KR101109620B1 - 단삼소납을 함유하는 피부미백 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단삼소납을 함유하는 피부미백 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단삼(丹參, Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물로부터 분리된 단삼소납(Sodium Danshensu)이 티로시나제 활성 저해, 멜라닌 생성 저해 등의 피부 미백 활성에 우수함을 확인함으로써, 단삼소납을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

단삼소납, 피부미백 화장료, 티로시나제, 멜라닌

Description

단삼소납을 함유하는 피부미백 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening containing Sodium Danshensu}

본 발명은 단삼소납을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 햇빛에 노출이 되면 피부색은 검게 변하게 된다. 이것은 자외선으로부터 피부를 보호하기 위한 자연스러운 작용이다. 자외선에 노출된 피부는 멜라닌 형성 세포인 멜라노사이트(Melanocyte) 내에서 티로시나제(Tyrosinase) 효소가 촉진되어 흑색의 멜라닌 색소가 생성되고 각질 형성세포로 전이되어 표피세포에 분포함으로써 피부가 검게 되어 자외선을 차단하게 되는 것이다. 하지만 현대인들은 환경오염 및 다양한 외부적인 요인으로 자외선에 노출되는 시간이 증가하면서 멜라닌 색소의 과다한 형성 및 침착 등으로 이어져 피부의 흑화, 기미, 주근깨 등의 문제를 야기시킬 수 있다. 따라서, 이것들로부터 피부를 보호하기 위하여 미백 화장료가 절실히 요구되고 있다.

멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(Melanocyte)라는 세 포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(Tyrosinase), 티로시나제 관련 단백질 1(Tyrosinase Related protain 1), 도파크롬 타우토메라제(Dopachrome Tautomerase) 등이 있으나, 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다.

티로시나제(Tyrosinase)는 넓은 범위의 페놀 화합물을 기질로 이용하는 구리함유 효소로서 티로신(Tyrosine)을 기질로 이용하여 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-3,4-dihydroxylphenylalanine)을 생성시키고 이를 다시 도파퀴논(L-DOPAquinone)으로 전이시키는 연속된 효소적 산화를 거쳐 각 생성물의 중합반응에 의해 멜라닌(Melanin)이 생합성된다.

현재 식물에서 추출하여 티이로시나제(Tyrosinase) 저해 활성을 갖는 원료로는 하이드로퀴논(hydroquinone), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 아스코르빈산(ascorbic acid) 등이 있다. 하지만 하이드로퀴논은 약간의 미백 효과를 발휘하지만, 피부 자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한하고 있고 안정성 부분에서도 변색에 취약한 것으로 알려져 있으며, 코직산은 구리이온을 킬레이트시켜 효소활동을 저해하는데 뛰어난 효과를 나타내나, 화장품 제제 적용시 안정성과 관련하여 문제점이 많아 화장료로는 적당하지 않다. 또한, 발암성이 보고되면서 잠정적으로 사용이 중지된 상태이다. 알부틴은 in vitro 상에서는 확실한 효능 효과를 발휘하나, 인체에 적용 시 그 효과가 떨어지는 문제점이 있고, 아스코르빈산은 산화되기 쉬워 변색, 변취되는 문제가 발생한다. 따라서, 이와 같은 문제 점을 해결하기 위하여 기능성 식물 소재에 유도체를 가미하거나 리포좀 및 캡슐레이션 등을 적용하여 안정성을 높이는 등의 노력을 하고 있지만 현재까지 실적이 미비한 실정이다.

현재 기존 미백 효능 물질들 이외에 천연물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구가 계속 이루어지고 있는데, 그 중 상백피, 감초, 천궁 등 다수의 식물 추출물이 티이로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는데 많은 문제점을 갖고 있으며 만족할 만한 결과를 내지 못한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 종래의 미백물질들이 갖는 안전성, 안정성 문제점들을 극복하면서 미백 효과까지 우수한 천연소재를 선별하였고, 단삼 추출물로부터 분리된 단삼소납이 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 단삼소납을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 바와 같은 목적을 구현하기 위하여 본 발명은 단삼에서 추출한 단삼소납을 함유하면서 안전성, 안정성이 우수하며 미백 효과까지 뛰어난 것을 특징으로 하는 미백 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 단삼에서 추출한 유효성분인 단삼소납을 함유하는 미백 화장료 조성물로써 피부에 안전하면서 티이로시나제 저해 활성을 통한 멜라닌 생성 억제 작용을 활발히 진행시켜 뛰어난 미백 효과를 부여할 수 있게 하였다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 단삼(丹參, Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물로부터 분리된 단삼소납이 티로시나제 활성 저해, 멜라민 생성 저해 등의 피부 미백 활성에 우수함을 확인함으로써, 단삼소납을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

단삼은 뿌리줄기와 뿌리를 약용으로 사용하며, 뿌리줄기(근경)는 짧고 거칠며 끝부분에 보통 줄기 자국이 남아 있다. 뿌리는 긴 원통형으로 여러 개로 갈라져 있으며 바깥면은 적갈색 또는 어두운 적갈색이고 거칠고 세로 주름이 있다. 단삼은 혈액순환을 돕고, 어혈을 제거하며, 사지관절 동통을 완화시킨다. 부인의 생리 불순, 생리통, 산후복통, 어혈성심복부통, 타박상 등을 치료한다. 고열로 인한 정신혼몽, 헛소리, 번조, 불면증, 피부발진, 심계항진 등을 치료한다. 약리작용으로는 관상동맥 확장, 콜레스케롤 강하, 혈압 강하, 간기능 활성화, 진정, 항염, 항암, 항균 작용이 보고되어 있다.

단삼의 성분으로는 지용성 비키논류 성분이 함유되어 있다. 그 성분으로는 탄시논 I(Tanshinone I), 탄시논 ⅡA(Tanshinone ⅡA), 탄시논 ⅢB(Tanshinone ⅢB), 크립탄시논(Cryptanshinone), 디클로르탄시논(dichlortanshinone) 등이 있으며, 수용성 성분으로는 프로토카테쿠알데아히드(Protocatechualdehyde), 프로토카페누익산(Protocatechuic acid), 살비아닉산 A(Salvianic acid A), 비타민 E 등이 있다.

단삼소납[(1) 3,4-Dihydroxyphenyl-α-hydroxypropanoic acid Sodium Salt ; Sodium DL-β-(3,4-dihydroxyphenyl)lactate]은 단삼에서 추출한 성분으로서 이것의 분자 구조식은 하기 화학식 1과 같으며, 분자 화학식은 C₉H₉O₅Na이고, 분자량은 200.16이다. 본 발명에서 단삼소납을 함유하는 미백 화장료 조성물은 멜라닌 생성에 대해 강력한 억제 효과를 나타내며, 일정 농도 이상 배합하였을 경우 피부 에 대한 우수한 미백 효과를 발휘하게 됨을 발견하였다.

[화학식 1]

본 발명의 단삼소납은 단삼으로부터 얻을 수 있을 뿐만 아니라 유기합성으로도 제조 가능하다.

본 발명은 단삼소납이 멜라닌 생성을 억제하므로 미백 효과를 부여하는 피부 미백 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 사용 가능함을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 단삼소납을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물을 특징으로 하며, 바람직하기로는 상기 단삼소납이 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 ~ 30.0 중량%로 함유되고, 더욱 바람직하게는 0.01 ~ 5.0 중량%가 적합하다. 상기 단삼소납의 함량이 0.001 중량% 미만이면 효능이 미약하며, 30.0 중량%를 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효능의 증가가 나타나지 않아 경제적이지 못하다.

단삼소납에 대한 분리, 정제는 단삼을 건조시킨 후 균일하게 분쇄하고, 물과 유기용매의 혼합용액으로 추출하여 농축한 추출물을 얻는다.

그 추출물을 유기 용매를 이용하여 분리추출하고, 크로마토그래피로 분리하여 단삼소납을 얻는다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 단삼소납을 화장료 적용 시 기초제품 화장료 (화장수, 로션, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 젤), 색조제품 화장료(파운데이션, 메이크업 베이스) 등으로 사용이 가능하나, 바람직하게는 화장수, 로션, 크림, 에센스 등에 사용하는 것이 가장 이상적이며, 전체 화장료 조성에 대하여 0.001 ~ 30.0 중량% 배합한다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는 바, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 단삼 추출물의 제조 및 단삼소납의 분리

국내산 단삼의 뿌리를 건조한 것 1kg을 분쇄기에 넣고 균일하게 파쇄한 후 그 분쇄물에 에탄올:물(70:30) 10ℓ를 가하고 2~3일간 상온에서 방치한 후 여과액을 얻었다. 이 여과액을 진공 건조하여 단삼 추출물 240 g을 얻었다. 추출물 중 단삼소납의 함량은 약 0.9%이었다. 이 추출물을 물 0.5ℓ에 녹인 후 노르말 헥산을 동량 가하고 분액여두에서 분액하여 수층을 얻었다. 그 수층에 동부피의 노르말 부탄올로 3회 반복분배 추출하였다. 그 노르말 부탄올층을 진공 건조하여 부분 정제물 18 g을 얻었다. 이 부분 정제물 중 단삼소납의 함량은 약 11.5%이었다. 이 부분 정제물에 대해서 물:아세토니트릴:메탄올(80:10:10)을 용리액으로 하여 리크로소브 RP-18 컬럼(Merck, 8*50㎝)을 이용하여 크로마토그래피를 실시하였다. 단삼소납이 함유된 분획을 모아 증발 건고시켜 단삼소납을 약 1.9 g을 얻었다(단삼소납의 전체 수율은 0.19%이었다.).

실시예 2: 세포독성 확인

단삼소납에 대한 세포독성을 확인하기 위해, MTT 분석방법을 이용하여 세포독성 실험을 함으로써 이것을 통하여 단삼소납 물질의 안전성을 판단하였다.

MTT 분석은 탈수소 효소 작용을 이용한 것으로써 살아있는 세포에서 수용성이고 노란색을 띠는 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)가 수불용성인 파란색의 프로마진(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 프로마진 유도체는 용해제(보통 dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정하였다. 좀 더 자세히 설명하면, 단삼소납을 5가지 농도로 나누어 각 농도별 세포독성 실험을 실시하였다. 인간 섬유아세포주(ATCC, CRL-2310)를 1 x 10⁴ cells/㎖의 농도로 하여 24 웰 플레이트에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)을 사용하였다. 접종 24시간 후, 소혈청 2%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)으로 교체하고, 시험 시료를 50 ㎍/㎖의 농도로 10㎕ 첨가한 후, 3일 동안 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200 ㎕씩을 가하여 세척하고 MTT 용액을 웰당 1.0 ㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 1.0 ㎖씩 가한 후 하룻밤 37 ℃에서 인큐베이션 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

MTT 분석을 통한 세포독성 실험 결과는 하기 표 1과 같으며, 단삼소납은 세포독성이 거의 나타나지 않는 것으로 판단된다.

[표 1]

실시예 3: DPPH 라디칼 소거 효과

본 실시예는 단삼소납에 대하여 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)를 사용하여 프리라디칼(free radical) 소거능 효과를 측정하였다. 프리라디칼 소거능을 측정함으로써 티로신으로부터 시작되는 멜라닌 합성 단계 중 산화과정 저해 효과를 통해 미백 활성을 확인할 수 있다.

0.2 mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 1 ㎖에 단삼소납을 2 ㎖ 첨가하고, 상온에서 10 분간 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 프리라디칼 소거 효과(%)를 구하였다. 이때 대조군은 DPPH 대신 메탄올을 사용하며, 실험군과 동일한 농도의 단삼소납 2 ㎖을 첨가하였다. 또한, 프리라디칼 소거능의 양성 대조군으로는 프리라디칼 소거능이 뛰어난 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있는 녹차 추출물과 아스코르빈산을 이용하여 비교하였다.

프리라디칼 소거활성 SC₅₀은 프리라디칼을 50% 소거하는데 필요한 단삼소납의 농도를(㎍/㎖) 표시하고 있다. 결과는 하기 표 2와 같다.

하기 표 2의 결과를 보면 실시예의 단삼소납는 단삼 추출물에 비해 현격히 낮은 농도에서 SC₅₀ 농도를 나타내고 있으며, 녹차 추출물 및 아스코르빈산과 비교에서도 보다 낮은 농도에서 SC₅₀ 농도를 나타내어 프리라디칼 소거능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.

[표 2]

실시예 4 : 티로시나제의 저해 활성 확인

본 실시예는 단삼소납에 대하여 티로시나제의 저해 활성을 측정하였다.

모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. B16 멜라노마 세포(ATCC CRL6323)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO₂, 37 ℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone; 멜라닌 세포 자극호르몬, 0.34 ug/㎖, Sigma)가 처리된 DMEM 10% 배지로 갈아준 후 실시예의 시료들을 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들은 트립신을 처리하여 떼어낸 후 1.5 ㎖ 튜브에 넣어 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 PBS로 2회 세척하였다. 세포 침전물에 1% 트리톤 X-100과 2 mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride; 단백질 분해 억제제)가 포함된 80 mM 포타슘 포스페이트 완충용액(pH 6.8) 1 ㎖를 첨가하여 얼음 속에서 20분간 진탕 혼합하여 4 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후 4 ℃, 20분, 12,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 모았다. 상층액 0.3 ㎖와 1.5 mM 티로신 0.3 ㎖를 37 ℃에서 3시간 반응시켰다. 강하게 진탕 혼합하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상층액의 단백질 정량은 Bio-rad 단백질 정량 프로토콜에 따라 분석하였으며, 생성된 멜라닌의 흡광도를 단백질 량으로 나누어 주었다.

대조군으로는 단삼 추출물과 알부틴을 사용하였으며, 일반적으로 알부틴은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475 nm에서 흡광도

B : 시료를 첨가한 반응용액의 475 nm에서 흡광도

[표 3]

실시예 5: 멜라닌 생성 억제 확인

본 실시예는 단삼소납에 대한 B16 멜라노마의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.

B16 멜라노마 세포 배양을 통하여 멜라닌 생성 억제 기능을 세포 수준에서 검정하였다. B16 멜라노마 세포는 10% 소혈청을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에서 5% CO₂, 37 ℃의 조건에서 2일간 배양하여 1.0 X 10⁸ 세포/T25 프라스크가 될 때까지 배양하였다. 그 다음 농도별로 단삼소납 및 대조군 시료를 넣고 5% CO₂, 37 ℃에서 2일간 배양하였다. 그 후 트립신을 첨가 하여 세포들을 수거하여 세포의 흑화 정도를 관찰하였다. 멜라닌이 생성되어 배출된 T25 플라스크의 상층액을 취해 475 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌을 정량하고, 세포수는 수거된 세포: tryphan blue = 1 : 9 의 비율로 혼합하여 현미경으로 관찰하여 살아있는 세포수를 세어 단위 세포당 생성된 멜라닌의 양을 정량하여 저해 효과를 나타낸다. 대조군으로 사용된 알부틴은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.

실험결과는 하기 표 4와 같이 단삼소납은 단삼 추출물, 알부틴과 비교하여 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보이며, 또한 단삼소납은 농도가 증가할수록 멜라닌 생성 억제율도 증가하는 것을 알 수 있다.

[표 4]

제조예 1 ~ 3 및 비교제조예 1 ~ 4 : 화장수 제조

본 발명의 단삼소납을 함유하는 화장료 중 화장수의 제조를 위한 조성 및 함량은 하기 표 5와 같다.

<제조방법>

화장수 제조는 하기 표 5의 원료 2를 정확히 평량하고, 온도를 45℃까지 가온하였다. 원료 3 을 정확히 평량하고, 천천히 원료 2와 혼합하고 Disper Mixer를 사용하여 2000 rpm 속도로 교반하였다. 마지막으로 원료 1을 투입하고 2분 정도 교반하였다.

[표 5]

제조예 4 ~ 6 및 비교제조예 5 ~ 8 : 로션의 제조

본 발명의 단삼소납을 함유한 화장료 중 로션의 제조를 위한 조성 및 함량은 하기 표 6과 같다.

<제조방법>

로션 제조는 하기 표 6과 같이 원료 2를 정확히 평량하고, 혼합교반하면서 80 ~ 85 ℃까지 가온하였다. 원료 3을 정확히 평량하고 온도를 80 ~ 85 ℃까지 가온하였다. 원료 3에 원료 2를 천천히 투입하면서 유화기를 사용하여 3600 rpm의 속도로 4분간 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35 ℃까지 냉각하고, 원료 1을 투입하였다. 25 ℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

[표 6]

제조예 7 ~ 9 및 비교제조예 9 ~ 12 : 크림의 제조

본 발명의 단삼소납을 함유한 화장료 중 크림의 제조를 위한 조성 및 함량은 하기 표 7과 같다.

<제조방법>

크림 제조는 하기 표 7과 같이 원료 2를 정확히 평량하고, 혼합교반하면서 80 ~ 85 ℃까지 가온하였다. 원료 3을 정확히 평량하고 온도를 80 ~ 85 ℃까지 가온하였다. 원료 3에 원료 2를 천천히 투입하면서 유화기를 사용하여 3600 rpm의 속도로 4분간 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35 ℃까지 냉각하고, 원료 1을 투입하였다. 25 ℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

[표 7]

실시예 6: 피부에서의 미백 효과 확인

상기 제조예 7 ~ 9와 비교제조예 9와 12의 크림을 피부에 도포했을 때 미백효과에 대한 영향을 실험하기 위해 20~55세의 여성층으로서 20명을 선정하였다. 피검자의 윗 팔뚝 부위에 직경 1.5 ㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소 홍반량(MED ; Minimal Erythema Dose)의 1.5 ～ 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 색소 침착을 유도하고, 시험 물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 각 시험 물질들은 아침과 저녁에 걸쳐 매일 2회 바르도록 하였다.

효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 L^* 값을 구하여 결정하였다. 일반적으로 인공적인 색소 침착을 유도하지 않은 한국인 피부의 L^* 값은 50～70의 영역에 속한다.

시험 물질들을 도포하여 효과가 있을 경우에는 L^* 값이 점차 증가하게 된다. 도포 시작 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(ΔL^*)를 하기 수학식 4에 따라 계산하여 사람 피부에서의 미백 효과를 비교하였으며, 그 측정결과는 하기 표 8에 나타내었다.

[표 8]

상기 결과와 같이, 본 발명에서 단삼소납을 함유한 미백 기능성 화장료 조성물은 알부틴, 코직산을 함유한 조성물에 비해 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

Claims (4)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge) 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 피부 미백 화장료 조성물.

   [화학식 1]

   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물의 함량은 0.001 ~ 30.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물의 함량은 0.01 ~ 5.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.