 동안 감압 건조함으로써 포스포릴콜린기를 표면에 직접 갖는 분체를 용이하게 얻을 수 있다.
반응 용매는 물-메탄올 혼합 용매 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매나, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 톨루엔, 디에틸에테르 등의 비프로톤성 용매를 사용할 수 있고, 이들을 단일 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 담체 표면에 수산기가 존재하지 않는 경우에는, 식 (5) 및 (6)의 화합물을 휘발성 용매에 용해시키고, 그 용액을 물질 표면에 도포, 그 후 용매를 건조시키는 방법이 유효하다. 구체적으로는, 식 (5) 및 (6)의 화합물의 메탄올 용액(0.3mmol/mL)을 물질의 비표면적에 따라 적당량을 직접 물질에 도포한다. 다음, 10℃에서 250℃의 온도 범위에서 메탄올을 기화시킨다. 이 때, 식 (5) 및 (6)의 화합물의 Si-OCH3끼리 탈수 반응을 일으켜 Si-O-Si 결합을 생성하고, 물질 표면을 덮는 것이 가능하다. 이러한 탈수 반응은 이미 알려져 있다. 메탄올의 휘발 시에 이와 같이 생성되는 막은 대부분의 물질 표면에 미량으로 존재하는 수산기와도 군데군데 결합을 발생시키므로 안정성이 양호한 표면 개질을 행할 수 있다. 본 방법은 수산기를 갖지 않는 물질뿐만 아니라, 수산기를 갖는 물질에 대해서도 매우 유효한 표면 개질법이다.
담체 표면에 먼저 아미노기를 도입하고 나서 글리세로포스포릴콜린의 산화적 해열(解裂) 반응에 의해 얻어지는 알데히드체를 함유하는 화합물을 도입시키는 방법과 본 발명의 표면 개질제를 사용하는 방법의 가장 큰 차이점은 물체 표면에서의 미반응 아미노기의 유무이다.
즉, 본 발명에 의한 표면 개질제를 사용한 경우에는, 물질 표면에 미반응 아미노기를 혼재시키지 않고 포스포릴콜린기만을 도입할 수 있다. 먼저 아미노기를 분체 표면에 도입하는 경우에는, 두 번째 단계의 포스포릴콜린기를 도입시키는 반응이 액상 중의 글리세로포스포릴콜린의 알데히드체와 고상 표면의 아미노기가 반응하여야 하므로 확산 율속이나 고상 표면의 입체 구조에 의한 입체 장애, 포스포릴콜린기 자체의 입체성 등으로 인해 반응율이 낮다. 약 30%의 아미노기에밖에 포스포릴콜린기를 도입할 수가 없다. 잔존한 아미노기는 다른 저분자 화합물을 결합시킴으로써 어느 정도 봉쇄하는 것이 가능한데, 물체 표면의 친수성을 유지하기가 어려울뿐만 아니라 모두를 봉쇄할 수는 없다.
또한 물질 표면에 아미노기가 많이 잔존하는 경우, 아미노기는 강한 염기성을 가지고 있기 때문에 주로 산성인 단백질이 현저하게 강한 전기적인 상호 작용을 나타내고, 그 대부분이 흡착되어 버린다. 크로마토그래피용 충전제로 간주한 경우에는 해당 단백질의 회수율의 악화나 피크의 현저한 테일링의 원인이 된다. 또한, 단백질의 흡착은 그 변성을 초래하며, 생체 적합성 소재로 간주한 경우에는 염증의 원인이 되어 바람직하지 못하다.
이에 대하여 본 발명에 의한 표면 개질제는 합성시 아미노기를 갖는 유기 실란 화합물에 대하여 포스포릴콜린의 알데히드 유도체를 과잉으로 첨가하고, 이 둘을 액상 내에서 반응시킨다. 아미노기와 알데히드기의 반응성은 매우 높으며, 알데히드를 과잉으로 첨가한 경우에는 약 100%의 아미노기가 알데히드와 반응한다는 것이 일반적으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명에 의한 표면 개질제에는 미반응 아미노기는 검출되지 않는다. 따라서, 본 발명에 의한 표면 개질제를 사용함으로써 물체 표면에 미반응 아미노기를 혼재시키지 않고 포스포릴콜린기만을 도입할 수 있다. 이에 따라 고상 상에서 2단계의 반응을 행하는 방법보다 생체 적합성이 매우 뛰어나 단백질의 흡착이 적은 분체를 얻을 수 있다.
또한 구상 분체를 액상으로 분산시킴으로써 표면 개질을 하는 경우, 강도가 약한 분체에서는 교반 중에 분체가 붕괴되는 현상이 알려져 있다. 본 방법에서는 하나의 단계로 단시간에 직접 포스포릴콜린기를 분체에 도입하는 것이 가능해지기 때문에, 고상 상에서 2단계의 반응을 행하는 방법보다 분체의 교반 시간이 4분의 1 이하이면 되어 보다 폭넓은 구조, 소재의 분체에 적용하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 세공 직경이 1000 옹스트롬을 초과하는 기계적 강도가 약한 분체에 대해서 도 분체 형상을 해치지 않고 표면 개질을 행할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 담체에는 실리카, 실리카겔, 활성탄, 제올라이트, 알루미나, 점토 광물 등의 무기 다공질체, 다공질의 유기 고분자 수지가 있다. 담체는 분체가 바람직하다. 바람직하게는 구형 또는 파쇄형 다공질 실리카겔이다. 구상 다공질 실리카겔의 평균 입자 직경은 1~200μm, 바람직하게는 1~10μm, 구상 다공질 실리카겔의 세공의 평균 직경이 10~2000 옹스트롬, 바람직하게는 80~1000 옹스트롬이고, 비표면적은 0.01~800m2/g, 바람직하게는 80~600m2/g이다.
본 발명의 크로마토그래피용 충전제를 GFC용 칼럼으로 사용하면 단백질이나 폴리펩타이드의 흡착이 매우 적어 높은 분리 능력을 발휘한다.
즉, 단백질 및 폴리펩타이드의 흡착을 억제하는 데 뛰어난 칼럼 충전제이다. 따라서, 단백질 및 폴리펩타이드를 분자량의 차이에 의해 분리하는 모드(GFC 모드)에 적용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피용 충전제는 포스포릴콜린기가 갖는 쌍전하에 의해 시료의 분자량의 차이뿐만 아니라, 시료가 갖는 미약한 전하의 차이에 기초하여 보다 높은 분리 능력을 갖는 칼럼 충전제이다. 이와 같이 쌍전하를 갖는 작용기가 단백질의 흡착을 억제하기 위하여 도입된 예는 없으며, 본 발명의 표면 처리제에 의해 제조되는 크로마토그래피용 충전제는 지금까지 없는 새로운 GFC용 칼럼 충전제이다. 이 전하를 갖는다는 특징에 의해, 단백질이나 폴리펩타이드를 분자량의 차이 이상으로 그들이 갖는 전하에 따라 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 이 동 상의 pH나 염 농도를 변화시킴으로써 충전제 표면과 단백질이나 폴리펩타이드 간의 상호 작용의 세기를 제어하는 것도 가능하다는 것을 나타내고 있다. 따라서, 이동 상의 pH나 염 농도를 최적화시킴으로써 목적으로 하는 단백질이나 폴리펩타이드를 자유 자재로 유지시킬 수 있다.
GFC 모드는 단백질이나 효소를 실활(失活)시키지 않고 이들을 분리, 정제할 수 있으므로, 알려지지 않은 생체 시료의 단리나 의료 용도라는 측면에서도 본 발명의 칼럼 충전제의 높은 분리 능력이 도움이 될 것으로 기대된다.
본 발명의 크로마토그래피용 충전제는 구체적으로는, 단백질 및 폴리펩타이드의 흡착이 매우 적은 고분리능 칼럼 충전제로서, 예컨대 인간 혈청 내의 단백질의 분리, 또는 단백질을 트립신 소화하여 얻어진 시료에 포함되는 폴리펩타이드의 분리, 또는 생체 내에 포함되는 미지 단백질의 활성 평가에 기초한 분리 및 분취에 뛰어나다.
"표면 개질제로 처리된 필터"
생체 시료 내에 포함되는 단백질 등을 분석하는 경우, 생체 유래의 협잡물을 제거하는 전처리가 필요해진다. 구체적으로는, 혈액 중의 단백질 농도를 측정하는 경우, 단백질이 용해되어 있는 혈청을 얻기 위하여 혈구나 혈소판 등을 여과, 혹은 원심 분리 등을 이용하여 미리 제거할 필요가 있다. 혈액 등의 여과에서는 사용되는 필터에 단백질이 흡착되기 때문에 단백질의 정량성이 저하된다는 문제가 있다. 이 이외에도, 원심력을 이용하여 세공이 빈 막을 통과시키는 2층 구조의 용기가 단백질 시료의 농축이나 탈염, 용매 치환 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 예컨 대 Ultrafree-MC 원심식 필터 유닛(제품명)(NIHON MILLIPORE K.K.)을 들 수 있다. 이러한 필터 유닛은 상부에 농축 전의 시료를 넣고, 하부가 원심 분리기의 외측을 향하도록 설치하고, 5000G 정도의 원심력을 가함으로써 여과를 달성한다. 이러한기구의 여과막에 대해서도 단백질의 회수율이 50% 가까이까지 내려가는 경우가 있어 양호하지 않다는 과제가 있다.
식 (5) 및 (6)의 화합물에 의해 필터 표면을 개질함으로써 단백질의 흡착이 매우 적은 필터를 얻을 수 있다. 식 (5) 및 (6) 중의 Si-OCH3가 필터 표면의 수산기와 탈수 반응을 일으키고 결합함으로써 간편하게 단백질 흡착 억제 능력이 뛰어난 포스포릴콜린기를 도입할 수 있다. 금속제, 유리제, 유리 섬유제 등 사용된 필터의 대부분의 표면이 산화물에 유래하는 수산기를 가지고 있으므로 폭넓은 소재에 대하여 유효하다.
또한, 수산기를 갖지 않는 소재의 경우에는, 식 (5) 및 (6)의 화합물을 휘발성 용매에 용해시키고, 그 용액에 필터 또는 그 소재를 침적하고, 그 후 용매를 건조시켜 세정하는 방법이 유효하다. 구체적으로는, 식 (5) 및 (6)의 화합물의 메탄올 용액(0.3mmol/mL)을 물질의 비표면적에 따른 적당량으로 직접 물질을 담근다. 다음으로, 10℃에서 250℃의 온도 범위에서 메탄올을 기화시킨다. 이 때, 식 (5) 및 (6)의 화합물의 Si-OCH3끼리 탈수 반응을 일으키고, Si-O-Si 결합을 생성하여 물질 표면을 덮는 것이 가능하다. 이러한 탈수 반응은 이미 알려져 있다. 메탄올의 휘발 시에 이와 같이 생성되는 막은 대부분의 물질 표면에 미량으로 존재하는 수산 기와도 군데군데 결합을 발생시키므로 비교적 강인한 표면 개질을 행할 수 있다. 본 방법은 수산기를 갖지 않는 물질뿐만 아니라, 수산기를 갖는 물질에 대해서도 매우 유효한 표면 개질법이다.
필터와 같은 미세공을 갖는 물체를 포스포릴콜린기로 표면 처리하는 경우에는, 이미 공지화된 포스포릴콜린기를 갖는 폴리머로 코팅하기가 어렵다. 폴리머가 미세공을 막아 버려 필터로서의 능력을 저하시키게 되는 것이 주요 원인이다. 식 (5) 및 (6)과 같은 저분자를 사용함으로써 미세공이라는 담체의 구조 특성을 손상시키지 않고 담체 표면을 개질시키는 것이 가능해졌다. 또한, 담체 표면과는 물리 흡착이 아니라 화학 결합을 생성시킬 수 있으므로 내구성이라는 측면에서도 매우 우수하다.
"표면 개질제로 처리된 유리로 된 실험 기구"
유리로 된 실험 기구란 보존 용기, 계량용 기구, 셀, 분취용 칩, 샘플 분취용 시린지(syringe) 등의 실험 기구이다. 본 발명의 표면 개질제를 이용하여 처리한 경우에는 단백질 흡착이 매우 적은 실험 기구를 얻을 수 있다.
실시예
다음, 본 발명을 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않는다.
"합성예 1 포스포릴콜린기를 함유하는 알데히드 화합물"
L-α-글리세로포스포릴콜린(450mg)을 증류수 15ml에 용해하고, 얼음물 욕조 내에서 냉각하였다. 과요오드산 나트륨(750mg)(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.)을 첨가하고, 5시간 동안 교반하였다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조하고, 메탄올에 의해 목적물을 추출하였다. 하기 화합물 (8)에 구조를 나타내었다. 식 (8)의 화합물의 1H NMR 스펙트럼을 도 1에, Mass 스펙트럼을 도 18에 나타내었다.
"실시예 1: 식 (5) 및 (6)의 화합물의 제조"
합성예 1의 화합물 7.5g을 탈수한 메탄올 30mL에 용해시키고, 용기 안을 건조 질소로 치환한다. 다음, 화합물 1의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란(SHIN-ETSU CHEMICAL CO., LTD.)을 3.6g 첨가하였다. 이 혼합 용액을 실온에서 5시간 동안 교반한 후 빙냉하고, 시아노하이드로 붕소화 나트륨(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) 2.5g을 첨가하고, 실온으로 되돌려 16시간 동안 교반하였다. 이 동안에도 반응 용기에는 건조 질소를 계속 흘렸다. 침전을 여과한 후, 목적 물질인 하기식 (10) 및 (11)의 화합물의 메탄올 용액을 얻었다.
"실시예 2: 개질 분체의 제조"
실시예 1에서 제조한 식 (10) 및 (11)의 화합물을 포함하는 메탄올 용액에 증류수 35mL를 부가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 30nm이고 비표면적이 140m2/g인 실리카겔을 14g 더 첨가하였다. 이 분체 분산 용액을 80℃에서 5시간 동안 환류하였다. 환류 후에 메탄올 100mL로 여과 세정하여 목적 물질을 얻었다.
이상의 순서로 실시예 1의 표면 개질제로 처리한 개질 분체의 원소 분석값을 표 1에 나타내었다. 표 안의 C% 또는 N%란 분체에 포함되는 탄소 원소 또는 질소 원소의 질량%를 나타낸다. 이 값으로부터, 실시예 1의 표면 개질제에 의한 처리 후의 분체의 탄소와 질소의 원자 수 비(C/N)는 5.08이 된다. 식 (10) 및 (11)의 표면 개질제의 메톡시기 부위가 모두 결합한 후의 C/N은 5이므로, 표면 개질제가 파괴되지 않고 분체에 도입되었음을 나타내고 있다.
원소 분석값 | ||
C% | N% | |
표면 개질제 처리 전의 분체 | 0.06 | 0.03 |
표면 개질제 처리 후의 분체 | 3.95 | 0.91 |
또한 이러한 실리카겔의 13C-CPMAS 스펙트럼 및 13C-PSTMAS 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. PSTMAS 스펙트럼이란 자유 운동을 하고 있는 분자쇄의 스펙트럼을 선택적으로 얻는 방법으로서, 분체 표면의 수식쇄의 해석에 널리 이용되고 있는 방법이다. 도 2에서는 54.2ppm에서 콜린기의 탄소에 기인하는 스펙트럼이 관측된다.
한편, 도 3에 나타낸 상기 실리카겔의 31P-CPMAS 스펙트럼에서는 대상으로서 측정한 NaH2PO4와 거의 동일한 화학 시프트 값에서 피크가 검출되었으므로, 인산기의 존재를 확인할 수 있다. 도 2에 의해 콜린기의 존재가, 그리고 도 3에 의해 인산기의 존재가 확인되었으므로, 포스포릴콜린기를 담체 실리카겔 표면에 도입할 수 있었다고 생각된다.
또한 도 2에서는, 규소 원자와 포스포릴콜린기 사이에 존재하는 프로필의 탄소에 기인하는 스펙트럼이 9ppm, 23ppm 부근에서 관측되고, 포스포릴콜린 내의 에틸에 유래하는 스펙트럼은 60ppm, 69ppm 부근에서 관측된다. 이와 같은 사실에서, 식 (5) 및 (6)의 구조가 파괴되지 않고 실리카겔에 도입할 수 있었음을 알 수 있다. 또한, 포스포릴콜린기와 프로필트리메톡시실란의 결합 부분은 식 (5)에 나타낸 2차 아민의 것과 식 (6)에 나타낸 아미드 결합의 것이 혼재해 있다.
도 4에 본 실시예에서 합성한 개질 분체의 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다. 1650cm-1 부근에 아미드 결합에 특유한 흡수를 관측할 수 있었다.
"실시예 3: 크로마토그래피용 충전제"
실시예 2에서 제조한 개질 분체를 담체로서 통상의 슬러리법에 의해 내경 4.6mm, 길이 250mm의 빈 칼럼에 충전하였다. 크로마토그램의 취득 조건은 다음과 같다.
이동 상: 50mmol/L 인산 버퍼 + 500mmol/L NaCl pH 6.8
유속: 100μL/min
온도: 25℃
검출: UV 280nm
실시예 3의 칼럼을 본 조건으로 사용한 경우의 교정 곡선을 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 교정 곡선은 측정 범위에서 직선성이 매우 좋다. 단백질의 흡착이 적기 때문에 충전제 표면과 단백질 간의 상호 작용이 매우 작고, 결과적으로 분자량이 큰 분자로부터 빨리 용출하는 GFC 모드에서의 분리가 행해졌음을 알 수 있다. 다음, 상기 조건으로 인간 혈청 단백질을 분리한 결과를 도 6에 나타내었다.
시료로 사용한 것은 컨셀러 N(제품명)을 증류수에 의해 2배 희석한 것으로서, 2μL를 주입하였다. 인간 혈청과 같은 실제 시료에서도 분자량 순의 GFC 모드에서의 분리가 행해졌으며, 실용성이 매우 높다는 사실을 알 수 있다.
"비교예 1"
다음, 시판품인 크로마토그래피용 칼럼(Shodex PROTEIN KW803, SHOWA DENKO K. K 제조)을 시판 상태 그대로 이용하여 인간 혈청 시료(컨셀러 N(제품명)을 증류수로 두 배로 희석하였음) 내의 단백질의 분리를 시도하였다. 비교예에서 든 본 칼럼은 실시예 3에서 설명한 칼럼과 동일한 내경과 길이이다.
이 충전제는 다공성 실리카겔의 표면에 친수성 기를 화학 결합시킨 사이즈 배제 모드용 충전제라고 설명되어 있다. 평균 세공 직경 300 옹스트롬, 평균 입자 직경 5μm로서, 실시예 1에서 설명한 충전제와의 비교에 적합하다. 분자량 1만에서 수 십만의 단백질의 분리에 적합하다고 설명되어 있다.
Shodex PROTEIN KW803은 비해리성의 친수성기를 이용하고 있기 때문에, 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제와 달리 전하를 띤 작용기를 가지고 있지 않다. 따라서 단백질과의 이온적인 상호 작용은 거의 없다고 생각된다.
실시예 3과 동일한 방법으로, 50㎜ol/l 인산 버퍼(Na2HPO4 및 KH2PO4로부터 조제)에 500mmol/l의 염화 나트륨을 부가한 이동 상을 이용하여, 유속을 0.1ml/min, 칼럼 오븐 온도 25℃에서 인간 혈청 시료(컨셀러 N(제품명)을 순수로 두 배로 희석하였음)의 단백질 분리를 시도하였다. 검출은 UV280nm으로 행하였다. 결과를 도 7(b)에 나타내었다.
또한 비교를 위하여, 도 7(a)에는 실시예 3에서 얻은 본원 발명의 표면 개질제를 사용하여 조제한 충전제에서의 동일 조건, 동일 시료에서의 크로마토그램을 나타내었다.
또한 도 8(a)에 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제를 염 농도 150mM로 적용한 경우의 크로마토그램을, 도 8(b)에는 Shodex PROTEIN KW803을 염 농도 150mM로 적용한 경우의 크로마토그램을 나타내었다. 도 8에서의 염 농도 이외의 조건은 도 7과 동일하다.
본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제를 사용한 크로마토그램(도7 (a))에서는, 인간 혈청에서 주요한 단백질인 γ-글로블린과 알부민 이외에 트랜스페린(transferrin)의 피크가 숄더 형태로 확인되고 있는 것이 커다란 특징이다. 피크의 귀속은 단리된 각 단백질의 시판품을 이용하여 행하였다.
이에 대하여 종래의 GFC용 충전제를 사용한 경우에는(도 7(b)), 알부민과 트랜스페린이 전혀 분리되지 않는다. 이는 단리된 시판품의 각 단백질의 용출 시간이 동일하였다는 것에서 확인되었다.
알부민과 트랜스페린의 분자량은 각각 약 69,000과 75,000으로서, 매우 비슷하다. 종래의 GFC용 칼럼에서는 알부민과 트랜스페린과 같은 분자량이 가까운 시료를 분리할 수 없다. 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제는 단백질의 흡착이 매우 적을 뿐만 아니라, 포스포릴콜린기가 갖는 쌍전하에 의해 단백질과 미약한 이온적 상호 작용을 갖기 때문에 분자량이 가까운 단백질에 대해서도 등전점이나 소수성의 차이에 기초하여 분리할 수 있음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 크로마토그래피용 충전제는 GFC 모드에서 분자량의 차이뿐만 아니라 단백질이 갖는 등전점이나 소수성의 차이에 따라 시료를 분리할 수 있음을 알 수 있다.
본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제가 미약한 이온 교환 상호 작용을 가지고 있다는 사실은 이동 상의 염 농도를 내림으로써 확인할 수 있다.
이동 상의 염 농도가 500mM인 도 7(a)에서는 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제에서도 트랜스페린은 알부민의 피크의 숄더로서 인식되는 정도이지만, 이동 상의 염 농도를 150mM로 내린 도 8(a)에서는 트랜스페린과 알부민의 피크가 베이스라인 분리를 달성하고 있다.
또한, 도 8(a)에서는 수 많은 단백질에 의한 피크를 확인할 수 있다. 일반적으로, 충전제 표면과 이동 상 내의 물질 사이에 작용하는 이온 교환 상호 작용은 이동 상의 염 농도가 작아질수록 강해진다는 것이 알려져 있다. 이는 이동 상의 염 농도가 작아짐으로써 이온 교환 상호 작용을 받는 물질은 강하게 유지된다는 것을 의미하고 있다. 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제는 이동 상의 염 농도를 작게 함으로써 특히 알부민에 강한 유지를 발생시키고, 트랜스페린과의 완전 분리를 달성하였다.
도 7, 도 8과 같은 중성 pH 하에서 음으로 대전되어 있는 알부민을 낮은 염 농도로 유지하였으므로, 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제가 음 이온 교환 모드를 가지고 있는 것으로 추정된다.
따라서, 다음으로 락트산, 아세트산, 숙신산, 말론산, 시트르산의 5종류의 유기산을 이용하여, 본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제가 갖는 음이온 교환 능력을 평가하였다. 평가 조건은 다음과 같다. 결과를 도 9에 나타내었다.
칼럼: 4.6×150mm
이동 상: 50mmol/L 인산 버퍼(pH 6.8)
유속: 1000mL/min
검출:UV 210nm
도 9에 의하면, 본원 발명의 표면 개질제에 의해 조제된 충전제는 카르복실산의 수에 따라 각종 유기산을 분리할 수 있었음을 알 수 있다.
구체적으로는, 5종의 카르복실산에 기인하는 각 피크를 귀속하면, 카르복실산을 하나 갖는 유기산 2종이 가장 빨리 용리되고, 다음으로 카르복실산을 2개 갖는 유기산 2종이 용리되고, 마지막으로 카르복실산을 3개 갖는 시트르산이 용리되었다. 카르복실산의 수가 늘어날수록 유지가 커지는 경향이 인정되므로, 이 충전제가 음이온 교환 능력을 가지고 있음은 명확하다. 따라서, 본원 발명의 표면 개질제에 의해 처리된 분체는 음이온 교환용 충전제로서도 매우 유효하다고 할 수 있다. 이상에 나타낸 이온 교환성은 단백질을 흡착, 변성시킬 정도의 세기는 없으며, 양호한 회수율로 유니크한 분리를 하기 위하여 적합하다.
한편, 일반적인 GFC용 칼럼인 Shodex PROTEIN KW803은 도 8(b)에 나타낸 바와 같이, 150mM의 염 농도에서도 트랜스페린과 알부민을 분리할 수 없다.
본원 발명의 표면 개질제를 이용하여 조제한 충전제는 단백질의 흡착을 억제한다는 뛰어난 기능에 의한 GFC 모드(사이즈 배제 모드)에 더하여, 이온 교환 모드도 존재하는 매우 유니크한 충전제이다. 단백질의 흡착이 매우 적으므로 단백질이 변성되지 않고, 효소의 활성을 유지한 상태에서의 단백질의 분리, 정제가 가능하다. 아울러, GFC 모드뿐만 아니라 이온 교환 모드가 혼재하기 때문에, 이동 상의 염 농도나 pH에 따라 분리를 제어할 수 있는 매우 획기적인 충전제이다.
"실시예 4 크로마토그래피용 충전제"
(규소 원자와 포스포릴콜린기 사이에 질소 원자를 두 개 갖는 식 (1) 중 R이 식 (4) p=1로 표시되는 화합물에서의 표면 개질)
합성예 1의 화합물 7.5g을 탈수한 메탄올 30mL에 용해시키고, 용기 안을 건조 질소로 치환한다. 다음, 화합물 1의 메탄올 용액에 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란(SHIN-ETSU CHEMICAL CO., LTD.)을 3.6g 첨가하였다.
이 혼합 용액을 실온에서 5시간 동안 교반한 후 빙냉하고, 시아노하이드로 붕소화 나트륨 2.5g을 첨가하고, 실온으로 되돌려서 16시간 동안 교반하였다. 이 동안에도 반응 용기에는 건조 질소를 계속 흘렸다.
침전을 여과한 후, 목적 물질인 하기식 (12), (13)의 화합물의 메탄올 용액을 얻었다.
식 (12) 및 (13)의 화합물을 포함하는 메탄올 용액에 증류수 35mL을 부가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 30nm이고 비표면적이 140m2/g인 실리카겔을 14g 첨가하였다. 이 분체 분산 용액을 80℃에서 5시간 동안 환류하였다. 환류 후 메탄올 100mL로 여과 세정하여 목적 물질을 얻었다.
도 10(b)에 식 (12) 및 (13)을 도입한 실리카겔을 통상의 슬러리법에 의해 충전하고, 인간 혈청 시료(컨셀러 N(제품명)을 증류수로 2 배로 희석하였음)를 주입하였을 때의 크로마토그램을 나타내었다.
도 10(a)는 실시예 3에서 조제한 분체를 이용한 경우의 크로마토그램이다.
실시예 3과 본 실시예의 차이는 표면 개질제의 스페이서 부분의 2차 아민의 수가 다르다는 것이다. 또한, 도 10(a)와 (b)에서 사용한 실리카겔은 동일한 것이다.
규소 원자와 포스포릴콜린기 사이에 2차 아민을 도 10(a)보다 하나 많이 갖는 도 10(b)에서는 트랜스페린과 알부민의 분리가 더욱 개선되었음을 알 수 있다. 이는 규소 원자와 포스포릴콜린기 사이에 2차 아민이 삽입됨으로써 수식기의 염기성이 증가하고 산성 단백질인 알부민이 보다 강하게 유지되었기 때문으로 생각된다.
이와 같이 본원 발명의 표면 개질제는 포스포릴콜린기에 의한 단백질 흡착 억제 효과에 더하여, 규소 원자와 포스포릴콜린기 사이의 스페이서의 성질을 바꿈으로써 이온 교환성, 소수성, 친수성, 수소 결합성이라는 상호 작용을 부여시키는 것이 가능하다.
"실시예 5: 붕규산 유리 섬유 필터 재료"
<포스포릴콜린기 결합 붕규산 유리 섬유 필터 재료의 조제>
100mL 삼각 플라스크에 증류수 20g, 실시예 1에서 제조한 식 (10) 및 (11)의 화합물(약 0.4mmol)을 포함하는 메탄올 용액 1.OmL를 넣고 흔들어 섞었다. 여기에 WHATMAN JAPAN K.K. 제조 붕규산 유리 섬유 필터(유리 섬유 여과지 그레이드 GF/F, 직경 25mmφ, 1장 당 약 0.070g) 8장을 첨가한 후, 100℃로 가열하고 5시간 동안 환류하며 끓였다. 실온으로 냉각한 후 필터를 여과, 세정하고, 80℃에서 3시간 동안 감압 건조하여 포스포릴콜린기를 표면에 직접 갖는 붕규산 유리 섬유 필터를 얻었다.
<필터 재료의 단백질 흡착 억제 효과 측정>
소 혈청 알부민(BSA) 10mg을 인산 완충액 100mL(TAKARA BIO INC. 제조 PBS 태블릿 1정을 증류수에 용해하고, 전량을 100mL로 한 것. pH 7.4~7.5)에 용해하여 BSA 용액으로 하였다. 폴리프로필렌제 30mL 샘플관 3개에 조제한 BSA 용액을 2.Og씩 덜고, 이 중 하나의 샘플관에 실시예 6에서 조제한 붕규산 유리 섬유 필터를, 다른 하나의 샘플관에 미처리 붕규산 유리 섬유 필터를 넣고 침지시켰다. 이것을 24시간 동안 실온(25℃)에서 방치하고, Lowry법으로 각각 3개의 샘플관 내의 BSA 용액을 발색, 흡광 광도를 분석함으로써 필터 1장 당 BSA 흡착량을 정량 분석하였다(표 2).
본 발명의 붕규산 유리 섬유 필터는 미처리품과 비교하여 BSA 흡착량이 줄었음을 알 수 있었다.
샘플 | BSA 흡착량(μg/장) |
미처리 붕규산 유리 필터 | 37.8 |
PC 처리 붕규산 유리 필터 | 7.8 |
상기 결과로부터, 본 발명은 단백질이나 폴리펩타이드의 흡착이 매우 적은 필터 재료를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 필터 재료는 항체, 효소 등의 분리, 농축이나 혈액 투석, 혈액 필터 등의 혈액 정화, 분석 등의 광범위한 생체 물질의 여과에 유용하다.
"실시예 6: 유리로 된 바이알"
<포스포릴콜린기 결합 유리 바이알의 조제>
100mL 삼각 플라스크에 증류수 20g, 실시예 1에서 제조한 식 (10) 및 (11)의 화합물(약 O.4mmol)을 포함하는 메탄올 용액 1.OmL를 넣고 흔들어 섞었다. 여기에 WATERS JAPAN CORPORATION 제조 유리로 된 바이알인 12×32mm 유리 바이알 스크류식 10개를 첨가한 후, 100℃로 가열하고 5시간 동안 환류하며 끓였다. 실온으로 냉각한 후, 바이알을 메탄올로 세정하고, 80℃에서 3시간 동안 감압 건조하여 포스포릴콜린기를 표면에 직접 갖는 유리 바이알을 얻었다.
이와 같이 본 발명의 표면 개질제에 의해 단백질 흡착이 매우 적은 유리로 된 실험 기구를 얻을 수 있다. 단백질의 흡착을 억제할 수 없는 일반적인 바이알에서는 실험 조작 중에 단백질의 시료 농도가 시간이 경과함에 따라 감소된다는 것이 알려져 있다. 구체적으로는, 보존 용기로부터 액체 고속 크로마토그래피에 시료를 주입하는 경우, 매회 동일 양의 부피를 주입하고 있음에도 불구하고 시간이 경과함에 따라 피크 면적이 감소하는 현상이 알려져 있다. 본 실시예에서 제조한 유리로 된 바이알은 단백질의 흡착 억제가 뛰어나므로 이러한 현상을 회피하는 것이 가능하다.
또한, 고분자를 용기 내면에 흡착시켜 단백질의 흡착을 억제하는 경우에는, 시료에 유기 용매가 포함되면 고분자의 탈착이 일어나 내구성에 문제가 있다는 것이 알려져 있다. 고분자에 의한 표면 피복은 고분자와 폴리프로필렌 용기와 같은 기재 사이의 소수성 상호 작용에 의한 흡착에 의해 실현되고 있다. 시료 용매 내에 유기 용매가 포함되면 고분자와 기재 사이의 소수성 상호 작용이 약해져 고분자가 박리된다. 한편, 본 발명의 표면 개질제(실란 커플링제)는 화학 결합으로 표면 수식을 행할 수 있으므로, 시료 내의 용매의 영향을 실질적으로 받지 않고 효과를 지속할 수 있다.
"실시예 7 : 카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체의 제조"
200ml 플라스크 내에 글리세로포스포릴콜린 5g(19.4mmol), 과요오드산 나트륨 17g(79.7mmol, 4.1eq)(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.), 3염화 루테늄(수화물) 81mg(0.39mmol, O.02moleq)(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.), 및 이온 교환수 70g, 아세토니트릴 30g을 부가한다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후 여과하고, 여과액으로부터 용매를 제거한다. 얻어진 고형물로부터 메탄올로 목적물을 추출, 계속하여 메탄올을 제거함으로써 식 (9)에 나타낸 카르복실기를 갖는 포스포릴콜린 유도체를 얻었다. 식 (9)의 화합물의 1H NMR 스펙트럼을 도 16에, Mass 스펙트럼을 도 17에 나타내었다.
"실시예 8 : 규소 원자와 포스포릴콜린기 사이에 아미드 결합을 갖는 식 (1) 중 R이 식 (3) L=2로 표시되는 유기 실란 화합물(실란 커플링제)"
상기 식 (9)의 화합물 3g(12.4㎜ol)을 탈수한 메탄올 100ml에 용해시키고, 용기 안을 건조 질소로 치환한다. 다음으로, 3-아미노프로필트리메톡시실란 1.1g(6.2mmol), N-하이드록시숙신이미드 1.4g(12.4mmol) 및 N-에틸-N'-3-디메틸아미노프로필카보디이미드 2.4g(12.4mmol)을 첨가하고, -10℃에서 16시간 동안 반응시켜, 하기식 (11)에 나타낸 아미드 결합을 스페이서에 갖고 포스포릴콜린기를 말단에 갖는 유기 실란 화합물 포함하는 용액을 얻었다.
또한 상기 식 (9)에 나타낸 화합물 대신 포스포릴콜린기와 카르복실기 사이에 탄소수 5의 포화 알킬쇄를 갖는 O-포스포릴콜린하이드록시 헥산산을 이용함으로써 동일한 순서에 따라 식 (1) 중 R이 식 (3) L=6으로 표시되는 화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 표면 개질제는 정제를 행하지 않고도 포스포릴콜린기를 기재에 고정화하는 것이 가능하다. 그러나, 예컨대 하기의 방법으로 정제할 수도 있다.
<정제 방법>
얻어진 용액을 감압 농축하고, 이것을 증류수에 용해시킨다. 이 수용액을 시료로 한다. 소수성 상호 작용과 양이온 교환능을 갖는 고속 액체 크로마토그래피용 칼럼인 캡슐 팩 SCX UG80 S-5(사이즈:4.6mmi.d.×250㎜)(SHISEIDO CO., LTD.)를 HPLC 장치에 접속하고, 0.2mmol/L의 인산 완충액(pH 3.5)을 1mL/분의 유속으로 흘려 평형화시킨 후, 시료를 10μL 주입한다. 검출기로서 시차 굴절계를 사용함으로써 크로마토그램을 얻을 수 있고, 목적으로 하는 화합물을 단리할 수 있다.
"실시예 9 : 아미드 결합을 스페이서에 갖고 포스포릴콜린기를 말단에 갖는 유기 실란 화합물에 의해 처리된 개질 분체"
실시예 8에서 제조한 식 (11)의 화합물을 포함하는 용액 30mL(0.25mmol/mL)에 증류수 35mL을 부가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 30nm이고 비표면적이 140m2/g인 실리카겔을 14g 더 첨가하였다. 이 분체 분산 용액을 80℃에서 5시간 동안 환류하였다. 환류 후 메탄올 100mL로 여과 세정하여 목적 물질을 얻었다. 이상의 순서로 얻어진 실시예 8의 표면 개질제로 처리한 개질 분체(처리 전의 탄소 함유량 0.15%)의 탄소 함유량은 2.49%이었다.
"인의 정량에 의한 PC기 도입의 확인"
실시예 9에서 제조한 포스포릴콜린기를 표면에 갖는 개질 분체의 인 원소의 정량을 행하였다. 본 발명의 제조 방법에서 인 원소는 포스포릴콜린기 고유의 원소로서, 분체 표면에 존재하는 인 원소를 정량함으로써 실제로 포스포릴콜린기의 도입을 확인할 수 있다.
인 원소의 정량은 몰리브덴산 발색법에 의해 행하였다. 이하에 정량 방법을 설명한다.
(1) 소정량의 분체를 충분히 세정한 시험관에 재어서 던다.
(2) 1의 분체에 60% 과염소산 수용액(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.)을 3mL 첨가한다.
(3) 액의 휘산을 피하기 위하여 2의 시험관 상부에 냉각관을 부착하고, 120℃에서 1시간 동안, 이어서 180℃에서 2시간 동안 가열한다. 본 조작에서 분체 표면의 수식쇄를 모두 산화시키고, 특히 인 원소는 인산으로서 유리시킨다.
(4) 3의 용액을 원심 분리기에 넣고(3000rpm, 5분), 위에 뜬 것을 1mL 샘플 튜브로 옮긴다.
(5) 4의 용액에 증류수 1mL와 0.5M의 몰리브덴산 나트륨(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) 500μL 및 0.5M의 아스코르브산 500μL를 첨가한다.
(6) 5의 용액을 95℃의 뜨거운 욕조에서 5분간 가열하고, 그 후 냉수로 냉각한다.
(7) 6의 발색 완료된 용액을 96 구멍 플레이트에 200μL 떨어뜨리고, 플레이트 리더로 710nm에서의 발색 강도를 측정한다
(8) 미리 이미 알려진 농도의 인산 용액의 발색 강도로부터 얻은 검량선을 바탕으로 샘플에 포함되는 인 원소의 양을 정량한다. 인산의 표준 용액은 WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.에서 입수할 수 있다.
그 결과, 실시예 9에서 제조한 포스포릴콜린기를 표면에 갖는 개질 분체의 인 원소는 0.13mmol/ggel이었다. 즉, 0.13mmol/ggel의 포스포릴콜린기를 분체 표면에 고정화할 수 있었음을 알 수 있다.
도 11에 본 실시예에서 합성한 개질 분체의 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다.
1650cm-1 부근에 아미드 결합에 특유한 흡수를 관측할 수 있었다.
"실시예 10 : 아미드 결합을 스페이서에 갖고 포스포릴콜린기를 말단에 갖는 표면 개질제(실란 커플링제)에 의해 처리된 액체 크로마토그래피용 충전제"
실시예 9에서 합성한 개질 분체를 담체로서 통상의 슬러리법에 의해 내경 46㎜, 길이 250mm의 빈 칼럼에 충전하였다. 크로마토그램의 취득 조건은 다음과 같다.
이동 상 : 50㎜ol/L 인산 버퍼+500mmol/L NaCl pH 6.9
유속 : 200μL/min
온도 : 25℃
검출 : UV 280nm
먼저, α2 매크로글로블린 0.67mg/mL(분자량 약 800,000, 약호 α2M), γ-글로블린 1.3mg/mL(분자량 약 160,000, 약호 γG), 인간 혈청 알부민 1.7mg/mL(분자량 약 70,000, 약호 HSA), 리소자임 0.3mg/mL(분자량 약 14,000, 약호 LYZ), 우라실 0.017mg/mL(분자량 112, 약호 U)를 혼합한 수용액 시료를 2μL 주입하였을 때의 크로마토그램을 도 12에 나타내었다. α2M, γ-G, HSA, LYZ는 SIGMA-ALDRICH JAPAN K.K.로부터, 우라실은 NACALAI TESQUE, INC.로부터 각각 입수하였다. 5개의 피크가 명확하게 확인되었고, 이들을 시판 단품 시료의 용출 시간으로부터 동정하였더니, 용출 순서가 빠른 순서로 α2M, γG, HSA, LYZ, U이었다. 5개의 피크 이외에 관측된 작은 피크는 시판 표준 샘플에 포함되는 불순물이다. 아미드 결합을 통하여 포스포릴콜린기가 실리카겔 상에 고정화됨으로써 단백질의 흡착이 적기 때문에, 충전제 표면과 단백질 간의 상호 작용이 매우 작고, 결과적으로 분자량이 큰 분자부터 빨리 용출하는 GFC 모드에서의 분리가 이루어졌음을 알 수 있다.
아미드 결합은 친수성이 양호하다. 단백질의 흡착을 억제한다는 관점에서는 물질 표면을 친수성으로, 그리고 비이온성의 작용기로 덮는 것이 바람직하다. 포스포릴콜린기는 쌍성 이온 고유의 매우 뛰어난 친수성과 쌍성 이온의 전하 밸런스의 균형으로부터 실질적인 이온성은 매우 미약하며, 단백질의 흡착 억제가 뛰어난 작용기라고 할 수 있다. 그러나, 포스포릴콜린기를 물질 표면에 고정화시키기 위하여 이용하는 스페이서의 소수성이 높으면 단백질의 비특이적 불가역 흡착을 유발한다. 따라서, 스페이서에 아미드 결합이 존재하는 것은 매우 중요하며, 보다 친수적인 표면 개질을 실현하는 것이다. 이러한 스페이서까지도 포함시킨 친수성이 단백질의 흡착 억제에서 매우 효과적이다.
<베타인 구조의 표면 개질제와의 비교예(선행 기술과의 비교)>
"비교예 2"
포스포릴콜린기와 다른 베타인 구조를 갖는 유기 실란계 표면 개질제에 대하여 일본 특허 공개 평 5-222064호 공보에는 식 (14)에 나타낸 설포베타인을 갖는 실란 화합물이 개시되어 있다. 또한 일본 특허 공개 소 63-295593호 공보에는 식 (15)에 나타낸 카르복시베타인을 갖는 실란 화합물이 개시되어 있다.
식 (14) 및 (15)의 실란 화합물과 실시예 1의 식 (10) 및 (11)의 화합물을 비교하였다.
식 (14) 및 (15)의 화합물의 제조 방법은 해당하는 공지 문헌을 따랐다.
다음, 식 (14)의 화합물 2.Og에 메탄올 20mL와 증류수 20mL를 부가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 30nm이고 비표면적이 140m2/g인 실리카겔을 5.0g 더 첨가하였다. 이 분체 분산 용액을 80℃에서 5시간 동안 환류시키고, 식 (14)에 나타낸 화합물의 실리카겔 상에 고정화하였다. 환류 후 메탄올 50mL로 여과 세정하고, 식 (14)에 나타낸 화합물에 의해 표면 개질된 실리카겔을 얻었다.
식 (15)에 나타낸 화합물에 대해서도 동일한 조작을 행하여, 식 (15)에 나타낸 화합물에 의해 표면 개질된 실리카겔을 얻었다.
계속하여, 얻어진 표면 개질 실리카겔을 각각 통상의 슬러리법에 의해 내경 4.6mm, 길이 250mm의 빈 칼럼에 충전하였다. 크로마토그램의 취득 조건은 다음과 같다.
이동 상 : 50mmol/L 인산 버퍼+500mmol/L NaCl
pH 6.9
유속 : 200μL/min
온도 : 25℃
검출 : UV 280nm
먼저, 실시예 3의 포스포릴콜린기를 표면에 갖는 충전제를 충전한 칼럼에 대하여 α2 매크로글로블린 0.67mg/mL(분자량 약 800,000, 약호 α2M), γ-글로블린 1.3mg/mL(분자량 약 160,000, 약호 γG), 인간 혈청 알부민 1.7mg/mL(분자량 약70,000, 약호 HSA), 리소자임 0.3mg/mL(분자량 약 14,000, 약호 LYZ), 우라실 0.017mg/mL(분자량 112, 약호 U)를 혼합한 수용액 시료를 2μL 주입하였을 때의 크로마토그램을 도 13에 나타내었다. α2M, γ-G, HSA, LYZ는 SIGMA-ALDRICH JAPAN K.K.로부터, 우라실은 NACALAI TESQUE, INC.로부터 각각 입수하였다.
5개의 메인 피크가 명확하게 확인되었으며, 이들을 단품 시료의 용출 시간으로부터 동정하였더니, 용출 순서가 빠른 순으로 α2M, γG, HSA, LYZ, U이었다. 지금까지 설명해 온 바와 같이 분자량이 큰 것부터 용출하는 GFC 모드이다. 5개의 피크 이외에 관측된 작은 피크는 시판되고 있는 표준 단백질에 포함되는 불순물이다.
한편, 식 (14)로 나타낸 설포베타인을 고정화한 충전제를 충전한 칼럼에 대하여 동일한 시료를 주입하였을 때의 크로마토그램을 도 14에 나타내었다. 5종류의 물질 중 인간 혈청 알부민과 우라실밖에 피크가 관측되지 않았고, 특히 리소자임에 대해서는 이 시료 농도에서 용출을 확인할 수 없었다. 설포베타인을 구성하는 4차 암모늄과 설폰산 사이에서 전기적인 중성이 달성되지 않고 끝단에 존재하는 강산인 설폰산에 기인하는 양이온 교환 능력이 발현된 결과, 중성에서 양 전하를 갖는 리소자임과의 사이에 매우 강한 이온 교환 상호 작용이 발생하였기 때문이다.
식 (15)로 나타낸 카르복시베타인을 고정화한 충전제를 충전한 칼럼에 대하여 동일한 시료를 주입하였을 때의 크로마토그램을 도 15에 나타내었다. 5종류의 피크는 설포베타인을 고정화한 칼럼의 경우에 비하여 양호하게 용출되어 있었으며, α2M, γ-글로블린, 리소자임, 우라실, 인간 혈청 알부민의 순으로 용출되었다. 착안해야 할 것은, 중성 이동 상 하에서 음으로 대전되어 있는 인간 혈청 알부민이 특징적으로 유지되어, 저분자인 우라실보다 나중에 용출하였다는 것이다. 이는 카르복시베타인을 구성하는 4차 암모늄과 카르복실기 사이에서 전기적인 중성이 달성되지 않고, 상대적으로 이온성이 강한 4차 암모늄에 의한 강한 음이온 교환성이 발현되었으므로, 중성에서 음 전하를 갖는 인간 혈청 알부민과의 사이에 매우 강한 이온 교환 상호 작용이 발생하였기 때문이다.
이와 같이 일반적으로 잘 알려져 있는 베타인은 이온적으로 완전히 중성이 아니다. 예로 든 설포베타인이나 카르복시베타인과 같은 베타인 구조는 뛰어난 친수성을 가지고 있지만, 지나치게 강한 이온 교환성으로 인해 단백질의 흡착을 유발한다. 그 중에서 포스포릴콜린기는 인산과 4차 암모늄의 전하의 밸런스가 적절하여, 베타인 구조 고유의 매우 뛰어난 친수성과 비이온성이라는 단백질 흡착을 억제하는 기능이 뛰어나다는 것을 알 수 있다.
이상으로부터, 지금까지 보고예가 없는 포스포릴콜린기를 갖는 유기 실란계표면 개질제(실란 커플링제)는 단백질 비흡착을 목적으로 한 물질 표면 개질에 매우 유효하다고 할 수 있다. 본 발명의 표면 개질제를 이용함으로써 단백질의 흡착이 적고 생체 적합성이 뛰어난 표면 개질을 실시할 수 있다.
본 발명의 화합물, 이 화합물로 이루어지는 표면 개질제를 사용하면, 각종 물체의 표면을 한 단계의 매우 간편한 반응에 의해 원하는 임의의 양의 포스포릴콜린기를 부여하는 것이 가능하다. 그 결과, 포스포릴콜린기에 의해 원하는 기능을 갖는 개질 분체, 이 개질 분체를 담체로서 이용한 크로마토그래피용 충전제, 이 표면 개질제에 의해 개질된 필터 및 유리로 된 실험 기구를 용이하게 제조할 수 있다.
더욱 상세하게 말하면, 본 발명에 의하면, 단백질이나 폴리펩타이드의 흡착이 매우 적은 포스포릴콜린기를 간편하면서도 정량적으로 물체 표면의 미세 구조를 손상시키지 않고 도입할 수 있다. 또한 포스포릴콜린기 이외의 미반응 작용기가 도입되지도 않으므로, 생체 적합성이 매우 높은 소재를 제공하는 것이 가능하다.
실리카겔 등의 크로마토그래피용 담체에 적용한 경우에는 매우 뛰어난 GFC용 충전제가 된다. 본 발명의 표면 개질제를 이용하여 합성되는 크로마토그래피용 충전제의 특징은 GFC 모드에 기인하는 분자량의 차이에 의한 분리는 물론, 단백질이나 폴리펩타이드가 갖는 등전점이나 소수성의 차이에 따른 뛰어난 분리능을 갖는다는 것이다.
또한, 이온 교환성이나 소수성은 이동 상의 염 농도나 pH에 따라 조절할 수 있으므로, 단백질에 따른 유니크한 분리를 하는 것이 가능하다. 게다가, 단백질이 분체 표면에 비가역적 흡착을 일으키지 않으므로, 단백질의 변성, 실활을 수반하지 않아 분리, 분취, 분석하는 것이 가능하다.
필터 및 유리로 된 실험 기구를 본 발명의 표면 개질제를 이용하여 처리한 경우에는, 단백질 흡착이 매우 적은 필터 및 유리로 된 실험 기구를 얻을 수 있다.
본 발명의 포스포릴콜린기를 함유하는 신규 화합물은 표면 개질제로서 유용하다. 본 발명의 표면 개질제는 생체 적합성, 보습성, 기타 다양한 유용한 기능을 물체에 부여한다. 본 발명의 표면 개질제에 의해 포스포릴콜린기에 의해 개질되는 개질 분체, 이 개질 분체를 담체로서 이용한 크로마토그래피용 충전제, 이 표면 개질제에 의해 개질된 필터, 이 표면 개질제에 의해 개질된 유리 기구를 용이하게 제조할 수 있다.
Claims (8)
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 포스포릴콜린기 함유 화합물로 이루어지는 표면 개질제.
- 제 3 항에 기재된 표면 개질제로 처리된 개질 분체.
- 제 3 항에 기재된 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 크로마토그래피용 충전제.
- 제 3 항에 기재된 표면 개질제로 처리된 필터.
- 제 3 항에 기재된 표면 개질제로 표면 처리된 유리로 된 실험 기구.
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