KR101603521B1 - 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 매우 우수한 친수성 상호작용을 발현하는 충전제 및 분리 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 하기 식(6) 또는 (7)로 나타내는 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.(식 중, m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3는 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중, 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 것이어도 된다.)
Figure 112010081719607-pct00021

Description

친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제{FILLER FOR HYDROPHILIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제 및 그 충전제를 사용한 분리 방법에 관한 것이다.
또한 상세하게는 충전제 표면에 포스포릴콜린기를 긴밀하게 존재시킴으로써, 우수한 친수성 상호작용을 발현하는 충전제에 관한 발명이다. 본 발명의 충전제에 의해, 극성 화합물을 매우 샤프한 피크 형상과 충분한 유지에 의한 우수한 분리가 가능해진다.
포스포릴콜린기를 가지는 중합체는 생체 적합성 고분자로서 검토되고 있으며, 이 중합체를 각종 기제에 피복시킨 생체 적합성 재료가 개발되어 있다.
예를 들어, 특허문헌 1에는 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린의 단독중합체 및 공중합체로 피복한 분말을 화장료용 분말로서 이용하여 보습성이나 피부밀착성을 개선한 화장료가 개시되어 있다.
또, 특허문헌 2 및 특허문헌 3에는 포스포릴콜린기를 가지는 중합체로 피복한 의료용 재료나 분리제가 개시되어 있다.
상기한 재료는 주로 수산기를 가지는 아크릴계 모노머와 2-클로로-1,3,2-디옥사포스포란-2-옥사이드를 반응시키고, 또한 트리메틸아민에 의해 4급 암모늄으로 함으로써 포스포릴콜린 구조를 가지는 모노머를 합성하여 이것을 중합하여 얻어지는 중합체에 의해 그 표면이 피복된 것이다(중합체의 제조 방법에 관해서는 특허문헌 4 및 5를 참조).
특허문헌 4에는 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린과 메타크릴산에스테르의 공중합체가 제조되고, 특허문헌 5에는 2-메타크로일옥시에틸포스포릴콜린의 단독중합체가 제조되고 있다.
이상에 나타낸 생체 적합성은 포스포릴콜린이 세포막의 최외면을 구성하고 있는 것에 주목한 성질인데, 일반적으로 생체 적합성을 획득함에 있어서 중요한 물리화학적인 요소의 하나가 친수성이다. 포스포릴콜린기도 높은 친수성을 가지고 있는 것은 비특허문헌 1에도 기재되어 있다. 덧붙여서 포스포릴콜린기는 쌍성 이온 구조이면서 전기적으로 중성인 것도 중요한 점이다.
한편, 친수성의 상호작용을 활용한 크로마토그래피가 최근 생물학 및 의약분야에 있어서 급속히 그 중요성을 더해가고 있다. 친수성 상호작용 크로마토그래피는 이동상으로 유기용매를 많이 사용했을 때에 생기는 친수성 물질끼리의 상호작용에 의해 물질을 분리하는 수법이다. 이 친수성 상호작용 크로마토그래피는 가장 범용적으로 사용되고 있는 소수성 상호작용 크로마토그래피와는 정반대의 상호작용을 이용한 것이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피는 충전제 표면에 존재하는 옥타데실기(C18기)로 대표되는 것 같은 소수성 관능기와, 분석 대상 물질의 소수성끼리의 상호작용의 강약에 의해 분리를 달성한다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 예를 들어 소수성 물질끼리의 미약한 차를 인식하여 잘 분리하지만, 친수성 물질끼리의 분리 능력이 매우 약하여, 이들의 분석에는 적합하지 않다.
이와는 반대로, 충전제에 친수성 관능기를 수식하고, 분석 대상 물질의 미약한 친수성의 차를 인식하여 분리하는 방법이 친수성 상호작용 크로마토그래피이다.
물이 풍부한 생체내에 있어서, 친수성 화합물은 다양한 형태로 중요한 생리기능을 담당하고 있다. 예를 들어, 당류, DNA 등을 구성하는 핵산염기, 단백질을 구성하는 아미노산, 수용성의 비타민, 호르몬류는 친수성이 높기 때문에 일반적인 소수성 상호작용 컬럼에서의 분석이 매우 곤란했다.
친수성 물질의 분석에 적합한 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제에는 몇가지 실용화된 것이 존재한다. 가장 단순한 충전제로서는 실리카겔 그 자체를 충전한 컬럼이다. 예를 들어 워터즈 코퍼레이션으로부터 Atrantis Hilic Silica로서 시판되고 있다. 이와 같은 충전제는 실리카겔 그 자체가 가지는 친수성을 이용하는 것이다.
그러나, 물을 포함하는 이동상을 장시간 사용함으로써 실리카겔이 서서히 용해되는 문제가 있다. 덧붙여서, 널리 알려져 있는 실라놀이 전리하여 부전하를 띰으로써 정전하를 가지는 분석 대상 물질의 피크 형상이 무너지고 흡착한다는 문제가 거론되고 있다.
실리카겔의 용해를 막기 위해서, 친수성의 관능기를 가지는 실란커플링제로 수식을 행한 충전제도 존재한다. 예를 들어 니혼다이오넥스 가부시키가이샤로부터는 친수성의 관능기로서 디올기(2개의 수산기를 가지는 관능기)를 실리카겔에 고정화한 충전제가 발매되어 있다. 또, 도소 가부시키가이샤로부터는 카르바모일기를 친수성 관능기로서 가지는 컬럼이 발매되어 있다. 이들 2개의 친수성 관능기는 앞선 실리카겔 그 자체를 사용하는 것을 포함하여 친수성 상호작용 컬럼으로서 널리 인지되어, 많은 분석이 행해지고 있다.
또, 특허문헌 6 및 7에는 베타인 구조(즉 쌍성 이온 구조)를 가지는 유기실란계 표면 개질제(즉 실란커플링제)가 개시되어 있다. 특허문헌 6에서는 디메틸아미노알킬실란을 유기용매중 1,3-프로판술톤과 반응시킴으로써, 4급 암모늄의 정전하와 술폰산의 부전하로 이루어지는 술포베타인을 가지는 실란커플링제를 얻을 수 있다고 되어 있다.
특허문헌 7에서는 4급 암모늄과 카르복실기로 이루어지는 카르복시베타인을 가지는 실란커플링제의 제조 방법이 기재되어 있다. 이들 실란커플링제에 의해 실리카겔 표면을 친수적으로 개질하는 것이 가능하다. 그러나, 이들 구조의 베타인에서는 물질 표면에 친수성을 부여할 수 있어도, 베타인중의 정전하와 부전하의 강도에 편차가 있기 때문에 전기적으로 중성이 되지는 않는다. 예를 들어, 술포베타인에서는 술폰산의 강산성에 의해 부전하를 띠고, 카르복시베타인에서는 4급 암모늄에 의한 정전하의 성질이 나타난다.
따라서, 이러한 베타인 구조에서는 친수성 상호작용 뿐만 아니라 이온 교환 상호작용이 동시에 나타나는 점에서, 이온성 화합물의 흡착이나 피크 형상의 혼란이 생긴다.
한편, 포스포릴콜린기는 전기적으로 중성의 베타인 관능기이다. 비특허문헌 1에는 담체상에 화학적으로 그래프트된 포스포릴콜린기에 의해 단백질의 흡착이 감소되는 것이 기재되어 있다. 또 비특허문헌 2에는 마찬가지로 그래프트 중합에 의해 표면 수식된 포스포릴콜린기에 의한 친수성 상호작용 크로마토그래피가 나타나 있다.
그러나, 상기 비특허문헌 1에 있어서 검토된 포스포릴콜린기 수식 충전제는 이온 교환성으로 생각되는 상호작용이 인정된다고 되어 있다. 본래 전기적으로 중성일 포스포릴콜린기에 의해 수식된 충전제가 이온 교환성을 나타나는 이유로서, 그래프트 중합과 같은 중합체에 의한 수식에서는 실리카 표면을 덮기에 불충분한 것을 들 수 있고, 그 결과, 실리카겔 유래의 전하가 분리에 영향을 준 것으로 생각된다.
이상으로부터, 종래의 당업자의 기술상식은 포스포릴콜린기에 의해 수식된 충전제는 대체로 친수성 상호작용 컬럼에는 사용할 수 없다는 것이었다.
한편, 그래프트 중합에 의해, 매우 입체 장애성이 높은 포스포릴콜린기를 정량적으로 높은 밀도로 충전제가 되는 담체 표면에 수식시키는 것은 매우 곤란하기도 했다.
특허문헌 8에는 포스포릴콜린기로 담체 표면을 수식한 크로마토그래피용 충전제가 기재되어 있다.
그러나, 특허문헌 8에 기재된 크로마토그래피용 충전제는 주로 사이즈 배제 모드의 크로마토그래피에 응용하는 것으로서, 이것을 친수성 상호작용에 의한 극성 화합물 분리를 위한 충전제로서 사용한다는 발상은 대체로 당업자에게 존재하지 않았다.
일본 특허 공개 평7-118123호 공보 일본 특허 공개 2000-279512호 공보 일본 특허 공개 2002-98676호 공보 일본 특허 공개 평9-3132호 공보 일본 특허 공개 평10-298240호 공보 일본 특허 공개 평5-222064호 공보 일본 특허 공개 소63-295593호 공보 일본 특허 공개 2005-187456호 공보
Water in Biomaterials Surface Science. Edited by M. Morra.(2001 John Wiley & Sons, Ltd.) Tohru Ikegami등, J.Chrom.A, 2008, 1184, 474-503
포스포릴콜린기를 가지는 중합체에 의해 물체의 표면을 피복하여 개질하는 방법에서는, 복잡한 세공 구조를 가지는 실리카겔 표면 전체를 균일하게 피복하는 것은 어려우며, 세공의 미세 구조와 같은 담체의 기본적 성질이 상실되는 경우마저 있다.
이것은 비특허문헌 2에 있어서, 그래프트 중합에 의해 도입한 포스포릴콜린기 수식 실리카를 충전한 컬럼에서는 피크의 샤프함을 나타내는 이론단수가 낮은 것에 깊게 관련된다.
또, 디올이나 카르바모일기와 같은 저분자의 실란커플링제에 의해 친수성의 수식을 행하는 경우에도, 실리카겔의 실라놀기의 부전하에 의한 이온 교환성이나, 수식쇄의 소수성 부위에 의한 친수성의 저하가 과제이다.
이와 같이, 현상황의 친수성 상호작용 크로마토그래피용에 있어서는 일부의 친수성 화합물 피크의 이론단수의 저하나, 이동상중의 염농도에 의해 유지 시간이 크게 변동한다는 과제가 있다.
발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 행했다. 그리고, 비특허문헌 1과 같이 그래프트 중합 등의 중합체가 아닌 포스포릴콜린기를 직접 화학적으로 담체 표면에 결합시킨 충전제에 의해(즉 특허문헌 8에 기재된 충전제를 사용하여), 극성 화합물의 분리를 행해 보면, 놀랍게도 충전제의 이온 교환성이 억제되고, 매우 우수한 친수성 상호작용을 발현하여, 매우 샤프한 피크 형상과 충분한 유지에 의한 우수한 분리가 가능하게 되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 하기 식(1)로 나타내는 포스포릴콜린기가 담체 표면에 직접적으로 화학 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
Figure 112010081719607-pct00001
또, 본 발명은, 하기 식(2)로 나타내는 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
Figure 112010081719607-pct00002
식 중, m은 2~6, n은 1~4이다.
X1, X2, X3는 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중, 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 것이어도 된다.
R은 하기 식(3)~(5) 중의 구조의 어느 하나이다(단, 하기 식(3)~(5)에 있어서, 식(2)의 화합물을 A-R-B로 나타낸다).
Figure 112010081719607-pct00003
Figure 112010081719607-pct00004
Figure 112010081719607-pct00005
식(3)~(5) 중, L은 1~6, P는 1~3을 나타낸다.
또한, 본 발명은, 하기 식(6) 또는 (7)로 나타내는 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지는 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
Figure 112010081719607-pct00006
Figure 112010081719607-pct00007
식 중, m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3는 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중, 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 것이어도 된다.
또, 본 발명은, 상기 담체가 실리카인 것을 특징으로 하는 상기한 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 상기 실리카가 구상 또는 파쇄형이며, 그 평균 입경이 1~200μm인 것을 특징으로 하는 상기한 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
또, 본 발명은, 상기 실리카가 다공성이며, 그 세공의 평균 직경이 10~2000옹스트롬인 것을 특징으로 하는 상기한 크로마토그래피용 충전제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 수용성 유기용매를 50% 이상 포함하는 수용액을 이동상으로서 사용하여, 상기한 크로마토그래피용 충전제가 충전된 컬럼에 의해, 고극성 물질을 포함하는 물질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
또, 본 발명은, 물을 포함하지 않는 유기용매를 이동상으로서 사용하여, 상기한 크로마토그래피용 충전제가 충전된 컬럼에, 고극성 물질을 포함하는 물질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 충전제를 사용하면, 극성 화합물(구체적으로는 당류, 핵산염기류, 아미노산류, 비타민류, 호르몬류, 친수성약제, 펩티드 등)의 친수성 상호작용에 의해, 기존의 충전제에 비해 매우 샤프한 피크 형상과 충분한 유지에 의한 우수한 분리를 행할 수 있다.
더욱 상세하게는 본 발명의 충전제는 비특허문헌 2의 충전제에 비해 포스포릴콜린기를 정량적이고 또한 고밀도로 물체 표면의 미세 구조를 손상시키지 않고 도입할 수 있고, 또 포스포릴콜린기 이외의 미반응 관능기가 도입되는 일도 없다.
그리고, 충전제에 실리카를 사용한 경우는 포스포릴콜린기는 일반적인 친수성 관능기(디올기나 카르바모일기)에 비해 부피가 크기 때문에, 부로 대전한 실리카겔 표면에 분석 대상 물질이 상호작용하는 것을 막을 수 있다는 이점을 가진다. 덧붙여서, 동일 정도로 부피가 큰 포스포릴콜린기 이외의 쌍성 이온(술폰산-4급 암모늄형이나 카르복실산-4급 암모늄형)과 같이 전하를 가지지 않는다.
따라서, 포스포릴콜린기는 친수성 이외의 상호작용이 매우 억제된 충전제를 제공하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서는, 피크 형상의 악화(테일링)나 미량 이온성 물질의 흡착에 의한 분석 감도의 저하를 막는 것이 가능하게 되고, 매우 우수한 극성 화합물의 분리가 가능하게 되었다.
도 1은 식(9)의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 식(9)의 화합물의 Mass 스펙트럼이다.
도 3은 식(10)의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 식(10)의 화합물의 Mass 스펙트럼이다.
도 5는 실시예 1의 충전제의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 6은 식(11)의 화합물의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 7은 실시예 1의 충전제의 크로마토그램이다.
도 8은 실시예 1과 비교예 1의 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 9는 실시예 1과 비교예 2의 충전제에 의한 크로마토그램이다.
도 10은 실시예 1과 비교예 2의 충전제에 의한 크로마토그램이다.
「표면 개질제와, 그것에 의해 담체 표면을 처리함으로써 제조되는 본 발명의 충전제」
<표면 개질제>
하기 식(8)에 나타낸 포스포릴콜린 유도체를 증류수에 용해시킨다. 하기 식(8)의 포스포릴콜린 유도체는 공지의 화합물이며 시판품을 입수할 수 있다.
Figure 112010081719607-pct00008
식(8)의 화합물의 수용액을 빙수욕중에서 냉각하고, 과요오드산나트륨을 첨가하여 5시간 교반했다. 반응액을 감압 농축, 감압 건조시키고, 메탄올에 의해 하기 식(9)에 나타내는 알데히드기를 가지는 포스포릴콜린 유도체를 추출한다. 구조식 및 NMR 스펙트럼을 도 1에, Mass 스펙트럼을 도 2에 나타낸다.
Figure 112010081719607-pct00009
다음에, 식(9)의 메탄올 용액에 3-아미노프로필트리메톡시실란을 0.5당량 첨가한다. 이 혼합용액을 실온에서 소정 시간 교반한 후, 빙냉하고, 시아노히드로붕소화나트륨을 적량 첨가하고, 실온으로 되돌려서 16시간 교반한다. 이 동안에도 반응용기에는 건조 질소를 계속 흘린다. 침전을 여과한 후, 식(6) 및/또는 식(7)의 메탄올 용액을 얻는다.
다음에, 이들 화합물의 정제 방법에 대해서 설명한다. 본 발명의 화합물의 정제 방법은 이하에 한정되는 것은 아니다.
얻어진 메탄올 용액을 감압 농축하고, 잔류물을 증류수에 용해시킨다. 이 수용액을 시료로 한다. 소수성 상호작용과 카티온 교환능을 가지는 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼인 캡슐팩 SCX UG80 S-5(사이즈:4.6mm i.d.×250mm)(가부시키가이샤 시세이도)를 HPLC 장치에 접속하고, 0.2mmol/L의 인산 완충액(pH3.5)을 1mL/분의 유속으로 흘려서 평형화시킨 후에, 시료를 10μL 주입한다. 검출기로서 시차 굴절계를 사용함으로써 크로마토그램을 얻을 수 있으며, 목적으로 하는 화합물을 단리할 수 있다.
단, 이들 화합물은 정제전의 메탄올 용액의 단계에서, 실리카를 비롯한 담체의 표면 수식에 그대로 사용하는 것이 가능하다.
상기한 순서는 식(6) 또는 (7)에 나타낸 화합물중의 m, n이 바뀌어도 마찬가지로 행할 수 있다. 여기서 나타낸 순서는 m=3, n=2인 경우이다. 또한 아미노기를 가지는 실란 화합물로서 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란 등을 사용함으로써 실란 부위와 포스포릴콜린기 사이에 ２급 아민을 삽입하는 것도 가능하며, 이것에 대해서도 상기와 마찬가지의 순서로 행할 수 있다. 반응 용매는 특별히 한정되지 않고, 상기 서술한 메탄올 이외에도 물이나, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 알코올, N,N-디메틸포름아미드나 디메틸술폭시드 등의 비프로톤성 용매를 사용할 수 있다. 단, 반응중의 유기 실란 화합물의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하다.
또, 식(6) 또는 (7) 중의 메톡시기(OCH3)가 에톡시기(OC2H5)인 경우에는 메탄올을 에탄올로 바꾸어서 반응을 행하고, Cl의 경우는 디메틸포름아미드나 디메틸술폭시드로 변경한다.
또한, Si와 결합하는 메톡시기 또는 에톡시기 또는 Cl 중, 2개 또는 1개가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 하나로 치환되어 있는 경우도 상기한 수법과 마찬가지로 제조할 수 있다.
식(7) 기재의 화합물은 카르복실기를 가지는 포스포릴콜린 유도체를 사용하여 제조할 수도 있다.
글리세로포스포릴콜린, 과요오드산나트륨, 3염화 루테늄(수화물)을 아세토니트릴 수용액에 가한다. 실온에서 교반한 후, 여과하여, 여액으로부터 용매를 제거한다. 얻어진 고형물로부터 메탄올로 목적물을 추출하고, 계속해서 메탄올을 증류제거함으로써 하기 식(10)에 나타내는 카르복실기를 가지는 포스포릴콜린 유도체를 얻는다. 구조식 및 NMR 스펙트럼을 도 3에, Mass 스펙트럼을 도 4에 나타낸다.
또한, 반응 용매는 물이라도 가능하고, 또, 과요오드산 이외에도 다른 과요오드산염이나 과요오드산 등을 사용하는 것도 가능하며, 3염화 루테늄 이외에도 다른 2가 및/또는 3가의 루테늄 화합물이나 그들의 수화물 등을 사용하는 것도 가능하다.
Figure 112010081719607-pct00010
다음에, 식(10)에 나타낸 화합물의 메탄올 용액에, 3-아미노프로필트리메톡시실란을 0.5등량, 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)와 N-에틸-N'-3-디아미노프로필카르보디이미드(EDC)를 각각 1등량 첨가한다. 이 혼합 용액을 실온에서 3시간 교반함으로써 식(7)에 나타내는 화합물을 얻는다.
또한, 반응 용매는 N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 클로로포름 등 메탄올 이외에도 가능하고, 또 NHS, EDC 이외에도 디시클로카르보디이미드(DCC), 카르복시디이미다졸(CDI) 등을 사용하는 것도 가능하다.
상기한 순서는 식(7)에 나타낸 화합물중의 m, n이 바뀌어도 완전히 마찬가지로 행할 수 있다. 여기서 나타낸 순서는 m=3, n=2인 경우이다. 단, 반응중의 유기 실란 화합물의 중합을 막기 위해서는 탈수 용매가 바람직하다.
또, 식(7) 중의 메톡시기(OCH3)가 에톡시기(OC2H5)인 경우에는 메탄올을 에탄올로 바꾸어서 반응을 행하고, Cl의 경우는 디메틸포름아미드나 디메틸술폭시드로 변경한다.
또한, Si와 결합하는 메톡시기 또는 에톡시기 또는 Cl 중, 2개 또는 1개가 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 하나로 치환되어 있는 경우도 상기한 수법과 완전히 마찬가지로 제조할 수 있다.
<친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제의 제조>
상기 서술한 표면 개질제에 의해, 담체 표면을 개질하여, 용이하게 원하는 양의 포스포릴콜린기를 가지는 본 발명의 크로마토그래피용 충전제를 제조할 수 있다.
구체적으로는 담체 표면에 존재하는 수산기와, 식(6) 또는 (7)의 화합물의 Si-OCH3의 탈수 반응에 의해 포스포릴콜린기를 담체 표면에 도입한다.
식(6) 또는 (7)의 화합물의 메탄올 용액(0.3mmol/mL) 20mL에 증류수 20mL를 가하고, 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 300옹스트롬, 비표면적 100m2/g의 구상 고순도 실리카겔을 4g 첨가한다. 이 분체 분산액을 오일배스중 80℃에서 환류하고, 5시간후에 분체를 여과하여, 메탄올로 세정하고, 80℃에서 3시간 감압 건조함으로써 포스포릴콜린기를 표면에 직접 가지는 분체를 용이하게 얻을 수 있다.
반응 용매는 물-메탄올 혼합 용매 이외에도 물, 에탄올, 2-프로판올 등의 프로톤성 용매나, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 톨루엔, 디에틸에테르 등의 비프로톤성 용매를 사용할 수 있고, 이들을 단일 또는 조합시켜서 사용할 수 있다.
또한, 담체 표면에 수산기가 존재하지 않는 경우는, 식(6) 또는 (7)의 화합물을 휘발성 용매에 용해시켜, 그 용액을 물질 표면에 도포, 그 후 용매를 건조시키는 방법이 유효하다. 구체적으로는, 식(6) 또는 (7)의 화합물의 메탄올 용액(0.3mmol/mL)을 물질의 비표면적에 따라서 적량을 직접 물질에 도포한다. 다음에 10℃ 내지 250℃의 온도 범위에서 메탄올을 기화시킨다. 이 때, 식(6) 또는 (7)의 화합물의 Si-OCH3끼리가 탈수 반응을 일으켜, Si-O-Si 결합을 생성하고, 물질 표면을 덮는 것이 가능하다. 이 탈수 반응은 공지이다. 메탄올의 휘발시에 이와 같이 생성되는 막은 대부분의 물질 표면에 미량으로 존재하는 수산기와도 여기저기서 결합을 발생시키기 때문에 안정성이 양호한 표면 개질을 행할 수 있다.
본법은 수산기를 가지지 않는 담체 뿐만 아니라, 수산기를 가지는 담체에 대해서도 매우 유효하다.
담체 표면에 먼저 아미노기를 도입하고 나서, 글리세로포스포릴콜린의 산화적 해열(解裂) 반응에 의해 얻어지는 알데히드체를 함유하는 화합물을 도입시키는 방법과, 상기 방법과의 최대의 상이점은 물체 표면에 있어서의 미반응의 아미노기의 유무이다.
즉, 상기 방법은 담체 표면에 미반응의 아미노기를 혼재시키지 않고 포스포릴콜린기만을 도입할 수 있다. 먼저 아미노기를 분체 표면에 도입하는 경우는 2단계째의 포스포릴콜린기를 도입시키는 반응이, 액상중의 글리세로포스포릴콜린의 알데히드체와 고상 표면의 아미노기가 반응해야하기 때문에 확산율속이나 고상 표면의 입체 구조에 의한 입체 장애, 포스포릴콜린기 자체의 입체성 등에 의해 반응률이 낮다. 그 때문에, 약30%의 아미노기에만 포스포릴콜린기를 도입할 수 있다. 잔존한 아미노기는 별도의 저분자 화합물을 결합시킴으로써 어느정도 봉쇄하는 것이 가능하지만, 담체 표면의 친수성을 유지하는 것이 곤란할 뿐만 아니라, 그 전부를 봉쇄할 수는 없다.
또, 담체 표면에 아미노기가 많이 잔존하는 경우, 아미노기는 강한 염기성을 가지고 있기 때문에, 주로 산성의 화합물과 현저하게 강한 전기적인 상호작용을 나타내고, 그 대부분이 흡착해버린다. 크로마토그래피용 충전제로서 파악된 경우는 당해 화합물의 회수율 및 검출 감도의 악화나, 피크 형상의 현저한 테일링의 원인이 된다.
본 발명에서 사용하는 담체에는 실리카, 실리카겔, 활성탄, 제올라이트, 알루미나, 점토 광물 등의 무기 다공질체, 다공질의 유기 고분자 수지가 있다. 담체는 분체가 바람직하다. 바람직하게는 구형 또는 파쇄형 다공질 실리카겔이다. 구상 실리카의 평균 입경은 1~200μm, 바람직하게는 1~10μm, 다공질 실리카의 세공의 평균 직경이 10~2000옹스트롬, 바람직하게는 50~1000옹스트롬이며, 비표면적은 0.01~800m2/g이다.
본 발명의 크로마토그래피용 충전제가 충전된 컬럼에 있어서는, 수용성 유기용매를 50% 이상 포함하는 수용액을 이동상으로서 사용함으로써, 고극성 물질을 포함하는 물질을 친수성 상호작용에 의해 분리할 수 있다.
수용성 유기용매는 예를 들어 아세토니트릴, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드 및 메탄올 등의 지방족 알코올과 같은 일반적으로 액체 고속 크로마토그래피에서 사용되는 용매이다. 이들 복수를 임의의 비율로 혼합하여 사용하면 된다.
당연히 액체고속 크로마토그래피용 이동상으로 사용되는 일반적인 염, pH 조정제, pH 완충제, 분리 조정제와 같은 첨가제를 사용하면 된다.
또, 본 발명의 크로마토그래피용 충전제가 충전된 컬럼에 있어서는, 물을 포함하지 않는 유기용매를 이동상으로서 사용함으로써, 고극성 물질을 포함하는 물질을 친수성 상호작용에 의해 분리할 수 있다.
유기용매는 예를 들어 아세토니트릴, 디메틸술폭시드, 디메틸포름아미드, 메탄올 등의 지방족 알코올, 시클로헥산올과 같은 환상 알코올, 시클로헥산, 톨루엔, 크실렌, 벤젠과 같은 일반적으로 액체 고속 크로마토그래피에서 사용되는 용매이며, 이들 복수를 임의의 비율로 혼합하여 사용하면 된다.
당연히 액체 고속 크로마토그래피용 이동상으로 사용되는 일반적인 염, pH 조정제, pH 완충제, 분리 조정제와 같은 첨가제를 사용하면 된다.
본 발명의 충전제 및 분석 조건을 사용하면, 극성 화합물, 특히 당류, 핵산염기류, 아미노산류, 비타민류, 호르몬류, 친수성 약제, 펩티드 등의 친수성 상호작용에 의해, 기존의 분리 기술에 비해 매우 샤프한 피크 형상과 충분한 유지에 의한 우수한 분리를 행할 수 있다.
(실시예)
이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
「실시예 1 : 아미드 결합을 스페이서에 가지고, 포스포릴콜린기를 말단에 가지는 유기 실란 화합물에 의해 처리된 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제」
200ml 플라스크내에 글리세로포스포릴콜린 5g(19.4mmol), 과요오드산나트륨17g(79.7mmol, 4.1eq)(와코준야쿠코교 가부시키가이샤), 3염화 루테늄(수화물) 81mg(0.39mmol, 0.02moleq)(와코준야쿠코교 가부시키가이샤), 및 이온 교환수 70g, 아세토니트릴 30g을 가한다. 실온에서 2시간 교반한 후, 여과하여, 여액으로부터 용매를 제거한다. 얻어진 고형물로부터 메탄올로 목적물을 추출하고, 계속해서 메탄올을 제거함으로써 식(10)에 나타내는 카르복실기를 가지는 포스포릴콜린 유도체를 얻었다. 식(10)의 화합물의 NMR 스펙트럼을 도 3에, Mass 스펙트럼을 도 4에 나타낸다.
Figure 112010081719607-pct00011
상기 식(10)의 화합물 3g(12.4mmol)을 탈수한 메탄올에 100ml에 용해시키고, 용기내를 건조 질소로 치환한다. 다음에, 3-아미노프로필트리메톡시실란 1.1g(6.2mmol), N-히드록시숙신이미드 1.4g(12.4mmol) 및 N-에틸-N'-3-디메틸아미노프로필카르보디이미드 2.4g(12.4mmol)을 첨가하고, -10℃에서 16시간 반응시켜, 하기 식(11)에 나타내는 아미드 결합을 스페이서에 가지고, 포스포릴콜린기를 말단에 가지는 유기 실란 화합물을 포함하는 용액을 얻었다. 도 6에 식(11)에 나타내는 화합물의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
Figure 112010081719607-pct00012
Figure 112010081719607-pct00013
또, 상기 식(10)에 나타낸 화합물 대신에, 포스포릴콜린기와 카르복실기 사이에 탄소수 5의 포화 알킬쇄를 가지는 O-포스포릴콜린히드록시헥산산을 사용하면, 마찬가지의 순서에 의해, 식(2) 중, m=3, n=2, R이 식(4) L=5로 나타내는 화합물이 얻어진다.
식(11)의 화합물을 포함하는 용액 30mL(0.25mmol/mL)에 증류수 35mL를 가하고, 또한 평균 입자 직경 5μm, 평균 세공 직경 10nm이며 비표면적이 350m2/g의 실리카겔을 14g 첨가했다. 이 분체 분산 용액을 80℃에서 5h 환류했다. 환류후 메탄올 100mL로 여과 세정하여 목적으로 하는 충전제를 얻었다. 이상의 순서로 얻어진 충전제의 질소 함유량은 0.32mmol/g이었다. 수식기 1mol에 대해서, 질소원자가 2mol 존재하는 점에서, 본 방법에 의해 0.16mmol/g의 수식기를 실리카겔에 도입할 수 있었다.
도 5에 본 실시예에서 제조한 충전제의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
1650cm-1 부근에 아미드 결합에 특유의 흡수를 관측할 수 있었다.
실시예 1에서 제조한 충전제를 통상의 슬러리법에 의해 내경 4.6mm, 길이 250mm의 엠프티 컬럼에 충전했다. 크로마토그램의 취득 조건은 다음과 같다.
이동상 : 10mmol/L HCOONH4, CH3CN/H2O=90/10(pH=7.19)
유속 : 1.0mL/min
온도 : 40℃
검출 : UV 254nm
도 7에 본 발명의 크로마토그래피용 충전제를 충전한 컬럼으로 핵산 염기 화합물 3종과 나프탈렌을 분석한 결과를 나타낸다. 일반적인 역상 컬럼에서는 소수성이 높은 나프탈렌의 유지가 가장 커지지만, 본 발명의 충전제에서는 나프탈렌의 유지가 가장 작고, 나프탈렌보다 친수성이 높은 극성 화합물의 핵산 염기 3종이 보다 유지되고 있는 것을 알 수 있다. 친수성 상호작용 크로마토그래피에서는 친수성의 화합물을, 역상 크로마토그래피에서는 소수성의 화합물을 각각 크게 유지하는 점에서, 본 발명의 충전제는 친수성 상호작용에 의해 분리를 달성하고 있는 것을 알 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 친수성이 높은 핵산 염기 3종끼리도 매우 양호하게 분리되어 있다. 피크의 대칭성을 나타내는 시메트리 계수(시메트리 계수=1에서 피크가 완전히 대칭, 1 이상에서 테일링(피크 후반이 꼬리 모양으로 끌림)인 것을 나타냄)도 1에 가까워, 매우 양호한 분리가 행해지고 있는 것을 알 수 있다.
「비교예 1 : 일반적인 친수성 관능기를 가지는 충전제와의 친수성 상호작용의 비교」
도 8에 본 발명의 충전제와, 대표적인 친수성 관능기인 폴리에틸렌옥사이드를 실시예 1과 동일한 실리카겔에 수식한 컬럼 충전제와의 비교를 나타냈다.
크로마토그램의 취득 조건은 다음과 같다.
이동상 : 10mmol/L HCOONH4, CH3CN/H2O=90/10(pH=7.19)
유속 : 1.0mL/min
온도 : 40℃
검출 : UV 254 nm
비교 대상에서는 컬럼 길이가 짧은데(150mm), 유지 시간은 컬럼 길이에 정비례하는 것을 감안하면, 도 8로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 컬럼은 친수성 상호작용 크로마토그래피에 있어서, 일반적인 수식 방법보다 매우 큰 유지 시간을 나타내는 것을 알 수 있다. 이것은 포스포릴콜린기를 사용하여 친수성 상호작용 크로마토그래피를 실시함으로써 비로소 분명해진 결과이다.
「비교예 2 : 발매되어 있는 대표적인 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제와의 친수성 상호작용의 비교」
다음에, 발매되어 있는 것 중에서 가장 널리 이용되고 있는 친수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼의 하나인 TSKgel Amide-80 5μm(도소 가부시키가이샤)와의 비교에 대해서 나타낸다. 비교 대상으로 한 이 컬럼은 카르바모일기를 실리카겔에 고정화한 것으로 되어 있다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다.
컬럼 : 4.6 mmi.d. x 250 mm
온도 : 40℃
이동상 : 10mmol/L HCOONH4, CH3CN/H2O=90/10(pH=7.19)
10mmol/L HCOONH4, CH3CN/H2O=90/10(pH=3.50)
유속 : 1.0mL/min
검출 : UV/254nm
시료 : 티민 50μg/mL, 아데닌 50μg/mL, 시토신 100μg/mL, 나프탈렌 100μg/mL in 50% CH3CN
주입량 : 5μL
동일 사이즈로 양 컬럼을 비교한 결과를 2종류 든다.
우선 pH가 산성인 이동상을 사용한 결과를 도 9에 나타냈다. 이동상이 산성인 경우, 컬럼 충전제 담체의 실리카겔상에 잔존하는 실라놀기는 중성이므로, 컬럼 전체로서는 전기적으로 중성이 되고, 친수성 상호작용 이외의 상호작용은 존재하지 않는다고 생각된다.
이 조건에 있어서, 본 발명의 충전제는 비교예 2보다 큰 유지를 나타냈다. 이것은 본 발명의 컬럼이 보다 강한 친수성 상호작용을 가지는 컬럼인 것을 나타내고 있다.
또한 주목해야 할 것은, 본 발명에 의한 컬럼에 의해 얻어진 피크의 이론 단수의 높이(이론 단수가 높을수록 샤프한 피크인 것을 나타냄)이다. 본 발명에서는 모든 핵산 염기 화합물에 대해서, 이론 단수 20000 이상을 얻었다. 비교예 2에서는, 이론 단수 5000~7000인 것을 생각하면, 본 발명의 컬럼은 친수성 상호작용에 있어서의 친수성 화합물의 분리에 매우 유효한 것을 나타낸다.
도 9에서, 특히 중요한 주목해야 할 점은, 일반적인 친수성 상호작용 크로마토그래피용 충전제에서는 분석이 매우 어려운 티민의 분리 피크이다.
비교예 2에 있어서는 5000단인데, 본 발명의 컬럼에 있어서는 22000단이라는 경이적인 이론 단수를 얻었다.
즉, 본 발명의 충전제는 티민의 분리 특성에 매우 우수하다.
이와 같이 샤프한 피크가 얻어진다는 것은, 인접하는 피크가 있는 경우라도 정확한 분석을 행할 수 있는 것을 나타내고 있다.
또한, 매우 미량의 물질이라도, 피크가 샤프한 것에 의해 검출 감도를 향상시킬 수 있는 것을 의미하고 있으며, 단순 계산으로도 본 예에 있어서의 티민에 대해서는 4배 이상이나, 그 밖의 물질에 대해서도 3배정도의 감도 향상을 예상할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 친수성 상호작용 크로마토그래피용 컬럼 충전제는 현재 가장 신뢰되는 동 분야의 컬럼 충전제에 비해 압도적으로 우수하다.
피크의 이론 단수는 충전제의 입자 직경이 작은 경우에 높아지는 것이 알려져 있으며, 이 경우, 입자계가 작을수록 컬럼 압력이 높아진다. 즉, 컬럼 압력이 높고, 또한 이론 단수가 높은 경우는 단순히 컬럼 충전제의 입자 직경이 작아졌기 때문이라고 유추된다.
그러나, 도 9에 도시한 바와 같이, 본 발명의 컬럼 충전제(4.9MPa)는 비교 대상(4.6MPa)과 동등한 컬럼 압력이었다.
이 결과는 본 발명의 컬럼 충전제에 의해 얻어지는 이론 단수의 높이가 충전제의 입자 직경이라는, 관능기와는 무관계한 이유에 의한 것이 아닌 것을 나타내고 있다. 덧붙여서, 입자 직경에 의존하는 이론 단수의 변화는 물리적인 요인이므로, 모든 화합물에 대해서 동일한 비율로 이론 단수가 변화되는 것에 대해, 본 발명에서는 티민에 있어서 경이적인 이론 단수를 나타냈다.
이와 같은 화합물에 따라서 증감하는 경향은 충전제의 물리적 요인을 부정하고, 표면 수식의 효과를 반영하는 것이다.
다음에 pH가 중성인 이동상을 사용한 결과를 도 10에 나타낸다. 이동상이 중성인 경우, 컬럼 충전제 담체의 실리카겔상에 잔존하는 실라놀기는 산성이 되기 때문에, 일반적인 표면 수식 방법에서는 컬럼 전체가 부전하를 띤다.
따라서, 친수성 상호작용 컬럼으로서는 이온성 상호작용이 이레귤러로 관여하거나, 정전하를 띠는 염기성 물질의 흡착이나 이론 단수의 저하를 초래하거나 하기 때문에 바람직하지 않다. 이 관점에서 도 9와 도 10을 비교하면, 비교 대상 컬럼에서는 이동상이 중성이 됨으로써 각 물질의 유지 시간이 대폭 증가하고 있는 것을 알 수 있다. 분석 대상 물질이 정전하를 띠기 쉬운 염기성 물질인 핵산 염기(즉 부전하를 띤 충전제와 상호작용함)인 것을 생각하면, 비교 대상 컬럼에 있어서는 이온 교환 상호작용이 발생한 것은 명백하다. 이것은 실리카겔 표면에 잔존한 실라놀기에 의한 영향이라고 추찰된다. 이와 같은 비교 대상에 있어서의 중성 이동상에서의 유지 시간의 증가는 바람직하지 않은 유지 시간의 증가이다.
한편, 본 발명의 컬럼에서는 이동상의 pH가 변화되어도 거의 유지 시간이 변동하지 않고 있다. 이 결과는 본 발명이 순수한 친수성 상호작용에 기초하는 분리인 것을 나타내고 있다. 게다가 그 유지 능력은 시판되는 충전제에 비해 높고, 이론 단수가 매우 높다.
(산업상 이용가능성)
본 발명의 포스포릴콜린기를 함유하는 친수성 상호작용 크로마토그래피용 컬럼 충전제는 제시한 이동상 조성에 있어서, 극성 화합물(즉 친수성 물질)의 분리, 분석에 있어서 매우 유효하다.
본 발명에서 분리 가능한 친수성 물질에는 당류, DNA 등을 구성하는 핵산 염기, 단백질을 구성하는 아미노산, 수용성의 비타민, 호르몬류 등 생물학적으로 매우 중요한 화합물이 포함되고, 이들의 분석에 있어서 고감도의 검출, 고성능의 분리를 실현하는 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 식(1)로 나타내는 포스포릴콜린기가 담체 표면에 직접적으로 화학 결합하고, 포스포릴콜린기 이외의 미반응 관능기가 도입되지 않는, 친수성 상호작용에 의한 극성 화합물 분리를 위한 크로마토그래피용 충전제.
    Figure 712016000176090-pct00014
  2. 하기 식(2)로 나타내는 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지고, 포스포릴콜린기 이외의 미반응 관능기가 도입되지 않는, 친수성 상호작용에 의한 극성 화합물 분리를 위한 크로마토그래피용 충전제.
    Figure 712016000176090-pct00015

    식 중, m은 2~6, n은 1~4이다.
    X1, X2, X3는 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중, 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 것이어도 된다.
    R은 하기 식(3)~(5) 중의 구조의 어느 하나이다(단, 하기 식(3)~(5)에 있어서, 식(2)의 화합물을 A-R-B로 나타낸다).
    Figure 712016000176090-pct00016

    Figure 712016000176090-pct00017

    Figure 712016000176090-pct00018

    식(3)~(5) 중, L은 1~6, P는 1~3을 나타낸다.
  3. 하기 식(6) 또는 (7)로 나타내는 표면 개질제로 처리된 개질 담체로 이루어지고, 포스포릴콜린기 이외의 미반응 관능기가 도입되지 않는, 친수성 상호작용에 의한 극성 화합물 분리를 위한 크로마토그래피용 충전제.
    Figure 712016000176090-pct00019

    Figure 712016000176090-pct00020

    식 중, m은 2~6, n은 1~4이다. X1, X2, X3는 각각 단독으로 메톡시기, 에톡시기 또는 할로겐이다. 단, X1, X2, X3 중, 2개까지는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기의 어느 것이어도 된다.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 담체가 실리카인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피용 충전제.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 실리카가 구상 또는 파쇄형이며, 그 평균 입경이 1~200μm인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피용 충전제.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 실리카가 다공성이며, 그 세공의 평균 직경이 10~2000옹스트롬인 것을 특징으로 하는 크로마토그래피용 충전제.
  7. 삭제
  8. 삭제
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